JPH06253837A - ヒト・膵臓エラスターゼｉｉｉａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】配列表の配列番号：２に表される＋１位のVal
から＋242 位のHis までのアミノ酸配列で示されるヒト
・膵臓エラスターゼIII Ａ。 【効果】本発明により、ヒト・膵臓エラスターゼIII A
を大量に得ることが可能になる。この遺伝子産物ヒト・
膵臓エラスターゼIII A は、新規動脈硬化剤として有効
に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト・膵臓エラスター
ゼIII Ａ、それをコードする塩基配列を含有するDNA 、
それで形質転換せしめた宿主および該宿主を用いるヒト
・膵臓エラスターゼIII Ａの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エラスターゼは、セリン・プロテアーゼ
の１種であり、繊維状の不溶性蛋白質であるエラスチン
を加水分解する酵素である。エラスチンは、硬蛋白質の
１種で、高等動物の結合組織、腱、大動脈外皮、頸索を
構成しており、ペプシン、トリプシンによりわずかに分
解される。

【０００３】Balo' らは、動脈硬化症の研究途上で、血
管壁のエラスチン繊維の分解を認め、１９４９年、その
分解酵素の存在を推定した。〔 Balo' , J. and Banga,
I. : Schweiz Z. Pathol. Bacteriol., 12, 350 (194
9) 〕。つづいて、Banga は、１９５２年、エラスチン
を特異的に分解する酵素を、膵臓のなかに発見し、結晶
状に取り出し、エラスターゼと命名した。〔Banga, I.
: Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 3, 317 (1952)
〕。

【０００４】エラスターゼは、ヒト、猿、猫、兎等ほと
んどの動物の膵臓に存在することが確認されており、そ
の含量はヒトが3.1mg/膵臓g 、牛が2.2mg/g 、ラットが
10.2mg/g程度である。ヒトのエラスターゼ活性と、年令
との関係が認められており、男４０才以上、女６０才以
上では膵臓および血漿中のエラスターゼ活性が著しく低
下していた〔Loeven, W. A., and Maureen M. Baldwin.
: Gerontologia, 17,170 (1971) 〕。

【０００５】動脈硬化症の患者の場合、膵臓のエラスタ
ーゼの活性は、健常人のそれより著しく低下している
か、または消失していた〔 Balo' , J., and Banga,
I.: Nature, 178, 310 (1956) 〕。なお、エラスターゼ
はエラスチンを酵素的に分解するだけでなく、その生合
成をも促進することが、その後の研究で明らかとなって
きた。

【０００６】ラット、兎などを用いて、エラスターゼの
薬理作用が研究されており、以下のような効果が明らか
となった。

【０００７】１）動脈壁への脂質およびカルシウムの沈
着抑制作用 ２）動脈壁のコレステロールおよびカルシウムの除去作
用 ３）変性エラスチンに対する選択的分解作用 ４）動脈壁弾力線維の新生促進作用 ５）血清脂質低下作用 ６）リポ蛋白代謝改善作用 以上の研究をもとに行った臨床研究において、エラスタ
ーゼを経口投与した結果、以下のような効果が明らかと
なった。

【０００８】１）動脈壁の弾力性・伸展性の回復作用 ２）血清脂質異常の改善作用 ３）リポ蛋白代謝の改善作用 上記の研究には、ブタの膵臓より抽出精製したエラスタ
ーゼが用いられた。しかし、ブタエラスターゼをヒトに
投与した場合、それはヒトにとって異種タンパク質であ
るから、抗体産生が生じ、患者への再度の投与はアナフ
ィラキシーをおこす危険性がある（特開昭59−11180)。
従ってヒトに投与する場合は、ヒトエラスターゼを用い
るのが好ましい。しかし、ヒトエラスターゼを十分量入
手することは極めて困難であった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
組換えDNA 技術を用いて、ヒトの膵臓のエラスターゼII
I Ａ遺伝子をクローニングし、得られた組換えDNA 分子
を宿主に移入して、ヒト・膵臓エラスターゼIII Ａ遺伝
子を発現せしめ、目的とするエラスターゼIII Ａを得る
ことのできる技術の開発研究を行った結果、本発明を完
成するにいたった。

【００１０】現在、２種のヒト・膵臓エラスターゼの存
在は、すでに、知られているが、その特性付けは、いま
だ充分にはおこなわれておらず、そのうちの１種のアミ
ノ酸配列は、そのプロ部分の１２個および本体のわずか
４個が明らかにされている〔C. Largman et al; Biochi
m. Biophys. Acta, 623, 208 (1980) 〕のみで、その構
造は、現在までまったく不明であった。ところが、本発
明者らにより、そのアミノ酸配列のすべておよびそのDN
A 配列のすべてが明らかにされるに至った。本発明によ
り明らかとなったアミノ酸配列は、上述の如く、わずか
に明らかにされたアミノ酸配列とは異なり、本発明がま
ったくの新規物質に係るものであることが明らかであ
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、ヒ
ト・膵臓エラスターゼIII Ａに関するものである。

【００１２】本発明は、配列表の配列番号：２に表され
る＋１位のVal から＋242 位のHisまでのアミノ酸配列
で示されるヒト・膵臓エラスターゼIII Ａに関する。そ
して、式中、(N) −末端には水素原子、Met 、あるいは
プロ及びプレ部分として、配列表の配列番号：２に表さ
れる−28位のMet から−１位のArg までのアミノ酸配列
の一部または全部を有していてもよい。

【００１３】特に、本発明のヒト・膵臓エラスターゼII
I Ａは、配列表の配列番号：１の100 〜102 位のGTT か
ら823 〜825 位のCAC よりなる（ただし、826 〜828 位
のTAA は、TGA またはTAG でもありうる) 塩基配列(DNA
(II))またはそれと同効の塩基配列を含有するDNA 配列
でコードされる。

【００１４】上記DNA (II)は、その５’末端にＡＴＧ、
または配列表の配列番号：１の16〜18位のATG から97〜
99位のCGC よりなる塩基配列の一部または全部を有して
いてもよい。

【００１５】DNA (II)がＡＴＧを有するときには、配列
表の配列番号：２に表される＋１位のVal から＋242 位
のHis までのアミノ酸配列で示されるポリペプチド(II
I) に加えて、(III) のＮ末端にMet を有するポリペプ
チドをコードする。

【００１６】DNA (II)の5'末端に配列表の配列番号：１
の16〜18位のATG から97〜99位のCGC よりなる塩基配列
を有するときには、ポリペプチド(III) に加えて、(II
I) のＮ末端に配列表の配列番号：２に表される−28位
のMet から−１位のArg までのアミノ酸配列のを有する
ポリペプチドをコードする。

【００１７】式(II)で表される塩基配列またはそれと同
効の塩基配列を含有する本発明のDNA は、たとえば以下
に示す（イ）〜（ニ）のステップにより製造することが
できる。

【００１８】(イ) ヒトの膵臓より、mRNAを分離する。

【００１９】(ロ) このmRNAおよび逆転写酵素を用いてc
DNAバンクを作製する。

【００２０】(ハ) 作製したcDNAバンクから、たとえ
ば、ブタエラスターゼI cDNAをプローブに用い、目的と
するヒトエラスターゼIII ＡをコードするcDNAを含有す
るプラスミドを単離する。

【００２１】(ニ) このプラスミドから目的とするクロ
ーン化DNA を切り出す。

【００２２】膵臓のRNA 抽出にあたっては、グアニジン
・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン
・チオシアネート・塩化セシウム法なども採用しうるが
グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法が以
下の点で、上述の２法より優れている。(1) 操作が簡単
である。(2) 抽出・回収率が高い。(3) 比較的大量の臓
器からの抽出が可能である。(4) DNA が混入してこな
い。(5)RNAの分解が少ない。

【００２３】真核細胞の細胞質に存在するmRNAの多く
は、その3'末端にポリA 配列をもつことが知られている
ので、この特徴を利用して、オリゴ(dT)セルロースのカ
ラムにmRNAを吸着せしめて、つぎに、これを溶出して精
製する。

【００２４】得られたmRNAを鋳型として、逆転写酵素を
用いて相補的二重鎖DNA を合成するが、その方法として
はS1ヌクレアーゼ法〔Efstratiadis, A. et al. : Cel
l. 7,279 (1976) 〕、Land法〔Land. H. et al. : Nucl
eic Acids Res., 9, 2251 (1981)〕、Okayama-Berg法
〔Okayama, H. and P. Berg: Mol. Cell. Biol., 2, 16
1 (1982)〕、O. Joon yoo 法〔O. Joon Yoo, et al.: P
roc. Natl. Acad. Sci.USA. 79, 1049 (1982)〕など採
用しうるが、本発明の目的には、Okayama-Berg法が好適
であった。

【００２５】つぎに、得られた組換えプラスミドを大腸
菌、たとえばRR1 株に導入して形質転換させる。テトラ
サイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性を、指標とし
て、組換え体を選択することができる。

【００２６】得られた組換え体のなかから、エラスター
ゼIII ＡをコードするDNA を含有するクローンを選択す
るためには、³²P でラベルしたブタエラスターゼI (特
開昭60−207583) cDNAをプローブに用いるコロニーハイ
ブリダイゼーション法を用いた。

【００２７】選択されたクローンに含有される塩基配列
の決定は、ファージM13 を用いたジデオキシヌクレオチ
ド合成鎖停止の方法〔Messing, J. ら: Nucleic Acids
Res., 9, 309 (1981) 〕およびMaxam-Gilbert 法〔Maxa
m, A.M. and Gilbert, W. :Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 74, 560 (1977)〕で実施しうるが、本発明ではジデ
オキシヌクレオチド合成鎖停止の方法を採用し、ヒト・
膵臓エラスターゼIIIＡを完全にコードするDNA を有す
るクローンを決定した。

【００２８】つぎに、得られたクローンからエラスター
ゼIII Ａ遺伝子を切り出し、これを適当な発現ベクター
につないで、適当な宿主に導入して発現せしめることが
できる。

【００２９】プロモーターとしては、大腸菌において
は、トリプトファン(trp) プロモーター、ラクトース(l
ac) プロモーター、トリプトファン・ラクトース(tac)
プロモーター、リポプロテイン(lpp) プロモーター、バ
クテリオファージ由来のラムダ(λ) P L プロモータ
ー、ポリペプチド鎖伸長因子Tu(tufB)プロモーターなど
を使用しうる。

【００３０】宿主としては、大腸菌、枯草菌などの細
菌、酵母などの微生物のほか、動物細胞を採用しうる。
本発明においては、大腸菌（LE392 、YA21など）が宿主
としては好適である。

【００３１】本発明のDNA を大腸菌の宿主に、形質転
換、導入する方法としては、Hanahanの方法〔Hanahan,
D.: J. Mol. Biol., 166, 557 (1983) 〕、塩化カルシ
ウム法〔Dagert, M. and S. D. Ehrlich: Gene, 6, 23
(1979)〕、低pH法〔高木康敬編著：遺伝子操作マニュア
ル，ｐ．４９，講談社サイエンティフィク(1982)〕等を
使用しうる。本発明においては、Hanahan の方法が好適
であった。

【００３２】このようにして得た宿主 (組換え体) を、
公知の培地で培養し、培養物の中に、配列表の配列番
号：２に表される＋１位のVal から＋242 位のHis まで
のアミノ酸配列で示されるペプチドまたはその同効物質
を生成蓄積せしめ、これを採取することにより本発明の
目的を達することができる。

【００３３】培地としては、グルコース、カザミノ酸な
どからなる培地、例えば、M9培地〔Miller, J. : Exper
iments in Molecular Genetics, 431 〜433 (Cold Spri
ng Harbor Lab., New York (1972))〕が挙げられる。組
換え体の培養は、通常、１５〜４３℃で、３〜２４時間
行い、必要に応じて、通気や攪拌を加えることができ
る。なお、動物細胞を宿主とする場合には、３〜１０日
間の培養を必要とする。

【００３４】培養後は、組換え体細胞を、公知の方法、
例えば遠心分離等で集める。宿主として、枯草菌、酵
母、動物細胞などを用いる場合、ベクターの選択によっ
ては、生産されたエラスターゼIII Ａは細胞外に出て、
上澄液に含まれる。

【００３５】一方、大腸菌を宿主とした場合、生産され
たエラスターゼIII Ａは、不溶性の蛋白として、その細
胞内のinclusion bodyに含まれる場合が多い。この場合
は、菌体を破壊して遠心分離することにより、生産され
たエラスターゼIII Ａは沈澱物として得られる。

【００３６】菌体の破壊の方法としては、超音波処理、
リゾチーム処理、凍結融解処理等を採用することができ
る。該上澄液または沈澱物からのエラスターゼの単離
は、通常知られている蛋白質の精製方法により実施しう
る。

【００３７】

【作用】本発明により製造されるエラスターゼIII Ａ
は、ヒト膵液より抽出精製したエラスターゼと同等の生
物学的活性を示し、これと同様の目的に、同様の用法に
より使用することができる。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００３９】(1) ヒト膵臓よりのmRNAの分離 5.5 g のヒト膵臓 (剖検試料) をグアニジンチオシアネ
ート溶液 (4Mのグアニジンチオシアネート, 1 ％のサル
コシル, 20mMのエチレンジアミン四酢酸 (EDTA), 25 mM
のクエン酸ナトリウム (pH 7.0), 100mMの2-メルカプト
エタノール, 0.1 ％のアンチフォームA)中でポリトロン
によって破壊、変性した後、遠心して上澄みを得た。こ
れに0.025 倍量の１Ｍ酢酸および0.75倍量のエタノール
を加え、−20℃で数時間冷却した後、遠心処理によって
沈澱を得た。次にこの沈澱をグアニジンハイドロクロラ
イド溶液 (7.5Mのグアニジンハイドロクロライド・25mM
のクエン酸ナトリウム (pH7.0), 5 mMのジチオスレイト
ール (DTT)に懸濁し、0.02５倍量の1 M 酢酸および0.5
倍量のエタノールを加え、−20℃で数時間冷却した後、
遠心処理を行った。ここで得られた沈澱をグアニジンハ
イドロクロライド溶液に再懸濁し、酢酸、エタノールを
加え、−20℃に冷却した後、遠心処理で沈澱を集めた。
次に、この沈澱をエタノールで数回洗い、混在している
グアニジンハイドロクロライドを除き、蒸留水に溶かし
た後にエタノールでRNA を沈澱させた。遠心分離により
沈澱を集め、53.9mgのRNA を得た。

【００４０】こうして得たRNA を高塩溶液 (0.5MのNaC
l, 20mMのTris-HCl (pH7.5), 1mM のEDTA, 0.1 ％のド
デシル硫酸ナトリウム(SDS))中でオリゴ(dT)セルロース
カラムに吸着させた後、ポリ(A) を含むmRNAを溶出溶液
(10mMのTris-HCl (pH 7.5), 1mMのEDTA, 0.05％のSDS)
で溶出させ、255 μg のmRNAを得た。

【００４１】(2)cDNA バンクの作製 cDNAバンクの作製は、 Okayama-Berg 法に従って行っ
た。すなわち、5 μg のmRNA及び24ユニットの逆転写酵
素を20μl の反応液〔50mMのTris-HCl pH8.3、8mM のMg
Cl₂ 、30mMのKCl 、0.3mM のDTT 、2mM のdATP、2mM の
dGTP、2mM のdCTP、2mM のdTTP、10μCiのα−³²P dCT
P、1.4 μg のベクター・プライマーDNA(PL-Pharmacia
より購入) 〕中で、42℃、60分反応させた。

【００４２】2 μl の0.25M EDTAと1 μl の10％ SDSを
加えた反応を止めた後、20μl のフェノールクロロフォ
ルムで除蛋白を行った。遠心した後、水層をとり、20μ
l の4 M 酢酸アンモニウムと80μl のエタノールを加
え、−70℃、15分間冷却した。次いで、遠心して沈澱を
集め75％エタノールで沈澱を洗った後、減圧乾燥した。

【００４３】沈澱を15μl のターミナルトランスフェラ
ーゼ反応液 (140mM のカコジル酸カリウム、30mMのTris
-HCl pH 6.8 、1mM の塩化コバルト、0.5mM のDTT 、0.
2 μg のpoly A、100 mMのdCTP) に溶かした。

【００４４】37℃で 3分間反応液をあたためた後、18ユ
ニットのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを加え、５分間反応させた。次に、 1μl の0.
25MEDTA及び0.5 μl の10％SDS を加え反応をとめた
後、フェノール・クロロフォルムで除蛋白を行った。反
応液を遠心後、水層をとり、15μl の4 M 酢酸アンモニ
ウム、60μl のエタノールを加えよく混合した。−70℃
に15分間おいた後、遠心して沈澱を集めた。

【００４５】沈澱を10μl の制限酵素用緩衝液 (50mMの
NaCl、10mMのTris-HCl pH 7.5 、10mMのMgCl₂ 、1mM の
DTT)に溶かし、2.5 ユニットの制限酵素Hind IIIを加
え、37℃で約 1時間消化した。つぎに、フェノール・ク
ロロフォルムで除蛋白後、エタノール沈澱を行った。−
70℃で15分間冷却した後、遠心によって沈澱を集め、１
０μｌ のTE (10mMのTris-HCl pH 7.5 、1mM のEDTA)
に溶かした。

【００４６】次に、上記試料の1 μl をオリゴdG付きリ
ンカー (PL-Pharmaciaより購入) 10ngを加えた反応液
(10mMのTris-HCl pH 7.5 、1mM のEDTA、10mMのNaCl)
に加え、65℃で５分間加熱し、次いで42℃で30分間保温
した。

【００４７】氷中で反応液を冷却した後、10μl の10倍
リガーゼ緩衝液(10mM のATP 、660mM のTris-HCl pH 7.
5 、66mMのMgCl₂ 、100mM のDTT)、78μl の蒸留水、8
ユニットのT4 DNAリガーゼを加え、12℃で一晩保温し
た。

【００４８】次に、10μl の1MのKCl 、1 ユニットのリ
ボヌクレアーゼH 、33ユニットのDNA ポリメラーゼI 、
４ユニットのT4 DNAリガーゼ、0.5 μl のヌクレオチド
溶液(20mMのdATP、20mMのdGTP、20mMのdCTP、20mMのdTT
P) 、0.1 μl の50μg/μl牛血清アルブミン(BSA) を加
え、12℃で１時間、ついで25℃で１時間保温した。

【００４９】この反応液を、５倍に希釈した後、ただち
にHanahan の方法〔Hanahan. D. :J. Mol. Biol., 166,
557 (1983)〕によって、大腸菌RR1 株を形質転換し、
ヒト膵臓cDNAバンクを作製した。

【００５０】(3) ヒト・膵臓エラスターゼIII Ａ cDNA
を含有する組換え菌の分離 上述のヒト・膵臓cDNAバンクのうち4700株の組換え菌の
DNA を、Grunstein. M. and Hogness, D.S. の方法〔Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA,72, 3961 (1975)〕によっ
てニトロセルロースフィルター上に固着した。

【００５１】一方、ブタ膵臓エラスターゼI cDNA断片を
制限酵素Pst I によって切り出し、ニックトランスレー
ション法〔Rigby. P.W. et al. J. Mol. Biol., 113, 2
37(1977)〕によって³²P で標識した。このDNA 断片をプ
ローブとして、40％のホルムアミド、５倍濃度の0.15M
塩化ナトリウムおよび0.015Mクエン酸ナトリウム溶液(S
SC)、0.1 ％ BSA、0.1 ％フイコール、0.1 ％ポリビニ
ルピロリドン、0.5 ％のSDS 、10mMのリン酸ナトリウ
ム、100 μg/mlのサケ精子DNA の溶液中で、35℃にて、
フィルター上に固着させたDNA と会合させた。その後、
オートラジオグラフィーを行い、上記プローブと反応す
る７株の菌株を得た。

【００５２】これらの菌株のうちの１株に含有される組
換えプラスミドに挿入されているcDNAをCL2 と命名し
た。

【００５３】(4) CL2 のコードするアミノ酸配列とヒト
・膵臓エラスターゼIII Ａ CL2 には、270 アミノ酸をコードしうる唯一のオープン
リーデイングフレームが存在していた。その塩基配列か
ら確定したアミノ酸配列は、トリプシン、キモトリプシ
ンとは３０％程度の相同性しか示さないが、ブタ膵臓エ
ラスターゼＩとは５７％の高い相同性を示した。また、
トリプシン、キモトリプシン等のセリンプロテアーゼに
共通して見出される活性中心付近のアミノ酸配列(Gly-A
sp-Ser-Gly-Gly-Pro) が、同一の領域に存在していた。
また、セリンプロテアーゼに特徴的な電化リレーに関与
する45番目のヒスチジン残基、189 番目のセリン残基も
存在していた。

【００５４】さらに、エラスターゼにおいて基質と結合
するポケットを形成するカルボキシル末端付近のアミノ
酸配列は、CL2 がコードするそれとブタエラスターゼＩ
との間でよく似ており、基質結合ポケットに特徴的な２
１１番目のバリン残基、２２３番目のトレオニン残基
が、CL2 がコードするアミノ酸配列にも存在していた。
CL2 の塩基配列およびそれがコードするアミノ酸配列は
配列表の配列番号：１に示されている。

【００５５】CL2 によってコードされる蛋白質のアミノ
酸組成は、Largman らによって報告されているヒト膵臓
エラスターゼI のアミノ酸組成〔Largman. C. et al. B
iochemistry 15, 2491 (1976）〕と一見類似している
が、詳細な点においては明らかに異なり、また分子量も
異なっていた。また、そのアミノ酸配列より計算した等
電点は7.5 〜7.8 であった。この値は、Scheele, G. ら
によって報告されているヒト膵臓プロエラスターゼＩの
等電点7.6 〔Scheele, G. et al. Gastroenterology 8
0, 461 (1981)〕と同様な値を示した。

【００５６】CL2 によってコードされるヒト・プレプロ
エラスターゼIII Ａは、Ｎ末から28番目のアルギニン残
基のＣ末端側がトリプシンにより切断され、活性型のヒ
ト・エラスターゼIII Ａが生じる。

【００５７】CL2 は、ヒトエラスターゼIII ＡmRNAから
逆転写酵素によって合成された完全長のcDNAであるの
で、このcDNA配列を適当な発現ベクターに移すことで、
大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞などを宿主として、ヒ
ト・膵臓エラスターゼIII Ａを大量生産できる。

【００５８】(5) 動物細胞を用いたヒト・膵臓エラスタ
ーゼIII Ａの生産発現プラスミドpSV2-CL2の構築 動物細胞を宿主にしてヒトエラスターゼIII ＡcDNAを発
現させるため、図１に示す手順によってcDNAと発現用ベ
クターとを連結した。

【００５９】図１は、pSV2-CL2プラスミド構築の手順を
示す。pSV2- βグロビンはpSV2ベクターにβ−グロビン
のcDNAが挿入されているプラスミドであり、pCL2はOkay
ama-BergベクターにヒトエラスターゼIII Ａ cDNA が挿
入されているプラスミドである。平滑末端化等の反応は
“モレキュラークローニング”〔Maniatis, T. et al.
(ed) Molecular cloning" Cold Spring Harbor Lab(19
82) 〕に記載の方法に従った。太矢印はSV40由来のプロ
モーターを示し、細矢印は転写の方向を示す。H はHind
III、B はBg1 II、S はSauIIIＡを示す。

【００６０】発現用ベクターには、SV40のプロモータ
ー、エンハンサー、ポリＡシグナル、small T antigen
遺伝子の介在配列 (イントロン) を含むpSV2プラスミド
を使用した。

【００６１】ベクターとcDNAが転写方向に関して順の向
きに連結したクローンを、各種の制限酵素の切断パター
ンにより選択し、動物細胞(COS1 細胞) へリン酸カルシ
ウム法により導入 (トランスフェクション) した。

【００６２】COS1細胞への発現プラスミドpSV2-CL2の導
入 リン酸カルシウム法によるトランスフェクションはGrah
amとVan Der Ebの方法に従った〔Virology 52, 456(197
3)〕。

【００６３】トランスフェクションに使用するCOS1細胞
は直径10cmのシャーレに１×10⁶ 細胞をまき、10％牛胎
児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地で一晩培養し
た。次に、 300μg のpSV2-CL2プラスミドを12.55ml の
滅菌蒸留水に懸濁し、0.75mlの2.5MCaCl₂ を加えよく混
合した後に、ピペットを用いて溶液中に泡をたてなが
ら、1.5ml の10×HeBS溶液 (210mM のHEPES 、1.37M の
NaCl、4.7mM のKCl 、10.6M のNa₂HPO₄ 、55.5mMのブド
ウ糖pH 7.05)を滴下してDNA とリン酸カルシウムの沈澱
を形成させた。30分間室温で放置して沈澱を熟成させた
後、この1 mlを、予め10％牛胎児血清を含む新鮮な培地
に置換したCOS1細胞へシャーレ1 枚あたりに加えつづい
てこれを37℃、５％CO₂ 存在下にて12時間培養した後、
培養液を捨て、牛胎児血清を含まない新しいダルベッコ
変法イーグル培地にて置換し、更に37℃、５％CO₂ 存在
下にて、48時間培養した。なお、ここで得られた、トラ
ンスフェクションしたCOS1細胞は、ヒトエラスターゼII
IAmRNAが発現していることの確認、及び培養上清中のエ
ラスターゼ活性の測定に供される。

【００６４】COS1細胞からのmRNA抽出 トランスフェクションしたCOS1細胞中に発現プラスミド
から転写されたヒトエラスターゼIIIAmRNAが存在してい
ることを確認するため、以下のように、COS1細胞からmR
NAを抽出してノーザンブロット ハイブリダイゼーショ
ンを行った。

【００６５】48時間培養後のCOS1細胞に、シャーレ１枚
あたり、１mlのグアニジンチオシアネート溶液 (4Mのグ
アニジンチオシアネート、１％のサルコシル、20mMのエ
チレンジアミン四酢酸、25 mM のクエン酸ナトリウム
(pH 7.0) 、 100mMの2-メルカプトエタノール、0.1 ％
のアンチフォームA)を加え、細胞を融解した。次に、こ
の溶液を、21ゲージの注射針に数回通して高分子DNA を
低分子化した後、5.7Mの塩化セシウム、0.1Mのエチレン
ジアミン四酢酸溶液の上に重層し、日立RPS40 スウイン
グローターを用いて、30000rpm、20℃、17時間遠心し
た。ここで得られたRNA 沈澱を少量のエタノールで洗
い、300 μl の蒸留水に溶解した。ここでは、約10⁸ 個
のCOS1細胞より810 μg の全RNA が分離された。

【００６６】次に、分離した全RNA をAvivとLeder の方
法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA69, 1408 (1972) 〕に
従ってオリゴｄＴセルロースカラムにかけ、数μg のmR
NAを精製した。精製したmRNAの半量を使用してThomasの
方法を〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201(1980)
〕を用いてノーザンブロットハイブリダイゼーション
をおこなった。プローブには、ニックトランスレーショ
ン法〔Rigby, P.W. etal. J. Mol. Biol. 113, 237(197
7) 〕によって³²P 標識したヒトエラスターゼIII Ａ cD
NA を用いた。ハイブリダイゼーションの結果、pSV2-CL
2をトランスフェクションしたCOS1細胞のmRNAのみにプ
ローブとハイブリダイズする大きさ1.8kb の強いバンド
と、大きさ1.0kb の弱いバンドが検出された。pSV2-CL2
が転写された場合、ベクターに含まれるポリＡシグナル
で転写が終結すると1.8kb の大きさのmRNAが生じ、cDNA
に含まれるポリＡシグナルで転写が終結すると1.0kb の
mRNAが生じると推定される。ノーザンブロットハイブリ
ダイゼーションによって得られた結果はそれらの推定値
と一致した。したがって、COS1細胞中でpSV2-CL2はSV40
のプロモーターを使用して多量に発現し、転写された大
部分のmRNAはcDNAに含まれているポリA シグナルでは終
結せずにベクターに含まれているポリＡシグナルで終結
していることが明らかとなった。

【００６７】培地上清中のエラスターゼ活性 pSV2に組み込んだヒトエラスターゼIII Ａ cDNA はシグ
ナルペプチド領域を保持しているので、発現されるエラ
スターゼは培地中へプロエラスターゼとして分泌される
ことが期待される。そこで、４８時間培養後の培養液中
のエラスターゼ活性を測定したエラスターゼ活性の測定
は、Bieth らの合成基質を用いた方法〔Front. Matrix.
Biol. 6, 1 (1978)〕に従った。

【００６８】１mlの培養上清に200 μl の1MのTris-HCl
(pH 8.5) と50μl の10mg/ml のトリプシンを加え、25
℃で15分間保温することによってプロエラスターゼの活
性化処理を行った後、50μl のダイズトリプシンインヒ
ビター溶液 (10mg/ml)および10.4μl のN-メチルピロリ
ドンに溶解した125mM スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド (Suc-Al
a-Ala-Ala-pNA)を加えた。この反応液を37℃に１時間保
温した後、その410nm の吸光度を測定した。

【００６９】pSV2-CL2をトランスフェクションしたCOS1
細胞の培養液を用いてエラスターゼ活性を測定した結
果、OD₄₁₀ 値は0.21％を示し、培養液中にその活性が認
められた。しかしながら、その合成基質に対する分解活
性は、ブタエラスターゼI cDNAをpSV2ベクターに連結し
た発現プラスミドpSV2-PEL1 をトランスフェクションし
たCOS1細胞の培養上清の分解活性に比較して、5.2 ％で
あった ( [表１] )。なお、Largman らが基質Suc-Ala-
Ala-Ala-pNA に対する分解活性もブタエラスターゼに比
較して3.5 ％程度であると報告されている〔 Largman,
C. et al. Biochemistry15, 2491 (1976) 〕。従って、
ブタエラスターゼに対しては非常に鋭敏な基質であるSu
c-Ala-Ala-Ala-pNA は、ヒトエラスターゼの活性を測定
する基質としては、鋭敏な基質ではない。

【００７０】pSV2-CL2をCOS1細胞へ導入した本実施例に
おいては、ヒトエラスターゼIII Ａの生産は短期的(tra
nsient expression)であるが、pSV2-CL2プラスミドに適
当な選択マーカー (例えばneo 遺伝子、dihydrofolate
reductase 遺伝子など) を連結してCHO 細胞等に導入す
れば長期間にわたりヒトエラスターゼIII Ａを生産可能
な細胞株を得ることができる。

【００７１】

【表１】 試料 合成基質分解活性（％） pSV2-PEL1 を導入した細胞の培養上清 100 ％ pSV2-CL2を導入した細胞の培養上清 5.2％ 精製ブタエラスターゼ 100 ％ 精製ヒトエラスターゼ I 3.5％ (6) 枯草菌を用いたヒト膵臓エラスターゼIII Ａの生産発現ベクターの構築 発現ベクターの構築法は図２に示した。

【００７２】図２は、pHE010プラスミド構築の手順を示
す。pTUB218 は、枯草菌の複製開始点をもったベクター
に、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子が挿入されたプラス
ミドである。黒く塗りつぶした領域はヒト・エラスター
ゼIII ＡcDNAを示す。

【００７３】すなわち、ヒトエラスターゼIII ＡのcDNA
がクローン化されているプラスミドを、制限酵素HindII
I とBg1 IIで切断し、ヒトエラスターゼIII Ａ cDNA の
一部を含む712 塩基対のDNA 断片をアガロースゲル電気
泳動によて単離した。本DNA断片に、枯草菌α−アミラ
ーゼのシグナルペプチドの一部ならびにエラスターゼII
I Ａのアミノ末端側の24個のアミノ酸をコードする、93
塩基対からなる、合成オリゴヌクレオチド (図３) をT4
DNA リガーゼにて結合させた後、アガロースゲル電気泳
動にて、805 塩基対のDNA 断片を分離した。

【００７４】図３は、枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のシ
グナルペプチド領域および成熟ヒト・エラスターゼIII
Ａのアミノ末端側に対応するcDNAのアミノ末端側を含む
93塩基対の合成DNA を示す。（配列番号：３参照。） 一方、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子がクローニングさ
れているプラスミドpTUB228 (K. Ohmura, T. shiroza,
K. Nakamura, A. Nakayama, K. Yamane, K. Yoda, M. Y
amasaki, and G. Tamura: J. Biochem.95, 87 - 93 (19
84))を制限酵素HindIII で切断して、α−アミラーゼの
プロモーターおよびシグナルペプチドの一部含む428 塩
基対のDNA 断片、および複製開始点を含む5100塩基対の
DNA 断片を、それぞれ1.2 ％のアガロースげる電気泳動
にて単離した。428 塩基対のDNA断片はさらに制限酵素H
pa IIにて、また、5100塩基対のDNA 断片は制限酵素Bcl
Iにて切断した後、1.2 ％のアガロースゲル電気泳動に
てそれぞれ385 塩基対、およ4173塩基対のDNA 断片を単
離した。上記の３種のDNA 断片をT4 DNAリガーゼにて結
合させたのち、常法により枯草菌207 − 25 株(m^- ₁₆₃ h
srM recE4 amyE07 aroI906 leuA8 lys21; Marburg 株由
来) のプロトプラスト中に取り込ませ、再生を行ったの
ち、カナマイシン10μg/ml含有培地にて培養し、培地上
に生育可能な形質転換株を得た。目的の組換え体は、図
３に示す93塩基対のDNA をプローブに用いたコロニーハ
イブリダイゼーション法にて得られた陽性のクローンよ
りプラスミドを分離し、そのDNA の塩基配列を調べる事
により、採取した。こうして取得したクローンの一つを
pHEX010 と命名した。

【００７５】生成物の確認 前述のエラスターゼIII Ａの発現ベクター、pHEX010 を
導入した枯草菌207 −25 株は、50μg/mlのカナマイシ
ンを含むLG培地１リットル（１リットルあたり、Bacto
Tryptone (Difco) 10g, Bato Yeast Extract (difco) 5
g, NaCl 5 g,Glucose 2 g, pH7.0) にて、35℃で48時
間往復振とう培養した。

【００７６】培養終了後、培養液は４℃に冷却したの
ち、3000×g/5 分の遠心分離にて菌体を除いた後、55％
飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で12時
間攪拌した。本操作によって生じた不溶物を8000×g/20
分の遠心操作にて沈澱させたのち、上清を除き、沈澱物
を20 ml の50mM Tris - HCl (pH 8.0)に溶解した。本溶
液を、500 mlの50mMTris - HCl (pH 8.0) に対して16時
間透析し、不溶性物質を8000g ×20分の遠心分離にて除
いた。この透析内液を粗エラスターゼIII Ａ液として以
下の検定に用いた。

【００７７】試料のエラスターゼ活性は、下記の方法に
て測定した。すなわち、合成基質 N-carbobenzoxy - L
- alanine-p-nitrophenyl ester(Sigma)を50 mM Tris-H
Cl(pH8.0) に溶解して0.1mM 溶液とする。この基質液0.
25mlに対して、エラスターゼIII Ａ試料液0.25mlを添加
し、37℃にて30分間反応させたのち、410nm の吸光度を
測定した。同時に、試料液にエラスターゼの阻害剤であ
るエラスタチナールもしくはα-1- アンチトリプシンを
終濃度0.1mg/m1となるように加えて、その活性に対する
阻害密度を測定した。プロモーター部と正しく結合した
プラスミドを導入した207 −25株では、その吸光度が、
対照液と比較して、0.32上昇し、エラスターゼ活性を検
出しえた。本エラスターゼ活性は上述の２種の阻害剤に
よって抑えられることも同時に確認された。

【００７８】なお、本実施例にて使用した制限酵素や他
の酵素の反応は、酵素購入時に添付されている説明書に
記載された緩衝液および反応条件に従った。

【００７９】(7) 大腸菌を用いたヒト膵臓エラスターゼ
III Ａの生産 ヒトエラスターゼIII ＡのcDNA, CL2 を制限酵素EcoRI
及びBglII で切断し、ヒト・エラスターゼIII ＡのcDNA
を含む1215 bp のDNA 断片を分離した。これを制限酵素
Fnu4HIで部分切断し、つづいてS1ヌクレアーゼで処理し
て１本鎖部分を平滑末端として788bp のDNA 断片を得
た。別に、プラスミドPUC 8 を制限酵素Sma1で切断し、
ホスファターゼ処理して、ラクトースオペロンのプロモ
ーター、オペレーター領域と、β−ガラクトシダーゼの
一部を含むDNA 断片を分離した。

【００８０】上記二種類のDNA 断片をT4リガーゼを含む
30μl の溶液 (66mMのTris-HCl) pH7.6), 6.6mM のMgCl
₂, 10mM のDTT, 1mMのATP, 2.5ユニットのT4リガーゼ)
中で６℃、72時間保温し、両DNA 断片を連結させた (
[図４] ）。

【００８１】こうして、構築したヒトエラスターゼ発現
プラスミドをpHEX002 と命名した。各種大腸菌をpHEX00
2 にて形質転換して、ヒトエラスターゼを生産しうる菌
株を得た。

【００８２】この方法によって発現されるヒトエラスタ
ーゼは、下記の如く成熟ヒトエラスターゼのＮ末端に８
個のβ−ガラトシダーゼ由来のアミノ酸が結合した融合
蛋白になる。

【００８３】ヒトエラスターゼ発現プラスミドpHEX002
中のエラスターゼ遺伝子の5'末端付近のDNA 塩基配列と
アミノ酸配列を下に示す。

【００８４】

【化１】

【００８５】（配列番号：４参照。）以上のようにして
得たエラスターゼ発現プラスミドを含む菌株を、２×Ｔ
Ｙ−アンピシリン培地 (1.6 ％のバクトトリプトン、1
％のイーストエキストラクト、0.5 ％のNaCl、50μg/ml
のアンピシリン) に接種し、37℃、15時間培養した。培
養後、培養液を遠心して菌体を集め、2.4 ×10⁸ 細胞相
当量の菌体を15μl のSDS 溶液 (2 ％のSDS 、5 ％の2
- メルカプトエタノール、10％のグリセリン、60mMのTr
is-HCl(pH6.8) 〕に懸濁し、100 ℃３分間加熱した後、
Laemmli らの方法〔 Nature, 227 680 (1970) 〕に従っ
てSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、生産されて
いる蛋白を解析した。

【００８６】結果は図５に示すごとく、ＹＡ２１株にお
いて最も多量にエラスターゼ融合蛋白が生産されてい
た。エラスターゼ融合蛋白の生産高はＹＡ２１株が生産
している全蛋白の33％に相当していた。X984株において
も比較的多量のエラスターゼ融合蛋白が生産されていた
が、生産高はYA21株の半分以下 (全菌体蛋白の14％) で
あった。その他２株の大腸菌 (HB101 株およびMC4100
株) におけるエラスターゼ融合蛋白の生産量は著しく低
かった。

【００８７】エラスターゼ融合蛋白は菌体内でinclusio
n bodyを形成しているので比較的容易に精製することが
できた。すなわち、YA21/pHEX002の培養液１リットルよ
り、inclusion bodyを形成している菌体が6.5g得られ
た。得られた菌体6.5gを、Lysozyme 0.2mg/ml およびデ
オキシコール酸１mg/ml を含む50mMのトリス-HCl緩衝液
(pH8.0) 中で処理して溶菌させた。未破壊の菌体を、低
速遠心分離(1500 ×g, 10 分間) にて除いた後、高速遠
心分離(11000 ×g, 20 分間) にてinclusion bodyを沈
澱として得た。このinclusion bodyにはまだ菌体断片が
多量に含まれているのでトライトンX-100#5 mg/ml を含
む 50mM トリスHCl 緩衝液に懸濁した後、高速遠心分離
(11000 ×g, 20 分間）により洗浄した。洗浄後、incl
usion bodyは少量のトリス-HCl緩衝液中に懸濁して４℃
で保存した。

【００８８】この様にして精製することにより370mg の
inclusion body が得られ、これは約58％のエラスター
ゼIII Ａ融合蛋白を含有している。またYA21/pHEX002で
生産されたinclusion bodyがエラスターゼ融合蛋白であ
ることは、immuno-blotting法にて確認した。

【００８９】上述のように大腸菌にて生産されたエラス
ターゼの大部分は、inclusion bodyとなり菌体の不溶性
画分に存在しているが、一部は可溶性であり、酵素活性
をも保持した状態で存在している。本酵素活性の検出は
以下のようにして行った。

【００９０】エラスターゼIII Ａ発現プラスミドを導入
した大腸菌Χ９８４株を2 ×TY- アンピシリン培地１リ
ットルにて37℃で15時間振とう培養した。培養終了後、
菌体を3000 ×g/5 分の遠心分離にて集め30mlの緩衝液
Ａ(50mM Tris- HCl, 1mM EDTA, 50mM NaCl pH 8.0)に懸
濁し、リゾチームを10mg加えたのち５℃で20分間保温し
た。

【００９１】その後、デオキシコール酸を最終濃度１mg
/ml となるように加えたのちポリトロンホモジエナイザ
ー処理にて菌体を破砕した。こうして得た溶菌液を8000
0 ×g/40分の遠心分離にかけ、菌体断片を除いたのち、
セファデックスG-75カラムクロマトグラフィーにかけ
た。エラスターゼ活性画分はさらに抗体アフィニティク
ロマトグラフィーにて精製した。その後、0.1mg/mlとな
るようにトリプシンを加えて25℃で５分間保温し、次い
で0.1mg/mlとなるようにダイズトリプシンインヒビター
を加えてプロエステラーゼを活性化したものを粗エラス
ターゼIII Ａ試料液として以下の検定に用いた。

【００９２】試料のエラスターゼ活性は、下記の方法に
て測定した。すなわち、合成基質N-carbobenzoxy-L-ala
nine-p-nitrophenyl ester(Sigma) を50mM Tris-HCl(pH
8.0)に溶解して0.1mM 溶液とする。この基質液0.25mlに
対して、エラスーゼ試料液0.25mlを添加し、37℃にて30
分間反応させたのち、410nm の吸光度を測定したとこ
ろ、その吸光度が0.41上昇し、エラスターゼ活性を検出
しえた。同時に、試料液に、エラスターゼの阻害剤であ
るエラスタチナールもしくはα−１−アンチトリプシン
を、終濃度0.1mg/mlとなるように加えたところ、その活
性が、これらにより阻害されることを確認した。

【００９３】(8) 酵母を用いたヒト膵臓エラスターゼII
I Ａの生産 酵母を宿主とする場合も大腸菌、枯草菌および動物細胞
の場合と同様に、ヒト膵臓エラスターゼIII ＡのcDNA
を、常法にて、適当なる発現ベクターに連結して、宿主
細胞に移入し、それを発現させることができ、その培養
物中にエラスターゼ活性の存在を確認することができ
た。「組換えDNA 実験指針」に記載さているS. cerevis
iae を宿主とすることができるが、具体的には同S288C
株などが好適であった。一方ベクターとしては、YEp13
などが好適であった。またプロモーターとしては、アル
コール脱水素酵素遺伝子をコードするADH1遺伝子などが
好適であった。

【００９４】

【発明の効果】本発明により、ヒト・膵臓エラスターゼ
III A を大量に得ることが可能になる。この遺伝子産物
ヒト・膵臓エラスターゼIII A は、新規動脈硬化剤とし
て有効に使用できる。

【００９５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ： 897 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA 起源: 生物名 ヒト 配列: ATCATCACAA AACTC ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC CTT GTG 51 Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Val -25 -20 GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TCT CAC TCT TCC AGC CGC 99 Ala Val Ala Ser Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser His Ser Ser Ser Arg -15 -10 -5 -1 GTT GTC CAT GGT GAG GAT GCG GTC CCC TAC AGC TGG CCC TGG CAG GTT 147 Val Val His Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 TCC CTG CAG TAT GAG AAA AGT GGA AGC TTC TAC CAC ACG TGT GGC GGT 195 Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly 20 25 30 AGC CTC ATC GCC CCC GAT TGG GTT GTG ACT GCC GGC CAC TGC ATC TCG 243 Ser Leu Ile Ala Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser 35 40 45 AGG GAT CTG ACC TAC CAG GTG GTG TTG GGT GAG TAC AAC CTT GCT GTG 291 Arg Asp Leu Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr Asn Leu Ala Val 50 55 60 AAG GAG GGC CCC GAG CAG GTG ATC CCC ATC AAC TCT GAG GAG CTG TTT 339 Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Phe 65 70 75 80 GTG CAT CCA CTC TGG AAC CGC TCG TGT GTG GCC TGT GGC AAT GAC ATC 387 Val His Pro Leu Trp Asn Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile 85 90 95 GCC CTC ATC AAG CTC TCA CGC AGC GCC CAG CTG GGA GAT GCC GTC CAG 435 Ala Leu Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Val Gln 100 105 110 CTC GCC TCA CTC CCT CCC GCT GGT GAC ATC CTT CCC AAC AAG ACA CCC 483 Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu Pro Asn Lys Thr Pro 115 120 125 TGC TAC ATC ACC GGC TGG GGC CGT CTC TAT ACC AAT GGG CCA CTC CCA 531 Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Arg Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro 130 135 140 GAC AAG CTG CAG CAG GCC CGG CTG CCC GTG GTG GAC TAT AAG CAC TGC 579 Asp Lys Leu Gln Gln Ala Arg Leu Pro Val Val Asp Tyr Lys His Cys 145 150 155 160 TCC AGG TGG AAC TGG TGG GGT TCC ACC GTG AAG AAA ACC ATG GTG TGT 627 Ser Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Thr Val Lys Lys Thr Met Val Cys 165 170 175 GCT GGA GGG TAC ATC CGC TCC GGC TGC AAC GGT GAC TCT GGA GGA CCC 675 Ala Gly Gly Tyr Ile Arg Ser Gly Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro 180 185 190 CTC AAC TGC CCC ACA GAG GAT GGT GGC TGG CAG GTC CAC GGT GTG ACC 723 Leu Asn Cys Pro Thr Glu Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr 195 200 205 AGC TTT GTT TCT GCC TTT GGC TGC AAC TTC ATC TGG AAG CCC ACG GTG 771 Ser Phe Val Ser Ala Phe Gly Cys Asn Phe Ile Trp Lys Pro Thr Val 210 215 220 TTC ACT CGA GTC TCC GCC TTC ATC GAC TGG ATT GAG GAG ACC ATA GCA 819 Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Glu Glu Thr Ile Ala 225 230 235 240 AGC CAC TAG AAC CAA GGC CCA GCT GGC AGT GCT GAT CGA TCC CAC ATC 867 Ser His CTG AAT AAA GAA TAA AGA TCT CTC AGA AAA 897 配列番号：2 配列の長さ： 242 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 配列： Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Val -25 -20 Ala Val Ala Ser Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser His Ser Ser Ser Arg -15 -10 -5 -1 Val Val His Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly 20 25 30 Ser Leu Ile Ala Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser 35 40 45 Arg Asp Leu Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr Asn Leu Ala Val 50 55 60 Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Phe 65 70 75 80 Val His Pro Leu Trp Asn Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Val Gln 100 105 110 Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu Pro Asn Lys Thr Pro 115 120 125 Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Arg Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro 130 135 140 Asp Lys Leu Gln Gln Ala Arg Leu Pro Val Val Asp Tyr Lys His Cys 145 150 155 160 Ser Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Thr Val Lys Lys Thr Met Val Cys 165 170 175 Ala Gly Gly Tyr Ile Arg Ser Gly Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro 180 185 190 Leu Asn Cys Pro Thr Glu Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr 195 200 205 Ser Phe Val Ser Ala Phe Gly Cys Asn Phe Ile Trp Lys Pro Thr Val 210 215 220 Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Glu Glu Thr Ile Ala 225 230 235 240 Ser His 配列番号：３ 配列の長さ： 89 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA 配列: CG GCG GCT GCG AGT GCT GTT GTC CAT GGT GAG GAT GCT GTC CCC TAC 47 Ala Ala Ser Ala Ala Val Val His Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr AGC TGG CCC TGG CAG GTT TCC CTG CAG TAT GAG AAA AGT GGA 89 Ser Trp Pro Trp Glu Val Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser Gly 配列番号：４ 配列の長さ： 30 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA 配列: ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCC CGC GTT GTC 30 Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Arg Val Val

【図面の簡単な説明】

【図１】pSV2-CL2プラスミド構築図。

【図２】pHE010プラスミド構築図。

【図３】 枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のシグナルペプ
チド領域および成熟ヒト・エラスターゼIII Ａのアミノ
末端側に対応するcDNAのアミノ末端側を含む93塩基対の
合成DNA 図。

【図４】pHEX002 プラスミド構築図。

【図５】 pHEX002プラスミドを導入した各種大腸菌にお
けるヒトエラスターゼIII Ａの生産性を示す電気泳動
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/66 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/66 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/66 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号：２に表される＋１位の
   Val から＋242 位のHisまでのアミノ酸配列で示される
   ヒト・膵臓エラスターゼIII Ａ。
2. 【請求項２】(N) −末端が水素原子、Met 、あるいはプ
   レおよびプロ部分として配列表の配列番号：２に表され
   る−28位のMet から−１位のArg までのアミノ酸配列の
   一部または全部を有する請求項１記載のアミノ酸配列で
   示されるヒト・膵臓エラスターゼIII Ａ。