WO2002064800A1 - Vecteur plasmide navette entre escherichia coli et brevibacillus - Google Patents

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plasmid
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escherichia coli
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Koji Yashiro
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Higeta Shoyu Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a plasmid shuttle vector between Escherichia coli and Brevibacillus bacteria, and a method for transforming Brevibacillus bacteria using the plasmid shuttle vector.
  • a plasmid shuttle vector suitable for Previbacillus bacterium that has a gene expression regulatory region that efficiently secretes and expresses the target gene in Brevibacillus bacterium but efficiently suppresses its expression in Escherichia coli.
  • the present invention relates to a method for producing a protein, comprising culturing a transformant transformed by the transformation method.
  • plasmid vectors useful for the expression of genes of Brevibacillus bacteria include, for example, pNU200 (Shigezo Udaka, Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry 61, 669-676 (1987)), pNH300 (Shiga, Y. et al. 3 Applied and Environment al Microbiol ogy, 58, 525-531 (1992)), pNH400 (I shihar a, T, et al., J, Bacterio l., 177, 745-749 (1995)), pHY 700 (JP-A-4-278091), pHT-type plasmids (Patent No. 2727391) and the like have been reported.
  • pNU200 Shigezo Udaka, Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry 61, 669-676 (1987)
  • pNH300 Shiga, Y. et al. 3 Applied and Environment al Microbiol ogy, 58, 525-531 (1992)
  • a secretory production system for proteins using a bacterium belonging to the genus Brevibacillus as a host is one of useful systems in protein production by genetic recombination.
  • the transformation efficiency of Brevibacillus bacteria is lower than that of Escherichia coli, and it is difficult to construct a recombinant gene expression plasmid using Brevibacillus bacteria compared to Escherichia coli.
  • electro Bole one Chillon method Tala method for example, electro Bole one Chillon method (Takagi, T. et al., Agric. Bi o l.
  • proteins with complex higher-order structures such as cholera toxin (CT) (Clements and Finke lste in, I) produced by Vibrio cholera A consisting of one A-subunit and five B-subunits ntect. Immun., 24; 760-769 (1979)). Transformation of bacteria of the genus Brevibacillus with a gene encoding a protein and production of the protein by the transformant have so far been difficult. there were.
  • CT cholera toxin
  • shuttle vector 1 a plasmid vector that can replicate in Escherichia coli.
  • a method may be considered in which a recombinant gene expression plasmid is constructed using a host cell, and further, the Brevibacillus bacterium is transformed by electroporation using the recombinant gene expression plasmid.
  • the shuttle vector and the transformation method using the shuttle vector are techniques known to those skilled in the art. For example, as a shuttle vector between Escherichia coli and Bacillus subtilis, JP-A-63-198986 and JP-A-2000-197491 are reported. However, up to now, transformation work of Brevibacillus spp. A plasmid shuttle vector that can be used for expression and a method for transforming Brevibacillus bacteria using the plasmid shuttle vector have not been known. Means for solving the problem
  • the present inventors have focused on the usefulness of secreting the target protein out of the cells in an expression system using a bacterium belonging to the genus Brevibacillus as a host, and have developed a novel host vector that solves the above-mentioned disadvantages.
  • the present inventors have found that, among many plasmid vectors, the plasmid vector pNY301, for which the present inventors have already applied for a patent, is derived from Brevibacillus choshinensis HPD31. We re-focused on the fact that the plasmid vector contains the promoter sequence and the secretory signal sequence. Based on this plasmid vector — PNY301, various DNA sequences were synthesized by PCR, etc.
  • the novel plasmid shuttle vector successfully created in this manner was introduced into Escherichia coli and bacteria of the genus Brevibacillus, and the resulting bacteria were cultured.
  • the plasmid shuttle vector was replicated in any host.
  • the target gene is efficiently secreted and expressed in Brevibacillus bacteria. It has been found that their expression is remarkably suppressed.
  • the expression of the plasmid can be reduced by using the plasmid shuttle. After confirming that conversion was possible, the present invention was completed.
  • the present invention provides a plasmid shuttle between Escherichia coli and Brevibacillus genus useful for transformation of Brevibacillus genus bacteria by genetic recombination and production of protein by the transformant.
  • a vector and a transformation method using the plasmid shuttle vector are provided.
  • plasmid shuttles that efficiently secrete and express the target gene in Brevibacillus bacteria, but are suitable for gene expression and protein production in Previbacillus bacteria that have a gene expression regulatory region that significantly suppresses its expression in Escherichia coli Provide vector.
  • the present invention provides a method for transforming a bacterium belonging to the genus Brevibacillus using the plasmid shuttle vector and a method for producing a protein, which comprises culturing the bacterium belonging to the genus Brevibacillus transformed using the plasmid shuttle vector. I do.
  • S D sequence (S D 1) is shown.
  • Fig. 4 Shows the SD sequence (SD 2).
  • R2L type 6 modified signal peptides (base sequence in upper row, amino acid sequence in lower row) are shown.
  • the PCR cloning primer 1-4 is shown.
  • the PCR cloning primer 1 is shown.
  • the PCR cloning primer-1 is shown.
  • the PCR cloning primer 17 is shown.
  • the PCR cloning primer 19 is shown.
  • the PCR cloning primer 1 is shown.
  • the PCR cloning primer 14 is shown.
  • the PCR cloning primer 15 is shown.
  • 1 shows a restriction map of plasmid shuttle vector pNCMO2.
  • E. coli JM109 / pNCM02BLA and E. coli JM109 / pNC 3 1 is a drawing-substituting photograph showing halo-forming ability and growth by 01 BLA.
  • FIG. 1 shows the process of constructing a recombinant gene expression plasmid pNCM02CT.
  • FIG. 1 is a photograph as a substitute for a drawing showing a Kumasi-Priliantolu-single staining image and a Western plotting image of a culture of a transformant Previbacillus choshinensis HPD 31 -S5 / pNCM 02 CT.
  • the plasmid shuttle vector of the present invention is a plasmid shuttle vector capable of replicating in both Escherichia coli and Brevibacillus bacteria, a promoter that can function in Brevibacillus bacteria, and a Brevibacillus bacteria and Escherichia coli. It has a DNA sequence encoding the gene for selection.
  • the plasmid shuttle vector of the present invention comprises Escherichia coli and Brevibacill. It is capable of autonomous replication in bacteria of the genus Genus. Therefore, a recombinant gene expression plasmid can be constructed by an operation such as insertion of a DNA fragment into the plasmid shuttle vector of the present invention using Escherichia coli, and further using the recombinant gene expression plasmid. Brevibacillus bacteria can be transformed.
  • the promoter that can function with the Brevibacillus bacterium possessed by the plasmid shuttle vector of the present invention is not particularly limited as long as it functions with the Brevibacillus bacterium, but is preferably a promoter derived from the Brevibacillus bacterium. Evening — is. Particularly preferred examples are the MWP promoter overnight region derived from Brevibacillus brevis 47 (conventionally, Notillus brevis 47) (Japanese Patent Publication No. 1-58950, Japanese Patent Publication No. 7-108224), or Brevibacillus. ⁇ HWP promoter overnight region derived from C.
  • chinensis HPD31 (FERM BP-6863) (conventionally, this strain is the same as Bacillus brevis H102 (FERM BP-1087))
  • the promoters included in Kaihei 4-278 091 and JP-A-6-133782 for example, P2 promoter overnight (SEQ ID NO: 1; FIG. 1).
  • the plasmid shuttle plasmid of the present invention encodes a ribosome binding region (SD sequence) at the 3 'end of a promoter that functions in a bacterium belonging to the genus Brevibacillus, and a signal peptide for secreting the expressed protein.
  • SD sequence for example, sequences derived from the HWP gene expression regulatory region of Brevibacillus choshinensis, such as SD1 (SEQ ID NO: 3; FIG. 3) and SD2 (SEQ ID NO: 4: FIG. 4), can be used.
  • a signal peptide contained in the HWP promoter region of Brevibacillus choshinensis HPD31 (FERM BP-1087, FERM BP-6863) can be used.
  • R2L A modified HWP signal sequence such as type 6 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-170984) can be mentioned.
  • R 2 L 6 type modified signal peptide the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 5;
  • the nucleotide sequence of the DNA to be loaded is shown in SEQ ID NO: 21. Both sequences are shown in Fig. 5. In the figure, the base sequence is shown in the upper row, and the amino acid sequence is shown in the lower row.
  • the plasmid shuttle vector of the present invention contains a DNA sequence encoding a replication control region necessary for replication in bacteria.
  • the replication control region may be the same for both Brevibacillus bacteria and Escherichia coli, or may be different for each.
  • the replication control region in Brevibacillus bacteria consists of: a Rep protein gene and an origin of replication.
  • the sequence that can function as a replication control region in Brevibacillus bacteria is not particularly limited as long as it is a DNA sequence that is contained in a plasmid that replicates and propagates in Brevibacillus bacteria and acts as a plasmid replication control region.
  • Particularly preferred examples include the DNA sequence encoding the Rep protein gene derived from the plasmid pUB110 and the replication origin.
  • Escherichia coli requires a replication origin as a replication control region.
  • the DNA sequence encoding a replication origin that can function in Escherichia coli is not particularly limited as long as it is a DNA sequence that is contained in a plasmid that replicates and proliferates in Escherichia coli and acts as a plasmid replication origin.
  • a DNA encoding a pUC system such as pUC18, pUC118 or pUC119 or a plasmid ORB region such as pBR322 or the like which is commonly used for genetic recombination using Escherichia coli. Is an array.
  • a complex that can function in both Brevibacillus bacteria and Escherichia coli As a DNA sequence encoding a control region of pLS1 / pE194 plasmid family (Del Solar, G. et al., Mol. Microbio), a replication control region capable of functioning in both gram-positive and gram-negative bacteria. l., 8, 789-796 (1993)).
  • a replication control region composed of ori, RepA, and RepB of plasmid pLA106 derived from Lactobacillus acidophilus (Sano, K. et al., FEMS Microbiology Letters, 148, 223). -226 (1997)) can be used.
  • the plasmid shuttle vector of the present invention has a sequence capable of functioning as a selection marker for Brevibacillus bacteria and Escherichia coli even if the same sequence is used for both Brevibacillus bacteria and Escherichia coli.
  • a different one may be used.
  • a sequence that can function as a selection marker a drug resistance gene can be used.
  • DNA sequences containing drug resistance genes derived from Brevibacillus bacteria and closely related Bacillus bacteria can be used.
  • Particularly preferred examples include the neomycin resistance gene contained in the plasmid vector pNY301 (Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • the erythromycin resistance gene contained in pHT110 (Patent No. 2727391).
  • Escherichia coli DNA sequences encoding kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene and the like, which are known drug resistance genes derived from Escherichia coli, can be used.
  • a zeocin resistance gene or the like can be used as a drug resistance gene capable of functioning in both bacteria of the genus Brevibacillus and Escherichia coli.
  • the plasmid shuttle vector of the present invention can include a DNA sequence having a function of suppressing expression of the recombinant gene in Escherichia coli.
  • a lac operator sequence derived from Escherichia coli (SEQ ID NO: 2; FIG. 2) can be included at the end of the promoter sequence that functions in a bacterium belonging to the genus Previbacillus.
  • the plasmid shuttle vector of the present invention is novel, for example, pNCMO2 is a 5,224 bp plasmid vector.
  • FIG. 21 shows a restriction map of pNCMO2 and a partial nucleotide sequence including the promoter.
  • the promoter region of NCMO2 is a P2 promoter derived from the HWP promoter region of Brevibacillus choshinensis HPD31, a lac operelle derived from Escherichia coli, an SD sequence, and a R2L6 modified secretory signal peptide. It contains an HS gene (JP-A-9-1224677) as a variable signal peptide, a multi-cloning site, and an overnight mine.
  • Pstl, BamHI, Sail, XbaI, Xhoe, EcoRI, Kpnl, Smal, Clal, and HindII sites can be used as a closing site.
  • the plasmid shuttle vector pNCMO2 contains a neomycin resistance gene as a selection marker gene for Brevibacillus bacteria, a pUB110-derived Rep protein gene required for replication in Brevibacillus bacteria, and C01 as a replication origin in Escherichia coli.
  • the E1 or i region has a DNA sequence encoding an ampicillin resistance gene as a selective gene for E. coli.
  • Plasmid pNY301 is disclosed in JP-A-10-295378.
  • other plasmids used for constructing the plasmid shuttle vector of the present invention can be purchased on the market.
  • the host used for the construction of the expression plasmid of the present invention is not particularly limited as long as it is a strain belonging to Escherichia coli, but a particularly preferred example is Escherichia coli JM109.
  • Escherichia coli JM109 is a known strain and can be purchased on the market.
  • Hosts used for expression of the recombinant gene of the present invention include Brevibacillus sp. Although any strain belonging to any strain can be used, Brevibacillus choshinensis is preferred. Particularly preferred examples include Brevibacillus choshinensis HPD 31 (FERM BP-1087, FERM BP-6863) and its mutant strain Previbacillus' choshinensis HPD 31-S5 (FERM BP-6623). Can be.
  • the method of transforming a bacterium belonging to the genus Brevibacillus using the shuttle vector of the present invention and a recombinant gene expression plasmid constructed by Escherichia coli may be performed by a transformation method known to those skilled in the art, such as an electoporation method.
  • the medium used for culturing the transformant of the present invention contains a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts as necessary.
  • the culture may be performed using a synthetic medium mainly containing sugars and inorganic salts.
  • an auxotrophic strain it is desirable to add nutrients necessary for its growth to the medium. If necessary, the medium may be supplemented with an antibiotic or an antifoam.
  • the initial pH of the medium is adjusted to 5.0 to 9.0, preferably to 6.5 to 7.5.
  • the culturing temperature is usually 15 ° (° 42 ° 0; preferably 24 to 37 ° C.), and the culturing time is generally 16 to 360 hours, preferably 24 to 144 hours.
  • the transformed Brevibacillus spp. Produces and accumulates proteins in the culture broth.
  • the target protein can be collected from the culture by solvent extraction, ultrafiltration, ammonium sulfate fractionation, HPLC, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography. It is possible by appropriately combining protein purification methods known to those skilled in the art, such as graphing, electrophoresis, and isoelectric focusing.
  • solvent extraction ultrafiltration, ammonium sulfate fractionation, HPLC, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography. It is possible by appropriately combining protein purification methods known to those skilled in the art, such as graphing, electrophoresis, and isoelectric focusing.
  • HPLC high-hexane
  • gel filtration chromatography gel filtration chromatography
  • ion exchange chromatography affinity chromatography
  • hydrophobic interaction chromatography hydrophobic interaction chromatography
  • the resulting PCR product was To obtain a DNA fragment of about 2 kbp containing a Co1E1 ori region which is a replication origin of E. coli and an ampicillin resistance gene.
  • PCR For PCR, use a PCR kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). Primer: 100 pmo IT aq polymerase 2.5 units, dNTP 200 M, pUC 119 template DNA 1 Tig 100 zl 10111 ⁇ : Tris-hydrochloric acid (pH 8.5) ⁇ 2.5 mM M + 50 mM potassium chloride, 100 / g / ml ⁇ serum albumin) mixed, kept at 96 ° C for 30 seconds, Thermal denaturation (94 ° C, 60 seconds), primer annealing (54.C ;, 60 seconds), and primer extension (70 ° 60 seconds) were performed for 25 cycles. Is the condition 1.
  • Brevibacillus choshinensis HPD31 a P5 promoter derived from the HWP promoter region and a secretory signal peptide containing a natural HWP signal peptide sequence as a plasmid pNY301 (JP-A-10-295376).
  • the DNA fragment of about 2 kbp previously obtained at the Sse8387 I site was subjected to T4 DNA ligase using a DNA ligation kit (Takara Shuzo). Connected.
  • Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed by the CaCl 2 method (Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Srin 1 Harbor Laboratory, 1, 82, (1989)). Plasmid was extracted from the obtained ampicillin-resistant transformant. The obtained plasmid was a novel plasmid shuttle replicable in Escherichia coli and bacteria of the genus Brevibacillus, and was named pNC301.
  • Plasmid shuttle vector pNC301 is a P5 promoter derived from the HWP promoter overnight region of Brevibacillus typhidininsis HPD31, a neomycin resistance gene as a selection marker gene for Brevibacillus, and C01 as a replication origin in E. coli.
  • the E1 or i region contains the ampicillin resistance gene as a selective marker gene for E. coli. Further, it includes a natural HWP signal peptide as a secretory signal peptide. (Fig. 22)
  • Primer 3 (SEQ ID NO: 8: FIG. 8) and Primer 4 (SEQ ID NO: 9: FIG. 8) were obtained by removing the entire length of pNC301 from the plasmid shuttle vector pNC301 excluding the HWP promoter region derived from Previbacillus choshinensis HPD31. Amplified by the PCR method under condition 1 using 9), the amplified fragment of about 5 kbp was treated with Be1I, and self-ligated with T4 DNA ligase. Using this D NA was transformed with CaC 1 2 method into E. coli JM109, to obtain a plasmid pN C.
  • the PCR reaction conditions were as follows: (denaturation temperature: 94 ° C to 60 sec, annealing temperature: 54 ° C to 120 sec, DNA strand elongation temperature: 70 ° C to 180 sec. (The cycle is repeated 25 times.)
  • pGEM-TP2 + was treated with BamHI and PstI, the obtained fragment of about 400 bp was inserted into the BCI1I / PstI site of pNC, and T4DNA ligase was used. after ligation was transformed with C a C 1 2 method into E. coli JM 109.
  • a plasmid was extracted from the obtained ampicillin-resistant strain to obtain a novel plasmid shuttle vector pNCMO2 (FIG. 23).
  • FIG. 21 shows a restriction enzyme map of the novel plasmid shuttle vector pNCMO2 thus obtained and a partial nucleotide sequence containing a promoter and the like.
  • Brevibacillus' choshinensis HPD 31-S5 (FERM BP-6623) was transformed using this plasmid shuttle vector in the same manner as described above, and the resulting transformant (Brevibacil lus choshinens is HPD) was transformed.
  • 31 -S 5 / pNCMO 2 was deposited internationally as FERM BP-7394.
  • Table 1 shows the transformation efficiency of pNCM02 and pNC301.
  • the transformation efficiency of both vectors against Escherichia coli JM109 was sufficiently high.
  • the transformation efficiency of pNCMO2 for Brevibacillus choshinensis HPD 31-S5 was lower than that of pNC301, but was sufficiently high for the purpose of inserting the constructed plasmid.
  • transformation CaC 1 2 Method of E. coli JM109 (M o lecuiar Clonin, Co ld Spring Harbor Laborat ory, P rese 5 1, 82, (1989)) was performed using,
  • the transformation of Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 was carried out by electroporation (Takagi, H.
  • the Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis) porcine (BLA) gene was used as a template with pHY4631 (Yamagata, H. et al., J. of Biot echnol, 169, 1239-1245 (1987)) as a template.
  • pHY4631 Yamagata, H. et al., J. of Biot echnol, 169, 1239-1245 (1987)
  • SEQ ID NO: 14: FIG. 14 and Primer 10 (SEQ ID NO: 15: FIG. 15) were used for amplification by PCR.
  • the obtained PCR product was digested with restriction enzymes Pstl and Hindlll to obtain a DNA fragment of about 1.5 kb containing the BLA gene.
  • the plasmid vectors pNCM02 and pNC301 constructed in Example 1 were digested with restriction enzymes PstI and Hindlll, the fragment containing the BLA gene obtained above was ligated with T4 DNA ligase, and plasmid vector Yuichi pNCM02BLA, And pNC30 IB LA were obtained ( Figure 24). Further, Escherichia coli JM109 was transformed by the CaCl 2 method using the plasmids pNCMO2BLA and pNC301BLA, respectively. E. coli JM109 / pNC301BLA was obtained.
  • a plasmid containing the BLA gene for example, a DNA fragment excised from HT110BLA (Patent No. 2727391) could also be used.
  • E. coli JM109 / pNCM02BLA and E. coli JMl09 / pNC301BLA were inoculated on LA agar medium containing 3% starch, and cultured at 37 ° C overnight to form colonies.
  • Fig. 26 Drawing substitute photograph.
  • E. coli JM109 / pNCM02BLA was suppressed as compared with E. coli JM109 / pNC301 BLA due to the smaller halo size around the colony.
  • E. coli JM109 / pNCM02BLA grew faster. This is thought to be because the expression of 81 ⁇ A was efficiently suppressed in Escherichia coli JM109 /]] ⁇ 028] ⁇ 8, resulting in reduced stress on the strain and improved growth.
  • Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 is transformed by electroporation with each of the plasmid vectors PNCM02BLA and pNC30 IB LA obtained in (1), and each of the plasmid vectors pNCMO 2BLA and NC301 BLA is retained.
  • the transformant, Brevibacillus' Cowshinensis HPD31-S5 / pNCMO 2 BLA, Brevibacillus ⁇ Cowshinensis HPD31-S5 / pNC301BLA was obtained (FIG. 24).
  • the electro-bore is a 1.5 kV, 1 kV using Genepulsa-1 (BioRad).
  • the test was performed under the conditions of 000 ohm, 25 F, and 1.8 ms e c. Each transformant was inoculated into a test tube containing 1.5 ml of TMN medium and cultured with shaking at 30 ° C for 2 days. The culture solution was centrifuged, and the amylase activity of the culture supernatant was determined using soluble starch as a substrate according to the method of Saito (Arch. Biochem. Biophys).
  • Plasmid pT7Blue (manufactured by Novagen) and the previously obtained CTA gene or CTB gene were ligated using T4 ligase to obtain plasmids pT7BlueCTA and pT7BlueCTB that retain the CTA gene and CTB gene.
  • Plasmid PNY326 (a signal peptide of pNY301 (Japanese Patent Laid-Open No. 10-295378) converted to R2L6 type (SEQ ID NO: 5, 21: Fig. 5)) was treated with Nc0I and Hindlll and treated with 3.6kbp. A fragment was obtained.
  • pT 781116 ⁇ Chain was treated with 1 001 and 11; 111 (1111) to obtain a 0.7 kbp DNA fragment containing the CT ⁇ gene, and the previously obtained 3.6 kbp gene fragment and T 4 Ligation was carried out using DNA ligase Ligation DNA was used to transform Previbacillus thiocyaninsis HPD31-S5 by electroporation, and plasmid was extracted from the obtained neomycin-resistant strain, and CT PNY 326 CTA carrying the A gene was obtained.
  • PNY326 is treated with Nc 0 I and B amHI to 3.6 kbp DNA fragment was obtained.
  • pT7BlueCTB was treated with Ncol and BamHI to obtain a 0.3 kbp DNA fragment containing the CTB gene, and ligated to the previously obtained 3.6 kbp DNA fragment using T4 DNA ligase.
  • Brevibacillus choshinensis HPD 31-S5 was transformed with the ligated DNA, and a strain having a neomycin resistant strain was selected. Plasmid was extracted from the selected strain to obtain plasmid pNY326 CTB, which retains the CTB gene.
  • pNY326 CTB was treated with BamHI and Hindlll to obtain a 4.7 kbp DNA fragment. Further, using two kinds of primers 15 (SEQ ID NO: 20: FIG. 20) and primer 11 (SEQ ID NO: 16: FIG. 16) with pNY326 CTA as a template, the CTA gene containing the SD 2 sequence (SD— It was amplified by PCR using the CTA gene (0.8 kbp). The ⁇ 11 product was treated with 8 & 111111 and Hindlll to obtain a 0.4 kbp fragment, and ligated to the previously obtained 4.7 kbp DNA fragment derived from pNY326 CTB using T4 DNA ligase.
  • SD SD 2 sequence
  • Brevibacillus choshinensis HPD 31-S5 was transformed by the electroporation method, and neomycin 50 ⁇ / 1111 containing choline) ⁇ agar medium (1% peptone, 0.2% yeast extract, 0.2% 5% meat extract, 1% glucoamylase one scan, 0. 001% Fe S0 4 ⁇ 7H 2 O s 0. 001% MnS0 4 ⁇ 4H 2 O 0. 0001% ZnS0 4 ⁇ 7 H 2 0, 1. 5% agar , PH 7.0), and attempted to select a strain with neomycin resistance, but no resistant strain was obtained. Electroboration was performed using Gene Pulser (BioRad) at 1.5 kV, 1000 ohms, 25 / F, 1.8 ms ec.
  • BioRad Gene Pulser
  • PNCM02 the Nco l and B AMH I is treated with 5. Further c to obtain a fragment of 2 kbp, a 0. 3 kbp DNA fragment containing the CTB gene by processing pT7BlueCTB with Nco I and B AMH I
  • the 5.2 kbp gene fragment obtained above was ligated with T4 DNA ligase (FIG. 29). Escherichia coli JM109 was transformed with the ligated DNA, and the plasmid was extracted to obtain pNCMO 2 CTB carrying the CTB gene.
  • PNCM02CTB was treated with BamHI and Hindlll to obtain a 5.5 kbp fragment.
  • the SD-CTA gene (0.8 kbp) obtained in Example 4 (5) was treated with BamHI and Hindlll to recover a 0.8 kbp fragment, and the 5.5 kbp gene fragment obtained earlier and T 4 Ligation was performed using DNA ligase (FIG. 29).
  • Escherichia coli JM109 was transformed using the ligated DNA, and a strain having ampicillin resistance was selected. Plasmids were extracted from the selected strains to obtain three plasmids, pNCM02CT, which retain the CTB gene.
  • the strain obtained here was Escherichia coli J Ml09 / pNCM02 CT.
  • Brevibacillus choshinensis HPD 31-S5 was transformed by electroporation with PNCM02 CT extracted from Escherichia coli JMl 09 / pNCM02 CT, and a large number of transformants retaining the plasmid were obtained.
  • the obtained strain was designated as Brevibacillus' Thiosinensis HPD31-S5 / pNCMO2CT.
  • Electroboration was performed using Gene Pulser (BioRad) at 1.5 kV, 1,000 ohms, 25 / F, 1.8 ms ec. (3) Expression of CT by Brevibacillus choshinensis HPD 31 -S 5 / pNC MO 2 CT
  • Brevibacillus choshinensis HPD31-S5 / pNCMO2CT is shake-cultured at 30 ° C for 2 days in 3 ml of TM liquid medium containing neomycin 50 ⁇ g / m1 in a medium test tube and cultured.
  • the supernatant was subjected to SDS-PAGE, and analyzed by Coomassie priliable blue staining and Western blotting using a egret CT polyclonal antibody.
  • the estimated molecular weights of the eighteen and eight proteins were 28 kDa and 12 kDa, respectively, and each showed a staining band at a position with a considerable molecular weight.
  • the secretion production of CTA was 7 Omg based on the band density. / 1, CTB secretory production was estimated to be 3 OmgZl
  • the SDS-PAGE electrophoresis pattern is shown in the drawing-substitute photograph (Fig. 30). (Microbial Pathogenes is, 16, 71-79 (1994).) When the purified fraction was run without heat treatment, the band shifted to the position of about 9 OkDa. It was presumed that the expressed unit had a 1A5B structure.
  • the present invention provides a plasmid shuttle between Escherichia coli and bacteria of the genus Brevibacillus.
  • the plasmid shuttle vector of the present invention suppresses gene expression in Escherichia coli as shown in the results of the expression of the BLA gene in Example 3, and enables efficient gene expression in Brevibacillus choshinensis. It can be carried out.
  • the plasmid shuttle vector PNCM02 of the present invention is particularly useful for constructing a recombinant gene expression plasmid which requires complicated gene construction. It is also useful for protein production by a transformant transformed with the recombinant gene expression plasmid.
  • Brevibacillus choshinensis HPD31 (FERM BP-1087) i The name and address of the depositary institution that deposited the microorganism.

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Description

明細 i 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルべクタ一 発明の属する技術分野
本発明は、 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクター および該プラスミドシャトルベクターを用いたブレビバチルス属細菌の形質転 換方法に関する。 また特には、 ブレビバチルス属細菌中で目的遺伝子を効率的 に分泌発現するが、 大腸菌ではその発現が著しく抑えられる遺伝子発現調節領 域を持つプレビバチルス属細菌でその遺伝子発現に適したプラスミドシャトル ベクターに関する。 更には、 該形質転換方法により形質転換された形質転換体 を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法に関する。 従来の技術
鵜高らは、 菌体外に多量のタンパク質を分泌し、 また菌体外プロテア一ゼ活 性が弱いという大腸菌、 枯草菌にない優れた特徴を持つブレビバチルス属 （従 来のバチルス属の分類から分離） 細菌を宿主とする遺伝子組み換えタンパク質 の発現系の開発に成功した。 （特許第 2082727号、 特開昭 62— 201
583号公報、 Yamagat a, H. ら， J. Bact er io l., 16 9, 1239 - 1245 (1987)、 鵜高重三、 日本農芸化学会誌 61， 6
69 - 676 (1987)、 Takao, M. ら， Appl. Microbi o 1. Bl ot echnol., 30， 75— 80 ( 1989 )、 Y ama g a ta, H, ら， Pro c. Nat l. Acad. Sc i., USA86, 35 89 - 3593 (1989))。 また、 これまでにブレビバチルス属細菌を宿主 とした発現系によるひ一アミラーゼ （特許第 2082727号)、 ヒト上皮細 胞増殖因子 （hEGF) (特許第 2787585号） の生産などが報告されて いる。
一方、 これまでに、 ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプ ラスミドベクタ一としては、 例えば、 pNU200 (鵜高重三、 日本農芸化学 会誌 61, 669 - 676 ( 1987))、 pNH300 (Shiga, Y. ら3 Appl ied and Environment al Microbiol ogy, 58, 525 - 531 ( 1992))、 pNH400 (I shihar a, T, ら， J, Bact erio l., 177, 745- 749 (1995))、 pHY 700 (特開平 4— 278091号公報)、 pHT系プラスミド （特許 2727391号） などが報告されている。 特に、 本発明者らは、 ブレビバチ ルス属細菌の形質転換に有用なプラスミドベクターとして pNY301他の p NY系プラスミド （特開平 10— 295378号公報） を特許出願した。 発明が解決しょうとする課題
前記のように、 ブレビバチルス属細菌を宿主として用いるタンパク質の分泌 生産系は、 遺伝子組換えによるタンパク質生産において有用な系のひとつであ る。 しかしながら、 従来、 ブレビバチルス属細菌の形質転換効率は、 大腸菌の 形質転換効率に比べて低く、 そのため大腸菌に比較するとブレビバチルス属細 菌を用いた組換え遺伝子発現プラスミドの構築は困難であるという欠点があつ た。 例えば、 エレクトロボレ一シヨン法 （Takagi, T. ら， Agric. Bi o l. Chem., 53, 3099-3100 ( 1989)) を用いた場合、 大腸菌での形質転換効率は 101QCFU/ugDNAに達するが、 ブレビバチ ルス属のブレビバチルス 'チョウシネンシス（Bre vibac i 11 u s c ho shinens i s) (従来は チルス'ブレビス（B a c i 11 u s b ： revis)。 Shida 0. ら， Int. J. S y s t . Bact eri o l.， 46, 939 - 946 ( 1996) において分類学的位置の変更があ つた。） の場合、 107CFU/ugDNAに過ぎなかった。 またエレクトロボ レ一シヨン法以外の方法を用いた場合、 ブレビバチルス属細菌の形質転換効率 は更に低下することが知られていた。
特に複雑な高次構造を持ったタンパク質、 例えば 1つの Aサブュニッ トと 5つの Bサブュニヅトからなるコレラ菌 （Vibrio cho lera Θ) によって生産されるコレラトキシン （CT) (Clement s and Finke l s t e in, I n t e c t . I mmu n. , 24； 760-76 9 ( 1979)) などのタンパク質をコードした遺伝子によるブレビバチルス 属細菌の形質転換および該形質転換体によるタンパク質生産には、 これまで多 犬な困難があった。
この課題に対する解決策のひとつとして、 形質転換操作が容易な他の宿主 細胞、 例えば大腸菌内でも複製可能なプラスミ ドぺク夕一 （以下、 「シャトル ベクタ一」 という。） を用い、 まず、 その宿主細胞を用いて組換え遺伝子発現 プラスミドの構築を行い、 更に、 その組換え遺伝子発現プラスミドを用いてブ レビバチルス属細菌の形質転換をエレクトロポレーション法などにより行う方 法が考えられる。
シャトルべクタ一およびシャトルべクタ一を用いた形質転換方法は、 当 業者に公知の技術である。 たとえば大腸菌と枯草菌間のシャトルべクタ一とし ては、 特許公開昭 63 - 198986号公報、 特許公開 2000- 19749 1号公報などが報告されている。 しかしながら、 これまでブレビバチルス属細 菌の遺伝子組換えによる形質転換作業および該形質転換体による組換え遺伝子 発現に利用可能なプラスミドシャトルべクタ一および該プラスミドシャトルべ クタ一を用いたブレビバチルス属細菌の形質転換方法は知られていなかった。 課題を解決するための手段
本発明者らは、 ブレビバチルス属細菌を宿主とした発現系において、 目的夕 ンパク質を菌体外に分泌するという有用性に着目し、 また、 上記した欠点を解 決する新規宿主一べクタ一系の開発の必要性を痛感し、 大腸菌およびブレビバ チルス属細菌を宿主とすることができ、 遺伝子組換えに使用可能な新規プラス ミドシャトルべク夕一を開発することとした。
そこで上記目的を達成するため、 本発明者らは、 数多くのプラスミドべ クタ一の中から特に本発明者らが既に特許出願したプラスミドベクター p N Y 3 0 1がブレビバチルス ·チョウシネンシス H P D 3 1由来のプロモ一夕一及 び分泌シグナル配列を含有している点に改めて着目し、 このプラスミドベクタ — P N Y 3 0 1をもとに、 各種の D NA配列を P C R法等によって合成したり あるいは既知の配列から切り出したりし、 更にこれらの D NA断片を該プラス ミドぺク夕一に組み込み、 組み込まれることを確認しただけでなく、 得られた プラスミドによる形質転換の確認、 形質転換体における発現の確認等、 デリケ —トにして莫大な数の各種処理、 操作を試行錯誤した結果、 遂に目的とする新 規なプラスミドシャトルべクタ一の創製に成功した。
そして、 このようにして創製するのに成功した新規プラスミドシャトル ベクタ一を大腸菌およびブレビバチルス属細菌に導入し、 得られた細菌を培養 したところ、 何れの宿主においても該プラスミドシャトルベクターの複製が行 われた。 また該プラスミドシャトルべクタ一を用いた組換え遺伝子発現におい て、 ブレビバチルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、 大腸菌 ではその発現が著しく抑えられることを見出したこと、 更に他の公知の方法で は、 ブレビバチルス属細菌の形質転換体が得られない場合においても、 該プラ スミドシャトルぺク夕一の使用により形質転換が可能なことを確認し本発明を 完成した。
すなわち、 本発明は、 上記課題を解決するためにブレビバチルス属細 菌の遺伝子組換えによる形質転換および該形質転換体による夕ンパク質生産に 有用な大腸菌とブレビバチルス属細菌との間のプラスミドシャトルベクターお よび該プラスミドシャトルぺク夕一を用いた形質転換方法を提供する。 特には、 ブレビバチルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、 大腸菌では その発現が著しく抑えられる遺伝子発現調節領域を持つプレビバチルス属細菌 での遺伝子発現およびタンパク質生産に適したプラスミドシャトルべクタ一を 提供する。 更に該プラスミドシャトルべクタ一を用いたブレビバチルス属細菌 の形質転換方法、 および該プラスミドシャトルベクタ一を用いて形質転換され たブレビバチルス属細菌を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法を 提供する。
,図面の簡単な説明
図 1
P 2プロモーターを示す。
図 2
L a cオペレータ配列を示す。
図 3
S D配列 （S D 1 ) を示す。
図 4 SD配列 （SD 2) を示す。
図 5
R2L 6型の改変シグナルべプチド（上段に塩基配列、下段にアミノ酸配列） を示す。
図 6
P CRクロ一ニングプライマ一 1を示す。
図 7
P CRクローニングプライマ一 2を示す。
図 8
P CRクローニングプライマー 3を示す。
図 9
P CRクローニングプライマ一 4を示す。
図 10
P CRクローニングプライマ一 5を示す。
図 11
P C Rクローニングプライマ一 6を示す。
図 12
P C Rクローニングプライマ一 7を示す。
図 13
P C Rクロ一ニングプライマ一 8を示す。
図 14
P CRクローニングプライマ一 9を示す。
図 15
P CRクロ一ニングプライマ一 10を示す。 図 16
PCRクロ一ニングプライマー 11を示す。
図 17
PCRクローニングプライマ一 12を示す。
図 18
P CRクローニングプライマ一 13を示す。
図 19
PCRクローニングプライマ一 14を示す。
図 20
PCRクローニングプライマ一 15を示す。
図 21
プラスミドシャトルべクタ一 pNCMO 2の制限酵素地図を示す。
図 22
プラスミドシャトルべクタ一 pNCMO 2の構築の過程を示す。
図 23
同上続きを示す。
図 24
組換え遺伝子発現プラスミド PNCM02BLAおよび pNC301 BLA の構築の過程を示す。
図 25
大腸菌 JM109/ 〇1 0251^ ぉょび大腸菌 ^4109/pNC 3 01 BLAの生産性を示す。
図 26
大腸菌 JM109/pNCM02BLAおよび大腸菌 JM109/pNC 3 01 BLAによるハロー形成能および生育を示す図面代用写真である。
図 27 .
大腸菌 JM109/pNCMO 2BLAによる BLA発現に対する I PTG の効果を示す図面代用写真である。
図 28
ブレビバチルス，チョウシネンシス HPD 31-S 5/pNCM02BLA およびブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 31 -S 5/pNC 301 B L Aによる B L Aの生産性を示す。
図 29
組換え遺伝子発現プラスミド pNCM02 CTの構築の過程を示すものであ る。
図 30
形質転換体プレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 31 -S 5/pNCM 02 C Tの培養物のクマシ一プリリアントプル一染色像およびウエスタンプロ ッティング像を示す図面代用写真である。 発明の実施の形態
以下、 本発明について詳しく説明する。
本発明のプラスミドシャトルべクタ一は、 大腸菌およびブレビバチル ス属細菌のいずれにおいても複製可能なプラスミドシャトルべクタ一であり、 ブレビバチルス属細菌において機能し得るプロモー夕一、 およびブレビバチル ス属細菌および大腸菌に対する選択マ一力一遺伝子をコードした DNA配列を 有する。
本発明のプラスミドシャトルベクタ一は、 大腸菌およびブレビバチル ス属細菌で自律複製可能である。 したがって、 大腸菌を用いて本発明のプラス ミ ドシャトルべクタ一への DNA断片の挿入などの操作により組換え遺伝子発 現プラスミ ドを構築することができ、 更に該組換え遺伝子発現プラスミ ドを用 いてブレビバチルス属細菌の形質転換を行うことができる。
本発明のプラスミ ドシャトルべクタ一が有するブレビバチルス属細菌 で機能し得るプロモー夕一は、 ブレビバチルス属細菌で機能するものであれば、 特に限定されないが、 好ましくはブレビバチルス属細菌に由来するプロモー夕 —である。 特に好ましい例としてブレビバチルス ·ブレビス 47 (従来は、 ノ チルス■ブレビス 47) 由来の MWPプロモ一夕一領域 （特公平 1— 5895 0号公報、 特公平 7— 108224号公報)、 または、 ブレビバチルス ·チヨ ゥシネンシス HPD31 (FERM B P— 6863 ) (従来は、 バチルス ' ブレビス、 本菌株は、 バチルス 'ブレビス H102 (FERM BP— 108 7) と同一菌株である。） 由来の HWPプロモ一夕一領域 （特開平 4— 278 091号公報、 特開平 6— 133782号公報） に含まれるプロモ一夕一、 例 えば P 2プロモ一夕一 （配列番号 1 ：図 1) などを挙げることができる。
更に本発明のプラスミ ドシャトルぺク夕一は、 ブレビバチルス属細菌 で機能するプロモーターの 3' 末端側にリボソーム結合領域 （SD配列)、 発 現夕ンパク質を分泌するためのシグナルぺプチドをコードする DN A配列を含 む。 SD配列は、 例えば SD 1 (配列番号 3 ：図 3) や SD2 (配列番号 4 ： 図 4) などのブレビバチルス ·チョウシネンシスの HWP遺伝子発現調整領域 に由来する配列を用いることができる。 また、 分泌シグナルペプチドとしては、 例えば、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31 (FERM BP- 1 087、 FERM BP— 6863) の HWPプロモー夕一領域に含まれるシ グナルペプチドなどを使用することができる。 特に好ましい例として、 R2L 6型などの改変 HWPシグナル配列 （特開平 7— 170984号公報） を挙げ ることができる （この R 2 L 6型改変シグナルペプチドについて、 そのアミノ 酸配列を配列番号 5に示し、 それをコ一ドする D N Aの塩基配列を配列番号 2 1に示す。 また両者の配列を図 5に示す。 図中、 上段に塩基配列、 下段にアミ ノ酸配列を示す。）
また本発明のプラスミドシャトルベクタ一は、 細菌中での複製に必要な 複製制御領域をコードする DN A配列を含む。 複製制御領域は、 ブレビバチル ス属細菌および大腸菌の両方に対して同一のものを使用しても、 各々に対して 異なったものを使用しても構わない。 ブレビバチルス属細菌における複製制御 領域は、 ： Repタンパク質遺伝子と複製開始点からなる。 ブレビバチルス属細 菌において複製制御領域として機能し得る配列は、 ブレビバチルス属細菌にお いて複製増殖するプラスミドに含まれ、 プラスミドの複製制御領域として作用 する DNA配列であるならば、 特に限定されないが、 特に好ましい例としてプ ラスミド pUB 110由来の Repタンパク質遺伝子および複製開始点をコ一 ドする D N A配列を挙げることができる。
また大腸菌においては複製制御領域として複製開始点が必要である。 大腸菌において機能し得る複製開始点をコードする DNA配列としては、 大腸 菌において複製増殖するプラスミドに含まれ、 プラスミドの複製開始点として 作用する DNA配列であるならば、 特に限定されないが、 好ましくは、 プラス ミドの複製開始点として作用する OR 1領域を含む DNA配列である。 特に好 ましくは、 大腸菌を用いた遺伝子組換え操作に通常用いられている pUC 18、 pUC118、 pUC 119などの pUC系又は pBR322などのプラスミ ドべク夕一の OR I領域をコードする DN A配列である。
更にブレビバチルス属細菌と大腸菌のいずれにおいても機能し得る複 製制御領域をコードする DN A配列として、 グラム陽性菌においてもグラム陰 性菌においても機能し得る複製制御領域である pLS 1/pE 194プラスミ ドファミリ一 （Del Solar, G. ら， Mo l. Microbio l., 8， 789 - 796 ( 1993)) に属するプラスミドの複製制御領域を挙げ ることができる。 たとえばラク卜バチルス ·ァシドフィラス （Lactobacillus acidophilus) 由来のプラスミド pLA 106の o r i、 RepA、 R e p B で構成される複製制御領域 （S an o， K. ら， FEMS Mi crobio logy Let t ers, 148, 223 - 226 (1997)) をコード する D N A配列などが使用可能である。
更に、 本発明のプラスミドシャトルベクタ一が有するブレビバチルス 属細菌および大腸菌に対する選択マーカ一として機能し得る配列は、 ブレビバ チルス属細菌および大腸菌の両方に対して同一のものを使用しても、 各々に対 して異なったものを使用しても構わない。 選択マーカ一として機能し得る配列 として、 薬剤耐性遺伝子を使用することができる。 例えば、 プレビバチルス属 細菌に対しては、 ブレビバチルス属細菌並びにその近縁関係にあるバチルス属 細菌などに由来の薬剤耐性遺伝子を含む D N A配列などを使用することができ る。 特に好ましい例として、 プラスミドベクター pNY301 (特開平 10— 295378号公報） に含まれるネオマイシン耐性遺伝子や pHT 110に含 まれるエリスロマイシン耐性遺伝子 （特許 2727391号） を挙げることが できる。 また、 大腸菌に対しては、 例えば、 公知の大腸菌由来の薬剤耐性遺伝 子であるカナマイシン耐性遺伝子、 アンピシリン耐性遺伝子、 クロラムフエ二 コ一ル耐性遺伝子などをコードする DN A配列が使用可能である。 更にブレビ バチルス属細菌と大腸菌のいずれにおいても機能し得る薬剤耐性遺伝子として ゼオシン耐性遺伝子などが使用可能である。 更に本発明のプラスミドシャトルベクターは、 組換え遺伝子の大腸菌で の発現'を抑える機能を持つ DNA配列を含むことができる。 たとえば 1 ac I 遺伝子を有する大腸菌の場合、 プレビバチルス属細菌で機能するプロモーター 配列の 3，末端側に大腸菌由来の lacオペレーター配列（配列番号 2：図 2 ) を含むことができる。
本発明のプラスミドシャトルベクタ一は新規であり、 例えば pNCMO 2は、 大きさが 5, 224 bpのプラスミドベクタ一である。 pNCMO 2の 制限酵素地図およびプロモーターを含む一部の塩基配列を図 21に示した。 p NCMO 2のプロモーター領域は、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31の HWPプロモーター領域に由来する P 2プロモーター、 大腸菌に由来す る lacォペレ一夕一、 SD配列、 分泌シグナルペプチドとして R 2 L 6型改 変シグナルペプチド、 マルチクロ一ニングサイトおよび夕一ミネ一夕一として HS遺伝子 （特開平 9一 224677号公報） を含む。 該マルチクローニング サイトは、 Ps t l、 BamHI、 Sai l, XbaI、 Xhoェ、 EcoR I、 Kpnl、 Smal、 Clal、 H i n d I I Iサイトをクロ一ニングサ ィトとして使用することができる。
また、 プラスミドシャトルベクター pNCMO 2は、 ブレビバチルス属 細菌に対する選択マーカ一遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子、 ブレビバチ ルス属細菌中での複製に必要な pUB 110由来の Repタンパク質遺伝子、 大腸菌の複製開始点として C 01 E 1 or i領域、 大腸菌に対する選択マ一 力一遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子をコードする DN A配列を持つ。
本発明のプラスミドシャトルベクタ一 pNCMO 2の構築には、 pN Y301、 ρΝΗ 326および pNU201などを用いる。 プラスミド pNY 301は、 特開平 10— 295378号において、 プラスミド ϋΝΗ 326は、 K a j i n o , T.， ら. Appl. Environ. Mi crobiol., 66, 638-642 (2000) において、 また pNU201は、 Udak a, Sリ ら, Methods in E n z ymo logy, 217, 23 -33 ( 1993) において、 それぞれ公開されており公知のプラスミドであ る。 また、 その他の本発明のプラスミドシャトルベクタ一の構築に使用される プラスミドは、 市場で購入することが可能である。
プラスミドベクタ一 pNCMO 2を保持するプレビバチルス ·チョウ シネンシス HPD 31—S 5/pNCMO 2は、 平成 12年 12月 12日通商 産業省工業技術院生命工学工業技術研究所の特許微生物寄託センター （現、 独 立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン夕一） に国際寄託され、 受 託番号 FERM BP— 7394が付されている。
本発明の発現プラスミドの構築に用いる宿主は、 大腸菌に属する菌株な らば特に限定されないが、 特に好ましい例として大腸菌 JM109を挙げるこ とができる。 大腸菌 JM109は、 公知の菌株であり市場で購入することが可 能である。
大腸菌を用いて本発明のプラスミドシャトルベクターから組換え遺伝子 発現プラスミドを構築する方法は、 当業者に公知の標準的な分子生物学的技術 に基づいた方法を適宜使用することができる。 例えば、 モレキユラ一 'クロ一 ニング ·ァ ·ラボラトリ一マニュアル第 2版、 コールド ·スプリング ·ハーバ 一 *ラポラトリー (Mo lecular Clonin 2nd ed.， A Laborat ory Manual, Cold Sprin H a r b o r Laborat ory (1989)) に記載の方法などが挙げられる が、 具体的な詳細は、 実施例に示した。
本発明の組換え遺伝子の発現に用いる宿主には、 ブレビバチルス属細 菌のいずれの株に属するものでも使用できるが、 好ましくはブレビバチルス · チョウシネンシスである。 特に好ましい例として、 ブレビバチルス ·チョウシ ネンシス HPD 31 (FERM BP— 1087、 FERM BP— 6863) やその変異株であるプレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31-S 5 (F ERM BP— 6623) などを挙げることができる。
本発明のシャトルベクターと大腸菌により構築された組換え遺伝子発現 プラスミドを用いたブレビバチルス属細菌を形質転換する方法には、 エレクト 口ポレーション法などの当業者に公知の形質転換方法を使用することができる c 本発明の形質転換体の培養に用いる培地には炭素源、 窒素源の他、 無機 塩類が必要に応じて含められる。 また、 糖と無機塩類を主とする合成培地を用 いて培養してもよい。 栄養要求性を示す菌株を用いる場合には、 その生育に必 要な栄養物質を培地に添加することが望ましい。 さらに、 必要であれば、 培地 に抗生物質や消泡剤などを加えてもよい。
また培養条件は、 培地の初発 pHを 5. 0〜9. 0、 好ましくは 6. 5〜7. 5に調節する。 培養温度は、 通常15°(〜42°0；、 好ましくは 24〜 37°Cであり、 培養時間は通常 16〜360時間、 好ましくは 24〜144時 間である。 これにより本発明の方法により形質転換されたブレビバチルス属細 菌は、 培養液中にタンパク質を生成、 蓄積する。
培養終了後、 培養物からの目的タンパク質の採取は、 溶媒抽出、 限外濾 過、 硫安分画、 HPLC、 ゲルろ過クロマトグラフィー、 イオン交換クロマト グラフィ一、 ァフィ二ティクロマトグラフィー、 疎水性相互作用クロマトグラ フィ一、 電気泳動、 等電点電気泳動などの当業者に公知のタンパク質精製方法 を適宜組合わせることにより可能である。 実施例 ,
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 これは例示的なも のであり、 本発明はこれに限定されるものではない。
実施例 1
プラスミドシャトルべクタ一 pNCMO 2の構築
(1) プラスミ ドシャトルべクタ一 pNC 301の構築
プラスミドベクタ一 pUC 119をテンプレートとしてプライマ一 1 (配列 番号 6 ：図 6) およびプライマー 2 (配列番号.7 ：図 7) を用いて PCR法に より増幅し、 得られた PCR産物を Ns i Iで切断し、 大腸菌の複製開始点で ある C o 1 E 1 o r i領域とアンピシリン耐性遺伝子を含む約 2 k b pの D NA断片を得た。
PCRは、 PCRキット （宝酒造社製） を使用し、 プライマ一を各々 1 00 pmo I T a qポリメラ一ゼ 2. 5単位、 dNTP 200 M、 pUC 119テンプレート DNA 1 Tig 100 zl 丁&(1緩衝液 （10111^：ト リス一塩酸 （pH8. 5)ヽ 2. 5mM M +\ 50mM塩化カリウム、 1 00 /g/mlゥシ血清アルブミン） を混合し、 96 °Cで 30秒保持した後、 DNAの熱変性 （94°C、 60秒)、 プライマーのアニーリング （ 54。C；、 6 0秒）、 プライマ一の伸長 （70° 60秒） を 25サイクルさせることによ つて行った。 以下、 この条件を条件 1とする。
ブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 31の HWPプロモー夕一領域 由来の P 5プロモーターおよび分泌シグナルぺプチドとして天然型 HWPシグ ナルペプチド配列を含むプラスミ ドぺク夕一 pNY301 (特開平 10— 29 5376号） の Sse8387 Iサイ トに先に得た約 2 kbpの DNA断片を DNAライゲ一シヨンキット （宝酒造社製） を用いて T4DNAリガ一ゼによ り連結した。 この DNAを用いて大腸菌 JM109 (宝酒造社製） を CaCl 2法 (Molecular Cloning 2nd e d . , A Labor a t o r y Manual, Cold S rin 1 Harbor Lab orat ory, 1 , 82, ( 1989)) により形質転換し、 得られたアンピ シリン耐性の形質転換体よりプラスミ ドを抽出した。 得られたプラスミ ドは、 大腸菌とブレビバチルス属細菌において複製可能な新規なプラスミドシャトル ぺク夕—であり、 pNC301と命名した。
プラスミ ドシャトルベクター pNC 301は、 ブレビバチルス ·チヨ ゥシネンシス HP D 31の HWPプロモ一夕一領域由来の P 5プロモーター、 ブレビバチルス属に対する選択マーカ一遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子、 大腸菌の複製開始点として C 01 E 1 or i領域、 大腸菌に対する選択マー 力一遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子を含む。 また更に分泌シグナルぺプ チドとして天然型 HWPシグナルペプチドを含む。 （図 22)
以下、 図 23を参照しながら、 プラスミ ドシャトルベクタ一 pNCMO 2の 構築について説明する。
(2) プラスミ ド pNCの構築
プラスミ ドシャトルべクタ一 pNC 301よりプレビバチルス ·チョウシネ ンシス HPD 31由来の HWPプロモー夕一領域を除いた pNC 301全長を プライマ一 3 (配列番号 8 ：図 8) とプライマ一 4 (配列番号 9 ：図 9) を用 いた条件 1の PCR法により増幅し、 増幅された約 5 kbpの断片を Be 1 I で処理し、 T 4 DNAリガ一ゼによりセルフライゲ一シヨンを行った。 この D NAを用いて大腸菌 JM109に CaC 12法で形質転換し、 プラスミ ド pN Cを得た。 P CRの反応条件は、 （変性温度： 94°C〜60 s e c、 ァニ一ル 温度： 54°C- 120 s e c、 DNA鎖伸長温度： 70°C〜180 s e cを 1 サイクルとして 25回繰り返す） とした。
(3) プラスミ ド pGEM— TP 2の構築
プラスミ ド pNU210 (Udaka, S. ら， Me thods In E nz ymo l o gy, 217, 23— 33 ( 1993)) に含まれる HWPプ ロモ—夕—領域由来の p 2プロモー夕—をコ一ドする DNA配列をプライマ一
5 (配列番号 10 ：図 10) とプライマ一 6 (配列番号 1 1 ：図 11) を用い て条件 1の PCR法により増幅し、 約 14 Obpの DNA断片を得た。.プライ マー 6には 1 a cォペレ一夕一配列が含まれるため、 この DNA断片は P 2プ ロモ一夕一の 3' 末端側に 1 a cォペレ一夕一配列を含む。 この DN A断片を pGEM-T (Pr omega社製） に T 4 D N Aリガ一ゼにより連結した。 この DNAを用いて大腸菌 JM109を CaC l2法により形質転換し、 得ら れたアンピシリン耐性の形質転換体よりプラスミ ドを抽出し、 pGEM— TP 2を得た。
(4) プラスミ ド pGEM— TP 2+の構築
プラスミ ド PNH326 (Kaj ino, T., ら. App l. Envi r on. Mi cr ob i o l., 66, 638- 642 (2000)) に含まれる ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31の HWPプロモ一夕一領域の S D 1と SD 2配列と分泌シグナルぺプチド配列である R 2 L 6型の改変 HWP シグナル配列 （特開平 7— 170984号） （配列番号 5、 配列番号 21 ：図 5) およびマルチクローニングサイ トを含む DNA配列を、 プライマ一 7 (配 列番号 12 ：図 12) とプライマー 8 (配列番号 13 ：図 13) を用いて、 条 件 1の条件で P C R法により増幅し、 約 270 b pの D N A断片を得た。 得ら れた DNA断片を制限酵素 Ns i Iと Hindlll で処理し、 pGEM— TP 2の Ps t I/HindIII サイ 卜に T 4 D N Aリガーゼで連結した。 この！） NAを用いて大腸菌 JM109をコンビテントセル法により形質転換し、 pG EM— TP 2+を得た。
(5) プラスミ ドシャトルベクタ一 pNCMO 2の構築
更に pGEM— TP 2+を B amH Iおよび P s t Iで処理し、 得られた約 400 bpの断片を pNCの B c 1 I/P s t Iサイ トに揷入し、 T 4DNA リガーゼを用いて連結後、 大腸菌 J M 109に C a C 12法で形質転換した。 得られたアンピシリン耐性株からプラスミドを抽出し、 新規なプラスミドシャ トルべクタ一 pNCMO 2を得た (図 23)。 プラスミドシャトルベクター p NCM02の構築の概要を図 22、 図 23に示す。 このようにして得た新規プ ラスミドシャトルベクター pNCMO 2の制限酵素地図及びプロモー夕一等を 含む一部の塩基配列を図 21に示した。 上記と同様にして本プラスミドシャト ルベクターを用いてブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31 - S 5 (F ERM BP— 6623) を形質転換し、 得られた形質転換体 （B r e v i b ac i l lus choshinens i s HPD 31 -S 5/pNCMO 2) を FERM BP— 7394として国際寄託した。
実施例 2
pNCM02、 pNC 301の形質転換効率
pNCM02、 pNC 301の形質転換効率を表 1に示す。 両ベクターの大 腸菌 JM109に対する形質転換効率は十分に高いものであった。 pNCMO 2のブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 31—S 5に対する形質転換効 率は pNC301に比べて低いが、 構築済みのプラスミドを挿入する目的には 十分高いものであった。なお、大腸菌 JM109の形質転換は CaC 12法（M o lecuiar Clonin , Co ld Spring Harbor Laborat ory, P r e s e5 1, 82 , ( 1989)) を用いて行い、 ブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 3 1— S 5の形質転換はエレクトロ ポレ一シヨン法 （Takag i, H. ら， Agr i c. B i o l. Chem.， 53， 309 9— 3 100 ( 1 989 )) を用いて行った。 エレクトロボレ一 シヨンはジーンパルサー （B i 0 Had社製） を用いて、 1. 5kV、 100 0オーム、 25〃F、 1 ·— 8 ms e cの条件で行った。
(表 1) 、
pNCM02、 p N C 301の形質転換効率
1 1 1 1
1プラスミドベクター 1 ノ 宿 王 囷： 1形質転換効率 I
1 (CEU/^gDNA) 1
1 pNOMO 2 · 1大腸菌 J M 109 16. 1 X 106 1
1'pNC 30 1 V . 1大腸菌 J M 1 09 |· 8. 6 X 106 1
1 pUC 1 1 9 1大腸菌 JM 1 09 11. 9 X 107 1
1 pNCMO 2 1ブレビバチルス -チヨゥシネンシス 15. 2 104 1
1 HPD 3 1 - S 5
1 pNC 30 1 1ブレビバチルス ·チョウシネンシス 11. 2 x 10s 1
1 HPD 3 1 - S 5
1 p ΝΎ 30 1 1プ'レビバチルス ·チヨゥシネンシス 11. 9 X 106 1
1 HPD 3 1 -S 5
1 1 1 1 実施例 3
プラスミドシャトルぺク夕一 pNCMO 2とプラスミドシャトルベクター p NC 301の BLAの生産での比較
(1)組換え遺伝子発現プラスミド PNCM02BLAおよび pNC3 01 BLAの構築
バチルス ' リケニフォルミス （Bacillus licheniformis) 由来ひーァミラ —ゼ （BLA)遺伝子を pHY4631 (Yamagata, H. ら， J. o f B iot echno l, 169, 1239— 1245 (1987)) をテ ンプレートとしてプライマ一 9 (配列番号 14：図 14) およびプライマ一 1 0 (配列番号 15 ：図 15) を用いて PCR法で増幅した。 得られた PCR産 物を制限酵素 Pst l、 Hindlllで消化し、 B L A遺伝子を含んだ約 1. 5kbの DNA断片を得た。 実施例 1で構築したプラスミドベクタ一 pNCM 02および pNC 301を制限酵素 P s t I、 Hindlll で消化し、 先に得 た BLA遺伝子を含んだ断片を T4DNAリガーゼで連結し、 プラスミドべク 夕一 pNCM02BLA、 および pNC30 IB LAを得た （図 24)。 更に プラスミドぺク夕一 pNCMO 2 BLAおよび pNC 301BLA、 各々を用 いて CaCl2法により大腸菌 JM109を形質転換し、 プラスミドベクタ一 pNCM02BLA、 p N C 301 B L A各々を保持する形質転換体、 大腸菌 JM109/pNCMO2BLA、 大腸菌 JM109/pNC301BLAを 得た。
また、 BLA遺伝子としては、 BL A遺伝子を含有するプラスミド、 例えば HT 110BLA (特許第 2727391号） から切り出した DN A断片を 使用することも可能であった。
(2)大腸菌 JM109/pNCM02BLAおよび大腸菌 JM109 /pNC 301 B LAによる B LAの生産
それぞれの形質転換体を、 2 X Y T培地を 1. 5ml分注した培地に接種し、 37°Cで一晩振とう培養した。 この培養液を、 菌体を破砕する為に、 ソニケ一 夕一で 30秒間処理し、 その処理液中のアミラーゼ活性を可溶性澱粉を基質と して斎藤の方法 （Arch. B iochem. B i o p hy s . , 155, 2 90 ( 1973)) を用いて測定した （図 25)。 大腸菌 JMl 09/pNCM 02BLAは、 大腸菌 JMl 09/pNC301 B LAと比較すると約 70分 の 1のアミラーゼしか生産せず、 大腸菌における遺伝子発現が効率的に抑制さ れていた。
また、 3%澱粉を含む L A寒天培地上に大腸菌 JM109/pNCM 02BLA、 大腸菌 JMl 09/pNC 301BLAを植菌し 37°Cで一晩培 養し、コロニーを形成させ、それぞれのハロー形成能および生育を比較した（図 26 ：図面代用写真）。 その結果、 大腸菌 JM109/pNCM02BLAは、 大腸菌 JM 109/pNC 301 BLAと比較すると、 コロニ一周囲のハロー のサイズが小さいことから、 BLAの発現が抑えられていた。 また、 生育した コロニ一の大きさから大腸菌 JM109/pNCM02BLAのほうが増殖が 早いことが判明した。 これは大腸菌 JM109/ 〇]\ 028]^八では81^ Aの発現が効率よく抑えられており、 その結果菌株にかかるストレスが低減さ れ増殖がよくなつたためと考えられる。
更に大腸菌 JM109/ 1^〇1^0281^八を11111\/1 I PTGを含ん だ寒天培地で培養したところ形成されたハロ一の大きさが、 I P T Gを含まな い寒天培地上で培養した同菌株と比較してほとんど変わらなかった （図 27 ： 図面代用写真）。 pNCMO 2が持つ大腸菌での発現抑制効果は、 lacオペ レ—夕—の挿入する抑制効果に加えて、 p 2プロモー夕一活性が p 5プロモー 夕一活性と比較すると大腸菌中で非常に低いことによると考えられた。
(3) ブレビバチルス，チョウシネンシス HPD 31 -S 5/pNCM 〇 2BLAおよびブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 3 1 -S 5/pN C30 1 BLAによる BLAの生産
( 1) で得たプラスミ ドベクタ一 PNCM02BLAおよび pNC30 I B LA各々でブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 3 1 - S 5をエレクトロ ポレーシヨン法で形質転換し、 プラスミ ドベクタ一 pNCMO 2BLA、 N C30 1 BLA各々を保持する形質転換体、 ブレビバチルス 'チョウシネンシ ス HPD 3 1 -S 5/pNCMO 2 BLA, ブレビバチルス ■チョウシネンシ ス HPD 3 1— S 5/pNC30 1 BLAを得た （図 24)。 エレクトロボレ —シヨンは、 ジーンパルサ一 （B i oRad社製） を用いて、 1. 5kV、 1
000オーム、 25 F、 1. 8ms e cの条件で行った。 各々の形質転換体 を、 1. 5mlの TMN培地を含んだ試験管に接種し、 30°Cで 2日間振とう 培養した。 この培養液を遠心分離し、 その培養上清のアミラーゼ活性を可溶性 澱粉を基質として斎藤の方法 （Ar ch. B i o c hem. B i o phy s
155, 290 ( 1973)) を用いて測定した （図 28)。 ブレビバチルス ■ チョウシネンシス HPD 31— S 5/pNCMO 2BLAはブレビバチルス - チョウシネンシス HPD 3 1— S 5/pNC 30 1 B L Aの約 22倍のアミラ ーゼを生産したことから、 p N C M 02はブレビバチルス属細菌中において p NC301よりも遥かに効率的に遺伝子を発現できることが示された。
実施例 4
組換え遺伝子発現プラスミ ド pNY326 CTの構築
( 1) CTA遺伝子および CTB遺伝子の取得
コレラ菌染色体 DNA (Meka 1 ano s, J. ら， Nat ur e, 30 6, 551 - 557 ( 1983)) をテンプレートとして、 合成した 2種類の プライマ一 11 (配列番号 16 ：図 16 )、 プライマ一 12 (配列番号 17 ： 図 17) を用いてコレラトキシン （CT) の Aサブュニヅト遺伝子 （CTA) (0. 7bp) を PCR法で増幅した。 同様に 2種類のプライマ一 13 (配列 番号 18 ：図 18)、 プライマ一 14 (配列番号 19 ：図 19) を用いて CT の Bサブュニヅト遺伝子 （CTB) (0. 3bp) を増幅した。
(2) プラスミ ド pT 7B lue CTAおよびプラスミ ド pT7Blue CTB
プラスミ ド pT7B lue (Novagen社製） と先に得た CTA遺伝子 あるいは CTB遺伝子を T 4リガ一ゼを用いて連結し、 CTA遺伝子、 CTB 遺伝子を保持するプラスミド pT7BlueCTA、 pT7BlueCTBを 得た。
(3) プラスミド pNY326 CTAの構築
プラスミ ド PNY326 (pNY301 (特開平 10— 295378号） の シグナルペプチドを R 2 L 6型 （配列番号 5、 21 ：図 5) に変換したもの） を Nc 0 Iと Hindlll で処理し 3. 6kbpの断片を得た。 さらに、 pT 781116〇丁八を1^ 001と11;111(1111で処理し、 CT Α遺伝子を含有す る 0. 7kbpの DNA断片を得、 先に得た 3. 6 k b pの遺伝子断片と T 4 DNAリガ一ゼを用いて連結した。 連結 DN Aを用いてプレビバチルス 'チヨ ゥシネンシス HPD31— S5をエレクトロボレ一ション法で形質転換し、 得 られたネオマイシン耐性株よりプラスミ ドを抽出し、 CT A遺伝子を保持する pNY 326 CTAを得た。
(4) プラスミド pNY326 CTBの構築
同様の方法で PNY326を Nc 0 Iと B amH Iで処理して 3. 6 kbp の DN A断片を得た。 さらに pT7BlueCTBを Nco lと BamH Iで 処理して CTB遺伝子を含有する 0. 3kbpの DNA断片を得、 先に得た 3. 6 kbpの DNA断片と T4DNAリガ一ゼを用いて連結した。 連結 DNAを 用いてブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31— S 5を形質転換し、 ネ ォマイシン耐性株を持つ株を選択した。 選択株よりプラスミ ドを抽出して CT B遺伝子を保持するプラスミ ド pNY326 CTBを得た。
(5) pNY326 CTによるブレビバチルス ·チョウシネンシス HP D31-S 5の形質転換の試行
pNY326 CTBを B amH Iと H indlllで処理し、 4. 7kbpの DNA断片を得た。 さらに、 pNY326 CTAをテンプレートとして 2種類 のプライマ一 15 (配列番号 20：図 20)、 プライマー 11 (配列番号 16 ： 図 16) を用いて、 CT A遺伝子を SD 2配列を含めた形 （SD— CTA遺伝 子 （0. 8 kbp)) で PC R法で増幅した。 卩〇11産物を8&111111と Hi ndlllで処理して 0. 4 kbpの断片を得、 先に得た pNY326 CTB由 来の 4. 7kbpの DNA断片と T4DNAリガ一ゼを用いて連結した。 連結 DNAを用いてブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 31 - S 5をエレク トロポレーシヨン法で形質転換し、 ネオマイシン 50〃 //1111含有丁]\寒天 培地 （1%ペプトン、 0. 2%酵母エキス、 0. 5%肉エキス、 1%グルコ一 ス、 0. 001% Fe S04 · 7H2Os 0. 001% MnS04 · 4H2O 0. 0001% ZnS04 · 7 H20、 1. 5 %寒天、 p H 7. 0 ) に塗布を して、 ネオマイシン耐性を持つ株を選択しょうとしたが、 耐性株が得られなか つた。 エレクトロボレ一シヨンはジーンパルサ一 （BioRad社製） を用い て、 1. 5kV、 1000オーム、 25 /F、 1. 8 ms e cの条件で行った。
実施例 5 組換え遺伝子発現プラスミド PNCM02CTの構築
(1) プラスミド pNCMO 2 CTBの構築
PNCM02を Nco lと B amH Iで処理して 5. 2 kbpの断片を得た c さらに、 pT7BlueCTBを Nco Iと B amH Iで処理して C T B遺伝 子を含有する 0. 3 kbpの DNA断片を得、 先に得た 5. 2 kbpの遺伝子 断片と T 4 DN Aリガ一ゼを用いて連結した （図 29)。 連結 DN Aを用いて 大腸菌 JM109を形質転換し、 プラスミドを抽出して CTB遺伝子を保持す る pNCMO 2 CTBを得た。
(2) プラスミド pNCMO 2 CTの構築
PNCM02CTBを BamHIと Hindlll で処理し 5. 5kbpの断 片を得た。 実施例 4 (5) で得た SD— CTA遺伝子 （0. 8kbp) を Ba mHIと Hindlll で処理して 0. 8kbpの断片を回収し、 先に得た 5. 5 kbpの遺伝子断片と T 4 DNAリガ一ゼを用いて連結した （図 29)。 連 結 DNAを用いて大腸菌 JM109を形質転換し、 アンピシリン耐性を持つ株 を選択した。 選択株よりプラスミドを抽出して CTB遺伝子を保持するプラス ミド pNCM02 CTを 3株得た。 何れの株もシーケンスの結果 CTB遺伝子 が正しくプラスミドに連結されていることが解った。 ここで得た株を大腸菌 J Ml 09/pNCM02 CTとした。 大腸菌 JMl 09/pNCM02 CTよ り抽出した PNCM02 CTで、 エレクトロポレ一シヨン法によりブレビバチ ルス 'チョウシネンシス HPD 31—S 5を形質転換したところ、 同プラスミ ドを保持する形質転換体が多数個得られた。 得られた株をブレビバチルス 'チ ヨウシネンシス HPD 31— S 5/pNCMO 2 CTとした。 エレクトロボレ —シヨンは、 ジーンパルサ一 （B i oRad社製） を用いて、 1. 5kV、 1 000オーム、 25 /F、 1. 8ms e cの条件で行った。 (3) ブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 31 -S 5/pNC MO 2 CTによる CTの発現
ブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 31 -S 5/pNCMO 2 CTを 中試験管を用いてネオマイシン 50〃 g/m 1含有 TM液体培地 3 mlで 3 0°Cで 2日間振とう培養を行い、 その培養上清を SDS— PAGEに供し、 ク マシ一プリリアントブル一染色、 およびゥサギ CTポリクロ一ナル抗体を用い たウエスタンブロヅト法により解析を行った。 （ 1八ぉょび〇丁8の推定分子 量は、 それぞれ 28kDa、 12kDaであり、 それぞれが相当の分子量の位 置に染色バンドを示した。 バンドの濃さより CT Aの分泌生産量は 7 Omg/ 1、 CTBの分泌生産量は 3 OmgZlと推定した。 その SDS— PAGE電 気泳動パターンを図面代用写真に示す （図 30)。 また、 培養上清を CTを特 異的に結合するガラクト一ス樹脂を用いて精製したあと （Mi crobial Pathogenes is, 16， 71 -79 ( 1994 ))。 精製分画を加熱 処理せずに泳動した場合、 バンドが約 9 OkDaの位置にシフトしたことから、 発現されたサブュニットは 1 A 5 B構造を取っている事が推測された。 発明の効果
本発明により、 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミ ドシャトルべク 夕一が提供される。 また本発明のプラスミドシャトルベクタ一は、 実施例 3に おける BL A遺伝子の発現の結果が示すように大腸菌において遺伝子の発現が 抑制され、 ブレビバチルス ·チョウシネンシス中において効率的な遺伝子の発 現を行うことができる。 更に実施例 4および実施例 5における C Tの発現によ り示されたように、 本発明におけるプラスミドシャトルべクタ一 PNCM02 は、 特に複雑な遺伝子構築を必要とする組換え遺伝子発現プラスミドの構築お よび該組換え遺伝子発現プラスミ ドにより形質転換された形質転換体による夕 ンパク質の生産に有用である。
規則第 13規則の 2の寄託された微生物への言及
Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/p CMO 2
ィ 当該微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名
名称 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕' あて名 〒305- 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 口 ィの寄託機関に寄託した日付
平成 12年 （2000年） 12月 12日
ノヽ ィの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP- 7394
Brevibacillus choshinensis HPD31 (FERM BP- 1087) ィ 当該微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名
名称 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕- あて名 亍 305- 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 口 ィの寄託機関に寄託した日付
平成 11年 （1999年） 8月 31日
ハ ィの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP- 6863

Claims

請求の範囲
1. ブレビバチルス （Brevibac i l lus)属細菌および大 腸菌 （ェシヱリヒア 'コリ （Escherichia coli)) のいずれにおいても複製可 能で、 ブレビバチルス属細菌において機能し得るプロモー夕一と大腸菌および ブレビバチルス属細菌の選択マ一カーとして機能し得る配列をコードする DN A配列を有することを特徴とするプラスミドシャトルべクタ一。
2. (ィ） ブレビバチルス属細菌において機能し得るプロモー夕一、 S D配列およびシグナル配列、 （口） ブレビバチルス属細菌において機能し得る Repタンパク質遺伝子および複製開始点をコードする DNA配列、 （ハ） ブ レビバチルス属細菌に対する選択マ一力一として機能し得る配列をコードする DNA配列、 （二） 大腸菌において機能し得る複製開始点をコードする DNA 配列、 （ホ） 大腸菌に対する選択マ一カーとして機能し得る配列をコードする DN A配列を有することを特徴とする大腸菌およびブレビバチルス属細菌のい ずれの細菌でも複製可能なプラスミ ドシャトルべクタ一。
3. 請求項 1又は 2に記載のブレビバチルス属細菌中で機能し得るプ ロモ—夕—が、 プレビバチルス ·チョウシネンシス （Brevibac i l l us cho shinens i s) 由来の HWPプロモ一夕一が包含する P 2 プロモー夕一であって、 その塩基配列は配列番号 1で表わされるものであるこ と、 を特徴とする請求項 1又は 2に記載のプラスミ ドシャトルベクター。
4. 更に、 大腸菌での組換えタンパク質の発現を抑制する機能を持つ D N A配列を有すること、 を特徴とする請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の プラスミ ドシャトルべク夕一。
5. 請求項 4に記載の大腸菌での組換えタンパク質の発現を抑制する 機能を持つ DN A配列が大腸菌由来の 1 a cォペレ一夕一配列であって、 その 塩基配列は配列番号 2で表されるものであること、 を特徴とする請求項 4に記 載のプラスミ ドシャトルべクタ一。
6. 下図に記載の制限酵素認識部位を有するプラスミドシャトルぺク 夕一 pNCM〇2。
-aaggcgccqc _ aacttttgat. tcgctcaggc gtttaatagc ata-taattgt qaacaaataa 60
Figure imgf000032_0001
7. 請求項 6のプラスミ ドシャトルべクタ一 pNCMO 2を含有し、 国際寄託番号 FERM BP- 7394として寄託されているブレビバチル ス ，チョウシネンシス ^Brevibac i l lus cnoshinens is) HPD31— S5/pNCM02株。
8. 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載のプラスミ ドシャトルベクタ 一にタンパク質をコードする遺伝子の DN A配列を組み込んでなる組換えブラ スミ ドによって形質転換されたブレビバチルス ·チョウシネンシス。
9. ブレビバチルス 'チョウシネンシスが、国際寄託番号 FERM B P- 6623として寄託されているブレビバチルス ·チョウシネンシス HP D 31—S5であること、 を特徴とする請求項 8に記載のプレビバチルス 'チヨ
10. 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載のプラスミ ドシャトルべク 夕一にタンパク質をコードする遺伝子の DNA配列を組み込んでなる組換えプ ラスミ ドで大腸菌を形質転換し、 得られた形質転換体から抽出したプラスミ ド を用いてブレビバチルス属細菌を形質転換すること、 を特徴とする形質転換方
11. 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載のプラスミ ドシャトルべク 夕一にタンパク質をコードする遺伝子の DN A配列を組み込んでなる組換えプ ラスミ ドによって形質転換されたブレビバチルス属細菌を培養し、 その培養液 に分泌、 蓄積された目的タンパク質を採取すること、 を特徴とするタンパク質 の製造方法。
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