JPH05227976A - Ａｌｖ遺伝子の塩基配列及びその利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ５−アミノレブリン酸（ＡＬＶと略す）の生
合成に関与する酵素をコードする遺伝子及びその塩基配
列を利用して、該酵素を効率的に製造する方法を提供す
る。 【構成】 ＡＬＶ合成に係わる酵素をコードする遺伝子
をクローン化し、その遺伝子の塩基配列を決定する。該
酵素をコードする領域をベクターに組み込んで組換え体
ＤＮＡを得、次にその組換え体ＤＮＡで宿主を形質転換
する。このようにして得られた形質転換体を大量に培養
することにより、ＡＬＶ合成に関与する酵素を効率的に
製造する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、配列表の配列番号１に
示したアミノ酸配列を有し、δ−アミノレブリン酸（以
下、ＡＬＶと略す）合成活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ、そのＤＮＡとベクターＤＮＡとよりな
る組換え体ＤＮＡ、その組換え体ＤＮＡで形質転換せし
められた形質転換体、及び該形質転換体を利用したＡＬ
Ｖ合成酵素の製造法に関する。また、こうして得られた
形質転換体を利用することにより除草剤として有用なＡ
ＬＶを効率よく製造することができる。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ＡＬＶ
は医薬品、農薬もしくは化学薬品原料として、また除草
剤として有用な化合物である（永井ら、バイオインダス
トリー、8(8)535(1991) ）。ＡＬＶは生体内でポルフィ
リン、ヘム、ビタミンＢ₁₂などの前駆物質として知られ
ている。従来、化学合成法により生産され市販されてい
るが、その化学合成は容易ではなく、合成工程も複雑で
収率も悪かった（例えば、特開平2-76841 ）。これに代
わる方法として、微生物や藻類による発酵生産も試みら
れている（例えば、特開平2ー92293）。微生物の中では
大腸菌のＡＬＶ生合成経路は比較的良く調べられている
が、不明な点も多くいまだ充分に解明されているとは言
えない。また、その生産量も低く生産菌として用いるに
は現状では満足のいく結果は得られていなかった。

【０００３】このような状況のもとで、本発明者らは鋭
意研究を行い、その結果大腸菌よりＡＬＶ生産に関与す
る新しい遺伝子を遺伝子組換えの手法で単離するととも
に、その遺伝子を用いた組換えＤＮＡで形質転換せしめ
たＡＬＶ合成酵素高生産性の組換え微生物を取得した。
本発明者らは、更に研究を進め、前記組換え手法で得ら
れたＡＬＶ生産に関与する遺伝子の塩基配列の決定を試
みそれに成功すると共に、ＡＬＶ生産に直接関与する遺
伝子部分を特定化した。さらに本発明者らは、このよう
にして育種した組換え微生物がＡＬＶ合成酵素を著量生
産することを見い出し本発明を完成した。

【０００４】即ち、本発明は、（１）配列表の配列番号
１に示したアミノ酸配列を有し、ＡＬＶ合成活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡあるいは配列表の配
列番号１に示した塩基配列を有するＤＮＡ、（２）上記
（１）のＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体Ｄ
ＮＡ、（３）上記（２）の組換え体ＤＮＡで形質転換せ
しめられた形質転換体、（４）上記（３）の形質転換体
を培養し、得られた組換え体からＡＬＶ合成酵素を採取
することを特徴とするＡＬＶ合成酵素の製造法に関す
る。

【０００５】以下、本発明を更に詳細に説明する。 （１）ＡＬＶ合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡの単
離 本発明の配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有
し、ＡＬＶ合成活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ（以下、単にＡＬＶ遺伝子ともいう）は、ＡＬＶ
の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡから製造するこ
とができる。

【０００６】このＡＬＶの合成に関与する遺伝情報を担
うＤＮＡとしては、例えば、大腸菌から得られたものが
挙げられる。大腸菌としてはＡＬＶ生産性大腸菌株であ
れば特に限定されないが、特に好ましいものとしては大
腸菌Ｃ６００株をあげることができる。また、このＤＮ
Ａは、それが一旦単離取得されたならば、慣用方法にし
たがってそのＤＮＡ中の塩基配列の大部分あるいは一部
分を利用して、それをプローブとして用いて他の生物を
検索し、その生物の保有する遺伝子の内にＡＬＶの合成
に関与する遺伝子情報を担うものを見つけ出し、次にそ
のようにして同定された遺伝子を遺伝子組換え技術の手
法を応用して切り出し、それを大量に得、それをこの大
腸菌に由来するものと同様に用いることは、当業者であ
れば容易に理解し得るところのものである。

【０００７】従って、本発明のＡＬＶの合成に関与する
遺伝情報を担うＤＮＡ源としては、大腸菌のみでなく、
上記したような手法の適用できるグラム陰性あるいはグ
ラム陽性細菌であってＡＬＶ合成酵素をコードする遺伝
子を有するものを用いることが出来る。この他にも、Ａ
ＬＶ遺伝子を有するものであれば、動物、植物、下等生
物、高等生物の区別なく利用することが可能である。

【０００８】次に大腸菌由来のＡＬＶ合成酵素をコード
する遺伝子を含むＤＮＡを例にあげて、ＡＬＶ遺伝子の
単離法について説明する。 （ａ）大腸菌Ｃ６００株より染色体ＤＮＡを抽出し、制
限酵素で切断する。染色体ＤＮＡの抽出は、Marmur法
（J.Marmur,J.Mol.Biol.,3,208(1961)）などの通常用い
られている方法で行うことが出来る。またその染色体Ｄ
ＮＡの抽出は、培養して得られた菌体をリゾチームある
いはプロテナーゼで処理し、フェノールで抽出すること
等によりなされる。このようにして抽出されたＤＮＡは
適当な制限酵素で切断される。

【０００９】切断に用いる制限酵素としては、染色体Ｄ
ＮＡを適当に切断でき、かつ本目的に使用するベクター
の開裂に用いることができる制限酵素であればいずれも
使用可能である。この際用いる制限酵素によって目的遺
伝子の内部が切断されることを避けるために、低活性の
制限酵素でＤＮＡを部分的に分解し、目的遺伝子を完全
に含むような適当な大きさのＤＮＡ断片を得ることが望
ましい。このようにして得られたＤＮＡ断片はショ糖密
度勾配遠心法、アガロースゲル又は、アクリルアミドゲ
ル等を用いたゲル電気泳動法あるいはＲＰＣ−５レジン
等を用いたカラムクロマトグラフィー法によって精製す
ることができる。本発明の場合特にショ糖密度勾配遠心
法が好適に使用され、その５〜１０Ｋｂの画分を好適に
組換え体ＤＮＡの作製に用いることが出来る。

【００１０】（ｂ）ベクターＤＮＡを制限酵素で切断・
開裂させる。ベクターＤＮＡの開裂は、ベクターＤＮＡ
に適当な制限酵素を充分作用させることにより行う。こ
こで使用される制限酵素は、上記（ａ）において使用し
た制限酵素を考慮して決めることが出来るが、必ずしも
同一である必要はない。それは下記（ｃ）で記載するよ
うに、各ＤＮＡの末端部を必要に応じて移籍することが
出来るからである。このような方法としては、公知の方
法を適宜組み合わせて用いることが出来る。しかしなが
ら、その制限酵素は、上記（ａ）において使用したもの
と同一のものを用いると便利であり、好ましい結果が得
られる。

【００１１】ここで使用し得るベクターＤＮＡとして
は、通常の公知の宿主−ベクター系として知られている
ものの中から選んで用いることができる。このようなベ
クターＤＮＡとしては、各宿主細胞中で自律複製可能な
ものであれば制限なく使用でき例えば、宿主細胞として
大腸菌を用いる場合、大腸菌Ｋ−１２株（ＥＫ）用によ
く知られた発現ベクターがあげられる。このようなもの
の代表例としては、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３１３、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２４、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵ
Ｃ１９、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９、Ｃｈａｒｏ
ｎファージ、コスミドベクター、ランナウェイ・プラス
ミドベクターなどがあげられるほか、１ａｃＵＶ５、ｔ
ｒｐプロモーター、外膜リポタンパク遺伝子（１ｐ
ｐ）、タンパク合成の延長因子ＥＦ−Ｔｕ遺伝子（ｔｕ
ｆＢ）、ｒｅｃＡ遺伝子のプロモーター、コリシンＥ１
遺伝子のプロモーター、及びλファージ初期遺伝子群プ
ロモーター（Ｐ_L ）、などを単独であるいはそれらの任
意のものを組み合わせたもので制御されたプラスミドベ
クターがあげられる。このようなプラスミドベクターの
うち特に好ましいものとしてはｐＢＲ３２２があげられ
る。以上、ここで使用されるベクターＤＮＡは、その宿
主細胞中で自律複製できるものであれば、特に制約はな
いし、また単に目的とする遺伝子をクローン化するため
のみであれば格別の制限なく、公知のものを用いること
ができる。また、ここで使用されるベクターＤＮＡは、
選別のためのマーカー等、遺伝子組換えにおいて要求さ
れる通常知られた機能を有することはもちろんである。

【００１２】（ｃ）ベクターＤＮＡの開裂部位に上記
（ａ）で得たＤＮＡ断片を組み込み、閉環した組換え体
ＤＮＡをつくる。ベクターＤＮＡの開裂部位にＤＮＡ断
片を組み込むには、大腸菌のＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼの様な連結酵素を作用させるなどの通常の方
法を用いることが出来る。この際、ベクターＤＮＡの分
子内環化による組換え効率の低下を避けるために、あら
かじめＣＩＰ（Calf intestine alkaline phosphatas
e）、ＢＡＰ（Bacterial alkaline phosphatase）など
のアルカリ性フォスファターゼにより開裂ベクターＤＮ
Ａ末端の脱リン酸処理を行うことが好ましい。また、ベ
クターＤＮＡと上記（ａ）で得たＤＮＡの末端部が、そ
の相互の結合に不適な場合は、公知の方法で適当に核酸
塩基を付加したり、あるいは消化して除いたり、あるい
は平滑末端とするなどの方法により修飾してから、その
ベクターＤＮＡと上記（ａ）で得たＤＮＡの連結を行う
ことが出来る。

【００１３】（ｄ）組換え体ＤＮＡをＡＬＶ要求性の宿
主細胞に移入し、その要求性を回復した株を選択する。
組換え体ＤＮＡの宿主への移入は、接合や形質転換な
ど、用いる宿主−ベクター系に適した方法を選択するこ
とが出来る。ここで使用し得る宿主細胞としては、通常
の遺伝子組換え体技術において、遺伝子のクローニング
のために使用されるものであれば特に制限なく使用でき
るが、特に好適な宿主細胞としては大腸菌があげられ
る。また、宿主細胞が、上記菌株であって、かつ人工突
然変異などの方法によって誘導されたＡＬＶ要求性株で
あれば、ＡＬＶ合成酵素遺伝子の単離をより効率的に行
うことができる。

【００１４】（ｅ）目的の組換え体ＤＮＡを保有する細
胞株から目的のＤＮＡ断片を単離する。目的の組換えＤ
ＮＡの抽出は通常の方法を用いて行うことができる。例
えば、培地中で増殖させた該形質転換体を収穫し、細胞
壁をリゾチーム処理等の細胞破壊法として知られた方法
により壊し、次に核酸画分を分離した後、密度勾配遠心
などの方法により所望の画分に分ける。得られた組換え
ＤＮＡを、連結に用いた制限酵素などの適当な制限酵素
でベクターＤＮＡから切断し、アガローズゲル電気泳動
などの方法で所望のＡＬＶの合成に関与する遺伝情報を
担うＤＮＡを分離することが出来る。

【００１５】（２）ＡＬＶ合成酵素をコードするＤＮＡ
の塩基配列の決定 次に大腸菌由来のＡＬＶ生産に関与する遺伝子を含むＤ
ＮＡを例に挙げて、ＡＬＶ合成酵素をコードするＤＮＡ
の塩基配列の決定法について説明する。ＡＬＶ生産に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片は、その塩基配列を決定
するのに適した程度まで断片化され、次に当該分野でよ
く知られた方法により処理されてその塩基配列を決定す
ることが出来る。ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定法
としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法、ジデオキシ
・ シークエンス法、ジデオキシ・ チェイン・ ターミネー
ション法等があげられる。このような方法の内には、適
当な制限酵素を作用させ、制限酵素地図を作製した上
で、必要な断片をサブクローン化する方法や、ショット
ガン・ クローニング法、ＰＣＲにより遺伝子を増幅する
方法、核酸分解酵素によりディリーションする方法など
の様々な手法が含まれていることはもちろんである。

【００１６】次に、こうしてＤＮＡ塩基配列の決定され
たＤＮＡのうちからＡＬＶ合成活性を有するポリペプチ
ドをコードしているＤＮＡ領域を決定する。上記のよう
にして構造解析されたＤＮＡから、ＡＬＶ合成酵素をコ
ードするＤＮＡ以外の領域を除くには、様々な方法を用
いることができる。このような方法としては、ＢＡＬ３
１ヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼIII による欠失
法、制限酵素切断サイトを利用した組換え法などがあげ
られる。この際、遺伝子の固有のプロモーターを他のも
のに変更したり、部位特異的変異を導入してプロモータ
ーの強度を変化させることは、現在の遺伝子操作技術を
用いれば容易に行い得る。従って、そのように一部を変
更したＤＮＡ断片であっても、ＡＬＶ合成活性を示すポ
リペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片であれ
ば、全て本発明に含まれることは明白である。

【００１７】また、本発明のＡＬＶ合成活性を示すポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片として
は、ＡＬＶ合成活性を示すポリペプチドをコードするＤ
ＮＡに加えて、その遺伝子を生体内で発現させるのに重
要な役割を担う制限領域、例えば、遺伝子の転写プロモ
ーター、リボソーム結合部位、転写のターミネーターな
どをコードするＤＮＡをも含んだものがあげられる。本
発明に従えば、一旦そのＡＬＶ合成活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡの塩基配列が明らかにされる
と、その機能を損なわない範囲でその塩基の置換あるい
は欠失を当該分野においてよく知られた方法を適用して
容易に行うことができる。例えば、相当するアミノ酸を
コードする遺伝子暗号の縮重を利用したもの、生物の遺
伝暗号の利用率を考慮した変換あるいはＡＬＶの機能に
悪影響を及ぼさないようなアミノ酸配列の変換のための
塩基の置換、付加または欠失処理などがあげられる。更
にまた、このような改変のうちには、ＡＬＶ合成酵素の
活性中心のみを保存し、その他の部分を大幅に変化させ
るようにそのＤＮＡの配列及び長さをかえることも含ま
れる。従って、本発明のＡＬＶ合成酵素をコードするＤ
ＮＡとしては、以上のような改変を施したもの全てが含
まれることは当業者であれば容易に理解し得るところの
ものである。

【００１８】以上のような事情に鑑み、本発明のＡＬＶ
合成酵素をコードするＤＮＡは、本発明の思想を実質的
に利用して得られ、本発明のＤＮＡと実質的に同一の機
能を有するもの全てを含有するものである。

【００１９】（３）ＡＬＶ遺伝子を持つ組換え体ＤＮＡ
の作製 ＡＬＶの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを含む断
片から、適当な手段を施してＤＮＡ合成に不必要な領域
を欠失させたＤＮＡは、それを適当なベクターＤＮＡに
再び組み込むことにより、宿主細胞に再び導入すること
が出来る。本発明の上記ＡＬＶ合成酵素をコードするＤ
ＮＡを宿主細胞に導入し、そしてそれをその導入された
宿主細胞内で発現させるために用いられるベクターＤＮ
Ａとしては、適当な宿主細胞内で、ＡＬＶ遺伝子を発現
できるものであれば特に制限なく使用し得る。このよう
なベクターＤＮＡとしては、上記ＡＬＶ合成酵素をコー
ドするＤＮＡを組み込むことの出来るものであり、組換
えたベクターＤＮＡで宿主細胞を形質転換できるもので
あり、そして得られた形質転換体の細胞内で導入された
ＡＬＶ合成酵素をコードするＤＮＡの発現ができるもの
であれば特に限定されず、如何なるものも使用すること
ができる。また、このようなベクターＤＮＡとしては、
宿主細胞中で自律複製可能であり、さらに組換え宿主細
胞のみを選別できるような適当な選択マーカーなどが付
与されたものがあげられる。さらにまた、このようなベ
クターＤＮＡは公知のベクターＤＮＡ等から等業者が容
易に製造し得るようなものであってもよい。このような
ベクターＤＮＡとしては、上記（１）記載のベクターが
好適に用いられる。

【００２０】上記ベクターＤＮＡに、上記ＡＬＶ合成酵
素をコードするＤＮＡを組み込むには、先ず、上記ベク
ターＤＮＡに適当な制限酵素を作用させ、得られたベク
ターＤＮＡ断片を、上記ＡＬＶ合成酵素をコードするＤ
ＮＡ断片と混合し、これにＤＮＡリガーゼを作用させる
ことによりなしうる。この際、必要に応じ当該分野で知
られたリンカー付与、ブラントエンド化等の処理を加え
ることもできる。このようにして得られた組換え体ＤＮ
Ａは次に適当な宿主細胞の中に導入される。

【００２１】（４）組換え体ＤＮＡの宿主細胞への導入 上記のようにして作製した組換え体ＤＮＡを導入するた
めの宿主細胞としては、上で得られた組換えベクターで
もって形質転換されて、ＡＬＶ遺伝子を発現させること
ができるようなものであれば、特に制限なく使用するこ
とが出来る。この様な宿主細胞としては、本発明の目的
に沿ってＡＬＶ遺伝子の発現を達成し得る限り、グラム
陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、下
等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞であ
ろうと植物由来細胞であろうと使用できる。ここで、使
用することの出来る宿主細胞としては、本発明のＡＬＶ
合成酵素をコードするＤＮＡの発現が達成され得るもの
があげられ、このような宿主細胞としては、大腸菌、キ
サントモナス属細菌、アセトバクター属細菌、シュード
モナス属細菌、グルコノバクター属細菌、アゾトバクタ
ー属細菌、リゾビウム属細菌、アルカリゲネス属細菌、
クレブシェラ属細菌、サルモネラ属細菌及びセラチア属
細菌から選ばれたものがあげられる。特に好ましい宿主
細胞としては、例えば大腸菌があげられる。

【００２２】上記組換え体ＤＮＡを用いて上記宿主細胞
を形質転換などをするに当たっては、ＤＮＡ組換え技術
において広く知られた方法を適用して行うことが出来
る。このような方法としては、宿主細胞をコンピテント
（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）状態にして形質転換用緩衝液中
で組換え体ＤＮＡ 混合するとか、ヘルパー・ プラスミ
ドを用いて接合伝達により移入するなどの方法があげら
れる。

【００２３】（５）形質転換体によるＡＬＶ合成酵素の
製造 本発明により得られたＡＬＶ生産形質転換体は、それを
栄養培地中で培養せしめ、次に得られた培養物をそのま
まＡＬＶ合成酵素含有物として、あるいは培養物中から
ＡＬＶ合成酵素を単離して、ＡＬＶの合成に用いること
が出来る。ＡＬＶ合成酵素生産形質転換体は、適当な栄
養培地中で培養することにより、それを大量に得ること
が出来る。培養に用いられる培地は微生物の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培地であ
る。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添
加すると望ましい結果が得られる場合が多い。培養は、
好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜６０℃の任意
の範囲に制御して１〜１０日間培養を行えばよい。形質
転換体を用いる場合、使用する菌株に応じてアンピシリ
ン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加
してもよい。

【００２４】大量に培養して得たＡＬＶ生産形質転換体
の細胞あるいはその培養液よりの単離精製にあたって
は、その産生量が非常に高いことからより簡便な方法が
利用できる。このような方法を行うには、まず、生物体
を機械的方法、酵素処理方法、自己溶解法、超音波処理
法などの方法によって破壊し、粗抽出液を得、ついでこ
れを硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウムなどの塩析剤
あるいはアセトン又はエタノールなどの溶媒によるタン
パク質沈殿法、電気泳動法、ゲル濾過法あるいは分子ふ
るいクロマトグラフィー法、限外濾過法、逆相クロマト
グラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法、イオン
交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラ
フィー法、吸着クロマトグラフィー法、などの方法を単
独あるいは適宜組み合わせて用いることが出来る。以
下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。

【００２５】

【実施例】

実施例１ ＡＬＶ合成酵素をコードする遺伝子のクローニング 以下、大腸菌Ｃ６００株をＤＮＡ供与体として用い、該
菌体のＡＬＶ遺伝子を大腸菌の宿主、ベクター系を利用
してクローニングした例を具体的に示す。 （１）ＤＮＡ供与体からの染色体ＤＮＡの調製とその切
断 染色体ＤＮＡの調製はＭａｒｍｕｒ法を一部改良して行
った。即ち、ＤＮＡ供与体である大腸菌Ｃ６００株を１
００ｍｌのＬＢ倍地（１％ポリペプトン、０.５％酵母
エキス、０. ５％ＮａＣｌ；ｐＨ７. ０）で３時間培養
し、培養液から菌体を集菌した後、ＴＥ緩衝液（１０ｍ
Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン( 以下トリ
スと略す) 、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム( 以下ＥＤＴＡと略す) ；ｐＨ８. ０）で洗浄し
た。１２ｍｌのリゾチーム溶液（５０ｍＭ グルコー
ス、２５ｍＭ トリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍｇ／
ｍｌ リゾチーム；ｐＨ８. ０）に懸濁した後、３７℃
で６０分間反応させた。１２. ５％のドデシル硫酸ナト
リウム( 以下ＳＤＳと略す) 水溶液１ｍｌを添加して穏
やかに混合し、次いで１０ｍｌのフェノール／クロロホ
ルム( ４：１) 混合溶媒で処理した後、１５, ０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心して除蛋白を行った。この抽出操作
を３〜４回、界面に沈殿がなくなるまで繰り返し、０.
２ｍｌのＲＮａｓｅ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）で処理した後
さらに一回行った。次いで、エタノールを静かに加え、
ガラス棒を用いて、初め穏やかに、次第に急速に撹拌し
ながら粗ＤＮＡを巻き付けた。ガラス棒を壁に押しつけ
て余分のエタノールを除去した後、９ｍｌの０. １×Ｓ
ＳＣ（０. ０１５Ｍ ＮａＣｌ、０. ００１５Ｍ クエ
ン酸ナトリウム）に一晩かけて溶解した。１０×ＳＳＣ
（１. ５Ｍ ＮａＣｌ、０. １５Ｍ クエン酸ナトリウ
ム）を１ｍｌ添加し、５. ４ｍｌのイソプロピルアルコ
ールを徐々に滴下しながらＤＮＡをガラス棒に巻き付け
た。ガラス棒を８０％エタノール水溶液に浸漬した後、
所定量のＴＥ緩衝液に溶解した。

【００２６】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ記載
の方法に従い、染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲI によ
り部分的に切断した。１２０μｇの染色体ＤＮＡを含む
１２００μl のＥｃｏＲＩ用緩衝液（１０ｍＭ トリ
ス、７ｍＭ ＭｇＣl₂、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ
メルカプトエタノール、０. ０１％ ウシ血清アルブ
ミン；ｐＨ８. ０）に１４単位のＥｃｏＲI を加えて３
７℃で２時間反応させた。反応終了後、６８℃で１０分
間加熱し、エタノール沈殿でＤＮＡを回収後、５０μl
のＴＥ緩衝液に再溶解した。超遠心分離用チューブ（日
立４ＰＡチューブ）に４０、３０、２０及び１０％のシ
ョ糖溶液（１Ｍ ＭａＣｌ、２０ｍＭ トリス、５ｍＭ
ＥＤＴＡ；ｐＨ８. ０）を各１ｍｌ、次いで、上記Ｄ
ＮＡ溶液全量を重層し、分離用超遠心機（日立ＳＣＰ７
０Ｈ；スウィングローターＲＰＳ５６Ｔ）で３２, ００
０ｒｐｍ、２０時間遠心分離した。遠心終了後、密度勾
配フラクショネーター（日立ＤＧＦ−Ｕ）により分子量
分画し、エタノール沈殿によってＤＮＡを回収した。各
画分を所定量のＴＥ緩衝液に溶解し、アガロース・ ゲル
電気泳動でその分子量分布を調べ、５〜１０ＫｂのＤＮ
Ａ断片を含む画分を組換え体ＤＮＡの作成に供した。

【００２７】（２）プラスミドｐＢＲ３２２の調製 プラスミドｐＢＲ３２２の調製は、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
＆ Ｄｏｌｙの方法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，９０）に
従って行った。ｐＢＲ３２２を持つ大腸菌Ｃ６００株の
形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む４
００ｍｌのＬＢ培地で一晩培養した。培養液から菌体を
集菌し、４ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む４ｍｌのグル
コース溶液（５０ｍＭ グルコース、２ｍＭ トリス、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ８. ０）に懸濁して室温で反
応させた。８ｍｌのアルカリＳＤＳ溶液（０. ２Ｎ Ｎ
ａＯＨ、１％ ＳＤＳ）および６ｍｌの酢酸カリウム溶
液（５Ｍ 酢酸カリウム；ｐＨ４. ８）を順次添加して
穏やかに混和してから氷水中に５分間置いた。１５, ０
００ｒｐｍで２０分間遠心して沈殿を除去した後、１
０. ８ｍｌのイソプロピルアルコールを添加して氷中に
１０分間静置し、１５, ０００ｒｐｍで２０分間遠心し
て上澄みを除去した。８０％エタノール水溶液を添加し
て再度遠心した後、減圧下で乾燥した。

【００２８】ＴＥ緩衝液１０ｍｌを加えて沈殿ペレット
を静かに溶解してから１０ｍｇ／ｍｌエチジウム・ ブロ
マイド１ｍｌを添加し、これに１０. ５ｇの塩化セシウ
ムを加えて静かに溶解した。この溶液を１２, ０００ｒ
ｐｍで５分間遠心して沈殿を除去した後、分離用超遠心
機（ローターＲＰＶ４５Ｔ）を用いて４５, ０００ｒｐ
ｍで１６〜２０時間遠心分離した。紫外線照射下で閉環
状ＤＮＡを含む画分１ｍｌを注射器で抜取り、ＮａＣｌ
飽和イソプロピルアルコールで少なくとも５回処理して
エチジウム・ ブロマイドを抽出除去した。ＴＥ緩衝液２
ｍｌ、エタノール６ｍｌを順次加え、−２０℃で１０分
間冷却後１５, ０００ｒｐｍで２０分間遠心し、析出・
沈殿させた。８０％エタノール水溶液で洗浄後減圧下に
乾燥して４００μl のＴＥ緩衝液に溶解した。

【００２９】（３）組換え体ＤＮＡの作製 プラスミドｐＢＲ３２２を１μｇ含む制限酵素ＥｃｏＲ
I 用反応緩衝液１４μlに１２単位のＥｃｏＲI を添加
し、３７℃で１８時間消化反応させた。エタノール沈殿
による回収後、アルカリフォスファターゼ（ベーリンガ
−・ マンハイム社製ＣＩＰ）用緩衝液（５０ｍＭ トリ
ス、０. １ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ８. ０）１９０μl に
溶解し、１００単位／μl のＣＩＰを１０μl 添加して
１時間反応させた。フェノール抽出によりＣＩＰを失活
させた後エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。染色
体ＤＮＡのＥｃｏＲI 部分消化物と混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを含む反応液を加え、１５℃で３０分間反応さ
せた。得られた反応混合物を形質転換に供した。

【００３０】（４）遺伝子のクローニング 宿主菌であるＡＬＶ要求性の大腸菌Ｃ６００株を５０ｍ
ｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で２時間４５分間培養し
た。集菌後直ちに１０ｍｌの冷却したＣｏｍｐｅｔｅｎ
ｔ調製用緩衝液（５０ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１０ｍＭ Ｒ
ｂＣｌ₂ 、０.１Ｍ ＭＯＰＳ；ｐＨ６. ５）に懸濁
し、氷中３０分間静置した。遠心によって上澄を除去後
２. ５ｍｌの同一緩衝液に再懸濁し、氷中で３０分間以
上静置した。供試ＤＮＡを含む微量遠心チューブに１０
０μl の形質転換用緩衝液（１０％ポリエチレングリコ
ール( 分子量1000) 、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭＯ
ＰＳ；ｐＨ７. ２）、２００μl のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ
ｃｅｌｌを採取し、混合後氷中に３０分間０. ８ｍｌ
のＬＢ培地を添加し、３７℃で１時間培養した。１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に０. １
ｍｌずつ溶液を塗布した。３７℃で３日間培養した後、
ＡＬＶを含まない培地上で生育したクローンを選択し
た。

【００３１】（５）ＡＬＶ遺伝子を保持する組換え体プ
ラスミドの調製 ＡＬＶ遺伝子を保持する組換え体プラスミドＤＮＡを持
つ形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
４００ｍｌのＬＢ培地で一晩培養した。培養液から菌体
を集菌し、上記（２）の方法でプラスミドを抽出し、エ
チジウム・ ブロマイド−塩化セシウム密度勾配超遠心法
で精製した。紫外線照射下で閉環状ＤＮＡを含む画分１
ｍｌを注射器で抜取り、ＮａＣｌ飽和イソプロピルアル
コールで少なくとも５回処理してエチジウム・ ブロマイ
ドを抽出除去した。ＴＥ緩衝液２ｍｌ、エタノール６ｍ
ｌを順次加え、−２０℃で１０分間冷却後、１５, ００
０ｒｐｍで２０分間遠心し、析出・ 沈澱させた。８０％
エタノール水溶液で洗浄後減圧下に乾燥して４００μl
のＴＥ緩衝液に溶解した。得られたプラスミドをｐＡＳ
３３２と命名し、その構造を図１に示した。また、この
ようにして得られた形質転換体Ｃ６００（ｐＡＳ３３
２）は、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌
記寄第１２７５７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７５７）とし
て寄託されている。

【００３２】実施例２ ＡＬＶ合成酵素遺伝子の塩基配列の決定 プラスミドｐＡＳ３３２の欠失解析を行い、約３. ９ｋ
ｂのＮａｅＩ／ＰｓｔＩ断片上にＡＬＶ遺伝子が存在す
ることを確認した。この断片を該当する制限酵素でｐＡ
Ｓ３３２から切り出し、エチジウム・ブロマイドを含む
１％アガローズ・ ゲル電気泳動で分離した。目的のＤＮ
Ａ断片を含むゲルを紫外線照射下で切り出し、常法に従
い、ゲル内部からＤＮＡ断片を抽出・ 回収した。Ｎａｅ
Ｉ／ＰｓｔＩ断片の制限酵素切断パターンを図２に示し
た。Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ法によりこの断
片の全塩基配列を決定した。この断片中ＢｇｌIIからＮ
ａｅＩまでの２０６０塩基対の配列を配列表の配列番号
１に示す。塩基配列中にはＡＬＶ遺伝子の全領域が含ま
れていた。塩基配列中には、４６５番目のＡＴＧからは
じまり、１０８６番目のＴＡＡで終わる６２１塩基対の
ＡＬＶ合成酵素に対応するオープンリーディングフレー
ムが存在した。これより、ＡＬＶ合成酵素は２０７個の
アミノ酸残基からなる分子量２３, ０００のタンパク質
であると推定された。

【００３３】実施例３ ＡＬＶ合成酵素遺伝子を有する組換え体ＤＮＡの作製 図３に示したスキームに従い、塩基配列を決定したＤＮ
Ａ領域を含むＰｓｔＩ−ＮａｅＩの約３. ９ｋｂのＤＮ
Ａ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩサイ
トとＰｓｔＩサイトの間に組換えて、ＡＬＶ遺伝子を有
する組換え体ＤＮＡを作製した例を具体的に示す。先に
調製したプラスミドｐＡ３３２を制限酵素ＰｓｔＩおよ
びＮａｅＩで順次切断した。エチジウム・ブロマイドを
含む１％アガロースゲル電気泳動で分離し、目的のＤＮ
Ａ断片を含むゲルを紫外線照射下で切り出した。常法に
従い、ゲル内部からＤＮＡ断片を抽出・回収した。プラ
スミドベクターｐＵＣ１８を制限酵素ＰｓｔＩおよびＳ
ｍａＩで順次切断した。フォスファターゼＣＩＰ（ベー
リンガーマンハイム社製）による脱リン酸化後、上で調
製したＰｓｔＩ／ＮａｅＩ断片と混合してＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結した。こうして得られた組換えプラスミド
で大腸菌Ｃ６００のコンピテントセルを形質転換し、こ
の形質転換体から得られた組換え体ＤＮＡの構造を制限
酵素で切断後のＤＮＡの電気泳動パターンにより確認し
た。このプラスミドをｐＡＳ３３５と命名した。

【００３４】実施例４ 形質転換体のＡＬＶ合成酵素活性 実施例３で得た形質転換体からプラスミドｐＡＳ３３５
を調製した。このプラスミドを再度大腸菌のコンピテン
トセルに形質転換しＡＬＶ生産菌を得た。ｐＡＳ３３５
を持つ大腸菌Ｃ６００株の形質転換体を１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含む４００ｍｌのＬＢ培地で一晩培
養した。得られた菌体を抽出用緩衝液（０. １Ｍ Ｔｒ
ｉｓ( ｐＨ7.9)、０. ３Ｍ グリセロール、１５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、３ｍＭ ジチオスレイトール）で２回洗浄
した。得られた菌体ペレットを同緩衝液に懸濁し、４℃
で超音波破砕した。遠心後上清をアッセー用緩衝液
（０.１Ｍ Ｔｒｉｓ( ｐＨ7.9)、１Ｍ グリセロー
ル、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭ ＤＴＴ）で平衡化
したゲル濾過用セファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア）カラムを通過させることにより、低分子量物質を除
去した。所定量の細胞抽出液にＬ−１−［¹⁴Ｃ］−グル
タミン酸を含むグルタミン酸（ＮＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ）５０μＭ、ＮＡＤＰＨ １ｍＭ、
ＡＴＰ ５ｍＭ、レブリン酸 ５ｍＭ、ピリドキサール
リン酸 ２０μＭ、大腸菌由来グルタミンｔＲＮＡ（ベ
ーリンガー・マンハイム）０. １ ＯＤユニットを採取
し、アッセイ用緩衝液で液量を５０μl に調製した。３
７℃で９０分間インキュベーションした。反応終了後、
２０μl のリン酸緩衝液（ｐＨ６. ８）、アセチルアセ
トン１０μl 、１ｍＭ ＡＬＶ ５μl を添加し、２０
分間湯浴で煮沸後、急速に室温まで冷却した。遠心分離
により変性タンパク質を除去した後、ペーパークロマト
グラフィー（ファットマン３ＭＭ濾紙）で展開した（展
開溶媒、１０Ｎアンモニア：ｎ−ブタノール：水＝１：
４９：５０）。放射活性のあるＡＬＶピロ−ルのスポッ
トを濾紙から切取り、液体シンチレーション・ カウンタ
ーでカウントした。得られた結果を親株およびベクター
ｐＵＣ１８のみによる形質転換体と比較して表１に示し
た。

【表１】

【００３５】

【発明の効果】本発明に従って、配列表の配列番号１に
示したアミノ酸配列を有し、ＡＬＶ合成酵素活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡをあるいは配列表の
配列番号１に示した塩基配列を有するＤＮＡを用いて、
それをベクターに組み込んで得られた組換え体ＤＮＡを
宿主に導入して得られる形質転換体は、効率よくＡＬＶ
合成酵素を生産できるので、ＡＬＶ及びそれを前駆体と
する種々の化合物の合成に利用でき、産業上極めて有用
なものである。

【配列表】

配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ） 株名：Ｃ６００ 配列の特徴 特徴を記す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置： 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGATCTTCTT CATTAAGATT GTGATAATCG CAAAGCCAGC GGATTAACGC CTCTTGCAGG 60 TTGTCCTGCT CTTCAACGCT AAGATAAAGT TCCGTGCGGT TGCACGTCGA CAGCACCACG 120 CCGCCCTGCA CCATCGGCTG CGCAAGCAGG CTGTCAAGCG CCTGATCGAG CTTATCCGGC 180 GAAAACGATA CACGTTCTCG CAGCGATACA GGTGCCGTTT TATGGTTGAT ACCGAGTGCT 240 AAAAGGGTCA TGTCTGCGGG AAATAATACC AACGTTGATA GGGTTAGTCT GCTTGCATCA 300 TACAGGATGC GTAAGATCAA TAAAAGAGAG CGCCCCCTTT TGGAGTAATT GCCGAAAGCC 360 GTTAGATTCT GGCAATTAAG ACAACTTGAA CATAGACGAT AGCGGACGGT AACGCTAGCA 420 TTAAGGGTTA TAACTGCAAC GTATCTCAAG GACTTGTCAT CACT ATG CCC CTG CCC 476 Met Pro Leu Pro 1 GAT TTT CGT CTT ATC CGC CTC GTA CCG CTG GCT GCT CTT GTG CTC ACT 524 Asp Phe Arg Leu IIe Arg Leu Val Pro Leu Ala Ala Leu Val Leu Thr 5 10 15 20 GCC TGT TCC GTT ACC ACG CCC AAA GGT CCT GGC AAA AGC CCG GAT TCG 572 Ala Cys Ser Val Thr Thr Pro Lys Gly Pro Gly Lys Ser Pro Asp Ser 25 30 35 CCA CAA TGG CGT CAG CAT CAG CAA GAC GTG CGC AAT CTT AAT CAG TAT 620 Pro Gln Trp Arg Gln His Gln Gln Asp Val Arg Asn Leu Asn Gln Tyr 40 45 50 CAG ACT CGC GGC GCG TTC GCT TAT ATT TCT GAC CAA CAA AAA GTG TAC 668 Gln Thr Arg Gly Ala Phe Ala Tyr Ile Ser Asp Gln Gln Lys Val Tyr 55 60 65 GCC CGC TTT TTC TGG CAG CAA ACC GGC CAG GAT CGC TAC CGT CTG CTG 716 Ala Arg Phe Phe Trp Gln Gln Thr Gly Gln Asp Arg Tyr Arg Leu Leu 70 75 80 CTC ACT AAC CCA TTG GGC AGC ACG GAA CTG GAG CTG AAT GCT CAA CCG 764 Leu Thr Asn Pro Leu Gly Ser Thr Glu Leu Glu Leu Asn Ala Gln Pro 85 90 95 100 GGT AAC GTG CAG TTA GTC GAC AAT AAA GGT CAG CGT TAT ACC GCC GAT 812 Gly Asn Val Gln Leu Val Asp Asn Lys Gly Gln Arg Tyr Thr Ala Asp 105 110 115 GAC GCC GAA GAG ATG ATT GGC AAA TTG ACC GGA ATG CCA ATT CCG CTC 860 Asp Ala Glu Glu Met Ile Gly Lys Leu Thr Gly Met Pro Ile Pro Leu 120 125 130 AAC AGC TTG CGC CAG TGG ATT TTA GGT TTA CCG GGT GAT GCA ACC GAC 908 Asn Ser Leu Arg Gln Trp Ile Leu Gly Leu Pro Gly Asp Ala Thr Asp 135 140 145 TAC AAA CTG GAC GAC CAG TAC CGC CTG AGC GAA ATT ACC TAC AGC CAG 956 Tyr Lys Leu Asp Asp Gln Tyr Arg Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Ser Gln 150 155 160 AAT GGC AAA AAC TGG AAG GTT GTT TAT GGT GGT TAT GAC ACC AAA ACG 1004 Asn Gly Lys Asn Trp Lys Val Val Tyr Gly Gly Tyr Asp Thr Lys Thr 165 170 175 180 CAA CCT GCG ATG CCA GCC AAT ATG GAA CTC ACC GAC GGT GGT CAA CGC 1052 Gln Pro Ala Met Pro Ala Asn Met Glu Leu Thr Asp Gly Gly Gln Arg 185 190 195 ATC AAG TTA AAA ATG GAT AAC TGG ATA GTG AAA TAATG CGGACACAGT 1100 Ile Lys Leu Lys Met Asp Asn Trp Ile Val Lys 200 205 GGCCCTCTCC GGCAAAACTT AATCTGTTTT TATACATTAC CGGTCAGCGT GCGGATGGTT 1160 ACCACACGCT GCAAACGCTG TTTCAGTTTC TTGATTACGG CGACACCATC AGCATTGAGC 1220 TTCGTGACGA TGGGATATTC GTCTGTTAAC GCCCGTTGAA GGCGTGGAAC ATGAAGATAA 1280 CCTGATCGTT CGCGCAGCGC GATTGTTGAT GAAAACTGCG GCAGACAGCG GGCGTCTTCC 1340 GACGGGAAGC GGTGCGAATA TCAGCATTGA CAAGCGTTTG CCGATGGGCG GCGGTCTCGG 1400 CGGTGGTTCA TCCAATGCCG CGACGGTCCT GGTGGCATTA AATCATCTCT GGCAATGCGG 1460 GCTAAGCATG GATGAGCTGG CGGAAATGGG GCTGACGCTG GGCGCAGATG TTCCTGTCTT 1530 TGTTCGGGGG CATGCCGCGT TTGCCGAAGG CGTTGGTGAA ATACTAACGC CGGTGGATCC 1580 GCCAGAGAAG TGGTATCTGG TGGCGCACCC TGGTGTAAGT ATTCCGACTC CGGTGATTTT 1640 TAAAGATCCT GAACTCCCGC GCAATACGCC AAAAAGGTCA ATAGAAACGT TGCTAAAATG 1700 TGAATTCACC CAGGCGTACG GGCGGGCGAA TACCAAAGGC GCTCCATTCA GGAGAACGGC 1760 GGTAAAGTGC AGGAGTCTGG GCAAACTGCT TCTTGAATGC GCGGGTAAAT GTCTGTTGAG 1820 AGTCGAAGCG GTATTGCAGC GCGATGTCCA GAATCGGACG CGCAGTCAGG CGTAGTGCGA 1880 CCGCCGATTT CGACAAACGA CGAGCACGAA TATACGCGCC AATAGCATGG CCAGTGACAT 1940 CTTTAAACAT TCTCTGTAAG TGCCACTTGG AATAACCTGC TTCGCCGCTA CATTGTCGAG 2000 CGACAGGGGC TGATCCAGAT GACCTTCCAG CCTGATTAAA AGGTCGCGAA TAATGCCGGC 2060

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えプラスミドｐＡＳ３３２の構造を示す。

【図２】ＡＬＶ遺伝子を含むＮａｅＩ／ＰｓｔＩ断片の
制限酵素切断パターンである。

【図３】組換えプラスミドｐＡＳ３３５の作製方法の概
略図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
   列を有し、δ−アミノレブリン酸合成活性を有するポリ
   ペプチドをコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示した塩基配列を
   有する請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
   列を有し、δ−アミノレブリン酸合成活性を有するポリ
   ペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んでな
   る組換え体ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 ポリペプチドをコードするＤＮＡが配列
   表の配列番号１に示した塩基配列を有するものである請
   求項３記載の組換え体ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
   列を有し、δ−アミノレブリン酸合成活性を有するポリ
   ペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んでな
   る組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項４に記載の組換え体ＤＮＡで形質
   転換せしめられた形質転換体である請求項５記載の形質
   転換体。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
   列を有し、δ−アミノレブリン酸合成活性を有するポリ
   ペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んでな
   る組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換体を
   培養し、次に得られたδ−アミノレブリン酸合成酵素を
   採取することを特徴とするδ−アミノレブリン酸合成酵
   素の製造法。
8. 【請求項８】 該形質転換体が請求項６記載のものであ
   る請求項７記載の製造法。