MX2008012128A - Mejoramiento de la produccion microbiana de etanol. - Google Patents

Abstract

Un microorganismo termofílico que carece de la actividad de la lactato deshidrogenasa y de preferencia contiene una trayectoria de piruvato formiato liasa activa. El microorganismo termofílico contiene un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD. El gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD es de preferencia una versión de codón optimizada del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable. Las construcciones de ADN permiten la expresión estable del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD en el microorganismo termofílico. Las construcciones de ADN se basan en el uso de una secuencia de inserción para lograr la expresión estable o recombinación para insertar el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD en el gen de la lactato deshidrogenasa, logrando así la inactivación genética y una nueva funcionalidad en una etapa sencilla. Los microorganismos son útiles en la fermentación de azúcares para producir etanol.

Description

MEJORAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN MICROBIANA DE ETANOL Campo de la Invención Esta invención se refiere a procedimientos de fermentación y a microorganismos para su uso en los mismos y, en particular, al mejoramiento de la producción microbiana de etanol . Más específicamente, la invención se refiere a la producción mejorada de etanol por la bacteria termofílica, tal como un Bacillus de azúcares mezclados derivados de la hidrólisis de la biomasa. En particular, la invención contempla una trayectoria novedosa para la producción de etanol al clonar un gen que codifica una enzima de formiato deshidrogenasa enlazada a NAD en un microorganismo que posee un gen funcional que codifica un complejo de la enzima de piruvato-formiato liasa, pero que carece de la actividad del lactato deshidrogenasa.

Antecedentes de la Invención El bioetanol se produce actualmente a partir de glucosa, maltosa o sacarosa derivada de almidón de cereal, caña de azúcar o remolacha azucarera, las cuales tienen un valor alimenticio. Las celulosas y hemicelulosas forman una parte importante de los subproductos agrícolas y podrían, en principio, ser una fuente importante de bioetanol renovable de bajo costo. Sin embargo, es difícil y costoso derivar azúcares fermentables a partir de la celulosa. En cambio, las hemicelulosas son casi tan abundantes como la celulosa y son fáciles de hidrolizar, pero producen una mezcla de azúcares principalmente pentosa cuyas levaduras no pueden fermentarse. Por esta razón, Hartley (véase la Publicación Internacional Número WO 88/09379) propuso la producción de etanol por mutantes de un Bacillus termofílico, el cual fermenta muy rápidamente todos los azúcares derivados de la biomasa a temperaturas de hasta 70°C. Sin embargo, se obtiene una producción elevada de etanol únicamente por células en estrés y moribundas. Muchos microorganismos contienen una trayectoria de la piruvato-formiato liasa (PFL) que convierte el piruvato en acetilo CoA y formiato (Figura 1A) . Los microorganismos fermentables en heterolactato son una clase tal. Estos microorganismos primero convierten los azúcares ingeridos en piruvato (generalmente por la trayectoria EMP de glicolisis), el cual puede entonces tomar muchas rutas para producir lactato, formiato, acetato, etanol y C02, en varias proporciones, dependiendo de las condiciones de crecimiento. En células completamente aeróbicas, el piruvato normalmente se metaboliza a H20 y C02 mediante la trayectoria de piruvato deshidrogenasa (PDH) , el ciclo del ácido tri-carboxilico y la Cadena de Transporte de Electrones. Sin embargo, en muchos de estos organismos, particularmente en el Bacillus termofílico, la absorción del azúcar y la glicólisis parecen no estar reguladas y el lactato es un producto dominante en concentraciones elevadas de azúcar, incluso bajo condiciones aeróbicas . Esto sugiere que el flujo de PDH se ha saturado entonces y que el piruvato en exceso se desvía hacia una trayectoria de lactato deshidrogenasa de sobreflujo. Esto no se utiliza para el crecimiento, pero produce calor que ocasiona que la temperatura ambiental se eleve y elimine los competidores mesofílieos, como puede observarse cuando se coloca pasto fresco en una pila de composta. Si el gen Idh (que codifica la lactato deshidrogenasa) se inactiva, como se describe por ejemplo en O 02/29030, la producción de lactato se detiene y el piruvato en exceso se desvía principalmente hacia la trayectoria de PFL enlazada al crecimiento, (Figura 1A) . Sin embargo, en concentraciones muy elevadas de azúcar y/o en el pH ácido, el flujo de la trayectoria de PFL desciende y el piruvato en exceso se desborda entonces hacia una trayectoria de PDH anaeróbica, la cual produce únicamente etanol y C02 (Figura IB) . Por lo tanto, las condiciones preferidas para obtener producciones elevadas de etanol son aquéllas que reducen el flujo a través de la trayectoria de PFL e incrementan el flujo a través de la trayectoria de PDH (Hartley, B.S. y Shama, G. Proc . Roy. Soc . Lond. 321, 555-568 (1987)). Desafortunadamente, en tales condiciones, las células experimentan tensión metabólica, con una producción reducida de ATP y un desequilibrio potencial en relaciones de NAD/NADH y CoA/acetilo CoA (Figura 1C) . Se han propuesto diversos protocolos de fermentación para tratar de evitar o de minimizar este problema tal como el de Hartley, B.S. que se discute anteriormente (véase la Publicación Internacional Número WO 88/09379) . Existen dos clases de formiato deshidrogenasa . Una (codificada por el gen fdhF) convierte el formiato en C02 + H2 y es típico de enterobacterias tales como E. coli. La otra (codificada por el gen fdhl) convierte el formiato + NAD en C0 + NADH2 y se encuentra presente en muchos anaerobios facultativos. Berrios-Rivera et al. (Metabolic Engineering 4, 217-219 (2002) reemplazó el gen fdhF en E. coli con un gen fdhl de levadura y encontró que los productos anaeróbicos reducidos tales como etanol, lactato y succinato se incrementaron en relación con los productos oxidados tales como acetato. Con base en esta observación, San, K-Y. Berrios-Rivers , S.J. y Bennett, G.N. (véase la Publicación Internacional Número WO 2003/040690) propuso la introducción de un gen formiato deshidrogenasa enlazado a NAD como un método general para incrementar la capacidad de reducción en las células implicadas en un amplio margen de biotransformaciones . Posteriormente San, K-Y. Bennett, G.N. y Sánchez, A. (Solicitud de Patente Norteamericana US 2005/0042736 Al) propusieron una aplicación específica de este concepto para la producción de succinato. Estos estudios se llevaron a cabo en E. coli, un ejemplo de un mesófilo en el que se regula la absorción de azúcar. El propósito de estos experimentos fue incrementar los niveles intracelulares de NADH a fin de proporcionar la capacidad de reducción mejorada para diversas biotransformaciones . La formiato deshidrogenasa de la levadura recomendada por Sen. et al. (2004) es inactiva a 60°C, la cual es la temperatura mínima de crecimiento para la bacteria termofílica potencialmente para su uso en la producción de bioetanol . Las formiato deshidrogenasas más termoestables descritas hasta ahora es la enzima Pseudomonas sp. 101 (A. Rojkova, A. Galkin, L. Kulakova, A. Serov, P. Savitsky, V. Fedorchuk, V. Tishkov FEBS Letters, Volumen 445, Issue 1, Páginas 183-188, 1999) .

Compendio de la Invención La presente invención intenta solucionar los problemas para producir altos rendimientos de etanol a partir de una biomasa. En particular, se describe en la presente por primera vez una trayectoria metabólica novedosa que permite que los microorganismos termofílieos , especialmente bacterias tales como el Bacillus produzcan máximos rendimientos de etanol . La invención se basa en microorganismos que carecen de la actividad de lactato deshidrogenasa y que por lo tanto requieren una ruta alternativa para la re-oxidación de NADH en exceso producida por glicólisis. Esto se proporciona mediante la introducción en el microorganismo de un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD, tal como un gen fdhl. En microorganismos termofílicos y a diferencia de mesófilos tales como E. coli, la absorción de azúcar no se regula y esto conduce a la acumulación de NADH en presencia de niveles elevados de azúcares. Esto eventualmente conduce a un colapso metabólico y a una denominada "muerte redox" como se muestra en forma esquemática en la figura 1C . La incorporación en el microorganismo de un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD ayuda a evitar la muerte celular en concentraciones elevadas de azúcar al conducir a una disminución en los niveles de NADH y a un incremento en los niveles de NAD. Esto es, en parte, al restaurar el flujo a través de la trayectoria de la piruvato deshidrogenasa (PDH) , pero aún más importante, la inclusión de un gen que codifica la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD crea una trayectoria novedosa de piruvato-formiato liasa (PFL) -formiato deshidrogenasa enlazada a NAD (FDH) para la producción de etanol. La Figura ID muestra el potencial para esta trayectoria de PFL-FDH de restaurar el equilibrio redox al convertir todo el piruvato producido por glicolisis rápida en presencia de niveles elevados de azúcar en etanol y C02, especialmente en condiciones de pH neutras. Es importante destacar que la trayectoria opera en condiciones que sean óptimas para el crecimiento celular que conduzcan a la producción rápida y al rendimiento elevado de etanol, ya que la trayectoria de PFL es la principal trayectoria anaeróbica enlazada al crecimiento en microorganismos termofí lieos . Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona un microorganismo, en particular un microorganismo termofilico que carece de la actividad de la lactato deshidrogenasa (Idh) , caracterizado porque el microorganismo, de preferencia un microorganismo termofilico, contiene un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD (fdh) . En una modalidad, el microorganismo carece de la actividad de lactato deshidrogenasa en virtud de una eliminación apropiada del gen u otra mutación que remueva la actividad de la lactato deshidrogenasa. De este modo, de preferencia el gen Idh se elimina o de otra manera se vuelve no funcional. Los métodos de inactivación y eliminación genética se conocen bien en la técnica y ejemplos preferidos se describen en detalle en la presente. Además, cepas conocidas de bacterias que carecen de la actividad de la lactato deshidrogenasa (tales como TN-T9 depositadas bajo el número de acceso NCIMB 41075 y TN-TK depositada bajo el número de acceso NCIMB 41115) pueden ser adecuadas para su uso en la presente invención. El microorganismo de la invención típicamente contiene una trayectoria de la piruvato formiato liasa activa. En particular, el microorganismo de preferencia comprende un gen que codifica una piruvato formiato liasa, tal como el gen pf1. Los microorganismos de la invención típicamente también contienen una trayectoria de piruvato deshidrogenasa (PDH) activa. En una modalidad preferida, el gen que codifica la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se integra en el genoma del microorganismo termofílico. Sin embargo, también es posible que se logre la expresión estable sin la integración, por ejemplo, por la introducción de un plásmido adecuado. Un método preferido de integración es por recombinación. El gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD puede enlazarse operablemente a cualquier elemento regulador adecuado para la expresión directa de la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD. Por "enlazado operablemente" se quiere decir que existe una conexión funcional entre el elemento regulador y el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD. Por ejemplo, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD puede enlazarse a un promotor adecuado que puede ser, por ejemplo, un promotor constitutivo o inducible. "Promotor" se define en la presente para incluir una región de ADN que está implicada en la unión de ARN polimerasa para iniciar la transcripción. Típicamente, el promotor es un promotor procariótico y, por lo tanto, incluye las secuencias -10 y -35 apropiadas, las secuencias consenso de las cuales se definen apropiadamente en la técnica. El gen también puede enlazarse operablemente a otras secuencias reguladoras apropiadas tales como por ejemplo, terminadores . "Terminador" se define como una secuencia de nucleótidos que ocasiona que la ARN polimerasa termine la transcripción. En una modalidad, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se expresa a partir de su propio promotor. En una modalidad alternativa, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se expresa a partir de un promotor del microorganismo termofílico (debido a la integración en una ubicación apropiada en el genoma) . También pueden contemplarse construcciones en las que la expresión del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se activa por un promotor extraño. Esto puede realizarse para lograr, por ejemplo, niveles máximos de expresión o la expresión inducible. Como un ejemplo, los promotores fago tales como T7 pueden utilizarse junto con una polimerasa del fago adecuada (la cual puede proporcionarse en una construcción separada o igual de ADN) . En una modalidad particularmente preferida, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se enlaza operablemente a las regiones reguladoras apropiadas de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa, en particular, las regiones reguladoras corriente arriba. La región reguladora de preferencia comprende el promotor de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa. El promotor puede definirse para incluir como una unidad funcional mínima las secuencias -10 y -35 apropiadas. De este modo, de acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se inserta en el gen de lactato deshidrogenasa del microorganismo termofílico, inactivando así la actividad de la lactato deshidrogenasa del microorganismo termofílico. Esta modalidad se prefiere particularmente, ya que ambas modificaciones requeridas para producir un microorganismo termofílico de la invención se producen en la misma etapa. Construcciones adecuadas para lograr esto se describen en detalle en la presente. La producción de etanol por bacterias termofílicas es ventajosa, ya que puede llevarse a cabo a temperaturas elevadas. Aunque los microorganismos termofílicos tienen menor tolerancia al etanol que las levaduras, el etanol puede removerse continua y convenientemente de la fermentación a alta temperatura por membrana y/o evaporación moderada al vacío. En condiciones de crecimiento anaeróbico óptimas, la cepa Bacillus LLD-R crece muy rápido a 70°C casi exclusivamente por la trayectoria de PFL (Hartley y Shama, 1982). Puede contemplarse que el crecimiento por la trayectoria novedosa de PFL-FDH podría ser igualmente vigorosa, pero la temperatura de crecimiento máxima podría limitarse por la termoestabilidad de la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD introducida en el microorganismo termofílico. Por consiguiente, en una modalidad preferida, el microorganismo termofílico de la invención incorpora un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable y/o un gen cuya secuencia de nucleótidos ha sido un codón optimizado para facilitar la expresión por un microorganismo termofílico. La producción de tal formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable se describe en detalle en la presente. En una modalidad específica, el gen que codifica comprende una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD, consiste esencialmente de o consiste de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO : 1. En una modalidad adicional, el microorganismo termofílico de la invención incorpora un codón optimizado para expresión en Bacillus, el gen que codifica comprende una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD que consiste esencialmente de o que consiste de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 2. Esta secuencia incluye, además de la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable, básica, regiones promotoras y terminadoras y también sitios Xbal para facilitar la clonación del gen dentro de una construcción de ADN adecuada. En aún una modalidad adicional del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD es el gen fdhl . El gen fdhl puede derivarse de cualquier fuente adecuada y es de preferencia un codón optimizado para la expresión en el microorganismo termofílico relevante. El microorganismo termofílico de la invención puede producirse por la transformación con cualquiera de las construcciones de ADN de la invención como se describe en detalle adicional en la presente. Por consiguiente, la discusión provista aquí aplica con los cambios debidos a esta modalidad de la invención. El microorganismo termofílico de la invención puede ser cualquier microorganismo adecuado para la producción de etanol a partir de una biomasa. De preferencia, el microorganismo termofílico es un microorganismo fermentable de heterolactato . Más preferiblemente, el microorganismo termofílico es una bacteria termofílica y es más preferiblemente del género Bacillus e incluso más preferiblemente Bacillus stearothermophilus . En una modalidad, el microorganismo termofílico de la invención se deriva de la cepa conocida LLD-R o LLD-15 (de Bacillus stearothermophilus) . En una modalidad adicional, el microorganismo termofílico es° Geobacillus thermoglucosidasius . Los procesos de fermentación facilitados por la presente invención de preferencia utilizan una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD sintética, diseñada para expresar una secuencia de aminoácidos termoestable debido al uso de las preferencias del codón del microorganismo termofílico apropiado tal como la cepa Bacillus LLD-R. El gen sintético de preferencia contiene sitios de restricción diseñados para ayudar a la inserción en el gen de la lactato deshidrogenasa. Por consiguiente, la eliminación de la trayectoria de LDH y la creación de la trayectoria de PFL-FDH se logran en una sola operación. Por consiguiente, en un segundo aspecto, la invención proporciona una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable. De preferencia, la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable sigue siendo funcional en o sobre una temperatura de 60°C. De preferencia, la enzima termoestable se codifica por una secuencia de nucleótidos, la cual ha sido un codón optimizado para la expresión en un microorganismo termofílico. La formiato deshidrogenasa puede comprender, conformarse esencialmente de o consistir de la secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 3 en una modalidad.

Una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable , específica se ha diseñado con base en la secuencia de aminoácidos de la formiato deshidrogenasa Pseudomonas sp 101 (SEQ ID NO: 3) y mediante el uso de codones optimizados para Geobacillus termoglucosidasius como se discute en más detalle en la descripción detallada posteriormente. La persona experta apreciará que los derivados de la secuencia básica retendrán funcionalidad. Por ejemplo, sustituciones moderadas y semi-moderadas pueden resultar en formiato deshidrogenasas enlazadas a NAD termoestables y estos derivados se pretenden para caer dentro del alcance de la invención siempre y cuando retengan actividad y termoestabilidad catalítica efectiva de manera que son útiles en la producción de etanol utilizando microorganismos termofílieos . En forma similar, eliminaciones y/o adiciones menores de aminoácidos pueden producir derivados que retienen una funcionalidad apropiada. En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un gen sintético que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable. De preferencia, el gen comprende, se conforma esencialmente de o consiste de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 1. Esta secuencia representa una secuencia genética fdh novedosa en la cual los codones se optimizan para la producción de una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable. En una modalidad más específica, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable comprende, se conforma esencialmente de o consiste de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 2. Esta secuencia incorpora la región de codificación para la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable junto con un promotor de Bacillus adecuado y un terminador independiente de rho . La secuencia también incorpora sitios de restricción adecuados para ayudar a la clonación, en particular sitios Xbal . La persona experta apreciará fácilmente que modificaciones menores a la secuencia de nucleótidos pueden hacerse sin alterar la funcionalidad o la termoestabilidad de la enzima resultante, por ejemplo, al reemplazar codones optimizados con otros codones los cuales se prefieren en los sistemas de traducción del microorganismo termofílico apropiado . La invención también se relaciona con una construcción de ADN que contiene un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD, en particular una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable, en donde el gen se flanquea por sitios de restricción que facilitan la clonación del gen en una construcción de ADN adecuada, tal como un vector o un plásmido de expresión. En un aspecto relacionado, la invención también proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia reguladora operablemente unida a un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable . Esta construcción de ADN facilita asi la transformación de microorganismos termofílieos , en particular aquellos que carecen de la actividad de la lactato deshidrogenasa, con el fin de producir microorganismos termofílicos capaces de la fermentación eficiente dando máximos rendimientos de etanol . Como se menciona anteriormente, el término "operablemente unido" como se utiliza en la presente se refiere a una conexión funcional entre la secuencia reguladora y el gen que codifica la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD, de manera que la secuencia reguladora es capaz de influenciar la expresión genética. Por ejemplo, una secuencia reguladora preferida es un promotor. Como se menciona anteriormente, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD de preferencia comprende, se conforma esencialmente de o consiste de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 1. Una secuencia reguladora preferida es un promotor, aunque la construcción de ADN puede incorporar adicionalmente secuencias terminadoras adecuadas . En una modalidad específica, el promotor comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 4. Otros promotores, como se discute anteriormente, pueden utilizarse para niveles elevados y/o expresión inducible.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD y una secuencia de inserción, en donde la secuencia de inserción facilita la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD en el genoma de un microorganismo termofílico transformado con la construcción de ADN. Por "secuencia de inserción" se quiere decir un elemento de ADN reversible el cual es capaz de la integración en el genoma del microorganismo termofílico apropiado. Las secuencias de inserción pueden también referirse como elementos de secuencia de inserción (IE) y pueden presentarse en forma natural. En una modalidad específica de la invención, la secuencia de inserción se deriva de la cepa Bacillus stearothermophilus LLD-R o LLD-15. En una modalidad más específica, la secuencia de inserción comprende, se conforma esencialmente de o consiste de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 5 (Figura 3) . La secuencia de inserción preferida puede generarse por amplificación utilizando cebadores que comprende, se conforma esencialmente de o que consiste de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 6 y 7. En este caso, el ADN genómico de la cepa Bacillus stearothermophilus LLD-15 conocida puede utilizarse como la plantilla. Una construcción de ADN particularmente preferida es el plásmido pUB-ISFl (como se describe en la sección experimental posterior y en la figura 5) . En un aspecto aún adicional, la invención se relaciona con una construcción de ADN que comprende un gen (fdh) que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD enlazada operablemente a regiones reguladoras apropiadas de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa, en particular las regiones reguladoras corriente arriba. Las regiones reguladoras comprenden de preferencia el promotor de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa (ldh) . El promotor puede definirse para incluir como una unidad funcional mínima las secuencias -10 y -35 apropiadas para permitir la unión efectiva de la AR polimerasa. El promotor genético de la lactato deshidrogenasa es adecuado para conducir niveles elevados de expresión en microorganismos termofílicos tales como Bacilli y también puede utilizarse ventajosamente como parte de la estrategia de clonación para lograr tanto la eliminación de la actividad de la lactato deshidrogenasa como la introducción de la actividad de la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD en la misma etapa. La construcción de ADN puede así también definirse como que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD operablemente unida a una molécula de ácido nucleico la cual comprende el promotor de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa (ldh).

La construcción de ADN de preferencia también contiene parte de la secuencia de codificación del gen de la lactato deshidrogenasa huésped corriente abajo del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD. Esto facilita la integración genética en un microorganismo transformado con la construcción de ADN. Por "por lo menos en parte" significa una porción del gen de suficiente longitud para permitir la integración genética en el genoma de un microorganismo que contiene el gen de la lactato deshidrogenasa por recombinación (de preferencia por cruce doble) . La parte de la secuencia de codificación de preferencia incorpora el extremo del gen de la lactato deshidrogenasa. En una modalidad, por lo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ó 750 nucleótidos del gen de la lactato deshidrogenasa se incorporan corriente abajo del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD. De este modo, en una modalidad de la invención, la construcción de ADN comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD en donde el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se flanquea por la secuencia de nucleótidos desde un gen que codifica una lactato deshidrogenasa (derivada del microorganismo termofílico de interés). Las secuencias de flanqueo son de suficiente longitud para permitir la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD en el gen huésped que codifica una lactato deshidrogenasa por lo que se introduce la actividad de la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD y la actividad de la lactato deshidrogenasa inactivada en una sola etapa de clonación. De preferencia, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se flanquea corriente arriba por lo menos por la región promotora del gen que codifica una lactato deshidrogenasa, de manera que se sigue la integración por la recombinación del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se enlaza operablemente al promotor. En una modalidad particularmente preferida, la porción corriente abajo del gen de la lactato deshidrogenasa es aquella obtenible por amplificación del gen ldh utilizando cebadores que comprenden, que se conforman esencialmente de o que consisten de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 8 y 9, utilizando la cepa LLD-R como una plantilla. La región de flanqueo corriente arriba, la cual incorpora de preferencia el promotor ldh, de preferencia comprende por lo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ó 750 nucleótidos de las regiones corriente arriba ldh apropiadas para maximizar la eficiencia de integración por recombinación con el genoma huésped. Esta región corriente arriba puede depender del contexto de la secuencia genética ldh en el microorganismo termofílico específico de interés, como se determinaría fácilmente por una persona experimentada. De este modo, la persona experimentada con conocimiento de la secuencia genética ldh podría determinar fácilmente las regiones de flanqueo apropiadas para permitir la integración por recombinación. Por ejemplo, pueden estudiarse las secuencias genómicas publicadas, las reacciones de secuenciación llevadas a cabo o regiones de flanqueo amplificadas por PCR utilizando cebadores derivados de la secuencia genética ldh. De este modo, el gen fdh se interpone entre dos secuencias de nucleótidos derivadas a partir del gen ldh, de manera que el gen fdh reemplaza, en el marco, por lo menos parte del gen ldh. De este modo, la construcción de ADN generalmente comprende un cásete de integración genética en el cual el gen de interés (gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD) se inserta dentro de la secuencia de codificación (ORF) de un gen que se inactiva durante la integración (gen de lactato deshidrogenasa en este caso) . En la integración mediante recombinación, la expresión del gen de interés está en efecto bajo el control del gen inactivo. Tal construcción puede ser de aplicabilidad general en la circunstancia en donde un gen necesita inactivarse a favor de la expresión de un gen heterólogo. En una modalidad preferida, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable . La discusión de la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable provista en la presente se aplica así con los cambios debidos a este aspecto de la invención. En particular, en una modalidad, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable, comprende, se compone esencialmente de o consiste de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 1 6 2. Una construcción de ADN particularmente preferida es el plásmido pUCK-LFl (como se describe en la sección experimental posterior y en la figura 8) . Para todas las construcciones de ADN de la invención una forma preferida es un vector de expresión. De este modo, las construcciones de ADN permiten la expresión confiable del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable en un microorganismo transformado con la construcción. En una modalidad particularmente preferida, la construcción de ADN es un plásmido. De preferencia, la construcción de ADN puede replicarse únicamente en el microorganismo termofílico huésped mediante recombinación con el genoma del microorganismo termofílico huésped . Las construcciones de ADN de la invención también incorporan de preferencia un gen reportero adecuado como un indicador de la transformación exitosa. En una modalidad, el gen reportero es un gen de resistencia antibiótica, tal como un gen de resistencia a la kanamicina o la ampicilina. Otros reporteros, tales como la proteína fluorescente verde (GFP) , y la beta-galactosidasa (lacZ) pueden utilizarse cuando sea apropiado. Las construcciones de ADN pueden incorporar múltiples genes reporteros, cuando sea apropiado. La pérdida de la función reportera es, en generaciones subsiguientes, indicativa de la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable , junto con las regiones de flanqueo apropiadas. En aún otro aspecto adicional, la invención se relaciona a un microorganismo que comprende una construcción de ADN de la invención. Los microorganismos receptores preferidos son un microorganismo fermentable de heteroloactato . En particular, la invención se relaciona de preferencia a bacterias termofílicas , tales como aquellas del género Bacillus y especialmente Bacillus stearothermophilus . La bacteria puede derivarse de la cepa LLD-R o LLD-15 por ejemplo. En una modalidad adicional, el microorganismo termofílico es Geobacillus thermoglucosidasius . En aún un aspecto adicional, la invención se relaciona al uso de un microorganismo de la invención o a un microorganismo termofílico de la invención en fermentación, y en particular para la producción de etanol. En forma similar, la invención se relaciona a un proceso de fermentación para la producción de etanol que comprende suministrar un microorganismo termofílico de la. invención o un microorganismo de la invención con azúcares. Los microorganismos construidos de acuerdo con la presente invención son particularmente adecuados para producción elevada de etanol y productividad volumétrica bajo condiciones óptimas de crecimiento. Por consiguiente, cualquier microorganismo de la invención puede utilizarse en cualquier configuración termentadora, tal como procesos de fermentación por lotes, alimentado por lotes o continuo. En una modalidad preferida, el proceso de fermentación es un proceso alimentado por lotes. Uno de los beneficios principales de utilizar microorganismos tales como bacterias termofílicas para producir bioetanol es que, a diferencia de las levaduras, son capaces de fermentar un amplio rango de azúcares derivados de productos residuales agrícolas tales como hemicelulosas . Por consiguiente, en una modalidad, los azúcares utilizados en los procesos de fermentación de la invención se derivan de la biomasa. En una modalidad adicional, la fermentación es de azúcares mezclados. En una modalidad específica, los azúcares mezclados incluyen azúcares pentosa, de preferencia una mayoría de azúcares pentosa. En una modalidad adicional, el proceso de fermentación se mantiene en un equilibrio redox. Esto es particularmente crítico con los termófilos ya que, a diferencia de las mesófilas, la incorporación de azúcar parece no regularse en estos microorganismos. De preferencia, esto se logra mediante el uso de sensores de retroalimentación . Aunque las bacterias termofílicas tienen baja tolerancia al etanol, esto puede superarse convenientemente en los procesos de fermentación de la invención por la remoción regular o continua del etanol . Esto asegura que la concentración del etanol en la fermentación se mantenga debajo de la tolerancia del etanol del microorganismo termofílico o el microorganismo de la invención. El etanol puede removerse continua y convenientemente a partir de la fermentación a temperatura elevada por evaporación o destilación, tal como por ejemplo por membrana y/o evaporación de vacio moderado. La invención se describirá ahora con referencia a la siguiente descripción no limitante y a las figuras.

Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra el efecto de varias condiciones en las trayectorias metabólicas en un microorganismo termofílico en el cual se ha inactivado la trayectoria de lactato deshidrogenasa . La forma y espesor de las flechas indican el dominio relativo de las trayectorias metabólicas respectivas . A. Las trayectorias metabólicas se activan en pH neutro y en la presencia de azúcares bajos. Aquí, domina una trayectoria de piruvato formiato liasa. B. Las trayectorias metabólicas se activan a un pH bajo y en la presencia de azúcares bajos. Aquí, domina una trayectoria de piruvato deshidrogenasa anaeróbica. C. Las trayectorias metabólicas se activan a un pH bajo y en la presencia de azúcares elevados. Aquí las células experimentan tensión metabólica y quedan fuera del equilibrio redox conduciendo a la así llamada "muerte redox" . D. Las trayectorias metabólicas se activan en microorganismos termofílicos de la presente invención en pH neutro y en la presencia de azúcares elevados. Aquí, la trayectoria de PFL-FDH novedosa es dominante y el etanol y CO2 son los únicos productos anaeróbicos . La Figura 2 establece la secuencia de nucleótidos del gen fdh sintético producido por la optimización del codón para maximizar la termoestabilidad . La secuencia de ADN del marco de lectura abierto fdh se flanquea por las regiones promotoras y terminadoras (cursivas). Los recuadros -35 y -10 del promotor se subrayan. Para clonar la construcción en un vector adecuado, sitios Xbal se introdujeron en ambos lados de la secuencia. La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos de la Secuencia de Inserción (IS) de la Cepa B. stearothermophilus LLD-15. Los extremos de repetición invertidos de 9 pb se muestran en negritas. La Figura 4 es una representación esquemática del plásmido pCR-Fl derivado de pCR-Blunt . El plásmido incluye un gen fdhl optimizado con el codón bajo el control del promotor ldh, clonado en pCR-Blunt en el único sitio Xbal . La Figura 5 es una representación esquemática del plásmido pUB-ISFl derivado de pUBllO. El plásmido incluye un gen fdhl optimizado con el codón bajo el control del promotor ldh, derivado del plásmido pCR-Fl y también una secuencia de inserción (IS) derivado de la cepa Bacillus LLD-15. La Figura 6 es una representación esquemática del plásmido derivado pUC18 llamado pUCK. El plásmido incluye un gen de resistencia a la kanamicina clonado del plásmido pUBllO en el único sitio de restricción en pUC18. La Figura 7 es una representación esquemática del pUCK-LC derivado de pUCK. El plásmido porta un gen ldh con una eliminación de 363 pb en la mitad del ORF. La Figura 8 es una representación esquemática del pUCK-ldhB derivado de pUCK. El plásmido contiene 750 pb del gen ldh, incluyendo la región corriente abajo del gen. La Figura 9 es una representación esquemática del plásmido pUCK-LFl . Este plásmido es un derivado de pUCK que incorpora un gen que integra el cásete que contiene el gen fdh bajo el control del promotor ldh.

Descripción de la Invención Materiales Medios y t mpones Medio LB: Triptona 10 g; Extracto de Levadura 5 g; NaCl 10 g; agua desionizada a 1 litro pH ajustado a 7 y calentado en autoclave para esterilizar Para el medio de placa se agregó 20 g/1 de agar al medio antes de calentar por autoclave, se enfrió a 55°C y se vertió en platos Petri estériles (aproximadamente 20 ml/placa) . Para las placas LB-amp se agregó una solución de ampicilina esterilizada en filtro para una concentración final de 50 µg/ml antes de verter a las platos Petri. Medio SOC: Triptona 2.0 g; Extracto de Levadura 0.5 g; NaCl 0.05 g; MgCl2.6H20 0.204 g; MgS04.7H20 0.247 g; Glucosa 0.36 g; H20 desionizada a 100 mi. Disuelto, ajustado el pH a 7.0 y esterilizado en filtro. Medio TGP: Triptona 17 g; Peptona de soya 3 g; K2HP04 2.5 g; NaCl 5 g; piruvato de sodio 4 g; glicerol 4 mi; agua desionizada a 1 litro. pH ajustado a 7 y calentado en autoclave para esterilizar. Para un medio de placa, se agregó 20 g/1 de agar en el medio antes de calentar en autoclave, se enfrió a 55°C y se vertió en platos Petri estériles (aproximadamente 25 ml/placa) . Para placas TGP-kan, la solución de kanamicina esterilizada en filtro para una concentración final de 10 ^g/ml se agregó antes de verter en las platos Petri . Tampón TH: Trehalosa 272 mM; HEPES (pH 7.5 con KOH) 8 mM; H20 doble destilada a 1 litro.

Cepas Microbianas Se adquirieron cepas químicamente competentes DH5-alfa de E. coli a partir de Invitrogen (Cat. 18265-017). Bacillus subtilis subsp. Recolección de cultivo Subtilis-German, DSMZ (DSM o. 10). Bacillus stearothermophilus . cepa LLD-R Depositada como NCIMB 12403. Bacillus stearothermophilus. cepa LLD-15 Depositada como NCIMB 12428.

Plásmidos Se obtuvieron plásmidos pCR-Blunt y pCR-TOP02 de Invitrogen . Se obtuvo el plásmido pUBllO - cepa Bacillus subtilis BD170 que alberga este plásmido de la recolección de cultivo alemana, DSMZ (DMS No. 4514) .

Se obtuvo el plásmido pUC18 de Sigma-Aldrich.

Ejemplo 1. Construcción de un gen de formiato deshidrogenasa sintético (Figura 2) Se tradujo de nuevo una secuencia de aminoácidos (No. de Acceso de la Base de Datos de la Proteína NCBI P 33160 - SEQ ID NO: 3) de las formiato deshidrogenadas Pseudomonas sp 101 en una secuencia de ADN con codones optimizados para Geobacillus ther oglucosidasius . Una región promotora y terminadora independiente de rho de una cepa Bacillus se agregaron, corriente arriba y corriente abajo de la secuencia traducida respectivamente (Figura 2). La secuencia novedosa mostró menos de 40% de similaridad con las secuencias del gen fdh conocidas (37% de identidad con el gen fdhl conocido) . Se diseñaron sitios Xbal en ambos lados de la construcción para facilitar su clonación en vectores adecuados . Se sintetizó la secuencia deseada utilizando el método de Gao et al (véase Xinxin Gao, Peggy Yo, Andrew Keith, Timothy J. Ragan y Thomas K. Harris (2003). Nucleic Acids Research, 31 (22), el43) y se clonó en pCR-Blunt en su única posición Xbal. El vector resultante pCR-Fl (Figura 4) se introdujo en células alfa DH5 E. coli y los clones positivos se confirmaron por PCR y análisis de restricción. Dos estrategias alternativas están disponibles para insertar y expresar este gen fdh sintético en el genoma del Bacilo objetivo como se muestra en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 2. Inserción del gen fdh en múltiples sitios (IS) Esta estrategia se aplica a las cepas tales como la cepa LLD-R de Bacillus stearothermophilus que contiene una Secuencia de Inserción (IS) que recombina frecuentemente en múltiples sitios de inserción. Un vector que porta el gen fdh y esta secuencia IS se espera que se integre establemente en una o más de tales ubicaciones.

Construcción del plásmido pUB-ISFl (Figura 5) En primer lugar, la Secuencia de Inserción conocida de la cepa LLD-R (SEQ ID NO: 5 y la Figura 3) es una PCR amplificada utilizando un cebador delantero (AGTACTGAAATCCGGATTTGATGGCG - SEQ ID NO : 6) y un cebador inverso (AGTACTGCTAAATTTCCAAGTAGC - SEQ ID NO: 7) con la cepa LLD-15 de B. stearothermophilus como la plantilla. Los sitios de restricción Seal se introducen en ambos lados de la secuencia. El producto de PCR se clona primero en el plásmido pCR-TOP02.1 y el plásmido pCR-IS resultante se introduce entonces en las células alfa DH5 E. coli y se utiliza para aislar la región IS por la digestión de restricción Seal. La IS aislada se clona entonces en pUBlO en su único sitio Scal y el plásmido pUB-IS resultante se introduce en Bacillus subtilis . Luego, un fragmento de 1.5 kb que contiene el promotor Idh y el gen fdh se digieren a partir del plásmido pCR-Fl utilizando la enzima de restricción Xbal , y se clona en el plásmido pUB-IS que se linearizó ya con la misma enzima. El plásmido pUB-ISFl resultante (Figura 5) se introduce entonces en B. subtilis y los clones positivos se seleccionan en placas TGP-kan y se confirman por PCR y análisis de restricción.

Integración del gen fdh en la cepa LLD-R El plásmido pUB-ISFl se metila entonces in vitro con la enzima metilasa fíaelll y luego con la cepa LLD-R de Bacillus stearothermophilus o sus células de las cepas eliminadas de ldh (véase el Ejemplo 3) se transforman con el plásmido pUB-ISFl metilado. Los clones positivos se seleccionan después de 48 horas en placas TGP-Kan a 50°C, y se analizan por amplificación de PCR del gen fdh. El gen fdh se integra entonces en el cromosoma desarrollando un clon transformado en un medio TGP-Kan a 60-65°C para pocas generaciones y seleccionando en placas TGP-Kan. Los clones positivos se analizan para la presencia del gen fdh y luego se seleccionan para la producción de etanol y la utilización de azúcar C5 (pentosa) y C6 (hexosa) en matraces de agitación y en termentadores.

Ejemplo 3. Construcción de cepas eliminadas de ldh La primera etapa es clonar un marcador de resistencia a kanomicina del Bacillus (kan) y un cásete que porta el gen ldh de la cepa LLD-R de B. stearothermophilus en el plásmido pUC18, el cual puede replicar sólo en microorganismos gram negativos.

Construcción del vector de clonación de Bacillus. Plásmido pUCK (Figura 6) . Se clonó el gen de resistencia a la kanamicina (kan) en el plásmido pUC18 en su único sitio Zral el cual está fuera de cualquier región de codificación y del gen reportero (lacZ) en el plásmido. Para clonar el gen kan, un fragmento de 1.13 kb que contiene el gen de resistencia a la kanamicina se amplificó por PCR con los cebadores: Kan-BsZ-F (ACACAGACGTCGGCGATTTGATTCATAC - SEQ ID NO: 10) y kan-BsZ-R ( CGCCATGACGTCCATGATAATTAC AATACTAGG - SEQ ID NO: 11) utilizando el plásmido pUBllO como plantilla. Los sitios Zral se introdujeron en ambos extremos del gen kan a través de los cebadores. El producto PCR se digirió entonces con una enzima endonucleasa de restricción Zral y se ligó con el plásmido pUC18 previamente digerido con Zral y desfosforilado . El plásmido pUCK resultante (Figura 6) se introdujo entonces en células alfa DH5 E. coli. Los clones positivos se seleccionaron en placas LB-amp y se confirmaron por PCR y análisis de restricción.

Construcción del plásmido pUCK-LC (Figura 7) el cual porta un gen ldh eliminado Se diseñó un cásete ldh de 1.36 kb para contener el gen ldh completo de la cepa LLD-R a partir del cual 363 pb de su ORF se eliminó más sus flancos. El cásete se construyó por amplificación de PCR de las regiones superiores e inferiores del gen ldh utilizando la cepa LLD-R como una plantilla. Estas regiones se ligaron y clonaron entonces en el plásmido pUCK. Los sitios BglII se introdujeron en los cebadores internos. La región superior fue PCR amplificada utilizando los siguientes cebadores: LC-U-F1 (AGGGCAATCTGAAAGGAAGGGAAAATTCC - SEQ ID NO: 12) y LC-UB-R1 TGCACAGATCTCCACCAAATCGGCGTC - SEQ ID NO: 13). La región inferior fue PCR amplificada utilizando los siguientes cebadores: LC-DB-F1 (TTGAGCAGATCTTGATGCAAAACGATAAC - SEQ ID NO: 14) y LC-D-R1 (TAAAGCCGATGAGCAGCAGTTGAAG - SEQ ID NO: 15) . Se digirieron los productos de PCR con una enzima endonucleasa de restricción BglII y se ligaron utilizando la enzima ADN ligasa T4. Utilizando el ligando como plantilla, el cásete ldh fue entonces PCR amplificada utilizando como cebadores : LC-UX-F2 (ATATTATCTAGACATTACGGAAATGATAATGGC - SEQ ID NO: 16) Y LC-DX-R2 (TCACAATCTAGACAATCGGCCATAAAC- SEQ ID NO . 17) . Se introdujeron los sitios de Xbal en ambos extremos del cásete mediante los cebadores . El producto PCR se digirió entonces con la enzima Xbal y se clonó en el plásmido pUCK pre-digerido con la misma enzima y se desfosforiló . El plásmido pUCK-LC resultante se introdujo entonces en E. coli DH5 alfa. Los clones positivos se seleccionaron en placas LB-amp y se confirmaron por PCR y análisis de restricción.

Construcción de las cepas eliminadas ldh El plásmido pUCK-LC se metilo in vitro con la enzima metilasa HaelII y las células termófilas de tipo silvestre (por ejemplo, la cepa LLD-R) se transforman en el plásmido metilado por electroporación (1000 V, 201 ohms , 25 micro-Faraday, y 5 milisegundos ) . Los clones positivos se seleccionan en placas TGP-Kan a 65°C y se confirmaron como casos cruzados sencillos por amplificación de PCR del gen kan . Para lograr la eliminación genética por doble cruce, los clones positivos se cultivaron en un medio TGP durante unas cuantas generaciones (aproximadamente 5 sub-cultivos) y los clones los cuales pueden cultivarse en placas TGP pero no en placas TGP-kan se seleccionan. Los clones positivos se confirman entonces como eliminaciones del gen ldh y para la ausencia del gen kanamicina por análisis de PCR. Los clones se caracterizan entonces para la producción de etanol y utilización de azúcar C5 y C6 en matraces de agitación y en termentadores.

Ejemplo 4. Inserción simultánea del gen fdh y eliminación del gen ldh. Esta estrategia alternativa es ampliamente aplicable a una clase amplia de microorganismos fermentables de heterolactato así como el bacilo termofílico , aunque el último se utilizará como ilustración.

Construcción del plásmido pUCK-LF (Figura 9). Un cásete que integra el gen que contiene el gen fdh más el gen ldh completo y aproximadamente 300 pb de las regiones de flanqueo corriente arriba y corriente abajo se clona en el plásmido pUCK. En esta construcción, las primeras 450 pb del marco de lectura abierto ldh se reemplazan con el gen fdh de tal manera que la expresión genética se convierte bajo control del promotor del gen ldh. Para lograr esto un fragmento de ADN de aproximadamente 750 pb que contiene la región corriente abajo del gen ldh es PCR amplificada utilizando; LDHB-X-F1 (GAACGATTCTAGATACAGCAAGATTCCGC - SEQ ID NO: 8) y LDHB-E-R1 (GTTTGCGAATTCATAGACGGACGCAG - SEQ ID NO: 9) como cebadores y la cepa LLD-R de Bacillus stearothermophilus como una plantilla. Los sitios Xbal y EcoRl se introducen entonces en los extremos del fragmento de PCR. El fragmento de PCR se digiere entonces y se clona direccionalmente en el plásmido pUCK entre los sitios Xbal y EcoRl . El plásmido resultante, pUCK-ldhB (Figura 8) se introduce en E. coli DH5 alfa y los clones positivos se seleccionan en placas LB-amp y se confirman por PCR y restricción. Luego, un fragmento de 1.5 kb que contiene el promotor ldh y el gen fdh se digieren desde el plásmido pCR-Fl utilizando la enzima de restricción Xbal y se clonan en el plásmido pUCK-ldhB (Figura 8) la cual se linearizó ya con la misma enzima. El plásmido pUCK-LFl resultante (Figura 9) se introduce en las células E. coli DH5 alfa y los clones se seleccionan en placas LB-Amp. Los clones positivos y la orientación correcta de la construcción se confirman por PCR y análisis de restricción.

Construcción de las cepas que hacen etanol por la trayectoria PFL-FDH novedosa El plásmido pUCK-LFl se metila in vitro con la enzima metilasa Hael~L~L y Las células de tipo silvestre objetivo (por ejemplo, las células de la cepa LLD-R) se transforman con el plásmido metilado y se seleccionan en placas TGP-Kan a 60°C. Los clones positivos representan casos cruzados sencillos y se analizaron por amplificación de PCR del gen fdh. Para lograr la doble integración del gen cruzado, los clones que se cultivan en placas TGP, pero no en placas TGP-Kan se seleccionan. Los clones positivos se confirman entonces para la presencia del gen fdh y la ausencia del gen de kanamicina. Finalmente, los clones se seleccionan para la producción de etanol y la utilización de azúcar C5 y C6 en matraces de agitación y en fermentadores . Todas las referencias se incorporan en la presente en su totalidad.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Un microorganismo termofílico que carece de la actividad de la lactato deshidrogenasa caracterizado en que el microorganismo termofílico contiene un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD.
2. 2. El microorganismo termofílico de la reivindicación 1, el cual expresa una actividad de piruvato formiato liasa.
3. 3. El microorganismo termofílico de la reivindicación 1 ó 2, en donde el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se integra en el genoma del microorganismo termofílico.
4. 4. El microorganismo termofílico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se expresa desde su propio promotor o desde un promotor del microorganismo termofílico .
5. 5. El microorganismo termofílico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el gen que codifica la formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se inserta dentro del gen de la lactato deshidrogenasa del microorganismo termofílico, inactivando así la actividad de la lactato deshidrogenasa del microorganismo termofílico.
6. 6. El microorganismo termofílico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD comprende la secuencia de nucleótido establecida como la SEC . ID. NO: 1 ó 2.
7. 7. El microorganismo termofílico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual se ha transformado con una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD operablemente enlazada a una región corriente arriba de un gen que codifica lactato deshidrogenasa en donde la región corriente arriba incluye el promotor y además comprende por lo menos parte del gen de la lactato deshidrogenasa corriente abajo del gen que codifica una formiato deshidrogenasa de tal modo que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD se interpone entre una porción suficiente del gen lactato deshidrogenasa sobre cualquier lado para facilitar la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD mediante recombinación con un gen de lactato deshidrogenasa en el genoma del microorganismo termofílico.
8. 8. El microorganismo termofílico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores el cual es una bacteria termofílica del género Bacillus.
9. 9. Un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable que comprende la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 1.
10. 10. Una construcción de ADN que comprende una secuencia reguladora operablemente enlazada a un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable que comprende la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 1.
11. 11. Una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD, opcionalmente una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable, y una secuencia de inserción, en donde la secuencia de inserción facilita la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD en el genoma de un microorganismo termofílico transformado con la construcción de ADN.
12. 12. Una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD, opcionalmente una formiato deshidrogenasa enlazada a NAD termoestable, operablemente unida a una región corriente arriba de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa, en donde la región corriente arriba incluye el promotor.
13. 13. Un microorganismo que comprende la construcción de ADN como se define en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
14. 14. El uso de un microorganismo termofílico como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un microorganismo como se reivindica en la reivindicación 13 para la producción de etanol.
15. 15. Un proceso de fermentación para la producción de etanol que comprende suministrar un microorganismo termofílico como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un microorganismo como se reivindica en la reivindicación 13 con azúcares.