JP2020508072A - バチルス・リケニフォルミスにおける増加したタンパク質産生のための組成物及び方法 - Google Patents

バチルス・リケニフォルミスにおける増加したタンパク質産生のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、概して、増加したタンパク質産生能力を有するバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株を得るための組成物及び方法に関する。本開示の所定の実施形態は、変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株に由来する遺伝子改変されたバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株に関する。【選択図】図１

Description

本開示は、一般に、細菌学、微生物学、遺伝学、分子生物学、酵素学、工業用タンパク質産生などの分野に関する。より特別には、本開示は、増加したタンパク質産生能力を有するバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株（例えば、タンパク質産生宿主；細胞工場）を得るための組成物及び方法に関する。したがって、本開示の所定の実施形態は、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする染色体ｒｇｈＲ２遺伝子（変異体）を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、その改変細胞が、配列番号２のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子の遺伝子改変を含む、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１７年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／４６３，２６８号に対する優先権を主張するものである。
配列表の参照
「２０１８０２２０＿ＮＢ４１２０３ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５＿Ｆｉｎａｌ．ｔｘｔ」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０１８年２月１３日に作成され、サイズは１７８ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などのグラム陽性菌は、それらの優れた発酵特性と高い収率（例えば、培養物１Ｌ当たり最大２５グラム；Ｖａｎ Ｄｉｊｌ ａｎｄ Ｈｅｃｋｅｒ，２０１３）から、工業用関連タンパク質を生産するための微生物工場として頻繁に使用されている。例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、食品、繊維、洗濯、医療機器の洗浄、薬品工業などのために必要なα−アミラーゼ（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｒａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）及びプロテアーゼ（Ｂｒｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６）の製造用として周知でである（Ｗｅｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらの非病原性グラム陽性菌は、有害な副生成物を全く含まないタンパク質（例えば、リポ多糖類；内毒素としても公知であるＬＰＳ）を産生するので、欧州食品安全機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）の「安全性適格推定（Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ）」（ＱＰＳ）の評価を得ており、それらの生成物の多くは、アメリカ食品医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から「安全食品認定（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）」（ＧＲＡＳ）の評価を獲得した（Ｏｌｅｍｐｓｋａ−Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃａｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
したがって、微生物宿主細胞内でのタンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体など）の産生は、バイオテクノロジー分野において特に関心が高い。同様に、関心対象の１種以上のタンパク質を産生及び分泌させるためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の最適化は、特に工業バイオテクノロジーの状況においては高度に重要であり、タンパク質が工業的に大量生産される場合は、タンパク質収量の小さな改善が極めて重要な意味を有する。より特別には、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）は、工業的重要性の高いバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の宿主細胞であるので、したがって、強化／増加したタンパク質発現／産生のためにＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞を改変及び操作する能力は、新規及び改善されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）産生株を構築するために高度に望ましい。本開示は、したがって、増加したタンパク質産生能力を有するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞）を得て構築するための高度に望ましい、未だ満たされていない必要に関する。
本開示は、概して、増加したタンパク質産生能力を有するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（例えば、タンパク質産生宿主；細胞工場）を得るための組成物及び方法に関する。本開示の所定の実施形態は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、その改変細胞が、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子の遺伝子改変を含み、その改変宿主細胞が、（未改変親細胞に比較して）増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。所定の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質は、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質と比較して、転写調節タンパク質としては実質的に不活性である。他の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親細胞は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応するｒｇｈＲ２遺伝子内で１８ヌクレオチド重複（ｒｇｈＲ２ｄｕｐ）を含み、改変細胞が、ｒｇｈＲ２遺伝子内で１８ヌクレオチド重複を欠失（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）させ、それにより配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする改変を含む。所定の他の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号３との少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復をコードする１８ヌクレオチド重複を含む。他の実施形態では、配列番号２のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号１のｒｇｈＲ２遺伝子との９０％の配列同一性を含む核酸配列を含む。さらにまた別の実施形態では、増加した量の関心対象のタンパク質は、親細胞と比較して少なくとも１．０％増加している。所定の他の実施形態では、改変細胞は、ａｂｒＢ１、ｒｐｍＪ、ｒｐＩＭ、ＢＬｉ００４１２、ｒａｐＫ、ｐｈｒＫ、ＢＬｉ００７５３、ｙｆｊＴ、ＢＬｉ００８２８、ｙｈｄＸ、ｙｈｚＣ、ｔｅｒｆ２、ｚｏｓＡ、ａｂｂＡ、ｓｐｅＧ、ｙｐｐＦ、ＢＬｉ０２５４３、ｍｎｔＲ、ＢＬｉ０２７６８、ｓｓｐＡ、ＢＬｉ０３１２７、ＢＬｉ０３６３５、ｍｒｇＡ、ＢＬｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ｒｇｈＲ１、ｓｐｏ０Ｆ、ｙｗｊＧ、ｙｗｑ１２、ＢＬｉ０４１９９、ＢＬｉ０４２００、ｌｉｃＴ、ｂｇｌＨ及びｂｇｌＰからなる群から選択される少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を崩壊させる、欠失させる、不活性化する、又は下方制御する遺伝子改変をさらに含む。所定の実施形態では、改変細胞は、ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）から選択される１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子、ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）からなる群から選択される少なくとも２つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子、又はｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）からなる群から選択される少なくとも３つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子又は全４つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する遺伝子改変を含む。また別の実施形態では、増加した量の関心対象のタンパク質は、異種タンパク質である。したがって、所定の実施形態では、改変細胞は、関心対象の異種タンパク質をコードする発現構築物を含む。関心対象の異種タンパク質をコードするそのような発現構築物は、上述した１つ以上の遺伝子改変の前に親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内に導入（例えば、形質転換）され得る、上述した１つ以上の遺伝子改変中に改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞内に導入（例えば、形質転換）され得る、又は上述した１つ以上の遺伝子改変後に改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞内に導入（例えば、形質転換）され得る。所定の他の実施形態では、関心対象のタンパク質は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシナーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｌｙｓａｓｅｓ）、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ及びヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される。
また別の実施形態では、本開示は、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、配列番号２のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子を含み、改変細胞が、未改変親細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に向けられる。
所定の他の実施形態では、本開示は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、その中に導入された、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結した５’プロモーター領域を含むポリヌクレオチド構築物を含み、改変細胞が、未改変親細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。所定の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質は、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質と比較して、転写調節タンパク質としては実質的に不活性である。また別の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親細胞は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応するｒｇｈＲ２遺伝子内に１８ヌクレオチド重複を含む。他の実施形態では、改変細胞は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする内在性ｒｇｈＲ２遺伝子を欠失させる、崩壊させる、不活性化する、又は下方制御する遺伝子改変をさらに含む。他の実施形態では、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。また別の実施形態では、改変細胞は、ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）からなる群から選択される少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する遺伝子改変をさらに含む。所定の他の実施形態では、配列番号との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする核酸配列と機能的に連結した５’プロモーター領域を含むポリヌクレオチド構築物は、ベクター内に含まれる。所定の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。所定の他の実施形態では、ベクターは、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に組み込まれる。また別の実施形態では、ベクターは、天然ｒｇｈＲ２染色体座でＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に組み込まれ、それにより配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子を欠失又は崩壊させるので、このため配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結した５’プロモーター領域を含む導入されたポリヌクレオチド構築物を挿入する。他の実施形態では、増加した量の関心対象のタンパク質は、異種タンパク質である。また別の実施形態では、改変細胞は、関心対象の異種タンパク質をコードする発現構築物を含む。所定の実施形態では、関心対象のタンパク質は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシナーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｌｙｓａｓｅｓ）、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ及びヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される。他の実施形態では、増加した量の関心対象のタンパク質は、親宿主細胞と比較して少なくとも１．０％増加している。また別の実施形態では、改変細胞は、変異ＧｌｃＴタンパク質のアミノ酸６７位でロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換を含む変異Ｇｌｃｔタンパク質をコードする、対立遺伝子ｇｌｃＴ１（配列番号１４４）を含む発現構築物をさらに含む。
他の実施形態では、本開示は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、配列番号１８との９０％の配列同一性を含むＹｖｚＣタンパク質をコードする内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｚＣ遺伝子を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する遺伝子改変を含み、改変細胞が、未改変親細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
他の実施形態では、本開示は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、配列番号２０との９０％の配列同一性を含むＢｌｉ０３６４４タンパク質をコードする内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する遺伝子改変を含み、改変細胞が、未改変親細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
他の実施形態では、本開示は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、配列番号２２との９０％の配列同一性を含むＡｂｒＢ１タンパク質をコードする内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｂｒＢ１遺伝子を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する遺伝子改変を含み、改変細胞が、未改変親細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
他の実施形態では、本開示は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、配列番号２４との９０％の配列同一性を含むａｂｈ（ＡｂｒＢ２）タンパク質をコードする内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｂｈ（ＡｂｒＢ２）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する遺伝子改変を含み、改変細胞が、未改変親細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
所定の他の実施形態では、本開示は、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）からなる群から選択された少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する遺伝子改変を含み、改変細胞が、未改変親細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。所定の実施形態では、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。また別の実施形態では、上述した改変細胞が、変異ＧｌｃＴタンパク質のアミノ酸６７位でロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換を含む変異Ｇｌｃｔタンパク質をコードする、対立遺伝子ｇｌｃＴ１（配列番号１４４）を含む発現構築物をさらに含む。
また別の実施形態では、本開示は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）からなる群から選択された少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する遺伝子改変を含み、改変細胞が、未改変親細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。所定の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号３との少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質は、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質と比較して、転写調節タンパク質としては実質的に不活性である。他の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親細胞は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応するｒｇｈＲ２遺伝子内に１８ヌクレオチド重複を含む。所定の他の実施形態では、増加した発現の関心対象のタンパク質は、関心対象の異種タンパク質である。
所定の他の実施形態では、本開示は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質の活性を回復させる方法であって、親細胞が、配列番号４との９０％の配列同一性を含む実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含み：（ａ）配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を得る工程であって、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子が、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応するｒｇｈＲ２遺伝子内で１８ヌクレオチド重複を含む工程と、（ｂ）ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子を産生するためにｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチド重複を欠失させることにより工程（ａ）の細胞を改変する工程であって、ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子がそれにより配列番号２との９０％の配列同一性を含む活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードする工程とを含む方法に関する。本方法の所定の実施形態では、工程（ｂ）の改変細胞が、関心対象の異種タンパク質をコードする導入されたポリヌクレオチド発現構築物をさらに含む。本方法のまた別の実施形態では、工程（ｂ）のｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチド重複を欠失させることは、相同組み換え、部位特異的突然変異誘発、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子編集及びＺＦＮ遺伝子編集から選択される方法によってヌクレオチド重複を欠失させることを含む。所定の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号３との９０％の配列同一性を含む核酸配列を含み、配列番号３のヌクレオチド１１１〜１２９での１８ヌクレオチド重複が欠失させられている。他の実施形態では、工程（ｂ）の改変細胞が、ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）からなる群から選択される少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する遺伝子改変をさらに含む。本方法の所定の実施形態では、少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる遺伝子改変は、完全な遺伝子欠失又は部分的欠失である。所定の実施形態では、部分的遺伝子欠失は、遺伝子のオペレーターを欠失させること、遺伝子のプロモーターを欠失させること、遺伝子のエンハンサーを欠失させること、遺伝子の５’側ＵＴＲを欠失させること、遺伝子の開始コドンを欠失させること、遺伝子のコードされたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を欠失させること、遺伝子の３’側ＵＴＲを欠失させること、遺伝子のコーディング配列の１０％を欠失させること、遺伝子のコーディング配列の２５％を欠失させること、遺伝子のコーディング配列の５０％を欠失させること、遺伝子のコーディング配列の７５％を欠失させること、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
また別の実施形態では、本開示は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質の活性を回復させるための方法であって、親細胞が、配列番号４との９０％の配列同一性を含む実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子を含み：（ａ）配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を得る工程であって、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子が、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応するｒｇｈＲ２遺伝子内で１８ヌクレオチド重複を含む工程と、（ｂ）配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子に機能的に連結した５’プロモーター領域を含むポリヌクレオチド構築物をその中に導入することにより工程（ａ）の親細胞を改変する工程と、（ｃ）配列番号２との９０％の配列同一性を含む活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードする工程（ｂ）の改変細胞内に導入されたポリヌクレオチド構築物を発現させる工程とを含む方法に関する。特定の実施形態では、改変細胞は、関心対象の異種タンパク質をコードする導入されたポリヌクレオチド発現構築物を含む。また別の実施形態では、改変細胞は、ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）からなる群から選択される少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する遺伝子改変を含む。また別の実施形態では、少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる遺伝子改変は、完全な遺伝子欠失又は部分的欠失である。所定の実施形態では、部分的遺伝子欠失は、遺伝子のオペレーターを欠失させること、遺伝子のプロモーターを欠失させること、遺伝子のエンハンサーを欠失させること、遺伝子の５’ＵＴＲを欠失させること、遺伝子の開始コドンを欠失させること、遺伝子のコードされたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を欠失させること、遺伝子の３’ＵＴＲを欠失させること、遺伝子のコーディング配列の１０％を欠失させること、遺伝子のコーディング配列の２５％を欠失させること、遺伝子のコーディング配列の５０％を欠失させること、遺伝子のコーディング配列の７５％を欠失させること、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
他の実施形態では、本開示は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内の関心対象の内在性タンパク質の産生を増加させるための方法であって：（ａ）配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を得る工程であって、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応するｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチド重複を含む工程と、（ｂ）ｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチド重複を欠失させることによって工程（ａ）の細胞を改変する工程であって、ｒｇｈＲ２遺伝子が、それにより配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする工程と、（ｃ）内在性タンパク質を産生するために好適な培地中で工程（ｂ）の改変細胞を培養する工程と、（ｄ）培養培地若しくは細胞溶解物から工程（ｃ）において産生した内在性タンパク質を回収する工程であって、工程（ｂ）の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞が、工程（ａ）の細胞及び工程（ｂ）の細胞の両方が同一条件下で培養された場合に、工程（ａ）において得られた親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、増加した量の内在性タンパク質を産生する工程とを含む方法に関する。所定の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号３との９０％の配列同一性を含む核酸配列を含み、配列番号３のヌクレオチド１１１〜１２９での１８ヌクレオチド重複が欠失させられている。所定の実施形態では、少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる遺伝子改変は、完全な遺伝子欠失又は部分的欠失である。所定の実施形態では、部分的遺伝子欠失は、遺伝子のオペレーターを欠失させること、遺伝子のプロモーターを欠失させること、遺伝子のエンハンサーを欠失させること、遺伝子の５’側ＵＴＲを欠失させること、遺伝子の開始コドンを欠失させること、遺伝子のコードされたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を欠失させること、遺伝子の３’側ＵＴＲを欠失させること、遺伝子のコーディング配列の１０％を欠失させること、遺伝子のコーディング配列の２５％を欠失させること、遺伝子のコーディング配列の５０％を欠失させること、遺伝子のコーディング配列の７５％を欠失させること、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
さらに他の実施形態では、本開示は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内の関心対象の異種タンパク質の産生を増加させるための方法であって：（ａ）配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を得る工程であって、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子が、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応するｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチド重複を含む工程と、（ｂ）ｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチド重複を欠失させることによって工程（ａ）の細胞を改変する工程であって、ｒｇｈＲ２遺伝子が、それにより配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする工程と、（ｃ）工程（ｂ）の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内に異種タンパク質をコードする発現構築物を導入する工程と、（ｄ）異種タンパク質を産生するために好適な培地中で工程（ｃ）の改変細胞を培養する工程と、（ｅ）培養培地若しくは細胞溶解物から工程（ｄ）において産生した異種タンパク質を回収する工程であって、工程（ｂ）の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞が、工程（ａ）の細胞及び工程（ｂ）の細胞の両方が同一条件下で培養された場合に、異種タンパク質をコードする同一の導入発現構築物を含む、工程（ａ）において得られた親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、増加した量の内在性タンパク質を産生する工程とを含む方法に向けられる。所定の実施形態では、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号３との９０％の配列同一性を含む核酸配列を含み、配列番号３のヌクレオチド１１１〜１２９での１８ヌクレオチド重複が欠失させられている。
所定の他の実施形態では、本開示は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質の活性を回復させるための方法であって、親細胞が、配列番号４との９０％の配列同一性を含む実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含み：（ａ）配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を得る工程であって、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応するｒｇｈＲ２遺伝子内で１８ヌクレオチド重複を含む工程と、（ｂ）（ｉ）ｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチド重複を欠失させること、又は（ｉｉ）ｒｇｈＲ２遺伝子を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御することによって工程（ａ）の親細胞を改変する工程と、（ｃ）ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）からなる群から選択された少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、又は下方制御する工程であって、改変細胞が、未改変親細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する工程とを含む方法に関する。
他の実施形態では、本開示は、本明細書に開示した方法によって産生した、単離（改変）されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に向けられる。
他の実施形態では、本開示は、実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードする変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株を同定するための方法であって、（ａ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株を得てその中のｒｇｈＲ２遺伝子をシーケンシングする工程と、（ｂ）シーケンシングしたｒｇｈＲ２遺伝子と配列番号１の天然ｒｇｈＲ２遺伝子とを整列させて比較する工程であって、配列番号１のｒｇｈＲ２遺伝子のＨＴＨドメイン内に１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換及び／又は重複を含むシーケンシングされたｒｇｈＲ２遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株が実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードする変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含む工程とを含む方法に関する。所定の実施形態では、配列番号２の天然ｒｇｈＲ２タンパク質のＨＴＨドメインは、配列番号２のアミノ酸残基５〜５８内に含まれる。また別の実施形態では、ｒｇｈＲ２遺伝子のＨＴＨドメイン内の１つ以上のヌクレオチドの挿入は、配列番号１のヌクレオチド１１１〜１１２の間である。また別の実施形態では、実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードする変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、配列番号４のＲｇｈＲ２変異タンパク質内に存在する６アミノ酸反復を含む。
したがって、本開示の所定の実施形態は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（すなわち、娘細胞）であって、改変（娘）細胞が、増加した量の１種以上の関心対象のタンパク質、特に例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼなどの工業的に重要なタンパク質（酵素）を発現／産生することができる、改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＤＳＭ１３株のＲｇｈＲ２タンパク質とＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株のＲｇｈＲ２タンパク質とのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。図１に示したように、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）単離体Ｂｒａ７由来のＲｇｈＲ２タンパク質、Ｂｒａ７由来の単離体であるＴ５、ＡＴＣＣ−６５９８及びＡＴＣＣ−９７８９（例えば、配列番号４の全長変異ＲｇｈＲ２タンパク質を参照されたい）は、それぞれアミノ酸「Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ」の直接反復を含む。例えば、図１に示したように、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）単離体Ｂｒａ７由来の変異ＲｇｈＲ２タンパク質、Ｂｒａ７誘導体であるＴ５、ＡＴＣＣ−６５９８及びＡＴＣＣ−９７８９（配列番号４）は、下記：Ａｌａ３２−Ａｌａ３３−Ａｌａ３４−Ｉｌｅ３５−Ｓｅｒ３６−Ａｒｇ３７−Ａｌａ３８−Ａｌａ３９−Ａｌａ４０−Ｉｌｅ４１−Ｓｅｒ４２−Ａｒｇ４３（配列番号６）のような挿入された６アミノ酸反復「ＡＡＩＳＲ」を含む。対照的に、図１に示したように、例えばＤＳＭ１３、ＡＴＣＣ−２７８１１及びＤＳＭ６０３などのＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）単離体由来の天然ＲｇｈＲ２タンパク質は、配列番号６に規定した反復「Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ」配列を含まない（例えば、配列番号２の全長天然ＲｇｈＲ２タンパク質を参照されたい）。 特にＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ、ｐＥ１９４感温性レプリコン（Ｔｓレプリコン）、カナマイシンコーディング配列（Ｋａｎ）、カナマイシンプロモーター（ｐＫａｎマーカー）、リボソーム終了配列（Ｔｅｒｍ ｒｒｎＢ）、β−ラクタマーゼ（「Ｂｌａ」）遺伝子及びＩ−Ｓｃｅ部位が存在する様々な制限酵素部位を含むプラスミド「ｐＣＺ１０５」を示す図である。 遺伝子組み換え「ｐＣＺ１０５ ｒｇｈＲ２」プラスミドを示す図である。このプラスミドは、ｐＥ１９４感温性レプリコン（Ｔｓレプリコン）、カナマイシンコーディング配列（Ｋａｎ）、カナマイシンプロモーター（ｐＫａｎマーカー）、リボソーム終了配列（Ｔｅｒｍ ｒｒｎＢ）、Ｉ−Ｓｃｅ部位、１８塩基対（１８ｂｐ）欠失ｒｇｈＲ２遺伝子及びｒｇｈＲ２フランキング領域を含む。 プラスミド「ｐＢＬＣｏｍＫ」のマップを示す図である。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２複製起点をコードするＤＮＡ配列、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）スペクチノマイシン耐性（Ｓｐｅｃｒ）遺伝子ｓｐｃ（ａａｄ９とも呼ばれる）、バチルス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）における複製のためのＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ｎａｔｔｏ）プラスミドｐＴＡ１０６０ｒｅｐ遺伝子、（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡプロモーターにより制御される）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｃｏｍＫ遺伝子及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＲ遺伝子を含む。 コントロール（親）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞（すなわち、１８ｂｐのｒｇｈＲ２重複；ｒｇｈＲ２ｄｕｐを含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞）及びＢ．リケニフォルミス１９７（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）クローン（すなわち、回復ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）娘細胞）の徐放性マイクロタイタープレート実験（実施例２を参照されたい）の結果を示している棒グラフを示す図である。より特別には、図５に示したように、薄灰色の棒は、コントロールに対する相対光学密度（細胞密度）を表し、黒色の棒は、コントロールに比較した異種パエニバチルス・クルドラノリチクス（Ｐｅａｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の変異α−アミラーゼの相対産生力価を表す。 コントロール（親；ｒｇｈＲ２ｄｕｐ）株に比較した、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ株（すなわち、娘細胞、クローン１９７）の特異的な相対的タンパク質産生（すなわち、Ｐ．クルドラノリチクス（Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）のα−アミラーゼ）を示す図である。 （親）コントロール宿主細胞と比較した、崩壊したＢＬｉ０３６４４遺伝子（ΔＢＬｉ０３６４４）、崩壊したａｂｒＢ１遺伝子（ΔａｂｒＢ１）、崩壊したｙｖｚＣ遺伝子（ΔｙｖｚＣ）又は崩壊したａｂｈ遺伝子（Δａｂｈ）を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞内で発現したＰ．クルドラノリチクス（Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）のα−アミラーゼ（黒色棒）の（タンパク質）産生を示す図である。これらの細胞培養のＯＤ６００は、図７において灰色の棒として提示した。 ボールド体で示したＤＮＡ結合に関係する残基をコードする、ＤＳＭ１３ ｒｇｈＲ２遺伝子内のコドンを示す図である。Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株であるＢｒａ７、Ｔ５、ＡＴＣＣ−９７８９及びＡＴＣＣ−６５９８のｒｇｈＲ２遺伝子内で重複している１８ｂｐ配列は、ボックス内に記載されており、配列特異的ＤＮＡ結合部位をコードすると予測される領域内に位置する。 リパーゼ／エステラーゼ活性を含む異種ＥＣ３．１．１．３酵素の産生を示す図である。図９のＳＤＳ−ＰＡＧＥに示したように、リパーゼ／エステラーゼ活性を含む異種ＥＣ３．１．１．３酵素は、１８ｂｐ重複を有するｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｄｕｐ）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に対してＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ細胞内で改善されている。
生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、配列番号２の天然バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号２は、配列番号１の核酸配列によってコードされた天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３は、配列番号４の変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。より特別には、配列番号３の変異核酸配列は、配列番号１の核酸配列中には存在しない、１８塩基対（ｂｐ）ヌクレオチド重複を含む。
配列番号４は、配列番号３の核酸配列によってコードされた変異ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列である。より特別には、配列番号４の変異ＲｇｈＲ２タンパク質は、（配列番号４の）アミノ酸残基３６〜４１で「Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ」の６アミノ酸残基反復を含むが、配列番号２の天然ＲｇｈＲ２タンパク質は、アミノ酸残基３６〜４１で「Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ」の６アミノ酸残基反復を含まない。
配列番号５は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｇｈＲ２タンパク質（すなわち、配列番号１によってコードされた）のアミノ酸残基３０〜３５（Ａｌａ３０−Ａｌａ３１−Ａｌａ３２−Ｉｌｅ３３−Ｓｅｒ３４−Ａｒｇ３５）を示している。
配列番号６は、配列番号４内のアミノ酸３６〜４１位で配列番号５の反復を含む、（配列番号３によってコードされた変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸残基３０〜４１（Ａｌａ３０−Ａｌａ３１−Ａｌａ３２−Ｉｌｅ３３−Ｓｅｒ３４−Ａｒｇ３５−Ａｌａ３６−Ａｌａ３７−Ａｌａ３８−Ｉｌｅ３９−Ｓｅｒ４０−Ａｒｇ４１）を示している。したがって、配列番号３に規定した１８ｂｐヌクレオチド重複は、本明細書では配列番号６に規定された「Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ」として示されている、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇの６アミノ酸反復をコードする。
配列番号７は、プライマー３６９の核酸配列である。
配列番号８は、プライマー３７８の核酸配列である。
配列番号９は、プライマー３７９の核酸配列である。
配列番号１０は、プライマー３８０の核酸配列である。
配列番号１１は、プライマー３８１の核酸配列である。
配列番号１２は、プライマー３８４の核酸配列である。
配列番号１３は、プライマー７５２の核酸配列である。
配列番号１４は、プライマー７５３の核酸配列である。
配列番号１５は、配列番号１６の天然バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｇｈＲ１タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号１６は、配列番号１５の核酸配列によってコードされた天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｇｈＲ１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、配列番号１８のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｖｚＣタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号１８は、配列番号１７の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｖｚＣタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、配列番号２０のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｂｌｉ０３６４４タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号２０は、配列番号１９の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｂｌｉ０３６４４タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、配列番号２２のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｂｒＢ１タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号２２は、配列番号２１の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｂｒＢ１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、配列番号２４のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ａｂｈ（ＡｂｒＢ２）タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号２４は、配列番号２３の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ａｂｈ（ＡｂｒＢ２）タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２５は、配列番号２６のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｐｍＪタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号２６は、配列番号２５の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｐｍＪタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２７は、配列番号２８のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｐＩＭタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号２８は、配列番号２７の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｐＩＭタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２９は、配列番号３０のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ００４１２タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号３０は、配列番号２９の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ００４１２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３１は、配列番号３２のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲａｐＫタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号３２は、配列番号３１の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲａｐＫタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、配列番号３４のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰｈｒＫタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号３４は、配列番号３３の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰｈｒＫタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、配列番号３６のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ００７５３タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号３６は、配列番号３５の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ００７５３タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、配列番号３８のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｆｊＴタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号３８は、配列番号３７の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｆｊＴタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、配列番号４０のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ００８２８タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号４０は、配列番号３９の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ００８２８タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４１は、配列番号４２のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｈｄＸタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号４２は、配列番号４１の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｈｄＸタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４３は、配列番号４４のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｈｚＣタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号４４は、配列番号４３の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｈｚＣタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４５は、配列番号４６のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｔｅｒｆ２タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号４６は、配列番号４５の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｔｅｒｆ２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４７は、配列番号４８のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＺｏｓＡタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号４８は、配列番号４７の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＺｏｓＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４９は、配列番号５０のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｂｂＡタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号５０は、配列番号４９の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｂｂＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号５１は、配列番号５２のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳｐｅＧタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号５２は、配列番号５１の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳｐｅＧタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号５３は、配列番号５４のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｐｐＦタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号５４は、配列番号５３の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｐｐＦタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号５５は、配列番号５６のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０２５４３タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号５６は、配列番号５５の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０２５４３タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号５７は、配列番号５８のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＭｎｔＲタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号５８は、配列番号５７の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＭｎｔＲタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号５９は、配列番号６０のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０２７６８タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号６０は、配列番号５９の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０２７６８タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６１は、配列番号６２のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳｓｐＡタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号６２は、配列番号６１の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳｓｐＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６３は、配列番号６４のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０３１２７タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号６４は、配列番号６３の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０３１２７タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６５は、配列番号６６のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０３６３５タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号６６は、配列番号６５の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０３６３５タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６７は、配列番号６８のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＭｒｇＡタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号６８は、配列番号６７の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＭｒｇＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６９は、配列番号７０のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｓｐｏ０Ｆタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号７０は、配列番号６９の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｓｐｏ０Ｆタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７１は、配列番号７２のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｗｊＧタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号７２は、配列番号７１の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｗｊＧタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７３は、配列番号７４のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｗｑＩ２タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号７４は、配列番号７３の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｗｑＩ２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７５は、配列番号７６のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０４１９９タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号７６は、配列番号７５の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０４１９９タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７７は、配列番号７８のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０４２００タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号７８は、配列番号７７の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬｉ０４２００タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７９は、配列番号８０のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬｉｃＴタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号８０は、配列番号７９の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬｉｃＴタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号８１は、配列番号８２のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢｇＩＨタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号８２は、配列番号８１の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｂｇ１Ｈタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号８３は、配列番号８４のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｂｇ１Ｐタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号８４は、配列番号８３の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｂｇ１Ｐタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号８５は、配列番号８６のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＣｏｍＫタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号８６は、配列番号８５の核酸配列によってコードされたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＣｏｍＫタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号８７は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株の１８ｂｐ重複のヌクレオチド配列である。
配列番号８８は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号８９は、アシドミノコッカス種（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）Ｃｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号９０は、Ｎ．グレゴリイ（Ｎ．ｇｒｅｇｏｒｙｉ）Ａｇｏタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号９１は、配列番号８８のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号９２は、配列番号８８のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列である。
配列番号９３は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーターの核酸配列である。
配列番号９４は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡプロモーターの核酸配列である。
配列番号９５は、ｓｐａｃプロモーター核酸配列である。
配列番号９６は、Ｈｙｐｅｒ−ｓｐａｎｋプロモーター核酸配列である。
配列番号９７は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｖｅｇプロモーターの核酸配列である。
配列番号９８は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｎｐｒＥプロモーターの核酸配列である。
配列番号９９は、Ｔ５ファージＮ２５プロモーターの核酸配列である。
配列番号１００は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｇｒｏＥプロモーターの核酸配列である。
配列番号１０１は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｒａＡプロモーターの核酸配列である。
配列番号１０２は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｒａＡ２プロモーターの核酸配列である。
配列番号１０３は、λファージＴ０ターミネーターの核酸配列である。
配列番号１０４は、Ｃａｓ９発現カセットの核酸配列である。
配列番号１０５は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｂｒａ７）の１８ｂｐ重複の核酸配列である。
配列番号１０６は、１７ｂｐのＶＴの核酸配列である。
配列番号１０７は、１８ｂｐのＶＴの核酸配列である。
配列番号１０８は、１９ｂｐのＶＴの核酸配列である。
配列番号１０９は、２０ｂｐのＶＴの核酸配列である。
配列番号１１０は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメインをコードする核酸配列である。
配列番号１１１は、１８ｂｐ重複を標的とするガイド−ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸配列である。
配列番号１１２は、ｇＲＮＡ発現カセットをコードする核酸配列である。
配列番号１１３は、１８ｂｐ重複の５’側（上流）である５００ｂｐの核酸配列である。
配列番号１１４は、１８ｂｐ重複の３’側（下流）である５００ｂｐの核酸配列である。
配列番号１１５は、ｒｇｈＲ２（１８ｂｐ重複）編集鋳型核酸配列である。
配列番号１１６は、ｒｇｈＲ２遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｂｒａ７）核酸配列である。
配列番号１１７は、ｒｇｈＲ２遺伝子座に向けられたフォワードプライマー配列である。
配列番号１１８は、ｒｇｈＲ２遺伝子座に向けられたリバースプライマー配列である。
配列番号１１９は、編集されたｒｇｈＲ２遺伝子座を含む核酸配列である。
配列番号１２０は、ｒｇｈＲ２シーケンシングプライマーである。
配列番号１２１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１核酸配列である。
配列番号１２２は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位２核酸配列である。
配列番号１２３は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位３核酸配列である。
配列番号１２４は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位４核酸配列である。
配列番号１２５は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位５核酸配列である。
配列番号１２６は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位６核酸配列である。
配列番号１２７は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位７核酸配列である。
配列番号１２８は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位８核酸配列である。
配列番号１２９は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位９核酸配列である。
配列番号１３０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１０核酸配列である。
配列番号１３１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１１核酸配列である。
配列番号１３２は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１２核酸配列である。
配列番号１３３は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１３核酸配列である。
配列番号１３４は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１４核酸配列である。
配列番号１３５は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１５核酸配列である。
配列番号１３６は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１６核酸配列である。
配列番号１３７は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１７核酸配列である。
配列番号１３８は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１８核酸配列である。
配列番号１３９は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｙｖｃ標的部位１９核酸配列である。
配列番号１４０は、サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）の変異＃１α−アミラーゼ発現カセットを含む核酸配列である。
配列番号１４１は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異α−アミラーゼ発現カセットを含む核酸配列である。
配列番号１４２は、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＭ１の変異α−アミラーゼ発現カセットを含む核酸配列である。
配列番号１４３は、サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）の変異体＃２のα−アミラーゼ発現カセットを含む核酸配列である。
配列番号１４４は、対立遺伝子ｇｌｃＴ１（Ｃ１９９Ｔ）を含む合成核酸配列である。
本開示は、概して、増加したタンパク質産生能力を有するバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株を得るための組成物及び方法に関する。本開示の所定の実施形態は、変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株に由来する遺伝子改変されたバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株に関する。したがって、本開示の所定の実施形態は、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする染色体ｒｇｈＲ２遺伝子（変異体）を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、配列番号２のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子の遺伝子改変を含む、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。本開示の所定の他の実施形態は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞由来の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）であって、改変細胞が、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子の遺伝子改変を含み、改変細胞が、（すなわち、未改変親細胞と比較して）増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に関する。
他の実施形態では、本開示は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、その中に導入された、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする核酸配列と機能的に連結した５’プロモーター領域を含むポリヌクレオチド構築物を含み、改変細胞が、（未改変親細胞と比較して）増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
他の実施形態では、本開示は、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）から選択された少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、不活性化する、又は下方制御する遺伝子改変を含み、改変細胞が、（未改変親細胞と比較して）増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
他の実施形態では、本開示は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、ｙｖｚＣ、Ｂｌｉ０３６４４、ＡｂｒＢ１及びａｂｈ（ＡｂｒＢ２）から選択された少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、不活性化する、又は下方制御する遺伝子改変を含み、改変細胞が、（未改変親細胞と比較して）増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
所定の他の実施形態では、本開示は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、ｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチド（１８ｂｐ）重複を欠失させる遺伝子改変を含む、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
他の実施形態では、本開示は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、ｒｇｈＲ２遺伝子を欠失させる、崩壊させる、不活性化する、又は下方制御する遺伝子改変を含む、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
他の実施形態では、本開示は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、ＹｖｚＣタンパク質（配列番号１８）、ＢＬｉ０３６４４タンパク質（配列番号２０）、ＡｂｒＢ１タンパク質（配列番号２２）及び／又はＡｂｈ（ＡｂｒＢ２）タンパク質（配列番号２４）をコードする少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、不活性化する、又は下方制御する遺伝子改変を含み、改変細胞が、（未改変親細胞と比較して）増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
他の実施形態では、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号２の回復ｒｇｈＲ２遺伝子並びにＹｖｚＣタンパク質（配列番号１８）、ＢＬｉ０３６４４タンパク質（配列番号２０）、ＡｂｒＢ１タンパク質（配列番号２２）及び／又はＡｂｈ（ＡｂｒＢ２）タンパク質（配列番号２４）をコードする少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、不活性化する、又は下方制御する遺伝子改変を含み、改変細胞が、（未改変親細胞と比較して）増加した量の関心対象のタンパク質を産生する。
所定の他の実施形態では、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子並びに変異ＧｌｃＴタンパク質のアミノ酸６７位）でロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換（Ｌ６７Ｆを含む変異ＧｌｃＴ（転写アンチターミネーション）タンパク質をコードする対立遺伝子ｇｌｃＴ１（Ｃ１９９Ｔ）を含む核酸構築物（配列番号１４３）を含む。
本開示の他の実施形態は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中の不活性ＲｇｈＲ２タンパク質の活性を回復させるための方法に関する。本開示の所定の他の実施形態は、そのような組成物及び改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中の関心対象のタンパク質の産生を増加させるための方法に関する。他の実施形態では、本開示は、本開示の方法によって改変及び産生された単離Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞に関する。
Ｉ．定義
本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞及び本明細書に記載したそれらの方法を考慮して、以下の用語及び句を定義する。本明細書中に定義されていない用語は、当該技術分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。
他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。本組成物及び本方法を実施又は試験する際、本明細書に記載のものに類似した、又は同等の方法及び材料を使用することができるが、以下では説明に役立つ代表的な方法及び材料を記載する。本明細書で引用した全ての刊行物及び特許は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
特許請求の範囲が、任意選択的な要素を排除するように記載されていることにもさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ〜のみ（ｏｎｌｙ）」、「〜を除いて（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含まない（ｎｏｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの排他的な用語の使用、又は「否定的な」限定の使用のための先行文として機能することを意図している。
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法はいずれも、記載した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
本明細書で使用する「天然バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」は、配列番号２のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む（例えば、表１及び図１を参照されたい）。
本明細書で使用する「変異１８ＢＰ」Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」は、配列番号４の変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む（例えば、表１及び図１を参照されたい）。
本明細書で使用する、配列番号４の変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む「変異１８ＢＰのＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」は、「ｒｇｈＲ２ｄｕｐ」と略記することができ、その（６アミノ酸反復「ＡＡＡＳＩＲ」を含む）変異ＲｇｈＲ２タンパク質は、「ＲｇｈＲ２ｄｕｐ」と略記することができる。
本明細書で使用する「変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」には、コードされたＲｇｈＲ２タンパク質のヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）ドメインにおける１つ以上のヌクレオチド挿入、１つ以上のヌクレオチド欠失、１つ以上のヌクレオチド重複及び／又は１つ以上のヌクレオチド置換を含む変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする任意のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子が含まれ、そのコードされたＲｇｈＲ２タンパク質のＨＴＨドメイン内における１つ以上のヌクレオチド挿入、１つ以上のヌクレオチド欠失、１つ以上のヌクレオチド重複及び／又は１つ以上のヌクレオチド置換は、転写調節タンパク質としてのＲｇｈＲ２タンパク質を実質的に不活性化する。
本明細書で規定したように、配列番号２の天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｇｈＲ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸残基５〜５８内に含まれる。
例えば、所定の実施形態では、当業者であれば、配列番号１の天然ｒｇｈＲ２遺伝子配列に対してｒｇｈＲ２遺伝子を容易にスクリーニング／シーケンシングし、コードされたＲｇｈＲ２タンパク質のＨＴＨドメイン内の突然変異（例えば、ヌクレオチド挿入、欠失、置換、重複など）を含む変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする「変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」配列を同定することができる。
したがって、所定の実施形態では、本開示は、「変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」配列（すなわち、ＨＴＨドメイン内に突然変異を含む変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする）を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。他の実施形態では、本開示は、「変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」配列（すなわち、ＨＴＨドメイン内に突然変異を含む変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする）を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、配列番号２の天然ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子を含む、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
本明細書で使用する（ｉ）「変異１８ＢＰのＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」（配列番号３）又は（ｉｉ）「変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」（すなわち、配列番号２のアミノ酸残基５〜５８内に含まれるコードされたＲｇｈＲ２タンパク質のＨＴＨドメイン内に突然変異を含む）のいずれかを含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）であって、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号２の天然ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子を含み、「改変細胞内の回復ｒｇｈＲ２遺伝子」は、本明細書では「ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ」と略記することができ、コードされたその天然タンパク質は、「ＲｇｈＲ２ｒｅｓｔ」と略記することができる。
Figure 2020508072
より詳細には、上記の表１に示したように、本開示の「変異１８ＢＰのＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」（配列番号３）は、「Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ」（以下では「ＡＡＡＩＳＲ」）である６アミノ酸の連続的反復をコードする１８ヌクレオチド（１８ｂｐ）重複を含み、コードされた変異ＲｇｈＲ２タンパク質の一次アミノ酸配列は、配列番号４に規定されており（表１及び図１を参照されたい）、下記：「Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ」；以下では「ＡＡＡＩＳＲＡＡＡＩＳＲ」（配列番号６）のようなこれらの６アミノ酸の線状（連続的）反復を含む。例えば、ＲｇｈＲ２ｄｕｐタンパク質（配列番号４）中に存在する６アミノ酸反復は表１に提示されており、この１４０アミノ酸タンパク質の反復アミノ酸残基は、配列番号４のＡ３８〜Ｒ４３位でボールド体のアミノ酸を含む。
対照的に、本開示の「天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号１）」は、この１８ヌクレオチド（１８ｂｐ）重複を含んでいない。したがって、天然ｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号２の天然ＲｇｈＲ２タンパク質（これは、配列番号６に提示した、連続反復「ＡＡＡＩＳＲ」を含んでいない）をコードする。例えば、コードされた天然ＲｇｈＲ２タンパク質の一次アミノ酸配列は表１に示されているが、「ＡＡＡＩＳＲ」の６アミノ酸反復は、この１３４アミノ酸タンパク質の３８〜４３位（配列番号２）には存在しない。
本明細書に規定するように、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株Ｂｒａ７（若しくはＢｒａ７株）は、伝統的な遺伝的改良法を使用して野生型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）親株から発生／由来したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞である。本開示の所定の実施形態及び説明は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株Ｂｒａ７に関するが、本開示の組成物及び方法は、特定のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種には限定されるものではなく、本開示の組成物及び方法はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞の特定株に限定されるものでもない。
本明細書で使用する「Ｂｒａ７株のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の誘導体」は、特に、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の親Ｂｒａ７（株）宿主細胞に由来するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を指す。より特別には、本明細書で使用する「Ｂｒａ７株のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の誘導体」は、国際公開第２００８／０２４３７２号パンフレットに記載された５つの遺伝子欠失（Δｃａｔ、ΔａｍｙＬ、Δｓｐｏ、ΔａｐｒＬ、ΔｅｎｄｏＧｌｕＣ）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７親株に由来するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞である。
本明細書で使用する、本明細書では任意選択的に「ＰｃｕＡｍｙｌ−ｖ６」と略記される異種パエニバチルス・クルドラノリチクス（Ｐｅａｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の変異α−アミラーゼ（例えば、実施例２及び４を参照されたい）は、国際公開第２０１４／１６４８３４号パンフレットに開示されている。
本明細書で使用する、本明細書で「サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）α−アミラーゼ変異体＃１」（例えば、実施例５を参照されたい）及び「サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）α−アミラーゼ変異体＃２」（例えば、実施例１１及び１２）」と呼ぶサイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）の変異α−アミラーゼは、国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレット；同第２０１２／１６４８００号パンフレット及び同第２０１４／１６４８３４号パンフレットに開示されている。
本明細書で使用する「変異ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異アミラーゼ」（例えば、実施例５を参照されたい）は、国際公開第２００９／１４９１３０号パンフレットに開示された変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のα−アミラーゼである。
本明細書で使用する、国際公開第２００８／１５３８０５号パンフレット及び米国特許出願第２０１４／００５７３２４号明細書に概して開示されているそれらの改良されたアルカリ性の性能／安定性を含むバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）第７０７号に由来する変異α−アミラーゼである「変異アルカリ性α−アミラーゼ」（例えば、実施例９を参照されたい）は、本明細書ではアルカリ性α−アミラーゼ「変異体１」、アルカリ性α−アミラーゼ「変異体２」、アルカリ性α−アミラーゼ「変異体３」及びアルカリ性α−アミラーゼ「変異体４」と呼ばれる。
本明細書で使用するシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＭ１の「Ｇ４アミラーゼ（変異体）」（例えば、実施例８を参照されたい）は、国際公開第２０１０／１３３６４４号パンフレットに開示されている。
本明細書で使用する「リパーゼ／エステラーゼ活性を含む酵素をコードする」異種ＤＮＡ／核酸配列（例えば、実施例１０を参照されたい）、そのようなＤＮＡ／核酸配列は、リパーゼ／エステラーゼ活性を含む酵素番号「ＥＣ３．１．１．３酵素」をコードする。
本明細書で使用する、対立遺伝子ｇｌｃＴ１を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞（例えば、実施例１２を参照されたい）、対立遺伝子ｇｌｃＴ１は、２０１８年１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６１３，３３９号明細書に記載されたように、変異ＧｌｃＴタンパク質のアミノ酸６７位（Ｆ６７）でフェニルアラニン（Ｆ）を含む変異ＧｌｃＴ（転写アンチターミネーション）タンパク質をコードする。
したがって、所定の実施形態では、「天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」は、配列番号２との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、「天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」は、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質がＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で転写調節タンパク質として活性であることを前提に、配列番号２との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。所定の他の実施形態では、「天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」は、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質が、配列番号６に規定したアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復を含まないことを前提に、配列番号２との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
所定の実施形態では、ｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子は、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。所定の実施形態では、ｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子は、配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。所定の実施形態では、ｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質が、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で転写調節タンパク質として実質的に不活性であることを前提に、配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。所定の他の実施形態では、ｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質が、配列番号６に規定したアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復を含むことを前提に、配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態では、本開示の変異ｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１１１位と１１２位との間の天然ｒｇｈＲ２遺伝子の核酸配列において挿入された、欠失した、重複したなどの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１８、２０個などのヌクレオチドを含む任意のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２遺伝子を含み、それにより天然ｒｇｈＲ２遺伝子を天然ｒｇｈＲ２遺伝子の核酸配列内に挿入された少なくとも１、２、３、４、５、１０、１８、２０個などのヌクレオチドを含む変異ｒｇｈＲ２遺伝子に変換させる。
したがって、他の実施形態では、実質的に不活性であるＲｇｈＲ２タンパク質は、ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸残基３７と３８との間に挿入された少なくとも１、２、３、４、５、６、７個などのアミノ酸を含む変異ＲｇｈＲ２タンパク質をさらに含み（すなわち、配列番号２の活性ＲｇｈＲ２タンパク質配列を参照して）、そのようなアミノ酸挿入（すなわち、残基３７と３８との間）は、ＲｇｈＲ２タンパク質を転写調節タンパク質として実質的に不活性にさせる。
したがって、所定の実施形態では、変異ｒｇｈＲ２遺伝子によってコードされた変異ＲｇｈＲ２タンパク質は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で実質的に「転写調節タンパク質として不活性」である。
本明細書で規定した、「アミノ酸ＡＡＡＩＳＲの６アミノ酸反復を含む、配列番号４のＲｇｈＲ２ｄｕｐタンパク質」は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）内で実質的に「転写調節タンパク質として不活性」である。
本明細書で規定した、配列番号２のコードされたＲｇｈＲ２の「ＨＴＨドメイン内の突然変異を含む変異ｒｇｈＲ２タンパク質をコードする変異ｒｇｈＲ２遺伝子」は、配列番号２の天然ＲｇｈＲ２タンパク質と比較して、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で実質的に「転写調節タンパク質として不活性」である。
所定の実施形態では、実質的に「転写調節タンパク質として不活性」である変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子は、当業者には公知であるＤＮＡ結合アッセイにおいて（天然ＲｇｈＲ２タンパク質；配列番号２と比較して）変異ＲｇｈＲ２タンパク質をスクリーニングすることによって決定される。
例えば、本明細書では、上記に規定したＨＴＨドメインを含む転写調節タンパク質であるＲｇｈＲ２タンパク質は、その転写調節活性を発揮するためにはＤＮＡに十分に結合しなければならないことが企図されている。したがって、１種以上の変異ＲｇｈＲ２タンパク質（すなわち、突然変異ＨＴＨドメインを含む）に比較して天然ＲｇｈＲ２タンパク質のＤＮＡ結合親和性を比較することによって、天然ＲｇｈＲ２タンパク質に対して変異ＲｇｈＲ２タンパク質の減少したＤＮＡ結合親和性は、実質的に「転写調節タンパク質として不活性」であるそのような変異ＲｇｈＲ２タンパク質にとって必然的結果である。例えば、本明細書で企図したように、有意に減少したＤＮＡ結合親和性（又は、ＤＮＡ結合の完全な消失）を有する変異ＲｇｈＲ２タンパク質（すなわち、突然変異ＨＴＨドメインを含む）は、転写調節タンパク質として実質的に活性である天然ＲｇｈＲ２タンパク質と比較して、転写調節タンパク質の実質的な減少（又は完全な消失）を有するであろう。
したがって、所定の実施形態では、本開示の変異ｒｇｈＲ２遺伝子には、図８に示したような、ｒｇｈＲ２遺伝子のこれらの（ＤＮＡ結合）領域内のヌクレオチドの挿入、重複、欠失、非同義置換などを含む任意のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２遺伝子変異体が含まれる。例えば、本開示の図８は、ＤＮＡ結合に包含されるＲｇｈＲ２タンパク質内のアミノ酸残基をコードすると予測される所定のｒｇｈＲ２コドン（すなわち、図８におけるボールド体のヌクレオチド）を示している。したがって、所定の実施形態では、本開示の変異ｒｇｈＲ２遺伝子は、ｒｇｈＲ２遺伝子のこれらの（ＤＮＡ結合）領域内の１つ以上のヌクレオチドの挿入、重複、欠失、非同義置換などを含む変異ｒｇｈＲ２遺伝子である。より特別には、所定の実施形態では、ｒｇｈＲ２遺伝子のＤＮＡ結合領域内のヌクレオチドの挿入、重複、欠失、非同義置換などを含む変異ｒｇｈＲ２遺伝子は、実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードする。
実質的に「転写調節タンパク質として不活性」であるＲｇｈＲ２タンパク質という語句には、ｒｇｈＲ２遺伝子のこれらの（ＤＮＡ結合）領域内の１つ以上のヌクレオチドの挿入、重複、欠失、非同義置換（など）を含む変異ｒｇｈＲ２遺伝子によってコードされた変異ＲｇｈＲ２タンパク質を含み、ここでコードされた変異タンパク質は、転写調節タンパク質として実質的に不活性である。
本明細書で使用する用語「同等位置」は、特に配列番号４のアミノ酸残基３２〜４３に由来する配列番号４のＲｇｈＲ２ポリペプチド配列と整列させた後のアミノ酸残基位置を指す。配列番号４について上述した１２連続アミノ酸残基（すなわち、同等位置）（すなわち、配列番号４の残基３２〜４３）は、配列番号６のアミノ酸配列（「ＡＡＡＩＳＲＡＡＡＩＳＲ」）に示されている。したがって、所定の実施形態では、本開示の変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子若しくはＯＲＦは、コードされたＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列の同等位置を配列番号６に規定した反復アミノ酸配列と比較することによって同定することができるが、ここで配列番号６の反復配列の存在は、本開示の変異ＲｇｈＲ２タンパク質を示す。
用語「改変」及び「遺伝子改変」は、互換的に使用され：（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）内での１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去又は遺伝子若しくはそのＯＲＦ内での１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子崩壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子の下方制御、（ｆ）本明細書に開示した任意の１つ以上の遺伝子の特異的変異誘発及び／又は（ｇ）ランダム突然変異誘発が含まれる。例えば、本明細書で使用する遺伝子改変には、ｒｇｈＲ２、ｒｇｈＲ１、ａｂｒＢ１、ｒｐｍＪ、ｒｐＩＭ、ＢＬｉ００４１２、ｒａｐＫ、ｐｈｒＫ、ＢＬｉ００７５３、ｙｆｊＴ、ＢＬｉ００８２８、ｙｈｄＸ、ｙｈｚＣ、ｔｅｒｆ２、ｚｏｓＡ、ａｂｂＡ、ｓｐｅＧ、ｙｐｐＦ、ＢＬｉ０２５４３、ｍｎｔＲ、ＢＬｉ０２７６８、ｓｓｐＡ、ＢＬｉ０３１２７、ＢＬｉ０３６３５、ｍｒｇＡ、ＢＬｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ｓｐｏ０Ｆ、ｙｗｊＧ、ｙｗｑ１２、ＢＬｉ０４１９９、ＢＬｉ０４２００、ｌｉｃＴ、ｂｇｌＨ及びｂｇｌＰからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の改変が含まれるがそれらに限定されない。
本明細書で使用する「遺伝子の崩壊」、「遺伝子崩壊」、「遺伝子の不活性化」及び「遺伝子不活性化」は、互換的に使用され、宿主細胞が機能的遺伝子産物（例えば、タンパク質）を産生することを妨げる任意の遺伝子改変を広く指す。典型的な遺伝子破壊方法には、ポリペプチドコーディング配列、プロモーター、エンハンサー又はまた別の調節エレメントを含む遺伝子の任意の部分の完全若しくは部分的な消失又は同一物の突然変異誘発が含まれるが、ここで突然変異誘発は、標的遺伝子を崩壊／不活性化し、機能的遺伝子産物（すなわち、タンパク質）の産生を実質的に減少若しくは防止する、置換、挿入、欠失、逆位並びにそれらの任意の組み合わせ及び変形形態を包含する。
本明細書で使用する用語、遺伝子発現の「下方制御」及び遺伝子発現の「上方制御」には、遺伝子のより低い（下方制御された）又はより高い（上方制御された）発現を生じさせる任意の方法が含まれる。例えば、遺伝子の下方制御は、ＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシング、例えばプロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）／シャイン・ダルガーノ配列、未翻訳領域（ＵＴＲ）、コドン変化などの制御要素の遺伝子改変によって達成され得る。
本明細書で使用する語句「１８ヌクレオチド重複を欠失させる」又は「１８ｂｐ重複を欠失させる」又は「１８ヌクレオチド重複を欠失させることにより細胞を改変する」は、特に１８ヌクレオチド重複を含む変異ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｄｕｐ）を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の遺伝子改変を意味しており、その重複は、変異ＲｇｈＲ２タンパク質内のアミノ酸「ＡＡＡＩＳＲ」（配列番号６）の反復をコードする（ＲｇｈＲ２ｄｕｐ；例えば、配列番号４を参照されたい；配列番号４の３２〜３７位でのアミノ酸「ＡＡＡＩＳＲ」は、配列番号４の３８〜４３位で連続的に反復される）。
したがって、所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、配列番号６の「ＡＡＡＩＳＲ」反復配列をコードする１８ヌクレオチド重複を含む変異染色体ｒｇｈＲ２遺伝子（例えば、ｒｇｈＲ２ｄｕｐ；配列番号３）を含む親Ｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来するが、ここで改変Ｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、「１８ヌクレオチド重複を欠失させること」によって改変され、それにより天然ｒｇｈＲ２タンパク質をコードする「回復」ｒｇｈＲ２遺伝子配列（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ；配列番号１）を含む改変Ｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞が生じる。親Ｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内の１８ヌクレオチド重複を欠失させるための方法には、下記の第ＩＶ章でさらに記載する相同組み換え、ＣＲＳＩＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集、メガヌクレアーゼ遺伝子編集、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）編集などが含まれるが、それらに限定されない。したがって、所定の実施形態では、本開示は、「回復」ｒｇｈＲ２遺伝子を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に向けられる。
本明細書で使用する「宿主」細胞は、新たに導入されるＤＮＡ配列のための宿主又は発現ビヒクルとして作用する能力を有する細胞を指す。これは、本開示の所定の実施形態では、宿主細胞は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。
本明細書で使用する「親細胞」、「親宿主細胞」又は「親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（宿主）細胞」は、互換的に使用することができ、「未改変」親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を指す。例えば、「親」細胞は、「親」細胞のゲノムが（例えば親細胞に導入された１つ以上の突然変異によって）変更させられて、改変「娘」細胞を生成する微生物の任意の細胞又は株を指す。
本明細書で規定する「改変細胞」、「改変宿主細胞」又は「改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（宿主）細胞」は、互換的に使用することができ、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞がそれに由来する「親」Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞内に存在しない少なくとも１つの遺伝子改変を含む組み換えＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（宿主）細胞を指す。例えば、所定の実施形態では、本開示の「親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（宿主）細胞」は、配列番号４の変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする配列番号３の染色体ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｄｕｐ）を含み、本開示の「改変」Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞（すなわち、配列番号３の染色体ｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞に由来する）は、配列番号３における１８ヌクレオチド重複を欠失する遺伝子改変を含み、それにより配列番号２の天然ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする天然ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）を含む改変（回復）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞を生じさせる。
所定の実施形態では、「未改変」Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（親）細胞は、特に、「改変」Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞と比較した場合、又はそれに対して、「コントロール細胞」と呼ぶことができる。本明細書で使用するように、「未改変」（親）細胞（すなわち、コントロール細胞）内の関心対照のタンパク質（ＰＯＩ）の発現及び／又は産生が、「改変」（娘）細胞中の同一ＰＯＩの発現及び／又は産生と比較される場合、「改変」及び「未改変」細胞は、実質的に同一条件（すなわち、培地、温度、ｐＨなどの同一条件）下で増殖／培養／発酵されることは理解されるであろう。
本明細書で使用する、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」には、当業者には公知である「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての種が含まれ、例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられるが、それらに限定されない。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的再編成を受け続けていることは認識されている。したがって、この属は、例えば、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されている「Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」などの生物を含むがそれらに限定されない再分類されている種を含むことが意図されている。
本明細書で規定した用語、「増加した発現」、「強化された発現」、「ＰＯＩ産生の増加した発現」、「増加した産生」、「ＰＯＩの増加した産生」などの用語は、「改変」Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を指し、ここで、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」は、常に同一ＰＯＩを発現／産生する「未改変」（親）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（親）細胞に比較して（〜に対して）である。
本明細書で使用する用語「発現」は、本開示の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）若しくはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現は、またｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指し得る。したがって、用語「発現」には、例えば、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌などを含むがそれらに限定されないポリペプチドの産生に関与する任意の工程が含まれる。
本明細書で規定した、例えば語句「改変宿主細胞が（未改変）親宿主細胞と比較して関心対象のタンパク質の増加した量を発現／産生する」において使用する複合用語「発現／産生する」は、本開示の宿主細胞内の関心対象のタンパク質の発現及び産生に関与する任意の工程を含むことが意図されている。
同様に、本明細書で使用する、例えば「改変宿主細胞が（未改変）親宿主細胞に比較して増加した量の１種以上の関心対象のタンパク質を発現／産生する」などの語句において使用した場合の「増加した量」は、特に、改変宿主細胞内で発現／産生した任意の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）の「増加した量」を指すが、この「増加した量」は常に同一ＰＯＩを発現／産生する（未改変）親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関し、ここで改変及び未改変細胞は、同一条件（例えば、培地、温度、ｐＨなどの同一条件）下で増殖／培養／発酵させられる。例えば、増加した量のＰＯＩは、内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰＯＩ又は本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で発現した内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰＯＩ若しくは異種ＰＯＩであってよい。
したがって、本明細書で使用するタンパク質産生を「増加させる」又は「増加した」タンパク質産生は、産生したタンパク質（例えば、関心対象のタンパク質）の増加した量を指す。タンパク質は、宿主細胞の内部で産生されても、培養培地中へ分泌（又は、輸送）されてもよい。所定の実施形態では、関心対象のタンパク質は、培養培地中へ産生（分泌）される。増加したタンパク質産生は、例えば、親宿主細胞と比較して、より高い最大レベルのタンパク質若しくは酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性など）又は産生される総細胞外タンパク質として検出され得る。
本明細書で使用する「核酸」は、ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド配列、及びそれらの断片若しくは部分、並びに、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれを表していても、二本鎖であっても一本鎖であってもよい、ゲノム若しくは合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを指す。遺伝子コードの縮重の結果として、多数のヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されよう。
本明細書に記載したポリヌクレオチド（若しくは核酸分子）には、「遺伝子」、「ベクター」及び「プラスミド」が含まれることは理解されている。
したがって、用語「遺伝子」は、タンパク質のコーディング配列の全部又は一部を含む、アミノ酸の特定配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば、遺伝子が発現する条件を決定する、プロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’側−非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’側−ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）並びにコーディング配列を含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「コーディング配列」は、その（コードする）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を指す。コーディング配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレーム（以下では、「ＯＲＦ」）によって決定されて、通常はＡＴＧ開始コドンで始まる。コーディング配列には、典型的には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組み換えヌクレオチド配列が含まれる。
本明細書で規定した用語「オープンリーディングフレーム」（以下では、「ＯＲＦ」）という用語は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を表す一連の２つ以上のコドン及び（ｉｉｉ）終止コドンからなる（天然型であるか、非天然型であるか、又は合成であるかにかかわらず）連続するリーディングフレームを含む核酸又は核酸配列を意味し、ＯＲＦは、５’側から３’側の方向に読まれる（又は、翻訳される）。
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、コーディング配列若しくは機能的ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を指す。一般に、コーディング配列は、プロモーター配列の３’側末端側（下流）に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来してもよい、又は、天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されていてもよい、又は、合成核酸区間を含んでいてさえよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、種々の生育段階で、又は種々の環境若しくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者には理解されている。大多数の場合にほとんどの細胞型で遺伝子の発現を誘発するプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡ断片が同一プロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。
本明細書で使用する用語「機能的に連結した」は、一方の機能が他方により影響されるような、単一核酸断片上での核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、コーディング配列に機能的に連結している。コーディング配列は、センス若しくはアンチセンス配向で調節配列に機能的に連結され得る。
核酸は、他の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「機能的に連結している」。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに機能的に連結している；プロモーター若しくはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に機能的に連結している；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コーディング配列に機能的に連結している。一般に、「機能的に連結した」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接している、及び分泌リーダーの場合には、隣接してリーディング期にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、便宜的な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプター若しくはリンカーが使用される。
本明細書で使用する「関心対象のタンパク質コーディング配列の遺伝子に連結した関心対象の遺伝子の発現を制御する機能的プロモーター配列（又はそれらのオープンリーディングフレーム）」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）におけるコーディング配列の転写及び翻訳を制御するプロモーター配列を指す。例えば、所定の実施形態では、本開示は、５’プロモーター（又は、５’プロモーター領域若しくはタンデム５’プロモーターなど）を含むポリヌクレオチドであって、そのプロモーター領域が配列番号２のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結しているポリヌクレオチドに向けられる。したがって、所定の実施形態では、機能的プロモーター配列は、配列番号２のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子の発現を制御する。他の実施形態では、機能的プロモーター配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞中、より特別にはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞中の関心対象のタンパク質をコードする異種遺伝子（若しくは内在性遺伝子）の発現を制御する。
本明細書で規定した「好適な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’側非コーディング配列）、コーディング配列内又はコーディング配列の下流（３’側非コーディング配列）に位置しており、関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造を含み得る。
本明細書で定義した、例えば「細菌細胞内に導入すること」又は「Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内に少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はその遺伝子、又はそのベクターを導入すること」などの語句に使用される用語「導入すること」は、プロトプラスト融合法、天然若しくは人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）法、形質導入法、トランスフェクション法、共役法などを含むがそれらに限定されない、ポリヌクレオチドを細胞内に導入するための当技術分野で公知の方法を含む（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
本明細書で使用する「形質転換された」又は「形質転換」は、細胞が組み換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを指す。形質転換は、典型的には、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、１つのポリヌクレオチド、ＯＲＦ若しくは遺伝子）を細胞内に挿入することによって発生する。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換対象である細胞中に天然には存在しない配列）であってよい。例えば、本開示の所定の実施形態では、配列番号４の変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、親細胞内に配列番号２の天然ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド構築物を導入することによって改変（例えば、形質転換）され、それによって結果として、「未改変」（親）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）宿主細胞が生じる。
本明細書で使用する「形質転換」は、ＤＮＡが、染色体成分又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、外生ＤＮＡを宿主細胞内に導入することを指す。本明細書で使用する「トランスフォーミングＤＮＡ」、「トランスフォーミング配列」及び「ＤＮＡ構築物」は、配列を宿主細胞内若しくは生物内に導入するために使用されるＤＮＡを指す。トランスフォーミングＤＮＡは、配列を宿主細胞若しくは生物内に導入するために使用されるＤＮＡである。このＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＣＲ又は任意の他の好適な技術によって生成され得る。一部の実施形態では、トランスフォーミングＤＮＡは、入来配列を含むが、他の実施形態では、トランスフォーミングＤＮＡは、相同ボックスによってフランキングされた入来配列をさらに含む。さらに別の実施形態では、トランスフォーミングＤＮＡは、末端に付加された、他の非相同配列（すなわち、スタッファー配列若しくはフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクター内への挿入など、トランスフォーミングＤＮＡが閉環を形成するように閉じることができる。
核酸配列を細胞内に導入する状況において本明細書で使用する用語「導入（された）」は、核酸配列を細胞内に移すために好適な任意の方法を指す。導入のためのこのような方法には、プロトプラスト融合法、トランスフェクション法、形質転換法、エレクトロポレーション法、接合法及び形質導入法が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
本明細書で使用する「入来配列」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内に導入されるＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、入来配列は、ＤＮＡ構築物の一部である。他の実施形態では、入来配列は、１種以上の関心対象のタンパク質をコードする。一部の実施形態では、入来配列は、形質転換対象の細胞のゲノム内に既に存在していても、存在していなくてもよい（すなわち、相同配列若しくは非相同配列のいずれかであってよい）配列を含む。一部の実施形態では、入来配列は、１種以上の関心対象のタンパク質、遺伝子及び／又は突然変異若しくは改変遺伝子をコードする。代替実施形態では、入来配列は、機能的な野生型遺伝子若しくはオペロン、機能的な突然変異遺伝子若しくはオペロン又は非機能的な遺伝子若しくはオペロンをコードする。一部の実施形態では、非機能的配列は、遺伝子の機能を崩壊させるために遺伝子内に挿入され得る。また別の実施形態では、入来配列は、選択マーカーを含む。さらに別の実施形態では、入来配列は、２つの相同ボックスを含む。
本明細書で使用する「相同ボックス」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内の配列と相同である核酸配列を指す。より詳細には、相同ボックスは、本発明にしたがって、欠失させられる、崩壊させられる、不活性化させられる、下方制御されるなどの遺伝子又は遺伝子の一部の直接的フランキングコーディング領域との約８０〜１００％の配列同一性、約９０〜１００％の配列同一性又は約９５〜１００％の配列同一性を有する上流又は下流領域である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内にＤＮＡ構築物が組み込まれる場所を指令し、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどの部分が入来配列により置換されるのかを指令する。本開示を限定することは意図していないが、相同ボックスは、約１塩基対（ｂｐ）〜２００キロ塩基（ｋｂ）を含み得る。好ましくは、相同ボックスは、約１ｂｐ〜１０．０ｋｂ；１ｂｐ〜５．０ｋｂ；１ｂｐ〜２．５ｋｂ；１ｂｐ〜１．０ｋｂ及び０．２５ｋｂ〜２．５ｋｂを含む。相同ボックスは、約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ〜０．１ｋｂもまた含み得る。一部の実施形態では、選択マーカーの５側’及び３’側末端は、相同ボックスによってフランキングされるが、ここで相同ボックスは、遺伝子のコーディング領域を直接的にフランキングする核酸配列を含む。
本開示のさらにまた別の実施形態では、ＤＮＡアレイ解析（例えば、本明細書に記載したトランスクリプトーム解析）によって決定される不適切な時間に活性である遺伝子の欠失、崩壊、不活性化又は下方制御は、関心対象のタンパク質の強化された発現を提供する。本明細書で使用する「トランスクリプトーム解析」は、遺伝子転写の解析を指す。
本明細書で使用する用語「選択可能マーカーコーディングヌクレオチド配列」は、宿主細胞内で発現することができ、選択可能マーカーの発現が発現した遺伝子を含有する細胞に対応する選択的作用物質の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力を付与する、ヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用する用語「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」は、ベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にさせる、宿主細胞内で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指す。そのような選択可能マーカーの例としては、抗微生物剤が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、用語「選択可能マーカー」は、宿主細胞が関心対象の入来ＤＮＡを取り上げたか、又は何らかの他の反応が発生したことの兆候を提供する遺伝子を指す。典型的には、選択可能マーカーは、形質転換中に外生配列を受け入れていない細胞から外生ＤＮＡを含有する細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性又は代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。
「存在する選択可能マーカー」は、形質転換対象の微生物の染色体上に所在する選択マーカーである。存在する選択可能マーカーは、トランスフォーミングＤＮＡ構築物上の選択可能マーカーとは異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは、当業者には周知である。上記で示したように、マーカーは、微生物耐性マーカー（例えば、ａｍｐＲ、ｐｈｌｅｏＲ、ｓｐｅｃＲ、ｋａｎＲ、ｅｒｙＲ、ｔｅｔＲ、ｃｍｐＲ及びｎｅｏＲ（例えば、Ｇｕｅｒｏｔ−Ｆｌｅｕｒｙ，１９９５；Ｐａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０００；及びＴｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３を参照されたい）であってよい。一部の実施形態では、本発明は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（例えば、ｐＣ１９４上に存在する遺伝子並びにバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に存在する耐性遺伝子）を提供する。この耐性遺伝子は、本発明において、並びに染色体に組み込まれたカセット及び統合的プラスミドの染色体増幅を包含する実施形態では、特に有用である（例えば、Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ ａｎｄ Ｇａｌｉｚｚｉ，１９８５；Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｆｅｒｒａｒｉ，１９８４を参照されたい）。本発明にしたがって有用な他のマーカーとしては、限定はされないが、セリン、リシン、トリプトファンなどの栄養要求性マーカー及びβ−ガラクトシダーゼなどの検出マーカーが挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書で規定した宿主細胞「ゲノム」、細菌（宿主）細胞「ゲノム」又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（宿主）細胞「ゲノム」は、染色体遺伝子及び染色体外遺伝子を含む。
本明細書で使用する用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、細胞の中央代謝には典型的には関与しない遺伝子を運ぶことが多い、通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある染色体外要素を指す。そのような要素は、多数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’側未翻訳配列と共に細胞内に導入できる固有の構成に接合又は再結合されている任意の起源に由来する、線状若しくは環状の、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってよい。
本明細書で使用する「形質転換カセット」は、遺伝子（若しくは、そのＯＲＦ）を含み、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特異的ベクターを指す。
本明細書で使用する用語「ベクター」は、細胞内で複製（増殖）することができ、新たな遺伝子若しくはＤＮＡセグメントを細胞中に運ぶことができる任意の核酸を指す。したがって、この用語は、様々な宿主細胞間を輸送するために設計された核酸構築物を指す。ベクターとしては、「エピソーム」（すなわち、自律的に複製するか、又は宿主生物の染色体に組み込むことができる）である、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＰＬＡＣ（植物人工染色体）などの人工染色体が挙げられる。
「発現ベクター」は、細胞内で異種ＤＮＡを組み込んで発現させる能力を有するベクターを指す。多数の原核生物及び真核生物の発現ベクターは、商業的に入手可能であり、当業者には公知である。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内に含まれる。
本明細書で使用する用語「発現カセット」及び「発現ベクター」は、標的細胞中の特定核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を用いて、組み換えにより、又は合成的に生成される核酸構築物（すなわち、これらは、上述したベクター若しくはベクター要素である）を指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス若しくは核酸断片内に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列及びプロモーターが含まれる。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物には、標的細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素もまた含まれる。所定の実施形態では、本開示のＤＮＡ構築物は、本明細書に規定した選択マーカー及び不活性化染色体セグメント若しくは遺伝子セグメント若しくはＤＮＡセグメントを含む。
本明細書で使用する「ターゲティングベクター」は、その中にターゲティングベクターが形質転換される宿主細胞の染色体内の領域に相同のポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組み換えを駆動できるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組み換えによって宿主細胞の染色体内に突然変異を導入する際に使用される。一部の実施形態では、ターゲティングベクターは、例えば末端に付加される他の非相同配列（すなわち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクター内への挿入など、ターゲティングベクターが閉環を形成するように閉じることができる。例えば、所定の実施形態では、配列番号４の変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（宿主）細胞は、「回復」天然ｒｇｈＲ２遺伝子を含む改変宿主細胞が配列番号２の天然ＲｇｈＲ２タンパク質をコードするように、内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の変異ｒｇｈＲ２遺伝子の１８ヌクレオチド重複を欠失させるために設計されている１つ以上の「ターゲティングベクター」を親細胞内に導入することによって改変（例えば、形質転換）される。適切なベクターの（例えば、ｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチド重複を欠失させるための）選択及び／又は構築は、当業者の知識の範囲内に明確に含まれる。
本明細書で使用する用語「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用され、多くの細菌や一部の真核生物において染色体外の自己複製遺伝要素を形成する、環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物を指す。一部の実施形態では、プラスミドは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれる。
本明細書で使用する用語「関心対象のタンパク質」若しくは「ＰＯＩ」は、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）宿主細胞中で発現するのが望ましく、ＰＯＩは、増加したレベル（すなわち、「未改変」（親）細胞に比較して）で発現する。したがって、本明細書で使用するＰＯＩは、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造タンパク質、受容体タンパク質などであってよい。所定の実施形態では、本開示の改変細胞は、親細胞に比較して増加した量の関心対象の異種タンパク質若しくは関心対象の内在性タンパク質を産生する。特定の実施形態では、本開示の改変細胞によって産生した関心対象のタンパク質の増加した量は、親細胞と比較して、少なくとも０．５％の増加、少なくとも１．０％の増加、少なくとも５．０％の増加又は５．０％超の増加である。
同様に、本明細書で規定した「関心対象の遺伝子」若しくは「ＧＯＩ」は、ＰＯＩをコードする核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子若しくはオープンリーディングフレーム）を指す。「関心対象のタンパク質」をコードする「関心対象の遺伝子」は、天然型遺伝子、突然変異遺伝子又は合成遺伝子であってよい。
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対し、従来の１文字又は３文字コードを使用する。ポリペプチドは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、改変アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって分断されていてもよい。ポリポチペプチドという用語には、自然に、又は介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化などの介入、又は例えば標識化成分との共役結合などの任意の他の操作若しくは改変などを介して改変されているアミノ酸ポリマーも包含される。また、この定義の範囲内には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において知られる他の改変も含まれる。
所定の実施形態では、本開示の遺伝子は、例えば酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｌｙｓａｓｅｓ）、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせなどの商業的に関連する工業用の関心対象のタンパク質をコードする。
本明細書で使用する「変異」ポリペプチドは、典型的には組み換えＤＮＡ技術による、１個以上のアミノ酸の置換、付加若しくは欠失による親（若しくは参照）ポリペプチドに由来するポリペプチドを指す。変異ポリペプチドは、少数のアミノ酸残基によって親ポリペプチドと異なる可能性があり、親（参照）ポリペプチドとの一次アミノ酸配列の相同性／同一性のレベルによって定義され得る。
好ましくは、変異ポリペプチドは、親（参照）ポリペプチド配列との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％さえのアミノ酸配列同一性を有する。本明細書で使用する「変異」ポリヌクレオチドは、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指し、ここで「変異ポリヌクレオチド」は、親ポリヌクレオチドと規定の程度の配列相同性／同一性を有する、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で親ポリヌクレオチド（若しくはその相補体）とハイブリダイズする。好ましくは、変異ポリヌクレオチドは、親（参照）ポリヌクレオチド配列との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％さえのヌクレオチド配列同一性を有する。
本明細書で使用する「突然変異」は、核酸配列内の任意の変化又は変更を指す。点突然変異、欠失突然変異、サイレント突然変異、フレームシフト突然変異、スプライシング突然変異などを含む数種のタイプの突然変異が存在する。突然変異は、特異的に（例えば、部位特異的変異誘発によって）又はランダムに（例えば、化学薬品、修復マイナス細菌株を通しての継代によって）行われ得る。
本明細書で使用するポリペプチド若しくはその配列に関連して、用語「置換」は、１つのアミノ酸とまた別のアミノ酸との取り換え（すなわち、置換）を意味する。
本明細書で規定した「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置に存在する遺伝子を指す。
本明細書で規定した「異種」遺伝子、「非内在性」遺伝子又は「外来」遺伝子は、通常は宿主生物中では見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子（若しくはＯＲＦ）を指す。本明細書で使用する用語「外来」遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子（若しくはＯＲＦ）及び／又は天然若しくは非天然生物中に挿入されたキメラ遺伝子を含む。
本明細書で規定した「異種」核酸構築物若しくは「異種」核酸配列は、その中でそれが発現する細胞に対して天然ではない配列の部分を有する。
本明細書で規定した「異種制御配列」は、天然では関心対象の遺伝子の発現を調節（制御）するために機能しない遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター若しくはエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、その中にそれらが存在する細胞又はゲノムの一部に対して内在性（天然）ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に付加されている。「異種」核酸構築物は、天然宿主細胞内で見出される制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせと同一又は異なる制御配列／ＤＮＡコーディング（ＯＲＦ）配列の組み合わせを含有し得る。
本明細書で使用する用語「シグナル配列」及び「シグナルペプチド」は、成熟タンパク質若しくはタンパク質の前駆体形の分泌又は直接輸送に関与する可能性があるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、典型的には、前駆体若しくは成熟タンパク質配列のＮ末端に所在する。シグナル配列は、内在性であっても外在性であってもよい。シグナル配列は、通常は、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、典型的には、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
用語「由来する」には、用語「〜から出た」、「〜から得た」、「入手可能な」及び「作成された」が含まれ、一般には、１つの特定の材料若しくは組成物が別の材料若しくは組成物にその起源が見出されるか、又は他の特定の材料若しくは組成物を参照して記載できる特徴を有することを示す。
本明細書で使用する用語「相同性」は、相同ポリヌクレオチド若しくは相同ポリペプチドに関する。２つ以上のポリヌクレオチド若しくは２つ以上のポリペプチドが相同である場合、これは、それらの相同のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドが、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９８％の「同一性度」を有することを意味している。２つのポリヌクレオチド若しくはポリペプチドが、本明細書で規定したように相同であるほどの十分に高い同一性度を有するか否かは、当該技術分野で公知であるコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供される「ＧＡＰ」（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）を使用して２つの配列を整列させることにより適切に調査することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０））。ＤＮＡ配列比較のために次の設定：５．０のＧＡＰ作成ペナルティ及び０．３のＧＡＰ伸長ペナルティを用いるＧＡＰを使用して。
本明細書で使用する用語「パーセント（％）同一性」は、配列アライメントプログラムを使用して整列させたときの、ポリペプチドをコードする核酸配列間又はポリペプチドのアミノ酸配列間の核酸又はアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。
本明細書で使用する用語「比生産性」は、所定の期間にわたって、細胞１個当たり、単位時間当たりに産生するタンパク質の総量を指す。
本明細書で規定した用語「精製（された）」、「単離（された）」又は「濃縮（された）」は、生体分子（例えば、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド）が、それが本来結合している、天然型の一部若しくは全部の構成要素から分離することによって、その天然状態から改変されることを指す。そのような単離若しくは精製は、最終組成物中に望ましくない全細胞、細胞残屑、不純物、外来タンパク質又は酵素を除くための、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈澱若しくは他のタンパク質塩析、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動若しくは勾配による分離などの当該技術分野で公知の分離技術によって実施することができる。精製若しくは単離した生体分子組成物には、その後さらに、追加の便益を付与する構成要素、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨ調節化合物又は他の酵素若しくは化学物質を添加することができる。
本明細書で使用する「ＣｏｍＫポリペプチド」は、コンピテンス開発の前の最終自己調節制御スイッチとして作用する転写因子ＤＮＡ結合及び取り込み並びに組み換えに関与する後期反射能遺伝子の発現の活性化に関与するｃｏｍＫ遺伝子の産物であると規定されている；（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｚｕｂｅｒ，１９９８，Ｈａｍｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。典型的なＣｏｍＫ核酸及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号８５及び配列番号８６に規定されている。
本明細書で使用する「相同遺伝子」は、種が異なるが通常は関連する種に由来する、相互に対応する、及び相互に同一若しくは極めて類似する１対の遺伝子を指す。この用語は、種分化（すなわち、新規な種の発生）によって分離された遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）並びに遺伝子重複によって分離されてきた遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
本明細書で使用する「オルソログ」及び「オルソロガス遺伝子」は、種分化によって共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）から生じた異なる種の遺伝子を指す。典型的には、オルソログは、進化の過程中に同一機能を保持している。オルソログの同定は、新規にシーケンシングされるゲノムにおける信頼性の高い遺伝子機能の予測に使用される。
本明細書で使用する「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内での複製に関係する遺伝子を指す。オルソログは進化の過程を通して同一機能を保持するが、他方、パラログは、一部の機能の多くは元の機能に関連するものの新規な機能を展開する。パラログ遺伝子の例としては、全部がセリンプロテイナーゼであり、同一種において一緒に発生するトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビンをコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書で使用する「相同性」は、配列類似性若しくは同一性を指すが、同一性が好ましい。この相同性は、当該技術分野で公知の標準技術を使用して決定される（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照されたい）。
本明細書で使用する「アナログ配列」は、遺伝子の機能が、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する遺伝子と実質的に同一である配列である。さらに、アナログ遺伝子は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞の配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む。アナログ配列は、公知の配列アラインメント法によって決定される。一般に使用されるアラインメント法はＢＬＡＳＴであるが、配列を整列させる際には他の方法もまた使用される。
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、当該技術分野で公知であるように、それによって核酸鎖がその相補鎖と塩基対を形成することによって接合するプロセスを指す。核酸配列は、２つの配列が中から高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体若しくはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、典型的には、Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）；「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約５〜１０℃低い；「中間ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍより約１０〜２０℃低い；及び「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約２０〜２５℃低い温度で起こる。機能的には、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性若しくはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ、一方、中間若しくは低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列ホモログを同定若しくは検出するために用いることができる。中〜高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野ではよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％のホルムアミド、５×のＳＳＣ、５×のデンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ及び１００ｐｇ／ｍＬの変性キャリアＤＮＡ中における約４２℃でのハイブリダイゼーション、その後の２×のＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ中における室温での２回の洗浄並びに０．１×のＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ中における４２℃での２回の洗浄が挙げられる。中ストリンジェンシー条件の例としては、２０％のホルムアミド、５×のＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×のデンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中における３７℃での一晩のインキュベーション、その後の１×のＳＳＣ中における約３７〜５０℃でのフィルターの洗浄が挙げられる。当業者であれば、例えばプローブ長などの因子を適応させるために必要な温度、イオン強度などの調整方法を知っている。
本明細書で使用する「組み換え」は、異種核酸配列の導入によって改変されている、又は細胞がそのように改変された細胞に由来する細胞又はベクターへの言及が含まれる。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形態内の同一形態においては見出されない遺伝子を発現する、又はヒトが意図的に介入した結果として、さもなければ異常に発現する、過少発現する、若しくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。「組み換え」、「組み換える」又は「組み換え」核酸を生成することは、一般に、２つ以上の核酸断片の集合体であるが、ここで集合体は、キメラ遺伝子を発生させる。
本明細書で使用する「フランキング配列」は、考察対象の配列の上流又は下流のいずれかにある任意の配列を指す（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃについては、遺伝子ＢがＡ及びＣ遺伝子配列にフランキングされている）。所定の実施形態では、入来配列は、両側で相同ボックスにフランキングされている。また別の実施形態においては、入来配列及び相同ボックスは、両側でスタッファー配列によってフランキングされている単位を含む。一部の実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各相同ボックスの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内の配列と相同である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内に新規な構築物が組み込まれ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどの部分が入来配列により置換されるかを指令する。他の実施形態において、選択マーカーの５’側及び３’側末端は、不活化染色体断片の一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。一部の実施形態では、フランキング配列は、片方の側（３’又は５’のいずれか）にのみ存在するが、他の実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。
本明細書で使用する用語「スタッファー配列」は、相同ボックスをフランキングする任意の追加ＤＮＡ（典型的にはベクター配列）を指す。しかし、この用語は、任意の非相同ＤＮＡ配列を包含する。何らかの理論によって制限されることなく、スタッファー配列は、ＤＮＡ取り込みを開始する細胞にとって重要ではない標的を提供する。
ＩＩ．Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）ＲＧＨＲ１／ＲＧＨＲ２転写制御因子
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｖａＮ遺伝子は、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ（Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）及びｒａｐＤ（Ｏｇｕｒａ ＆ Ｆｕｊｉｔａ，２００７）並びに改名されたｒｇｈＲのリプレッサー（ｒａｐＧ及びｒａｐＨリプレッサー）であると同定された。ｒｇｈＲの下流には、機能は未知であるが、配列相同性に基づくとＨＴＨ型（ヘリックスターンヘリックス）転写調節因子をコードする遺伝子ｙｖａＯが存在する。「ＲｇｈＲ」と「ＹｖａＯ」との間のアミノ酸配列同一性は、およそ５２％である。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の上流には、遺伝子ｙｖｚＣ及びｙｖａＭが存在する。ｙｖｚＣ遺伝子は、さらに推定ＨＴＨ型転写調節因子をコードするが、ｙｖａＭの翻訳産物は、推定ヒドロラーゼである。
より特別には、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）は、「ＲｇｈＲ１」及び「ＲｇｈＲ２」と命名されているバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲｇｈＲ／ＹｖａＯの２つのホモログをコードする。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（１６８株）「ＲｇｈＲ」タンパク質とＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＤＳＭ１３株）「ＲｇｈＲ１」タンパク質との間のアミノ酸配列同一性は、およそ５９％である；及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（１６８株）「ＲｇｈＲ」とＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＤＳＭ１３株）「ＲｇｈＲ２」との間のアミノ酸配列同一性は、およそ５７％である。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ１の上流には、２つの遺伝子、ｙｖｚＣ（ＢＬｉ０３６４５；配列番号１７）転写調節因子及びＢＬｉ０３６４４（配列番号１９）転写調節因子が存在する。Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＹｖｚＣは、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＹｖｚＣのホモログである。しかしながら、Ｂｌｉ０３６４４は転写調節因子のＡｂｒＢファミリーに属しており、推定ヒドロラーゼＹｖａＭのホモログではない。
より特別には、下記の実施例の項で提示及び考察するように、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＤＳＭ１３株＝ＡＴＴＣ１４５８０）は、推定ＨＴＨ型転写調節因子をコードする、ｒｇｈＲ２（ＫＥＧＧゲノムＴ００２００ Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＤＳＭ１３の遺伝子番号ＢＬｉ０３６４７）と命名された遺伝子を含有する。Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＤＳＭ１３）のｒｇｈＲ２の核酸配列は、配列番号１に提示されており、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＤＳＭ１３）のＲｇｈＲ２タンパク質のコードされたアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。
例えば、本開示の出願人は、（１）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株のゲノム、（２）Ｂｒａ７株のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の誘導体のゲノム、（３）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＡＴＣＣ−９７８９株のゲノム（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ／９７８９．ａｓｐｘ）及び（４）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＡＴＣＣ−６５９８株のゲノム（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｅｎ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ／６５９８．ａｓｐｘ）をシーケンシングしたが、これはこれらのＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株全部がｒｇｈＲ２遺伝子内に１８ヌクレオチド（１８ｂｐ）の重複、（すなわち、反復）を有することを明らかにした（例えば、配列番号３を参照されたい；ヌクレオチド「ＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＧＡ」は、連続順序で２回繰り返されるが、そのヌクレオチド重複は配列番号８７に規定されている）及びこの１８ヌクレオチド配列は、配列番号４の変異ＲｇｈＲ２タンパク質が「ＡＡＡＩＳＲ」の反復を含む（すなわち、配列番号６に示したように；ＡＡＡＩＳＲ−ＡＡＡＩＳＲ）ように、アミノ酸「ＡＡＡＩＳＲ」（配列番号５）をコードする。
したがって、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株（配列番号４）のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４に示したように、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７誘導体、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ−９７８９株及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ−６５９８株のＲｇｈＲ２の配列と同一である。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）とＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＤＳＭ１３株のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）とのアラインメントは、配列番号４における反復（ＡＡＡＩＳＲ）を例示している図１に示した。配列「ＡＡＡＩＳＲ」の挿入（反復）は、図８に示したようにヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）ドメイン内、及びＲｇｈＲ２タンパク質の配列特異的ＤＮＡ結合部位の近くにある。
例えば、配列番号４の（例えば、ｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子によってコードされた）ＲｇｈＲ２タンパク質は、１４０個のアミノ酸残基、約１６．１ｋＤａの分子量、＋４．５の理論的正味電荷及び９．３８の理論的等電点（ＰＩ）（一次アミノ酸配列に基づく分子量、正味電荷及びＰＩの計算）を含むが、他方配列番号２の（例えば、天然若しくはｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子によってコードされた）ＲｇｈＲ２タンパク質は、１３４個のアミノ酸残基、約１５．６ｋＤａの分子量、＋３．５の理論的正味電荷及び８．８５の理論的等電点（ＰＩ）（一次アミノ酸配列に基づく分子量、正味電荷及びＰＩの計算）を含む。同様に、Ｐｆａｍ解析（バージョン３１．０）を使用したＲｇｈＲ２タンパク質の評価は、ＲｇｈＲ２タンパク質が、ＨＴＨドメインが配列番号２のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸残基５〜５８内に含まれている、ＨＴＨファミリー＿３１（ＨＴＨ＿３１；ｃｌａｎ−０１２３）のヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）ドメインを含むことを示している。例えば、配列番号４の変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードするＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株のｒｇｈＲ２遺伝子は、６アミノ酸反復「ＡＡＡＩＳＲ」の重複を含むが（図１）、この６アミノ酸反復は、ＨＴＨドメイン（アミノ酸）配列のほぼ中央に所在する。
特定の理論、作用機序若しくは作用様式によって拘束されることを望むものではないが、本明細書では、配列番号４における配列「ＡＡＡＩＳＲ」の挿入（反復）は、転写調節因子としてのＲｇｈＲ２タンパク質の機能に有意な影響を及ぼす、又は完全に無効にさえすることが企図されている。例えば、転写調節因子として、ＲｇｈＲ２は、数個の他の遺伝子の発現を直接的及び間接的に調節するであろう（例えば、実施例３を参照されたい）。したがって、配列番号６に規定した「ＡＡＡＩＳＲ」アミノ酸反復をコードするこの１８ｂｐヌクレオチド重複によるＲｇｈＲ２の不活性化は、細胞の生理機能に影響を及ぼす、したがって、細胞増殖及び異種タンパク質産生のような因子に大きな影響を及ぼす可能性があると企図されている。より特別には、配列番号３の中に存在するこの１８ｂｐヌクレオチド重複が及ぼす大きな影響は、実施例２において、様々な異種酵素を産生するＢｒａ７（株）細胞内のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の誘導体のｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ｂｐ重複を取り除く（例えば、欠失させる）ことによって詳細に調査した。より特別には、図４に示したように、ｒｇｈＲ２の１８ｂｐ重複の欠失は、培養したときにバイオマス中での減少を示したが、同時に改良されたアミラーゼ産生力価（すなわち、関心対象のタンパク質の増加した産生）を証明した。したがって、図５に示したように、比生産性（酵素産生／ＯＤ６００）は、ｒｇｈＲ２の回復（すなわち、Δ１８ｂｐ重複）株において少なくとも係数２は改善された。
ＩＩＩ．Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）ｒｇｈＲ２変異細胞及びｒｇｈＲ２回復細胞において上方制御及び下方制御された遺伝子のトランスクリプトーム解析
実施例３において規定したように、Ｂｒａ７株細胞のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の誘導体（すなわち、１８ｂｐ重複を有するｒｇｈＲ２を含む；配列番号３）及びこの株のｒｇｈＲ２回復変異体（すなわち、１８ｂｐ重複の除去による；配列番号１）のトランスクリプトーム解析は、数個の遺伝子の転写がｒｇｈＲ２によって調節されることを明らかにした。例えば、ｒｇｈＲ２回復株において少なくとも２倍（すなわち、１８ｂｐ重複を含むｒｇｈＲ２不活性株に比較して）上方制御及び下方制御された遺伝子の転写は、実施例３、表２及び表３に示されている。
より特別には、本明細書では、ｒｇｈＲ２回復Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株（すなわち、配列番号２のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む）又はｒｇｈＲ２不活性化Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株（すなわち、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む）のいずれかでの表３における１つ以上の遺伝子の欠失、崩壊、不活性化又は下方制御が、ｒｇｈＲ２遺伝子の再活性化によって観察された作用（すなわち、ｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ｂｐ反復の除去／欠失を介して）に類似して、これらの改変宿主細胞内でのタンパク質産生にプラスの作用を有するであろうことは企図されている。そこで、実施例４に示したように、これらの遺伝子（すなわち、Ｂｌｉ０３６４４（配列番号１９）；ｙｖｚＣ（配列番号１７）；ａｂｒＢ１（配列番号２１）及びａｂｈ（配列番号２３））のサブセットの不活性化（例えば、欠失、崩壊又は下方制御）が異種タンパク質産生に及ぼす作用を探索した。例えば、Ｂｌｉ０３６４４、ａｂｒＢ１、ｙｖｚＣ及びａｂｈ遺伝子は、異種α−アミラーゼを産生するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７誘導体中への抗生物質マーカーの挿入によって不活性化した。そこで、アミラーゼ産生は、４つの単一ノックアウト株（すなわち、ΔＢＬｉ０３６４４、ΔａｂｒＢ１、ΔｙｖｚＣ及びΔａｂｈ）中で決定し、コントロールとしての親株と比較した（実施例２に記載したように）。より特別には、図７に示したように、Ｂｌｉ０３６４４、ａｂｒＢ１、ｙｖｚＣ及びａｂｈの不活性化は、改良されたアミラーゼ産生を生じさせたが、他方細胞増殖（ＯＤ６００）はあまり影響を受けなかった（すなわち、増加した比生産性（Ｑｐ）を示している）。
ＩＶ．分子生物学
上記に規定したように、本開示の所定の実施形態は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子の遺伝子改変を含む、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。他の実施形態では、配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、配列番号２のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子を含む、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。また別の他の実施形態では、本開示は、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子並びにａｂｒＢ１、ｒｐｍＪ、ｒｐＩＭ、ＢＬｉ００４１２、ｒａｐＫ、ｐｈｒＫ、ＢＬｉ００７５３、ｙｆｊＴ、ＢＬｉ００８２８、ｙｈｄＸ、ｙｈｚＣ、ｔｅｒｆ２、ｚｏｓＡ、ａｂｂＡ、ｓｐｅＧ、ｙｐｐＦ、ＢＬｉ０２５４３、ｍｎｔＲ、ＢＬｉ０２７６８、ｓｓｐＡ、ＢＬｉ０３１２７、ＢＬｉ０３６３５、ｍｒｇＡ、ＢＬｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ｒｇｈＲ１、ｓｐｏ０Ｆ、ｙｗｊＧ、ｙｗｑ１２、ＢＬｉ０４１９９、ＢＬｉ０４２００、ｌｉｃＴ、ｂｇｌＨ及びｂｇｌＰからなる群から選択される少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、不活性化する、又は下方制御する遺伝子改変を含む、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。また別の実施形態では、本開示は、配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子並びにａｂｒＢ１、ｒｐｍＪ、ｒｐＩＭ、ＢＬｉ００４１２、ｒａｐＫ、ｐｈｒＫ、ＢＬｉ００７５３、ｙｆｊＴ、ＢＬｉ００８２８、ｙｈｄＸ、ｙｈｚＣ、ｔｅｒｆ２、ｚｏｓＡ、ａｂｂＡ、ｓｐｅＧ、ｙｐｐＦ、ＢＬｉ０２５４３、ｍｎｔＲ、ＢＬｉ０２７６８、ｓｓｐＡ、ＢＬｉ０３１２７、ＢＬｉ０３６３５、ｍｒｇＡ、ＢＬｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ｒｇｈＲ１、ｓｐｏ０Ｆ、ｙｗｊＧ、ｙｗｑ１２、ＢＬｉ０４１９９、ＢＬｉ０４２００、ｌｉｃＴ、ｂｇｌＨ及びｂｇｌＰからなる群から選択される少なくとも１つの内在性Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子を欠失させる、崩壊させる、不活性化する、又は下方制御する遺伝子改変を含む、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。他の実施形態は、ＲｇｈＲ２タンパク質のＨＴＨドメインのコーディング配列を変化させる遺伝子改変に関する。
したがって、本開示の所定の実施形態は、改変（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）細胞を生成するために本開示の親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を遺伝子改変（変化）させるための組成物及び方法、並びにより特別には、（すなわち、（未改変）親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して）増加した量の関心対象の内在性若しくは異種タンパク質を産生する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を提供する。
そこで、本開示の所定の実施形態は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を遺伝子改変するための方法であって、その改変が、（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）内での１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳のために必要とされる調節要素内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子の崩壊、（ｃ）遺伝子の変換、（ｄ）遺伝子の欠失、（ｅ）遺伝子の下方制御、（ｆ）部位特異的変異誘発及び／又は（ｇ）ランダム突然変異誘発を含むがそれらに限定されない方法に向けられる。例えば、本明細書で使用する遺伝子改変には、ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ａｂｒＢ１、ｒｐｍＪ、ｒｐＩＭ、ＢＬｉ００４１２、ｒａｐＫ、ｐｈｒＫ、ＢＬｉ００７５３、ｙｆｊＴ、ＢＬｉ００８２８、ｙｈｄＸ、ｙｈｚＣ、ｔｅｒｆ２、ｚｏｓＡ、ａｂｂＡ、ｓｐｅＧ、ｙｐｐＦ、ＢＬｉ０２５４３、ｍｎｔＲ、ＢＬｉ０２７６８、ｓｓｐＡ、ＢＬｉ０３１２７、ＢＬｉ０３６３５、ｍｒｇＡ、ＢＬｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ｓｐｏ０Ｆ、ｙｗｊＧ、ｙｗｑ１２、ＢＬｉ０４１９９、ＢＬｉ０４２００、ｌｉｃＴ、ｂｇｌＨ及びｂｇｌＰからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の改変が含まれるがそれらに限定されない。
所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、当分野において周知である方法、例えば、挿入、崩壊、置換又は欠失を使用して、上記に規定した遺伝子の発現を減少させる、又は排除することによって構築される。改変若しくは不活性化対象の遺伝子の部分は、例えば、コーディング領域又はコーディング領域を発現させるために必要とされる調節要素であってよい。
そのような調節配列若しくは制御配列の例は、プロモーター配列若しくはその機能的部分（すなわち、核酸配列の発現に影響を及ぼすために十分である部分）であり得る。改変のための他の制御配列には、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、転写活性化因子などが含まれるがそれらに限定されない。
所定の他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、本開示の上記の遺伝子の少なくとも１つの発現を排除若しくは減少させるための遺伝子欠失によって構築される。遺伝子欠失技術は、遺伝子の部分的若しくは完全除去を可能にし、それによりそれらの発現を排除する、又は非機能的（若しくは活性が減少した）タンパク質産物を発現させる。そのような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子をフランキングする５’及び３’領域を隣接して含有するために構築されていたプラスミドを使用する相同組み換えによって遂行され得る。隣接する５’及び３’領域は、例えば、プラスミドが細胞内で樹立されることを可能にする許容温度で第２選択可能マーカーと会合しているｐＥ１９４などの感温性プラスミド上のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内に導入され得る。細胞はその後、相同フランキング領域の１つで染色体内に組み込まれたプラスミドを有する細胞を選択するために非許容温度へ転位させられる。プラスミドを組み込むための選択は、第２選択可能マーカーについての選択によって実施される。組み込み後、第２相同フランキング領域でさえの組み換えは、選択せずに細胞を数世代にわたり許容温度へ転位させることによって刺激される。細胞は、単一コロニーを得るためにプレーティングされ、コロニーは両方の選択可能マーカーの消失について試験される（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３を参照されたい）。したがって、当業者であれば（例えば、ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ａｂｒＢ１、ｒｐｍＪ、ｒｐＩＭ、ＢＬｉ００４１２、ｒａｐＫ、ｐｈｒＫ、ＢＬｉ００７５３、ｙｆｊＴ、ＢＬｉ００８２８、ｙｈｄＸ、ｙｈｚＣ、ｔｅｒｆ２、ｚｏｓＡ、ａｂｂＡ、ｓｐｅＧ、ｙｐｐＦ、ＢＬｉ０２５４３、ｍｎｔＲ、ＢＬｉ０２７６８、ｓｓｐＡ、ＢＬｉ０３１２７、ＢＬｉ０３６３５、ｍｒｇＡ、ＢＬｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ｓｐｏ０Ｆ、ｙｗｊＧ、ｙｗｑ１２、ＢＬｉ０４１９９、ＢＬｉ０４２００、ｌｉｃＴ、ｂｇｌＨ及びｂｇｌＰ遺伝子（核酸）配列並びにそれらのコードされたタンパク質配列を参照することにより）、完全若しくは部分的欠失のために好適な遺伝子のコーディング配列及び／又は遺伝子の非コーディング配列内のヌクレオチド領域を容易に同定することができよう。
他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、それらの転写若しくは翻訳のために必要とされる遺伝子若しくは調節要素内の１つ以上のヌクレオチドを導入する、置換する、又は除去することによって構築される。例えば、ヌクレオチドは、停止コドンの導入、開始コドンの除去又はオープンリーディングフレームのフレームシフトを生じさせるように挿入又は除去され得る。そのような改変は、当分野において公知の方法にしたがって、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ生成突然変異誘発によって実施され得る（例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｌｅ，１９８５；Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９及びＳａｒｋａｒ ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ，１９９０を参照されたい）。したがって、所定の実施形態では、本開示の遺伝子は、完全若しくは部分的欠失によって不活性化される。
また別の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、遺伝子変換のプロセスによって構築される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ ａｎｄ Ｔｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照されたい）。例えば、遺伝子変換法では、遺伝子に対応する核酸配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させられて欠陥のある核酸配列を産生し、この核酸配列は、その後親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に形質転換されて欠陥のある遺伝子を産生する。相同組み換えによって、欠陥のある核酸配列は、内在性遺伝子に取って代わる。欠陥のある遺伝子若しくは遺伝子断片が、欠陥のある遺伝子を含有する形質転換体を選択するために使用され得るマーカーもまたコードするのが望ましい場合がある。例えば、欠陥のある遺伝子は、選択可能マーカーと会合している非複製プラスミド若しくは感温性プラスミド上で導入され得る。プラスミドを組み込むための選択は、プラスミド複製を許容しない条件下でのマーカーについての選択によって実施される。遺伝子置換をもたらす第２組み換え事象についての選択は、選択可能マーカーの消失及び突然変異遺伝子の獲得についてのコロニーの調査によって実施される（Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３）。又は、欠陥のある核酸配列は、下記で記載するように、遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠失を含有し得る。
他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、遺伝子の核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を使用する確立されたアンチセンス技術によって構築される（Ｐａｒｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔｏｋｅｒ，１９９７）。より詳細には、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞による遺伝子の発現は、この遺伝子の核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を導入することにより低減させる（下方制御する）又は排除することができ、これは細胞内で転写されることがあり、この細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。そこで、相補的アンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズすることを許容する条件下では、翻訳されるタンパク質の量は低減又は除去される。そのようなアンチセンス法には、それらに限定されないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれ、これらは全部が当業者であれば周知である。
他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集によって産生／構築される。例えば、ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ａｂｒＢ１、ｒｐｍＪ、ｒｐＩＭ、ＢＬｉ００４１２、ｒａｐＫ、ｐｈｒＫ、ＢＬｉ００７５３、ｙｆｊＴ、ＢＬｉ００８２８、ｙｈｄＸ、ｙｈｚＣ、ｔｅｒｆ２、ｚｏｓＡ、ａｂｂＡ、ｓｐｅＧ、ｙｐｐＦ、ＢＬｉ０２５４３、ｍｎｔＲ、ＢＬｉ０２７６８、ｓｓｐＡ、ＢＬｉ０３１２７、ＢＬｉ０３６３５、ｍｒｇＡ、ＢＬｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ｓｐｏ０Ｆ、ｙｗｊＧ、ｙｗｑ１２、ＢＬｉ０４１９９、ＢＬｉ０４２００、ｌｉｃＴ、ｂｇｌＨ及び／又はｂｇｌＰをコードする遺伝子は、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）及びＣｐｆ１若しくはガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）のいずれかを結合することによってそれらの標的ＤＮＡを見出す核酸誘導エンドヌクレアーゼによって崩壊（又は欠失若しくは下方制御）され得るが、ここでエンドヌクレアーゼはＤＮＡ内で一本鎖若しくは二本鎖切断を生成できる。この標的化ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ修復のための基質となり、遺伝子を崩壊若しくは欠失させるための提供された編集鋳型と再結合し得る。例えば、核酸誘導エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子（このためにはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９）又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターと機能的に連結しており、これによりバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｃａｓ９発現カセットが作成される。同様に、関心対象の遺伝子に固有の１つ以上の標的部位は、当業者であれば容易に同定できる。例えば、関心対象の遺伝子内の標的部位に向けられたｇＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を構築するためには、可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）は、そのヌクレオチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＣＥＲ）に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメインをコードするＤＮＡに融合している、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＧＧ）の５’側である標的部位のヌクレオチドを含むであろう。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組み合わせは、それによりｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。したがって、ｇＲＮＡのためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現カセットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターにｇＲＮＡをコードするＤＮＡを機能的に連結させることによって作成される。
所定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列を用いて修復／置換される。例えば、上述したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生成されたＤＮＡ切断を精密に修復するためには、細胞のＤＮＡ修復機構が編集鋳型を利用できるように、ヌクレオチド編集鋳型が提供される。例えば、標的化遺伝子の約５００ｂｐの５’側は、編集鋳型を生成するために標的化遺伝子の約５００ｂｐの３’側に融合させることができ、その鋳型は、ＲＧＥＮによって生成されたＤＮＡ切断を修復するためにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主の機構によって使用される。
Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集鋳型は、多数の様々な方法（例えば、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、天然コンピテンス又は誘導コンピテンス）を使用して糸状菌細胞に共送達することができる。形質転換細胞は、遺伝子座をフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅させることによる、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅させることによってスクリーニングされる。これらのプライマーは、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集されている改変遺伝子座を増幅させることができる。これらの断片は、次に編集されたコロニーを同定するためにシーケンシングプライマーを使用してシーケンシングされる（例えば、下記の実施例６及び７を参照されたい）。
さらに他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、化学的突然変異誘発（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，１９７０を参照されたい）及び転座（例えば、Ｙｏｕｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３を参照されたい）を含むがそれらに限定されない当分野において周知の方法を使用して、ランダム突然変異誘発又は特異的突然変異誘発によって構築される。遺伝子の改変は、親細胞に突然変異誘発を受けさせること、及びその中で遺伝子の発現が低減若しくは排除されている突然変異細胞についてスクリーニングすることによって実施され得る。特異的であってもランダムであってもよい突然変異誘発は、例えば、好適な物理的若しくは化学的変異誘発剤の使用によって、好適なオリゴヌクレオチドの使用によって、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発（ＰＣＲ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）にかけることによって実施され得る。さらに、この突然変異誘発は、これらの突然変異誘発法の任意の組合せの使用により実施され得る。
本発明のために好適な物理的若しくは化学的突然変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチドアナログが挙げられる。そのような薬剤を使用する場合、突然変異誘発は、典型的には、好適な条件下で最適な変異誘発剤の存在下で突然変異誘発対象の親細胞をインキュベートする工程、及び遺伝子の減少した発現を示す、又は発現を示さない突然変異細胞を選択する工程によって実施される。
所定の他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ａｂｒＢ１、ｒｐｍＪ、ｒｐＩＭ、ＢＬｉ００４１２、ｒａｐＫ、ｐｈｒＫ、ＢＬｉ００７５３、ｙｆｊＴ、ＢＬｉ００８２８、ｙｈｄＸ、ｙｈｚＣ、ｔｅｒｆ２、ｚｏｓＡ、ａｂｂＡ、ｓｐｅＧ、ｙｐｐＦ、ＢＬｉ０２５４３、ｍｎｔＲ、ＢＬｉ０２７６８、ｓｓｐＡ、ＢＬｉ０３１２７、ＢＬｉ０３６３５、ｍｒｇＡ、ＢＬｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ｓｐｏ０Ｆ、ｙｗｊＧ、ｙｗｑ１２、ＢＬｉ０４１９９、ＢＬｉ０４２００、ｌｉｃＴ、ｂｇｌＨ及びｂｇｌＰから選択される内在性遺伝子の欠失を含む。したがって、所定のこれらの実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、上述したように構築される。
他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ａｂｒＢ１、ｒｐｍＪ、ｒｐＩＭ、ＢＬｉ００４１２、ｒａｐＫ、ｐｈｒＫ、ＢＬｉ００７５３、ｙｆｊＴ、ＢＬｉ００８２８、ｙｈｄＸ、ｙｈｚＣ、ｔｅｒｆ２、ｚｏｓＡ、ａｂｂＡ、ｓｐｅＧ、ｙｐｐＦ、ＢＬｉ０２５４３、ｍｎｔＲ、ＢＬｉ０２７６８、ｓｓｐＡ、ＢＬｉ０３１２７、ＢＬｉ０３６３５、ｍｒｇＡ、ＢＬｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ｓｐｏ０Ｆ、ｙｗｊＧ、ｙｗｑ１２、ＢＬｉ０４１９９、ＢＬｉ０４２００、ｌｉｃＴ、ｂｇｌＨ及びｂｇｌＰから選択される内在性遺伝子の崩壊を含む。所定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド崩壊カセットは、マーカー遺伝子を含む。
他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ａｂｒＢ１、ｒｐｍＪ、ｒｐＩＭ、ＢＬｉ００４１２、ｒａｐＫ、ｐｈｒＫ、ＢＬｉ００７５３、ｙｆｊＴ、ＢＬｉ００８２８、ｙｈｄＸ、ｙｈｚＣ、ｔｅｒｆ２、ｚｏｓＡ、ａｂｂＡ、ｓｐｅＧ、ｙｐｐＦ、ＢＬｉ０２５４３、ｍｎｔＲ、ＢＬｉ０２７６８、ｓｓｐＡ、ＢＬｉ０３１２７、ＢＬｉ０３６３５、ｍｒｇＡ、ＢＬｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ｓｐｏ０Ｆ、ｙｗｊＧ、ｙｗｑ１２、ＢＬｉ０４１９９、ＢＬｉ０４２００、ｌｉｃＴ、ｂｇｌＨ及びｂｇｌＰから選択される下方制御された内在性遺伝子を含む。例えば、所定の実施形態では、上記に規定した１つ以上の遺伝子を下方制御する工程は、その遺伝子の上流若しくは下流の調節要素を欠失させる、又は崩壊させる工程を含む。
国際公開第２００３／０８３１２５号パンフレットは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を迂回するためにＰＣＲ融合を使用する、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）欠失株及びＤＮＡ構築物の作成などの、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法を開示している。国際公開第２００２／１４４９０号パンフレットは、（１）統合的プラスミド（ｐＣｏｍＫ）の構築及び形質転換、（２）コーディング配列、シグナル配列及びプロペプチド配列のランダム突然変異誘発、（３）相同組み換え、（４）形質転換ＤＮＡに非相同フランクを付加することにより形質転換効率を増加させること、（５）二重交差組み込みを最適化すること、（６）部位特異的突然変異誘発、及び（７）マーカーレス欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法を開示している。
当業者であれば、細菌細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．））中にポリヌクレオチド配列を導入するために好適な方法を十分に承知している（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６７；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，１９８５；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８１及びＭｃＤｏｎａｌｄ，１９８４を参照されたい）。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合、形質導入並びにプロトプラスト融合を含む形質転換などの方法は公知であり、本開示での使用に適している。形質転換法は、特に、本開示のＤＮＡ構築物を宿主細胞内に導入するために好ましい。
一般に使用される方法に加えて、一部の実施形態では、宿主細胞は、直接的に形質転換させられる（すなわち、宿主細胞内に導入する前にＤＮＡ構築物を増幅させるために、又はさもなければプロセシングするために中間細胞が使用されない）。ＤＮＡ構築物の宿主細胞内への導入には、プラスミド若しくはベクター内へ挿入することなく、ＤＮＡを宿主細胞内に導入するために当分野において公知であるそれらの物理的及び化学的方法が含まれる。そのような方法としては、限定されないが、塩化カルシウム沈降法、エレクトロポレーション法、裸のＤＮＡ法、リポソーム法などが挙げられる。追加の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、プラスミドに挿入することなく、プラスミドと共に同時形質転換させられる。また別の実施形態では、選択マーカーは、当分野において公知の方法によって改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株から欠失させられる、又は実質的に切除される（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４及びＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照されたい）。一部の実施形態では、宿主染色体由来のベクターの分解は、染色体内のフランキング領域を残すが、他方では固有の染色体領域を除去する。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内での遺伝子の発現において使用するためのプロモーター及びプロモーター配列、それらのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又はそれらの変異配列は、一般に当業者には公知である。本開示のプロモーター配列は、一般に、それらがバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（例えば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞など）内で機能的であるように選択される。所定の典型的なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロモーター配列は、表６に提示した。同様に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内での遺伝子発現を駆動するために有用なプロモーターには、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）プロモーター（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラーゼプロモーター（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８３）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα−アミラーゼプロモーター（Ｔａｒｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の天然プロテアーゼ（ｎｐｒＥ）プロモーター（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、突然変異ａｐｒＥプロモーター（国際公開第２００１／５１６４３号パンフレット）又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）若しくは他の関連バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の任意の他のプロモーターが含まれるが、それらに限定されない。所定の他の実施形態では、プロモーターは、米国特許出願公開第２０１４／０３２９３０９号明細書に開示されたリボソームタンパク質プロモーター若しくはリボソームＲＮＡプロモーター（例えば、ｒｒｎＩプロモーター）である。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で広範囲の活性（プロモーター強度）を備えるプロモーターライブラリーをスクリーニング及び作成するための方法は、国際公開第２００３／０８９６０４号パンフレットに記載されている。
Ｖ．関心対象のタンパク質を産生するための改変細胞の培養
他の実施形態では、本開示は、未改変（親）細胞と比較して（すなわち、それに対して）改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞のタンパク質生産性を増加させるための方法を提供する。所定の実施形態では、本開示は、改変細菌細胞を発酵させる／培養する工程を含む関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法に向けられるが、ここで改変細胞は、ＰＯＩを培養培地中に分泌する。本開示の改変及び未改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を発酵させるためには、当該技術分野で周知の発酵方法を適用することができる。
一部の実施形態では、細胞は、バッチ又は連続発酵条件下で培養される。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵中には変更されない閉鎖系である。発酵の開始時に、培地には所望の生物が接種される。この方法では、この系にいかなる成分も添加することなく醗酵が許容される。典型的には、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度などの因子を制御することが頻繁に行われる。バッチシステムの代謝産物及びバイオマス組成物は、発酵が停止される時点まで絶えず変化する。典型的なバッチ培養内では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が減少若しくは停止する静止期に進む。未処理であれば、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞は、生成物の大部分の産生を担っている。
標準バッチ系に関する好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。典型的なバッチ系のこの変形形態では、発酵が進行するにつれて基質が徐々に加えられる。フェドバッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を抑制する可能性が高い場合、及び培地中で限定量の基質を有することが所望である場合に有用である。フェドバッチ系内での実際の基質濃度の測定は困難であり、このため例えばｐＨ、溶存酸素及びＣＯ２などの排気ガスの部分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において一般的であり、公知である。
連続発酵は、定義された発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、同時に処理のために等量の馴化培地が除去される開放系である。連続発酵は、一般に、細胞が主として対数増殖期にある一定の高密度で培養を維持する。連続発酵は、細胞の増殖及び／又は産生物の濃度に影響を及ぼす１つ以上の因子の調節を許容する。例えば、１つの実施形態では、例えば炭素源又は窒素源などの制限栄養素が一定比率で維持され、他の全てのパラメータは調節することができる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子は連続的に変化させられ得る。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度と平衡させられなければならない。連続発酵プロセスのための栄養素及び増殖因子を調節する方法並びに産物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の分野においては周知である。
したがって、所定の実施形態では、形質転換（改変）宿主細胞によって産生されたＰＯＩは、従来の手順、例えば、宿主細胞を培地から遠心分離若しくは濾過によって分離する、又は、必要であれば、細胞を破壊し、上清を細胞破砕物及び残屑から取り除くことによって、培養培地から回収することができる。典型的には、清浄化後、上清若しくは濾液のタンパク質成分は、塩、例えば、硫酸アンモニウムによって沈澱させられる。その後、沈澱したタンパク質は可溶化され、様々なクロマトグラフ法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過によって精製され得る。
ＶＩ．改変（宿主）細胞により産生される関心対象のタンパク質
本開示の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、任意の内在性若しくは異種タンパク質であってよく、そのようなＰＯＩの変異体であってよい。タンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有し得る、又はその機能的形態が単量体若しくは多量体であるタンパク質であり、すなわち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一（相同）若しくは非同一（異種）サブユニットから構成され、ここで、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、好ましくは関心対象の特性を備えるタンパク質である。
例えば、下記の実施例の項において規定するように、本開示の改変（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、増加した量の異種ＰＯＩ（例えば、実施例２及び５に規定した異種アミラーゼ）を産生するが、他方培養された場合はバイオマス中での減少を示す。したがって、所定の実施形態では、本開示の改変細胞は、内在性ＰＯＩ、異種ＰＯＩ又はそれらの１つ以上の組み合わせを発現する。例えば、所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、その未改変（親）細胞と比較して、少なくとも約０．５％超、少なくとも約１％超、少なくとも約５％超、少なくとも約６％超、少なくとも約７％超、少なくとも約８％超、少なくとも約９％超又は少なくとも約１０％以上のＰＯＩを産生する。
所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、（未改変）親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、ＰＯＩの増加した比生産性（Ｑｐ）を示す。例えば、比生産性（Ｑｐ）の検出は、タンパク質産生を評価するための好適な方法である。比生産性（Ｑｐ）は、下記の方程式：
「Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ」
（式中、「ｇＰ」は、タンク中で産生したタンパク質のグラム数であり；「ｇＤＣＷ」は、タンク中の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラム数であり、「ｈｒ」は、産生時間並びに増殖時間を含む、接種時点からの発酵時間である）によって決定できる。
したがって、所定の他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、未改変（親）細胞と比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の比生産性（Ｑｐ）の増加を含む。
所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｌｙｓａｓｅｓ）、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
したがって、所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、酵素番号（ＥＣ）のＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５若しくはＥＣ６から選択される酵素である。
例えば、所定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ１．１０．３．２（例えば、ラッカーゼ）、ＥＣ１．１０．３．３（例えば、Ｌ−アスコルビン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．１（例えば、アルコール脱水素酵素）、ＥＣ１．１１．１．１０（例えば、塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１７（例えば、ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．２７（例えば、Ｌ−乳酸脱水素酵素）、ＥＣ１．１．１．４７（例えば、グルコース１−脱水素酵素）、ＥＣ１．１．３．Ｘ（例えば、グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（例えば、ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．Ｘ（例えば、ジオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．１２（例えば、リノール酸１３Ｓ−リポキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１．３．１３（例えば、アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１４．１４．１（例えば、モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１４．１８．１（例えば、モノフェノールモノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１５．１．１（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、ＥＣ１．１．５．９（以前のＥＣ１．１．９９．１０、例えば、グルコース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．１８（例えば、セロビオース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．２９（例えば、ピラノース脱水素酵素）、ＥＣ１．２．１．Ｘ（例えば、脂肪酸還元酵素）、ＥＣ１．２．１．１０（例えば、アセトアルデヒド脱水素酵素）、ＥＣ１．５．３．Ｘ（例えば、フルクトシルアミン還元酵素）、ＥＣ１．８．１．Ｘ（例えば、ジスルフィド還元酵素）及びＥＣ１．８．３．２（例えば、チオールオキシダーゼ）から選択されるＥＣ１酵素（酸化還元酵素）を含むがそれらに限定されない酸化還元酵素である。
所定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ２．３．２．１３（例えば、トランスグルタミナーゼ）、ＥＣ２．４．１．Ｘ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４０（例えば、アルテルナスクラーゼ（ａｌｔｅｒｎａｓｕｃｒａｓｅ）、ＥＣ２．４．１．１８（例えば、１，４α−グルカン分枝酵素）、ＥＣ２．４．１．１９（例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２（例えば、デキストリンデキストラナーゼ）、ＥＣ２．４．１．２０（例えば、セロビオースホスホリラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２５（例えば、４−α−グルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．３３３（例えば、１，２−β−オリゴグルカンリントランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４（例えば、アミロスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．５（例えば、デキストランスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．６９（例えば、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．９（例えば、イヌロスクラーゼ）、ＥＣ２．７．１．１７（例えば、キシルロキナーゼ）、ＥＣ２．７．７．８９（以前のＥＣ３．１．４．１５、例えば、［グルタミンシンテターゼ］−アデニリル−Ｌ−チロシンホスホリラーゼ）、ＥＣ２．７．９．４（例えば、αグルカンキナーゼ）及びＥＣ２．７．９．５（例えば、ホスホグルカンキナーゼ）から選択されるＥＣ２（トランスフェラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないトランスフェラーゼ酵素である。
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ３．１．Ｘ．Ｘ（例えば、エステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．１（例えば、ペクチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．１４（例えば、クロロフィラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２０（例えば、タンナーゼ）、ＥＣ３．１．１．２３（例えば、グリセロール−エステルアシルヒドロラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２６（例えば、ガラクトリパーゼ）、ＥＣ３．１．１．３２（例えば、ホスホリパーゼＡ１）、ＥＣ３．１．１．４（例えば、ホスホリパーゼＡ２）、ＥＣ３．１．１．６（例えば、アセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７２（例えば、アセチルキシランエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７３（例えば、フェルロイルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７４（例えば、クチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．８６（例えば、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．８７（例えば、フモシンＢ１エステラーゼ）、ＥＣ３．１．２６．５（例えば、リボヌクレアーゼＰ）、ＥＣ３．１．３．Ｘ（例えば、リン酸加水分解酵素）、ＥＣ３．１．３０．１（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ヌクレアーゼＳ１）、ＥＣ３．１．３０．２（例えば、セルチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼ）、ＥＣ３．１．３．１（例えば、アルカリホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．２（例えば、酸性ホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．８（例えば、３−フィターゼ）、ＥＣ３．１．４．１（例えば、ホスホジエステラーゼＩ）、ＥＣ３．１．４．１１（例えば、ホスホイノシチドホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．３（例えば、ホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．４（例えば、ホスホリパーゼＤ）、ＥＣ３．１．６．１（例えば、アリールスルファターゼ）、ＥＣ３．１．８．２（例えば、ジイソプロピル−フルオロホスファターゼ）、ＥＣ３．２．１．１０（例えば、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１０１（例えば、マンナンエンド−１，６−α−マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１１（例えば、α−１，６−グルカン−６−グルカノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３１（例えば、キシランα−１，２−グルクロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３２（例えば、キトサンＮ−アセチルグルコサミノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３９（例えば、α−グルクロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１４（例えば、キチナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５１（例えば、キシログルカン特異的エンド−β−１，４−グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５５（例えば、キシログルカン特異的エキソ−β−１，４−グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１６４（例えば、ガラクタンエンド−１，６−β−ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７（例えば、リゾチーム）、ＥＣ３．２．１．１７１（例えば、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７４（例えば、ラムノガラクツロナンラムノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２（例えば、β−アミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２０（例えば、α−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２２（例えば、α−ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２５（例えば、β−マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２６（例えば、β−フルクトフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３７（例えば、キシラン１，４−β−キシロシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３９（例えば、グルカンエンド−１，３−β−Ｄ−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．４０（例えば、α−Ｌ−ラムノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５１（例えば、α−Ｌ−フコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５２（例えば、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５５（例えば、α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５８（例えば、グルカン１，３−β−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５９（例えば、グルカンエンド−１，３−α−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６７（例えば、ガラクツラン１，４−α−ガクツロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６８（例えば、イソアミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７（例えば、１−β−Ｄ−フルクタンフルクタノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７４（例えば、グルカン１，４−β−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７５（例えば、グルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７７（例えば、マンナン１，２−（１，３）−α−マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８０（例えば、フルクタンβ−フルクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８２（例えば、エキソ−ポリ−α−ガラクツロニシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８３（例えば、κ−カラギナーゼ）、ＥＣ３．２．１．８９（例えば、アラビノガラクタンエンド−１，４−β−ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９１（例えば、セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９６（例えば、マンノシル−グリコプロテインエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９９（例えば、アラビナンエンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ）、ＥＣ３．４．Ｘ．Ｘ（例えば、ペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．Ｘ（例えば、アミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１（例えば、ロイシルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１８（例えば、メチオニルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１３．９（例えば、Ｘａａ−Ｐｒｏジペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１４．５（例えば、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ）、ＥＣ３．４．１６．Ｘ（例えば、セリン型カルボキシペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１６．５（例えば、カルボキシペプチダーゼＣ）、ＥＣ３．４．１９．３（例えば、ピログルタミル−ペプチダーゼＩ）、ＥＣ３．４．２１．Ｘ（例えば、セリンエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．１（例えば、キモトリプシン）、ＥＣ３．４．２１．１９（例えば、グルタミルエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．２６（例えば、プロリルオリゴペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．４（例えば、トリプシン）、ＥＣ３．４．２１．５（例えば、トロンビン）、ＥＣ３．４．２１．６３（例えば、オリジン）、ＥＣ３．４．２１．６５（例えば、テルモミコリン）、ＥＣ３．４．２１．８０（例えば、ストレプトグリシンＡ）、ＥＣ３．４．２２．Ｘ（例えば、システインエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２２．１４（例えば、アクチニダイン）、ＥＣ３．４．２２．２（例えば、パパイン）、ＥＣ３．４．２２．３（例えば、フィカイン）、ＥＣ３．４．２２．３２（例えば、ステムブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．３３（例えば、フルーツブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．６（例えば、キモパパイン）、ＥＣ３．４．２３．１（例えば、ペプシンＡ）、ＥＣ３．４．２３．２（例えば、ペプシンＢ）、ＥＣ３．４．２３．２２（例えば、エンドチアペプシン）、ＥＣ３．４．２３．２３（例えば、ムコールペプシン）、ＥＣ３．４．２３．３（例えば、ガストリクシン）、ＥＣ３．４．２４．Ｘ（例えば、メタロエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２４．３９（例えば、ドイテロリシン）、ＥＣ３．４．２４．４０（例えば、セラリシン）、ＥＣ３．５．１．１（例えば、アスパラギナーゼ）、ＥＣ３．５．１．１１（例えば、ペニシリンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．１４（例えば、Ｎ−アシル−脂肪族−Ｌ−アミノ酸アミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２（例えば、Ｌ−グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２８（例えば、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４（例えば、アミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４４（例えば、タンパク質−Ｌ−グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．５（例えば、ウレアーゼ）、ＥＣ３．５．１．５２（例えば、ペプチド−Ｎ（４）−（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．８１（例えば、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ）、ＥＣ３．５．４．６（例えば、ＡＭＰデアミナーゼ）及びＥＣ３．５．５．１（例えば、ニトリラーゼ）から選択されるＥＣ３（ヒドロラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないヒドロラーゼ酵素である。
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ４．１．２．１０（例えば、マンデロニトリルリアーゼ）、ＥＣ４．１．３．３（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ）、ＥＣ４．２．１．１（例えば、炭酸脱水酵素）、ＥＣ４．２．２．−（例えば、ラムノガラクツロナンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．１０（例えば、ペクチンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２２（例えば、ペクチン酸三糖リアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２３（例えば、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ）及びＥＣ４．２．２．３（例えば、マンヌロン酸特異的アルギン酸リアーゼ）から選択されるＥＣ４（リアーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリアーゼ酵素である。
所定の他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ５．１．３．３（例えば、アルドース１−エピメラーゼ）、ＥＣ５．１．３．３０（例えば、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ）、ＥＣ５．４．９９．１１（例えば、イソマルツロースシンターゼ）及びＥＣ５．４．９９．１５（例えば、（１→４）−α−Ｄ−グルカン１−α−Ｄ−グルコシルムターゼ）から選択されるＥＣ５（イソメラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないイソメラーゼ酵素である。
さらに他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ６．２．１．１２（例えば、４−クマリン酸塩：補酵素Ａリガーゼ）及びＥＣ６．３．２．２８（例えば、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ）９から選択されるＥＣ６（リガーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリガーゼ酵素である。
したがって、所定の実施形態では、工業用プロテアーゼを産生するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、特に好ましい発現宿主を提供する。同様に、所定の他の実施形態では、工業用アミラーゼを産生するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、特に好ましい発現宿主を提供する。
例えば、典型的にはバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）によって分泌されるプロテアーゼには、２つの一般型、すなわち、中性（若しくは「金属プロテアーゼ」）及びアルカリ性（若しくは「セリン」）プロテアーゼがある。例えば、バチルス・サブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）タンパク質（酵素）は、本開示において使用するための典型的なセリンプロテアーゼである。極めて様々なバチルス・サブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、例えば、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７及びサブチリシン３０９が同定及びシーケンシングされている（例えば、国際公開第１９８９／０６２７９号パンフレット；及びＳｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照されたい）。本開示の一部の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）（すなわち、変異）プロテアーゼを産生する。数多くの参考文献、例えば国際公開第１９９９／２０７７０号パンフレット；同第１９９９／２０７２６号パンフレット；同第１９９９／２０７６９号パンフレット；同第１９８９／０６２７９号パンフレット；米国再発行特許第３４，６０６号明細書；米国特許第４，９１４，０３１号明細書；同第４，９８０，２８８号明細書；同第５，２０８，１５８号明細書；同第５，３１０，６７５号明細書；同第５，３３６，６１１号明細書；同第５，３９９，２８３号明細書；同第５，４４１，８８２号明細書；同第５，４８２，８４９号明細書；同第５，６３１，２１７号明細書；同第５，６６５，５８７号明細書；同第５，７００，６７６号明細書；同第５，７４１，６９４号明細書；同第５，８５８，７５７号明細書；同第５，８８０，０８０号明細書；同第６，１９７，５６７号明細書及び同第６，２１８，１６５号明細書は、変異プロテアーゼの例を提供する。したがって、所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、プロテアーゼをコードする発現構築物を含む。
所定の他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、アミラーゼをコードする発現構築物を含む。広範囲のアミラーゼ酵素及びそれらの変異体は、当業者には公知である。例えば、国際公開第２００６／０３７４８４号パンフレット及び同第２００６／０３７４８３号パンフレットは、改善された溶媒安定性を有する変異α−アミラーゼを開示しており、国際公開第１９９４／１８３１４号パンフレットは、酸化的に安定性であるα−アミラーゼ変異体について記載しており、国際公開第１９９９／１９４６７号パンフレット、同第２０００／２９５６０号パンフレット及び同第２０００／６００５９号パンフレットは、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第２００８／１１２４５９号パンフレットは、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番に由来するα−アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第１９９９／４３７９４号パンフレットは、マルト生成α−アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第１９９０／１１３５２号パンフレットは、超耐熱性α−アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第２００６／０８９１０７号パンフレットは、粒状デンプン加水分解活性を有するα−アミラーゼ変異体を開示している。
他の実施形態では、本開示の改変細胞内で発現及び産生したＰＯＩ若しくは変異ＰＯＩは、ペプチド、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、ＨＰＶ Ｅ７など）、及びそれらの変異体、それらの断片などである。他のタイプの関心対象のタンパク質（若しくは変異体）は、食品又は作物に栄養価を提供することのできるタンパク質であり得る。非限定的な例としては、抗栄養因子の形成を阻害できる植物タンパク質及びより望ましいアミノ酸組成（例えば、非トランスジェニック植物より高いリシン含量）を有する植物タンパク質が挙げられる。
細胞内及び細胞外で発現したタンパク質の活性を検出及び測定するためには、当業者には公知の様々な方法がある。特に、プロテアーゼについては、２８０ｎｍでの吸光度として測定される、又はフォリン法を使用して比色定量により測定されるカゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイがある（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。他のアッセイには、発色性基質の可溶化が包含される（例えば、Ｗａｒｄ，１９８３を参照されたい）。他の典型的なアッセイとしては、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラ−ニトロアニリドアッセイ（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当業者には公知である多数の追加の文献は、好適な方法を提供する（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４及びＨｓｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照されたい）。
国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットは、本明細書に記載したアミラーゼ活性のために有用なＣｅｒａｌｐｈａ α−アミラーゼ活性アッセイを開示している。
宿主細胞中の関心対象のタンパク質の分泌レベルを決定し、発現したタンパク質を検出するための手段には、タンパク質に特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体いずれかを用いるイムノアッセイの使用が挙げられる。その例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本開示の一部の態様は、限定するものと解釈すべきでない以下の実施例に照らせばさらに理解することができる。材料及び方法の変更は、当業者には明白であろう。
実施例１
バチルス・リケニフォルミス（ＢＡＣＩＬＬＵＳ ＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）株のｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ｂｐ配列の重複
バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＤＳＭ１３株（ＡＴＴＣ１４５８０）は、推定ＨＴＨ型転写調節因子をコードするｒｇｈＲ２（ＢＬｉ０３６４７）と命名された遺伝子を含有する。Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＤＳＭ１３のｒｇｈＲ２の核酸配列は、配列番号１に示されており、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＤＳＭ１３のＲｇｈＲ２タンパク質のコードされたアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。
（ａ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株、（ｂ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７誘導体、（ｃ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＡＴＣＣ−９７８９株（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ／９７８９．ａｓｐｘ）及び（ｄ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＡＴＣＣ−６５９８株（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｅｎ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ／６５９８．ａｓｐｘ）のゲノムのシーケンシングは、これらのＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の全部がｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチドの重複を有することを明らかにし、１８ｂｐヌクレオチド重複は、配列番号３：ＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＧＡに示されている。
したがって、（ａ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株のｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号３）のヌクレオチド配列は、配列番号３に示したように、（ｂ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７誘導体、（ｃ）ＡＴＣＣ−９７８９及び（ｄ）ＡＴＣＣ−６５９８のｒｇｈＲ２遺伝子のヌクレオチド配列と同一である。同様に、配列番号４に示したように、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株（配列番号５）のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７誘導体、ＡＴＣＣ−９７８９及びＡＴＣＣ−６５９８のＲｇｈＲ２のアミノ酸配列と同一である。
反復アミノ酸（ＡＡＡＩＳＲ）を例示している、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株のＲｇｈＲ２アミノ酸配列（配列番号４）とＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＤＳＭ１３株のＲｇｈＲ２アミノ酸配列（配列番号２）とのアラインメントは、図１に示した。配列「ＡＡＡＩＳＲ」の挿入は、図８に示したようにヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）ドメイン内にあり、配列特異的ＤＮＡ結合部位の近くにある。挿入は、ｒｇｈＲ２転写調節因子（すなわち、実質的に不活性な転写調節タンパク質）の「機能」に有意な影響を及ぼす、又は完全に無効にさえすると予測することができる。例えば、転写調節因子として、ＲｇｈＲ２は、数個の他の遺伝子の発現を直接的及び間接的に調節するであろう。本明細書では、（例えば、配列番号６に規定した「ＡＡＡＩＳＲ」アミノ酸反復をコードする配列番号５に規定した１８ｂｐ重複による）ＲｇｈＲ２の不活性化は、細胞生理学に影響を及ぼし、その結果として、増殖及びその異種タンパク質産生のような因子に大きな影響を及ぼし得ることは、企図されている。そこで、増殖及び異種タンパク質産生に及ぼす大きな影響について、様々な異種酵素を産生するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７株誘導体細胞内でのｒｇｈＲ２遺伝子における１８ｂｐヌクレオチド重複を除去することによってさらに試験した。
実施例２
ｒｇｈＲ２内の１８ｂｐ重複の除去並びにそれが細胞増殖及び異種酵素産生に及ぼす作用
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢｒａ７誘導体株（及びこの宿主株に関連若しくは由来する株）内の１８ｂｐ重複を除去するために、２回のＰＣＲ増幅をＢｒａ７のゲノムＤＮＡ上で実施した。第１回のＰＣＲ増幅は、プライマー３７８及び３７９（表２）を用いて実施し、第２回ＰＣＲ増幅は、プライマー３８０及び３８１（表２）を用いてＢｒａ７のゲノムＤＮＡ上で実施した。両方の断片は、ゲル精製し、１８ｂｐ重複の欠失を備えるｒｇｈＲ２断片を産生するために、プライマー３７８及び３８１を使用する融合ＰＣＲにおいて使用した。この断片は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩを用いて消化し、ゲル精製後に、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ消化及びゲル精製感温性組み込みプラスミドｐＣＺ１０５（図２）内にライゲートすると、プラスミド「ｐＺＣ１０５＿ｒｇｈＲ２」が産生した（図３）。
Figure 2020508072
プラスミドｐＺＣ１０５＿ｒｇｈＲ２は、ローリングサークル増幅し（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ（ＡｍｙＬ）遺伝子が欠如するが、異種パエニバチルス・クルドラノリチクス（Ｐｅａｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の変異α−アミラーゼをコードする発現カセットを有するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｂｒａ７誘導体）株内で形質転換させた。したがって、発現カセットは、強力なプロモーターの背後にＰ．クルドラノリチクス（Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の変異α−アミラーゼをコードする遺伝子を含み、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に組み込まれる。異種Ｐ．クルドラノリチクス（Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の変異α−アミラーゼの配列は、詳細にはその全体として参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１６４８３４号パンフレットに開示されている（すなわち、配列番号３５）。
細胞は、以前に２０１６年１０月２７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９０７８号明細書に記載されたようにプラスミドｐＢＬＣｏｍＫを使用してコンピテントにされた（図４）。細胞は、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ寒天上でプレーティングし、３７℃で一晩培養した。形成されたコロニーを新鮮Ｌｕｒｉａ寒天上で再画線培養し、３７℃で一晩培養した。単一コロニーを採取し、ゲノム内への組み込みを促進するために振とうしながら、Ｌｕｒｉａブロス中で一晩４２℃で培養した。引き続いて、細胞は、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ寒天上でプレーティングし、３７℃で一晩培養した。プライマー３６９及び３８４を使用するＰＣＲによってゲノム内への組み込みの検証後、適正なクローンを３７℃でＬｕｒｉａブロス中で一晩培養し、その後にＬｕｒｉａ寒天上でプレーティングした。単一コロニーをＬＢ寒天プレート及び３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上で再画線培養し、二重交差事象によるゲノムからのベクター部分の除去を検証するために３７℃で一晩培養した。カナマイシンの存在下で増殖できなかったコロニーをプライマー７５２及び７５３（表２）を使用するＰＣＲにかけ、得られた断片をシーケンシングした。これはｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ｂｐ重複の除去を確証した。
検証したクローンの１つであるクローン１９７をその後の試験のために使用した。ｒｇｈＲ２回復宿主中でＰ．クルドラノリチクス（Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）のα−アミラーゼを発現するクローン１９７（すなわち、ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ、１８ｂｐ重複の除去）及びＰ．クルドラノリチクス（Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）のα−アミラーゼを発現する親コントロール株（すなわち、１８ｂｐ重複を含むｒｇｈＲ２を含む）をトリプトンソイブロス（ＴＳＢ）培地に接種し、振とうしながら３７℃で一晩培養した。主要培養物は、グルコース徐放性マイクロタイタープレート（ｓｒＭＴＰ；ＰＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ，Ｈｅｒｚｏｇｅｎｒａｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してアミラーゼ産生培地中において０．１のＯＤ６６０でこの予備培養物から接種した。プレートは、３７℃で振とうしながら７２時間培養した。
７２時間後、ＯＤ６００を測定し（図５）、１００μＬの細胞は、５０％のプロピレングリコール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて１：１に希釈し、振とうしながら４０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、アミラーゼ活性は、Ｍｅｇａｚｙｍｅ社の取扱説明書に記載されたように、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９０７８号明細書に開示されたように、Ｃｅｒａｌｐｈａ試薬（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して測定した。
図５に示したように、ｒｇｈＲ２の１８ｂｐ重複の欠失は、培養したときにバイオマス中での減少を示したが、同時に改良されたアミラーゼ産生力価を証明した。例えば、図６は、異種α−アミラーゼの比生産性（酵素生成／ＯＤ６００）がｒｇｈＲ２回復株において少なくとも係数２は改善されたことを示している。
実施例３
ＲｇｈＲ２調節遺伝子
Ｂｒａ７産生株（すなわち、１８ｂｐ重複を有するｒｇｈＲ２を含む）及びこの株のｒｇｈＲ２回復（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）変異体のトランスクリプトーム解析は、数個の遺伝子の転写がＲｇｈＲ２によって調節されることを明らかにした（表３）。ｒｇｈＲ２回復株において少なくとも２倍（すなわち、１８ｂｐ重複を含むｒｇｈＲ２不活性株に比較して）下方制御された遺伝子の転写は、表４に示した。ｒｇｈＲ２回復株及びｒｇｈＲ２不活性化株（例えば、１８ｂｐ挿入による）の両方におけるこれらの遺伝子の（さらなる）下方制御又はこれらの遺伝子の欠失は、タンパク質産生にプラスの作用を有する。これは、１８ｂｐ反復の除去によるｒｇｈＲ２の再活性化によって見られる作用と類似の作用であろう。このため、これらの遺伝子（Ｂｌｉ０３６４４、ｙｖｚＣ、ａｂｒＢ１、ａｂｈ）のサブセットの不活性化が異種タンパク質産生に及ぼす作用を下記の実施例４において記載するように調査した。
Figure 2020508072
Figure 2020508072
実施例４
ＲｇｈＲ２調節遺伝子の不活性化及びそれらが異種タンパク質産生に及ぼす作用
Ｂｌｉ０３６４４、ａｂｒＢ１、ｙｖｚＣ及びａｂｈ遺伝子は、異種α−アミラーゼ（すなわち、国際公開第２０１４／１６４８３４号パンフレットにおいて開示されたＰ．クルドラノリチクス（Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の変異α−アミラーゼ）を産生するＢｒａ７株内の抗生物質マーカーの挿入によって不活性化されたが、ここで異種α−アミラーゼ産生は、実施例２に記載したように、４つの単一ノックアウト株（ΔＢＬｉ０３６４４、ΔａｂｒＢ１、ΔｙｖｚＣ及びΔａｂｈ）内で決定し、親（コントロール）株と比較した。例えば、図７に示したように、Ｂｌｉ０３６４４、ａｂｒＢ１、ｙｖｚＣ及びａｂｈの不活性化は、改良された異種α−アミラーゼ産生を生じさせたが、他方細胞増殖（ＯＤ６００）は余り影響を受けなかった。
実施例５
ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔを含む改変細胞中のアミラーゼの強化された産生
本実施例では、１８ｂｐ重複を有するｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号３）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞及び１８ｂｐ重複が欠如するｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ；配列番号１）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞はどちらも、下記の：１０ｍＬの播種培地（１５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５．５ｇ／Ｌのデキストロース、３ｇ／Ｌのリン酸カリウム、１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム）中の冷凍バイアル（１ｍＬ、２０％のグリセロール）から接種された、（ａ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に組み込まれた異種サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）の１番変異体のα−アミラーゼ発現カセット（配列番号１４０）又は（ｂ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に組み込まれた変異ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のα−アミラーゼ発現カセット（配列番号１４１）のいずれかの単一コピーを含む。培養物は、ＯＤ６００がおよそ２となるまで、３１０ＲＰＭで換気式１００ｍＬのフラスコ内において３８℃で増殖させた。各培養物から０．２５ｍＬを１００ｍＬの換気機能付きフラスコ内の２５ｍＬの産生培地（３０ｇ／Ｌの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、アミノ酸を含まず硫酸アンモニウムを含む６．７ｇ／Ｌの酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム若しくはアミノ酸を含まない１．７ｇ／Ｌの酵母窒素塩基、０．７ｇ／Ｌのソイトン、水酸化アンモニウムを用いてｐＨ６．８）に移し、２個の１４ｍｍ径のグルコース供給ビーズを添加し、このフラスコは、蒸発した水の損失を定期的に置換しながら８４時間にわたり３８℃、３１０ＲＰＭでインキュベートした。
８４時間後、各フラスコからサンプルを採取し、遠心した。１０分の１（０．１）ｍＬの上清を０．９ｍＬのブラッドフォード試薬と混合した。波長５９５ｎｍの吸光度として色を測定し、標準曲線と比較してタンパク質濃度を決定した。ペレットをプロピレングリコール中に再懸濁させ、３０分間加温し、上記と同様にブラッドフォード試薬を用いてアッセイした。２回の測定の凝集体によりアミラーゼ力価を決定し、表５に示した。
Figure 2020508072
したがって、上記の表５に示したように、ｒｇｈＲ２遺伝子内の天然に存在する１８ｂｐ重複の除去を示しているｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ対立遺伝子を含む両方のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、複数の異種アミラーゼ分子を産生するために有益である。
実施例６
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集及びＲｇｈＲ２遺伝子内の１８ｂｐ重複の欠失
本実施例では、核酸誘導エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９（配列番号９１））をコードする遺伝子又はそれらのコドン最適化遺伝子（例えば、配列番号９２のＣａｓ９ヌクレアーゼ）は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）内で活性なプロモーター（例えば、下記の表６を参照されたい）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）内で活性なターミネーター（例えば、配列番号１０３）に機能的に連結しており、それによりＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＣａｓ９発現カセット（配列番号１０４）を作成する。
Figure 2020508072
１８ｂｐ重複が欠如するｒｇｈＲ２遺伝子が標的部位を含有していないように、ｒｇｈＲ２の１８ｂｐ重複対立遺伝子に固有の標的部位（配列番号１０５）は、同定することができる。
同様に、１８ｂｐ重複内の固有の標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡ構築物（配列番号１０５）を構築するために、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８若しくは配列番号１０９（それらのヌクレオチドはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）ヌクレオチド「ＴＧＧ」の上流５’側である）の標的部位ヌクレオチドを含む可変標的化ドメイン（ＶＴ）は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ、配列番号１１０）をコードするＤＮＡに融合する。
ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組み合わせ（融合）は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（例えば、ｒｇｈＲ２内の１８ｂｐ重複由来の標的部位（配列番号１０５）を標的化するｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）を生成し、配列番号１１１を生成する。
ｇＲＮＡのためのＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の発現カセットは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号１１１）をＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）内で活性なプロモーター（例えば、表６）及びｇＲＮＡ発現カセット（ｓｐａｃ−ｇＲＮＡ−ｔ０ 配列番号１１２）を作成するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）内で活性なターミネーター（例えば、配列番号１０３）を機能的に連結させることによって作成される。Ｃａｓ９発現カセット（配列番号１０４）及びｇＲＮＡ発現カセット（配列番号１１２）によって生成されたＤＮＡ切断を正確に修復するためには、細胞の修復機構によって使用すべき編集鋳型が提供されなければならない。例えば、１８ｂｐ重複の５００ｂｐ上流（５’側）（配列番号１１３）は、１８ｂｐ重複の５００ｂｐ下流（３’側）（配列番号１１４）に融合して、ＲＧＥＮによって生成されたＤＮＡ切断を修復するためにＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の宿主機構によって使用され得る編集鋳型（配列番号１１５）を生成する。
Ｃａｓ９発現カセット（配列番号１０４）、ｇＲＮＡ発現カセット（配列番号１１２）及び編集鋳型（配列番号１１５）は、多数の様々な方法（例えば、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、天然コンピテンス又は誘導コンピテンス）を使用してＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に共送達される。形質転換細胞は、フォワードプライマー（配列番号１１７）及びリバースプライマー（配列番号１１８）を備える遺伝子座を増幅させることによりｒｇｈＲ２遺伝子座（配列番号１１６）を増幅させることによってスクリーニングされる。これらのプライマーは、野生型遺伝子座（配列番号１１６）又はＲＧＥＮ（配列番号１１９）によって編集されていた回復遺伝子座を増幅させる。これらの断片は、次に編集されたコロニーを同定するために、シーケンシングプライマー（配列番号１２０）を使用してシーケンシングされる。
したがって、本実施例に記載したように、ｒｇｈＲ２レギュロン内の遺伝子のいずれも、その遺伝子を不活性化する、強化する、下方制御する若しくは欠失させるために類似の方法で編集され得る。
実施例７
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集及び遺伝子の下方制御
本実施例では、ＣＲＳＩＰＲ−Ｃａｓ９編集による関心対象の遺伝子の調節（例えば、下方制御）について記載する。遺伝子発現レベルを調節するための典型的な方法は、標的遺伝子の転写を強化若しくは拮抗させるためのヌクレオチド誘導エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ欠陥変異体（例えば、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ若しくはＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ）の使用である。これらのＣａｓ９変異体は、タンパク質配列内に存在する全てのヌクレアーゼドメインに対して不活性である。これらのＣａｓ９変異体は、このため、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合活性を保持するが、同種標的部位に結合した場合にＤＮＡ構築物のいずれの鎖を切断することもできない。
例えば、ヌクレアーゼ欠陥Ｃａｓ９タンパク質は、（実施例６に記載したように構築された）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の発現カセットとして発現することができ、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｇＲＮＡ発現カセットと結合された場合に、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の特異的標的配列に向けられる。Ｃａｓ９（変異）タンパク質の特異的標的部位への結合は、細胞のＤＮＡ上の転写機構の結合若しくは移動を遮断し、それにより産生する遺伝子産物の量を減少させることができる。
さらに、結合活性は、転写機構がより容易に遺伝子に結合する、又は伸長させることを可能にする領域内でＤＮＡを局所的に溶融させることによって転写を強化することができ、これは産生する遺伝子産物の量を増加させるであろう。したがって、ｒｇｈＲ２レギュロン（若しくはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内の任意の他の遺伝子）は、この方法を使用して遺伝子発現の調節（上方制御若しくは下方制御）の標的とすることができる。
例えば、ヌクレアーゼ欠陥Ｃａｓ９タンパク質を有するｙｂｃＺ遺伝子を標的とするためには、標的とし得るｙｂｃＺ ＯＲＦ内の１９の固有の標的部位（配列番号１２１〜１３９）がある。これらの標的配列は、実施例６で記載したように、ｇＲＮＡ発現カセット内に作成することができる。
ヌクレアーゼ欠陥Ｃａｓ９発現カセット（例えば、上記の実施例６で記載したように構築した）と標的遺伝子のためのｇＲＮＡ発現カセットとの共送達は、遺伝子内の転写をサイレンシング若しくは活性化することにより遺伝子量の変化（調節）を可能にする。複数のｇＲＮＡ発現カセットを同時に送達することによって、同時の複数の遺伝子の標的化及び調節が可能である。遺伝子調節（上方制御若しくは下方制御）は、ヌクレアーゼ欠陥Ｃａｓ９発現カセット及びＲＮＡ発現カセットを含有する細胞内で、例えばＲＮＡｓｅｑなどの、当業者には公知である方法によって容易に監視される。
実施例８
ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔを含む改変細胞中の異種Ｇ４アミラーゼの強化された産生
本実施例では、１８ｂｐ重複（配列番号３）を有するｒｇｈＲ２遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞及び１８ｂｐ重複が欠如するｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ；配列番号１）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、どちらもシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＭＩの異種Ｇ４アミラーゼ（変異体）をコードする発現カセット（配列番号１４２）の単一コピーを含む（例えば、特に参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０／１３３６４４号パンフレットを参照されたい）。どちらの株も実施例２に記載したように培養し、４８時間後に採取した試料は、上述したようにＣｅｒａｌｐｈａ試薬を用いてアッセイした。ｒｇｈＲ２内に１８ｂｐ重複を含む株に比較したｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ株内の比生産性（Ｇ４アミラーゼ産生／ＯＤ６００）における倍率差は、表７に示した。
Figure 2020508072
したがって、上記の表７に示したように、異種Ｇ４アミラーゼの比生産性（Ｑｐ）は、ｒｇｈＲ２遺伝子内に１８ｂｐ重複を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に対してＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ細胞内では有意に改善される。
実施例９
ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔを含む改変細胞中のアルカリアミラーゼの強化された産生
本実施例では、１８ｂｐ重複を有するｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号３）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞及びｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ（配列番号１）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞はどちらも、下記の：（１）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に組み込まれたアルカリα−アミラーゼ変異体１のための発現カセット、（２）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に組み込まれたアルカリα−アミラーゼ変異体２のための発現カセット、（３）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に組み込まれたアルカリα−アミラーゼ変異体３のための発現カセット又は（４）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に組み込まれたアルカリα−アミラーゼ変異体４のための発現カセットのいずれかの単一コピーを含む。株は、フェドバッチ系中で発酵させ、発酵の終了時に試料を採取し、実施例２に記載したようにＭｅｇａｚｙｍｅ社のＣｅｒａｌｐｈａ試薬を使用してα−アミラーゼ活性についてアッセイした。ｒｇｈＲ２内に１８ｂｐ重複を含む株と比較して、ｒｇｈＲ２内に１８ｂｐ重複を含まない株中のアミラーゼ産生における倍率差は、表８に示した。
Figure 2020508072
したがって、上記の表８に示したように、フェドバッチ培養中のアルカリアミラーゼの産生は、ｒｇｈＲ２遺伝子内に１８ｂｐ重複を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に対してＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ細胞内では改善される。
実施例１０
ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞中の強化されたリパーゼ産生
本実施例では、１８ｂｐ重複を有するｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号３）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞及びｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子（配列番号１）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞はどちらも、リパーゼ／エステラーゼ活性を含む異種ＥＣ３．１．１．３酵素をコードする発現カセットの単一コピーを含む。したがって、どちらの株も実施例２に記載したように培養し、４８時間後に採取した等量試料は、供給業者の取扱説明書にしたがってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）にかけた。染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル（図９）は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ株によって産生したＥＣ３．１．１．３酵素（約２８ｋＤａ）の増加したレベルを示している（図９、レーン１を参照されたい）。したがって、上記の表９に示したように、異種リパーゼ／エステラーゼ酵素の産生は、１８ｂｐ重複を有するｒｇｈＲ２遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に比較して、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ細胞内では改善される。
実施例１１
フェドバッチ培養中におけるｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ株内のα−アミラーゼの強化された産生
本実施例では、１８ｂｐ重複を有するｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号３）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞及びｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子（配列番号１）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞はどちらも、国際公開第２０１４／１６４８３４号パンフレットに記載された異種サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）の変異体＃２のα−アミラーゼをコードする発現カセット（配列番号１４３）の単一コピーを含む。どちらの株も標準フェドバッチ発酵条件下で増殖させた。アミラーゼ活性は、実施例２に記載したようにＭｅｇａｚｙｍｅ社のＣｅｒａｌｐｈａ試薬を使用して発酵を通して監視した。ｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ｂｐ重複を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に比較したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ細胞の比生産性における倍率差は、下記の表９に示した。
Figure 2020508072
したがって、表９に示したように、異種サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）の変異体＃２のα−アミラーゼを産生するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞についての比生産性は、１８ｂｐ重複を有するｒｇｈＲ２遺伝子を含む細胞に比較して、ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子を含む細胞内では１０％改善される。
実施例１２
対立遺伝子ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ及びｇｌｃＴ１を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中の強化されたアミラーゼ産生
本実施例では、異種α−アミラーゼ発現カセットは、親及び改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞のＢＦ６２及びＢＦ１６９内に導入された。より特別には、異種α−アミラーゼ発現カセットを用いて形質転換された親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主は、「ＢＦ１３４」と命名された。同様に、下記の表１０に規定したように、異種α−アミラーゼ発現カセットを用いて形質転換されたｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞「ＢＦ６２」は、「ＢＦ１６５」と命名され、対立遺伝子ｇｌｃＴ１及びｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞「ＢＦ１６９」は、「ＢＦ２６０」と命名された。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の対立遺伝子ｇｌｃＴ１は、本明細書に参照により全体として組み込まれる、２０１８年１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６１３，３３９号明細書に記載されたように、変異ＧｌｃＴタンパク質のアミノ酸６７位（Ｆ６７）でフェニルアラニン（Ｆ）を含む変異ＧｌｃＴ（転写アンチターミネーション）タンパク質をコードする。
Figure 2020508072
したがって、キシロース誘導性ｃｏｍＫ発現カセットを運ぶプラスミドを含む親及び改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＢＦ６２及びＢＦ１６９細胞（表１０）は、１２５ｍＬのバッフル付きフラスコ内に１００μｇ／ｍＬの二塩酸スペクチノマイシンを含有する１５ｍＬのＬブロス（１（ｗ／ｖ）％のトリプトン、０．５（ｗ／ｖ）％の酵母抽出物、１（ｗ／ｖ）％のＮａＣｌ）中で３７℃及び２５０ＲＰＭで一晩増殖させた。一晩培養物は、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ内内に１００μｇ／ｍＬの二塩酸スペクチノマイシンを含有する２５ｍＬの新鮮Ｌブロス中で０．７（ＯＤ６００単位）に希釈した。細胞は、３７℃（２５０ＲＰＭ）で１時間増殖させた。Ｄ−キシロースは、５０（ｗ／ｖ）％のストックからの０．１（ｗ／ｖ）％に加えた。細胞は３７℃（２５０ＲＰＭ）でさらに４時間増殖させ、７分間にわたり１，７００×ｇでペレット化した。
細胞は、使用済み培地を使用して元の培養の４分の１量に再懸濁させた。１００μＬの濃縮細胞を（５’側〜３’側方向へ）野生型Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’−ＵＴＲ（ＷＴ−５’−ＵＴＲ）と機能的に連結された同一５’側ｃａｔＨ相同性アーム、ｃａｔＨ遺伝子及びｓｐｏＶＧｒｒｎＩｐハイブリッドプロモーターを含むおよそ１μｇの発現カセットと混合したが、ここでＷＴ−５’−ＵＴＲは、最終シグナル配列をコードして、その後に変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｒｕｓ）のα−アミラーゼをコードするＤＮＡ（ＯＲＦ）が続くＤＮＡに機能的に連結させた。変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のα−アミラーゼをコードするＤＮＡ（ＯＲＦ）の３’側末端は、３’側ｃａｔＨ相同性アームに機能的に連結されたｌａｔターミネーターに機能的に連結された。形質転換反応は、３７℃、１０，０００ＲＰＭでおよそ９０分間インキュベートした。
形質転換ミックスは、１．５（ｗ／ｖ）％寒天を用いて固化した１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬブロスが充填されたペトリ皿上でプレーティングした。プレートは、３７℃で２日間にわたりインキュベートした。コロニーは、１．５（ｗ／ｖ）％寒天を用いて固化した１（ｗ／ｖ）％の不溶性コーンスターチを含有するＬブロスが充填されたペトリ皿上で画線精製した。プレートは、コロニーが形成されるまで、３７℃で２４時間インキュベートした。デンプン加水分解は、ハローを形成する、コロニーを取り囲んでいる不溶性デンプンの除去によって指示されたので、これを使用して変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のα−アミラーゼタンパク質を発現する形質転換体を選択した。コロニーＰＣＲを使用して、標準技術並びにフォワード及びリバースプライマー対を使用してコロニーを生成するハローからｃａｔＨ遺伝子座を増幅させた。発現カセットを含む配列検証済みＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を保存し、表１０の第３列に示したように命名した。
したがって、α−アミラーゼ発現カセットを含むＢＦ１６５（すなわち、ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ）及びＢＦ２６０（すなわち、ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ＋ｇｌｃＴ１）と命名されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、小規模条件下でα−アミラーゼの産生について評価された。これらの株は、１（ｗ／ｖ）％の不溶性デンプンを含有するＬ寒天プレート上で画線精製し、およそ２４時間にわたり３７℃で増殖させた。単一ハロー陽性コロニーは、１５ｍＬのトリプティックソイブロス（１．７（ｗ／ｖ）％のトリプトン、０．３（ｗ／ｖ）％のソイトン、０．２５（ｗ／ｖ）％のグルコース、０．５％（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウム、０．２５％（ｗ／ｖ）のリン酸二ナトリウム）中に接種し、６時間にわたり３７℃（２５０ＲＰＭ）で増殖させた。引き続いて、この０．０２５ｍＬの種培養は、２５ｍＬのフラスコ増殖培地（水酸化アンモニウムと共に、微量金属を含有する４（ｗ／ｖ）％のＭＥＳ、０．１（ｗ／ｖ）％のリン酸一カリウム、０．０５（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウム、０．０３（ｗ／ｖ）％のソイトン、ｐＨ６．８）中に接種した。単一高グルコース放出性フィードビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ製）を添加した（供給速度５７ｍｇ／Ｌ／時間）。培養物は、４２℃（２５０ＲＰＭ）で９０時間にわたり増殖させた。総分泌タンパク質産生量は、ＢＳＡ標準物質を用いるブラッドフォード法を使用して決定した。各株についての少なくとも２本の独立フラスコの反復測定から平均化した相対α−アミラーゼ産生量は、下記の表１１に示した。
Figure 2020508072
したがって、表１１に示したように、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のＢＦ２６０細胞（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ及び対立遺伝子ｇｌｃＴ１を含む）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞ＢＦ１６５（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ及び野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含む）と比較した場合（それに対して）、相対α−アミラーゼ産生量のおよそ９％の増加を証明する。したがって、所定の実施形態では、回復ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）を含む本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、変異ＧｌｃＴタンパク質のアミノ酸６７位でロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換を含む変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする対立遺伝子ｇｌｃＴ１（配列番号１４４）を含む核酸構築物をさらに含む。
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Claims (14)

  1. 配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変バチルス・リケニフォルミス細胞であって、前記改変バチルス・リケニフォルミス細胞が、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする前記ｒｇｈＲ２遺伝子の遺伝子改変を含み、前記改変バチルス・リケニフォルミス細胞が、未改変親バチルス・リケニフォルミス細胞に比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変バチルス・リケニフォルミス細胞。
  2. 配列番号４との９０％の配列同一性を含む前記ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする前記ｒｇｈＲ２遺伝子を含む前記親バチルス・リケニフォルミス細胞が、配列番号４との９０％の配列同一性を含む前記ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応する前記ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｄｕｐ）内で１８ヌクレオチド重複を含み、前記改変バチルス・リケニフォルミス細胞が、前記ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）内で前記１８ヌクレオチド重複を欠失させ、それにより配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする改変を含む、請求項１に記載の改変バチルス・リケニフォルミス細胞。
  3. 配列番号４との９０％の配列同一性を含む前記ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする前記ｒｇｈＲ２遺伝子が、配列番号３との少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、配列番号４の前記ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復をコードする１８ヌクレオチド重複を含む、請求項１に記載の改変バチルス・リケニフォルミス細胞。
  4. 配列番号２の前記ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする前記ｒｇｈＲ２遺伝子が、配列番号１の前記ｒｇｈＲ２遺伝子との９０％の配列同一性を含む核酸配列を含む、請求項１に記載の改変バチルス・リケニフォルミス細胞。
  5. 前記増加した量の関心対象のタンパク質が、前記親バチルス・リケニフォルミス細胞と比較して少なくとも１．０％増加している、請求項１に記載の改変バチルス・リケニフォルミス細胞。
  6. 配列番号４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変バチルス・リケニフォルミス細胞であって、前記改変バチルス・リケニフォルミス細胞が、配列番号２の前記ＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子を含み、前記改変バチルス・リケニフォルミス細胞が、前記未改変親バチルス・リケニフォルミス細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変バチルス・リケニフォルミス細胞。
  7. 配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変バチルス・リケニフォルミス細胞であって、前記改変バチルス・リケニフォルミス細胞が、配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする核酸配列と機能的に連結した５’プロモーター領域を含む、その中に導入されたポリヌクレオチド構築物を含み、前記改変バチルス・リケニフォルミス細胞が、前記未改変親バチルス・リケニフォルミス細胞と比較して増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変バチルス・リケニフォルミス細胞。
  8. ベクターが、天然ｒｇｈＲ２染色体座で前記バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に組み込まれ、それにより配列番号４との９０％の配列同一性を含む前記ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする前記遺伝子を欠失又は崩壊させ、このため配列番号２との９０％の配列同一性を含む前記ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする前記核酸配列に機能的に連結した前記５’プロモーター領域を含む前記導入されたポリヌクレオチド構築物を挿入する、請求項７に記載の改変バチルス・リケニフォルミス細胞。
  9. 前記変異ＧｌｃＴタンパク質のアミノ酸６７位でロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換を含む変異Ｇｌｃｔタンパク質をコードする、対立遺伝子ｇｌｃＴ１（配列番号１４４）を含む発現構築物をさらに含む、請求項７に記載の改変バチルス・リケニフォルミス細胞。
  10. 親バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質の活性を回復させるための方法であって、前記親バチルス・リケニフォルミス細胞が、配列番号４との９０％の配列同一性を含む実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含み：
    （ａ）配列番号４との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス細胞を得る工程であって、ここで配列番号４との９０％の配列同一性を含む前記ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子が、配列番号４の前記ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応する前記ｒｇｈＲ２遺伝子内で前記１８ヌクレオチド重複を含む工程と、
    （ｂ）ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子を産生するために前記ｒｇｈＲ２遺伝子内の前記１８ヌクレオチド重複を欠失させることにより工程（ａ）の前記親バチルス・リケニフォルミス細胞を改変する工程であって、前記ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ遺伝子がそれにより配列番号２との９０％の配列同一性を含む活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードする工程とを含む方法。
  11. 親バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質の活性を回復させるための方法であって、前記親バチルス・リケニフォルミス細胞が、配列番号４との９０％の配列同一性を含む実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子を含み：
    （ａ）配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス細胞を得る工程であって、ここで配列番号４の前記ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする前記ｒｇｈＲ２ｄｕｐ遺伝子が、配列番号４の前記ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応する前記ｒｇｈＲ２遺伝子内で１８ヌクレオチド重複を含む工程と、
    （ｂ）配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ核酸配列に機能的に連結した５’プロモーター領域を含むポリヌクレオチド構築物をその中に導入することにより工程（ａ）の前記親バチルス・リケニフォルミス細胞を改変する工程と、
    （ｃ）配列番号２との９０％の配列同一性を含む前記活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードする工程（ｂ）の改変バチルス・リケニフォルミス細胞内に導入された前記ポリヌクレオチド構築物を発現させる工程とを含む方法。
  12. バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内の関心対象の内在性タンパク質の産生を増加させるための方法であって：
    （ａ）配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を得る工程であって、配列番号４の前記ＲｇｈＲ２タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号４の前記ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸３８〜４３位でアミノ酸ＡＡＡＩＳＲの反復に対応する前記ｒｇｈＲ２遺伝子内の１８ヌクレオチド重複を含む工程と、
    （ｂ）前記ｒｇｈＲ２遺伝子内の前記１８ヌクレオチド重複を欠失させることによって工程（ａ）の前記親バチルス・リケニフォルミス細胞を改変する工程であって、前記ｒｇｈＲ２遺伝子が、それにより配列番号２との９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする工程と、
    （ｃ）前記内在性タンパク質を産生するために好適な培地中で工程（ｂ）の改変バチルス・リケニフォルミス細胞を培養する工程と、
    （ｄ）前記培養培地若しくは細胞溶解物から工程（ｃ）において産生した前記内在性タンパク質を回収する工程と、を含み、
    ここで工程（ｂ）の前記改変バチルス・リケニフォルミス細胞が、工程（ａ）の前記親バチルス・リケニフォルミス細胞及び工程（ｂ）の前記改変バチルス・リケニフォルミス細胞の両方が同一条件下で培養された場合に、工程（ａ）において得られた前記親バチルス・リケニフォルミス細胞と比較して、増加した量の前記内在性タンパク質を産生する方法。
  13. 実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードする変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含むバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株を同定するための方法であって：
    （ａ）バチルス・リケニフォルミス株を得てその中の前記ｒｇｈＲ２遺伝子をシーケンシングする工程と、
    （ｂ）前記シーケンシングされたｒｇｈＲ２遺伝子と配列番号１の前記天然ｒｇｈＲ２遺伝子とを整列させて比較する工程とを含み、
    ここで、配列番号１の前記ｒｇｈＲ２遺伝子のＨＴＨドメイン内に１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換及び／又は重複を含むシーケンシングされたｒｇｈＲ２遺伝子を含むバチルス・リケニフォルミス株が、実質的に不活性なＲｇｈＲ２タンパク質をコードする変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含む方法。
  14. 配列番号２の天然ｒｇｈＲ２タンパク質の前記ＨＴＨドメインが、配列番号２のアミノ酸残基５〜５８内に含まれる、請求項１３に記載の方法。
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