DE4425527A1

DE4425527A1 - S-Layer-Signalsequenz

Info

Publication number: DE4425527A1
Application number: DE19944425527
Authority: DE
Inventors: Werner Dr Lubitz
Original assignee: Vogelbusch GmbH
Current assignee: Lubitz Werner Prof Dr Wien At Sleytr Uwe P
Priority date: 1994-07-19
Filing date: 1994-07-19
Publication date: 1996-01-25

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für ein Leader- bzw. Signalpeptid des S-Layerproteins von B. stea rothermophilus kodiert und die gegebenenfalls in operativer Verknüpfung mit einer 3′-seitig angeordneten Protein-kodieren den Nukleinsäure oder/und 5′-seitig angeordneten Expressions kontrollsequenz ist.

Kristalline bakterielle Zelloberflächenlayer (S-Layer) bilden in vielen Eubakterien und den allermeisten Archaebakterien, die äußerste Zellwandkomponente (Sleytr et al. (1988), Crystalline Bacterial Cell Surface Layers, Springer Verlag Berlin; Messner und Sleytr (1992), Adv. Microb. Physiol. 33, 213-275). Die mei sten der gegenwärtig bekannten S-Layerproteine sind aus iden tischen Glykoproteinen zusammengesetzt, die scheinbare Moleku largewichte im Bereich von 40.000 bis 220.000 aufweisen. Die Komponenten von S-Layern sind selbst-assemblierend und die mei sten Gitter haben eine schräge (p2), quadratische (p4) oder hexagonale (p6) Symmetrie. Die Funktionen von bakteriellen S- Layern sind immer noch nicht vollständig bekannt, aber aufgrund ihrer Lokalisierung an der Oberfläche dürften die porösen kri stallinen S-Layer hauptsächlich als Schutzhüllen, Molekular siebe oder zur Förderung der Zelladhäsion und Oberflächenerken nung dienen.

Genetische Daten und Sequenzinformationen sind für verschiedene S-Layergene aus Mikroorganismen bekannt. Eine Übersicht findet sich bei Peyret et al. (1993), Mol. Microbiol. 9, 97-109. Auf diese Daten wird ausdrücklich Bezug genommen. In dieser Arbeit ist die Sequenz des für das S-Layer-Protein von B. stearother mophilus PV72 kodierenden Gens und ein Verfahren zu dessen Klo nierung angegeben.

B. stearothermophilus PV72 ist ein gram-positives Bakterium, das mit einem hexagonal angeordneten S-Layer bedeckt ist. Die Hauptkomponente des B. stearothermophilus S-Layer ist ein 128 kDa Protein, bei dem es sich um das häufigste Protein der Zelle mit einem Anteil von ungefähr 5% bezüglich der gesamten Pro teinbestandteile handelt. Es sind verschiedene Stämme von B. stearothermophilus charakterisiert worden, die hinsichtlich des Typs von S-Layer Gitter, dem Molekulargewicht und der Glykosi lierung der S-Layer-Komponenten unterschiedlich sind (Messner und Sleytr (1992), Supra). Um die Regulation von Synthese, Transport und Variabilität von S-Layerproteinen zu verstehen, besteht ein starkes Bedürfnis daran, die Primärstruktur dieses Proteins inklusive seines Signal- bzw. Leaderpeptids zu bestim men.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit eine Nukleinsäure, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie für ein funktionel les Signalpeptid kodiert und

(a) den Signalpeptid-kodierenden Abschnitt, der in SEQ. ID. NO. 1 dargestellten Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
(c) eine zu den Sequenzen aus (a) oder/und (b) mindestens 90% homologe Nukleotidsequenz aufweist.

In SEQ. ID. NO. 1 ist die kodierende Nukeotidsequenz des S- Layergens aus B. stearothermophilus einschließlich des Signal peptid-kodierenden Abschnitts und der davon abgeleiteten Amino säuresequenz, gezeigt. Weiterhin sind auch 36 Nukleotide aus dem 5′-nicht-kodierenden Bereich und 112 Nukleotide aus dem 3′-nicht-ko dierenden Bereich gezeigt.

Das S-Layergen von B. stearothermophilus kodiert für ein Pro tein mit insgesamt 1229 Aminosäuren einschließlich eines N-ter minalen Signalpeptids mit 30 Aminosäuren. Die Spaltstelle zwi schen dem Signalpeptid und reifem Protein befindet sich zwischen Position 30 und 31 der Aminosäuresequenz. Das Signalpeptid des in SEQ. ID. NO. 1 gezeigten S-Layerproteins weist eine basische aminoterminale Domäne gefolgt von einer hydrophoben Domäne auf.

Sequenzvergleiche mit anderen Signalpeptiden zeigten eine ge wisse Homologie zu Signalpeptiden von extrazellulären Proteinen in Bazillen, wie etwa alkalische Phosphatase und neutrale Phos phatase von B. amyloliquefaciens (Vasantha et al. (1984), J. Bacteriol. 159, 811-819) sowie mit den Signalpeptiden für das B. sphaericus Gen 125 (Bowditch et al. (1989), J. Bacteriol. 171, 4178-4188) und das OWP-Gen von B. brevis (Tsuboi et al. (1986), J. Bacteriol. 168, 365-373).

Die erfindungsgemäße Signalpeptid-kodierende Nukleinsäure kann in operativer Verknüpfung mit einer 3′-seitig angeordneten, Protein-kodierenden Nukleinsäure sein, so daß die für das Sig nalpeptid kodierende Nukleinsäure und die Protein-kodierende Nukleinsäure eine genetische Fusion bilden, deren Genprodukt ein Polypeptid ist, das ein Signalpeptid und einen reifen Pro teinanteil enthält.

Das von der Protein-kodierenden Nukleinsäure kodierte Protein kann ein eukaryontisches oder prokaryontisches Protein, z. B. das homologe S-Layerprotein, ein anderes S-Layerprotein oder jedes andere beliebige heterologe Protein sein.

Insbesondere kann die Protein-kodierende Nukleinsäure

(a) den Protein-kodierenden Abschnitt der in SEQ. ID. NO. 1 dargestellten Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter strin genten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz auf weisen.

Unter dem Begriff "stringente Hybridisierung" im Sinne der vor liegenden Erfindung versteht man, daß eine Hybridisierung auch nach Waschen bei 55°C, vorzugsweise 60°C in einem wäßrigen Nied rigsalz-Puffer (z. B. 0,2 × SSC) noch auftritt (siehe auch Sam brook et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual).

Weiterhin kann das von der Protein-kodierenden Nukleinsäure kodierte Protein auch ein künstliches Polypeptid sein, das ei nen hohen Gehalt an seltenen Aminosäuren (z. B. Met, Trp und insbesondere Lys) enthält. Die Konstruktion derartiger künst licher Polypeptide orientiert sich vorzugsweise an Teilsequen zen des nativen Proteins, um eine bessere Sekretion zu gewähr leisten.

Besonders bevorzugt weist das Protein einen Lysin-Gehalt von mindestens 10% auf Basis der gesamten Aminosäuren auf. Einen derartigen Lysingehalt zeigt z. B. das in SEQ. ID. NO. 1 darge stellte native S-Layerprotein aus B. stearothermophilus.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Signalpeptid-kodierende Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit einer 5′-seitig angeordneten funktionellen Expressionskon trollsequenz sein, d. h. mit einer Nukleinsäure, welche Trans kriptions- und Translations-Regulationssignale enthält. Die Expressionskontrollsequenz kann an sich beliebig sein, sie wird zweckmäßigerweise anhand des zur Expression der Nukleinsäure verwendeten Wirtsorganismus und den Kultivierungsbedingungen ausgewählt. Einem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie sind zahlreiche Beispiele für geeignete eukaryontische und pro karyontische Expressionskontrollsequenzen bekannt, so daß hier im einzelnen nicht darauf eingegangen werden muß.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steht die Signalpeptid-kodierende Nukleinsäure jedoch in opera tiver Verknüpfung mit der nativen Expressionskontrollsequenz des B. stearothermophilus- S-Layergens oder einer funktionellen Variante davon, die insbesondere

(a) mindestens einen Abschnitt der in SEQ. ID. NO. 2 darge stellten Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter strin genten Bedingungen hybridisierenden Nukleotidsequenz auf weist.

Besonders bevorzugt weist die Expressionskontrollsequenz eine Homologie von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90% zu der in SEQ. ID. NO. 2 dargestellten Expressionskontrollsequenz auf.

In SEQ. ID. NO. 2 ist der 5′-nicht-translatierte Bereich des B. stearothermophilus S-Layergens in einer Länge von 247 Nukleoti den gezeigt, der die Expressionskontrollsequenz umfaßt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Po lypeptid, das von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert ist, d. h. ein funktionelles Signalpeptid gegebenenfalls in ope rativer Verknüpfung mit einer am Carboxyterminus des Signalpep tids angeordneten Proteinsequenz.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein re kombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungs gemäßen Nukleinsäure enthält. Der Vektor kann in Eukaryonten, Prokaryonten oder in Eukaryonten und Prokaryonten replizierbar sein. Er kann ein in das Genom der Wirtszelle integrierbarer Vektor (z. B. Bacteriophage Lambda) oder ein Vektor sein, der extrachromosomal vorliegt (z. B. ein Plasmid). Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Vektor ein Plasmid, insbesondere ein pro karyontisches Plasmid.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäure oder einem rekom binanten Vektor gemäß vorliegender Erfindung transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryontische als auch eine proka ryontische Zelle sein. Vorzugsweise ist die Zelle ein prokar yontischer Organismus, besonders bevorzugt ein gram-positiver prokaryontischer Organismus und am meisten bevorzugt ein Orga nismus der Gattung Bacillus. Verfahren zur Transformation von eukaryontischen und prokaryontischen Zellen mit Nukleinsäuren sind allgemeiner Stand der Technik und brauchen daher nicht zu erläutert werden.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) eine Wirtszelle bereitstellt, die mit einer erfindungsge mäßen Signalpeptid-kodierenden Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit einer Protein-kodierenden Nukleinsäure transformiert ist,
(b) die Wirtszelle unter solchen Bedingungen kultiviert, die mit einer Expression der Nukleinsäure und zu einer Erzeu gung und Sekretion des davon kodierten Polypeptids führen und
(c) das resultierende Polypeptid aus dem Kulturmedium gewinnt.

Als Wirtszelle für dieses Verfahren verwendet man vorzugsweise einen prokaryontischen Organismus, insbesondere einen Organis mus aus der Gattung Bacillus und am meisten bevorzugt den Orga nismus B. stearothermophilus. Der Organismus bevorzugt ein stark zuckerhaltiges, osmotisch starkes Medium und hat den Vor teil einer hohen Produktionsrate und hohen Züchtungstemperatu ren.

Die Expression von rekombinanten Polypeptiden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Signalpeptid-kodierenden Nukleinsäure zeigt den Vorteil einer extrem hohen Effizienz aufgrund der guten Sekretionsleistung durch das erfindungsgemäße Signalpep tid und aufgrund der Tatsache, daß B. stearothermophilus ein Temperatur-resistenter Organismus mit einer optimalen Wachs tumstemperatur im Bereich von 60°C ist, der eine schnelle Ex pression rekombinanter Polypeptide ermöglicht.

Zur verbesserten Gewinnung von Polypeptiden oder Proteinen aus dem Kulturmedium kann die Protein-kodierende Nukleinsäure einen Stretch geladener (z. B. Lys) oder hydrophober (z. B. Trp) Reste oder/und eine Streptavidin-Teilsequenz enthalten, die zur Bin dung an Biotin in der Lage ist.

In einem Aspekt betrifft dieses erfindungsgemäße Verfahren die rekombinante Herstellung von S-Layerproteinen, insbesondere des 128 kDa S-Layer Proteins von B. stearothermophilus.

In einem weiteren Aspekt betrifft das erfindungsgemäße Verfah ren die rekombinante Herstellung von Proteinen mit einem hohen Gehalt an essentiellen Aminosäuren, insbesondere einem Lysinge halt von mindestens 10% auf Basis der gesamten Aminosäuren. Zur Gewinnung dieser essentiellen Aminosäuren wird das erhaltene Protein vorzugsweise hydrolytisch (z. B. durch Säure oder/und durch Proteasen) gespalten und die bei der Spaltung entstehen den Aminosäuren auf an sich bekannte Weise (z. B. durch chroma tographische Methoden) isoliert. Beispiele für die Protease spaltung von Proteinen sind bei Qi et al. (Plant. Physiol. 104 (1994), 127-133), Bransom und Dreher (Virology 198 (1994), 148-154) und Di Ianni et al. (J. Biol. Chem. 268 (1993), 2048-2051) angegeben. Auf diese Offenbarung wird hiermit Bezug genommen.

Schließlich betrifft die Erfindung auch noch eine Expressions kontrollsequenz, die (a) mindestens einen Abschnitt der in SEQ. ID. NO. 2 dargestellten Nukleotidsequenz, (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes ent sprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist. Diese Expressionskontrollsequenz ermöglicht eine starke Expression, so daß z. B. das S-Layer protein in einem Anteil von 5-10% des zellulären Gesamtproteins exprimiert wird.

Weiterhin wird die vorliegende Erfindung durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit den Sequenzprotokollen SEQ. ID. NO. 1-6 und Fig. 1 erläutert.

Es zeigen:

SEQ. ID. NO. 1 die vollständige Nukleotidsequenz des kodierenden Abschnitts des S-Layergens von B. stearothermophi lus und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz,
SEQ. ID. NO. 2 den 5′-nicht-translatierten Bereich des B. stea rothermophilus S-Layergens,
SEQ. ID. NO. 3 das Oligonukleotid P1,
SEQ. ID. NO. 4 das Oligonukleotid P2,
SEQ. ID. NO. 5 das Oligonukleotid P3,
SEQ. ID. NO. 6 das Oligonukleotid P4 und

Fig. 1 eine schematische Darstellung der klonierten und durch PCR erhaltenen Genfragmente aus B. stearothermophilus.

Beispiel 1 Herstellung einer B. stearothermophilus PV72 Genbank

Eine im Expressionsvektor pSK(+) (Short et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988), 7583-7600) durch partielle HindIII-Spaltung chromosomaler B. stearothermophilus pV72 DNA erzeugte Genbank wurde im E.coli Stamm JM83 (Vieira und Messing (1982), Gene 19, 259-268) hergestellt. Die Kolonien dieser Genbank wurden mit polyklonalen Antikörpern gegen gereinigtes S-Layerprotein gemu stert. Durch die Antikörper-Musterung wurden drei immunreaktive Klone aus 10.000 rekombinanten Klonen identifiziert. In einer zweiten Musterungsrunde zeigte nur einer der drei Klone eine Kreuzreaktion mit S-Layer-spezifischen Antikörpern. Das in diesem Klon enthaltene Plasmid pBK24 enthielt eine HindIII-In sertion mit insgesamt ca. 2,3 kb Länge (Fig. 1, Konstrukt A). Eine DNA-Sequenzierung der Insertion ergab einen offenen Leser ahmen mit 2,3 kb einschließlich des 3′-Endes des S-Layergens.

Um eine vollständige Kopie des S-Layergens zu isolieren, wurde eine zweite Genbank hergestellt. Hierzu wurde die genomische DNA von B. stearothermophilus PV72 mit dem Restriktionsenzym PstI gespalten und eine genomische Southern Hybridisierungsana lyse bei 65°C (Sambrook et al. (1989), Supra) unter Verwendung von radioaktiv markierter DNA aus der Insertion des Plasmids pBK24 durchgeführt. Diese Hybridisierungssonde ergab nur ein positives Signal mit einer 4,6 kb Bande aus dem Southern Blot, die isoliert, in pUC18 kloniert und in den E.coli Stamm JM103 (Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9, 309-321) trans formiert wurde. Von 2.000 Transformanten ergaben 12 rekombi nante Klone positive Signale bei Musterung durch in situ Kolo nie-Hybridisierung mit einem (³²P)-markierten, Sequenz-spezifi schen Oligonukleotid P1 (SEQ. ID. NO. 3). Diese Klone wurden anschließend durch Restriktionsanalyse untersucht. Dabei wurde gefunden, daß sie identische 5′-Bereiche aufwiesen und inner halb des offenen Leserahmens 150 bp stromaufwärts der HindIII Restriktionsstelle aus pBK24 endeten. Ein ähnlicher Versuch wurde unter Verwendung des Vektors pPLcAT10 (Stanssens et al., Gene 36 (1985), 211-223) unternommen. Erneut wurde gefunden, daß alle positiven Klone an der gleichen Stelle innerhalb des offenen Leserahmens endeten.

Die Versuche zur Klonierung des vollständigen S-Layer Gens ein schließlich der Signalsequenz in E.coli waren somit nicht er folgreich.

Beispiel 2 Erzeugung der 5′-Region des S-Layer Gens von B. stearothermo philus PV72 durch PCR

Das erste PCR-Fragment (Fig. 1, Konstrukt B) wurde unter Ver wendung der Primer P1 (SEQ. ID. NO. 3) und P2 (SEQ. ID. NO. 4) synthetisiert. Der Primer P2 enthält Sequenzen aus dem amino terminalen Abschnitt des reifen S-Layergens und Restriktions stellen. Die Sequenzinformation zur Herstellung dieses Primers wurde durch Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz des reifen S-Layerproteins erhalten. Hierzu wurde das gereinigte S- Layerprotein einer 2-D-Gelelektrophorese unterworfen, auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran überführt und einer Mikrosequen zierung (Kalkkinen und Tilgmann (1988), J. Protein Chem. 7, 242-243) unterzogen.

Der Antisense-Primer P1 (SEQ. ID. NO. 3) enthält eine S-Layer gen-spezifische Region (entsprechend nt 1465 bis nt 1482, 60 bp stromabwärts der 5′-HindIII-Stelle von pBK24) und Restriktions stellen. Das unter Verwendung beider Primer erhaltene 1,3 kb PCR-Fragment wurde als PstI-Fragment unter Verwendung der flankierenden Restriktionsstellen in den Vector pUC18 kloniert und in den E.coli Stamm JM 103 transformiert.

Es wurde die DNA-Sequenz der PstI-Insertion bestimmt. Die re sultierenden Sequenzdaten zeigten, daß erneut eine 5′-Deletion stromaufwärts der HindIII-Stelle aufgetreten war.

Eine direkte Sequenzierung des PCR-Fragments I zeigte, daß die ses Fragment einen offenen Leserahmen (ORF) von 1,3 kb ent hielt. Diese Ergebnisse bestätigten, daß die ORF-Sequenz des PCR-Fragments I die DNA-Sequenz des reifen S-Layerproteins von B. stearothermophilus PV72 vervollständigte.

Um weitere 5′-stromaufwärts gelegene Bereiche des sbsA-Gens zu erhalten, wurde das PCR-Fragment I als Hybridisierungssonde für eine Southern Blot Analyse einer BamHI-gespaltenen genomischen DNA aus B. stearothermophilus verwendet. Das entsprechende Fragment der hybridisierenden Bande (5,8 kb) wurde aus einem Agarose-Gel isoliert und mit BamHI-gespaltenem pUC18 nach Stan dardmethoden ligiert. Zur Bestimmung weiterer 5′-Sequenzen des SbsA-Gens wurde ein zweites PCR-Fragment (Fig. 1, Konstrukt C) unter Verwendung des pUC18-spezifischen Primers P3 (SEQ. ID. NO. 5) und des sbsA-Gen-spezifischen Primers P4 (SEQ. ID. NO. 6) hergestellt. Das entsprechende PCR-Fragment II hatte eine Größe von 0,7 kb. Eine direkte Sequenzierung des PCR-Fragments II zeigte, daß sich 5′-seitig des sbsA-ORF eine Signalsequenz von 30 Codons befand.

Beispiel 3 Sequenzanalyse des SbsA-Gens

Das S-Layer Gen von B. stearothermophilus weist einen offenen Leserahmen in einer Länge von 3.687 bp auf, der für ein Protein mit 1.228 Aminosäuren kodiert. Der ORF startet mit einem ATG an Nukleotidposition 1 (SEQ. ID. NO. 1), von dem 5′-seitig eine ribosomale Bindungsstelle (rbs) bei Position -12 angeordnet ist. Die durch Edman-Abbau des reifen Proteins und tryptischer Peptide davon bestimmten Aminosäuren sind unterstrichen. Di rekte Nukleotid-Repeatsequenzen sind doppelt unterstrichen.

46 bp stromabwärts des TAA Stopcodons des sbsA-Gens wurde eine palindrome Sequenz gefunden, die als "Hairpin"-Sekundärstruktur zur Termination der Transkription durch die RNA-Polymerase die nen kann und durch Linien mit Pfeilen bezeichnet ist.

Die ersten 30 Aminosäuren des SbsA-Proteins bilden eine Signal sequenz. Die Spaltung des Signalpeptids findet nach einem Se quenzmotiv Ala-Ala statt (Pfeil), was häufig bei Signalpeptiden gefunden wird (Perlman und Halvorson (1983), J. Mol. Biol. 167, 391-409).

Die 5′-untranslatierte Sequenz des sbsA-Gens, mit der Ex pressionskontrollsequenz ist in SEQ. ID. NO. 2 gezeigt. Die rbs Region sowie die Bereiche bei -10 und -35 bezüglich des Trans kriptionsstarts sind unterstrichen.

Claims

1. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein funktionelles Signalpeptid kodiert und

(a) den Signalpeptid-kodierenden Abschnitt der in SEQ. ID. NO. 1 dargestellten Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
(c) eine zu den Sequenzen aus (a) oder/und (b) mindestens 90% homologe Nukleotidsequenz aufweist.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in operativer Verknüpfung mit einer 3′-seitig an geordneten, Protein-kodierenden Nukleinsäure ist.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Protein-kodierenden Nukleinsäure kodierte Protein ein S-Layerprotein ist.

4. Nukleinsäure nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Protein-kodierende Nukleinsäure

(a) den Protein-kodierenden Abschnitt der in SEQ. ID. NO. 1 dargestellten Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidse quenz aufweist.

5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Protein-kodierenden Nukleinsäure kodierte Protein einen Lysin-Gehalt von mindestens 10% auf Basis der gesamten Aminosäuren aufweist.

6. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß sie in operativer Verknüpfung mit einer 5′-seitig an geordneten funktionellen Expressionskontrollsequenz ist.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionelle Expressionskontrollsequenz

(a) mindestens einen Abschnitt der in SEQ. ID. NO. 2 dar gestellten Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidse quenz aufweist.

8. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-7 kodiert ist.

9. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-7 enthält.

10. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid ist.

11. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-7 oder einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 9 oder 10 transformiert ist.

12. Wirtszelle nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein gram-positiver prokaryontischer Organismus ist.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Organismus der Gattung Bacillus ist.

14. Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine Wirtszelle bereitstellt, die mit einer Nuklein säure nach Anspruch 2 transformiert ist,
(b) die Wirtszelle unter solchen Bedingungen kultiviert, die zu einer Expression der Nukleinsäure und zu einer Erzeugung und Sekretion des davon kodierten Polypep tids führen, und
(c) das resultierende Polypeptid aus dem Kulturmedium gewinnt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtszelle einen gram-positiven prokaryonti schen Organismus verwendet.

16. Anspruch nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Organismus der Gattung Bacillus verwendet.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14-16 zur rekombinanten Herstellung von S-Layer-Proteinen.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14-17 zur rekombinanten Herstellung von Proteinen mit einem Lysin-Gehalt von min destens 10% auf Basis der gesamten Aminosäuren.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14-18, weiterhin umfas send die Schritte der hydrolytischen Spaltung des Proteins und der Gewinnung von bei der Spaltung entstehenden Ami nosäuren.

20. Expressionskontrollsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie