JPH05301888A - 変異型モニターペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 次のアミノ酸配列を有する変異型モニターペ
プチド。 Gly Asn Pro Pro Ala Glu Val Asn Gly Lys Thr Pro Asn Cys Pro Lys Gln Ile Met Gly Cys Pro Arg Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Pro Ser Glu Cys Ser Leu Cys Phe Glu Asn X¹ X² Phe Gly Thr Ser Ile His Ile Gln Arg Arg Gly Thr Cys （配列中、X¹ X² はHis Asn 又はSer Thr を示す） 【効果】 本発明の変異型モニターペプチドは、ＣＣＫ
放出活性及びＥＧＦ様活性を引き起す小腸上皮細胞への
結合能において天然型モニターペプチドよりも優れてい
ることから、膵炎に代表される消化器疾患の治療剤とし
て有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はトリプシン阻害活性に優
れた変異型モニターペプチド及びその組換えＤＮＡ技術
による製造に関する。

【０００２】

【従来の技術】モニターペプチドは、伏木ら〔ＦＡＳＥ
Ｂ Ｊ．３；１２１−１２６（１９８９）〕によりラッ
ト小腸内において見出された６１個のアミノ酸から構成
されるポリペプチドであり、その配列は以下の通りであ
る。 Gly Asn Pro Pro Ala Glu Val Asn Gly Lys Thr Pro Asn Cys Pro Lys Gln Ile Met Gly Cys Pro Arg Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Pro Ser Glu Cys Ser Leu Cys Phe Glu Asn Arg Lys Phe Gly Thr Ser Ile His Ile Gln Arg Arg Gly Thr Cys

【０００３】モニターペプチドは、膵臓において産生さ
れ、膵管を経て小腸内へ分泌される。分泌されたモニタ
ーペプチドは、腸管内に食物が存在しない状態では、ト
リプシンなどのプロテアーゼなどにより分解されてしま
うが、摂食により腸管内に食物が存在すると、プロテア
ーゼによる分解を免れるようになる。分解を免れたモニ
ターペプチドは、腸管壁に存在する受容体に結合し、血
液中にコレシストキニン（ＣＣＫ）を放出する。次にＣ
ＣＫは、膵臓に作用して消化酵素の分泌を促進すること
によって、食物の消化がより速やかに行われる様に働
く。またＣＣＫは脳の満腹中枢を刺激し、摂食を抑制す
ることが推測されている。このようにモニターペプチド
はＣＣＫ分泌を介して、食物の消化吸収及び摂食に重要
な関連を持つ因子であると考えられている〔Ｆｕｓｈｉ
ｋｉ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｗａｉ，Ｋ．，ＦＡＳＥＢ
Ｊ．，３，１２１−１２６，１９８９；伏木亨、日本農
芸化学会誌，６１，１４５８−１４６１，１９８７〕。

【０００４】更に該ペプチドは、トリプシン阻害活性を
示すことが知られている。このことは、膵酵素の活性化
によって引き起こされる急性膵炎、あるいは胃や十二指
腸等の消化管の切除手術後に消化液が逆流して起こる逆
流性潰瘍の治療に蛋白分解酵素阻害剤が用いられている
ことから、モニターペプチドも同様の治療薬として期待
されている。また、該ペプチドと似たアミノ酸配列を持
つ蛋白性のトリプシン阻害剤に、ヒトを含めた動物の膵
臓から分泌されている膵臓分泌トリプシン阻害剤（ＰＳ
ＴＩ）があるが、このＰＳＴＩについては、該ペプチド
のようなＣＣＫ放出活性が報告されていない。

【０００５】また、モニターペプチドは、そのアミノ酸
配列中の上皮成長因子（ＥＧＦ）のそれと相同性の高い
部分を持っており、ＥＧＦ様活性を示すことから成長因
子としての生理作用も持っていることが報告されている
〔Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｂ．Ｂ．Ｒ．
Ｃ．，１３９，５４５−５５０，１９８６〕。

【０００６】上述したように、モニターペプチドは、種
々の異なる作用スペクトルを示すことから、消化器病治
療薬、潰瘍治療薬、抗肥満薬等としてそれ自体有用な物
質であると考えられている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のように従来の天
然型モニターペプチドは、１）ＣＣＫ放出活性、２）ト
リプシン阻害活性、３）ＥＧＦ様活性等の異なる複数の
生理作用を併せて有しており、これを医薬品として用い
るにあたっては、副作用の面からそれぞれの作用が分離
されるか、あるいは一部の作用が増強されることが望ま
しい。

【０００８】上記の観点から組換えＤＮＡの手法によ
り、天然型モニターペプチドのアミノ酸配列の一部を別
のアミノ酸に置き換えた新規ペプチドをコードする遺伝
子を構築して種々検討した結果、天然型モニターペプチ
ドのアミノ酸配列の４７番目及び４８番目を変異させた
特定のペプチドがＣＣＫ放出の引き金となる小腸上皮細
胞表面の受容体に対してより強い結合能を有することを
見出し本発明を完成した。

【０００９】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は次の
アミノ酸配列 Gly Asn Pro Pro Ala Glu Val Asn Gly Lys Thr Pro Asn Cys Pro Lys Gln Ile Met Gly Cys Pro Arg Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Pro Ser Glu Cys Ser Leu Cys Phe Glu Asn X¹ X² Phe Gly Thr Ser Ile His Ile Gln Arg Arg Gly Thr Cys （配列中、X¹ X² はHis Asn 又はSer Thr を示す）を有
する変異型モニターペプチドを提供するものである。

【００１０】また本発明は上記アミノ酸配列をコードす
る塩基配列を有する変異型モニターペプチド遺伝子、こ
の遺伝子をベクターに挿入した組換えベクター、この組
換えベクターにより形質転換された宿主細胞、及びこの
宿主細胞を培養して変異型モニターペプチドを製造する
方法を提供するものである。

【００１１】本発明の変異型モニターペプチドは、市販
のペプチド合成機を用いて化学的に合成することもでき
るが、このアミノ酸配列をコードする遺伝子を調製し、
これをベクターに組み込み、得られた組換えベクターを
用いて形質転換された細胞内で複製、転写、翻訳させる
ことにより製造するのが好ましい。

【００１２】本発明の変異型モニターペプチドをコード
する遺伝子は、通常の方法、例えばホスファイト トリ
エステル法により全合成することもできるが、天然型モ
ニターペプチドをコードする遺伝子を利用してその塩基
配列の一部を改変することにより製造するのが好まし
い。

【００１３】ここで天然型モニターペプチドをコードす
る遺伝子は、ラット小腸等の生体細胞からプローブ法で
調製することもできるが、化学的に合成したものを用い
るのが好ましい。また、当該化学合成の天然型モニター
ペプチド遺伝子を更に宿主細胞由来のプラスミドベクタ
ーに挿入し、当該組換えプラスミドを用いて得られた形
質転換体より採取してもよい。

【００１４】天然型モニターペプチド遺伝子の一部の塩
基配列の改変手段としては、公知の部位特異的変異導入
法を採用するのが好ましい。かかる変異手段としては、
例えばＭｕｔａｎ Ｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いる
方法が特に好ましい。変異導入用ミスマッチプライマー
の合成は、ＤＮＡ合成機を用いて常法に従って行い、置
換したいアミノ酸配列をコードする領域のオリゴマーを
合成する。かかるオリゴマーの例としては、次のものが
挙げられる。 （１）第４７−４８位アルギニン−リジンからヒスチジ
ン−アスパラギンへの置換 5'-GATGTGGATG GAAGTGCCGA AGTTATGGTT CTCAAAACAC AGGCTAC-3' （２）第４７−４８位アルギニン−リジンからセリン−
スレオニンへの置換 5'-GATGTGGATG GAAGTGCCGA ATGTACTGTT CTCAAAACAC AGGCTAC-3'

【００１５】このようにして得られた本発明変異型モニ
ターペプチド遺伝子としては、次の塩基配列を有するも
のが挙げられる。 GGTAACCCGCCGGCTGAAGTAAATGGTAAAACTCCGAACTGTCCGAAACAGATCATGGGTTGTCCGCGTA TCTACGACCCGGTTTGTGGTACCAACGGTATCACTTACCCGTCTGAGTGTAGCCTGTGTTTTGAGAACZZ ZEEETTCGGCACTTCCATCCACATCCAGCGCCGTGGGACCTGT （配列中、ZZZEEEはCATAAC又はAGTACAを示す）

【００１６】上記本発明変異型モニターペプチド遺伝子
を組み込むべきベクターとしては、形質転換すべき宿主
細胞中で複製可能なものであれば特に制限されず、宿主
細胞の選択に従って適宜決定すればよい。ここで宿主細
胞としては、真核生物及び原核生物のいずれをも利用で
き、真核生物としては哺乳類、酵母等が挙げられ、原核
生物としては大腸菌や枯草菌が挙げられる。宿主細胞と
して哺乳類を用いる場合のベクターとしては、ＳＶ４０
の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ等が挙げ
られ；酵母を用いる場合のベクターとしてはｐＡＭ８２
等が挙げられる。また宿主細胞として大腸菌を用いる場
合のプラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＭ
ＪＲ９６、ｐＫＫ２３３−２、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵ
Ｃ１８、ｐＵＣ１９等が挙げられる。またファージベク
ターとしてはＭ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９などが挙
げられる。これらのベクターへの目的遺伝子の組み込み
は、常法により公知の制限酵素及びリガーゼを用いて行
われる。

【００１７】かくして得られる組換えベクターの宿主細
胞への導入及びこれによる形質転換法としては、常法、
例えば塩化カルシウム法、リン酸カルシウム法、プロト
プラスト融合法、リポソーム法、マイクロインジェクシ
ョン法等が採用できる。

【００１８】得られた形質転換体は、常法に従って培養
でき、該培養により目的の変異型モニターペプチドが生
産、蓄積される。培養条件は用いた宿主細胞の性質に応
じて適宜決定される。宿主細胞が大腸菌の場合、培地と
しては例えばＬＢ培地やＭ９ＣＡ培地などを用いること
ができ、培養温度は大腸菌が増殖あるいは生育できる温
度であればよく、培養の形態は振盪培養やジャーファー
メンターによるのが好ましい。

【００１９】本発明変異型モニターペプチドの精製法は
公知の精製手段を用いて行うことが可能であり、多くの
文献や成書を参考にして実施することができる。精製方
法としては、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）、遠心分離操作、電気泳動などの精製手段あるいは
これらを組み合わせた方法があり、適当な方法を選択し
て精製することが可能である。

【００２０】かくして得られる本発明の変異型モニター
ペプチドは、優れたトリプシン阻害活性を有し、膵炎に
代表される消化器疾患治療剤として有用である。

【００２１】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本発明に係る諸実験は内閣総理大臣の定める「組換えＤ
ＮＡ実験指針」に従って行った。また実施例中のベクタ
ー、ＤＮＡ、種々の酵素、大腸菌などを扱う諸操作は以
下にあげる書籍、製造業者、供給業者の添付資料を参考
にして実施した。 １．遺伝子操作実験法、高木康敬編著（１９８０）講談
社 ２．遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著（１９８０）
講談社 ３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．ａ ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら編（１９８２）Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ４．Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＬ．Ｇ．Ｄａｖｉｓら編（１９
８６）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ

【００２２】 参考例（天然型モニターペプチド遺伝子の調製）モニターペプチドの遺伝情報をコードするＤＮＡ断片の
合成及び精製 遺伝子を構成するオリゴヌクレオチドを固相合成法で調
製した。すべての工程はジーンアセンブラー（Ｇｅｎｅ
Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ^TM）合成機（ファルマシア社製）
により、β−シアノエチルフォスフォアミダイト方法で
行った。出発ヌクレオチドをあらかじめ結合してある固
相支持体、保護したヌクレオチド、溶媒、試薬を製造業
者から入手し、合成装置の製造業者の操作の指示に従っ
て自動化した方法で実施した。ある種の修正は、製造業
者の操作の指示及び使用の報告に従って導入した。合成
が終了した時、支持体を合成装置から取り外し、濃アン
モニア水と共に５０℃に１６時間密閉容器中で加熱する
ことにより、固体の支持体からオリゴマーを切り離し、
溶液として回収した。オリゴマーを含むアンモニア液
は、ＦＰＬＣ^TM装置を用い、ＭｏｎｏＱ^TMカラム（いず
れもファルマシア社製）において１０mM ＮａＯＨ中Ｎ
ａＣｌの濃度勾配を用いたイオン交換クロマトグラフィ
ーにかけた。溶出されてきたオリゴマーを含む液は、あ
らかじめ１００mMトリエチルアミン酢酸緩衝液（pH７．
０）で平衡化したＮＡＰ−２５^TMカラム（ファルマシア
社製）で脱塩し、減圧乾固した。残留物を蒸留水に溶解
し、更にその４倍量の酢酸を加えて室温で２０分放置
し、オリゴヌクレオチドから保護基を外した。反応後、
エーテルで酢酸を除き、先に述べたＦＰＬＣ^TM装置、及
びＭｏｎｏＱ^TMカラムで同様のイオン交換クロマトグラ
フィー、ＮＡＰ−２５^TMカラムでの脱塩を行い、更に減
圧乾固して、精製オリゴヌクレオチドとした。設計した
１０種のＤＮＡ断片についてはすべて上記と同じ方法で
精製品が得られた。水溶性の２６０nmでの吸光度を測定
することより、３０から２００μg の精製物を得たこと
が判った。

【００２３】オリゴヌクレオチドの２本鎖ＤＮＡへの結合 等モル量（３００pmole ）の精製された各オリゴヌクレ
オチドを、５０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）、１０
mM塩化マグネシウム、１mM ＡＴＰ、１０mMジチオスレ
イトール及び１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
からなる反応液５０μl 中で３７℃９０分反応させ、
５’−ヒドロキシ末端をリン酸化した。なお、断片１と
６はリン酸化しなかった。各断片のリン酸化反応終了
後、これら１０個の断片を混合し、９５℃で１５分間加
熱して酵素を不活性化した。そのままの容器で３時間か
けて３０℃まで冷却し、各断片のアニーリングを行っ
た。次いでこの液をフェノール／クロロホルムで除蛋白
処理し、エタノール沈澱で濃縮した。得られた沈澱を１
００mMトリス塩酸緩衝液（pH７．６）、５mM塩化マグネ
シウムからなる液に溶かし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガ
ーゼを含むライゲーションキット（宝酒造社製）により
１６℃にて一夜ライゲーション反応を行った。反応後、
エタノール沈澱で濃縮した後、１．５％アガロースゲル
電気泳動にかけて目的の１９０ｂｐのＤＮＡ断片を分
離、回収した。得られた断片を先に述べたと同じ反応系
で５’−ヒドロキシ末端をリン酸化した。なお、この項
目及びこれ以降で述べるエタノール沈澱とは以下の操作
を言う。沈澱させようとする溶液にその体積の１０分の
１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH４．６）、２．５倍量の
エタノールを加え、−８０℃に１５分以上放置する。そ
の後、遠心分離して沈澱を得、７０％エタノールで洗浄
した後、真空乾燥する。

【００２４】クローニング 調製したＤＮＡ断片は５’−末端にＮｃｏＩ部位、３’
−末端にＨｉｎｄ III部位を持つので、ＮｃｏＩ、Ｈｉ
ｎｄ III制限プラスミドｐＫＫ２３３−２にクローニン
グし、ｐＫＭ１を得た（図１）。精製したｐＫＫ２３３
−２のＤＮＡを、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄ IIIで供給業者
の指示する消化条件により消化し、アガロースゲル電気
泳動で展開した後、エチジウムブロマイドで染色し、検
出されたバンドのうち約４ＫｂのＮｃｏＩ、Ｈｉｎｄ I
II断片を分離、回収した。この調製物６００ngとモニタ
ーペプチドをコードするＤＮＡ断片２０ngとを混合し、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼを用い、供給業者の指示
する条件で反応させて結合した。このＤＮＡ反応液を用
い、一般に行われている塩化カルシウム法に従ってコン
ピテントセルを調製した、Ｅ．ｃｏｌｉ ｍＨ３株を宿
主として形質転換を行った。５０μg ／mlのアンピシリ
ンに耐性の形質転換体１００個を得、うち６０個の形質
転換体について、アルカリ／ＳＤＳ法による迅速プラス
ミド抽出法でプラスミドを抽出し、得られたプラスミド
ＤＮＡを、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、及びＨｉｎｄ IIIで消
化した。ここに述べた３つの酵素の認識部位は合成した
モニターペプチド遺伝子の中に設計してあり、３つの酵
素認識部位の有無、及び消化して得られたＤＮＡ断片の
大きさでスクリーニングした。その結果、５クローンに
ＫｐｎＩ部位があり、かつＮｃｏＩとＨｉｎｄ IIIの二
重消化で目的とする約１８０ｂｐの断片が認められた。
これらのプラスミドを更に大量に調製し、ジデオキシ法
によるＤＮＡ塩基配列決定法によって配列を決定した。
その結果、目的とするラットモニターペプチド合成遺伝
子を持つクローンが１個得られ、これをｐＫＭ１とし
た。

【００２５】ｐＭＪＲ９６の構築 モニターペプタイドを発現させるための発現用ベクター
ｐＭＪＲ９６を構築した。手順は以下のとおりである
（図２）。

【００２６】ｌａｃプロモーターを制御する遺伝子、ｌ
ａｃＩ^Q を持つプラスミドｐＭＪＲ１５６０（アマシャ
ム社製）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで消化して得
られる断片のうち、ｌａｃＩ^Q 遺伝子を含む１２００bp
の断片をアガロースゲル電気泳動で回収、精製した。次
にＫｐｎＩ部位側にＥｃｏＯ１０９Ｉ部位に変換する合
成オリゴヌクレオチドを、またＰｓｔＩ部位側にはＳｓ
ｐＩ部位に変換する合成オリゴヌクレオチドを結合さ
せ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＳｓｐＩを各端に持つｌａｃ
Ｉ^q 遺伝子断片を作成した。また、ベクターとして、ｐ
ＵＣ１９を制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＳｓｐＩで消化
して、２５００bpの断片をアガロースゲル電気泳動で回
収、精製した。

【００２７】以上のようにして得たｌａｃＩ^Q 遺伝子断
片とＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＳｓｐＩ制限プラスミドｐＵＣ
１９とを常法に従ってＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼで
連結反応させ、一般に行われている塩化カルシウム法で
調製したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のコンピテントセ
ルに導入した。アンピシリン５０μg ／mlに耐性のコロ
ニーからプラスミドを抽出し、ｐＵＣ１９とｌａｃＩ^Q
遺伝子がＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＳｓｐＩで連結されたプ
ラスミドを得たことを確認し、これをｐＭＪＲ９６と名
付けた。

【００２８】このプラスミドはｐＵＣ１９由来の複製起
点、アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモーター、そ
の下流のマルチクローニング部位、及びｌａｃプロモー
ターを制御するためのｌａｃＩ^Q 遺伝子を持つ３．７Kb
のプラスミドである。

【００２９】 実施例１（変異型モニターペプチドの作成）工程１：Ｍ１３ＭＯＮ１の構築 参考例で得られた天然型モニターペプチド遺伝子を持つ
プラスミドｐＫＭ１３８μg を制限酵素ＥｃｏＲＩ及び
Ｈｉｎｄ III（宝酒造社製）で切断し、アガロースゲル
上で電気泳動を行い、モニターペプチド遺伝子を含むＥ
ｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ III断片を分離、回収して調製し
た。別にベクターＭ１３ｔｖ１８複製型ＤＮＡ（ＲＦ−
ＤＮＡ）１０μg を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ III
で切断し、マルチクローニングサイトを除去した後、ア
ルカリフォスファターゼ処理にて切断されたベクターの
５’末端の脱リン酸を行った。上記の方法で調製された
ベクターとインサートＤＮＡ（モニターペプチド遺伝子
のＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ III断片）のモル比を１：１か
ら３：１まで変えて、宝酒造社製のＤＮＡライゲーショ
ンキットを用いて１６℃で一夜反応させることによって
ライゲーションを行った。通常の塩化カルシウム法によ
り調製したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のコンピテント
細胞１００μl に、ライゲーション反応液の半量を混合
し、ライゲーションキット供給者の指示に従い形質転換
を行った。形質転換体よりＲＦ−ＤＮＡを調製し、制限
酵素による分析を行い、天然型モニターペプチドの構造
遺伝子を持つクローンを１２個得た。そのうちの１つを
選び、そのクローンが保持する組換え型ファージベクタ
ーをＭ１３ＭＯＮ１とした。

【００３０】工程２：変異型モニターペプチド遺伝子の作成 天然型モニターペプチドの第４７と４８位のアミノ酸を
他のアミノ酸に置換するためにＭｕｔａｎ Ｇ Ｋｉｔ
（宝酒造社製）を用い部位特異的変異をＤＮＡに導入し
た。変異導入用ミスマッチプライマーの合成は、ＤＮＡ
合成機（ミリジェンバイオサーチ社製）を用いて常法に
従って行い、置換を行いたいアミノ酸配列をコードする
領域の塩基配列を合成した。それぞれの部位を置換する
ために合成したオリゴマーの配列は、以下に示す。 （１）第４７−４８位アルギニン−リジンからヒスチジ
ン−アスパラギンへの置換 5'-GATGTGGATG GAAGTGCCGA AGTTATGGTT CTCAAAACAC AGGCTAC-3' （２）第４７−４８位アルギニン−リジンからセリン−
スレオニンへの置換 5'-GATGTGGATG GAAGTGCCGA ATGTACTGTT CTCAAAACAC AGGCTAC-3'

【００３１】工程１で得たＭ１３ＭＯＮ１の一本鎖ＤＮ
Ａ５００ngを含む溶液３．３μl に、Ｍ１３ｍｐＰのＤ
ＮＡ溶液１μl 、アニーリングバッファー１μl 及び水
６．７μl を加え、１００℃で３分間処理後、６５℃に
１０分続いて３７℃に１０分間保温することにより、ギ
ャップド二重鎖ＤＮＡを形成させた。形成されたギャッ
プド二重鎖ＤＮＡ １μl に５’末端をリン酸化した上
記のプライマーＤＮＡ１μl を混合し、６５℃で１５分
間、引き続いて３７℃で１５分間アニーリングを行っ
た。この反応液に伸長バッファー２５μl 、大腸菌ＤＮ
Ａリガーゼ１μl とＴ４ＤＮＡポリメラーゼ１μl を加
え２５℃で２時間反応させた。反応後、０．２Ｍ ＥＤ
ＴＡ（pH８．０）３μl を加え６５℃で５分間処理し反
応を停止した。

【００３２】上記操作で得られたＤＮＡを含む溶液１μ
l と、大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ溶液１０μl を
混合し、ＳＯＣ培地中で１時間培養したのち、遠心して
培養上清を回収した。回収した培養上清をファージ希釈
バッファーで１０〜１００倍に希釈し、大腸菌ＭＶ１１
８４に感染させた。感染された大腸菌をＬＢ寒天培地に
まき、プラークを形成させた。次にプラークから得られ
たファージを大腸菌ＪＭ１０９に感染させ、ＬＢ液体培
地中で一晩培養を行って培養上清を得た。この培養上清
０．８mlに２００μl のＰＥＧ／ＮａＣｌを加え、よく
混合して１５分間放置後、遠心分離にて沈澱を集めた。
この沈澱に１００μl のＴＥ及びＴＥで飽和したフェノ
ール１５０μl を加えて十分に攪拌した。次に遠心分離
を行い、水層を分離し、この水層にｃｈｌｏｒｏｆｏｒ
ｍ／ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ（２４：１）の混合
液１５０μl を加え、同様の操作を繰り返して水層を分
離した。次に冷却したエタノールを加えて一本鎖ＤＮＡ
を沈澱させ、遠心分離にて集めた。この一本鎖ＤＮＡを
鋳型として、当業者公知のダイデオキシ法により塩基配
列を確認して、目的の変異型ＤＮＡを得た。天然型モニ
ターペプチドの第４７、４８位のアルギニン、リジンが
それぞれヒスチジン、アスパラギンに、又はそれぞれセ
リン、スレオニンに置き換えられた変異型遺伝子を持つ
組換え型ファージベクターを、それぞれＭ１３ＭＯＮ
３、Ｍ１３ＭＯＮ４とした。

【００３３】工程３：変異型モニターペプチド遺伝子の
ｐＭＪＲ９６への組み込み 工程２で得られたそれぞれの変異型モニターペプチド遺
伝子の組換え型ファージーベクターを保持するクローン
から二本鎖の複製型ＤＮＡを調製し、その１０μg をＥ
ｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIで処理した後、アガロースゲル
電気泳動を行い、変異型モニターペプチド遺伝子断片を
単離調製した。３μg の発現用ベクターｐＭＪＲ９６を
同様の操作にてＥｃｏＲ I、ＨｉｎｄIIIで処理し、マ
ルチクローニングサイトの小さい断片を除去し、ベクタ
ー部分を得た。このようにして得られた変異型モニター
ペプチド遺伝子断片とベクターを混合して、工程１の操
作と同様にライゲーションを行い、各変異型モニターペ
プチドの発現型プラスミドを構築した。この反応液を用
いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換された大
腸菌ＤＨ５αから、常法によってプラスミドを単離して
塩基配列の確認を行い、目的通りに変異していることを
確認した。その結果、Ｍ１３ＭＯＮ３由来の遺伝子断片
は配列番号１に示す塩基配列を有し、Ｍ１３ＭＯＮ４由
来の塩基配列は配列番号２に示す塩基配列を有してい
た。モニターペプチドの第４７、４８位のアルギニン、
リジンがそれぞれセリン、スレオニンに、又はそれぞれ
ヒスチジン、アスパラギンに置き換えられた変異型遺伝
子の発現ベクターをそれぞれｐＭＯＮ１０及びｐＭＯＮ
１１とした。

【００３４】工程４：変異型モニターペプチド遺伝子を持つ菌の培養 工程３で得たプラスミドｐＭＯＮ１０及びｐＭＯＮ１１
のそれぞれを用いて大腸菌ＹＫ３３４０株を形質転換し
た。該菌株の性質については、文献（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｇｙ，３４，６３７−６４９，
１９６８）に記載されている。形質転換菌株をリットル
あたりバクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化
ナトリウム５ｇ、及びアンピシリン５０mgを含有する培
地中で培養し、更に培養途中で発現を誘導した。試験管
に５mlずつ分注した上記の培地に、該菌株を接種し、更
に３〜４時間３７℃で培養し、６６０nmの吸光度が０．
８に達した時点で、発現誘導剤であるＩＰＴＧ（ｉｓｏ
ｐｒｏｐｙｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎ
ｏｓｉｄｅ）溶液を最終濃度１mMになるように添加し
た。ＩＰＴＧ添加後３時間で培養を終了し、４℃におい
て４８００×ｇ、１０分間の遠心で菌体を集めた。

【００３５】工程５：変異型モニターペプチドの精製 収集した菌体８ｇを氷冷した６Ｍ塩酸グアニジン、pH
７．５の溶液８０mlで懸濁し、超音波破砕装置で菌体を
破壊した。遠心分離で固形物を沈澱させて上清を得、こ
れを１０倍量の０．１％トリフルオロ酢酸溶液で希釈し
た。再び遠心分離で固形物を除いた後、上清約８００ml
を得た。この溶液を予め、０．１％トリフルオロ酢酸で
平衡化したＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｃ１８（ウォータ
ーズ社製）カラム（１．８×１０cm）にかけ、０．１％
トリフルオロ酢酸溶液中でアセトニトリルの濃度勾配で
溶出した。減圧濃縮機で溶出画分からアセトニトリルを
除いた後、凍結乾燥した。凍結乾燥標品を１０mM酢酸ナ
トリウム、pH４．５に溶かし、ＦＰＬＣ^TM装置でＭｏｎ
ｏＳ^TMカラム（共にファルマシア社製）に供し、塩化ナ
トリウムの濃度勾配で溶出した。得られた画分をウェス
タンブロットとして知られる方法で分析し、変異型モニ
ターペプチドを含む画分を検出した。すなわち、分析し
たいサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
で展開し、ニトロセルロース膜に電気的に転写した。１
次抗体に天然型モニターペプチドのアミノ末端側１８ア
ミノ酸に対するウサギ抗体、２次抗体に西洋ワサビペル
オキシダーゼで標識された抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（バ
イオラッド社製）を用いた。最終的にペルオキシダーゼ
による発色で、変異型モニターペプチドと思われるバン
ドを確認した。更に、ＨＰＬＣのＣ１８カラムにかけ、
アセトニトリルの濃度勾配で溶出して、最終精製標品を
得た。それぞれの変異型モニターペプチドの精製法は同
一である。得られた標品はそれぞれ、ペプチドシークエ
ンサーＰＳＱ−１（島津製作所製）を用いてアミノ酸配
列を確認した。その結果、ｐＭＯＮ１０より得られたペ
プチドは配列番号３に示すアミノ酸配列を有し、ｐＭＯ
Ｎ１１より得られたペプチドは配列番号４に示すアミノ
酸配列を有していた。

【００３６】実施例２ （トリプシン阻害活性の測定） トリプシン阻害活性は、ウシ膵トリプシンの基質である
ＢＡＰＮＡ（α−Ｎ−ｂｅｎｚｏｙｌ−ＤＬ−ａｒｇｉ
ｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ ｈｙｄｒｏ
ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を分解することによって発色する反
応を阻害することによって測定した。９６穴マイクロプ
レート（ヌンク社製）の各ウェルに、５０μg ／mlの濃
度に水に溶かした変異型モニターペプチドを１０μl 入
れ、０．００１Ｎ塩酸に溶かした０．１mg／mlのトリプ
シン（シグマ社製）溶液１０μl と、１５０mM酢酸ナト
リウムpH４．９を１０μl 加え、３７℃に５分間保存し
た。次に、予め１０．９mgのＢＡＰＮＡを５００μl の
ジメチルスルフォキシドに溶解した後、５０mlの５０mM
トリスバッファーpH８．２／２０mM塩化カルシウムで希
釈することによって調製した基質溶液２００μl 加え、
３７℃で２〜３時間反応させ、波長４０５nmの吸光度を
測定した。トリプシンのみの吸光度が０．６以上の時
に、吸光度が０．１以下に発色を抑制する場合を阻害活
性＋とした。得られた結果を表１に示す。

【００３７】実施例３ （結合活性測定）工程１：小腸上皮細胞の調製 クレストフィールドらの胃粘膜から細胞を単離する方法
（Ｃｒｅｓｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９６３）に
準じて行った。切り出されたラットの小腸を氷冷した
０．１５５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、空腸粘膜をスパ
チュラで剥離した。粘膜を５mlのＭ１９９培地に移し、
０．１mg／mlのコラゲナーゼ、０．０５mg／mlのデオキ
シリボヌクレアーゼＩ（いずれもシグマ社製）、２mg／
mlのディスパーゼ（合同酒精社製）の存在下３７℃で３
０分間反応させた。５０×ｇで５分間の遠心にて上清と
沈澱を分け、沈澱は、１mM ＥＤＴＡ、１１８mM Ｎａ
Ｃｌ、５mM ＫＣｌ、１．２mM ＫＨ₂ＰＯ₄ 、２５mM
ＮａＨＣＯ₃ 及び２％牛血清アルブミンを含む２５mM
ＨＥＰＥＳ pH７．４に懸濁して３７℃で２０分間振
盪した。再び５０×ｇで５分間の遠心を行って得た上清
と、先の操作の上清を混合して、金属メッシュＮｏ．２
００引続き金属メッシュＮｏ．４００で濾過した。濾液
を１０００×ｇで３０分間遠心して細胞を集め、結合バ
ッファー（１２８mM ＮａＣｌ，５mM ＫＣｌ，３mM
ＭｇＳＯ₄ ，０．９mM ＣａＣｌ₂ ，０．１mM ＮａＨ
ＰＯ₄ ，１０mM ＨＥＰＥＳ pH７．５）で２回洗浄し
て調製した。

【００３８】工程２：ヨードラベル化モニターペプチドの調製 公知の方法（Ｋ．Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，８９５６−８９５９，１９８
７）に従って、ラット膵液から精製したモニターペプチ
ド１２μg に、３７ＭＢｇのＮａ¹²⁵Ｉを加え、通常ペ
プチドのラジオアイソトープラベルに用いられる公知の
クロラミンＴ法（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄｅｔ ａｌ．，１
９６３）により、モニターペプチドのヨードラベル化を
行った。

【００３９】工程３：結合活性測定 微量遠心チューブ内において工程１で調製された１×１
０⁶ の小腸細胞に、膵液から得られたモニターペプチ
ド、又は遺伝子組換え天然型又は変異型モニターペプチ
ドを１μg 加え、５分間インキュベーションした。小腸
細胞に何も加えなかったものをコントロールとした。次
に、工程２で調製されたヨードラベルしたモニターペプ
チド１ngを加え、最終濃度を１００μl に調製した後、
３７℃で１時間反応させた。更に、沈澱を氷冷したバッ
ファーで２回洗浄し、細胞に結合しなかったヨードラベ
ル化モニターペプチドを完全に除いた。次に、沈澱を
０．１５５Ｍ ＮａＣｌを含む５０mM Ｇｌｙｃｉｎｅ
塩酸pH３．０で洗浄し、４℃で１５００×ｇ、５分間遠
心した上清に遊離した放射活性をガンマーカウンターで
測定して、これを細胞への特異的な結合活性とした。結
果を表１に示す。

【００４０】

【表１】

【００４１】

【発明の効果】本発明の変異型モニターペプチドは、Ｃ
ＣＫ放出活性及びＥＧＦ様活性を引き起こす小腸上皮細
胞への結合能において天然型モニターペプチドよりも優
れていることから、膵炎に代表される消化器疾患の治療
剤として有用である。また、本発明のペプチドは４７、
４８位の塩基性アミノ酸が他のアミノ酸に置換されてい
るためこの部位におけるプロテアーゼによる分解を受け
難く、効果が持続的である。

【００４２】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：183 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGTAACCCGC CGGCTGAAGT AAATGGTAAA ACTCCGAACT GTCCGAAACA GATCATGGGT 60 TGTCCGCGTA TCTACGACCC GGTTTGTGGT ACCAACGGTA TCACTTACCC GTCTGAGTGT 120 AGCCTGTGTT TTGAGAACCA TAACTTCGGC ACTTCCATCC ACATCCAGCG CCGTGGGACC 180 TGT 183

【００４３】配列番号：2 配列の長さ：183 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGTAACCCGC CGGCTGAAGT AAATGGTAAA ACTCCGAACT GTCCGAAACA GATCATGGGT 60 TGTCCGCGTA TCTACGACCC GGTTTGTGGT ACCAACGGTA TCACTTACCC GTCTGAGTGT 120 AGCCTGTGTT TTGAGAACAG TACATTCGGC ACTTCCATCC ACATCCAGCG CCGTGGGACC 180 TGT 183

【００４４】配列番号：3 配列の長さ：61 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Asn Pro Pro Ala Glu Val Asn Gly Lys Thr Pro Asn Cys Pro Lys 1 5 10 15 Gln Ile Met Gly Cys Pro Arg Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asn 20 25 30 Gly Ile Thr Tyr Pro Ser Glu Cys Ser Leu Cys Phe Glu Asn His Asn 35 40 45 Phe Gly Thr Ser Ile His Ile Gln Arg Arg Gly Thr Cys 50 55 60

【００４５】配列番号：4 配列の長さ：61 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Asn Pro Pro Ala Glu Val Asn Gly Lys Thr Pro Asn Cys Pro Lys 1 5 10 15 Gln Ile Met Gly Cys Pro Arg Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asn 20 25 30 Gly Ile Thr Tyr Pro Ser Glu Cys Ser Leu Cys Phe Glu Asn Ser Thr 35 40 45 Phe Gly Thr Ser Ile His Ile Gln Arg Arg Gly Thr Cys 50 55 60

【図面の簡単な説明】

【図１】モニターペプチドをコードする合成ＤＮＡの二
重鎖と、プラスミドｐＫＫ２３３−２をＮｃｏＩとＨｉ
ｎｄ IIIで消化して得られたものとのライゲーションに
よるプラスミドｐＫＭＩの構築を模式的に示す図であ
る。

【図２】プラスミドｐＪＭＲ１５６０とプラスミドｐＵ
Ｃ１８とからのプラスミドｐＭＪＲ９６の構築を模式的
に示す図である。

【図３】プラスミドｐＭＪＲ９６とファージベクターＭ
１３ＭＯＮ３又はファージベクターＭ１３ＭＯＮ４とか
らのプラスミドｐＭＯＮ１０又はプラスミドｐＭＯＮ１
１の構築を模式的に示す図である。

【手続補正書】

【提出日】平成４年３月１７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３８】工程２：ヨードラベル化モニターペプチドの調製 公知の方法（Ｋ．Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，８９５６−８９５９，１９８
７）に従って、ラット膵液から精製したモニターペプチ
ド１２μｇに、３７ＭＢｑのＮａ^１２５Ｉを加え、通常
ペプチドのラジオアイソトープラベルに用いられる公知
のクロラミンＴ法（ＧｒｅｅｎＷｏｏｄｅｔ ａｌ．，
１９６３）により、モニターペプチドのヨードラベル化
を行った。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】プラスミドｐＭＪＲ１５６０とプラスミドｐＵ
Ｃ１８とからのプラスミドｐＭＪＲ９６の構築を模式的
に示す図である。

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＪ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00 8318−4Ｈ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のアミノ酸配列 Gly Asn Pro Pro Ala Glu Val Asn Gly Lys Thr Pro Asn Cys Pro Lys Gln Ile Met Gly Cys Pro Arg Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Pro Ser Glu Cys Ser Leu Cys Phe Glu Asn X¹ X² Phe Gly Thr Ser Ile His Ile Gln Arg Arg Gly Thr Cys （配列中、X¹ X² はHis Asn 又はSer Thr を示す）を有
   する変異型モニターペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載のアミノ酸配列をコードす
   る塩基配列を有する変異型モニターペプチド遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１記載のアミノ酸配列をコードす
   る塩基配列が、 GGTAACCCGCCGGCTGAAGTAAATGGTAAAACTCCGAACTGTCCGAAACAGATCATGGGTTGTCCGCGTA TCTACGACCCGGTTTGTGGTACCAACGGTATCACTTACCCGTCTGAGTGTAGCCTGTGTTTTGAGAACZZ ZEEETTCGGCACTTCCATCCACATCCAGCGCCGTGGGACCTGT （配列中、ZZZEEEはCATAAC又はAGTACAを示す）である請
   求項２記載の変異型モニターペプチド遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項２記載の遺伝子をベクターに挿入
   した組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項２記載の遺伝子をベクターに挿入
   した組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換された宿主細胞
   を培養し、当該培養物より変異型モニターペプチドを採
   取することを特徴とする変異型モニターペプチドの製造
   方法。