JP2763213B2 - 光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法 - Google Patents
光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、 一般式
【０００２】
【化３】
【０００３】(式中、 R1 はアルキル基、アラルキル基
またはアリール基、 R2 及び R3 はアルキル基、ｎは１
または２を示す) で表されるカルボン酸エステルのラセ
ミ体（以下、カルボン酸エステル〔Ｉ〕という。）を不
斉加水分解するエステラーゼをコードするＤＮＡ断片を
組み込んだプラスミドＤＮＡにより宿主微生物を形質転
換した形質転換微生物を用いて不斉加水分解することか
ら成る光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製
造法に関する。
またはアリール基、 R2 及び R3 はアルキル基、ｎは１
または２を示す) で表されるカルボン酸エステルのラセ
ミ体（以下、カルボン酸エステル〔Ｉ〕という。）を不
斉加水分解するエステラーゼをコードするＤＮＡ断片を
組み込んだプラスミドＤＮＡにより宿主微生物を形質転
換した形質転換微生物を用いて不斉加水分解することか
ら成る光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製
造法に関する。
【０００４】
一般式
【０００５】
【化４】
【０００６】(式中、 R1, R2,ｎは前記と同様) で表さ
れる光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルは、種
々の生理活性物質の合成原料として有用であり、本発明
者らは、既に、一般式〔Ｉ〕で表されるカルボン酸エス
テルのラセミ体を酵素や微生物を用いて不斉加水分解す
る方法を初めて提案している (例えば特開昭60-12992号
公報、同60-12993号公報など参照) 。
れる光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルは、種
々の生理活性物質の合成原料として有用であり、本発明
者らは、既に、一般式〔Ｉ〕で表されるカルボン酸エス
テルのラセミ体を酵素や微生物を用いて不斉加水分解す
る方法を初めて提案している (例えば特開昭60-12992号
公報、同60-12993号公報など参照) 。
【０００７】本発明者らは更にこの不斉加水分解活性の
高いエステラーゼ生産菌株として、土壌より分離取得し
たシュードモナス プチダ微工研条寄第３８４６号を提
案している（特開平１−２２２７９８号公報参照）。一
方、現在では、より一層酵素活性の高い微生物を取得す
るための手段として組換えＤＮＡ技術がしばしば用いら
れているが、上記の反応に関与するエステラーゼの生産
能力を向上させることを目的としたものとしては、ＤＮ
Ａ断片としてシュードモナス フルオレセンス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ３
０１８由来のエステラーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ
断片を調製し、該ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドＤ
ＮＡにより宿主微生物を形質転換して得た形質転換微生
物を使用する方法が知られている（特開平１−６７１９
０号公報）。
高いエステラーゼ生産菌株として、土壌より分離取得し
たシュードモナス プチダ微工研条寄第３８４６号を提
案している（特開平１−２２２７９８号公報参照）。一
方、現在では、より一層酵素活性の高い微生物を取得す
るための手段として組換えＤＮＡ技術がしばしば用いら
れているが、上記の反応に関与するエステラーゼの生産
能力を向上させることを目的としたものとしては、ＤＮ
Ａ断片としてシュードモナス フルオレセンス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ３
０１８由来のエステラーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ
断片を調製し、該ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドＤ
ＮＡにより宿主微生物を形質転換して得た形質転換微生
物を使用する方法が知られている（特開平１−６７１９
０号公報）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上記のようなカルボン
酸エステル［Ｉ］を不斉加水分解するに際しては、酵素
の精製等の繁雑な操作を省いて菌体そのものを酵素源と
して使用することが通常為される。この手法において効
率的な反応を行うためには、菌体の酵素活性が高いこと
は勿論、酵素自体の性質として光学純度の高いカルボン
酸の生成能を有すること、かつ温度やpH等の反応諸条件
に対して安定性が高いことが必要である。とくに熱安定
性の劣る酵素は経時的に熱失活が起こるため反応温度上
昇による反応速度向上、あるいは酵素回収再利用といっ
たことを図ることが難しく、効率的な反応を行うために
は熱安定性が良好な酵素を産生する菌体を取得すること
が必要である。
酸エステル［Ｉ］を不斉加水分解するに際しては、酵素
の精製等の繁雑な操作を省いて菌体そのものを酵素源と
して使用することが通常為される。この手法において効
率的な反応を行うためには、菌体の酵素活性が高いこと
は勿論、酵素自体の性質として光学純度の高いカルボン
酸の生成能を有すること、かつ温度やpH等の反応諸条件
に対して安定性が高いことが必要である。とくに熱安定
性の劣る酵素は経時的に熱失活が起こるため反応温度上
昇による反応速度向上、あるいは酵素回収再利用といっ
たことを図ることが難しく、効率的な反応を行うために
は熱安定性が良好な酵素を産生する菌体を取得すること
が必要である。
【０００９】菌体の酵素活性の高める方法としては前記
特開平１-67190号に開示されているように組み換えＤＮ
Ａ技術が有効である。一方、酵素自体の性質は、本質的
には酵素をコードしたＤＮＡに対応しており、上記諸条
件に対する安定性の高い酵素を取得しようとすれば、ま
ず諸反応条件に対して安定性の優れた酵素をコードする
ＤＮＡ断片を見いだす必要がある。
特開平１-67190号に開示されているように組み換えＤＮ
Ａ技術が有効である。一方、酵素自体の性質は、本質的
には酵素をコードしたＤＮＡに対応しており、上記諸条
件に対する安定性の高い酵素を取得しようとすれば、ま
ず諸反応条件に対して安定性の優れた酵素をコードする
ＤＮＡ断片を見いだす必要がある。
【００１０】しかしながら、前記したように特開平１-6
7190号においては、シュードモナスフルオレセンス (Ps
eudomonas fluorescens) IFO 3018由来のエステラーゼ
をコードしたＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドＤＮＡ
から成る形質転換微生物が開示されているが、この菌株
のエステラーゼは熱安定性が劣り、例えば45℃以上の温
度では数時間で失活してしまう問題点を有していた。
7190号においては、シュードモナスフルオレセンス (Ps
eudomonas fluorescens) IFO 3018由来のエステラーゼ
をコードしたＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドＤＮＡ
から成る形質転換微生物が開示されているが、この菌株
のエステラーゼは熱安定性が劣り、例えば45℃以上の温
度では数時間で失活してしまう問題点を有していた。
【００１１】そこで、本発明の課題は、カルボン酸エス
テル〔Ｉ〕を不斉加水分解するに際し、熱安定性の優れ
たエステラーゼをコードするＤＮＡ断片を調製し、この
ＤＮＡ断片を含みかつ良好な発現性を有する形質転換微
生物を用いて、該不斉加水分解を効率良く行うことにあ
る。
テル〔Ｉ〕を不斉加水分解するに際し、熱安定性の優れ
たエステラーゼをコードするＤＮＡ断片を調製し、この
ＤＮＡ断片を含みかつ良好な発現性を有する形質転換微
生物を用いて、該不斉加水分解を効率良く行うことにあ
る。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記カル
ボン酸エステル［Ｉ］を効率良く不斉加水分解するべく
有効な酵素源を用いる方法に関して鋭意研究した結果、
本発明者らが土壌から分離した、シュードモナス プチ
ダ微工研条寄第３８４６号からクローニングされたエス
テラーゼ遺伝子を含む形質転換微生物の菌体を用いれ
ば、該菌体が高い酵素活性を有するとともに、該酵素は
５０℃以上の高温反応でも経時的な熱失活が起きないこ
とにより極めて収率良くかつ短時間に反応を行うことが
できることを見いだし、本発明に至った。
ボン酸エステル［Ｉ］を効率良く不斉加水分解するべく
有効な酵素源を用いる方法に関して鋭意研究した結果、
本発明者らが土壌から分離した、シュードモナス プチ
ダ微工研条寄第３８４６号からクローニングされたエス
テラーゼ遺伝子を含む形質転換微生物の菌体を用いれ
ば、該菌体が高い酵素活性を有するとともに、該酵素は
５０℃以上の高温反応でも経時的な熱失活が起きないこ
とにより極めて収率良くかつ短時間に反応を行うことが
できることを見いだし、本発明に至った。
【００１３】すなわち本発明は、 一般式
【００１４】
【化５】
【００１５】(式中、 R1 はアルキル基、アラルキル基
またはアリール基、 R2 及び R3 はアルキル基、ｎは１
または２を示す) で表されるカルボン酸エステルのラセ
ミ体に、配列番号１の塩基配列又はその一部から成るＤ
ＮＡ断片を連結した組み換え体プラスミドを含む形質転
換微生物の培養液、菌体または菌体処理物を作用させる
ことを特徴とする、 一般式
またはアリール基、 R2 及び R3 はアルキル基、ｎは１
または２を示す) で表されるカルボン酸エステルのラセ
ミ体に、配列番号１の塩基配列又はその一部から成るＤ
ＮＡ断片を連結した組み換え体プラスミドを含む形質転
換微生物の培養液、菌体または菌体処理物を作用させる
ことを特徴とする、 一般式
【００１６】
【化６】
【００１７】(式中、 R1, R1 及びｎは前記と同様) で
表される光学活性カルボン酸（以下、光学活性カルボン
酸〔II〕という）及びその対掌体エステルの製造法に関
するものである。上記一般式［Ｉ］及び［II］の置換基
R1 において、アルキル基としては例えばメチル基、エ
チル基などが、アラルキル基としては例えばベンジル基
が、アリール基としては、例えばフェニル基がそれぞれ
挙げられ、置換基 R2 又は R3 のアルキル基としては、
例えばメチル基、エチル基が挙げられる。そして、カル
ボン酸エステル［Ｉ］としては、例えばβ−アセチルチ
オ−α−メチルプロピオン酸メチル、Ｓ−アセチル−β
−メルカプトイソ酪酸メチル、Ｓ−アセチル−γ−メル
カプト−α−メチル−ｎ−酪酸メチル、Ｓ−ベンゾイル
−β−メルカプトイソ酪酸メチル、Ｓ−フェニルアセチ
ル−β−メルカプトイソ酪酸メチル等が挙げられる。
表される光学活性カルボン酸（以下、光学活性カルボン
酸〔II〕という）及びその対掌体エステルの製造法に関
するものである。上記一般式［Ｉ］及び［II］の置換基
R1 において、アルキル基としては例えばメチル基、エ
チル基などが、アラルキル基としては例えばベンジル基
が、アリール基としては、例えばフェニル基がそれぞれ
挙げられ、置換基 R2 又は R3 のアルキル基としては、
例えばメチル基、エチル基が挙げられる。そして、カル
ボン酸エステル［Ｉ］としては、例えばβ−アセチルチ
オ−α−メチルプロピオン酸メチル、Ｓ−アセチル−β
−メルカプトイソ酪酸メチル、Ｓ−アセチル−γ−メル
カプト−α−メチル−ｎ−酪酸メチル、Ｓ−ベンゾイル
−β−メルカプトイソ酪酸メチル、Ｓ−フェニルアセチ
ル−β−メルカプトイソ酪酸メチル等が挙げられる。
【００１８】本発明にかかわるＤＮＡ断片の特徴である
配列番号１の塩基配列は、実施例１で得た組み換え体プ
ラスミドの全塩基配列を調査の上、活性に必須の領域と
ＳＤ配列などから決定されたものであるがその決定法詳
細は実施例１に記載の通りである。本願発明にかかわる
ＤＮＡ断片供与体としてはシュードモナス プチダ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）微工研条寄第３
８４６号が適当である。本菌株からのエステラーゼ遺伝
子を含むＤＮＡ断片のクローニング、組み換え体プラス
ミドの調製、組み換え体プラスミドの微生物への導入は
例えば実施例に記載した方法で実施可能である。
配列番号１の塩基配列は、実施例１で得た組み換え体プ
ラスミドの全塩基配列を調査の上、活性に必須の領域と
ＳＤ配列などから決定されたものであるがその決定法詳
細は実施例１に記載の通りである。本願発明にかかわる
ＤＮＡ断片供与体としてはシュードモナス プチダ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）微工研条寄第３
８４６号が適当である。本菌株からのエステラーゼ遺伝
子を含むＤＮＡ断片のクローニング、組み換え体プラス
ミドの調製、組み換え体プラスミドの微生物への導入は
例えば実施例に記載した方法で実施可能である。
【００１９】本願発明の熱安定性の優れたエステラーゼ
遺伝子を形質転換された微生物はＤＮＡ供与体である親
株シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ）微工研条寄第３８４６号と同様の酵素学
的性質を有し、また多コピープラスミドに連結すること
で親株に比べて遙かに高活性を発現する。この形質転換
微生物は、これを含む培養液、菌体または菌体処理物と
して反応に用いられる。
遺伝子を形質転換された微生物はＤＮＡ供与体である親
株シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ）微工研条寄第３８４６号と同様の酵素学
的性質を有し、また多コピープラスミドに連結すること
で親株に比べて遙かに高活性を発現する。この形質転換
微生物は、これを含む培養液、菌体または菌体処理物と
して反応に用いられる。
【００２０】これら形質転換微生物の培養は、通常は液
体培養で行われるが、固体培養によっても行うことがで
きる。培地としては、例えばＬＢ培地が用いられる。培
養は10〜50℃の温度で、pH２〜11の範囲で行われる。微
生物の生育を促進させるために通気攪拌を行ってもよ
い。加水分解反応を行うに際しては、培養の開始時又は
途中で培地にカルボン酸エステル〔Ｉ〕を添加してもよ
く、あらかじめ微生物を培養したのち培養液にカルボン
酸エステル〔Ｉ〕を添加してもよい。また増殖した微生
物の菌体を遠心分離等により採取し、これをカルボン酸
エステルを含む反応媒体に加えてもよい。この場合菌体
は取り扱い上の便宜から、乾燥菌体例えば凍結乾燥菌
体、噴霧乾燥菌体又は有機溶媒例えばアセトン、トルエ
ン等で処理した菌体、あるいは菌体破壊物、菌体抽出物
等の菌体処理物を用いることもできる。反応媒体として
は例えばイオン交換水又は緩衝液が用いられる。反応媒
体又は培養液中のカルボン酸エステルの濃度は0.01〜50
重量％が好ましい。カルボン酸エステルは水に懸濁した
状態で加えることもできる。メタノール、アセトンなど
の有機溶媒を反応液に加えてエステルの溶解性を向上さ
せることもできる。反応液のpHは２〜11、好ましくは５
〜８の範囲である。反応が進行するに伴い生成した光学
活性カルボン酸により反応液のpHが低下してくるが、こ
の場合は適当な中和剤で最適なpHに維持することが好ま
しい。反応温度に関しては本願発明の形質転換微生物の
生産する酵素は極めて熱安定性が良好であるため、５〜
80℃で反応が可能であるが、この菌株生成酵素の特徴を
生かすためにも好ましくは40℃以上が好ましい。酵素活
性を維持しつつ高温反応が可能となる。
体培養で行われるが、固体培養によっても行うことがで
きる。培地としては、例えばＬＢ培地が用いられる。培
養は10〜50℃の温度で、pH２〜11の範囲で行われる。微
生物の生育を促進させるために通気攪拌を行ってもよ
い。加水分解反応を行うに際しては、培養の開始時又は
途中で培地にカルボン酸エステル〔Ｉ〕を添加してもよ
く、あらかじめ微生物を培養したのち培養液にカルボン
酸エステル〔Ｉ〕を添加してもよい。また増殖した微生
物の菌体を遠心分離等により採取し、これをカルボン酸
エステルを含む反応媒体に加えてもよい。この場合菌体
は取り扱い上の便宜から、乾燥菌体例えば凍結乾燥菌
体、噴霧乾燥菌体又は有機溶媒例えばアセトン、トルエ
ン等で処理した菌体、あるいは菌体破壊物、菌体抽出物
等の菌体処理物を用いることもできる。反応媒体として
は例えばイオン交換水又は緩衝液が用いられる。反応媒
体又は培養液中のカルボン酸エステルの濃度は0.01〜50
重量％が好ましい。カルボン酸エステルは水に懸濁した
状態で加えることもできる。メタノール、アセトンなど
の有機溶媒を反応液に加えてエステルの溶解性を向上さ
せることもできる。反応液のpHは２〜11、好ましくは５
〜８の範囲である。反応が進行するに伴い生成した光学
活性カルボン酸により反応液のpHが低下してくるが、こ
の場合は適当な中和剤で最適なpHに維持することが好ま
しい。反応温度に関しては本願発明の形質転換微生物の
生産する酵素は極めて熱安定性が良好であるため、５〜
80℃で反応が可能であるが、この菌株生成酵素の特徴を
生かすためにも好ましくは40℃以上が好ましい。酵素活
性を維持しつつ高温反応が可能となる。
【００２１】反応液又は培養液からの生成物の分離精製
は、通常の方法例えば抽出、再結晶、カラムクロマトグ
ラフィ等により行うことができる。 実施例１ １）エステラーゼ遺伝子をコードしたＤＮＡ断片のクロ
ーニング Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（微工研条寄第
３８４６号）の培養菌体より、Ｍａｒｍｕｒ等の方法
［Ｊ．Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２０８，（１９６１）］にしたが
って染色体ＤＮＡを調製した。これを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ で部分分解しＤＮＡ断片を得た。一方、ベクタープ
ラスミドｐＵＣ１９を同酵素で切断した。ＥｃｏＲＩ切
断により直線状となったｐＵＣ１９とＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｐｕｔｉｄａからのＤＮＡ断片とを混ぜ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで末端を結合させることにより雑種Ｄ
ＮＡを形成させた。これを、あらかじめＣａＣｌ２処理
により外来ＤＮＡを受け入れやすくした宿主微生物のＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の一つで
あるＪＭ１０５株に導入した。ｐＵＣ１９を含むＪＭ１
０５株をアンピシリンとＩＰＴＧ、ＸＧａｌを含むＬＢ
寒天培地で増殖させるとＪＭ１０５株内で発現されたβ
−ガラクトシダーゼ活性によりＸＧａｌが切断され青色
のコロニーを形成した。ここでｐＵＣ１９のマルチクロ
ーニング部位に外来ＤＮＡ断片が挿入された場合はβ−
ガラクトーダーゼ活性は発現されずコロニーは無色にな
ることを利用してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄ
ａ由来のエステラーゼ遺伝子を発現する形質転換株を選
び出すために、アンピシリンとＩＰＴＧ、ＸＧａｌを含
むＬＢ寒天培地において無色のコロニーを選択し、その
うちでエステラーゼ活性を発現する株をスクリーニング
した。エステラーゼ遺伝子を持つＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５株の検索は以下のように行っ
た。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１
％ブロモクレゾールパープル、１００ｐｐｍ（±）−β
−アセチルチオ−α−メチルプロピオン酸メチルを染み
込ませたロ紙にコロニーを移し室温にて数時間放置し
た。エステラーゼ活性を持つコロニーは酸を生成しコロ
ニー付近のｐＨは低下した。ｐＨ指示薬であるブロモク
レゾールパープルは青紫色から黄色に変化するため、肉
眼観察によりエステラーゼ遺伝子を持つ株を得ることが
出来た。
は、通常の方法例えば抽出、再結晶、カラムクロマトグ
ラフィ等により行うことができる。 実施例１ １）エステラーゼ遺伝子をコードしたＤＮＡ断片のクロ
ーニング Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（微工研条寄第
３８４６号）の培養菌体より、Ｍａｒｍｕｒ等の方法
［Ｊ．Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２０８，（１９６１）］にしたが
って染色体ＤＮＡを調製した。これを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ で部分分解しＤＮＡ断片を得た。一方、ベクタープ
ラスミドｐＵＣ１９を同酵素で切断した。ＥｃｏＲＩ切
断により直線状となったｐＵＣ１９とＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｐｕｔｉｄａからのＤＮＡ断片とを混ぜ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで末端を結合させることにより雑種Ｄ
ＮＡを形成させた。これを、あらかじめＣａＣｌ２処理
により外来ＤＮＡを受け入れやすくした宿主微生物のＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の一つで
あるＪＭ１０５株に導入した。ｐＵＣ１９を含むＪＭ１
０５株をアンピシリンとＩＰＴＧ、ＸＧａｌを含むＬＢ
寒天培地で増殖させるとＪＭ１０５株内で発現されたβ
−ガラクトシダーゼ活性によりＸＧａｌが切断され青色
のコロニーを形成した。ここでｐＵＣ１９のマルチクロ
ーニング部位に外来ＤＮＡ断片が挿入された場合はβ−
ガラクトーダーゼ活性は発現されずコロニーは無色にな
ることを利用してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄ
ａ由来のエステラーゼ遺伝子を発現する形質転換株を選
び出すために、アンピシリンとＩＰＴＧ、ＸＧａｌを含
むＬＢ寒天培地において無色のコロニーを選択し、その
うちでエステラーゼ活性を発現する株をスクリーニング
した。エステラーゼ遺伝子を持つＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５株の検索は以下のように行っ
た。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１
％ブロモクレゾールパープル、１００ｐｐｍ（±）−β
−アセチルチオ−α−メチルプロピオン酸メチルを染み
込ませたロ紙にコロニーを移し室温にて数時間放置し
た。エステラーゼ活性を持つコロニーは酸を生成しコロ
ニー付近のｐＨは低下した。ｐＨ指示薬であるブロモク
レゾールパープルは青紫色から黄色に変化するため、肉
眼観察によりエステラーゼ遺伝子を持つ株を得ることが
出来た。
【００２２】この形質転換株から再びプラスミドＤＮＡ
を取り出し、これを種々の制限酵素で切断し、より小さ
なＤＮＡ断片を持つプラスミドpPE101、pPE110、pPE11
1、pPE112、pPE113、pPE114、pPE115及びpPE116を作成
した。これらのプラスミドによってE.coliJM105 を形質
転換した株のエステラーゼ活性の有無によって、エステ
ラーゼ遺伝子の位置を知ることが出来た〔図１参照〕。
を取り出し、これを種々の制限酵素で切断し、より小さ
なＤＮＡ断片を持つプラスミドpPE101、pPE110、pPE11
1、pPE112、pPE113、pPE114、pPE115及びpPE116を作成
した。これらのプラスミドによってE.coliJM105 を形質
転換した株のエステラーゼ活性の有無によって、エステ
ラーゼ遺伝子の位置を知ることが出来た〔図１参照〕。
【００２３】なお、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５をプラスミ
ドｐＰＥ１１６で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０
５（ｐＰＥ１１６）は工業技術院微生物工業技術研究所
にＭＲ−２１０１として寄託し、その寄託番号は微工研
条寄第３８３８号である。 ２）エステラーゼ遺伝子の塩基配列の決定と予想される
アミノ酸配列 ｐＰＥ１１６に含まれる親株由来のＤＮＡ断片の全塩基
配列を、Ｍ１３ ファージベクターを用いたｄｉｄｅｏ
ｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ法〔Ｆ．Ｓａ
ｎｇｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２１４，１２０５（１９
８１）〕により決定した。その結果、親株由来の約１．
２ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列は、配列番号２に示した
通りであった。配列番号２の塩基配列について検討し、
活性に必須な領域をカバーするオープンリーディングフ
レームは唯一つしか存在しないこと、ＳＤ配列が開始コ
ドンの数ベース上流に存在することなどから判断して配
列番号１に示した塩基配列がエステラーゼの構造遺伝子
であることが明らかとなった。また、この塩基配列から
予想されるエステラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２
の３０２番目より１１３２番目の塩基に相当する配列の
下段に示した通りである。 ３） （±）−β−アセチルチオ−α−メチルプロピオ
ン酸メチルの不斉加水分解 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５（ｐＰＥ１１６）をアンピシ
リン５０μｇ／ｍｌを含む５００ｍｌのＬＢ培地にて３
７℃一夜振盪培養した後、遠心分離により菌体を得た。
この菌体全量を５％（±）−β−アセチル−α−メチル
プロピオン酸メチル２００ｍｌに懸濁して、０．１Ｎ
ＮａＯＨでｐＨ７．０に制御しながら、４５℃にて３時
間反応を行った。反応終了後、菌体を遠心分離により除
き、上澄より未反応のβ−アセチルチオ−α−メチルプ
ロピオン酸メチルを酢酸エチルで抽出除去した。次いで
抽出残液の水層のｐＨを希硫酸で２．０以下に下げた
後、β−アセチルチオ−α−メチルプロピオン酸を酢酸
エチルで抽出した。そしてその抽出液に無水硫酸ナトリ
ウムを加えて脱水処理したのち溶媒を蒸発除去し、油状
物を得た。一部を取り水で希釈後ＨＰＬＣによりβ−ア
セチルチオ−α−メチルプロピオン酸を定量した。また
一部はクロロホルムに溶解し、自動旋光計（ユニオン技
研ＰＭ−１０１型）で旋光度を測定した。その結果、目
的の生成物は１．５ｇ得られ、比旋光度は
ドｐＰＥ１１６で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０
５（ｐＰＥ１１６）は工業技術院微生物工業技術研究所
にＭＲ−２１０１として寄託し、その寄託番号は微工研
条寄第３８３８号である。 ２）エステラーゼ遺伝子の塩基配列の決定と予想される
アミノ酸配列 ｐＰＥ１１６に含まれる親株由来のＤＮＡ断片の全塩基
配列を、Ｍ１３ ファージベクターを用いたｄｉｄｅｏ
ｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ法〔Ｆ．Ｓａ
ｎｇｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２１４，１２０５（１９
８１）〕により決定した。その結果、親株由来の約１．
２ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列は、配列番号２に示した
通りであった。配列番号２の塩基配列について検討し、
活性に必須な領域をカバーするオープンリーディングフ
レームは唯一つしか存在しないこと、ＳＤ配列が開始コ
ドンの数ベース上流に存在することなどから判断して配
列番号１に示した塩基配列がエステラーゼの構造遺伝子
であることが明らかとなった。また、この塩基配列から
予想されるエステラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２
の３０２番目より１１３２番目の塩基に相当する配列の
下段に示した通りである。 ３） （±）−β−アセチルチオ−α−メチルプロピオ
ン酸メチルの不斉加水分解 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５（ｐＰＥ１１６）をアンピシ
リン５０μｇ／ｍｌを含む５００ｍｌのＬＢ培地にて３
７℃一夜振盪培養した後、遠心分離により菌体を得た。
この菌体全量を５％（±）−β−アセチル−α−メチル
プロピオン酸メチル２００ｍｌに懸濁して、０．１Ｎ
ＮａＯＨでｐＨ７．０に制御しながら、４５℃にて３時
間反応を行った。反応終了後、菌体を遠心分離により除
き、上澄より未反応のβ−アセチルチオ−α−メチルプ
ロピオン酸メチルを酢酸エチルで抽出除去した。次いで
抽出残液の水層のｐＨを希硫酸で２．０以下に下げた
後、β−アセチルチオ−α−メチルプロピオン酸を酢酸
エチルで抽出した。そしてその抽出液に無水硫酸ナトリ
ウムを加えて脱水処理したのち溶媒を蒸発除去し、油状
物を得た。一部を取り水で希釈後ＨＰＬＣによりβ−ア
セチルチオ−α−メチルプロピオン酸を定量した。また
一部はクロロホルムに溶解し、自動旋光計（ユニオン技
研ＰＭ−１０１型）で旋光度を測定した。その結果、目
的の生成物は１．５ｇ得られ、比旋光度は
【００２４】
【数１】
【００２５】で親株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ
ｉｄａ微工研条寄第３８４６号）による生成物の比旋光
度−５８．３とほぼ同等であった。 実施例２ １）ｐＰＥ１１７の作製 ｐＰＥ１１６をＰｓｔＩで完全消化し、３．４ｋｂ，
０．４ｋｂのフラグメントを回収しリガーゼを用いて連
結した。この組換え体プラスミドをＥ．ｃｏｌｉＣ６０
０のコンペテントセルに形質転換し、実施例１と同様に
してエステラーゼ活性を示す株を選択し、その株の保有
するプラスミドをｐＰＥ１１７と命名した。このｐＰＥ
１１７は、ｐＰＥ１１６中に含まれるＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓｐｕｔｉｄａ由来のＤＮＡのうち、ＰｓｔＩ−Ｓ
ｍａＩの０．２ｋｂフラグメントを欠失したものであ
る。 ２）エステラーゼ活性の測定 上記の形質転換株の培養菌体を用い、実施例１と同様に
して（±）−β−アセチルチオ−α−メチルプロピオン
酸メチルの不斉加水分解反応を行なった。このうち、初
期１時間の酵素活性を測定し、親株と比較した。
ｉｄａ微工研条寄第３８４６号）による生成物の比旋光
度−５８．３とほぼ同等であった。 実施例２ １）ｐＰＥ１１７の作製 ｐＰＥ１１６をＰｓｔＩで完全消化し、３．４ｋｂ，
０．４ｋｂのフラグメントを回収しリガーゼを用いて連
結した。この組換え体プラスミドをＥ．ｃｏｌｉＣ６０
０のコンペテントセルに形質転換し、実施例１と同様に
してエステラーゼ活性を示す株を選択し、その株の保有
するプラスミドをｐＰＥ１１７と命名した。このｐＰＥ
１１７は、ｐＰＥ１１６中に含まれるＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓｐｕｔｉｄａ由来のＤＮＡのうち、ＰｓｔＩ−Ｓ
ｍａＩの０．２ｋｂフラグメントを欠失したものであ
る。 ２）エステラーゼ活性の測定 上記の形質転換株の培養菌体を用い、実施例１と同様に
して（±）−β−アセチルチオ−α−メチルプロピオン
酸メチルの不斉加水分解反応を行なった。このうち、初
期１時間の酵素活性を測定し、親株と比較した。
【００２６】
【表１】
【００２７】表１に示したようにE.coli C600 (pPE117)
は、親株であるP. putida に比べて約200倍のエステ
ラーゼ活性を示した。
は、親株であるP. putida に比べて約200倍のエステ
ラーゼ活性を示した。
【００２８】
【発明の効果】本発明により得られる組換え体プラスミ
ドpPE101、pPE116、pPE117およびこれらにより形質転換
されたEscherichia coli形質転換株は、カルボン酸エス
テル (Ｉ) を不斉加水分解するエステラーゼ遺伝子を含
有する。また、形質転換株のエステラーゼは、親株のそ
れと同様に熱安定性に優れているという特徴を有してい
る。そして、形質転換株のエステラーゼ活性はその親株
のそれに比して飛躍的に増大させることができた。更
に、この形質転換株の菌体またはその処理物を45℃以上
の高温でカルボン酸エステル〔Ｉ〕に作用させて光学活
性カルボン酸〔II〕及びその対掌体エステルを効率良く
得ることができた。
ドpPE101、pPE116、pPE117およびこれらにより形質転換
されたEscherichia coli形質転換株は、カルボン酸エス
テル (Ｉ) を不斉加水分解するエステラーゼ遺伝子を含
有する。また、形質転換株のエステラーゼは、親株のそ
れと同様に熱安定性に優れているという特徴を有してい
る。そして、形質転換株のエステラーゼ活性はその親株
のそれに比して飛躍的に増大させることができた。更
に、この形質転換株の菌体またはその処理物を45℃以上
の高温でカルボン酸エステル〔Ｉ〕に作用させて光学活
性カルボン酸〔II〕及びその対掌体エステルを効率良く
得ることができた。
【００２９】
配列番号：１ （１）配列の長さ：８３１ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：二本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （６）起源 （ａ）生物名：シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） （ｂ）株名：ＭＲ−２０６８微工研条寄第３８４６号 （７）配列の特徴：１〜８３１ Ｐ ＣＤＳ （８）配列： 配列番号：２ （１）配列の長さ：１３２９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：二本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （６）起源 （ａ）生物名：シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） （ｂ）株名：微工研条寄第３８４６号 （７）配列の特徴：３０２−１１３２ Ｐ ＣＤＳ （８）配列 配列番号：３ （１）配列の長さ：２７７ （２）配列の型：アミノ酸 （３）トポロジー：不明 （４）配列の種類：ペプチド （５）起源 （ａ）生物名：シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） （ｂ）株名：微工研条寄第３８４６号 （６）配列
ｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） （ｂ）株名：ＭＲ−２０６８微工研条寄第３８４６号 （７）配列の特徴：１〜８３１ Ｐ ＣＤＳ （８）配列： 配列番号：２ （１）配列の長さ：１３２９ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：二本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （６）起源 （ａ）生物名：シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） （ｂ）株名：微工研条寄第３８４６号 （７）配列の特徴：３０２−１１３２ Ｐ ＣＤＳ （８）配列 配列番号：３ （１）配列の長さ：２７７ （２）配列の型：アミノ酸 （３）トポロジー：不明 （４）配列の種類：ペプチド （５）起源 （ａ）生物名：シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） （ｂ）株名：微工研条寄第３８４６号 （６）配列
【図１】pPE101より作成した欠失プラスミドとエステラ
ーゼ活性を示す。
ーゼ活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中、Ｒ１はアルキル基、アラルキル基またはアリー
ル基、Ｒ２及びＲ３はアルキル基、ｎは１または２を示
す）で表されるカルボン酸エステルのラセミ体に、配列
番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする
ＤＮＡ断片、又は配列番号３のアミノ酸配列において１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつ配列番号３のアミノ酸配
列からなるタンパク質と同様のエステラーゼ活性を持つ
タンパク質をコードするＤＮＡ断片を連結した組み換え
体プラスミドを含む形質転換微生物の培養液、菌体また
は菌体処理物を作用させることを特徴とする、一般式 【化２】 （式中、Ｒ１，Ｒ２及びｎは前記と同様）で表される光
学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法。 - 【請求項２】 形質転換微生物が大腸菌であることを特
徴とする請求項１記載の光学活性カルボン酸及びその対
掌体エステルの製造法。 - 【請求項３】 ４５℃以上の温度で作用させることを特
徴とする請求項１記載の光学活性カルボン酸及びその対
掌体エステルの製造法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24992391A JP2763213B2 (ja) | 1991-05-15 | 1991-09-27 | 光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法 |
| CA002068614A CA2068614C (en) | 1991-05-15 | 1992-05-13 | Esterase genes, esterase, recombinant plasmids and transformants containing the recombinant plasmid and methods of producing optically active carboxylic acids and their enantiomeric esters using said transformants |
| US07/882,329 US5308765A (en) | 1991-05-15 | 1992-05-13 | Esterase genes, esterase, recombinant plasmids and transformants containing the recombinant plasmid and methods of producing optically acitve carboxylic acids and their enantiomeric esters using said transformants |
| EP92108205A EP0513806B1 (en) | 1991-05-15 | 1992-05-15 | Esterase genes, esterase, recombinant plasmids and transformants containing the recombinant plasmid and methods of producing optically active carboxylic acids and their enantiomeric esters using said transformants |
| DE69218034T DE69218034T2 (de) | 1991-05-15 | 1992-05-15 | Esterase-Gene, Esterase, rekombinante Plasmide und diese enthaltende Transformanten, und Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver Karbonsäure und ihrer enantiomeren Ester durch diese Transformanten |
| KR1019920008207A KR100232552B1 (ko) | 1991-05-15 | 1992-05-15 | 에스테라제 유전자, 에스테라제, 조환체 플라스미드 및 형질전환 미생물 및 이 형질전환 미생물을 사용한 광학활성 카본산 및 그 대장체 에스테르의 제조법 |
| AT92108205T ATE150087T1 (de) | 1991-05-15 | 1992-05-15 | Esterase-gene, esterase, rekombinante plasmide und diese enthaltende transformanten, und verfahren zur herstellung von optisch aktiver karbonsäure und ihrer enantiomeren ester durch diese transformanten |
| US08/183,213 US5482847A (en) | 1991-05-15 | 1994-01-14 | Esterase genes, esterase, recombinant plasmids and transformants containing the recombinant plasmid and methods of producing optically active carboxylic acids and their enantiomeric esters using said trasnformants |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11062891 | 1991-05-15 | ||
| JP3-110628 | 1991-05-15 | ||
| JP24992391A JP2763213B2 (ja) | 1991-05-15 | 1991-09-27 | 光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0568589A JPH0568589A (ja) | 1993-03-23 |
| JP2763213B2 true JP2763213B2 (ja) | 1998-06-11 |
Family
ID=26450220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24992391A Expired - Fee Related JP2763213B2 (ja) | 1991-05-15 | 1991-09-27 | 光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2763213B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4658315B2 (ja) * | 2000-12-27 | 2011-03-23 | 三菱レイヨン株式会社 | 光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造方法 |
| JP2015181397A (ja) * | 2014-03-24 | 2015-10-22 | 三井化学株式会社 | 粉末化触媒の製造方法 |
-
1991
- 1991-09-27 JP JP24992391A patent/JP2763213B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0568589A (ja) | 1993-03-23 |
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