KR101976691B1 - 재조합 미생물 및 이를 이용한 개미산 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 FDH1α(formate dehydrogenase 1 alpha subunit)를 코딩하는 내인성 유전자가 결실되고, FDH1을 코딩하는 외인성 유전자가 도입된, 개미산을 생산하기 위한 재조합 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 개미산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 미생물 및 이를 이용한 개미산 제조 방법{RECOMBINANT MICROORGANISM AND METHOD FOR PREPARING FORMIC ACID USING THE SAME}

본 발명은 내인성 fdh1α(formate dehydrogenase 1 alpha subunit) 유전자가 결실되고, 외인성 fdh1을 발현하는 개미산 생산량이 증진된 미생물, 구체적으로 메틸로박테리움 속 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 개미산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

화석연료를 이용하는 산업 전반의 빠른 발전은 대기중 이산화탄소의 농도를 급속하게 증가시키고 있다 [1]. 게다가, 다수의 논문들이 대기중 이산화탄소의 증가가 온실효과를 통한 지구온난화를 발생시키는 결정적인 요소임을 확인한 바 있다 [1-3]. 따라서 이러한 이산화탄소를 고부가가치의 화학물질로 전환하는 것은 대기중 이산화탄소 증가의 속도를 늦추는데 필수적인 기술로 상정되고 있다. 다행히도, 이산화탄소는 개미산, 디메틸 카보네이트, 고분자 등 환경 친화적인 화학 플랫폼을 생산하는 유망한 재생가능한 자원이다 [4].

이산화탄소로부터 생산할 수 있는 많은 후보물질들 중에서 개미산은 경제적 및 환경적 이익 측면에서 가장 이상적인 화학 원료이다 [5]. 특히, 개미산을 전기에너지로 전환시키는 직접적 개미산 연료셀(direct formate fuel cell; DFFC)은 풍력, 태양력, 수력 등 다양한 재생 에너지원에서 생산된 에너지를 개미산으로 쉽게 저장할 수 있기 때문에 재생 에너지 저장의 해결책으로 제시되고 있다. 또한 개미산은 환경에서 불연성, 무독성, 및 불활성이므로 수소 가스보다 안전하게 수송이 가능한 장점이 있다 [6, 7].

유망한 잠재력에도 불구하고, 이산화탄소로부터 고부가가치의 화합물을 생산하는 기존의 기술은 가혹한 반응 조건과 희귀한 귀금속 촉매 및 수소 가스, 수소화물 등과 같은 값 비싼 환원제를 요구하는 치명적인 한계를 갖고 있다 [8, 9]. 상대적으로 낮은 전기 에너지 비용을 고려할 때, 이산화탄소의 전기 촉매 반응이 유망한 대안일지라도, 일부 화학 전기 촉매는 이산화탄소의 개미산 전환 중에 높은 비율로 부산물인 수소 가스를 생산하기 때문에 불충분한 반응선택성을 보여주고 있는 실정이다 [10]. 따라서 효소 기반의 전기 촉매에 의한 이산화탄소로부터의 개미산 생산은 탁월한 개미산 선택성으로 인하여 더 많은 관심을 받고 있다 [11-14]. 그러나 음극으로부터 공급된 전자를 직접 이용하여 이산화탄소로부터 개미산 생산의 효과적인 생산을 위해서는 산소내성이 있는 생촉매의 개발이 절실히 필요하다 [15].

또한 석유화학공업에 있어서 원료를 탄소수 1개의 화합물로 공급하는 기술은 기본적인 단계로서 매우 중요하다. 이러한 기술을 'C1 화학'이라 정의하는데, C1 화학 분야에서는 석유 연료의 한계, 환경 및 경제적 원인을 이유로 미생물로부터 C1 화합물 얻기 위한 시도가 계속되고 있다. 특히 C1 화학에서는 이산화탄소를 개미산으로 전환하는 것이 C1 화학 플랫폼 구축에 매우 중요하게 인식되는데, 이러한 C1 화학 플랫폼을 구축하기 위한 수많은 미생물 중 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1 ( Methylobacterium extorquens AM1)은 이산화탄소를 개미산으로 전환하는데 탁월한 활동성을 지닌 것으로 보고된 바 있다. 본 발명자들은 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1 세포 전체를 바이오촉매로서 사용하는 전기 촉매 반응을 통해 이산화탄소를 개미산으로 전환시키는 새로운 접근법을 보고한 바 있다. 본 발명자들이 입증한 바에 의하면 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1은 전기 화학 반응기에서 높은 산소 안정성과 함께 이산화탄소로부터 개미산 생산 능력을 보여주었다 [16]. 그러나 이산화탄소로부터 개미산의 합성에 주로 관여하는 효소는 아직 알려진 바 없다.

1. PNAS, 2010, 107, 5687-5692. 2. PNAS, 2009, 106, 1704-1709. 3. Nature, 2009, 459, 829-U823. 4. Chem Rev, 2014, 114, 1709-1742. 5. Energy Environ. Sci., 2015, 8, 3283-3297. 6. ChemSusChem, 2015, 8, 3853-3858. 7. Environ. Sci. Technol., 2005, 39, 5095-5100. 8. Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 3703-3727. 9. ACS Catal., 2013, 3, 2412-2416. 10. JACS, 2012, 134, 5500-5503. 11. Science, 2013, 342, 1382-1385. 12. JACS, 2014, 136, 15473-15476. 13. Green Chem., 2016, 18, 5989-5993. 14. Green Chem., 2011, 13, 2285. 15. PNAS, 2008, 105, 10654-10658. 16. Bioresour. Technol., 2015, 185, 35-39.

일 양상은 FDH1α(formate dehydrogenase 1 alpha subunit)를 코딩하는 내인성 유전자가 결실되고, FDH1을 코딩하는 외인성 유전자가 도입된, 개미산을 생산하기 위한 재조합 미생물을 제공한다.

다른 양상은 상기 미생물을 배지에서 배양시키는 단계를 포함하는 개미산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

일 양상은 FDH1α(formate dehydrogenase 1 alpha subunit)를 코딩하는 내인성 유전자가 결실되고, FDH1을 코딩하는 외인성 유전자가 도입된, 개미산을 생산하기 위한 재조합 미생물을 제공한다.

일 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 메틸로박테리움 속 미생물로부터 유래된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 메틸로박테리움 속 미생물은 M. 아드하에시붐 (M. adhaesivum), M. 아에로라툼 (M. aerolatum ), M. 아미노보란스 (M. aminovorans ), M. 아쿠아티쿰 (M. aquaticum ), M. 브라치아툼 (M. brachiatum ), M. 브라치테시이 (M. brachythecii ), M. 불라툼 (M. bullatum ), M. 세라스티 (M. cerastii ), M. 단코오켄세 (M. dankookense ), M. 엑스토르쿠엔스 (M. extorquens ), M. 푸지사와덴세 (M. fujisawaense ), M. 그나팔리이 (M. gnaphalii ), M. 고에신켄세 (M. goesingense), M. 고씨피이콜라 (M. gossipiicola ), M. 그레간스 (M. gregans ), M. 하플로클라디이 (M. haplocladii ), M. 히스파니쿰 (M. hispanicum ), M. 이네르스 (M. iners ), M. 이스빌리엔세 (M. isbiliense ), M. 제오트갈리 (M. jeotgali ), M. 코마가타에 (M. komagatae ), M. 롱굼 (M. longum ), M. 마르찬티아에 (M. marchantiae), M. 메소필리쿰 (M. mesophilicum ), M. 노둘란스 (M. nodulans ), M. 오르가노필럼 (M. organophilum ), M. 오리자에 (M. oryzae ), M. 옥살리디스 (M. oxalidis), M. 페르시치눔 (M. persicinum ), M. 필로스파에라에 (M. phyllosphaerae), M. 필로스타키오스 (M. phyllostachyos ), M. 플라타니 (M. platani), M. 포다리움 (M. podarium ), M. 포푸리 (M. populi ), M. 슈도사사에 (M. pseudosasae), M. 슈도나시콜라 (M. pseudosasicola ), M. 라디오톨레란스 (M. radiotolerans), M. 로데시아눔 (M. rhodesianum ), M. 로디눔 (M. rhodinum ), M. 살수지니스 (M. salsuginis ), M. 솔리 (M. soli ), M. 수오미엔세 (M. suomiense ), M. 타르둠 (M. tardum ), M. 타르하니아에 (M. tarhaniae ), M. 티오시아나툼 (M. thiocyanatum), M. 투린지엔세 (M. thuringiense ), M. 트리폴리이 (M. trifolii ), M. 바리아빌레 (M. variabile ), 및 M. 자트마니이 (M. zatmanii ) 중 선택된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 메틸로박테리움 속 미생물은 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens), 구체적으로, 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 기탁번호 KCTC 13388BP인 미생물일 수 있다.

실시예에 의하면, 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1에서 FDH1α를 코딩하는 내인성 유전자인 fdh1α을 녹-아웃하고, FDH1을 코딩하는 유전자 fdh1을 형질전환하여 재도입하는 경우, 야행성 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1에 비해 개미산 생산량이 증가한다. 놀랍게도, 야행성 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1에 녹-아웃 전처리 없이 fdh1 코딩하는 유전자를 형질전환하여 인위적으로 발현시키는 경우, 본 발명의 재조합 미생물과 같은 개미산 생산량을 기대할 수 없었다. 따라서 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1으로부터 증가된 개미산 생산량을 기대하기 위해서는 FDH1α를 코딩하는 내인성 유전자의 결실 및, FDH1을 코딩하는 외인성 유전자의 도입이 반드시 요구된다.

메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1의 FDH1 단백질은 FDH1α 및 FDH1β로 이루어진다. 상기 FDH1α는 서열번호 1의 아미노산 서열(GenBank accession No. ACS42636.1)을 포함하고, 상기 FDH1β는 서열번호 2의 아미노산 서열(GenBank accession No. ACS42635.1)을 포함한다. 따라서 상기 FDH1α를 코딩하는 유전자인 fdh1α는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 것으로서, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열(GenBank accession, CP001510.1:5169596-5172565, Methylobacterium extorquens AM1, complete genome)을 포함하는 것일 수 있고, 상기 FDH1β를 코딩하는 유전자인 fdh1β는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 것으로서, 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열(CP001510.1:5167825-5169543, Methylobacterium extorquens AM1, complete genome)을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 FDH1을 코딩하는 유전자 fdh1은 상기 서열번호 3 및 4의 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 FDH1을 코딩하는 외인성 유전자는 유전 물질 전달체에 의해서 미생물 내에 도입된 것일 수 있다. 상기 유전 물질 전달체는 벡터일 수 있다. 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명에서 사용되는 벡터는 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 벡터는 PmxaF 프로모터를 포함하는 것일 수 있다. 상기 PmxaF 프로모터를 포함하는 벡터는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, pCM110일 수 있다. 본 발명의 재조합 미생물은 PmxaF 프로모터를 포함하므로 메탄올과 같은, 구하기 쉽고 조절이 용이한 물질로 FDH1의 발현량을 조절할 수 있는 장점이 있다. 실시예에 입증된 바에 따르면, 외래적으로 도입된 FDH1의 발현량이 증가함에 따라 개미산 생산량도 증가되므로, FDH1 발현량이 적절하게 조절된 재조합 미생물은 야생형 보다 뛰어난 개미산 생산 능력을 갖는다. 상기 벡터는 외인성 유전자를 세포(구체적으로, 미생물)로 도입시키기 위해 적합한 것이라면 통상의 기술자에게 알려진 어떤 것이든 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 PmxaF 프로모터는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물은 일반적인 미생물과 달리 NADH와 같은 값비싼 전자 공여체 없이도 전기 화학적으로 생산된 전자를 이용하여 이산화탄소로부터 개미산을 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 재조합 미생물이 존재하는 환경에 전자를 공급할 수 있는 시스템이라면 개미산을 생산하는데 이용될 수 있으며, 그러한 시스템으로는 예를 들어, 전극을 주입하여 전지로부터 직접 전류를 흘려주는 전기적 시스템 또는 산화 환원 반응에 의해 전류를 생성하고 전자를 공급할 수 있는 전기 화학적 (화학 전지) 시스템이 있다. 따라서, 일 구체예에서 상기 재조합 미생물은 개미산을 생산하기 위하여 전기적 또는 전기화학적 시스템에서 적용되는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 전기화학적 시스템은 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템에서 배양되는 것일 수 있다. 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템이란, 화학전지 원리를 이용하여 이산화탄소를 개미산으로 환원시킬 수 있는 시스템을 의미한다. 전기 화학적 전환 기술은 상온, 상압 조건에서도 이산화탄소 환원 반응이 가능하고, 물과 이산화탄소를 주로 이용하므로 화학물질의 배출이 없으며, 시스템이 간단하고 모듈화가 용이한 장점을 갖는다. 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템에 의하면 미생물 없이도 이산화탄소로부터 개미산 생성이 가능하다. 그러나 도 2에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 미생물 없이는 개미산이 측정 가능한 농도로 충분히 생성되지 않으며, 생산량 또한 야생형에 비해 현저히 뛰어나다. 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템은 도 8에 도식된 바와 같이, 예를 들어, 구리, 흑연(graphite), 탄소 펠트(carbon felt), 및 탄소 섬유와 같은 음극 및 백금과 같은 양극을 포함하고, Ag/AgCl와 같은 기준 전극을 더 포함할 수 있다. 그러나 상기 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템은 필요에 따라 통상의 기술자에게 잘 알려진 방식으로 얼마든지 변형 가능하다.

일 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 메탄올 농도에 의해 개미산 생산량이 조절될 수 있다. 실시예에 의하면, 본 발명의 재조합 미생물은 2 v/v% 메탄올(배지 부피 기준)을 유도물질로 사용한 경우, 21 시간 동안 26.6 mM의 개미산으로서 가장 높은 농도의 개미산을 생산하였다. 따라서 상기 메탄올 농도는 반응 초기 농도로서, 2.0 v/v% 이상일 수 있다. 상기 메탄올 농도는 미생물의 성장에 대한 독성을 고려하여 2.0 내지 10.0 v/v%, 2.0 내지 8.0 v/v%, 2.0 내지 6.0 v/v%, 또는 2.0 내지 4.0 v/v%로 설정할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 텅스텐산염이 30 μM 초과 120 μM 미만의 농도로 존재하는 환경에서 배양 또는 시스템에 적용되는 것일 수 있다. 실시예에 의하면 본 발명의 재조합 미생물은 텅스텐산염이 30 μM이 존재하는 환경에서는 특이적인 개미산 생산성 증가를 보이지 않았다. 또한 텅스텐산염이 120 μM이 존재하는 환경에서는 오히려 개미산 생산성이 감소하였다. 본 발명의 재조합 미생물은 텅스텐산염이 약 60 μM로 존재하는 환경에서 21시간동안 25.7mM의 개미산 생산으로, 다른 농도에 비해 현저하게 증가된 개미산 생산성을 보였다. 따라서, 상기 재조합 미생물은 텅스텐산염이 40 내지 110 μM, 50 내지 100 μM, 50 내지 90 μM, 50 내지 80 μM, 또는 50 내지 70 μM, 바람직하게는 약 60 μM의 농도로 존재하는 환경에서 배양 또는 시스템에 적용되는 것일 수 있다.

FDH1은 보결분자단으로 몰리브덴(Mo) 대신 W-프테린 구아니딘 디뉴클레오티드를 보유하는 것으로 알려져 있다 [17]. 구체적으로, FDH1α는 비스-텅스토프테린 구아닌 디뉴클레오티드 공동인자(bis-tungstopterin guanine dinucleotide cofactor), 3 개의 4Fe4S 클러스터, 및 한 개의 2Fe2S 클러스터를 포함한다. FDH1β는 플래빈 모노뉴클레오티드 (FMN), NAD, 및 한 개의 4Fe4S 클러스터를 보유한다 [18]. 대기 중에서 정제된 FDH1β는 전기 화학적 환원 시스템에서 인공 전자 매개체인 메틸 비올로겐(MV)을 이용하여 NADH의 재생에 성공적으로 적용될 수 있다 [19]. 일반적으로, 텅스텐의 가용성은 몰리브덴이 비해 훨씬 낮고, 화학적 성질이 매우 유사한 것으로 알려져 있지만 미생물은 특정 수송체로서 둘 중 하나를 더 선호하는 것으로 보인다 [22, 23]. 실시예에 의하면, 본 발명의 재조합 미생물은 다양한 전자 매개체 중 메틸 비올로겐, 에틸 비올로겐, 또는 이들의 조합이 존재하는 환경에서 증가된 개미산 생산량을 가졌다. 따라서 일 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 메틸 비올로겐, 에틸 비올로겐, 또는 이들의 조합이 존재하는 환경에서 증가된 개미산 생산량을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 미생물의 추가적으로 한가지 놀라운 점은 음극에서 공급되는 전자를 이용하여 매우 효과적으로 개미산을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 공기 분위기에서 산소에 매우 안정한 특성을 갖는다(예를 들어, 용존산소 약 1 mg/L). 기존에 알려진 생촉매들 중 음극에서 공급된 전자를 직접 이용할 수 있는 것이 있었으나, 이들은 매우 산소에 불안정하여 실제 적용이 불가능하였다 [15]. 따라서, 본 발명의 미생물은 실제 산업화 공정에 적용이 가능하므로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

다른 양상은 본 발명의 미생물을 배지에서 배양시키는 단계를 포함하는 개미산을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 미생물은 개미산을 생산하기 위해 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템에서 배양하는 것일 수 있다. 따라서 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 배지에 이산화탄소를 포화시키는 단계; 및 상기 배지에 전기적 또는 전기화학적 처리를 하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 주입하는 이산화탄소의 농도 및 속도는 필요에 따라 조절될 수 있고, 예를 들어 CO₂ 가스 배기 (purging) 약 99.999 %, 및 속도 약 1 mL/s으로 주입되는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법에서의 배지는 메탄올을 더 포함할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 메탄올에 의해서 본 발명의 재조합 미생물의 개미산 생산량을 조절할 수 있다. 적절한 메탄올 농도는 상기 언급한 바와 같다.

일 구체예에서, 상기 방법에서의 배지는 텅스텐을 더 포함할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 적절한 텅스텐산염 농도는 본 발명의 재조합 미생물의 개미산 생산량을 최적화하기 위해 중요하다. 적절한 텅스텐산염 농도는 상기 언급한 바와 같다.

일 구체예에서, 상기 방법에서의 배지는 FDH1으로 전자를 전달하는 전자 매개체를 더 포함할 수 있다. 상기 전자 매개체는 메틸 비올로겐, 에틸 비올로겐, 또는 이들의 조합일 수 있다.

일 양상에 따른 FDH1α(formate dehydrogenase 1 alpha subunit)를 코딩하는 내인성 유전자가 결실되고, FDH1을 코딩하는 외인성 유전자가 도입된, 개미산을 생산하기 위한 재조합 미생물은, 효율적이고 친환경적으로 개미산을 생산하기 위해 적용될 수 있고, 배양 및 운송이 용이한 미생물의 특성상 관련 산업 전반에 신규하고 진보한 개미산 생산 방법의 보급을 용이하게 할 수 있다.

다른 양상에 따른 상기 미생물을 배지에서 배양시키는 단계를 포함하는 개미산을 생산하는 방법에 의해서, 유해한 화학 부산물을 생성하지 않으면서 안전하고 효율적으로 개미산을 생산할 수 있다.

도 1은 M. 엑스토르쿠엔스 AM1의 돌연변이 균주를 제작하는 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 전기화학적 반응 시스템에서 다양하게 재조합된 균주의 개미산 생산량을 그래프로 나타낸 것이다. (반응 조건: 0.6 g 습식-셀(wet-cell), 10 mM MV, pH 6.0; CO₂ 가스 배기 (purging), 99.999 %, rate: 1 mL/s)
도 3A는 재조합 미생물 F1A-P1의 단백질 조추출물(crude extract)을 SDS-PAGE (10%)로 로딩 후 쿠마시 블루로 염색한 것이고(여기서 M은 마커를 의미한다), 도 3B는 재조합 미생물 F1A-P1의 단백질 중 FDH1α 및 FDH1β에 대해 웨스턴 블롯팅한 것을 나타낸 것이다.
도 4A는 다양한 MeOH 농도에서 재조합 미생물 F1A-P1의 단백질 중 FDH1α 및 FDH1β에 대해 웨스턴 블롯팅한 것을 나타낸 것이고, 도 4B는 다양한 MeOH 농도에서 재조합 미생물 F1A-P1의 개미산 생산량을 그래프로 나타낸 것이다. (반응 조건: 0.6 g 습식-셀(wet-cell), 10 mM MV, pH 6.0; CO₂ 가스 배기 (purging), 99.999 %, rate: 1 mL/s)
도 5A는 다양한 텅스텐산염 농도에서 재조합 미생물 F1A-P1의 단백질 중 FDH1α 및 FDH1β에 대해 웨스턴 블롯팅한 것을 나타낸 것이고, 도 5B는 다양한 텅스텐산염 농도에서 재조합 미생물 F1A-P1의 개미산 생산량을 그래프로 나타낸 것이다. (반응 조건: 0.6 g 습식-셀(wet-cell), 10 mM MV, 0.5 % (v/v) MeOH, pH 6.0; CO₂ 가스 배기 (purging), 99.999 %, rate: 1 mL/s)
도 6은 최적화된 조건에서 야생형 및 재조합 미생물 F1A-P1의 개미산 생산량을 그래프로 나타낸 것이다. (반응 조건: 0.6 g 습식-셀(wet-cell), 10 mM MV, pH 6.0; CO₂ 가스 배기 (purging), 99.999 %, rate: 1 mL/s)
도 7은 다양한 전기 매개체를 포함하는 배양 조건에서 재조합 미생물 F1A-P1의 개미산 생산량을 비교한 것이다. (MV; 메틸 비올로겐(methyl viologen), EV; 에틴 비올로겐(ethyl viologen), FMN; 플라빈 모노뉴클레오티드 (flavin mononucleotide), NR; 뉴랄 레드(neural red))
도 8은 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템을 도식화한 것이다.
도 9는 다양한 조건에서 야생형, F1A-P1, 및 야생형+FDH1의 개미산 생산량을 농도로 비교한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 수치는 명시하지 않아도 "약"의 의미를 포함하는 것으로 간주한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

실시예 1: 재조합 미생물의 제조

재조합 미생물을 제조하기 위해, 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1(ATCC 14781, GenBank accession No. CP001510.1)를 이용하여 도 1에 도시된 바에 따라 클로닝하여 변형시켰다. 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1은 3개의 암호화된 개미산 탈수소 효소 유전자 (fdh1 , fdh2 , fdh3)를 보유한 것으로 알려져 있다. 상기 3 개의 개미산 탈수소 효소 유전자 중에서, FDH1에 대한 fdh1 (GenBank accession No. ACS42636.1(α-subunit), ACS42635.1(β-subunit)) 유전자는 개미산의 전세포 산화과정 중에 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1의 재조합 미생물을 제작하기 위해 선택되었다 [17].

하기의 클로닝에는 모두 one-step SLIC(sequence and ligation-independent cloning)을 적용하였다 [25]. SLIC은 T4 DNA 중합 효소를 엑소뉴클레아제로 사용한다. 벡터를 제한효소 및 DNA 증폭기에 의해서 선형화 및 증폭시키고, NEB 2.1 버퍼 (B7202S, BioLabs) 및 T4 중합효소를 첨가하여 실온에서 2.5분 동안 인큐베이션한 다음, 즉시 10 분간 얼음에 인큐베이션하였다. 이후 상기 혼합물 1 ㎕를 100㎕의 수용성 대장균 DH5α (RBC)에 첨가하고, 상기 DH5α 대장균을 20 분간 얼음에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 950㎕의 LB 배지를 추가하여, 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다.

재조합 미생물의 제조 과정은 하기와 같다.

구체적으로, 유전자 녹-아웃은 논문의 설명에 따라 진행하였다 [24]. 먼저 결실시키고자 하는 유전자에 따라 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1의 FDH1α, 및/또는 FDH1β 유전자(GenBank accession No. ACS42636.1(α-subunit), ACS42635.1(β-subunit))의 앞 부분과 뒷 부분에 위치한 DNA를 증폭시켰다. 클로닝에 사용된 프라미어는 하기의 표 1과 같다.

프라이머	서열
fdh1α 녹아웃 upstream F	5'-gccgccatatgcatccatggtaccCCGGCGGGTCGATGCGGTTGGAAA-3'
fdh1α 녹아웃 upstream R	5'-cacctgacgtctagatctgaattcTGGCCCGCGACCTCACCGCGAACTACTT-3'
fdh1α 녹아웃 downstream F	5'-tggtcggctggatcctctagtgagctcTCTACGCCGAGGGCGTGAACGGACC-3'
fdh1α 녹아웃 downstream R	5'-gatccagcttatcgataccgcgggcccGAGGTGCCGATAGGCGTGGCGCGA-3'
fdh1β 녹아웃 upstream F	5'- gccgccatatgcatccatggtaccAATCTCTGTGTCCGCGCCT -3'
fdh1β 녹아웃 upstream R	5'- cacctgacgtctagatctgaattcGCTTCACCGCGTTCTTGAGGAA -3'
fdh1β 녹아웃 downstream F	5'- tggtcggctggatcctctagtgagctcGGCAGAGGTCTCGCCGTTGT -3'
fdh1β 녹아웃 downstream R	gatccagcttatcgataccgcgggcccGACGCGACCTGTGTTCCAACTAA -3'

상기 증폭된 DNA를 pC184 (Addgene plasmid 46012)의 loxP 및 카나마이신 유전자의 양측에 삽입하여 클로닝하였다. 상기 클로닝된 pC184를 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1에 형질전환시켰다. 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1은 pC184로 형질전환되었을 때, 대립 유전자 교환을 일으켜 loxP와 카나마이신 유전자를 획득하지만 FDH1의 유전자 서열을 부분적으로 상실하게 된다. 상기 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1에 pCM157(Addgene plasmid 45863)을 형질전환시키고, pCM157에서 발현된 cre 재조합 효소에 의해서 loxP부위 사이의 카나마이신 유전자를 부위 특이적 재조합 (site-specific recombination)으로 추출하여 녹-아웃된 미생물을 생산하였다.

이후 필요에 따라, 상기 녹-아웃된 미생물에 재조합 플라스미드를 발현시켰다. 구체적으로, 상기 특정 유전자가 녹-아웃된 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1에 FDH1을 코딩하는 유전자 또는 FDH1α를 코딩하는 유전자를 포함하는 pCM110으로 형질전환시켜 FDH1 또는 FDH1α의 발현을 다시 회복시켰다.

하기의 표 2는 박테리아 균주 및 녹-아웃 또는 재조합 발현을 위한 플라스미드를 나타낸 것이다.

균주	결실된 유전자	녹-아웃 플라스미드	재조합 플라스미드	선택적 항생제
야생형	-	-	-	Rif
F1A	Δfdh1α	pCM184(Dfdh1α)	-	Rif, Kan
F1A-P1	Δfdh1α	pCM184(Δfdh1α) pCM157(cre)	pCM110(fdh1)	Rif, Tet
F1AB-P1B	Δfdh1αβ	pCM184(Δfdh1α) pCM157(cre) pCM184(Δfdh1β)	pCM110(fdh1α)	Rif, Kan, Tet

상기 제작된 미생물 중 F1A-P1는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC 13388BP로 기탁하였다.

상기 미생물들의 기본적인 배양 배지는 탄소공급원으로 16 g/L 숙신산 및 최소염 배지(minimal salt medium) (1.62 g/L NH₄Cl, 0.2 g/L MgSO₄, 2.21 g/L K₂HPO₄, 및 1.25 g/L NaH₂PO_{4 ·}2H₂O)를 포함한다. 재조합 미생물을 선별하기 위한 선택적 항생제로는 50 ㎍/mL 리파미신 (Rif), 50 ㎍/mL 카나미신 (Kan), 또는 10 ㎍/mL 테트라시클린 (Tet)을 사용하였다. 상기 미생물들은 모두 1L 에를렌마이어 쉐이크 플라스크 중에 200 mL의 부피로 하여 26℃, 200 rpm에서 배양하였다.

실시예 2: 이산화탄소로부터 개미산 생산에 필수적인 효소의 확인

실시예 1에서 제조된 재조합 미생물의 개미산 생산량을 다양한 조건에서 측정하여 비교하였다.

개미산 생산 조건으로는 이전 논문에 따라 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템을 사용하였다 [16]. 상기 시스템은 구리판 (2 x 1.5 cm), 기준 전극 (Ag/AgCl), 및 양극으로 백금선을 포함한다. 상기 시스템에서 이산화탄소 환원 반응 동안, 백금선은 1mM 황산 수용액 (초기부피: 10mL) 중에서 전자와 양이온 물질(예를 들어, 양성자)을 생성시키고, 생성된 양이온은 양이온 교환막 (Nafion^®, 0.005-inch thickness, 30 x 30 cm, Sigma-Aldrich, USA)을 통해 음극으로 이동한다. 음극 부분은 0.6g의 습식-셀, 200mM 인산칼륨버퍼 (pH 6.0) 및 10mM MV를 포함하는데 (초기부피: 10mL), 이는 수용액에 공급된 전자 및 양이온을 이용하여 이산화탄소를 개미산으로 환원시키는 작용을 한다. 환원 반응을 위해 미생물을 포함하는 상기 음극 부분 용액에 고순도 이산화탄소가스 (99.999 %, 배기율 1 mL/s)로 포화시키고 실온에서 300rpm으로 교반하였다. 기준 전극으로 Ag/AgCl 전극(MF-2079, BASi)을 사용했을 때, 전위차계(MultiEnStat3, PalmSens, Netherlands)를 사용하여 산화 환원 전위(-0.75V)를 일정하게 제어하면서, 표시된 시간만큼 배양하였다. 그런 다음, 전세포 생체촉매 반응에 의해 생산된 개미산의 농도를 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 30℃에서 진행하였으며, Aminex HPX 87-H 이온 배제 컬럼(Ion Exclusion Column) (300 x 7.8 mm, Bio-Rad)과 함께 굴절률 검출기(RID)를 사용하여 분석하였다 (이동상; 5mM 황산, 유속 0.6mL/분).

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 야생형과 재조합 미생물 F1A-P1은 전기 화학적 환원 시스템에서 이산화탄소로부터 개미산을 생산할 수 있지만, FDH1α가 녹-아웃된 돌연변이인 F1A 및 FDH1β가 녹-아웃된 돌연변이인 F1AB-P1B는 분석가능한 수준의 개미산을 생산하지 못하였다. 이러한 결과는 FDH1이 이산화탄소를 개미산으로 전환시키는 주요 효소이며, FDH1이 적절히 기능하기 위해서는 FDH1α 및 β가 동시에 필요함을 의미한다.

또한 F1A-P1의 개미산 생산력은 0.98mM/hr/g-습식 셀이고, 야생형의 개미산 생산력은 0.68mM/hr/g-습식 셀로서, F1A-P1이 야생형에 비해 개미산 생산력이 우수하다. F1A-P1 균주는 플라스미드 pCM110(fdh1)에 의해 동성 발현 재조합된 것이므로, 강한 유도성 프로모터인 PmxaF를 함유하게 된다. 이 프로모터는 다른 프로모터보다 높은 유도성을 가지므로 FDH1의 발현을 상당히 증가시킬 수 있다 [20]. 이를 고려하면 세포 내에서 FDH1 발현이 개미산 생산에 직접적인 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있다.

또한, 야생형에 fdh1을 실시예 1에서와 같이 형질전환시켜 과발현시킨 경우를, F1A-P1과 비교하였다. 그 결과, 놀랍게도 fdh1을 단순 과발현시킨 경우는 (MeAM1(WT)+pCM110) F1A-P1 처럼 개미산을 생산하지 않았다 (도 9).

실시예 3: FDH1 발현 수준의 확인

F1A-P1의 FDH1 발현 수준을 분석하기 위해 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE) 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. FDH1α 및 FDH1β는 각각 108kDa 및 62kDa로 추정되는 분자량을 갖고 있으나, 상대적으로 약한 발현으로 인해 SDS-PAGE를 쿠마시 블루 염색하여 직접 육안으로 표적 밴드를 구별하기는 어렵다 (도 3A). 따라서 웨스턴 블롯팅을 추가적으로 수행하였다 (도 3B).

구체적으로, 웨스턴 블로팅은 하기와 같이 수행하였다. 미생물을 유레아 버퍼 (6 M urea, 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0)로 용해시키고, 그 추출물을 SDS-PAGE (10 % Tris/glycine)로 분리하였다. 그 후 트랜스퍼 버퍼 (24.9 mM Tris, 2.5 M methanol, 191, 8 mM glycine, pH 8.4)로 반건식 이동기(AE-8130, ATTA)를 이용하여 PVDF막 (Cat. No. KDM20, 10 cm x 10 cm, KOMA BIOTECH)으로 이동시켰다. 그런 다음, 상기 막을 블로킹 버퍼 (PBST; 10 mM phosphate buffer, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 1 % (w/v) Tween 20) (2 % (w/v) skim milk)에 담아 1 시간 동안 부드럽게 쉐이킹하며 인큐베이션하였다. 막을 PBST 버퍼로 20 분 간 4 회 세척한 후, 1 차 항체와 혼합한 블로킹 버퍼로 옮기고 1 시간 동안 부드럽게 쉐이킹하여 인큐베이션하였다. 그런 다음, PBST 버퍼로 20 분 간 4 회 세척한 후, 2 차 항체와 혼합한 블로킹 버퍼로 옮기고 1 시간 동안 부드럽게 쉐이킹하여 인큐베이션하였다. 마지막으로 BST 버퍼로 20 분 간 4 회 세척한 후, BCIP/NBT Liquid substrate solution (B1911, SIGMA)으로 염색하였다. FDH1α에 사용한 1 차 항체는 Anti-6x His tag 항체 (ab18184, ABCAM) (1:1000 dilution)이고, 2차 항체는 rabbit anti-mouse 항체 (ab6729, ABCAM) (1:2000 dilution)였다. FDH1β에 사용한 1 차 항체는 주문 제작하였고 (ABFRONTIER) (1:1000 dilution), 2차 항체는 goat anti-rabbit 항체 (ab6722, ABCAM) (1:2000 dilution)를 사용하였다.

그 결과, F1A-P1을 기본 배양 조건에서 48 시간 배양한 후 발현 수준이 회복되는 것을 반복적으로 확인하였으나, 41 시간 배양 후에는 FDH1α의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 동종 발현 재조합 FDH1의 상당 부분이 내인성 대사를 통해 분해될 수 있음을 암시한다 [21].

실시예 4: 재조합 미생물의 최적의 배양 조건

재조합 미생물로부터 개미산을 생산하기 위한 최적의 조건을 얻기 위해, 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템에서 재조합 미생물의 최적의 배양 조건을 탐색하였다.

미생물들은 26 ℃에서 200 rpm 쉐이킹 인큐베이터를 이용해 배양하였으며, 용존산소는 약 1 mg/L로 유지하였다. 미생물의 배양 배지는 상기 실시예 1에서 사용된 기본 배양 배지에 필요에 따라 미량필수원소(trace elements) (15 mg/L Na₂EDTA_{2 ·}H₂O, 4.5 mg/L ZnSO_{4 ·}7H₂O, 0.3 mg/L CoCl_{2 ·}6H₂O, 1 mg/L MnCl_{2 ·}4H₂O, 1 mg/L H₃BO₃, 2.5 mg/L CaCl₂, 0.4 mg/L Na₂MoO_4·2H₂O, 3 mg/L FeSO_{4 ·}7H₂O, 및 0.3 mg/L CuSO_{4 ·}5H₂O) 및 텅스텐산 나트륨을 첨가한 것을 사용하였다. 메탄올을 유도체로 추가하는 경우는, 상기 배양 배지에 19 시간 배양한 후 메탄올을 표시된 농도별로 추가하였다. FDH1의 발현은 메탄올-유도성 프로모터인 PmxaF에 의해 조절되기 때문에, 메탄올은 재조합 미생물인 F1A-P1에 발현 유도제 및 탄소원으로 사용될 수 있다 [20].

그 결과, 배지에서 메탄올의 농도가 F1A-P1의 FDH1 발현에 영향을 주는 것으로 나타났으며, 특히 48 시간 배양한 경우에는 메탄올의 농도가 높을수록 F1A-P1의 FDH1 발현이 더 증가하는 것으로 나타났다 (도 4A). 예상한 대로 초기 농도가 배지의 부피를 기준으로 2.0 v/v%인 메탄올이 들어있는 배지에서 재조합 미생물 F1A-P1은 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템에서 가장 높은 개미산 생산력인 2.11mM-개미산/hr/g-습식-셀을 보였다 (도 4B).

또한, 텡스텐산염 농도가 F1A-P1의 FDH1 발현에 영향을 미치는 것으로 보였다. 도 5에 의하면, 2 배의 텅스텐산염 (60 μM)에서 배양한 F1A-P1은 증가된 FDH1 발현을 보였고, 개미산 생산량도 가장 좋은 것으로 관찰되었다 (도 5B). 그러나 4 배의 텅스텐산염 (120 μM)에서 배양한 F1A-P1는 MeFDH1의 발현이 증가되지 않는 것으로 나타났다 (도 5A). 흥미롭게도, 텅스텐산염의 최적 농도는 FDH1의 분해를 억제하는 것으로 보였다 (도 5A), 이는 텅스텐산염이 결핍되는 경우, FDH1 아포 효소(apo-enzyme)가 내인성 분해에 더 취약해질 수 있음을 의미한다.

상기 다양한 메탄올 및 텅스텐산염 조건을 조합하여 야생형 및 F1A-P1에서의 개미산 생산량을 비교한 결과, F1A-P1은 24 시간 이내에 이산화탄소로부터 30mM 이상의 개미산을 생성하는데, 이러한 수치는 최적의 메탄올 및 텅스텐산염 농도에서 배양한 야생형 보다 3 배가 더 큰 것으로 나타났다 (도 6). 또한 야생형 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1의 개미산 생산력은 최적의 조건인지 여부가 큰 영향을 미치지 않음을 관찰하였다. 더욱이, 야생형에서 FDH1을 단순 과발현시켜 F1A-P1에서의 최적의 조건(MeOH 2.0 v/v%, W(텅스텐산염) 60 μM)으로 배양하여도 F1A-P1의 개미산 생산량을 달성할 수 없음을 확인하였다 (도 9). 이러한 결과는 야생형에서 FDH1 유전자를 코딩하는 다른 프로모터를 포함하는 유전 물질을 이용하여도 F1A-P1과 동일한 효과를 얻을 수 없을 것임을 입증한다. 결과적으로, PmxaF와 같은 프로모터가 재조합 미생물 F1A-P1의 개미산 생산량을 조절하는데 핵심적이고 FDH1의 동종 발현을 위한 핵심 요소 중 하나임을 의미한다.

전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템에서는 구리판 음극에서 FDH1으로 전자 전달을 위해 인공 전자 매개체가 사용됨이 적절하다. 따라서 F1A-P1이 특정 전자 매개체를 선호하는지 여부를 판단하기 위해, 다양한 전자 매개체가 존재하는 환경에서 개미산 생산량을 측정하였다. 그 결과, 특히 메틸비올로겐(MV) 및 에틸비올로겐(EV)을 전자 매개체로 사용하였을 때만 F1A-P1이 이산화탄소로부터 개미산을 생산할 수 있음을 확인하였다 (도 7).

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150 155 160 Val Ala Asp Gln Pro Glu Arg Ala Thr Ser His Asp Pro Ser Ser His 165 170 175 Phe Trp Val Gln Ala Asp Val Leu Asp Val Thr Glu Ser Arg Phe Pro 180 185 190 Ala Ala Glu Arg Trp Thr Ser Asp Val Ser His Pro Ala Met Ser Val 195 200 205 Asn Leu Asp Ala Cys Ile Gln Cys Asn Leu Cys Val Arg Ala Cys Arg 210 215 220 Glu Val Gln Val Asn Asp Val Ile Gly Met Ala Tyr Arg Ala Ala Gly 225 230 235 240 Ser Lys Val Val Phe Asp Phe Asp Asp Pro Met Gly Gly Ser Thr Cys 245 250 255 Val Ala Cys Gly Glu Cys Val Gln Ala Cys Pro Thr Gly Ala Leu Met 260 265 270 Pro Ala Ala Tyr Leu Asp Ala Asn Gln Thr Arg Thr Val Tyr Pro Asp 275 280 285 Arg Glu Val Lys Ser Leu Cys Pro Tyr Cys Gly Val Gly Cys Gln Val 290 295 300 Ser Tyr Lys Val Lys Asp Glu Arg Ile Val Tyr Ala Glu Gly Val Asn 305 310 315 320 Gly Pro Ala Asn Gln Asn Arg Leu Cys Val Lys Gly Arg Phe Gly Phe 325 330 335 Asp Tyr Val His His Pro His Arg Leu Thr Val Pro Leu Ile Arg Leu 340 345 350 Glu Asn Val Pro Lys Asp Ala Asn Asp Gln Val Asp Pro Ala Asn Pro 355 360 365 Trp Thr His Phe Arg Glu Ala Thr Trp Glu Glu Ala Leu Asp Arg Ala 370 375 380 Ala Gly Gly Leu Lys Ala Ile Arg Asp Thr Asn Gly Arg Lys Ala Leu 385 390 395 400 Ala Gly Phe Gly Ser Ala Lys Gly Ser Asn Glu Glu Ala Tyr Leu Phe 405 410 415 Gln Lys Leu Val Arg Leu Gly Phe Gly Thr Asn Asn Val Asp His Cys 420 425 430 Thr Arg Leu Cys His Ala Ser Ser Val Ala Ala Leu Met Glu Gly Leu 435 440 445 Asn Ser Gly Ala Val Thr Ala Pro Phe Ser Ala Ala Leu Asp Ala Glu 450 455 460 Val Ile Val Val Ile Gly Ala Asn Pro Thr Val Asn His Pro Val Ala 465 470 475 480 Ala Thr Phe Leu Lys Asn Ala Val Lys Gln Arg Gly Ala Lys Leu Ile 485 490 495 Ile Met Asp Pro Arg Arg Gln Thr Leu Ser Arg His Ala Tyr Arg His 500 505 510 Leu Ala Phe Arg Pro Gly Ser Asp Val Ala Met Leu Asn Ala Met Leu 515 520 525 Asn Val Ile Val Thr Glu Gly Leu Tyr Asp Glu Gln Tyr Ile Ala Gly 530 535 540 Tyr Thr Glu Asn Phe Glu Ala Leu Arg Glu Lys Ile Val Asp Phe Thr 545 550 555 560 Pro Glu Lys Met Ala Ser Val Cys Gly Ile Asp Ala Glu Thr Leu Arg 565 570 575 Glu Val Ala Arg Leu Tyr Ala Arg Ala Lys Ser Ser Leu Ile Phe Trp 580 585 590 Gly Met Gly Val Ser Gln His Val His Gly Thr Asp Asn Ser Arg Cys 595 600 605 Leu Ile Ala Leu Ala Leu Ile Thr Gly Gln Ile Gly Arg Pro Gly Thr 610 615 620 Gly Leu His Pro Leu Arg Gly Gln Asn Asn Val Gln Gly Ala Ser Asp 625 630 635 640 Ala Gly Leu Ile Pro Met Val Tyr Pro Asp Tyr Gln Ser Val Glu Lys 645 650 655 Asp Ala Val Arg Glu Leu Phe Glu Glu Phe Trp Gly Gln Ser Leu Asp 660 665 670 Pro Gln Lys Gly Leu Thr Val Val Glu Ile Met Arg Ala Ile His Ala 675 680 685 Gly Glu Ile Arg Gly Met Phe Val Glu Gly Glu Asn Pro Ala Met Ser 690 695 700 Asp Pro Asp Leu Asn His Ala Arg His Ala Leu Ala Met Leu Asp His 705 710 715 720 Leu Val Val Gln Asp Leu Phe Leu Thr Glu Thr Ala Phe His Ala Asp 725 730 735 Val Val Leu Pro Ala Ser Ala Phe Ala Glu Lys Ala Gly Thr Phe Thr 740 745 750 Asn Thr Asp Arg Arg Val Gln Ile Ala Gln Pro Val Val Ala Pro Pro 755 760 765 Gly Asp Ala Arg Gln Asp Trp Trp Ile Ile Gln Glu Leu Ala Arg Arg 770 775 780 Leu Asp Leu Asp Trp Asn Tyr Gly Gly Pro Ala Asp Ile Phe Ala Glu 785 790 795 800 Met Ala Gln Val Met Pro Ser Leu Asn Asn Ile Thr Trp Glu Arg Leu 805 810 815 Glu Arg Glu Gly Ala Val Thr Tyr Pro Val Asp Ala Pro Asp Gln Pro 820 825 830 Gly Asn Glu Ile Ile Phe Tyr Ala Gly Phe Pro Thr Glu Ser Gly Arg 835 840 845 Ala Lys Ile Val Pro Ala Ala Ile Val Pro Pro Asp Glu Val Pro Asp 850 855 860 Asp Glu Phe Pro Met Val Leu Ser Thr Gly Arg Val Leu Glu His Trp 865 870 875 880 His Thr Gly Ser Met Thr Arg Arg Ala Gly Val Leu Asp Ala Leu Glu 885 890 895 Pro Glu Ala Val Ala Phe Met Ala Pro Lys Glu Leu Tyr Arg Leu Gly 900 905 910 Leu Arg Pro Gly Gly Ser Met Arg Leu Glu Thr Arg Arg Gly Ala Val 915 920 925 Val Leu Lys Val Arg Ser Asp Arg Asp Val Pro Ile Gly Met Ile Phe 930 935 940 Met Pro Phe Cys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Asn Leu Leu Thr Asn Pro 945 950 955 960 Ala Leu Asp Pro Leu Gly Lys Ile Pro Glu Phe Lys Phe Cys Ala Ala 965 970 975 Arg Val Val Pro Ala Glu Ala Ala Pro Met Ala Ala Glu 980 985 <210> 2 <211> 572 <212> PRT <213> Methylobacterium extorquens <400> 2 Met Ser Glu Ala Ser Gly Thr Val Arg Ser Phe Ala His Pro Gly Arg 1 5 10 15 Gly Arg Asn Val Ala Arg Ala Val Pro Lys Gly Arg Gln Val Asp Pro 20 25 30 His Ala Lys Val Glu Ile Glu Glu Leu Leu Gly Thr Arg Pro Arg Gln 35 40 45 Arg Asp Leu Leu Ile Glu His Leu His Leu Ile Gln Asp Thr Tyr Gly 50 55 60 Gln Ile Ser Ala Asp His Leu Ala Ala Leu Ala Asp Glu Met Ser Leu 65 70 75 80 Ala Phe Ala Glu Val Phe Glu Thr Ala Thr Phe Tyr Ala His Phe Asp 85 90 95 Val Val Lys Glu Gly Glu Ala Asp Ile Pro Arg Leu Thr Ile Arg Val 100 105 110 Cys Asp Ser Ile Thr Cys Ala Met Phe Gly Ala Asp Glu Leu Leu Glu 115 120 125 Thr Leu Gln Arg Glu Leu Ala Ser Asp Ala Val Arg Val Val Arg Ala 130 135 140 Pro Cys Val Gly Leu Cys Asp His Ala Pro Ala Val Glu Val Gly His 145 150 155 160 Asn Phe Leu His Arg Ala Asp Leu Ala Ser Val Arg Ala Ala Val Glu 165 170 175 Ala Glu Asp Thr His Ala His Ile Pro Thr Tyr Val Asp Tyr Asp Ala 180 185 190 Tyr Arg Ala Gly Gly Gly Tyr Ala Thr Leu Glu Arg Leu Arg Ser Gly 195 200 205 Glu Leu Pro Val Asp Asp Val Leu Lys Val Leu Asp Asp Gly Gly Leu 210 215 220 Arg Gly Leu Gly Gly Ala Gly Phe Pro Thr Gly Arg Lys Trp Arg Ser 225 230 235 240 Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro Arg Leu Met Ala Val Asn Gly Asp Glu 245 250 255 Gly Glu Pro Gly Thr Phe Lys Asp Gln Leu Tyr Leu Asn Thr Asp Pro 260 265 270 His Arg Phe Leu Glu Gly Met Leu Ile Gly Ala His Val Val Glu Ala 275 280 285 Ala Asp Val Tyr Ile Tyr Leu Arg Asp Glu Tyr Pro Ile Ser Arg Glu 290 295 300 Ile Leu Ala Arg Glu Ile Ala Lys Leu Pro Glu Gly Gly Thr Arg Ile 305 310 315 320 His Leu Arg Arg Gly Ala Gly Ala Tyr Ile Cys Gly Glu Glu Ser Ser 325 330 335 Leu Ile Glu Ser Leu Glu Gly Lys Arg Gly Leu Pro Arg His Lys Pro 340 345 350 Pro Phe Pro Phe Gln Val Gly Leu Phe Asn Arg Pro Thr Leu Ile Asn 355 360 365 Asn Ile Glu Thr Leu Phe Trp Val Arg Asp Leu Ile Glu Arg Gly Ala 370 375 380 Glu Trp Trp Lys Ser His Gly Arg Asn Gly Arg Val Gly Leu Arg Ser 385 390 395 400 Tyr Ser Val Ser Gly Arg Val Lys Glu Pro Gly Val Lys Leu Ala Pro 405 410 415 Ala Gly Leu Thr Ile Gln Glu Leu Ile Asp Glu Tyr Cys Gly Gly Ile 420 425 430 Ser Asp Gly His Ser Phe Ala Ala Tyr Leu Pro Gly Gly Ala Ser Gly 435 440 445 Gly Ile Leu Pro Ala Ser Met Asn Asp Ile Pro Leu Asp Phe Gly Thr 450 455 460 Leu Glu Lys Tyr Gly Cys Phe Ile Gly Ser Ala Ala Val Val Ile Leu 465 470 475 480 Ser Asp Gln Asp Asp Val Arg Gly Ala Ala Leu Asn Leu Met Lys Phe 485 490 495 Phe Glu Asp Glu Ser Cys Gly Gln Cys Thr Pro Cys Arg Ser Gly Thr 500 505 510 Gln Lys Ala Arg Met Leu Met Glu Asn Gly Val Trp Asp Thr Asp Leu 515 520 525 Leu Gly Glu Leu Ala Gln Cys Met Arg Asp Ala Ser Ile Cys Gly Leu 530 535 540 Gly Gln Ala Ala Ser Asn Pro Val Ser Thr Val Ile Lys Tyr Phe Pro 545 550 555 560 Asp Leu Phe Pro Glu Pro Arg Ala Val Ala Ala Glu 565 570 <210> 3 <211> 2970 <212> DNA <213> Methylobacterium extorquens <400> 3 atgagcaacg gccccgaacc gcacggcaac aagatcgaac agcccgagat ccgcgccgac 60 gaacgtcagg atgccggcgg gccggcaaat ggcgcaccat cgacctccgg cggcgcctac 120 tcgcagggcg ccaagtcggg tggccaggcc gcgccggatc cgtccggctc ctacggcatc 180 aaggacgccc cggtcgcgcc cgcgaccatc gccttcgagt tcgacggcca acaggtcgag 240 gcccagcccg gcgagacgat ctgggcggtc gccaagcgcc ttggcacgca tatcccgcat 300 ctctgccaca agcccgatcc cggctaccgc ccggacggca attgccgcgc ctgcatggtc 360 gagatcgagg gcgagcgcgt gctcgccgcc tcgtgcaagc gcacgcccgc catcggcatg 420 aaggtgaagt cggccaccga gcgcgccacc aaggcccgcg ccatggtgct cgaactgctc 480 gtggccgatc agcccgagcg cgcgacctcg catgacccgt cgtcgcattt ctgggtgcag 540 gccgacgtcc tcgatgtgac cgagagccgc ttcccggcgg ccgagcgctg gaccagcgac 600 gtcagccacc cggcgatgag cgtcaatctc gacgcctgca tccagtgcaa tctctgtgtc 660 cgcgcctgcc gcgaggttca ggtcaacgac gtgatcggca tggcctaccg cgccgcgggc 720 tccaaggtcg tgtttgactt cgacgatccg atgggtggct ccacctgcgt ggcctgcggc 780 gagtgcgtcc aagcctgccc gaccggggcg ctgatgccgg ccgcctatct cgacgcaaac 840 cagacccgga cggtctatcc cgaccgcgag gtgaagtcgc tctgccccta ttgcggcgtc 900 ggctgccaag tctcctacaa ggtcaaggac gagcgcatcg tctacgccga gggcgtgaac 960 ggaccggcca accagaaccg gctctgcgtg aagggccgct tcggcttcga ctacgtccac 1020 cacccccacc gcctgacggt gccgctgatc cgcttggaga acgtgcccaa ggacgccaac 1080 gatcaggtcg atccggcgaa cccctggacg catttccgcg aggcgacctg ggaagaggcg 1140 ctcgaccgcg cggcgggcgg cctgaaggcg atccgtgaca ccaacgggcg caaggcgctg 1200 gcgggcttcg gctcggccaa gggttcgaac gaggaggcct acctcttcca gaagctcgtc 1260 cgcctcggct tcggcaccaa caacgtcgat cactgcacgc gcctgtgcca cgcctcgtcg 1320 gtggcggcgc tgatggaggg cctgaattcc ggcgccgtca ccgctccctt ctcggcagcg 1380 ctcgacgccg aggtcatcgt cgtcatcggc gccaacccga ccgtgaacca tccggtcgcg 1440 gcgaccttcc tcaagaacgc ggtgaagcag cgcggcgcca agctgatcat catggacccg 1500 cggcgccaga cgctctcgcg ccacgcctat cggcacctcg ccttccgccc cggctcggac 1560 gtggcgatgc tcaacgcgat gctcaacgtg atcgtcacgg agggcctcta cgacgagcag 1620 tacatcgccg gctacaccga gaacttcgag gctctgcgcg agaagatcgt cgacttcacg 1680 ccggagaaga tggcctcggt ctgcggcatc gacgccgaga ccctgcgcga ggtcgcccgg 1740 ctctacgccc gggccaagtc gtcgctcatc ttctggggca tgggcgtcag ccagcacgtg 1800 cacggcaccg acaactcgcg ctgcctgatc gcgctcgccc tcatcaccgg ccagatcggc 1860 cggcccggca ccggcctgca cccgttgcgc ggccagaaca acgtccaggg cgcgtccgat 1920 gccggcctga tcccgatggt ctacccggac tatcagtcgg tcgagaagga cgcggtgcgt 1980 gagctgttcg aggagttctg ggggcagtcc ctcgatcctc agaagggcct caccgtggtc 2040 gagatcatgc gcgcgatcca cgcgggcgag atccggggca tgttcgtcga gggcgagaac 2100 ccggcgatgt ccgaccccga cctcaaccat gcccgccacg cgctggcgat gctcgaccat 2160 ctcgtggtgc aggacctgtt cctgacggag acggccttcc acgccgacgt ggtgctgccg 2220 gcctcggcct ttgccgagaa agccgggacc ttcaccaaca ccgaccggcg cgtgcagatc 2280 gcccagcccg tcgtcgcccc tccgggcgat gcgcgccagg attggtggat catccaggaa 2340 ctggcccgac gcctcgacct cgactggaac tacggcggcc cggccgacat cttcgccgag 2400 atggcgcagg tgatgccgtc cttgaacaac atcacctggg agcggctgga gcgcgagggg 2460 gcggtgacct atccggtcga tgccccggac cagcccggca acgagatcat cttctatgcc 2520 ggcttcccga ccgagagcgg tcgcgccaag atcgtgcccg cggcgatcgt gccgccggac 2580 gaggtgccgg acgacgagtt cccgatggtg ctctcgaccg gccgcgtgct cgaacactgg 2640 cacacgggct cgatgacccg gcgcgcgggc gtgctcgacg cgctggagcc ggaggcggtg 2700 gccttcatgg cacccaagga gctctaccgg ctcggtctcc ggcccggcgg gtcgatgcgg 2760 ttggaaacac ggcgcggcgc cgtcgtgttg aaggtgcgct ccgaccggga cgtgccgatc 2820 ggcatgatct tcatgccctt ctgctacgcg gaagccgccg ccaaccttct gaccaacccc 2880 gccctcgacc ccctcggaaa gattcccgag ttcaaattct gcgcagcccg cgtcgtcccc 2940 gcggaggctg cgccgatggc cgccgagtaa 2970 <210> 4 <211> 1719 <212> DNA <213> Methylobacterium extorquens <400> 4 atgagtgagg caagtgggac tgtccggagc ttcgcgcatc cgggccgtgg ccgtaacgtc 60 gcccgcgccg tgccgaaggg gcgtcaggtc gatccccacg ccaaggtcga gatcgaggag 120 ctgctcggca cccgcccgcg ccagcgcgac ctgctgatcg agcacctgca cctgatccaa 180 gacacctacg gccagatcag cgccgatcat ctcgcggcgc tggccgacga gatgagcctc 240 gccttcgccg aggtgttcga gaccgcgacc ttctacgcgc atttcgatgt ggtgaaggag 300 ggcgaggccg acatcccgcg cctgacgatc cgggtttgcg acagcatcac ctgcgccatg 360 ttcggcgccg acgagctgct ggagacgctg cagcgcgagc tggcctcgga tgcggtccgc 420 gtcgtgcgcg cgccctgtgt cggcctgtgc gaccacgccc cggcggtcga ggtcgggcac 480 aacttcctgc accgggccga cctcgcctcc gtgcgcgccg cggtcgaggc cgaggacacc 540 cacgcccaca tccccactta cgtcgattac gacgcctacc gggccggcgg cggctacgcg 600 accctggagc ggctgcgcag cggcgaactg ccggtcgatg acgtgctgaa ggtgctcgac 660 gacggcggcc tgcgcggcct cggcggcgcc ggctttccca ccggccgcaa gtggcgctcc 720 gtgcgcggcg agcccggacc ccggctgatg gcggtcaacg gcgacgaggg cgagcccggc 780 accttcaagg atcagctcta cctcaacacc gatccgcacc gctttctgga aggcatgctg 840 atcggcgccc acgtcgtcga ggccgccgac gtctacatct acctgcgcga cgagtacccg 900 atctcccgcg agatcctggc ccgcgagatc gcgaagctcc ccgagggcgg cacccgcatc 960 cacctgcgcc gtggggccgg cgcctatatc tgcggcgagg aatcctcgct gatcgagtcg 1020 ctggagggca agcgcggcct gccgcggcac aagccgccct tccccttcca ggtcggcctg 1080 ttcaaccggc cgacgctgat caacaacatc gagacgctgt tctgggtgcg cgacctgatc 1140 gagcgcggcg ccgaatggtg gaagagccac gggcgcaacg gccgcgtcgg cctgcgctcg 1200 tactcggttt cgggccgggt caaggagccg ggcgtcaagc tcgcgcccgc cggcctgacc 1260 atccaggaac tcatcgacga gtattgcggc ggcatctctg acggccacag cttcgcggcc 1320 tacctgccgg gcggagcctc gggcggcatc ctgccggcct cgatgaacga catcccgctc 1380 gatttcggca cgctggaaaa atacggctgc ttcatcggct cggccgcggt cgtgatcctg 1440 tccgatcagg acgatgtgcg cggtgccgcg ttgaacctga tgaagttctt cgaggacgag 1500 tcctgcgggc agtgcacgcc ctgccgctcg ggcacgcaga aggcccgcat gctgatggag 1560 aacggcgtgt gggacaccga tctcctcggc gagctggcgc aatgcatgcg cgacgcctcg 1620 atctgcggtc tcggtcaggc ggcctcgaac cccgtcagca ccgtgatcaa gtacttccct 1680 gatctcttcc cggagccgcg ggccgtggcg gccgagtga 1719 <210> 5 <211> 340 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pmxaf <400> 5 cgagggcccg ttgacgacaa cggtgcgatg ggtcccggcc ccggtcaaga cgatgccaat 60 acgttgcgac actacgcctt ggcactttta gaattgcctt atcgtcctga taagaaatgt 120 ccgaccagct aaagacatcg cgtccaatca aagcctagaa aatataggcg aagggacgct 180 aataagtctt tcataagacc gcgcaaatct aaaaatatcc ttagattcac gatgcggcac 240 ttcggatgac ttccgagcga gcctggaacc tcagaaaaac gtctgagaga taccgcggat 300 cctaagggcg aattccagca cactggcggc cgttactagt 340

Claims (17)

1. FDH1α(formate dehydrogenase 1 alpha subunit)를 코딩하는 내인성 유전자가 결실되고, FDH1(formate dehydrogenase 1)을 코딩하는 외인성 유전자가 도입된, 개미산을 생산하기 위한 재조합 미생물로서,
   상기 재조합 미생물은 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속 미생물로부터 변형된 것이고,
   상기 메틸로박테리움 속 미생물은 개미산을 생산하는 것인 재조합 미생물.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 메틸로박테리움 속 미생물은 M. adhaesivum, M. aerolatum, M. aminovorans, M. aquaticum, M. brachiatum, M. brachythecii, M. bullatum, M. cerastii, M. dankookense, M. extorquens, M. fujisawaense, M. gnaphalii, M. goesingense, M. gossipiicola, M. gregans, M. haplocladii, M. hispanicum, M. iners, M. isbiliense, M. jeotgali, M. komagatae, M. longum, M. marchantiae, M. mesophilicum, M. nodulans, M. organophilum, M. oryzae, M. oxalidis, M. persicinum, M. phyllosphaerae, M. phyllostachyos, M. platani, M. podarium, M. populi, M. pseudosasae, M. pseudosasicola, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. salsuginis, M. soli, M. suomiense, M. tardum, M. tarhaniae, M. thiocyanatum, M. thuringiense, M. trifolii, M. variabile, 및 M. zatmanii 중 선택된 것인 재조합 미생물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 메틸로박테리움 속 미생물은 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens)인 것인 재조합 미생물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 미생물은 전기적 또는 전기 화학적 시스템에서 배양되는 것인 재조합 미생물.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 전기 화학적 시스템은 전기 화학적 이산화탄소 환원 시스템인 것인 재조합 미생물.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 외인성 유전자는 벡터에 의해서 도입된 것인 재조합 미생물.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 PmxaF 프로모터를 포함하는 것인 재조합 미생물.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 미생물은 메탄올 농도에 의해 개미산 생산량이 조절되는 것인 재조합 미생물.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 미생물은 텅스텐산염이 30 uM 초과 120 uM 미만의 농도로 존재하는 환경에서 배양되는 것인 재조합 미생물.
11. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 미생물은 메틸 비올로겐, 에틸 비올로겐, 또는 이들의 조합이 존재하는 환경에서 배양되는 것인 재조합 미생물.
12. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 미생물은 기탁번호 KCTC 13388BP인 재조합 미생물.
13. 청구항 1의 미생물을 배지에서 배양시키는 단계를 포함하는 개미산을 생산하는 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 배지에 이산화탄소를 포화시키는 단계; 및 상기 배지에 전기적 또는 전기화학적 처리를 하는 단계를 더 포함하는 방법.
15. 청구항 13에 있어서, 상기 배지는 메탄올을 더 포함하는 것인 방법.
16. 청구항 13에 있어서, 상기 배지는 텅스텐을 더 포함하는 것인 방법.
17. 청구항 13에 있어서, 상기 배지는 FDH1으로 전자를 전달하는 전자 매개체를 더 포함하는 것인 방법.

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