JPH0817710B2

JPH0817710B2 - 中性プロテアーゼ▲ｉｉ▼遺伝子、プレプロ型中性プロテアーゼ▲ｉｉ▼遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、及び中性プロテアーゼ▲ｉｉ▼の製造法

Info

Publication number: JPH0817710B2
Application number: JP1336737A
Authority: JP
Inventors: 宏樹辰巳; 成治村上; 亮平辻; 衛一中野; 宏茂田井; 弘次村上; 豊石田; 厚司真崎; 晴英川辺; 博文有村
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1989-12-27
Filing date: 1989-12-27
Publication date: 1996-02-28
Anticipated expiration: 2011-02-28
Also published as: JPH03198779A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、中性プロテアーゼII遺伝子、プレプロ型中
性プロテアーゼII遺伝子、新規な組み換え体DNA、及び
中性プロテアーゼIIの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、黄麹菌の１種であるアスペルギルス・オリゼー
（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼII遺伝
子の構造については、全く未知であり、また、該遺伝子
の単離すらされていないのが実情である。

中性プロテアーゼIIは、蛋白質又はその部分加水分解
物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解酵素
あって、医薬、飲食品、洗剤等広範に利用できる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、中性プロテアーゼII遺伝子、プレプロ型中
性プロテアーゼII遺伝子、新規な組み換え体DNA、及び
これを用いる中性プロテアーゼIIの製造法を提供するこ
とを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者等はアスペルギルス・オリゼー由来
の中性プロテアーゼII遺伝子について種々検討した結
果、アスペルギルス・オリゼー由来の中性プロテアーゼ
II遺伝子及びプレプロ型中性プロテアーゼII遺伝子を初
めて単離、そしてその構造を決定することに成功した。

更に、本発明者等は、プレプロ型中性プロテアーゼII
遺伝子を用い、中性プロテアーゼIIを効率よく生産すべ
く種々検討した結果、アスペルギルス属に属する微生
物、例えばアスペルギルス・オリゼー由来のプレプロ型
中性プロテアーゼII遺伝子をベクターDNA、例えばプラ
スミドベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含み、中
性プロテアーゼII生産能を有するサッカロマイセス属に
属する微生物、例えばサッカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）を培地に培養すれば、該
酵母菌体外に効率よく中性プロテアーゼIIが分泌生産さ
れること等の知見を得、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、第３図で示されるアミノ酸配列
をコードする中性プロテアーゼII遺伝子であり、また、
本発明は、第５図で示されるアミノ酸配列をコードする
プレプロ型中性プロテアーゼII遺伝子である。更に、本
発明は、第５図で示されるアミノ酸配列をコードするプ
レプロ型中性プロテアーゼII遺伝子をベクターDNAに挿
入したことを特徴とする新規な組み換え体であり、更に
また、本発明は第５図で示されるアミノ酸配列をコード
するプレプロ型中性プロテアーゼII遺伝子をベクターDN
Aに挿入した新規な組み換え体を含み、中性プロテアー
ゼ生産能を有するサッカロマイセス属に属する微生物を
培地に培養し、培養物より中性プロテアーゼIIを採取す
ることを特徴とする中性プロテアーゼIIの製造法であ
る。

以下、本発明を詳細に説明する。

先ず、本発明に用いられる中性プロテアーゼIIc−DNA
のドナーとして用いられるアスペルギルス属菌として
は、例えば、アスペルギルス・オリゼー（ATCC 20386）
等が挙げられる。

次いで、上記微生物を、特公昭48-38873号公報記載の
方法と全く同様にして培養し、培養物を得、該培養物か
ら常法、例えば、濾過、遠心分離処理等によりアスペル
ギルス・オリゼーの菌体を得る。

上記アスペルギルス・オリゼーの菌体よりｍ−RNAを
調製するには、例えば、菌体の破砕の際、ガラスビーズ
及びフェノールを用いる以外は、例えば、「モレキュラ
ー・クローニング」（Molecular Cloning）、第196頁、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
spring Harbor Laboratory）（1982）及び「分子遺伝
学実験法」、小関治男、志村令郎、第66〜67頁（1983）
記載の方法等により得ることができる。

得られたｍ−RNAよりｃ−DNAを合成するには、例え
ば、「モル・セル・バイオル」（Mol.Cell.Biol.）、第
２巻、第161頁（1982）及び「ジーン」（Gene）、第25
巻、第263頁（1983）記載の方法により行なうことがで
きる。

次いで、このようにして得られたｃ−DNAを、例え
ば、アマシャム社製のｃ−DNAクローニングシステムを
用い、ファージベクターλgt11に組み込み、種々の組み
換え体ファージを得、該ファージを大腸菌（E.coli）Y1
090に感染させ、種々の融合蛋白質を生産するプラーク
を得る。

上記の種々なプラークよりβ−ガラクトシダーゼと中
性プロテアーゼIIとの融合蛋白質を生産しているプラー
ク（すなわち、中性プロテアーゼIIc−DNA断片を含む組
み換え体ファージ）を検出するには、例えば抗中性プロ
テアーゼII血清と、バイオラッド社製のイミュン・ブロ
ットアッセイキットにより検出することが出来る。

このようにして得られた組み換え体ファージよりファ
ージDNAを精製するには、〔「モレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning）、第76頁、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory）（1982年）〕の方法により行なうことが
できる。

次いで、不完全な中性プロテアーゼIIc−DNAを³²Ｐを
用いニックトランスレーション法〔「モレキュラー・ク
ローニング」（Molecular Cloning）、第109〜112頁、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory）（1982年）、及び「ジェ
イ・モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第23
7〜251頁（1977）により標識したのち、該ｃ−DNAをプ
ロープとしてコロニーハイブリダイゼーション法〔「蛋
白質・核酸・酵素」、第26巻、第575〜579頁（1981）〕
によりプラスミドpUC119DNA（宝酒造社製）をベクター
として作成したｃ−DNAライブラリーより1.2Kbの完全長
中性プロテアーゼIIc−DNAを含有するプラスミドDNAを
得ることができる。

そして、このようにして得られた組み換え体プラスミ
ドDNAよりアスペルギルス・オリゼー由来の中性プロテ
アーゼIIをコードするｃ−DNAにおいてプレプロ領域を
有するもの（以下、プレプロ型中性プロテアーゼIIc−D
NAという）を含有するDNAを得るには、該プラスミドDNA
に、制限酵素、例えばEcoRIを温度30〜40℃、好ましく
は37℃で１〜24時間、好ましくは２時間作用させ、得ら
れた反応終了液を、アガロースゲル電気泳動法〔「モレ
キュラー・クローニング」（Molecular Cloning）、第1
50頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）記載〕に
よりアスペルギルス・オリゼー由来のプレプロ型中性プ
ロテアーゼIIc−DNAを含有するDNAを得ることができ
る。

そして、このプレプロ型中性プロテアーゼIIc−DNAの
塩基配列の決定を実施例の第９項目に示すような方法に
よって行ない（第４図参照）、次いで、前記塩基配列を
有する遺伝子によって翻訳されるポリペプタイドのアミ
ノ酸配列を確定する（第５図参照）。

次いで、ベクターDNAを、制限酵素、例えばEcoRI（宝
酒造社製）を温度30〜40℃、好ましくは37℃で１〜16時
間、好ましくは２時間作用させて、該ベクターDNAを切
断したものに、上記のようにして得たプレプロ型中性プ
ロテアーゼIIc−DNAを含有するDNA及びT4DNAリガーゼ
（宝酒造社製）等のDNAリガーゼを添加して常法により
連結させて組み換え体DNAを得る。

上記ベクターDNAとしては如何なるものでもよく、例
えば、プラスミドMA56DNA（ワシントン・リサーチ・フ
ァウンデーションより入手）等が挙げられる。

このようにして得られた組み換え体DNAは、例えば、
「プロク・ナトル・アカド・サイ」（Proc.Natl.Acad.S
ci.）第62巻、第1159〜1166頁（1969）記載の方法によ
り得ることができる。

そして、このようにして得られた組み換え体DNAを用
いて、サッカロマイセス属に属する微生物例えば、サッ
カロマイセス・セレビシエSHY1（ATCC 44769）等を、ベ
ッグス（Beggs）の方法〔「ネーチュアー」（Natur
s）、第275巻、第104〜109頁（1978）〕により形質転換
して、プレプロ型中性プロテアーゼIIc−DNAをベクター
DNAに挿入した組み換え体DNAを含み中性プロテアーゼII
分泌生産能を有するサッカロマイセス属に属する微生物
を得る。

次いで、上記微生物を培地に培養し、培養物より中性
プロテアーゼIIを採取するのである。

培地としては、例えば、サッカロマイセス属に属する
部生物の培養に用いられるものであれば、如何なるもの
でもよく、例えば、グルコース、ポリペプトン、酵母エ
キスからなるYPD培地が挙げられる。

また、培養温度は、例えば、25〜35℃、好ましくは30
℃程度で、培養時間は、例えば、16〜72時間、好ましく
は40時間程度である。

そして、培養物を、例えば、3,000r.p.m.で２分間程
度の遠心分離処理し、培養液及び菌体を得、得られた培
養液は、粗酵素液として用いることができ、また、得ら
れた菌体を、例えば、ガラスビーズと共に、ボルテック
スミキサーにより３分間程度攪拌して破砕し、粗酵素液
を得る。

そして、夫々の粗酵素液は、そのままでも使用可能で
あるが、必要により硫安分画、イオン交換クロマトグラ
フ法、例えば、DEAE−ゲイオゲルＡ等、ゲル濾過法、例
えば、ウルトロゲルAcA34等により精製して、純化され
た中性プロテアーゼIIを得る。

このようにして得られた中性プロテアーゼIIの理化学
的性質は、日本醤油研究所雑誌、第１巻、第78〜84頁
（1975）に記載されたものとほぼ同様である。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明によれば、中
性プロテアーゼ遺伝子、プレプロ型中性プロテアーゼ遺
伝子、プレプロ型中性プロテアーゼ遺伝子を組み込んだ
組み換え体DNAが提供され、更に、組み換え体DNAを含む
サッカロマイセス属に属する微生物を培地に培養するこ
とにより、極めて短期間のうちに、中性プロテアーゼII
を効率よく分泌生産させる方法が提供される。上記遺伝
子ｃ−DNAは、蛋白質工学用試料として用いることがで
きるので、本発明は、産業上極めて有用である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。

実施例黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ATCC 20386）由来
のプレプロ型中性プロテアーゼIIc−DNAのクローニング
及びサッカロマイセス・セレビシエによる発現。

1.菌体の取得黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ATCC 20386）の胞
子（1.2×10⁸個）を、中性プロテアーゼII生産培地〔0.
5％（W/V）加熱、加圧膨化処理した脱脂大豆、２％（W/
V）フスマ、１％（W/V）KH₂PO₄〕50mlに接種し、恒温振
盪機（大洋科学工業社製,M−100ⁿ）を用いて120r.p.
m.、温度30℃で34時間振盪培養を行ない培養物を得、常
法によりこの培養物を濾過して菌体2gを得た。

2.m−RNAの取得項目１で得られた菌体2gを、20mlのグアニジンイソチ
オシアネート溶液〔6Mグアニジンイソチオシアネート/3
7.5mMクエン酸ナトリウム（pH7.0）/0.75％（W/V）Ｎ−
ラウロイルザルコシンナトリウム/0.15M β−メルカプ
トエタノール〕に添加したものを、カップ型ブレンダー
（日本精機製作所社製）に入れ、更に、10gのガラスビ
ーズ（直径0.5mm）を添加し、10,000r.p.m.で５分間処
理したのち、また更に、10mlの水飽和フェノールを添加
し、10,000r.p.m.で10分間処理して菌体を破砕処理し、
破砕物を得た。

このようにして得られた破砕物を冷却遠心機（日立工
機社製、18PR-52）を用いて5,000r.p.m.で10分間遠心分
離処理して、菌体破砕液20mlを得た。

次いで、超遠心分離機用チューブ（日立工機社製）４
本に、予め1.2mlの5.7Mの塩化セシウム溶液を夫々重層
し、その上に、上記菌体破砕液を重層するように夫々分
注し、超遠心分離機（日立工機社製、SCP55H）を用いて
温度15℃、30,000r.p.m.で16時間遠心分離して沈澱物を
得た。

得られた沈澱物を、冷70％（V/V）エタノールを用い
て洗浄したものを、10mMトリス緩衝液〔10mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.4）/5mM EDTA/1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕4mlに懸濁したものに同量のｎ−ブタノール及びク
ロロフォルムを１対４（容量比）となる如く混合したも
のを添加して抽出し、常法により3,000r.p.m.で10分間
遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機溶
媒層に上記10mMトリス緩衝液4mlを添加し、上記抽出及
び分離操作を行う操作を２回繰り返して得られた水層
に、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及び２倍量の
冷エタノールを添加したものを温度−20℃で２時間放置
したのち、常法により8,000r.p.m.で20分間遠心分離
し、RNAを沈澱させ、得られたRNAを4mlの水に溶解し、
上記エタノール沈澱操作を行ない、得られたRNAを1mlの
水に溶解し、2mgのRNAを得た。

このRNA中よりｍ−RNAを選択するために、2mgのRNA
を、オリゴ（dT）−セルロース（ニューイングランドバ
イオラボ社製）カラムクロマトグラフィーにかけた。

カラムとして2.5mlテルモシリンジ（テルモ社製）を
用い、樹脂0.5gは、溶出緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH7.6）/1mM EDTA/0.1％（W/V）ドデシル硫酸ナト
リウム〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝
液〔10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）/1mM EDTA/0.4M
NaCl/0.1％ドデシル硫酸ナトリウム〕で平衡化したもの
である。

2mgのRNAに、1mlの緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.6）/1mM EDTA/0.8M NaCl/0.1％ドデシル硫酸ナト
リウム〕を添加し、温度65℃で10分間加熱処理し、氷中
で急冷し、オリゴ（dT）−セルロースカラムにかけたの
ち、結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−RNA及び
ｔ−RNAを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−RNAを
溶出し、14μｇのｍ−RNAを得た。

3.抗血清の調製精製中性プロテアーゼIIに対するウサギの抗中性プロ
テアーゼII血清は、以下の方法により調製した。

8mg/ml濃度の中性プロテアーゼII溶液1.0mlを、等量
のフロインド（Freund）完全アジュバントで懸濁したも
の8mgを、抗原として、体重2kgの日本白色種ウサギの視
床部に投与し、飼育２週間経過したのち、初回と同量の
抗原を背部皮内へ投与し、更に、飼育１週間経過したの
ち、同様の操作を行い、また更に、飼育１週間後全採血
を行った。

そして、得られた血液を、温度４℃で18時間放置した
ものを、常法により3,000r.p.m.で15分間遠心分離し、
上清として抗中性プロテアーゼII血清を得た。

4.c−DNAの合成ｃ−DNAの合成は、アマシャム社製キットを用いて行
ったものである。

上述の如くして得られたｍ−RNA 1.8μｇを用いてア
マシャム社の指示する「モル・セル・バイオル」（Mol.
Cell.Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及び「ジー
ン」（Gene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法に
従い実施した結果、250ngの２本鎖ｃ−DNAが得られた。

このようにして得たｃ−DNA 250ngに、アマシャム社
製ｃ−DNAクローニングシステムを用い、アマシャム社
の指示する方法により制限酵素EcoRI切断部位のメチル
化を行い、更にｃ−DNAの両端にEcoRIリンカーを付着さ
せた。

5.λgt11をベクターとしたｃ−DNAバンクの作製実施例項目４で得られたｃ−DNA 100ng及び制限酵素E
coRIで切断されたλgt11DNA（アマシャム社製）１μｇ
を連結したのち、イン・ビトロ（in vitro）パッケー
ジングを行ない組み換え体ファージを得た。

これらの操作は、アマシャム社製ｃ−DNAクローニン
グシステムを用いて指示に従って行なった。

6.pUC119をベクターとしたｃ−DNAバンクの作製プラスミドpUC119DNA（宝酒造社製）100ngを、８μｌ
の水に溶解したものに、１μｌのMed緩衝液〔100mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.5）/100mMMgCl₂/10mMジチオスレ
イトール/500mM NaCl〕を添加したのち、更に、これ
に、10ユニット（１μｌ）の制限酵素EcoRI（宝酒造社
製）を添加し、温度37℃で２時間切断処理を行った。

次いで、この切断処理物に、１μｌの1Mトリス−塩酸
緩衝液（pH8.0）及び0.3ユニット（１μｌ）のアルカリ
フォスファターゼ（宝酒造社製）を添加し、温度65℃で
１時間酵素反応処理し、切断処理物の両端の脱リン酸化
を行い、これに、12μｌの水飽和フェノールを添加して
除蛋白を行ったのち、回収した水層に、１μｌの3M酢酸
ナトリウム（pH5.8）及び26μｌの冷エタノールを夫々
添加し、温度−70℃で15分間放置し、微量遠心機
〔（株）トミー精工、MRX-150〕を用い、12,000r.p.m.
で５分間遠心分離処理を行いDNAを回収した。

このようにして得られた、制限酵素EcoRIで切断し、
かつ両端を脱リン酸化したプラスミドベクターpUC119DN
A 100ngと、項目４で調整したｃ−DNA 100ngを混合した
ものを、８μｌの水に懸濁したのち、これに、１μｌの
X10ライゲーション緩衝液〔200mMMgCl₂/660mMトリス−
塩酸緩衝液（pH7.6）/10mM ATP/150mMジチオスレイトー
ル〕を添加したものに、１ユニット（１μｌ）のT4 DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を添加し、温度16℃で16時間放
置し、プラスミドベクターDNA及びｃ−DNAのライゲーシ
ョンを行ない反応物を得た。

この反応物を用いて、ハナハン（Hanahan）の方法
〔「ディーエヌエイ・クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により大腸菌DH1
株（ATCC 33849）を形質転換し、プラスミドpUC119DNA
をベクターとしたｃ−DNAバンクを作製した。

7.中性プロテアーゼIIc−DNA断片の検索大腸菌Y1090（アマシャム社製）を、10mlのＬ培地
（１％ポリペプトン、0.5％酵母エキス及び0.5％NaCl）
に接種し、温度37℃、120r.p.m.で16時間振盪培養を行
なったものに、等量のSM緩衝液〔100mM NaCl/0.2％（W/
V）MgSO₄/50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/0.01％（W
/V）ゼラチン）を添加して受容菌溶液とした。

受容菌溶液100μｌに、項目５で得た組み換え体ファ
ージ溶液を、約10,000ファージ/mlとなるように、SM緩
衝液により希釈したもの100μｌを添加し、温度37℃で2
0分間保温したものを、温度45℃に保った5mlのトップア
ガー溶液（Ｌ培地に0.7％のバクトアガー（Difco社製）
を溶解したもの）に懸濁し、Ｌ寒天培地上に流し込ん
だ。次いで、温度43℃にて４時間培養し、プラークの直
径が約2mmになったところで、予じめ1mMのイソプロプル
−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）溶液に浸したの
ち、乾燥させたニトロセルロースフィルターを、上記寒
天上に置いて、温度43℃にて18時間保温し、β−ガラク
トシダーゼの誘導及び、ニトロセルロースフィルターへ
のタンパクの転移を行なった。ニトロセルロースフィル
ターを寒天上よりはがし、20mlのTBS緩衝液（20mMトリ
ス−塩酸緩衝液pH7.5、500mM NaCl）にて洗浄したの
ち、３％（W/V）のゼラチンを含むTBS緩衝液20ml中で30
分間振盪し、フィルターを非特異的な吸着よりブロック
した。次いで、フィルターを、項目３で得られた抗中性
プロテアーゼII血清1mlを１％ゼラチンを含むTBS緩衝液
24mlで希釈した溶液に移し、90分間振盪した。0.05％
Tween-20を含むTBS緩衝液20mlにて10分間振盪する操作
を２回行ない洗浄したのち、アルカリフォスファターゼ
で標識した抗ウサギイムノグロブリン抗体（バイオラッ
ド社製）及び１％ゼラチンを含むTBS緩衝液中にて60分
間振盪した。0.05％ Tween-20を含む緩衝液20ml中にて
10分間振盪する操作を２回行ない洗浄したのち、発色用
緩衝液（100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.8）/5mMMgCl₂/
100mM NaCl）10mlに浸し、7.5％（W/V）ニトロブルーテ
トラゾリウム10μｌ及び５％（W/V）５−ブロモ、４−
クロロ,3−インドリル，フォスフェイト60μｌを加えて
発色させた。

以上の操作を約80,000個の組み換え体ファージ（80枚
のニトロセルロースフィルター）について行ったとこ
ろ、６株の発色反応陽性のプラークを得た。

これら６株のプラークより、「モレキュラー・クロー
ニング」（Molecular Cloning）、第76頁、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Ha
rbor Laboratory）（1982）記載の方法により組み換え
体ファージDNAを単離した。

夫々のファージDNA20μｇを25μｌの水に溶解したも
のに、３μｌのMed緩衝液〔100mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.5/100mMMgCl₂/10mMジチオスレイトール/500mM Na
Cl〕を添加したのち、更にこれに20ユニット（２μｌ）
の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を添加し、温度37℃で
２時間切断処理を行った。これらの切断処理物について
アガロースゲル電気泳動を行ない、同等に泳動を行なっ
た分子量マーカー（φXDNAを制限酵素HincIIで切断した
もの）の移動度と対比することにより組み換え体ファー
ジに挿入されるDNA断片の大きさを調べた。６株の組み
換え体ファージは夫々の500〜1,100bpの挿入断片を持っ
ており、最も長い1,100bpの挿入断片を持つもの（λgt1
1-Np462）を選び、完全長中性プロテアーゼIIc−DNAの
検索に用いた。

8.完全長の中性プロテアーゼIIc−DNAの検索項目７で得られたアガロースゲルより組み換え体ファ
ージλgt11-Np462に挿入されている1,100bpの中性プロ
テアーゼIIc−DNA断片を含むアガロースゲルを切り出
し、透析チューブに入れたものに、500μｌのTE緩衝液
〔100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）/1mM EDTA）〕を
添加したのち、透析チューブをシールし、電気泳動によ
り、ゲル中より緩衝液中にDNAを溶出させた。このよう
にして得た溶液に、等容量の水飽和フェノールを添加し
て攪拌し、水層を回収し、常法に従ってエタノール沈澱
により200ngのDNAを回収した。このうち100ngの中性プ
ロテアーゼIIc−DNAを、［α−³²Ｐ］dCTP（アマシャム
社製）を用いてニックトランスレーション法により標識
した。ニックトランスレーションは、宝酒造社の指示す
る「ジェイ・モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113
巻、第237〜251頁（1977）及び「モレキュラー・クロー
ニング」（Molecular Cloning）、第109〜112頁（198
2）記載の方法に従った。このようにして調製した³²Ｐ
で標識した中性プロテアーゼIIc−DNA断片をプローブと
して用い、項目６で得たpUC119をベクターとしたｃ−DN
Aバンクに対しコロニーバイブリダイゼーション法
〔「蛋白質・核酸・酵素」、第26巻、第575〜579頁（19
81）〕により検索し、中性プロテアーゼIIc−DNAを有す
るコロニーを得た。そのうち１個のコロニーの有する組
み換え体プラスミドDNAをpONP28と命名し、モレキュラ
ー・クローニング（Molecular Cloning）第86頁、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory）1982記載の方法に従い組み換
え体プラスミドDNAを調製した。

該組み換え体プラスミドDNAを含有する大腸菌を大腸
菌（E.coli）DH1（pONP28）と命名した。

組み換え体プラスミドpONP28DNAを項目７に記載の方法
と同様にして制限酵素EcoRIで処理し、アガロースゲル
電気泳動を行ったところ、挿入DNA断片の大きさは1,200
bpであることが判明した。そして、本項目８記載の方法
と同様にしてこの1,200bpの中性プロテアーゼIIc−DNA
を含むDNA断片0.1μｇを分離、精製した。組み換え体プ
ラスミドpONP28DNAを制限酵素EcoRI、EcoRV、HindIII、
SacＩ及びScaＩの単一または二重消化を行い、項目７に
記載した同じ方法にて、現われた断片の大きさを分析す
ることにより、組み換え体プラスミドpONP28DNAの制限
酵素地図を作製し、該地図を第１図に示した。

9.完全長中性プロテアーゼIIc−DNAの塩基配列の決定完全長中性プロテアーゼIIc−DNAを含むプラスミドpO
NP28を榊の方法〔「ベクターDNA」、第70頁、講談社（1
986年）〕に従ってアルカリ変性させたのち、７−DEAZA
シークエンスキット（宝酒造社製）を用いて常法により
ダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法で塩基配
列の決定を行なった。なお、用いたプライマーは、シス
テム1EプラスDNA合成機（ベックマン社製）を用いた合
成した。

このようにしてアスペルギルス・オリゼー（ATCC 203
86）由来の中性プロテアーゼIIc−DNA断片の塩基配列を
決定し、そのオープンリーディングフレームに対応する
塩基配列を第４図に、また、前記第４図に示す塩基配列
を有する遺伝子から翻訳されるポリペプタイド（プレプ
ロ型中性プロテアーゼII）のアミノ酸配列を第５図に夫
々示した。第４図中、塩基番号−525（Ａ）〜１（Ｃ）
がプレプロ領域を、塩基番号１（Ａ）〜531（Ｃ）がマ
チュアーな中性プロテアーゼII遺伝子領域を示す。

翻訳されるポリペプタイドは、352アミノ酸配列から
なり、精製した中性プロテアーゼIIのＮ末端のアミノ酸
配列５個（Thr Glu Val Asp）は１番目からのアミノ酸
配列に一致した（第５図下線部）。したがって、−175
から−１番目までのアミノ酸配列は、中性プロテアーゼ
IIの分泌に必要なプレプロ領域であり、１番目から177
番目までのアミノ酸配列はマチュアーな中性プロテアー
ゼIIをコードする領域である。そして、このマチュアー
な中性プロテアーゼII遺伝子の塩基配列を第２図に、ま
たそれらの塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列を第３
図に示す。

10.組み換え体プラスミドpONP30DNAの構築酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩ由来のプロモータ
ーを含有するプラスミドベクターMA56DNA（ワシントン
・リサーチ・ファウンデーションより入手）100ngを、
項目６記載の方法により制限酵素EcoRI（宝酒造社製）
で切断したのち、常法により除蛋白及びエタノール沈澱
処理により、EcoRIで切断されたプラスミドベクターMA5
6DNA 100μｇを得た。

該DNA 100ng及び項目10で得られた組み換え体プラス
ミドpOAP28DNA由来の1,200bpのEcoRI断片100ngを項目６
記載の方法によりライゲーションを行ない、反応物を項
目６記載の方法により大腸菌DH1（ATCC 33849）を形質
転換し、得られた形質転換体より項目７記載の方法を用
いて組み換え体プラスミドDNAを調製し、EcoRIおよびEc
oRV（宝酒造社製）による単独切断DNAパターンを夫々ア
ガロースゲル電気泳動法を用いて分析した。この分析に
よりアルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーターに対し
て順方向に中性プロテアーゼIIc−DNAが組み込まれた組
み換え体プラスミドを選択し、この組み換え体プラスミ
ドDNAをpONP30と命名し、該プラスミドDNAの制限酵素地
図を第６図に示した。

11.組み換え体プラスミドpONP30DNAによる酵母の形質転
換及び中性プロテアーゼIIの生産組み換え体プラスミドpONP30DNAを用い、サッカロマ
イセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）SHY1
株（ATCC 44769）を、ベッグス（Beggs）の方法〔「ネ
イチュアー」（Nature）、第275巻、第104〜109頁（197
8）〕により形質転換し、形質転換株、サッカロマイセ
ス・セレビシエSHY1（pONP30）を得た。

なお、該形質転換株は、工業技術院微生物工業技術研
究所に、微工研菌等第11133号（FERMP-11133）として寄
託されている。

比較のため、プラスミドベクターMA56（ワシントン・
リサーチ・ファウンデーションより入手）を、サッカロ
マイセス・セレビシエSHY1（ATCC 44769）株に同様の方
法にて形質転換し、形質転換株、サッカロマイセス・セ
レビシエSHY1（MA56）を得た。

サッカロマイセス・セレビシエSHY1（pONP30）及びサ
ッカロマイセス・セレビシエSHY1（MA56）を、１％ミル
カゼイン（Merck社製、Hammarsten）及び1mMZnCl₂を含
むYPD寒天培地｛２％（W/V）グルコース、２％（W/V）
ポリペプトン、１％（W/V）酵母エキス、1.5％寒天｝上
で温度30℃にて３日間培養したところ、サッカロマイセ
ス・セレビシエSHY1（pONP30）の菌体の周辺にはハロー
が形成されたが、サッカロマイセス・セレビシエSHY1
（MA56）の菌体の周辺には、ハロー形成は認められなか
った。

以上より明らかな如く、本発明による得られる酵母菌
体の周辺に、プロテアーゼによる分解反応が認められた
ため、本発明に従い上記したサッカロミセス属に属する
酵母菌体を培養することにより、培地中に中性プロテア
ーゼIIが分泌生産されていることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドpONP28DNAの制限酵素
地図を示す図であり、第２図は、中性プロテアーゼIIに
対応するｃ−DNAの塩基配列を示し、第３図は、第２図
に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳されるポリペプ
タイドのアミノ酸配列を示し、第４図は、実施例９項目
に記載のプレプロ型中性プロテアーゼIIに対応するｃ−
DNAの塩基配列を示す。図中、塩基番号−525（Ａ）〜−
１（Ｃ）がプレプロ領域を、塩基番号１（Ａ）〜531
（Ｃ）がマチュアーなアルカリプロテアーゼ遺伝子領域
を示すし、第５図は、第４図に示す塩基配列を有する遺
伝子から翻訳されるポリペプタイドのアミノ酸配列を示
し、第６図は、本発明組み換え体プラスミドpONP30の制
限酵素地図を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/62 Ｃ１２Ｒ 1:865）Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者中野衛一千葉県野田市野田399番地キッコーマン株式会社内 (72)発明者茂田井宏千葉県野田市野田399番地キッコーマン株式会社内 (72)発明者村上弘次大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者石田豊大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者真崎厚司大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者川辺晴英大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者有村博文大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１株式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
中性プロテアーゼII遺伝子。
【請求項２】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
プレプロ型中性プロテアーゼII遺伝子。
【請求項３】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
プレプロ型中性プロテアーゼII遺伝子をベクターDNAに
挿入したことを特徴とする新規な組み換え体DNA。
【請求項４】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
プレプロ型中性プロテアーゼII遺伝子をベクターDNAに
挿入した新規な組み換え体DNAを含み、中性プロテアー
ゼII生産能を有するサッカロマイセス属に属する微生物
を培地に培養し、培養物より中性プロテアーゼIIを採取
することを特徴とする中性プロテアーゼIIの製造法。