KR100232552B1 - 에스테라제 유전자, 에스테라제, 조환체 플라스미드 및 형질전환 미생물 및 이 형질전환 미생물을 사용한 광학활성 카본산 및 그 대장체 에스테르의 제조법 - Google Patents

에스테라제 유전자, 에스테라제, 조환체 플라스미드 및 형질전환 미생물 및 이 형질전환 미생물을 사용한 광학활성 카본산 및 그 대장체 에스테르의 제조법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반식 (I)
(식 중, R1은 알킬기, 아랄킬기 또는 아릴기, R2및 R3는 알킬기, n는 1 또는 2를 나타낸다)로 표시되는 카본산에스테르를 부제가수분해를 하는 에스테라제의 아미노산 배열을 코딩하는 염기배열을 포함하는 DNA 단편, 이 DNA 단편에 코딩된 에스테라제, 이 DNA 단편을 포함하는 조환체 플라스미드, 이 조환체 플라스미드에 의한 형질전환미생물 및 이 형질전환미생물에 관한 것이며, 또 광학활성카본산 및 그 대장체 에스테르의 제조방법에 관한 것이다.

Description

에스테라제 유전자, 에스테라제, 조환체 플라스미드 및 형질전환 미생물 및 이 형질전환 미생물을 사용한 광학활성 카본산 및 그 대장체 에스테르의 제조법
제1도는 클로닝용 벡터 pCU 19를 나타낸 도면.
제2도는 본 발명의 에스테라제 구조유전자를 포함하는 DNA 단편이 포함된 조환체 플라스미드 pPE101의 제한 효소의 지도를 나타낸 도면.
제3도는 pPE101중의 소실된 DNA 단편과 EcoRI 단편에 관계된 그들의 여러가지 위치, pCU19내로 DNA 단편을 집어넣어 조제된 조환체 플라스미드 및 조환체 플라스미드로 형질 전환된 미생물의 에스테라제 활성을 나타낸 도면.
제4도는 본 발명의 에스테라제의 최적 pH를 나타낸 도면.
제5도는 pH변화에 있어서의 에스테라제의 안정성을 나타낸 도면.
제6도는 본 발명의 에스테라제의 최적온도를 나타낸 도면.
제7도는 본 발명의 에스테라제의 열안정성을 나타낸 도면.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
Amp : 앰피실린 내성 코딩영역
lacZ : β갈락토시다제 구조유전자영역
laci : 리프레서구조 유전자 영역
① : pCU19에 유래된 부분
② : 슈도모나스 퓨티다의 염색체 DNA에 유래된 부분
B : BglII C : ClaI
EI : EcoRI EV : EcoRV
P : PvuII S : SalI
Sm : SmaI Ps : PstI
본 발명은 카본산 에스테르의 부제가수분해반응을 촉매하는 열안정성이 높은 에스테라제를 코딩하는 염기배열을 포함하는 DNA 단편, 이 DNA 단편을 포함하는 조환체 플라스미드, 이 조환체 플라스미드에 의한 형질전환 미생물 및 이 형질전환 미생물을 사용한 광학활성 카본산 및 그 대장체 에스테르의 제조법에 관한 것이다.
일반식 (II)
(식 중, R1은 알킬기, 아랄킬기 또는 아릴기, R2는 알킬기, n은 1 또는 2를 나타낸다)로 표시되는 광학활성 카본산 및 그 대장체 에스테르는 여러가지 생리활성물질의 합성원료로서 유용하고 본 발명자등은 앞서 일반식 (I)
(식 중, R1, R2및 n은 상기와 같고 R3은 알킬기를 나타낸다)로 표시되는 카본산 에스테르의 라세미체(racemic mixture)를 효소나 미생물을 사용하여 부제가수분해하는 방법을 제안하였다(일본국 특개소 60-12992호 공보, 동 60-12993호 공보 참조).
본 발명자등은 슈도모나스 프티다(Pseudomonas putida)(FERM BP-3846)을 토양으로부터 분리 취득하여 그것이 카본산 에스테르를 위한 부제가수분해 활성이 높은 에스트라제를 생산함을 발견하여 일본국 특개평 1-1222798호 공보에 개시했다.
현재 높은 효소활성을 갖는 미생물을 수득하기 위하여 조환 DNA 기술이 때때로 사용되고 있다. 상기 반응에 관여되는 에라스타제의 생산능력을 향상시키는 것을 목적으로 한것으로는 DNA 단편으로서 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)(IFO 3018) 유래의 에스트라제를 코딩하는 유전자의 DNA 단편을 조제하고 이 DNA 단편을 갖는 플라스미드 DNA 에 의해서 숙주미생물을 형질전환하여 얻은 형질전환 미생물을 사용하는 방법이 알려져 있다.(일본국 특개평 1-67190호 공보).
상기와 같은 카본산에스테르(I)를 부제가수분해 할 때에는 효소의 정제등의 번잡한 조작을 생략하여 균체 그 자체를 효소원으로서 사용하는 것이 통상 행해진다. 이 방법에 있어서 효율적인 반응을 행하기 위해서는 균체의 효소활성이 높은 것은 물론이고 효소자체의 성질로서 광학순도가 높은 카본산의 생성능을 갖는 것과 온도나 pH등의 반응제조건에 대해서 안정성이 높을 필요가 있다.
열안정성이 떨어지는 효소는 경시적으로 열불활성이 생기기때문에 반응온도상승에 의한 반응속도상승, 또는 효소회수 재이용을 도모하기 어렵고 효율적인 반응을 행하기 위해서는 열안정성이 양호한 효소를 생성하는 균체를 취득하는 것이 필요하다.
균체의 효소활성을 높이는 방법으로서는 상기 일본국 특개평 1-67190호 공보에 개시되어 있는 바와 같이 조환 DNA 기술이 유효하다. 한편 효소자체의 성질은 본질적으로는 효소를 코딩한 DNA에 대응하고 있고 상기 제조건에 대한 안전성이 높은 효소를 취득하려면 우선 제반응조건에 대해서 안전성이 우수한 효소를 코딩하는 DNA 단편을 발견할 필요가 있다.
그러나 상기한 바와같이 일본국 특개평 1-67190호 공보에 있어서는 슈도모너스 플루오레센스(IFO 3018) 유래의 에스트라제를 코딩한 DNA 단편을 갖는 플라스미드 DNA로된 형질전환 미생물이 개시되어 있으나, 이 균주의 에스테라제는 열안정성이 떨어지고 예를들면 45℃이상의 온도에서는 수시간으로 불활성이 된다는 문제점을 갖고 있다.
본 발명의 목적은 카본산 에스테르(I)를 부제가수분해할 때에 열안정성이 우수한 에스트라제를 코딩하는 DNA 단편을 조제하고 이 DNA 단편을 포함하고 또한 양호한 발현성을 갖는 형질전환 미생물을 사용하여 이 부제가수분해를 효율좋게 행하는데 있다.
본 발명자등은 상기 카본산 에스테르(I)를 부제가수분해하기 위하여 유효한 효소원을 사용하는 방법에 관해서 예의 연구한 결과 본 발명자등이 토양에서 분리한 슈도모나스 프티다(FERM BP-3846)로부터 유래된 에스트라제 유전자를 포함하는 형질전환 미생물의 균체를 사용하면 이 균체가 높은 효소활성을 갖는 동시에 이 효소는 50℃이상의 고온반응에서도 경시적인 열불활성이 생기지않으므로 극히 수율좋게 또한 단시간에 반응을 행할 수 있음을 발견했다.
또, 이 형질전환 미생물로부터 열안정성이 우수한 신규 에스테라제를 실질적으로 효소로서 순수한 형으로 분리하여 이화학적 성질을 명백하게하는데 성공하였다.
본 발명은 일반식 (I)
(식 중, R1은 알킬기, 아랄킬기, 아릴기, R2및 R3은 알킬기, n은 1 또는 2를 나타낸다)로 표시되는 카본산 에스테르를 부제가수분해하여
일반식 (II)
(식 중, R1, R2및 n는 상기와 같은 의미이다)로 표시되는 광학활성 카본산을 제공하는 배열번호 2(SEQ ID No. 2)의 아미노산 배열을 갖는 에스테라제를 코딩하는 염기배열을 포함하는 DNA 단편을 제공한다.
또한 본 발명은 이 DNA 단편에 코딩된 에스테라제와 이 DNA 단편을 포함하는 조환 플라스미드와 조환체 플라스미드로 형질전환된 미생물을 제공한다.
또 본 발명은 일반식 (I)로 표시되는 카본산 에스테르의 라세미체(racemic mixture)를 형질전환 미생물의 배양액 또는 균체 또는 균체 처리물과 반응시켜서 일반식 (II)로 표시되는 광학활성 카본산과 그들의 대장체 에스테르를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의하면 일반식 (II)로 표시되는 광학활성 카본산과 그들의 대장체 에스테르를 일반식 (I)로 표시되는 카본산 에스테르의 라세미체로부터 효율좋게 생성한다.
본 발명의 에스테라제는 다음과 같은 이화학적 성질을 갖고 있다.
(1) 최적 pH : 7.0(제4도 참조)
(2) pH 안전성 : 6.0 ~ 8.0(제5도 참조)
(3) 최적온도 : 60 ~ 70℃(제6도 참조)
(4) 열안정성 : 70℃까지(제7도 참조)
(5) 분자량 : 약 30,000(SDS-PAGE에 의함)
(6) 등점점 : pH 3.90±0.1(등전위 포커싱 (IEE)에 의함)
(7) 아미노산 배열 : 배열번호2로 표시되는 배열을 갖는다.
(8) 기질특이성 : 주로 탄소수 8이하의 카본산에스테르를 잘 가수분해하고 방향족 알콜의 아세틸 에스테르도 가수분해한다.
일반식(I) 및 일반식 (II)에 있어서 R1으로 나타낸 알킬기로서는 바람직하기로는 탄소수가 1 ~ 6의 알킬기, 예를들면 메틸기, 에틸기, 아랄킬기로서는 예를들면 벤질기, 아릴기로서는 예를들면 페닐기를 들 수 있고, R2또는 R3로 나타낸 알킬기로서는 바람직하기로는 탄소수 1 ~ 6의 알킬기, 예를들면 메틸기, 에틸기를 들 수 있다.
일반식 (I)로 표시되는 카본산에스테르로서는 메틸 β-아세틸티오-α-메틸프로피오네이트, 메틸 S-아세틸-β-메르캅토부틸레이트, 메틸 S-아세틸-γ-메르캅토-α-메틸-n-부틸레이트, 메틸 S-벤조일-β-메르캅토이소부틸레이트 및 메틸 S-페닐아세틸-β-메르캅토이소부틸레이트를 들 수 있다.
본 발명의 DNA 단편으로서는 예를들면 배열번호 1로 표시되는 염기배열 또는 그 일부의 염기배열을 포함하는 DNA 단편, 배열번호 3으로 표시되는 염기배열 또는 그 일부의 염기배열을 포함하는 DNA 단편을 들 수 있다.
본 발명의 DNA 단편을 소망하는 에스테라제를 생성하는 미생물의 염색체로부터 클로닝에 의해서 또는 DNA 합성기를 사용한 합성에 의해서 얻을 수 있다. 이 염기체 배열은 1본쇄(single strand) 또는 2본쇄(double strand)라도 좋고 어느것이나 본 발명에 사용할 수 있다.
클로닝에 의해서 얻는 경우의 염색체 공여체로서 적합한 미생물은 예를들면 슈도모나스 프티다(FERM BP-3846)이다.
이하에 상기 배열 1로 표시되는 염기배열 전체를 포함하는 DNA 단편의 클로닝법을 설명하겠다.
염색체 공여균, 예를들면 슈도모나스 프티다(FERM BP-3846)에서 마르므르(Marmur)등의 방법[J.Marmur et al.,J.Mol,Biol., 3:208, 1961]에 따라서 얻은 염색체 DNA를 EcoRI로 부분소화시켜 제한단편을 얻는다.
플라스미드 pUC19를 EcoRI로 소화시킴으로써 Lac 오페론(대장균의 라크토스오페론)내의 LacZ 중의 멀티플 클로닝사이트에 있는 EcoRI 부위에서 이것을 개환하여 리니어 DNA를 얻는다.
이 EcoRI로 소화된 염색체 DNA와 pCU19가 T4DNA리가제를 사용하여 리게이트(ligate)된다.
이 반응생성물을 CaCl2처리된 숙주미생물 E. coli JM105주 (E. coli K-12주의 하나)에 도입하여 형질전환체를 얻는다. 이 형질전환체는 앰피실린, IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드) 및 X-Gal (5- 브로모 -4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토피라노사이드)를 포함하는 LB한천 플레이트 위에 뿌려 배양한다.
이 배양에 있어서 EcoRI 부위로의 DNA 단편의 삽입이 행해지지 않았던 pCU19를 갖는 형질전환체는 앰피실린 내성을 획득하고 또한 IPTG의 유도에 의해서 β-갈락토시다제를 발현하므로 상기 조성의 플레이트에 의해서 증식하고 그 콜로니는 β-갈락토시타제 활성에 의한 X-Gal의 절단에 의해서 청색 콜로니를 만든다. 한편 pCU19의 EcoRI 부위로 DNA 단편이 도입되면 형질전환체는 앰피실린 내성을 갖게 되지만 β-갈락토시다제의 발현이 되지않게되어 이들 형질전환체는 백색 클로니를 만든다.
플레이트위에서의 배양후에 백색 클로니를 채취함으로써 포지티브 형질전환체가 선별된다. 그런다음 이 포지티브 형질 전환체는 에스테라제 활성을 위하여 스크리닝한다.
이 스크리닝은 하기와 같이 행할 수 있다. 플레이트 위의 클로니를 10mM Tris-HCl/pH 7.5, 0.01% 브로모크레졸퍼플과 100ppm의 메틸 DL-β-아세틸티오-α-메틸프로피오네이트의 용액을 적신 여과지로 옮겨 실온에서 수시간동안 배양한다. 에스테라제 활성을 갖는 형질전환체는 카본산을 생성하여 브로모크레졸퍼플(pH 지시약)의 색을 자주빛색으로부터 황색으로 콜로니 둘레에서 pH 감소로 인해서 변색시킨다. 따라서 에스테라제 유전자를 갖는 형질전환체를 육안으로 관찰할 수 있다.
조환체 플라스미드중의 에스테라제유전자의 위치는 하기 방법으로 결정한다.
먼저 에스테라제 활성을 갖는 형질전환체로부터 플라스미드를 단리시킨다. 그런 후에 EcoRI로 플라스미드를 소화시켜 EcoRI DNA 단편을 얻는다. 이 EcoRI DNA 단편을 여러가지 제한 효소로 더 소화시킨다. 이 제한단편을 플라스미드 pCU19내에 삽입하여 조환체 플라스미드를 만든다. Ecoli JM105를 이 조환체 플라스미드로 형질전환시킨다. 그런다음 에스테라제 활성시험을 이 형질전환체에 대해서 행하여 포지티브 형질전환체 중에서 에스테라제 유전체 발현을 위하여 최소길이의 DNA 단편을 포함하는 형질전환체를 선정한다. DNA 단편의 뉴클레오티드 배열은 각종방법으로 결정되고 배열번호 1을 얻을 수 있다.
클로닝 벡터로서는 pBR 시리즈, pCU 시리즈등의 대장균중에서 안정되게 보지되는 다카피 플라스미드 벡터(high copy-number plasmid)와 pHY300PLK 등의 고초균(Bacillus subtilis)중의 플라스미드벡터, RSF1010 유래의 광숙주범위를 갖는 플라스미드벡터 등을 들 수 있다.
형질전환에 사용되는 숙주미생물로서는 대장균, 효모, 고초균, 방선균(Actinomycetes)를 들 수 있다.
열안정성이 우수한 에스트라제 유전자로 형질전환된 미생물은 DNA 공여체인 친주 슈도모나스 프티다(FERM BP-3846)과 같은 효소학적 성질을 갖고 또 다카피 플라스미드를 이 형질전환체가 갖기 때문에 이 형질전환체는 DNA 공여체균보다도 훨씬 고활성을 갖는다. 이 형질전환체는 배지중에서 성장하고 배양액, 균체 또는 균체처리물등의 형태로 사용된다.
이들 형질전환 미생물의 배양은 통상은 액체배지에서 행해지지만 고체배지에 의해서도 행할 수 있다. 예를들면 LB 배지를 사용할 수 있다. 배양은 10 ~ 50℃의 온도에서 pH2 ~ 11의 범위에서 행해진다. 미생물의 생육을 촉진시키기 위하여 통기교반을 행하여도 된다. 가수분해반응은 배양개시시 또는 도중에 또는 배양완료후에 배지에 일반식 [1]의 카본산 에스테르를 첨가하여 행할 수 있다.
또 증식된 미생물의 균체는 원심분리에 의해서 채취하여 이것을 일반식 (I)의 카본산 에스테르를 함유하는 용액에 첨가해도 좋다. 이 경우에 균체는 취급편의상 건조균체 예를들면 동결건조균체, 분무건조균체 또는 유기용매, 예를들면 아세톤, 톨루엔등으로 처리한 균체 또는 균체 파괴물, 균체추출물등의 균체처리물을 사용할 수도 있다. 균체추출물등의 균체처리물을 사용할 수도 있다. 반응매체로서는 예를들면 이온교환수 또는 완충액이 사용된다. 반응매체 또는 배양액 중의 일반식 (I)의 카본산 에스테르의 농도는 0.01 ~ 50중량%가 바람직하다. 일반식 [1]의 카본산 에스테르는 물에 현탁시킨 상태로 첨가할 수도 있다. 메타놀, 아세톤등의 유기용매를 반응액에 첨가하여 에스테르의 용해성을 향상시킬 수도 있다. 반응액의 pH는 2 ~ 11, 바람직하기로는 5 ~ 8의 범위이다. 반응이 진행됨에 따라서 생성된 일반식 (II)의 광학활성카본산에 의해서 반응액의 pH가 저하되지만 이 경우에는 적당한 중화제로 최적인 pH로 유지하는 것이 바람직하다. 반응온도에 관해서는 본 발명의 형질전환 미생물을 생육하는 효소는 극히 열안정성이 양호하기 때문에 5 ~ 80℃에서 반응이 가능하지만 이 균주생성효소의 특징을 살리기위하여 45℃이상이 바람직하다. 이 온도범위에서 효소가 반응중의 활성을 보지할 수 있다.
반응액 또는 배양액으로부터의 생성물의 분리 정제는 통상의 방법, 예를들면 추출, 재결정, 컬럼 크로마토그래피등에 의해서 행할 수 있다.
본 발명의 하나인 신규한 에스테라제는 본 발명의 형질전환 미생물의 배양체로부터 통상의 방법에 의해서 얻을 수 있다. 즉, 이 형질전환 미생물의 배양균체로 임의의 방법이나 균체내 효소를 포함하는 무세균 추출액을 얻는다. 황산암모늄에 의한 농축, 이온교환 크로마토그래피 컬럼, 겔여과 등의 수법을 반복함으로써 순수한 효소를 얻을 수 있다.
[실시예]
[실시예 1]
[1-(1) 염색체 DNA의 조제]
Marmur 등의 방법[J.Marmur et al J.M Biol, 3:208, 1961]에 따라 하기와 같은 조작에 의해서 슈도모나스 프티다(FERM BP-3846)을 식균하여 37℃에서 하루밤 배양했다. 배양후에 원심분리에 의해서 집균하여 그 중 약 3g(습중량)을 24㎖의 TEG 완충액 [25mM 트리스 HCl, 10mM EDTA (에틸렌디아민 4초산) 50mM 글루코스, pH 8.0]에 현탁시키고 리조짐(lysozyme) 용액(10mg/㎖의 농도로 리조짐을 TEG 완충액에 용해시킨것) 1㎖를 가하여 이것을 32℃에서 30분간 교반하였다. 교반종료후에 2㎖의 12.5% SDS(도데실황산 나트륨) 용액을 혼합시켰다. 얻어진 혼합물에 33.8㎖ 의 클로로포름/이소아밀알콜[24:1 용량비] 혼합물을 가하여 30분간 서서히 교반했다.
교반종료후에 혼합물을 원심처리하여 그 상청부를 그 2배량의 냉에탄올에 서서히 가하여 석출되는 DNA를 유리봉에 부착시켜 감아서 취하여 냉에탄올에서 꺼냈다. 이 DNA를 9㎖의 0.1xssc(15mM NaCl, 1.5mM 구연산 3나트륨)에 용해시켜 얻어진 용액에 1㎖의 10xssc(1.5M NaCl, 150mM 구연산 3나트륨)을 가하여 DNA 용액을 얻어 이 DNA 용액에 RNaseA를 50㎍/㎖의 농도가 되도록 가하여 30분간 서서히 교반한후에 10.2㎖의 클로로포름/이소아밀알콜(24:1 용량비)혼합액을 가하여 30분간 더 서서히 교반했다.
교반종료후에 반응혼합물을 원심처리하여 얻어진 상정부를 회수하여 이것에 1㎖의 초산-EDTA(3M 초산나트륨, 0.01M EDTA, pH 7.0)용액을 가하여 이것에 유리봉으로 교반하면서 이소프로필알콜을 적하(전량: 5.4㎖)하여 석출된 DNA를 유리봉으로 감아서 취하여 꺼냈다. 얻어진 DNA를 3㎖의 1xssc(0.15M NaCl, 15mM 구연산 3나트륨)에 용해시켜 2㎍/㎖의 염색체 DNA를 얻었다.
[1-(2) 조환체 플라스미드의 조제]
상기 1-(1)항에서 얻어진 염색체 DNA 용액 5㎕(10㎕ DNA에 상당)에 2단위/㎍ DNA이 되도록 제한 효소 EcoRI를 가하여 통상의 방법으로 반응시켜서 37℃에서 30분간 배양한후에 EcoRI에 의한 DNA 단편 혼합물을 얻었다. 한편, 통상의 방법에 따라 플라스미드 pCU19로 소화시켜 리니어 플라스키드 DNA를 얻었다.
소화된 염색체 DNA에서의 DNA 단편과 pCU19에서의 DNA 단편을 T4 리가제 존재하에 통상의 방법에 따라 반응시켜 리게숀 생성물을 얻었다.
[1-(3) 조환체 플라스미드의 단리]
대장균 JM105 (다까라 슈조가부시끼가이샤에서 구입할 수 있음)를 LB배지에 37℃에서 2 ~ 3시간 배양한 후에 배양균체를 집균하여 이것을 빙냉된 50mM CaCl2용액에 현탁시켰다. 이 현탁액을 원심처리하고 이 균체를 재차 신선한 50mM CaCl2용액에 현탁시켜 빙냉하면서 30분간 정지시켰다.
30분간 배양후에 이 현탁액중 약 100 ~ 200㎕를 시험관중에 채취하여 거기에 1-(2)항에서 얻은 리게숀 생성물(약 2㎕의 DNA)를 가하여 빙냉하면서 30분간 배양시켰다. 그후에 이 시험관을 42℃에서 2분간 가열한후에 1㎖의 LB배지를 주입하여 37℃에서 60분간 배양했다. 이 배양후에 형질 전환체 생성물 약 100㎕를 앰피실린 100㎍/㎕, TPTG 0.5mM, X-Gal 0.2%를 함유하고있는 한천배지플레이트위에 분산시켜 하루밤 37℃에서 배양했다.
플레이트위에 출현된 콜로니들 중 백색 콜로니에 대해서 에스테라제 활성시험을 행하였다. 에스테라제 유전체를 포함하는 조환체 플라스미드를 갖는 포지티브 형질전환체를 하기의 방법으로 선정했다.
[에스테라제 활성의 측정]
플레이트위의 백색 콜로니를 10mM의 트리스-HCl/pH 7.5, 0.01%의 브로모크레졸퍼플 및 100ppm의 메틸 DL-β-아세틸티오-α-메틸프로피오네이트 용액에 적신 여과지로 옮겼다. 이 여과지를 수시간동안 실온에 방치하여 배양하였다. 에스테라제 활성을 갖는 형질전환체는 카본산의 생성에 의한 pH감소에 따라 브로모크레졸 퍼플(pH 시약)을 자주빛 색으로부터 황색으로 변색을 일으키는 콜로니를 선정하여 이것을 에스테라제 유전자가 삽입된 조환체 플라스미드를 함유한 포지티브 형질전환주로 하였다.
포지티브 형질 전환주중의 하나를 생육시켜 Birnboim 등의 방법[Nucleic acid Res, 7 : 1513-1523, 1979]에 의해서 플라스미드 DNA를 조제하였다. 플라스미드의 제한효소지도를 작성하여 제2도에 나타냈다. 제2도에 나타낸 조환체 플라스미드를 pPE101로서 지정했다.
[1-(4) pPE101중의 에스테라제 유전자 영역]
공지의 방법으로 EcoRI로 pPE101를 소화시키고 얻은 제한체 단편을 전기영동법에 의해서 EcoRI DNA 단편(대단편)을 얻었다.
그후에 이 대 EcoRI DNA 단편을 각종 제한효소로 소화시켜 보다 작은 DNA 단편을 얻었다. 몇가지 제한체 지도를 제3도에 나타났다.
소 DNA 단편들을 pCU19의 lacZ영역내의 멀티클로닝 사이트에 삽입하여 조환체 플라스키드를 조제하고 대장균 JM105를 형질전환시키는데 얻어진 조환체 플라스미드를 사용했다. 형질전환주에 대해서 에스테라제 활성을 측정했다.
플라스미드 DNA의 조제, 형질전환주 및 에스테라제 활성의 측정은 상술한 1-(2) 및 (3)항 기재의 방법으로 행하였다. pCU19내로 소단편을 삽입할때에 필요에 따라 링커를 합성하여 사용했다.
형질전환주의 에스테라제 활성도 제3도에 나타냈다. 이 에스테라제 활성에 의하면 약 1.3Kb의 ClaI/Smal DNA 단편과 약 1.2Kb의 ClaI/PstIDNA 단편이 에스테라제 유전자를 포함하고 있는 것을 알 수 있다.
플라스미드 pPE116으로 형질전환된 E.coli JM105를 E. coli JM 105(pPE116)라고 지정했다. E. coli JM105(pPE116)는 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 MR-2101의 명칭으로 기탁되고 그 기탁번호는 FERM BP-3838 이다.
플라스미드 pPE117로 형질전환된 E. coli C600은 E. coli(pPE117)이라고 지정되고 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 MR-2103의 명칭으로 기탁되고 그 기탁번호는 FERM BP-3835 이다.
[1-(5) 에스테라제 구조유전자의 염기배열]
1-(4)항에서 얻은 ClaI/Smal DNA 단편의 전체염기배열은 파지 벡터(phage Vector)를 사용한 dedeoxy chain termination법(F. Sanger, Science., 214: 1205, 1981)에 의해서 결정했다. 또, 얻어진 염기배열을 분석하여 SD배열들의 위치나 효소활성에 필수적인 DNA 배열의 위치를 정했다. 분석결과에 준하여 오픈리딩 프레임과 대응하는 아미노산배열을 결정했다. 그 결과를 배열번호 4(SEQID No4)에 나타냈다.
[1-(6) 에스테라제 유전자의 염기배열 및 예상되는 아미노산 배열]
pPE117중의 DNA 단편의 전체 염기배열을 M13 파지벡터를 사용한 dideoxy chain termination법(F. Sanger, Science., 214: 1205, 1981)에 의해서 결정했다. 슈도모나스 프티다(FERM BP-3846)의 염색체 DNA로부터 유도된 약 1.2Kb의 DNA 단편의 염기배열은 SEQID No.3에서 설명한 것이다. SEQID No.3에 기재한 염기배열의 연구에서 다음 사항을 발견했다. 효소활성에 필수적인 영역을 커버하는 오픈리딩 프레임이 SEQID No.1에 기재한 염기 배열중에 유일하게 존재한다는 것; 개시코돈 및 오픈리딩 프레임의 수베이스 상류에 위치하는 SD 배열이 SEQID No.3에 기재한 염기배열중에 존재한다는 것 SEQID No.1에 기재한 염기배열로부터 예상되는 아미노산 배열을 SEQID No.2에 나타냈다.
[1-(7) 메틸 DL-β-아세틸티오-α-메틸프로피오네이트의 부제가수분해]
E. coli JM105(pPE116) 50㎍/㎕의 앰피실린을 함유하는 LB 500㎖중에서 37℃에서 하루밤 진탕하여 배양했다. 배양후에 원심처리하여 균체를 집균하였다. 균체 JS부를 5% 메틸 DL-β-아세틸티오-α-메틸프로피오네이트 용액 200㎖중에 현탁시켰다. 0.1N의 NaOH로 pH를 pH 7로 조정하면서 45℃에서 3시간동안 반응시켰다. 반응후에 원심분리처리에 의해서 균체를 제거하고 상등부의 미반응메틸 β-아세틸티오-α-메틸프로피오네이트를 초산에틸을 사용하여 제거했다. 얻어진 추출잔사수층의 pH는 희석황산으로 2.0이하로 조정했다. 그런후에 초산에틸로 이 혼합물을 추출하여 D-β-아세틸티오-α-메틸프로피오네이트 추출액을 얻었다.
이 추출액에 무수황산 나트륨을 가하여 탈수하고 탈수후에 용매를 증발처리하여 유상물을 얻었다. 이 유상물의 일부를 제거하고 물로 희석시켜 얻어진 희석된 샘플에 대해서 HPLC에 의해서 β-아세틸티오-α-메틸프로피오네이트를 정량 분석했다. 유상물의 일부를 클로로포름에 용해시켰다. 얻어진 샘플의 선광도(optical rotation)를 선광계(PM101, 유니온 기겐제)에 의해서 측정했다. 그 결과 1.5g의 목적하는 제품을 얻을 수 있었다. 비선광도(specific rotation)를 다음식으로 산출했다.
비선광도는 -58.3이었고 그것은 슈도모나스 프티다(FERM BP-3846)로 얻은 샘플의 선광도와 같은 값이었다.
[1-(8) 에스테라제 활성의 측정]
E. coli C600(pPE117)의 균체를 1-(7)항에 기재한 것과 같은 방법으로 메틸 DL-β-아세틸티오-α-메틸 프로피오네이트의 부제가수분해에 대해서 측정했다.
첫 1시간동안의 슈도모나스 프티다(FERM BP-3846), Ecoli JM 105(pPE116) 및 E. coli C600(pPE117)의 효소활성을 측정하여 비교했다. 그 결과를 표 1에 나타냈다.
[표 1]
* 슈도모나스 프티다(FERM BP-3846)를 1로 했다.
표 1에 나타난 바와 같이 E. coli C600(pPE117) [FERM BP-3835]는 슈도모나스 퓨다(FERM BP-3846)의 약 200배 이다.
[실시예 2]
슈도모나스 플루오레센스 IFO 3018, 슈도모나스 퓨티다 2068(FERM BP-3846) 및 E. coli JM105(pPE116) [FERM BP-3838]를 별도로 다음 조건으로 배양했다.
(a) 슈도모나스 플루오레센스 IFO 3018:
배지; LB배지(500㎖)
배양온도; 30℃
배양기간; 하루밤
(b) 슈도모나스 퓨티다 2068(FERM BP-3846)
배지; LB배지(500㎖)
배양온도; 30℃
배양기간; 하루밤
(c) E. coli JM105(pPE116) [FERM BP-3838]
배지; 앰피실린 50㎍/㎖를 함유하는 LB배지(500㎖)
배양온도; 30℃
배양기간; 하루밤
이와같이 얻어진 균체를 하기 방법에 의해서 에스테라제의 열안정성을 시험했다.
균체를 집균했다. 그 중 1.0g(습중량)의 균체를 메틸 DL-β-아세틸티오-α-메틸프로피오네이트 5.0g을 함유하는 0.05M인산 완충액(pH 7.0) 100㎖중에 현탁시켰다. 반응이 진행되는데 따라 0.1N NaOH를 현탁액에 적하하여 pH를 7.0으로 유지했다. 처음 1시간동안 pH를 유지하는데 사용한 NaOH의 전체량(Q1)을 측정했다.
1.0g(습중량)의 균체를 0.05M인산완충액(pH 7.0)100㎖ 중에 현탁시켰다. 이 현탁액을 3시간동안 20 ~ 80℃ 중에서 선택한 온도로 배양했다. 배양후에 5.0g의 메틸 DL-β-아세틸티오-α-메틸프로피오네이트를 이 현탁액에 첨가하여 30℃에서 효소반응시켰다. 반응이 진행되는데에 따라 0.1N NaOH를 현탁액에 적하하여 pH를 7.0으로 유지했다. 처음 1시간동안에 pH를 유지하는데 사용한 NaOH의 전체량(Q2)를 측정했다.
열에 영향받지않은 에스테라제 활성을 다음식으로 산출했다.
열 비영향 에스테라제 활성 = (Q2÷ Q1) × 100
결과를 표 2에 나타냈다.
[표 2]
표 2에서 명백한 바와같이 슈도모나스 퓨티다 2068(FERM BP-3846) E. coli JM105(pPE 116)에 의해서 생성되는 에스테라제의 열안정성은 슈도모나스 플루오레센스 IFO 3018에 의해서 생성되는 에스테라제 보다도 높다.
[실시예 3]
[3-(1) 신규한 에스테라제의 정제]
1% 폴리펩톤, 0.5% 이스트 추출물, 0.5% NaCl, 2% 글루코스, pH 7.0의 배지에서 37℃에서 14시간 통기 교반하여 E. coli C600(pPE 117) [FERM BP-3835]를 배양하여 원심분리 처리하여 균체 15g을 얻었다. 등량의 M/20 인산버퍼에 현탁시켰다. 이 균체를 초음파파쇠기를 사용하여 세포벽을 파쇠하고 원심 분리 처리하였다. 황산암모늄을 사용하여 상등액을 얻어 농축하여 M/20 인산버퍼로 평형화된 DEAE 세파덱스 D-50(파마시아제)컬럼에 흡착시키고 리니어 그라디엔트 용액, 0-0.5M NaCl를 이 컬럼에 가하여 에스테라제를 용출하고 에스테라제 활성단편을 모아서 농축시켰다. 이 농축된 샘플을 M/20 인산버퍼로 평형화된 세파덱스 G-100(파마시아제)컬럼에 흡착시켰다. 에스테라제를 M/20인산버퍼로 용출시켰다. 에스테라제 활성단편을 모아 농축하여 정제 에스테라제를 얻었다.
이 에스테라제의 분자량을 SDS PAGE에 의해서 측정한바 그 분자량은 약 30,000 이었다. 이 에스테라제의 등전점을 등전점 측정기(이스트 시스템 파마시아제)를 사용하여 측정한 바 pH 3.90 ± 0.1 이었다.
최적 에스테라제 활성을 위한 pH와 상이한 pH에 있어서의 에스테라제의 안정성을 제4도 및 제5도에 나타냈다. 에스테라제 활성을 위한 온도와 에스테라제의 열안정성을 제6도 및 제7도에 나타냈다.
3-(2) 신규의 에스테라제의 N말단아미노산 배열을 아미노산 배열 자동분석기(시미즈 세이사꾸쇼제)를 사용하여 분석한 결과 아래와 같았다.

Claims (9)

  1. 일반식 (I)
    (식 중, R1은 알킬기, 아랄킬기, 아릴기, R2및 R3은 알킬기, n는 1 또는 2를 나타낸다)로 표시되는 카본산 에스테르를 부제가수분해(asymmetrically hydrolyzing)하여 일반식 (II)
    (식 중, R1, R2및 n는 상기와 같은 의미이다)로 표시되는 광학활성 카본산을 생성할 수 있는 배열번호 2(SEQ ID No.2)의 아미노산 배열을 갖는 에스테라제를 코딩하는 염기배열을 포함하는 DNA 단편.
  2. 배열번호 2 기재의 아미노산 배열을 포함하는 에스테라제.
  3. 제1항에 있어서, 배열번호 1 기재의 염기배열을 포함하는 DNA 단편.
  4. 제1항에 있어서, 배열번호 3 기재의 염기배열을 포함하는 DNA 단편.
  5. 제1항 기재의 DNA 단편을 포함하는 조환체 플라스미드.
  6. 숙주미생물이 제5항 기재의 조환체 플라스미드에 의해서 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
  7. 일반식 (I)
    (식 중, R1, R2및 n는 상기와 같은 의미이다)로 표시되는 카본산 에스테르의 라세미체에 제6항 기재의 형질전환 미생물의 배양액, 균체 또는 균체처리물을 반응시켜서 일반식 (II)
    (식 중, R1, R2및 n는 상기와 같은 의미이다)로 표시되는 광학활성 카본산 및 그 대장체 에스테르(enantiometric ester)를 제조하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 형질전환 미생물이 대장균인 광학활성 카본산 및 그 대장체 에스테르를 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 45℃ 이상의 온도에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 광학활성 카본산 및 그 대장체 에스테르를 제조하는 방법.
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