CN117813316A - 用于生产纯度更高的感兴趣的化合物的地衣芽孢杆菌宿主细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于生产纯度提高的生物化合物的地衣芽孢杆菌宿主细胞。具体地，本发明涉及具有一种或多种遗传修饰的地衣芽孢杆菌，所述遗传修饰选自a)与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加的遗传修饰，b)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及c)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。本发明还涉及一种基于培养本发明的细菌宿主细胞来生产至少一种纯度提高的感兴趣的化合物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于生产纯度提高的生物化合物的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)宿主细胞。具体地，本发明涉及具有一种或多种遗传修饰的地衣芽孢杆菌，所述遗传修饰选自
a)与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加的遗传修饰，
b)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及
c)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。
本发明还涉及一种基于培养本发明的细菌宿主细胞来生产至少一种纯度提高的感兴趣的化合物的方法。
背景技术
芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物被广泛用作工业劳动力，用于生产有价值的化合物，如化学品、聚合物和蛋白，特别是蛋白，如洗涤和/或清洁活性酶或者用于饲料和食品应用的酶。这些有用物质的生物技术生产是通过这种芽孢杆菌的发酵和随后的产物纯化来进行的。在各种芽孢杆菌中，地衣芽孢杆菌被广泛用作分泌聚合物(WO2005098016)和蛋白(WO9102792,WO2016180928)的工业生产宿主。
芽孢杆菌属的革兰氏阳性微生物已进化出细胞分化、适应和存活机制，以应对不断变化的环境条件，如高温、干旱、水分过剩、营养限制。特别地，菌落内芽孢杆菌细胞的时空不同分化提供了一种生存策略，单个细胞执行不同的功能，如能力发育和群集运动、生物膜形成、胞外降解酶的产生以及合成抗生素和孢子。这些分化过程通过复杂的细胞间信号传导网络进行调节，并通过细胞内信号转导级联进行整合，最终导致差异化的基因表达。
在不同的细胞调节子系统中，DegS-DegU双组分系统控制枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和相关芽孢杆菌的各种细胞过程。反应调节子DegU及其同源的传感器激酶DegS控制着100多个基因的表达(U.,Homuth,G.；2002；Molecular Genetics andGenomics,268(4),455-467)。因此，DegU的磷酸化状态以及细胞内磷酸化的DegU(DegU-P)的总体水平决定了差异基因表达(Verhamme,/>T.；Nicola R.；2007；In:Molecularmicrobiology 65(2),S.554–568)。除DegS外，DegU的磷酸化状态还受几种其他蛋白如DegQ、DegR、RapG和PhrG的影响。
影响DegS-DegU双组分系统的几个突变被定位到编码DegS/DegU系统组分的基因，如degU32(DegU-H12L)、degU31(DegU-V131L)、degS100(DegS V236M)、degS200(DegS-G218E)和degS-S76D(DegS-S76D)(Amory,A.,Kunst,F.,Aubert,E.,Klier,A.,&Rapoport,G；(1987)；Journal of bacteriology,169(1),324-333.；Msadek T,Dedonder R；1990；JBacteriol 172(2):824–834)。已经在枯草芽孢杆菌中描述了degQ基因的过量表达以增强细胞外酶的产量(US5017477,US5264350)。
已对地衣芽孢杆菌生产宿主进行遗传修饰以去除不需要的分泌宿主细胞蛋白(WO2003093453,WO2003087149)，以减少红色素形成(WO2004011609)，或抗生素(WO2003087142,WO2016180928)，从而简化了期望的感兴趣的化合物，特别是分泌的感兴趣的化合物的后续下游纯化过程。
地衣芽孢杆菌宿主细胞的优化对于生物化合物的生产具有很高的相关性，即使稍微改进的地衣芽孢杆菌生产宿主也会对大规模工业生产系统和产品纯度产生重大影响。
因此，本发明涉及修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其具有减少的宿主细胞蛋白和更高纯度的感兴趣的化合物。
发明内容
在本发明的基础研究中发现，包含以下遗传修饰的至少一种的地衣芽孢杆菌宿主细胞允许在所述宿主细胞中以更高的纯度有效生产感兴趣的化合物：
a)与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加的遗传修饰，
b)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及
c)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。
因此，本发明涉及这种修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，特别是修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其包含表达盒，用于生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及一种生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的方法，包括
a)提供如本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，
b)在允许表达感兴趣的所述感兴趣的化合物的条件下培养所述宿主细胞，以及
c)任选从培养基分离所述感兴趣的化合物。
附图说明
图1：模拟补料分批培养72h后，来自地衣芽孢杆菌菌株的上清液的SDS-PAGE。
1-3＝对照菌株；4＝ForD缺失菌株；5-7＝DegQ过量表达菌株；
DegQ的过量表达导致ForD从胞外蛋白质组中丢失；
M＝Precision Plus Protein Standard，具有指示大小(kDa)的所选条带；实心箭头突出了ForD蛋白条带
图2：模拟补料分批培养72h后，来自地衣芽孢杆菌蛋白酶表达菌株的上清液的SDS-PAGE。
1-3＝对照菌株；4＝ForD缺失菌株；5-7＝DegQ过量表达菌株；
DegQ的过量表达导致ForD从胞外蛋白质组中丢失；M＝Precision Plus ProteinStandard，具有指示大小(kDa)的所选条带；实心箭头突出了ForD蛋白条带；空心箭头表示异源蛋白酶
发明详述
应当理解，如在说明书和权利要求书中所用，“一个(a)”或“一个(an)”可以表示一个或多个，这取决于其使用的上下文。因此，例如，提到“一个细胞”可以表示可以使用至少一个细胞。
此外，应当理解，如本文所用的术语“至少一个”表示可以按照本发明使用该术语后面提到的一个或多个项目。例如，如果该术语表示应当使用至少一种进料溶液，这可以理解为一种进料溶液或一种以上的进料溶液，即两种、三种、四种、五种或任何其他数量的进料溶液。根据该术语所指的项目，技术人员理解该术语可能指的上限(如果有的话)。
如本文所用的术语“约”表示对于所述术语之后列举的任何数字，存在区间精度，在该区间内可以实现技术效果。因此，如本文提到的约优选是指精确数值或所述精确数值±20％左右的范围，优选±15％，更优选±10％，甚至更优选±5％。
如本文所用的术语“包含”不应当理解为限制意义。该术语表示可能存在比实际提到的项目更多的项目，例如，如果它是指包含某些步骤的方法，则不应当排除其他步骤的存在。然而，术语“包含”还涵盖仅存在所提到的项目的实施方案，即它在“由…组成”的意义上具有限制性含义。
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用，是指任何长度的聚合无支化形式的核苷酸，通常是脱氧核糖核苷酸。术语“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指任何长度的聚合形式的氨基酸，通过肽键连接在一起。
术语“编码(coding for)”和“编码(encoding)”在本文中可互换使用。通常，这些术语是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的特性，用作合成其他大分子的模板，如确定的氨基酸序列。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码蛋白。
为了本发明的目的，关于细胞或生物体的术语“修饰的”、“遗传修饰的”或“遗传修饰”(在本文中也称作“重组的”或“转基因的”)表示所述细胞或生物体含有异源多核苷酸，其获得自不同生物体或由人类通过基因技术产生。因此，修饰的细胞是非天然细胞。
术语“天然”(或野生型或内源)细胞或生物体以及“天然”(或野生型或内源)多核苷酸或多肽分别是指在自然界中发现的细胞或生物体以及在细胞中以其天然形式和遗传环境发现的所讨论的多核苷酸或多肽(即，没有任何人为干预)。
如本文所用的术语“改变的蛋白”是指已经由人类通过基因技术修改的蛋白，可以由修饰的内源基因或外源基因(也称作对宿主细胞异源)编码，例如，插入宿主细胞的编码所述蛋白的外源基因，优选与编码所述蛋白的缺失或失活的内源基因一起。因此，改变的蛋白是非天然蛋白。
术语“无义突变”是在蛋白编码序列的编码区内导致终止密码子的点突变。
术语“错义突变”是在相应的氨基酸位置导致另一氨基酸的点突变。
术语“使基因失活”表示与对照细胞中的表达相比，基因的表达已有所降低。优选地，与对照细胞中的相应表达相比，本发明的细菌宿主细胞中基因的表达已降低至少40％，如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。更优选地，所述表达已降低至少95％。最优选地，其已降低100％，即已完全消除。
如本文提到的“对照细胞”是不携带相应修饰的同一物种的对照细胞，优选其与宿主细胞的不同之处仅在于不携带相应修饰。因此，对照细胞是未修饰的细胞，如野生型细胞，即未修饰的野生型细胞，优选地衣芽孢杆菌细胞，其不携带相应修饰。优选地，对照细胞是地衣芽孢杆菌细胞，其与宿主细胞的不同之处仅在于不携带相应修饰。
本文提到的基因失活可以通过任何被认为合适的方法来实现。在一实施方案中，通过突变，即通过突变基因，使基因失活。优选地，所述突变是缺失，优选地，缺失所述基因。
如本文所用，“基因的缺失”是指整个编码序列的缺失，部分编码序列的缺失，或包括侧翼区在内的编码序列的缺失，最终结果是缺失的基因实际上是无功能的。简单地说，“缺失”定义为核苷酸或氨基酸序列的变化，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基分别被去除(即，不存在)。因此，缺失菌株比各自的野生型生物体具有更少的核苷酸或氨基酸。
术语“使蛋白失活”表示蛋白的氨基酸序列发生改变，与未改变的蛋白相比，蛋白在细胞中的功能已经降低。优选地，与未改变的蛋白的相应功能相比，本发明的细菌宿主细胞中蛋白的功能已降低至少10％，如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。更优选地，所述功能已降低至少95％。最优选地，功能已降低100％，即蛋白是完全无功能的。
亲本蛋白的变体可以具有与亲本序列的氨基酸序列具有一定百分比相同性的氨基酸序列。因此，亲本多肽的变体可以包含与亲本多肽的氨基酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％相同的氨基酸序列。因此，变体可以通过它们与亲本多肽相比时的序列相同性来定义。序列相同性通过提供为“％序列相同性”或“％相同性”。为了确定两个氨基酸序列之间的百分比相同性，在第一步中在这两个序列之间产生成对序列比对，其中将两个序列在它们的整个长度上比对(即，成对全局比对)。用实现Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)的程序产生比对，优选通过使用程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))，用程序默认参数(gapopen＝10.0，gapextend＝0.5和matrix＝EBLOSUM62)。用于本发明目的的优选比对是可以由其确定最高序列相同性的比对。
比对两个序列之后，在第二步中，应当从比对确定相同性值。因此，根据本发明，以下百分比相同性的计算适用：
％-identity＝(相同残基/在其完整长度上显示本发明的相应序列的比对区域的长度)*100。因此，与根据这个实施方案的两个氨基酸序列的比较相关的序列相同性是通过将相同残基的数量除以比对区域的长度来计算的，所述比对区域在其完整长度上显示本发明的相应序列。将这个值乘以100以给出“％-相同性”。
对于计算两个DNA序列的百分比相同性，与计算两个氨基酸序列的百分比相同性相同，具有一些规范。对于编码蛋白的DNA序列，应当在编码区的整个长度上进行成对比对，从起始密码子到终止密码子，不包括内含子。对于非蛋白编码DNA序列，应当在本发明序列的整个长度上进行成对比对，因此将本发明的完整序列与另一序列或另一序列之外的区域进行比较。此外，实现Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)的优选比对程序是“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))，用程序默认参数(gapopen＝10.0，gapextend＝0.5和matrix＝EDNAFULL)。
在一实施方案中，变体多肽包含1-30、1-20、1-10或1-5个氨基酸取代，优选地，这类取代与酶的功能结构域无关。
变体可以通过它们与亲本多肽相比时的序列相似性来定义。序列相似性通过提供为“％序列相似性”或“％-相似性”。为了计算序列相似性，在第一步中必须如上所述生成序列比对。在第二步中，必须计算百分比-相似性，而百分比序列相似性考虑到定义的氨基酸集合具有相似的特性，例如，它们的大小，它们的疏水性，它们的电荷或其他特征。在这里，一个氨基酸与相似氨基酸的交换被称作“保守突变”。包含保守突变的多肽变体似乎对蛋白折叠的影响最小，导致某些多肽，优选酶，在与亲本多肽的多肽特性相比时，其特性基本上保持不变。
对于根据本发明确定％-相似性，适用以下内容，这也符合BLOSUM62矩阵(矩阵(Henikoff,J.G.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,10915–10919(1992))，该矩阵是数据库搜索和序列比对中最常用的氨基酸取代矩阵之一。如果字母对的BLOSUM62取代矩阵的值为正，则氨基酸交换被定义为相似。
氨基酸A与氨基酸S相似
氨基酸D与氨基酸E；N相似
氨基酸E与氨基酸D；K；Q相似
氨基酸F与氨基酸W；Y相似
氨基酸H与氨基酸N；Y相似
氨基酸I与氨基酸L；M；V相似
氨基酸K与氨基酸E；Q；R相似
氨基酸L与氨基酸I；M；V相似
氨基酸M与氨基酸I；L；V相似
氨基酸N与氨基酸D；H；S相似
氨基酸Q与氨基酸E；K；R相似
氨基酸R与氨基酸K；Q相似
氨基酸S与氨基酸A；N；T相似
氨基酸T与氨基酸S相似
氨基酸V与氨基酸I；L；M相似
氨基酸W与氨基酸F；Y相似
氨基酸Y与氨基酸F；H；W相似。
保守氨基酸取代可能发生在功能蛋白如酶的多肽序列的全长序列上。在一实施方案中，这类突变与酶的功能结构域无关。在另一实施方案中，保守突变与酶的催化中心无关。
因此，根据本发明，以下百分比相似性的计算适用：
％-相似性＝[(相同残基+相似残基)/在其完整长度上显示本发明的相应序列的比对区域的长度]*100。因此，与两个氨基酸序列的比较相关的序列相似性是通过将相同残基的数量加上相似残基的数量除以比对区域的长度来计算的，所述比对区域在其完整长度上显示本发明的相应序列。将这个值乘以100以给出“％-相似性”。
特别地，包含保守突变的变体多肽，其与相应的亲本序列至少m％相似，m是50和100之间的整数，优选与全长多肽序列相比50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，预期具有基本上不变的多肽特性。在另一实施方案中，保守突变与酶的催化中心无关。在一实施方案中，变体多肽包含1-30、1-20、1-10或1-5个保守氨基酸取代，优选地，这类取代与酶的功能结构域无关。
同样，一个氨基酸与非相似氨基酸的交换被称作“非保守突变”。包含非保守突变的酶变体似乎对蛋白折叠有影响，导致某些酶特性与亲本酶的酶特性相比不同。因此，如果字母对的BLOSUM62取代矩阵的值为负，则氨基酸交换被定义为非保守的。
氨基酸A与氨基酸D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、W、Y不相似
氨基酸C与氨基酸D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y不相似
氨基酸D与氨基酸A、C、F、G、H、I、K、L、M、P、R、T、V、W、Y不相似
氨基酸E与氨基酸A、C、F、G、I、L、M、P、T、V、W、Y不相似
氨基酸F与氨基酸A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、V不相似
氨基酸G与氨基酸C、D、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y不相似
氨基酸H与氨基酸A、C、D、F、G、I、K、L、M、P、S、T、V、W不相似
氨基酸I与氨基酸A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、W、Y不相似
氨基酸K与氨基酸A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、T、V、W、Y不相似
氨基酸L与氨基酸A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、W、Y不相似
氨基酸M与氨基酸A、C、D、E、G、H、K、N、P、R、S、T、W、Y不相似
氨基酸N与氨基酸A、C、F、I、L、M、P、V、W、Y不相似
氨基酸P与氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y不相似
氨基酸Q与氨基酸A、C、F、G、I、L、P、T、V、W、Y不相似
氨基酸R与氨基酸A、C、D、F、G、I、L、M、P、S、T、V、W、Y不相似
氨基酸S与氨基酸C、F、H、I、L、M、P、R、V、W、Y不相似
氨基酸T与氨基酸C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、W、Y不相似
氨基酸V与氨基酸C、D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y不相似
氨基酸W与氨基酸A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V不相似
氨基酸Y与氨基酸A、C、D、E、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V不相似
宿主细胞
本发明涉及一种修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，与未修饰的对照细胞相比，优选包含更高水平的磷酸化的DegU蛋白。“磷酸化的DegU”在本文中也称作DegU-P。优选地，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞不包含DegU32突变。术语“DegU32突变”在本文中是指导致地衣芽孢杆菌DegU蛋白中的氨基酸取代H12L的遗传修饰。
可以优选通过DegS/DegU双组分调节系统中的突变来增加DegU-P的量。在一实施方案中，可以通过遗传修饰来增加DegU-P的量，所述遗传修饰导致degU(或其变体)、degS(或其变体)、degQ(或其变体)、degR(或其变体)或phrG(或其变体)基因的表达增加。
特别地，本发明涉及一种修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含以下至少一种
a.地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加，
b.地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加，以及
c.地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低。
优选地，本发明涉及修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致degQ基因的表达增加。
优选地，本发明涉及一种修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致degQ基因的表达增加，以及地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加，或者地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低。
优选地，本发明涉及一种修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，与未修饰的对照细胞相比，其包含更高水平的磷酸化的DegU蛋白，其中所述更高水平的磷酸化的DegU蛋白是由以下至少一种引起的
a.地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加，
b.地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加，以及
c.地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低。
优选地，本发明涉及一种修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，与未修饰的对照细胞相比，其包含更高水平的磷酸化的DegU蛋白，其中所述更高水平的磷酸化的DegU蛋白是由地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰引起的，与未修饰的对照细胞相比，所述遗传修饰导致degQ基因的表达增加。
优选地，本发明涉及一种修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，与未修饰的对照细胞相比，其包含更高水平的磷酸化的DegU蛋白，其中所述更高水平的磷酸化的DegU蛋白是由以下引起的：地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致degQ基因的表达增加，以及地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加，或者地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低。
在一实施方案中，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加。优选地，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致degQ基因的表达增加。
增加基因或基因产物表达的方法在本领域中已有很好的记录，包括例如由适当启动子驱动的过量表达。用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的适当启动子在本领域是众所周知的，并且在本文的其他地方有更详细的描述。优选地，用于过量表达degQ、degU、degS、degR和phrG中的任何一个基因(优选degQ基因)的启动子序列包含与SEQ ID NO:3的核苷酸19-94具有至少80％、至少90％或100％的核苷酸序列。在一些实施方案中，通过将基因引入宿主细胞并表达(在合适的启动子控制下)来实现增加的表达。例如，可以通过将degQ基因引入宿主细胞并表达所述degQ基因来实现degQ的表达增加。因此，可以将一个额外的degQ拷贝引入宿主细胞。
此外，可以通过在基因的适当位置(通常在上游)引入作为启动子的分离核酸来实现核酸的表达增加，从而上调核酸编码基因的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代在体内改变内源启动子，或者可以将分离的启动子以适当的方向和与核酸编码序列的距离引入宿主细胞，以增加基因的表达。
术语“增加”和“增强”在本文中可互换使用，对于感兴趣的基因或蛋白的表达应指基因的转录和翻译的增加，优选至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。优选地，增加是相对于对照细胞。
本发明的宿主细胞可以是任何地衣芽孢杆菌宿主细胞。例如，宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC14580的宿主细胞(与DSM13相同，参见Veith et al."The completegenome sequence of Bacillus licheniformis DSM13,an organism with greatindustrial potential."J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2004)7:204-211)。
本文所述至少一个基因(例如，degQ、degU、degS、degR或phrG基因)的表达增加可以通过改变本文所述基因的控制序列来实现，从而导致编码蛋白的表达增加。或者或与其组合，本文所述至少一个基因的表达增加可以通过增加本文所述一个或多个基因的拷贝数来实现。本文所述一个或多个基因的额外拷贝可以编码天然蛋白或其变体。因此，本文所述一个或多个基因的表达增加可以通过过量表达天然或非天然蛋白来实现。可以将编码本文所述一个或多个蛋白的一个或多个额外基因整合到宿主细胞的基因组，即染色体中，也可以存在于染色体外的遗传元件中，例如，质粒DNA。
在一实施方案中，地衣芽孢杆菌细胞中DegQ、DegU、DegS、DegR或PhrG蛋白的表达增加可以通过增加来自相同芽孢杆菌，即地衣芽孢杆菌的DegQ、DegU、DegS、DegR或PhrG蛋白的表达来实现。在另一实施方案中，地衣芽孢杆菌细胞中DegQ、DegU、DegS、DegR或PhrG蛋白的表达增加可以通过增加来自不同芽孢杆菌的DegQ、DegU、DegS、DegR或PhrG蛋白的表达来实现，例如，与地衣芽孢杆菌密切相关的芽孢杆菌，例如，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，优选来自枯草芽孢杆菌。在另一实施方案中，地衣芽孢杆菌细胞中DegU、DegS、DegQ、DegR或PhrG蛋白的表达增加可以通过增加来自芽孢杆菌的DegQ、DegU、DegS、DegR或PhrG蛋白功能变体的表达来实现，优选来自地衣芽孢杆菌的DegQ、DegU、DegS、DegR或PhrG蛋白变体。
在一实施方案中，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致degQ基因的表达增加。
本文所述的degQ基因编码DegQ蛋白。DegQ是一种降解酶调节蛋白，其刺激磷酸-DegS向DegU的磷酸转移。degQ基因的表达增加导致感兴趣的化合物的产量提高。
在一实施方案中，DegQ蛋白来自地衣芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:37所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:35所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:37至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
在一实施方案中，DegQ蛋白来自枯草芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:38所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:36所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:38至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
在一实施方案中，DegQ蛋白来自贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQ ID NO:51所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:48所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:51至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
在一实施方案中，DegQ蛋白来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQ ID NO:52所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:49所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:52至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
在一实施方案中，DegQ蛋白来自短小芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:50所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:47所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:50至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
优选地，DegQ蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:37所示的序列或其变体。
在一优选实施方案中，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，通过将额外的degQ基因拷贝整合到地衣芽孢杆菌宿主细胞中，导致degQ基因的表达增加。优选地，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，通过将包含编码DegQ蛋白的基因的表达构建体引入宿主细胞，导致degQ基因的表达增加，所述表达构建体优选包含与SEQ ID NO:4的核苷酸11-151具有至少80％、至少90％或100％的核苷酸序列，与启动子序列可操作地连接，优选包含与SEQ ID NO:3的核苷酸19-94具有至少80％、至少90％或100％的核苷酸序列。优选地，表达构建体作为degQ基因的额外拷贝整合到地衣芽孢杆菌宿主细胞的染色体中。在一特别优选的实施方案中，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，通过将除内源性degQ基因外的表达构建体引入宿主细胞，导致degQ基因的表达增加，所述表达构建体包含编码DegQ蛋白的基因，该基因包含具有SEQ ID NO:4的核苷酸11-151的核苷酸序列，可操作地连接至包含SEQ ID NO:3的核苷酸19-94的启动子序列。
在一实施方案中，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致degU基因的表达增加。
本文所述的degU基因编码转录调节蛋白DegU。转录调节蛋白DegU是双组分调节系统DegS/DegU的成员，其在过渡生长阶段发挥重要作用。degU基因的表达增加导致感兴趣的化合物的产量提高。
在一实施方案中，DegU蛋白来自地衣芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:54所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:53所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:54至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，但少于100％相同的氨基酸序列。
在一实施方案中，DegU蛋白来自枯草芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:56所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:55所示序列的多核苷酸编码)。术语“变体”在本文其他地方有定义。通常，变体包含与SEQ ID NO:56至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
如本文所用的术语“磷酸化的DegU”优选是指在对应于SEQ ID NO:54的56位或SEQID NO:56的56位的位置磷酸化的DegU蛋白。
优选地，DegU蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:54所示的序列或其变体。
在一实施方案中，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致degS基因的表达增加。
本文所述的degS基因编码DegS蛋白。DegS是信号转导组氨酸-蛋白激酶/磷酸酶。该激酶在过渡生长阶段发挥重要作用，并且参与控制不同细胞功能的表达。该蛋白既是一种蛋白激酶，发生自磷酸化，又将磷酸转移至DegU。degS基因的表达增加导致感兴趣的化合物的产量提高。
在一实施方案中，DegS蛋白来自地衣芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:41所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:39所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:41至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
在一实施方案中，DegS蛋白来自枯草芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:42所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:40所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:42至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
优选地，DegQ蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:41所示的序列或其变体。
在一实施方案中，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致degR基因的表达增加。
DegR是稳定DegU磷酸化形式的调节蛋白。通常，这种稳定有助于磷酸化的DegU的水平升高，并且导致胞外酶如碱性蛋白酶和中性蛋白酶的产量增加。degR基因的表达增加导致感兴趣的化合物的产量提高。
在一实施方案中，DegR蛋白来自地衣芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:58所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:57所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:58至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
在一实施方案中，DegR蛋白来自枯草芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:60所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:59所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:60至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
优选地，DegR蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:58所示的序列或其变体。
如上所示，增加磷酸化的DegU的量的突变也可以是导致phrG表达增加的突变。因此，在一实施方案中，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致phrG基因的表达增加。
本文所述的phrG基因编码PhrG多肽。反应调节子天冬氨酸磷酸酶RapG通过与DegU-P的DNA结合结构域相互作用来控制DegU-P活性，从而阻止degU-P与其靶启动子结合，而PhrG与RapG的结合则抵消了这种相互作用。phrG基因的表达增加导致感兴趣的化合物的产量提高。
在一实施方案中，PhrG蛋白来自地衣芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:62所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:61所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:62至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
在一实施方案中，PhrG蛋白来自枯草芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:64所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:63所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:64至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。
优选地，PhrG蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:62所示的序列或其变体。
如上所示，增加磷酸化的DegU的量的突变也可以是增加DegS蛋白自磷酸化活性的修饰，如DegS-X76D突变，优选DegS-S76D突变。DegS蛋白已在上文中定义。DegS-X76D突变体包含X76D取代，即根据SEQ ID NO:41的编号在76位取代为天冬氨酸，优选根据SEQ ID NO:41的编号在DegS蛋白的76位氨基酸处用天冬氨酸取代76位的氨基酸丝氨酸。在一实施方案中，DegS-X76D突变多肽包含如SEQ ID NO:43或44所示的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:43，或是其变体。应当理解变体包含X76D，优选S76D取代。通常，变体包含与SEQ ID NO:43或44，优选SEQ ID NO:43至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列，其中变体包含X76D取代，优选S76D取代。优选地，突变多肽在修饰的宿主细胞中表达。这可以通过在宿主细胞中引入和表达编码突变多肽(或其变体)来实现。优选地，将多核苷酸可操作地连接至合适的启动子。
如上所示，增加磷酸化的DegU的量的突变也可以是减少DegS蛋白磷酸酶活性的遗传修饰，如degS200突变。DegS蛋白已在上文中定义。degS200突变，也称作DegS-X218E突变体，包含X218E取代，优选G218E，即根据SEQ ID NO:41的编号在218位取代为谷氨酸，优选根据SEQ ID NO:41的编号在DegS蛋白的218位氨基酸处用谷氨酸取代218位的氨基酸甘氨酸。在一实施方案中，DegS-X218E突变多肽包含如SEQ ID NO:45或46所示的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:45，或是其变体。应当理解变体包含X218E取代，优选G218E取代。然而，在本发明的范围内应当理解，氨基酸交换X218D，优选G218D，会导致相同的效果。通常，变体包含与SEQ ID NO:45或46至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列，其中变体包含X218E，优选G218E或G218D取代。优选地，突变多肽在修饰的宿主细胞中表达。这可以通过在宿主细胞中引入和表达编码突变多肽(或其变体)来实现。优选地，将多核苷酸可操作地连接至合适的启动子。
在一实施方案中，宿主细胞包含两个增加磷酸化的DegU的量的遗传修饰。例如，宿主细胞包含导致degQ表达增加的遗传修饰和degU32突变。
在一实施方案中，宿主细胞包含两个增加磷酸化的DegU的量的遗传修饰。例如，宿主细胞包含导致degQ、degU、degS、degR和phrG基因中至少一个的表达增加的遗传修饰以及DegS-X76D突变。
在另一实施方案中，宿主细胞包含导致degQ、degU、degS、degR和phrG基因中至少一个的表达增加的遗传修饰以及DegS-X218E突变。
优选地，宿主细胞包含两个增加磷酸化的DegU的量的遗传修饰。例如，宿主细胞包含导致至少一个degQ基因的表达增加的遗传修饰以及DegS-X76D突变。
优选地，宿主细胞包含导致至少一个degQ基因的表达增加的遗传修饰以及DegS-X218E突变。
因此，在一实施方案中，本发明涉及一种制备本文所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞的方法。优选地，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞可以通过包括以下步骤的方法获得
a)提供地衣芽孢杆菌细胞，以及
b)通过向地衣芽孢杆菌细胞中引入以下至少一种来修饰a)项提供的芽孢杆菌细胞
a.地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加，
b.地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加，以及
c.地衣芽孢杆菌宿主细胞中的遗传修饰，与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低。
优选地，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞不包含内源性forD基因的修饰。
在另一实施方案中，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞可以通过包括以下步骤的方法获得
a)提供地衣芽孢杆菌细胞，
b)通过引入核酸构建体来修饰a)提供的芽孢杆菌细胞，所述核酸构建体包含选自如本文所述的degQ、degU、degS、degR和phrG中的至少一种基因，优选衍生自天然地衣芽孢杆菌，或选自编码包含增加的自磷酸化活性的DegS蛋白的基因和编码包含降低的磷酸酶活性的DegS蛋白的基因，优选在合适的启动子序列的控制下，将其引入芽孢杆菌细胞，从而获得修饰的芽孢杆菌宿主细胞，以及
c)任选地失活，优选缺失内源性degQ、degU、degS、degR和phrG基因中的至少一个，优选维持内源性degQ、degU、degS、degR和phrG基因。
在另一实施方案中，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞可以通过包括以下步骤的方法获得
a)提供地衣芽孢杆菌细胞，以及
b)通过引入核酸构建体来修饰a)提供的芽孢杆菌细胞，所述核酸构建体包含选自如本文所述的degQ、degU、degS、degR和phrG中的至少一种基因，优选衍生自天然地衣芽孢杆菌，优选在合适的启动子序列的控制下，将其引入芽孢杆菌细胞，从而获得修饰的芽孢杆菌宿主细胞，以及
c)优选维持内源性degQ、degU、degS、degR和phrG基因。
在另一实施方案中，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞可以通过包括以下步骤的方法获得
a)提供地衣芽孢杆菌细胞，
b)通过引入核酸构建体来修饰a)提供的芽孢杆菌细胞，所述核酸构建体包含选自编码如本文所述包含增加的自磷酸化活性的DegS蛋白的基因(优选DegS-S76D突变)和编码如本文所述包含降低的磷酸酶活性的DegS蛋白的基因(优选DegS-200突变)的至少一种基因，优选在合适的启动子序列的控制下，将其引入芽孢杆菌细胞，从而获得修饰的芽孢杆菌宿主细胞，以及
c)任选地失活，优选缺失内源性degS基因中的至少一个。
在另一实施方案中，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞可以通过包括以下步骤的方法获得
a)提供地衣芽孢杆菌细胞，
b)修饰a)提供的芽孢杆菌细胞，通过将编码DegS蛋白的内源性基因修饰为如本文所述包含增加的自磷酸化活性的DegS蛋白变体(优选通过引入DegS-S76D突变)，或通过将编码DegS蛋白的内源性基因修饰为如本文所述包含降低的磷酸酶活性的DegS蛋白变体(优选通过引入DegS-200突变)，优选在合适的启动子序列的控制下，将其引入芽孢杆菌细胞，从而获得修饰的芽孢杆菌宿主细胞，以及
c)任选地失活，优选缺失内源性degS基因中的至少一个。
在另一实施方案中，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞可以通过包括以下步骤的方法获得
a)提供地衣芽孢杆菌细胞，
b)修饰a)提供的芽孢杆菌细胞，通过引入核酸构建体，所述核酸构建体包含选自如本文所述的degQ、degU、degS、degR和phrG中的至少一种基因，优选衍生自天然地衣芽孢杆菌，优选在合适的启动子序列的控制下，将其引入芽孢杆菌细胞，以及通过引入核酸构建体，所述核酸构建体包含选自编码如本文所述包含增加的自磷酸化活性的DegS蛋白的基因(优选DegS-S76D突变)和编码如本文所述包含降低的磷酸酶活性的DegS蛋白的基因(优选DegS-200突变)的至少一种基因，优选在合适的启动子序列的控制下，将其引入芽孢杆菌细胞，从而获得修饰的芽孢杆菌宿主细胞，以及
c)失活，优选缺失内源性degS基因中的至少一个。
在另一实施方案中，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞可以通过包括以下步骤的方法获得
a)提供地衣芽孢杆菌细胞，
b)修饰a)提供的芽孢杆菌细胞，通过引入核酸构建体，所述核酸构建体包含如本文所述的degQ基因，优选衍生自天然地衣芽孢杆菌，优选在合适的启动子序列的控制下，将其引入芽孢杆菌细胞，以及通过引入核酸构建体，所述核酸构建体包含选自编码如本文所述包含增加的自磷酸化活性的DegS蛋白的基因(优选DegS-S76D突变)和编码如本文所述包含降低的磷酸酶活性的DegS蛋白的基因(优选DegS-200突变)的至少一种基因，优选在合适的启动子序列的控制下，将其引入芽孢杆菌细胞，从而获得修饰的芽孢杆菌宿主细胞，以及
c)失活，优选缺失内源性degS基因中的至少一个。
在另一实施方案中，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞可以通过包括以下步骤的方法获得
a)提供地衣芽孢杆菌细胞，
b)修饰a)提供的芽孢杆菌细胞，通过引入核酸构建体，所述核酸构建体包含如本文所述的degQ基因，优选衍生自天然地衣芽孢杆菌，优选在合适的启动子序列的控制下，将其引入芽孢杆菌细胞，以及通过将编码DegS蛋白的内源性基因修饰为如本文所述包含增加的自磷酸化活性的DegS蛋白变体(优选通过引入DegS-S76D突变)，或通过将编码DegS蛋白的内源性基因修饰为如本文所述包含降低的磷酸酶活性的DegS蛋白变体(优选通过引入DegS-200突变)，优选在合适的启动子序列的控制下，将其引入芽孢杆菌细胞，从而获得修饰的芽孢杆菌宿主细胞，以及
c)失活，优选缺失内源性degS基因中的至少一个。
在一实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞用于生产如本文其他地方所述的感兴趣的化合物。感兴趣的化合物对宿主细胞可以是内源的或异源的。优选地，感兴趣的化合物是蛋白，优选酶。优选地，感兴趣的化合物对宿主细胞是异源的。优选地，感兴趣的化合物是蛋白，优选酶，对宿主细胞是异源的。
在一实施方案中，宿主细胞包含表达盒，用于生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽。在一实施方案中，感兴趣的多肽是酶，如选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、乳糖酶、磷酸酶、葡糖淀粉酶、核酸酶、半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶和纤维素酶的酶，优选蛋白酶和/或淀粉酶。
优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的Formosin D(ForD，细菌素)编码基因表达，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。优选地，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞不包含内源性forD基因的修饰，即，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞仍然包含未修饰的内源行forD基因。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的Formosin D蛋白编码基因表达，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，其中Formosin D蛋白由与SEQ ID NO:33具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性的序列编码。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的Formosin D蛋白编码基因表达，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，其中Formosin D蛋白与SEQ ID NO:34具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的Formosin D蛋白编码基因表达(优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比)，其中Formosin D蛋白与SEQ ID NO:34具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性。
优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌产生纯度更高的感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。因此，优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌包含纯度更高的感兴趣的化合物，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌产生感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽，且Formosin D(ForD)的量减少，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞产生感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽，且Formosin D蛋白的量减少，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，其中Formosin D蛋白与SEQ ID NO:34具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性。
优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌包含增加的感兴趣的化合物产量，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌包含增加的感兴趣的化合物纯度，优选Formosin D的量减少，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，并且包含增加的感兴趣的化合物产量，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。
产生修饰的芽孢杆菌细胞和改变的蛋白的方法，例如，通过引入外来核酸、染色体基因缺失、取代、突变和失活，是本领域已知的。
将DNA引入宿主细胞，在一实施方案中为芽孢杆菌细胞，可以例如通过原生质体转化(参见，例如，Chang and Cohen,1979,Molecular General Genetics 168:111-115)，通过使用感受态细胞(参见，例如，Young and Spizizen,1961,Journal of Bacteriology81:823-829，或Dubnau and Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology56:209-221)，通过电穿孔(参见，例如，Shigekawa and Dower,1988,Biotechniques 6:742-751)，或通过接合(参见，例如，Koehler and Thorne,1987,Journal of Bacteriology169:5271-5278)。对于各种类型的宿主细胞，具体转化方案在本领域是已知的(参见，例如，关于大肠杆菌原生质体转化参见Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)。
基因失活可以通过同源重组实现，即进入的DNA分子包含与待失活的宿主细胞(例如芽孢杆菌)染色体上靶序列的5’和3’侧翼序列同源的序列。随后在同源重组的过程中，所述侧翼序列之间的序列被进入的DNA分子的同源序列取代，即该序列从染色体中缺失。同样，“基因整合”，即DNA序列，如带有或不带有选择标记的基因表达盒，可以通过同源重组整合到细菌宿主细胞的染色体中。因此。待整合的DNA序列两侧是与染色体上的5’和3’侧翼序列同源的DNA序列。根据本发明可以理解，基因整合也可以将基因整合和基因缺失结合在一个步骤中，即染色体上的DNA序列被进入的DNA序列取代以进行基因整合。
同源重组可以通过本领域已知的两种不同方法实现：
通过与环状质粒DNA的连续两轮同源重组(Campbell重组)，例如基于众所周知的温度敏感质粒pE194(Nahrstedt et al.,Strain development in Bacilluslicheniformis:construction of biologically contained mutants deficient insporulation and DNA repair.JBiotechnol.2005Sep 29；119(3):245-54)。
在选择标记的选择条件下，在非允许温度下培养，即阻断质粒复制的温度，通过与第一同源区的第一次同源重组(Campbell重组)，实现含有进入的DNA分子的缺失质粒的整合，所述DNA分子包含与染色体上靶序列的5’和3’侧翼序列同样的序列。通过去除选择压力并在允许温度下培养来实现与第二同源区的第二次同源重组，即发生质粒复制，导致从染色体切除质粒。
或者，可以使用非复制性“自杀”质粒，通过在选择标记上选择来迫使整合。只有通过同源重组将质粒整合到基因组中的细胞能够在选择条件下生长。从染色体去除/切除质粒是通过第二次同源重组实现的，通过激活质粒上存在的反选择标记来迫使第二次同源重组。
同源重组的第二中方法是指同时发生的两个同源重组事件，也称作“双交叉”或“双同源重组”。进入的DNA序列是线性的，可以通过PCR、质粒DNA的线性化或染色体DNA的制备获得，这不可避免地导致片段化的线性DNA。WO0308125使用线性DNA构建体(线性化质粒或PCR片段)，其包含选择标记，两侧是5’和3’同源区，用于通过双交叉同源重组进行基因组整合。众所周知，在选择标记旁边，额外的DNA，如基因表达盒，当两侧是所述同源区时，被整合到细菌宿主细胞的染色体中。
同源重组需要足够大小的与宿主细胞染色体上靶序列的5’和3’侧翼序列同源的DNA序列，因此应当含有足够数量的核酸，如100-1,500个碱基对，优选400-1,500个碱基对，最优选800-1,500个碱基对，其与相应的靶序列具有高度相同性，以提高同源重组的概率(Dubnau,1993,Genetic exchange and homologous recombination.In Bacillussubtilis and Other Gram-positive Bacteria,p.555-584.Edited by A.I.Sonenshein,J.A.Hoch&R.Losick,Washington DC,American Society for Microbiology；Michel andEhrlich,1984,The EMBO Journal,vol.3,pp.2879-2884)。
通过缺失/插入/取代的基因失活也可以通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术来实现，其中CRISPR切割特性可以用于破坏几乎任何生物体基因组中的基因，并且具有前所未有的便利性(Mali P,et al(2013)Science.339(6121):819-823；Cong L,et al(2013)Science339(6121))。最近很明显，提供修复模板，例如同源区，允许在几乎任何位点用几乎任何期望的序列编辑基因组，将CRISPR转化为强大的基因编辑工具(WO/2014/150624,WO/2014/204728)。
基于CRISPR的基因组编辑系统在革兰氏阳性生物体中的应用已经得到了很好的描述，如基于芽孢杆菌的单质粒系统方法，即在单个大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体上包含Cas9内切核酸酶、gRNA0(例如sgRNA或crRNA/tracrRNA)、修复同样序列(供体DNA)(Altenbuchner,(2016):Applied and environmental microbiology 82(17),5421-5427；Zhou,et al.(2019):International journal of biological macromolecules 122,329–337)，或双质粒系统或将Cas9内切核酸酶整合到芽孢杆菌基因组中，如WO2020206202和WO2020206197所述。
除“定向”失活方法外，在本发明的范围内应当理解，通过应用诱变条件如将细胞暴露于UV辐射，或化学诱变化学品如NTG(N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)、EMS(甲基磺酸乙酯)，结合筛选和/或选择期望的特性，例如降低的脂肪酶/酯酶活性，进行全细胞诱变是实现功能失活的一种众所周知的方法。
此外，可以通过基因沉默使基因失活。基因沉默可以通过引入所述细菌宿主细胞反义表达构建体来实现，所述构建体导致与基因mRNA互补的反义RNA，从而抑制所述基因的表达。或者，可以通过CRISPR-抑制机制阻断转录起始或转录延伸来抑制所述基因的表达(WO18009520)。
生产感兴趣的化合物的方法
在另一实施方案中，本发明涉及一种生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的方法，优选具有增加的纯度。为了生产感兴趣的多肽，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞应当包含至少一个编码感兴趣的一种或多种多肽的多核苷酸，其中所述一个或多个多核苷酸与启动子可操作地连接。因此，宿主细胞应当包含至少一种感兴趣的多肽的表达盒。
因此，本发明涉及一种生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的方法，包括
a)提供修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含以下至少一种
a.与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加的遗传修饰，
b.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及
c.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰，
b)在所述修饰的芽孢杆菌宿主细胞上引入感兴趣的化合物的表达盒，优选感兴趣的多肽，优选由宿主细胞分泌的多肽，
c)在允许表达感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
d)任选地从培养基分离感兴趣的化合物，优选与未修饰的对照细胞相比，地衣芽孢杆菌宿主细胞产生纯度增加的感兴趣的化合物。
优选地，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞不包含内源性forD基因的修饰。
优选地，本发明涉及一种生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的方法，包括
a)提供包含遗传修饰的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，与未修饰的对照细胞相比，所述遗传修饰导致至少一个degQ基因的表达增加，
b)在所述修饰的芽孢杆菌宿主细胞上引入感兴趣的化合物的表达盒，优选感兴趣的多肽，优选由宿主细胞分泌的多肽，
c)在允许表达感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
d)任选地，从培养基分离感兴趣的化合物。
优选地，本发明涉及一种生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的方法，包括
a)提供修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含
a.与未修饰的对照细胞相比，导致至少一个degQ基因的表达增加的遗传修饰，以及任选地
b.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，或者
c.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰，
b)在所述修饰的芽孢杆菌宿主细胞上引入感兴趣的化合物的表达盒，优选感兴趣的多肽，优选由宿主细胞分泌的多肽，
c)在允许表达感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
d)任选从培养基分离感兴趣的化合物。
本发明进一步涉及一种提高地衣芽孢杆菌细胞产生的感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的纯度的方法，包括以下步骤
a)提供修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含以下至少一种
a.与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加的遗传修饰，
b.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及
c.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰，
b)在允许表达感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
c)从培养基分离感兴趣的化合物。
本发明进一步涉及一种提高地衣芽孢杆菌细胞产生的感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的纯度的方法，包括以下步骤
a)提供包含遗传修饰的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，与未修饰的对照细胞相比，所述遗传修饰导致degQ基因的表达增加，
b)在允许表达感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
c)从培养基分离感兴趣的化合物。
本发明进一步涉及一种提高地衣芽孢杆菌细胞产生的感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的纯度的方法，包括以下步骤
a)提供修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含
a.与未修饰的对照细胞相比，导致degQ基因的表达增加的遗传修饰，以及任选地
b.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，或者
c.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰，
b)在允许表达感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
c)从培养基分离感兴趣的化合物。
如果应用，本发明的方法允许提高感兴趣的化合物的纯度。优选地，与对照细胞产生的感兴趣的化合物的纯度相比，关于特定污染的纯度增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
优选地，与未修饰的对照细胞相比，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的FormosinD表达，优选地，其中Formosin D更优选包含与SEQ ID NO:34具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性的序列。优选地，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞不包含内源性forD基因的修饰。
本发明进一步涉及一种减少地衣芽孢杆菌细胞产生的感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的Formosin D污染的方法，包括以下步骤
a)提供修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含以下至少一种
a.与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加的遗传修饰，
b.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及
c.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰，
b)在允许表达感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
c)从培养基分离感兴趣的化合物。
如果应用，本发明的方法允许减少宿主细胞蛋白，优选Formosin D对感兴趣的化合物的污染。优选地，与对照细胞产生的感兴趣的化合物的污染相比，特定宿主细胞化合物，优选Formosin D对感兴趣的化合物的污染减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
上面给出的关于本发明修饰的宿主细胞的解释和定义比照适用于本发明的方法。
如本文所用的术语“培养”是指至少在预定时间内使培养物中包含的修饰的宿主细胞保持存活和/或增殖。该术语涵盖接种后生长开始时的指数细胞生长阶段以及稳定生长阶段。培养条件应当允许表达，即产生感兴趣的多肽。这类条件可以由技术人员选择，无需赘述。实施例1和2描述了培养修饰的宿主细胞的示例性条件。在本发明的方法的一实施方案中，培养作为补料分批培养进行。
如果应用，本发明的方法允许增加至少一种感兴趣的化合物，优选多肽的表达，即产生。优选地，与未修饰的对照细胞中的表达相比，表达增加。在一优选实施方案中，与对照细胞中的表达相比，至少一种感兴趣的多肽的表达增加至少10％、20％或至少40％，如至少50％，或至少80％。例如，与对照细胞相比，至少一种感兴趣的多肽的表达可以增加20％-100％，如40％-60％。此外，设想表达增加至少100％、150％、200％、250％或300％，如200％-300％。通常，可以通过确定宿主细胞和/或培养基中感兴趣的化合物的量来测量表达。
在一实施方案中，用于在芽孢杆菌宿主细胞中表达感兴趣的化合物的表达盒对芽孢杆菌宿主细胞是异源的。优选地，编码至少一种感兴趣的多肽的多核苷酸对芽孢杆菌宿主细胞是异源的。优选地，在一实施方案中，编码至少一种感兴趣的多肽的多核苷酸对细菌宿主细胞是异源的。在整个说明书中使用的术语“异源”(或外源或外来或重组或非天然)多肽或蛋白在本文中定义为非宿主细胞天然的多肽或蛋白。类似地，术语“异源”(或外源或外来或重组或非天然)多核苷酸是指非宿主细胞天然的多核苷酸。
优选地，编码感兴趣的多肽的表达构建体还编码信号序列，所述信号序列引导感兴趣的多肽分泌到细胞外，优选分泌到培养基(发酵液)中。这类信号肽在本领域是众所周知的，并且优选添加至感兴趣的多肽的N-末端，优选通过切割位点连接，以便在感兴趣的多肽分泌到宿主细胞外之前或期间将信号肽从感兴趣的多肽上切割下来。
在一实施方案中，所述至少一种编码感兴趣的多肽的多核苷酸存在于质粒上。术语“质粒”是指染色体外的环状DNA，即在宿主细胞中自主复制的载体。因此，质粒被理解为染色体外载体。
在一优选实施方案中，质粒的复制应当独立于细菌宿主细胞染色体的复制。对于自主复制，表达载体可以进一步包含复制起点，是载体能够在所述宿主细胞中自主复制。细菌的复制起点包括但不限于允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pSC101、pACYC177和pACYC184的复制起点(Sambrook,J.and Russell,D.W.Molecularcloning.Alaboratory manual,3rd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY.2001；Cohen,S.N.,Chang,A.C.Y.,Boyer,H.W.,&Helling,R.B.(1973).Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids InVitro.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,70(11),3240–3244)，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pC194、pE194、pTB19、pAMβ1和pTA1060(Janniere,L.,Bruand,C.,and Ehrlich,S.D.(1990).Structurallystable Bacillus subtilis cloning vectors.Gene 87,53-6；Ehrlich,S.D.,Bruand,C.,Sozhamannan,S.,Dabert,P.,Gros,M.F.,Janniere,L.,and Gruss,A.(1991).Plasmidreplication and structural stability in Bacillus subtilis.Res.Microbiol.142,869-873)，以及pE194(Dempsey,L.A.and Dubnau,D.A.(1989).Localization of thereplication origin of plasmid pE194.J.Bacteriol.171,2866-2869)。复制起点可以是具有突变的复制起点，使其功能在宿主细胞中对温度敏感。
质粒的拷贝数定义为在正常生长条件下每个细菌细胞或每个染色体的质粒平均数量。此外，有不同类型的复制起点，导致细菌宿主中的拷贝数不同。质粒复制子pBS72(登录号AY102630.1)和质粒pTB19及衍生物pTB51、pTB52在芽孢杆菌细胞内分别赋予6个拷贝和1-8个拷贝的低拷贝数，而质粒pE194(登录号V01278.1)和pUB110(登录号M19465.1)/pBC16(登录号U32369.1)分别赋予每个细胞14-20个拷贝的中低拷贝数和30-50个拷贝的中拷贝数。对质粒pE194进行了更详细的分析(Villafane,et al(1987):J.Bacteriol.169(10),4822-4829)，描述的几种pE194–cop突变体在芽孢杆菌内具有85个拷贝至202个拷贝的高拷贝数。此外，质粒pE194对温度敏感，在高达37℃下具有稳定拷贝数，但在43℃以上停止复制。此外，它存在一种称作pE194ts的pE194变体，在cop-repF区内有两个点突变(nt1235和nt 1431)，导致更强烈的温度敏感性–在高达32℃下具有稳定拷贝数，但是在37℃下每个细胞只有1-2个拷贝。
在一实施方案中，载体含有一个或多个选择标记，其允许容易选择转化的细胞。选择标记是编码产物的基因，其提供杀生物剂抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原营养等。细菌选择标记包括但不限于来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性的标记，如氨苄西林、卡纳霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性。此外，选择可以通过共转化来完成，例如，如WO91/09129所述，其中选择标记在不同的载体上。
在另一实施方案中，将所述至少一种编码感兴趣的多肽的多核苷酸稳定地整合到细菌染色体中。
启动子
所述至少一种编码感兴趣的多肽的多核苷酸应当与启动子可操作地连接。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指启动子序列和编码感兴趣的多肽的多核苷酸之间的功能性连接，使得启动子序列能够启动编码感兴趣的多肽的多核苷酸(在本文中也称作感兴趣的基因)的转录。
“启动子”或“启动子序列”是位于基因上游的核苷酸序列，与基因位于同一条链上，使该基因能够转录。启动子之后是基因的转录起始位点。启动子被RNA聚合酶(连同任何所需的转录因子)识别，从而启动转录。启动子的功能片段或功能变体是可被RNA聚合酶识别并能够启动转录的核苷酸序列。
“活性启动子片段”、“活性启动子变体”、“功能性启动子片段”或“功能性启动子变体”描述了仍然具有启动子活性的启动子核苷酸序列的片段或变体。
启动子可以是“诱导物依赖性启动子”或“诱导物非依赖性启动子”，包含组成型启动子或受其他细胞调节因子控制的启动子。
本领域技术人员能够选择合适的启动子来表达第三丙氨酸消旋酶和感兴趣的多肽。例如，编码感兴趣的多肽的多核苷酸优选可操作地连接至“诱导物依赖性启动子”或“诱导物非依赖性启动子”。此外，编码第三丙氨酸消旋酶的多核苷酸优选可操作地连接至“诱导物非依赖性启动子”，如组成型启动子。
“诱导物依赖性启动子”在本文中理解为在发酵培养基中添加“诱导物分子”后，其活性增加，从而使启动子可操作地连接的基因能够转录的启动子。因此，对于诱导物依赖性启动子，诱导物分子的存在会通过信号转导触发可操作地连接至启动子的基因的表达增加。通过诱导物分子的存在激活之前的基因表达不需要不存在，而是也可以以低水平的基础基因表达存在，在添加诱导物分子后增加。“诱导物分子”是一种分子，其在发酵培养基中的存在能够通过增加可操作地连接至基因的诱导物依赖性启动子的活性来影响基因表达的增加。优选地，诱导物分子是碳水化合物或其类似物。在一实施方案中，诱导物分子是芽孢杆菌细胞的次级碳源。在碳水化合物混合物的存在下，细胞选择性地吸收为其提供最多能量和生长优势的碳源(主要碳源)。同时，它们抑制参与不太优选的碳源(次级碳源)的分解代谢和摄取的各种功能。通常，芽孢杆菌的主要碳源是葡萄糖，各种其他糖和糖衍生物被芽孢杆菌用作次级碳源。次级碳源包括例如甘露糖或乳糖，但不限于这些。
诱导物依赖性启动子的实例在下表中参考各自的操纵子给出：
与此相反，不依赖于诱导物分子存在的启动子(在本文中称作“诱导物非依赖性启动子”)的活性是组成型活性的，或者可以增加，无论添加至发酵培养基中的诱导物分子是否存在。
组成型启动子不依赖其他细胞调节因子，转录起始依赖于σ因子A(sigA)。sigA依赖性启动子包含σ因子A特异性识别位点‘-35’-区和‘-10’-区。
优选地，“诱导物非依赖性启动子”序列选自组成型启动子，其不限于启动子Pveg、PlepA、PserA、PymdA、Pfba及其具有不同基因表达强度的衍生物(Guiziou et al,(2016):Nucleic Acids Res.44(15),7495-7508)，芽孢杆菌编码枯草杆菌蛋白酶的aprE基因的aprE启动子，噬菌体SPO1启动子P4、P5、P15(WO15118126)，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的cryIIIA启动子(WO9425612)，来自解淀粉芽孢杆菌的amyQ启动子，来自地衣芽孢杆菌的amyL启动子和启动子变体(US5698415)及其组合，或者它们的活性片段或变体，优选组成型启动子序列。
WO9102792公开了碱性蛋白酶基因aprE启动子的功能，用于在地衣芽孢杆菌中大规模生产枯草杆菌蛋白酶Carlsberg型蛋白酶及其在发酵过程中的生产。
编码枯草杆菌蛋白酶的短小芽孢杆菌基因aprE1和aprE2的启动子已用于在短小芽孢杆菌中表达重组蛋白酶和淀粉酶(Küppers T,Wiechert W.Microb CellFact.2014Mar24；13(1):46.)。特别地，与PaprE1-IV启动子变体(相对于起始ATG的nt-357)相比，包含相对于起始ATG的核苷酸nt-382的PaprE1-III启动子变体表现出非常高的生产力。
“aprE启动子”、“aprE型启动子”或“aprE启动子序列”是位于aprE基因上游的核苷酸序列(或者其部分或变体)，即编码芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因，与aprE基因位于同一条链上，使得aprE基因能够转录。
术语“转录起始位点”或“转录的起始位点”应当理解为在基因序列5’端的转录起始的位置。在原核生物中，称作+1的第一个核苷酸一般为腺苷(A)或鸟苷(G)核苷酸。在这种情况下，术语“位点”和“信号”在本文中可互换使用。
进一步任选地，启动子包含5'UTR。这是-1启动子位置下游的转录但不翻译的区域。例如，这种非翻译区应当包含核糖体结合位点，以便在靶基因编码肽或多肽的情况下促进翻译。
WO9102792公开了碱性蛋白酶基因启动子的功能，用于在地衣芽孢杆菌中大规模生产枯草杆菌蛋白酶Carlsberg型蛋白酶。特别地，WO9102792描述了地衣芽孢杆菌编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的aprE基因的5’区(图27)，其包含功能性aprE基因启动子和包含核糖体结合位点的5’UTR(Shine Dalgarno序列)。
术语“表达”或“基因表达”是指一个特定基因或多个特定基因或特定核酸构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别是指一个基因或多个基因或遗传构建体转录为结构RNA(例如，rRNA、tRNA)或mRNA，后者随后翻译或不翻译为蛋白。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
进一步任选地，启动子包含5'UTR。这是-1启动子位置下游的转录但不翻译的区域。例如，这种非翻译区应当包含核糖体结合位点，以便在靶基因编码肽或多肽的情况下促进翻译。
关于5'UTR，本发明特别教导将本发明的启动子与包含一个或多个稳定元件的5'UTR组合。这样，可以加工由启动子区合成的mRNA以产生在转录本的5’端具有稳定序列的mRNA转录本。如Hue et al,1995,Journal of Bacteriology 177:3465-3471所述，优选在mRNA转录本5'端的这种稳定物序列增加它们的半衰期。合适的mRNA稳定元件如下所述
-WO08148575，优选WO08140615的SEQ ID NO.1-5，或这些序列中保持mRNA稳定功能的片段，以及
-WO08140615，优选苏云金芽孢杆菌CrylllA mRNA稳定序列或噬菌体SP82mRNA稳定序列，更优选根据WO08140615的SEQ ID NO.4或5的mRNA稳定序列，更优选根据WO08140615的SEQ ID NO.6的修饰的mRNA稳定序列，或者这些序列中保持mRNA稳定功能的片段。
优选的mRNA稳定元件选自aprE、grpE、cotG、SP82、RSBgsiB、CrylllA mRNA稳定元件，或根据这些序列中保持mRNA稳定功能的片段。优选的mRNA稳定元件是grpE mRNA稳定元件(对应于WO08148575的SEQ ID NO.2)。
5'UTR还优选包含位于启动子下游和核糖体结合位点(RBS)上游的修饰的rib前导序列。在本发明的背景下，rib前导序列在此定义为芽孢杆菌细胞(更优选枯草芽孢杆菌细胞)中核黄素生物合成基因(rib操纵子)上游的前导序列。在枯草芽孢杆菌中，包含参与核黄素生物合成的基因的rib操纵子包括ribG(ribD)、ribB(ribE)、ribA和ribH基因。枯草芽孢杆菌中来自rib启动子(Prib)的核黄素操纵子的转录由核糖开关控制，该核糖开关涉及一个近300个核苷酸的非翻译调节前导区(rib前导区)，位于操纵子ribG中第一个基因的转录起始和翻译起始密码子之间的rib操纵子的5'-区域。WO2015/1181296，特别是第23-25页中描述了合适的rib前导序列，其援引加入本文。
对于工业发酵过程，可以对细菌宿主细胞进行遗传修饰以满足最高产品纯度和监管要求的需要。因此，在本发明的范围内使用芽孢杆菌生产宿主，其可以额外含有其他基因的修饰，例如，缺失或破坏，这些基因可能不利于感兴趣的多肽的生产、回收或应用。在一实施方案中，细菌宿主细胞是蛋白酶缺陷的细胞。细菌宿主细胞，例如，芽孢杆菌细胞，优选包含胞外蛋白酶基因的破坏或缺失，所述胞外蛋白酶基因包括但不限于aprE、mpr、vpr、bpr和/或epr。此外，优选细菌宿主细胞不产生芽孢。此外，优选细菌宿主细胞，例如，芽孢杆菌细胞，包含参与芽孢形成的基因的破坏或缺失。参与芽孢形成的基因是本领域众所周知的(EP1391502)，包括但不限于sigE、sigF、spoIIGA、spoIIE、sigG、spoIVCB、yqfD。在一优选实施方案中，使sigF基因缺失。此外，优选细菌宿主细胞，例如，芽孢杆菌细胞，包含参与表面活性素生物合成的基因之一的破坏或缺失，例如，srfA、srfB、srfC和/或srfD，参见，例如，美国专利第5,958,728号。还优选细菌宿主细胞包含参与聚谷氨酸生物合成的基因之一的破坏或缺失(US2016002591)。还可以破坏或缺失不利于感兴趣的多肽的生产、回收或应用的其他基因，包括但不限于amyE基因。
在一实施方案中，芽孢杆菌细胞包含选择标记。选择标记可以是抗生素抗性标记，如氨苄西林、卡纳霉素、红霉素、氯霉素或四环素，或者营养缺陷型抗性标记。
任选地，芽孢杆菌细胞可以包含如本文所述的反选择标记。在一优选实施方案中，反选择多肽是参与嘧啶代谢的多肽。因此，反选择多肽，如oroP、pyrE、pyrF、upp，在嘧啶代谢中使用中间体的氟化类似物，如5-氟-乳清酸酯或5-氟-尿苷。或者，毒素-抗毒素系统(TA)的毒素如mazEF、ccdAB可以用作芽孢杆菌中的功能性反选择多肽(参见Dong,H.,Zhang,D.Current development in genetic engineering strategies of Bacillusspecies.Microb Cell Fact 13,63(2014))。在一更优选的实施方案中，反选择多肽是胞嘧啶脱氨酶，如codBA系统提供(Kostner D,Rachinger M,Liebl W,Ehrenreich A.Markerlessdeletion of putative alanine dehydrogenase genes in Bacillus licheniformisusing a codBA-based counterselection technique.Microbiology.2017；163(11):1532-1539)。优选地，反选择剂是5-氟-胞嘧啶
感兴趣的化合物
本发明的宿主细胞应当进一步包含表达盒，用于生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽。
感兴趣的化合物可以是聚合物，优选透明质酸，优选如(WO2005098016)所述，或者聚谷氨酸，优选如EP2196534所述，或者可以是维生素，优选维生素B5，优选如WO2010018169所述，或者核黄素，优选如WO2017036903所述，或者可以是多肽，优选酶。
如本文所用的术语“感兴趣的多肽”是指打算在细菌宿主细胞中生产的任何蛋白、肽或其片段。因此，蛋白涵盖多肽、肽、其片段以及融合蛋白等。
优选地，感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽，由地衣芽孢杆菌宿主细胞分泌到细胞外。
优选地，感兴趣的多肽是酶，如胞外酶。胞外酶(细胞外酶)是由宿主细胞分泌的酶。
在一特别优选的实施方案中，所述酶被分类为氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、异构酶(EC 5)或连接酶(EC 6)。在一优选实施方案中，感兴趣的蛋白是适合用于洗涤剂、饲料和食品应用的酶。
最优选地，所述酶是水解酶(EC 3)，优选糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC 3.4)。特别优选的酶是选自淀粉酶(特别是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-β淀粉酶(EC 3.2.1.2)、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、内切-1,3-β-木聚糖酶木聚糖酶(EC 3.2.1.32)、内切-1,4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)、乳糖酶(EC 3.2.1.108)、半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23和EC 3.2.1.24)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.24和EC 3.2.1.25)、脂肪酶(EC 3.1.1.3)、植酸酶(EC 3.1.3.8)、核酸酶(EC3.1.11至EC 3.1.31)和蛋白酶(EC 3.4)的酶；特别是选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乳糖酶葡糖淀粉酶、核酸酶和纤维素酶的酶，优选淀粉酶、甘露聚糖酶、乳糖酶或蛋白酶，优选淀粉酶和蛋白酶。最优选的是丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)，优选枯草杆菌蛋白酶。
特别地，优选以下感兴趣的蛋白：
具有蛋白水解活性的酶称为“蛋白酶”或“肽酶”。蛋白酶是发挥“蛋白酶活性”或“蛋白水解活性”的活性蛋白。蛋白酶是EC 3.4类的成员。蛋白酶包括氨肽酶(EC 3.4.11)、二肽酶(EC 3.4.13)、二肽基-肽酶和三肽基-肽酶(EC 3.4.14)、肽基-二肽酶(EC 3.4.15)、丝氨酸型羧肽酶(EC 3.4.16)、金属羧肽酶(EC 3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(EC 3.4.18)、ω肽酶(EC 3.4.19)、丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(EC 3.4.23)、金属-内肽酶(EC 3.4.24)、苏氨酸内肽酶(EC 3.4.25)、催化机制未知的内肽酶(EC 3.4.99)。可商购的蛋白酶包括但不限于LavergyTM Pro(BASF)；DuralaseTM、DurazymTM、/>Ultra、/>Ultra、/> Ultra、/> Ultra、/>和/>(Novozymes A/S)，以商品名Prime、Pura-fect/>PurafectPurafect/> 和/>(Dan-isco/DuPont)、AxapemTM(Gist-Brocases N.V.)出售的那些蛋白酶，迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶和来自Kao的KAP(嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)蛋白酶)。至少一种蛋白酶可以选自丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶(EC 3.4.21)的特征在于在催化活性位点具有丝氨酸，其在催化反应期间与底物形成共价加合物。丝氨酸蛋白酶可以选自胰凝乳蛋白酶(例如，EC 3.4.21.1)、弹性蛋白酶(例如，EC 3.4.21.36)、弹性蛋白酶(例如，EC3.4.21.37或EC 3.4.21.71)、颗粒酶(例如，EC 3.4.21.78或EC 3.4.21.79)、激肽释放酶(例如，EC 3.4.21.34、EC 3.4.21.35、EC 3.4.21.118或EC 3.4.21.119)、纤溶酶(例如，EC3.4.21.7)、胰蛋白酶(例如，EC 3.4.21.4)、凝血酶(例如，EC 3.4.21.5)和枯草杆菌蛋白酶(也称作枯草杆菌肽酶，例如，EC 3.4.21.62)，后者在下文中也称作“枯草杆菌蛋白酶”。优选地，所述蛋白酶是迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶(BLAP)的蛋白酶变体，最优选包含取代R101E的BLAP(根据BPN的编号)。根据本发明的蛋白酶具有蛋白水解活性。确定蛋白水解活性的方法在文献中是众所周知的(参见例如Gupta et al.(2002),Appl.Microbiol.Bio-technol.60:381-395)。
因此，优选地，本发明涉及一种生产酶的方法，优选蛋白酶或淀粉酶，所述方法包括
a)提供修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含以下至少一种
a.与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加的遗传修饰，
b.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及
c.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰，
b)在所述修饰的芽孢杆菌宿主细胞上引入酶的表达盒，优选由宿主细胞分泌的酶，
c)在允许表达所述酶的条件下培养宿主细胞，以及
d)任选地从培养基分离所述酶。
优选地，本发明涉及一种生产酶的方法，优选蛋白酶或淀粉酶，所述方法包括
a)提供包含遗传修饰的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，与未修饰的对照细胞相比，所述遗传修饰导致至少一个degQ基因的表达增加，
b)在所述修饰的芽孢杆菌宿主细胞上引入酶的表达盒，优选由宿主细胞分泌的酶，
c)在允许表达所述酶的条件下培养宿主细胞，以及
d)任选地从培养基分离感兴趣的化合物。
优选地，本发明涉及一种生产酶的方法，优选蛋白酶或淀粉酶，所述方法包括
a)提供修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含
a.与未修饰的对照细胞相比，导致至少一个degQ基因的表达增加的遗传修饰，以及任选地
b.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，或者
c.与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰，
b)在所述修饰的芽孢杆菌宿主细胞上引入酶的表达盒，优选由宿主细胞分泌的酶，
c)在允许表达所述酶的条件下培养宿主细胞，以及
d)任选地从培养基分离所述酶。
优选的实施方案
1、一种修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含以下至少一种
a)与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加的遗传修饰，
b)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及
c)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。
2、实施方案1的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中与未修饰的对照细胞相比，a)至c)中任一项的修饰导致地衣芽孢杆菌宿主细胞中磷酸化的DegU蛋白的水平升高。
3、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中与未修饰的对照细胞相比，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的Formosin D蛋白表达，优选地，其中FormosinD蛋白更优选包含与SEQ ID NO:34具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性的序列，优选地，所述修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞不包含内源性forD基因的修饰。
4、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS和degR的至少一种基因表达增加，优选地，degQ基因的表达增加的遗传修饰。
5、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致degQ基因的表达增加的遗传修饰。
6、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致degQ基因的表达增加的遗传修饰，并且其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，或者与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。
7、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述导致DegS的自磷酸化活性增加的遗传修饰导致地衣芽孢杆菌宿主细胞的DegS蛋白中的氨基酸取代X76D，优选S76D(根据SEQ ID NO:41的编号)。
8、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述导致DegS的磷酸酶活性降低的遗传修饰导致地衣芽孢杆菌宿主细胞的DegS蛋白中的氨基酸取代X218E，优选G218E(根据SEQ ID NO:41的编号)。
9、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述degU基因编码DegU蛋白，其包含与SEQ ID NO:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，其中所述degS基因编码DegS蛋白，其包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，其中所述degQ基因编码DegQ蛋白，其包含与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，其中所述degR基因编码DegR蛋白，其包含与SEQ ID NO:58具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，并且其中所述phrG基因编码PhrG蛋白，其包含与SEQ ID NO:62具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列。
10、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述degQ基因编码DegQ蛋白，其包含与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列。
11、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中通过向宿主细胞中引入表达构建体来增加degQ基因的表达，所述表达构建体包含编码DegQ蛋白的基因，优选包含与SEQ ID NO:4的核苷酸11-151具有至少80％、至少90％或100％的核苷酸序列，可操作地连接至启动子序列，优选包含与SEQ ID NO:3的核苷酸19-94具有至少80％、至少90％或100％的核苷酸序列，优选地，将所述表达构建体作为degQ基因的额外拷贝整合到地衣芽孢杆菌宿主细胞的染色体中。
12、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞包含表达盒，用于生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽。
13、实施方案12的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中感兴趣的多肽是酶，如选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、乳糖酶、磷酸酶、葡糖淀粉酶、核酸酶、半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶和纤维素酶的酶。
14、实施方案11-13中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中感兴趣的蛋白包含信号序列，用于将感兴趣的多肽分泌到宿主细胞外。
15、实施方案11-14中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞产生纯度增加的感兴趣的化合物，优选具有减少的Formosin D蛋白污染。
16、实施方案11-15中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中与未修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含增加的感兴趣的多肽产量。
17、一种生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的方法，包括
a)提供实施方案11-16中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，
b)在允许表达感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
c)任选地从培养基分离感兴趣的化合物。
18、一种提高地衣芽孢杆菌细胞产生的感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的纯度的方法，包括以下步骤
a)提供实施方案11-16中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，
b)在允许表达感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
c)从培养基分离感兴趣的化合物。
19、实施方案17或18的方法，其中与未修饰的对照细胞相比，所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的Formosin D蛋白表达，优选地，其中Formosin D蛋白包含与SEQ ID NO:34具有递增优选的至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性的序列。
20、一种减少地衣芽孢杆菌细胞产生的感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的Formosin D蛋白污染的方法，包括以下步骤
a)提供权利要求11-16中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，
b)在允许表达感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
c)从培养基分离感兴趣的化合物。
21、前述实施方案中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞和方法，其中所述对照细胞是地衣芽孢杆菌细胞，其与宿主细胞的不同之处仅在于不携带相应的修饰。
实施例
材料和方法
以下实施例仅用于说明本发明。对本领域技术人员显而易见的许多可能的变化也落在本发明的范围内。
除非另有说明，以下实验是通过应用如遗传工程、分子生物学和通过微生物培养发酵生产化合物中使用的标准设备、方法、化学品和生物化学品进行的。还参见Sambrook等人(Sambrook,J.and Russell,D.W.Molecular cloning.Alaboratory manual,3rd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.2001)和Chmiel等人(Bioprocesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik,Gustav FischerVerlag,Stuttgart,1991)。
电转感受态地衣芽孢杆菌细胞和电穿孔
通过电穿孔将DNA转化到地衣芽孢杆菌菌株DSM641 US5352604中。电转感受态地衣芽孢杆菌细胞的制备和DNA的转化基本上如Brigidi等人(Brigidi,P.,Mateuzzi,D.(1991).Biotechnol.Techniques 5,5)所述进行，有以下修改：DNA转化后，将细胞在1mlLBSPG缓冲液中恢复并在37℃下温育60min(J.,1989,FEMS Microbio.Lett.,61:165-170)，然后在选择性LB-平板上铺板。
质粒分离
通过(Sambrook,J.and Russell,D.W.Molecular cloning.Alaboratory manual,3rd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.2001)中描述的标准分子生物学方法或碱性裂解方法(Birnboim,H.C.,Doly,J.(1979).Nucleic AcidsRes 7(6):1513-1523)从芽孢杆菌和大肠杆菌(E.coli)细胞分离质粒DNA。在细胞裂解之前，将芽孢杆菌细胞与在37℃下用10mg/ml溶菌酶处理30min的大肠杆菌进行比较。
质粒
质粒p689-T2A-lac
大肠杆菌质粒p689-T2A-lac是pUC57载体的衍生物，包含lacZ-α基因，侧翼为BpiI限制性位点，再有5’侧翼为大肠杆菌rrnB基因的T1终止子且3’侧翼为T0λ终止子，订购为基因合成构建体(SEQ ID 027)。
pEC194RS-芽孢杆菌温度敏感缺失质粒
将质粒pE194用具有侧翼PvuII位点的寡核苷酸SEQ ID 009和SEQ ID 010进行PCR扩增，用限制性内切核酸酶PvuII消化并连接至用限制性酶SmaI消化的载体pCE1。pCE1是pUC18衍生物，其中氨苄西林抗性基因内的BsaI位点已通过沉默突变去除。将连接混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄西林的LB-琼脂平板上，在37℃下培养过夜。从单个克隆中分离质粒DNA，并通过限制性消化分析其正确性。将得到的质粒命名为pEC194S。
从质粒pBSd141R(登录号：KY995200)PCR扩增II型组装mRFP盒(Radeck,J.,Mascher,T.2017.Bacillus SEVAsiblings:AGolden Gate-based toolbox to createpersonalized integrative vectors for Bacillus subtilis.Sci.Rep.7:14134)，用核苷酸SEQ ID 011和SEQ ID 012，包含限制性位点BamHI的额外核苷酸。将PCR片段和pEC194S用限制性酶BamHI限制，然后连接并转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄西林的LB-琼脂平板上，在37℃下培养过夜。从单个克隆中分离质粒DNA，并通过限制性消化分析其正确性。得到的质粒pEC194RS携带mRFP盒，其开放阅读框与红霉素抗性基因的阅读框相反。
pDel003–aprE基因缺失质粒
地衣芽孢杆菌aprE基因的基因缺失质粒是用质粒pEC194RS和基因合成构建体SEQID 021构建的，基因合成构建体SEQ ID 021包含aprE基因的基因组区域5’和3’，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。如(Radeck et al.,2017；Sci.Rep.7:14134)所述用限制性内切核酸酶BsaI进行II组装，随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Lifetechnologies)中。将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄西林的LB-琼脂平板上，在37℃下培养过夜。从单个克隆中分离质粒DNA，并通过限制性消化分析其正确性。将得到的aprE缺失质粒命名为pDel003。
pDel005-sigF基因缺失质粒
如对pDel003所述构建地衣芽孢杆菌sigF基因(spoIIAC基因)的基因缺失质粒，但是使用基因合成构建体SEQ ID 024，其包含sigF基因的基因组区域5’和3’，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。将得到的sigF缺失质粒命名为pDel005。
pDel006–限制酶基因缺失质粒
地衣芽孢杆菌DSM641 US5352604限制性修饰系统(SEQ ID 013)的限制酶基因(SEQ ID 014)的基因缺失质粒是用质粒pEC194RS和基因合成构建体SEQ ID 015构建的，基因合成构建体SEQ ID 015包含限制酶基因的基因组区域5’和3’，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。如上所述用限制性内切核酸酶BsaI进行II型组装，随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄西林的LB-琼脂平板上，在37℃下培养过夜。从单个克隆中分离质粒DNA，并通过限制性消化分析其正确性。将得到的限制酶缺失质粒命名为pDel006。
pDel007–多聚γ-谷氨酸合成基因缺失质粒
如对pDel006所述构建用于缺失参与多聚γ-谷氨酸(pga)产生的基因的缺失质粒，即地衣芽孢杆菌的ywsC(pgsB)、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)、ywtC(pgsE)，但是使用基因合成构建体SEQ ID 018，其包含ywsC(pgsB)、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)、ywtC(pgsE)基因侧翼的基因组区域5’和3’，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。将得到的pga缺失质粒命名为pDel007。
pDel023–formosin D缺失质粒
如对pDel003所述构建地衣芽孢杆菌formosin D基因(forD基因)的基因缺失质粒，但是使用基因构建体SEQ ID 030，其包含forD基因的基因组区域5’和3’，具有突变的RBS序列，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。将得到的forD缺失质粒命名为pDel023。
pMA110-pga::BLAP整合质粒
通过两步克隆策略构建用于将BLAP基因表达盒整合到多聚γ-谷氨酸合成基因座中的pga::BLAP整合质粒。使用寡核苷酸Seq ID 028和Seq ID 029从pCB56C(US5352604)PCR扩增包含PaprE启动子的BLAP蛋白酶表达盒，并且在与限制性内切核酸酶BpiI的II型组装反应中将其亚克隆到p689-T2A-lac中。对得到的质粒p689-BLAP进行序列验证。用质粒pEC194RS和p689-BLAP在与限制性内切核酸酶BsaI的第二次II型组装反应中构建通过BLAP表达盒交换pga合成基因座的质粒，提供pga合成基因座的5’和3’同源区(Seq ID 001和SeqID 02)作为基因合成构建体，侧翼是与pEC194RS和p689-BLAP相容的BsaI限制性位点，以允许定向克隆。将得到的序列验证的质粒命名为pMA110。
pInt010-CAT::Psy-degQ整合质粒
通过两步克隆策略构建用于将地衣芽孢杆菌degQ基因表达盒整合到氯霉素-乙酰转移酶(CAT)基因座中的CAT::Psy-degQ整合质粒。包含枯草芽孢杆菌Pveg启动子的合成启动子变体(称作Psy(SEQ ID 03))和地衣芽孢杆菌的degQ基因片段(SEQ ID 04)的degQ表达盒订购为具有侧翼BpiI限制性内切核酸酶位点的基因合成片段，并且在与限制性内切核酸酶BpiI的II型组装反应中亚克隆到p689-T2A-lac中。对得到的质粒p689-Psy-degQ进行序列验证。用质粒pEC194RS和p689-Psy-degQ在与限制性内切核酸酶BsaI的第二次II型组装反应中构建通过degQ表达盒交换CAT基因座的质粒，提供CAT基因座的5’和3’同源区(SeqID 05和Seq ID 06)作为基因合成构建体，侧翼是与pEC194RS和p689-Psy-degQ相容的BsaI限制性位点，以允许定向克隆。将得到的序列验证的质粒命名为pInt010。
菌株
大肠杆菌菌株Ec#098
大肠杆菌菌株Ec#098是携带编码DNA-甲基转移酶的表达质粒pMDS003WO2019016051的大肠杆菌INV110菌株(Life technologies)。
地衣芽孢杆菌基因k.o.菌株的产生
为了在地衣芽孢杆菌菌株DSM641(US5352604)及其衍生物中进行基因缺失，将缺失质粒转化到根据Chung的方法制备的感受态大肠杆菌菌株Ec#098中(Chung,C.T.,Niemela,S.L.,and Miller,R.H.(1989)。感受态大肠杆菌的一步制备：在相同溶液中转化和储存细菌细胞。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A86,2172-2175)，然后在含有100μg/ml氨苄西林和30μg/ml氯霉素的LB-琼脂平板上于37℃下选择。从单个克隆中分离质粒DNA，并用于随后转移到地衣芽孢杆菌菌株中。分离的质粒DNA分别携带地衣芽孢杆菌菌株DSM641的DNA甲基化模式，并且在转移到地衣芽孢杆菌中时免受降解。对于具有缺失的限制酶基因的地衣芽孢杆菌菌株中的基因缺失，在大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)内构建缺失质粒。
地衣芽孢杆菌P304：缺失的限制性内切核酸酶
如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌DSM641细胞(US5352604)，用1μg分离自大肠杆菌Ec#098的pDel006限制酶基因缺失质粒转化，然后在30℃下涂布于含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上。
如下所述进行基因缺失过程：
使携带质粒的地衣芽孢杆菌细胞在具有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上于45℃下生长，驱动缺失质粒通过Campbell重组整合到染色体中，pDel006的同源区之一与限制酶基因的序列5’或3’同源。挑取克隆，在没有选择压力的LB-培养基上于45℃下培养6小时，然后涂布在具有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。挑取单个克隆，用寡核苷酸SEQ ID 016和SEQ ID 017通过菌落-PCR分析筛选限制酶基因的成功基因组缺失。挑取推定的缺失阳性单个克隆，在不含抗生素的LB培养基中于45℃下连续两次过夜培养以固化质粒，并且涂布在LB-琼脂平板上于37℃下过夜培养。通过菌落PCR分析单克隆，确定限制酶基因的基因组缺失成功。分离出具有正确缺失的限制酶基因的单个红霉素敏感克隆，命名为地衣芽孢杆菌P304。
地衣芽孢杆菌P305：缺失的sigF基因
如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌P304细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)的pDel005 sigF基因缺失质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。
如对限制酶基因所述进行基因缺失过程。
用寡核苷酸SEQ ID 025和SEQ ID 026通过PCR分析sigF基因的缺失。将得到的缺失sigF基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P305，并且如所述(WO9703185)不再能够产生芽孢。
地衣芽孢杆菌P307：缺失的aprE基因
如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌P305细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞的pDel003 aprE基因缺失质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。
如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失过程。用寡核苷酸SEQ ID 022和SEQ ID023通过PCR分析aprE基因的缺失。将得到的缺失aprE基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P307。
地衣芽孢杆菌M309：缺失的多聚γ-谷氨酸合成基因
如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌P307细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)的pDel007 pga基因缺失质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。
如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失过程。用寡核苷酸SEQ ID 019和SEQ ID020通过PCR分析pga基因的缺失。将得到的缺失pga合成基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌M309。
地衣芽孢杆菌P311：缺失的forD基因
如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌M309细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞的pDel023 forD基因缺失质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。
如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失过程。用寡核苷酸SEQ ID 031和SEQ ID032通过PCR分析forD基因的缺失。将得到的缺失forD基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P311。
地衣芽孢杆菌M409：将BLAP蛋白酶表达盒整合到多聚γ谷氨酸合成(pga)基因座中
如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌P307细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)的pMA110-pga::PaprE-BLAP基因缺失/整合质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜(BLAP＝迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶)。
如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失/整合过程。用寡核苷酸SEQ ID ID NO:019和SEQ ID NO:020通过PCR分析通过置换pga基因整合BLAP表达盒。将得到的具有整合BLAP表达盒基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌M409。
地衣芽孢杆菌P312：将degQ表达盒整合到CAT基因座中
如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌M309细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)的pInt010基因缺失/整合质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。
如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失/整合过程。用寡核苷酸SEQ ID 007和008通过PCR分析通过置换CAT-基因座整合degQ表达盒。将得到的具有整合degQ表达盒基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P312。
地衣芽孢杆菌P313：缺失的forD基因
如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌M409细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞的pDel023 forD基因缺失质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。
如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失过程。用寡核苷酸SEQ ID 031和SEQ ID032通过PCR分析forD基因的缺失。将得到的缺失forD基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P313。
地衣芽孢杆菌PC57：将degQ表达盒整合到CAT基因座中
如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌M409细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)的pInt010基因缺失/整合质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。
如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失/整合过程。用寡核苷酸SEQ ID 007和008通过PCR分析通过置换CAT-基因座整合degQ表达盒。将得到的具有整合degQ表达盒基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌PC57。
表3：地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的基因
| 地衣芽孢杆菌 | 枯草芽孢杆菌 | ||
| 基因名称 | 功能 | DNA | DNA |
| forD | Formosin D(细菌素) | SEQ ID 033 | n.a. |
| degQ | 多效调节子 | SEQ ID 035 | SEQ ID 036 |
| degS | 双组分传感器激酶 | SEQ ID 039 | SEQ ID 040 |
表4：地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的蛋白(PRT：蛋白)
| 地衣芽孢杆菌 | 枯草芽孢杆菌 | ||
| 蛋白名称 | 功能 | PRT | PRT |
| ForD | Formosin D(细菌素) | SEQ ID 034 | n.a |
| DegQ | 多效调节子 | SEQ ID 037 | SEQ ID 038 |
| DegS | 双组分传感器激酶 | SEQ ID 041 | SEQ ID 042 |
| DegS_S76D | 双组分传感器激酶(突变体) | SEQ ID 043 | SEQ ID 044 |
| DegS_G218E | 双组分传感器激酶(突变体) | SEQ ID 045 | SEQ ID 046 |
实施例1：
在基于微量滴定板的补料分批过程中培养具有遗传修饰(如表1所示)的地衣芽孢杆菌菌株(Habicher et al.,2019Biotechnol J.；15(2))。
表1–地衣芽孢杆菌突变菌株
‘D’表示缺失；RE：限制性内切酶
| 地衣芽孢杆菌菌株名称 | 基因型 |
| DSM641(P300) | 野生型 |
| M309 | P300 DRe,DaprE,DsigF,Dpga |
| P311 | M309 DforD |
| P312 | M309 CAT::Psy-DegQ |
所有培养均在直径为25mm的轨道摇床(Innova 42,New Brunswick Scientific,Eppendorf AG；Hamburg,Germany)中在30℃和400rpm下进行。将菌株在FlowerPlates(MTP-48-OFF,m2p-labs GmbH)中进行后续两次预培养，使其同步生长。第一次预培养在800μl TB培养基中进行，接种来自划线在LB琼脂平板上的菌株的新鲜单菌落。20h后，用8μl第一次预培养物接种含有800μl V3基本培养基的第二次预培养物(Meissner etal.,2015,Journalof industrial microbiology&biotechnology 42(9):1203–1215)并培养24h。使用48-孔圆形和深孔微量滴定板进行基于微量滴定板的补料分批主要培养，每个孔的底部都有含葡萄糖的聚合物(FeedPlate,货号:SMFP08004,Kuhner Shaker GmbH；Herzogenrath,Germany)。将70μl第二次预培养物用于接种700μl不含葡萄糖的V3基本培养基。将主要培养物温育72h。用无菌透气密封箔(AeraSeal薄膜，Sigma-Aldrich)覆盖预培养物以避免污染。将饲养板用无菌透气、减少蒸发的箔(F-GPR48-10,m2p-labs GmbH)密封，以减少蒸发和避免污染。
在培养过程结束时，通过离心和用0.2μm过滤器无菌过滤制备培养上清液。对于SDS-PAGE分析，将等量的上清液直接用2xSDS样品缓冲液重悬并在95℃下煮沸10min，然后上样于SDS-PAGE凝胶上。
对于SDS PAGE分析，将4-12％BIS-TRIS-Gel(NuPAGE)、10孔与MES运行缓冲液一起使用。使用溶于乙酸/乙醇的考马斯亮蓝G250进行染色，用乙酸/乙醇进行脱色。
图1显示地衣芽孢杆菌M309培养上清液的SDS PAGE，与具有缺失的forD基因的地衣芽孢杆菌P311菌株以及具有组成型启动子控制下的degQ基因额外拷贝的包含forD基因的地衣芽孢杆菌P312菌株相比，DegQ表达水平增加。令人惊讶的是，与对照菌株M309相比，在地衣芽孢杆菌P312菌株中，Formosin D的量大大减少。作为对照，具有缺失的forD基因的地衣芽孢杆菌P311菌株在SDS-PAGE上未显示Formosin D条带。图1：模拟补料分批培养72h后，来自地衣芽孢杆菌菌株的上清液的SDS-PAGE。1-3＝对照菌株；4＝ForD缺失菌株；5-7＝DegQ过量表达菌株；M＝Precision Plus Protein Standard，具有指示大小(kDa)的所选条带；实心箭头突出了ForD蛋白条带。
实施例2：
如实施例1所述在基于微量滴定板的补料分批过程中培养具有遗传修饰(如表2所示)的地衣芽孢杆菌菌株。
表2–地衣芽孢杆菌突变菌株‘D’表示缺失；RE：限制性内切酶
| 地衣芽孢杆菌菌株名称 | 基因型 |
| DSM641(P300) | 野生型 |
| M309 | P300 DRe,DaprE,DsigF,Dpga |
| M409 | M309 pga::BLAP |
| P313 | M409 DforD |
| PC57 | M409 CAT::Psy-DegQ |
在培养过程结束时，通过离心和用0.2μm过滤器无菌过滤制备培养上清液。对于SDS-PAGE分析，将上清液TCA沉淀，然后进行SDS-PAGE，用考马斯蓝染色。对于TCA沉淀，将样品调整至13.3％TCA(w/w)，在冰上保持10min，然后使用台式离心机沉淀，用丙酮洗涤沉淀。然后使用1xSDS样品缓冲液重悬沉淀。在SDS-PAGE之前，将样品在95℃下煮沸10min。对于SDS-PAGE分析，将等量的上清液上样于SDS-PAGE凝胶上。对于SDS PAGE分析，将4-12％BIS-TRIS-Gel(NuPAGE)、10孔与MES运行缓冲液一起使用。使用溶于乙酸/乙醇的考马斯亮蓝G250进行染色，用乙酸/乙醇进行脱色。
图2显示地衣芽孢杆菌M409培养上清液的SDS PAGE，与具有缺失的forD基因的地衣芽孢杆菌P313菌株以及具有组成型启动子控制下的degQ基因额外拷贝的包含forD基因的地衣芽孢杆菌PC57菌株相比，DegQ表达水平增加。令人惊讶的是，与对照菌株M409相比，在地衣芽孢杆菌PC57菌株中，Formosin D的量大大减少。作为对照，具有缺失的forD基因的地衣芽孢杆菌P313菌株在SDS-PAGE上未显示Formosin D条带。图2：模拟补料分批培养72h后，来自地衣芽孢杆菌蛋白酶表达菌株的上清液的SDS-PAGE。1-3＝对照菌株；4＝ForD缺失菌株；5-7＝DegQ过量表达菌株；M＝Precision Plus Protein Standard，具有指示大小(kDa)的所选条带；实心箭头突出了ForD蛋白条带；空心箭头表示异源蛋白酶。
Claims (15)
1.一种修饰的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主细胞，其包含以下至少一种
a)与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加的遗传修饰，
b)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及
c)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。
2.权利要求1的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中与未修饰的对照细胞相比，a)至c)中任一项的修饰导致地衣芽孢杆菌宿主细胞中磷酸化的DegU蛋白的水平升高。
3.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中与未修饰的对照细胞相比，所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的Formosin D蛋白表达，优选地，其中所述Formosin D蛋白包含与SEQ ID NO:34具有递增优选的至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列。
4.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS和degR的至少一种基因表达增加的遗传修饰。
5.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致degQ基因的表达增加的遗传修饰。
6.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致degQ基因的表达增加的遗传修饰，并且其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，或者与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。
7.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述导致DegS的自磷酸化活性增加的遗传修饰导致地衣芽孢杆菌宿主细胞的DegS蛋白中的氨基酸取代X76D(根据SEQ ID NO:41的编号)。
8.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述导致DegS的磷酸酶活性降低的遗传修饰导致地衣芽孢杆菌宿主细胞的DegS蛋白中的氨基酸取代X218E(根据SEQ ID NO:41的编号)。
9.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述degU基因编码DegU蛋白，其包含与SEQ ID NO:54具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列，其中所述degS基因编码DegS蛋白，其包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列，其中所述degQ基因编码DegQ蛋白，其包含与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列，其中所述degR基因编码DegR蛋白，其包含与SEQ ID NO:58具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列，并且其中所述phrG基因编码PhrG蛋白，其包含与SEQ ID NO:62具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列。
10.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述degQ基因编码DegQ蛋白，其包含与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列。
11.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞包含表达盒，用于生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽。
12.权利要求11的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述感兴趣的多肽是酶，如选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、乳糖酶、磷酸酶、葡糖淀粉酶、核酸酶、半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶和纤维素酶的酶。
13.权利要求11和12中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中与未修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含增加的感兴趣的多肽的产生。
14.一种生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的方法，包括
a)提供权利要求11-13中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，
b)在允许表达所述感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
c)任选地，从培养基分离所述感兴趣的化合物。
15.一种提高感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的纯度的方法，包括以下步骤
a)提供权利要求11-13中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，
b)在允许表达所述感兴趣的化合物的条件下培养宿主细胞，以及
c)从培养基分离所述感兴趣的化合物。
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