WO2022149651A1 - 일산화탄소 탈수소효소 및 포름산 탈수소효소를 이용한 개미산의 제조 방법 - Google Patents

일산화탄소 탈수소효소 및 포름산 탈수소효소를 이용한 개미산의 제조 방법 Download PDF

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carbon monoxide
formic acid
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김용환
이진희
황호원
전병욱
김석민
강성혁
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울산과학기술원
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    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/07—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with an iron-sulfur protein as acceptor (1.2.7)
    • C12Y102/07004—Carbon-monoxide dehydrogenase (ferredoxin) (1.2.7.4)

Definitions

  • It relates to a method for producing formic acid using carbon monoxide dehydrogenase and formic acid dehydrogenase.
  • Waste gas emitted by industries such as steel and petrochemical industries contains a significant amount of toxic carbon monoxide (CO).
  • the purely isolated carbon monoxide can be a starting raw material from which various compounds can be made.
  • waste gas contains various impurities, it is technically difficult to directly use carbon monoxide contained in industrial waste gas as a raw material for chemical reaction.
  • most industries use a method of recovering some thermal energy by burning industrial waste gas containing carbon monoxide.
  • this method generates and emits a large amount of carbon dioxide through combustion of carbon monoxide, social interest in greenhouse gas reduction has recently increased, and regulations on large amount of carbon dioxide emission are being implemented. Therefore, it is necessary to prepare other alternatives. Accordingly, there is a growing demand to use the carbon monoxide contained in the waste gas as a valuable carbon resource instead of simply burning it.
  • One aspect is to provide a composition for producing formic acid comprising carbon monoxide dehydrogenase (Carbon monoxide dehydrogenase) and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase).
  • Another aspect is to provide a composition for removing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide and carbon dioxide, including carbon monoxide dehydrogenase and formate dehydrogenase.
  • Another aspect is to provide a composition for treating waste gas comprising carbon monoxide dehydrogenase and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase).
  • Another aspect is to provide a composition for air purification comprising carbon monoxide dehydrogenase and formate dehydrogenase.
  • Another aspect is to provide an apparatus for producing formic acid including carbon monoxide dehydrogenase (Carbon monoxide dehydrogenase) and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase).
  • carbon monoxide dehydrogenase Carbon monoxide dehydrogenase
  • formic acid dehydrogenase Form dehydrogenase
  • Another aspect is to provide an apparatus for removing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide and carbon dioxide, including carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase.
  • Another aspect is to provide an apparatus for treating waste gas comprising carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase.
  • Another aspect is to provide an apparatus for purifying air comprising carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase.
  • Another aspect is to provide a filter comprising carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase.
  • Another aspect is carbon monoxide and formic acid comprising the step of contacting a gas (gas) containing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide dehydrogenase (Carbon monoxide dehydrogenase) and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase) To provide a manufacturing method.
  • a gas gas containing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide dehydrogenase (Carbon monoxide dehydrogenase) and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase)
  • Another aspect is carbon monoxide and carbon monoxide comprising the step of contacting a gas (gas) containing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide and carbon monoxide dehydrogenase (Carbon monoxide dehydrogenase) and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase) and To provide a method for removing at least one molecule selected from the group consisting of carbon dioxide.
  • waste gas treatment comprising the step of contacting a gas (gas) containing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide and carbon dioxide to carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase. to provide a way
  • Another aspect is air purification comprising the step of contacting a gas comprising at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide and carbon dioxide with carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase. to provide a way
  • One aspect provides a composition for producing formic acid comprising carbon monoxide dehydrogenase (Carbon monoxide dehydrogenase) and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase).
  • the formic acid means formic acid, and the composition can be converted into formic acid by contacting with carbon monoxide and/or carbon dioxide.
  • the carbon monoxide dehydrogenase may convert carbon monoxide to carbon dioxide through the following Reaction Scheme 4:
  • the formic acid dehydrogenase can convert carbon dioxide to formic acid through the following scheme 5:
  • the composition may be to convert carbon monoxide or carbon monoxide into carbon dioxide in a gas containing carbon monoxide, and to prepare formic acid by converting the carbon dioxide into formic acid.
  • composition may be to produce formic acid by converting the carbon dioxide into formic acid in carbon dioxide or a gas containing carbon dioxide.
  • composition can be reused in a state where the production efficiency of formic acid does not fall.
  • the carbon monoxide dehydrogenase may be derived from nature or may be obtained by various protein synthesis methods well known in the art. As an example, it may be prepared using polynucleotide recombination and a protein expression system, or it may be prepared by a method of synthesizing in vitro through chemical synthesis such as protein synthesis, a cell-free protein synthesis method, and the like. Also, as an example, the carbon monoxide dehydrogenase may be a peptide, an extract of a plant-derived tissue or cell, or a product obtained by culturing a microorganism (eg, bacteria or fungi, and particularly yeast).
  • a microorganism eg, bacteria or fungi, and particularly yeast
  • protein refers to a polymer composed of two or more amino acids linked by amide bonds (or peptide bonds).
  • the term 'expression' refers to the process by which a polypeptide is produced from a structural gene. The process involves the transcription of a gene (polynucleotide) into mRNA and the translation of such mRNA into polypeptide (protein)(s).
  • the term 'recombinant' refers to a cell in which the cell replicates, expresses a heterologous nucleic acid, or expresses a peptide, a heterologous peptide or a protein encoded by the heterologous nucleic acid.
  • the recombinant cell may express a gene or a gene fragment not found in the natural form of the cell in either the sense or antisense form.
  • recombinant cells can express genes found in cells in a natural state, but the genes are modified and re-introduced into the cell by artificial means.
  • the carbon monoxide dehydrogenase has an amino acid sequence of carbon monoxide dehydrogenase and about 70% or more, about 75% or more, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more, about 92% or more, about 95% or more, about 97, respectively. % or greater, about 98% or greater, or about 99% or greater sequence homology.
  • the carbon monoxide dehydrogenase may be an isoenzyme of carbon monoxide dehydrogenase, for example, the carbon monoxide dehydrogenase is the genus Murella ( Moorella sp.), the genus Rhodospirillum ( Rhodospirillum sp.), the genus Methanococcus sp. .), Methanosarcina sp., Methanothermobacter sp., Clostridium sp., Oligotropha sp., Erpirum sp.
  • the genus Ferroglobus ( Ferroglobus sp.) and the genus Thermococcus ( Thermococcus sp.) may be derived from microorganisms of at least one genus selected from the group consisting of.
  • the carbon monoxide dehydrogenase is Murella thermoacetica ( Moorella thermoacetica ), Rhodospirillum rubrum ), Carboxydothermus hydrogenoformans ( Carboxydothermus hydrogenoformans ), Methanococcus vannielii ( Methanococcus vannielii ), Methanosarcina barkeri ( Methanosarcina barkeri ), Methanothermobacter thermautotrophicus ( Methanothermobacter thermautotrophicus ), Clostridium pasteurianum ( Clostridium pasteurianum ), Oligotropha carboxidovorans ( Oligotropha carboxidovorans ), Erpyrum pernix ( Aeropyrum pernix ), Ferroglobus placidus ( Ferroglobus placidus ), Clostridium autoethanogenum ( Clostridium autoethanogenum ) , Clostridium ragsdalei ), Clostridium ljungdahlii
  • the carbon monoxide dehydrogenase is Carboxydothermus hydrogenoformans derived carbon monoxide dehydrogenase II, Carboxydothermus hydrogenoformans derived carbon monoxide dehydrogenase IV and Thermococcus onnurinus ( Carboxydothermus hydrogenoformans ) Thermococcus onnurineus ) may be at least one carbon monoxide dehydrogenase selected from the group consisting of derived carbon monoxide dehydrogenase.
  • the carbon monoxide dehydrogenase II derived from the carboxydothermus hydrogenoformans may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the carboxydotherm hydrogenoformans ( Carboxydothermus hydrogenoformans ) derived carbon monoxide dehydrogenase IV may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the Thermococcus onnurineus derived carbon monoxide dehydrogenase may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the Carboxydothermus hydrogenoformans derived carbon monoxide dehydrogenase II may be a polypeptide encoded by a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11
  • the Carboxydothermus hydrogenoformans ( Carboxydothermus ) hydrogenoformans ) derived carbon monoxide dehydrogenase IV may be a polypeptide encoded by a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12
  • the Thermococcus onnurineus derived carbon monoxide dehydrogenase is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 It may be a polypeptide encoded by
  • homology is intended to indicate a degree of similarity with a wild-type amino acid sequence, and the comparison of such homology can be performed using a comparison program well known in the art, and the homology between two or more sequences is It can be calculated as a percentage (%).
  • enhanced pharmacological properties half-life, absorption, potency, potency, etc.
  • altered specificity e.g., broad spectrum of biological activity
  • reduced antigenicity N of the carbon monoxide dehydrogenase - or a protecting group
  • the protecting group may be an acetyl group, a fluorenyl methoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group or polyethylene glycol (PEG), but the modification of the carbon monoxide dehydrogenase, particularly the stability of the carbon monoxide dehydrogenase As long as it is a component capable of enhancing , it may be included without limitation.
  • PEG polyethylene glycol
  • stability may mean not only in vivo stability that protects the carbon monoxide dehydrogenase from attack by in vivo protein cleaving enzymes, but also storage stability (eg, room temperature storage stability).
  • the carbon monoxide dehydrogenase may additionally include an amino acid sequence prepared for a specific purpose for a targeting sequence, a tag, and a labeled residue, and specifically may be in a form bound to a His-tag terminal protein.
  • the formic acid dehydrogenase may be derived from nature, and may be obtained by various protein synthesis methods well known in the art. As an example, it may be prepared using polynucleotide recombination and a protein expression system, or it may be prepared by a method of synthesizing in vitro through chemical synthesis such as protein synthesis, a cell-free protein synthesis method, and the like. Also, as an example, the formate dehydrogenase may be a peptide, an extract of a plant-derived tissue or cell, or a product obtained by culturing a microorganism (eg, bacteria or fungi, and particularly yeast).
  • a microorganism eg, bacteria or fungi, and particularly yeast
  • the formic acid dehydrogenase is about 70% or more, about 75% or more, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more, about 92% or more, about 95% or more, about 97, respectively, with the amino acid sequence of formic acid dehydrogenase. % or greater, about 98% or greater, or about 99% or greater sequence homology.
  • the formate dehydrogenase may be an isoenzyme of formate dehydrogenase, for example, the formate dehydrogenase is a genus Methylobacterium sp., Thiobacillus sp., and Rhodobacter . sp.) may be derived from microorganisms of at least one genus selected from the group consisting of.
  • the formic acid dehydrogenase is at least one microorganism selected from the group consisting of Methylobacterium extorquens , Thiobacillus sp. KNK65MA and Rhodobacter capsulatus . may be of origin.
  • the formic acid dehydrogenase is methylobacterium extorquens derived formic acid dehydrogenase I, Thiobacillus sp. KNK65MA-derived formic acid dehydrogenase and Rhodobacter capsulatus derived from It may be at least one formate dehydrogenase selected from the group consisting of formic acid dehydrogenase.
  • the formic acid dehydrogenase I derived from Methylobacterium extorquens may be composed of MeFDH I ⁇ subunit, a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and MeFDH I ⁇ subunit, a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. And, the Thiobacillus sp.
  • KNK65MA-derived formic acid dehydrogenase may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and the Rhodobacter capsulatus -derived formic acid dehydrogenase of SEQ ID NO: 7 It may consist of RcFDH ⁇ subunit, which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence, RcFDH ⁇ subunit, which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and RcFDH ⁇ subunit, which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the formic acid dehydrogenase I derived from Methylobacterium extorquens is a polypeptide encoded by fdh1A, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, and fdh1B, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the thiobacillus sp. KNK65MA -derived formic acid dehydrogenase may be a polypeptide encoded by a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, and the Rhodobacter capsulatus derived formic acid dehydrogenase.
  • the enzyme is fdsA, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23, fdsB, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24, fdsG, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25, polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 It may be a polypeptide encoded by fdsC, which is a nucleotide, and fdsD, which is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27.
  • the N of the formate dehydrogenase - or a protecting group may be bonded to the C-terminus.
  • the protecting group may be an acetyl group, a fluorenyl methoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group, or polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the formic acid dehydrogenase may additionally include an amino acid sequence prepared for a specific purpose for a targeting sequence, a tag, and a labeled residue, and specifically may be in the form of binding to a His-tag terminal protein.
  • composition for preparing the formic acid may further include an electron transporter.
  • the formic acid production efficiency can be increased.
  • the electron transporter may be a natural electron transporter or an artificial electron transporter.
  • the electron transporter may be at least one electron transporter selected from the group consisting of an electron transporter having a viologen group and an electron transporter having an adenine dinucleotide group, for example, an alkyl viologen ( alkyl viologen), benzyl viologen, NAD (nicotinamide adenine dinucleotide), and FAD (flavin adenine dinucleotide) may be at least one electron transporter selected from the group consisting of, wherein the alkyl viologen is methyl Viologen (methyl viologen), ethyl viologen (ethyl viologen), propyl viologen (propyl viologen) and the like may be included.
  • the electron transporter is selected from the group consisting of methyl viologen, ethyl viologen, benzyl viologen, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and flavin adenine dinucleotide (FAD). It may be at least one electron transporter, and more specifically, it may be at least one electron transporter selected from the group consisting of methyl viologen and ethyl viologen.
  • the carbon monoxide dehydrogenase and the formate dehydrogenase in the composition may be present in a ratio of 1:1 to 1:3.
  • the carbon monoxide dehydrogenase and the formate dehydrogenase in the composition are 1:1 to 1:3, 1:1 to 1:2.5, 1:1 to 1:2.25, 1.5:1 to 1.5:3, 1.5: 1 to 1.5:2.5, 1.5:1 to 1.5:2.25, 1.75:1 to 1.75:3, 1.75:1 to 1.75:2.5 or 1.75:1 to 1.75:2.25, wherein the ratio is specifically a molar ratio.
  • the ratio is specifically a molar ratio.
  • the pH of the composition may be 5.0 to 8.0, 5.0 to 7.5, 5.0 to 7.0, 5.5 to 8.0, 5.5 to 7.5, 5.5 to 7.0, 6.0 to 8.0, 6.0 to 7.5 or 6.0 to 7.0. .
  • the pH of the composition When the pH of the composition is less than 5.0, the activity of the carbon monoxide dehydrogenase may be reduced, and when the pH of the composition is greater than 8.0, the activity of the formic acid dehydrogenase is lowered, and the formic acid production efficiency may be reduced.
  • carbon monoxide dehydrogenase may be within the above-described range.
  • carbon monoxide and/or carbon dioxide By converting the composition into formic acid in contact with carbon monoxide and/or carbon dioxide, carbon monoxide and/or carbon dioxide can be removed, and the removal efficiency can be reused without falling.
  • a specific carbon monoxide and/or carbon dioxide removal mechanism may be within the range described above.
  • Another aspect provides a composition for treating waste gas comprising carbon monoxide dehydrogenase and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase).
  • carbon monoxide dehydrogenase may be within the above-described range.
  • the waste gas may be waste gas discharged in large amounts during combustion of industries such as petrochemicals, steel industry, tobacco combustion, household cooking appliances, and various boilers, and specifically, may be waste gas containing a large amount of carbon monoxide and/or carbon dioxide.
  • the waste gas By converting the composition into formic acid in contact with carbon monoxide and/or carbon dioxide in the waste gas, the waste gas can be treated by removing carbon monoxide and/or carbon dioxide, and can be reused in a state where the treatment efficiency is not reduced.
  • a specific carbon monoxide and/or carbon dioxide removal mechanism may be within the range described above.
  • composition for air purification comprising carbon monoxide dehydrogenase and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase).
  • carbon monoxide dehydrogenase may be within the above-described range.
  • composition By converting the composition into formic acid in contact with carbon monoxide and / or carbon dioxide in the air, it is possible to purify the air by removing carbon monoxide and / or carbon dioxide, and can be reused in a state where the air purification efficiency does not fall.
  • a specific carbon monoxide and/or carbon dioxide removal mechanism may be within the range described above.
  • Another aspect provides an apparatus for producing formic acid comprising carbon monoxide dehydrogenase (Carbon monoxide dehydrogenase) and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase).
  • carbon monoxide dehydrogenase may be within the above-described range.
  • the device can be converted into formic acid in contact with carbon monoxide and/or carbon dioxide, and can be reused without a decrease in manufacturing efficiency.
  • the device may be to convert carbon monoxide or carbon monoxide into carbon dioxide in a gas containing carbon monoxide, and to produce formic acid by converting the carbon dioxide into formic acid.
  • the device may be to produce formic acid by converting the carbon dioxide into formic acid in carbon dioxide or a gas containing carbon dioxide.
  • Specific formic acid production mechanism may be within the above-described range.
  • Another aspect provides an apparatus for removing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide and carbon dioxide, including carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase.
  • carbon monoxide dehydrogenase may be within the above-described range.
  • the device is in contact with carbon monoxide and / or carbon dioxide by converting it to formic acid, it is possible to remove carbon monoxide and / or carbon dioxide, it is possible to reuse the removal efficiency in a state that does not fall.
  • a specific carbon monoxide and/or carbon dioxide removal mechanism may be within the range described above.
  • Another aspect provides an apparatus for treating waste gas comprising carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase.
  • carbon monoxide dehydrogenase may be within the above-described range.
  • the device is in contact with carbon monoxide and / or carbon dioxide in the waste gas by converting it into formic acid, by removing carbon monoxide and / or carbon dioxide to treat the waste gas, it is possible to reuse the treatment efficiency in a state that does not fall.
  • a specific carbon monoxide and/or carbon dioxide removal mechanism may be within the range described above.
  • Another aspect provides an apparatus for purifying air comprising carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase.
  • carbon monoxide dehydrogenase may be within the above-described range.
  • the device can purify the air by removing carbon monoxide and/or carbon dioxide by converting it into formic acid in contact with carbon monoxide and/or carbon dioxide in the air, and can be reused in a state where the air purification efficiency does not fall.
  • a specific carbon monoxide and/or carbon dioxide removal mechanism may be within the range described above.
  • Another aspect provides a filter comprising carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase.
  • carbon monoxide dehydrogenase may be within the above-described range.
  • carbon monoxide and/or carbon dioxide By converting the filter into formic acid in contact with carbon monoxide and/or carbon dioxide, carbon monoxide and/or carbon dioxide can be removed, and the removal efficiency can be reused in a state that does not fall.
  • a specific carbon monoxide and/or carbon dioxide removal mechanism may be within the range described above.
  • the filter can be applied to various filters in places where carbon monoxide and/or carbon dioxide are generated, such as cigarette filters and air purifier filters, and furthermore, industrial sites requiring hazardous gas treatment technology, sterilization/removal purification technology and system of harmful substances in the air, vehicles , treatment facilities and related technologies for indoor air quality management in transportation means such as trains, technologies and devices for ventilation efficiency and economical ventilation, and indoor air purification devices such as air purifiers, air conditioners, and fans.
  • filters in places where carbon monoxide and/or carbon dioxide are generated, such as cigarette filters and air purifier filters, and furthermore, industrial sites requiring hazardous gas treatment technology, sterilization/removal purification technology and system of harmful substances in the air, vehicles , treatment facilities and related technologies for indoor air quality management in transportation means such as trains, technologies and devices for ventilation efficiency and economical ventilation, and indoor air purification devices such as air purifiers, air conditioners, and fans.
  • Another aspect is carbon monoxide and formic acid comprising the step of contacting a gas (gas) containing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide dehydrogenase (Carbon monoxide dehydrogenase) and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase)
  • a gas gas containing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide dehydrogenase (Carbon monoxide dehydrogenase) and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase)
  • carbon monoxide dehydrogenase may be within the above-described range.
  • formic acid By contacting the carbon monoxide and / or carbon dioxide with carbon monoxide dehydrogenase and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase), formic acid can be easily and efficiently produced at room temperature and pressure.
  • the carbon monoxide dehydrogenase converts carbon monoxide into carbon dioxide in a gas containing carbon monoxide and / or carbon monoxide
  • the formic acid dehydrogenase continuously converts carbon dioxide into formic acid to produce formic acid.
  • the formic acid dehydrogenase may be to produce formic acid by converting carbon dioxide into formic acid in a gas containing carbon dioxide and / or carbon dioxide.
  • Specific formic acid production mechanism may be within the above-described range.
  • the carbon monoxide dehydrogenase and / or formic acid dehydrogenase can be reused in a state in which the production efficiency of formic acid does not fall.
  • the contacting comprises: contacting the gas with carbon monoxide dehydrogenase;
  • It may be comprised of the step of contacting the gas contacted with the carbon monoxide dehydrogenase to the formic acid dehydrogenase.
  • the gas may be simultaneously contacted with carbon monoxide dehydrogenase and formate dehydrogenase, but sequentially first contacted with carbon monoxide dehydrogenase, and then contacted with formic acid dehydrogenase.
  • the gas may be a continuously supplied gas.
  • carbon monoxide dehydrogenase and / or formic acid dehydrogenase can be reused, so that formic acid can be continuously produced.
  • the formic acid production rate may also increase.
  • the gas may be in contact with the carbon monoxide dehydrogenase and the formate dehydrogenase at the same time as the electron transporter.
  • the "electron transporter” may be within the above-described range, and when the electron transporter is additionally contacted, the formic acid production efficiency may be increased.
  • Another aspect is carbon monoxide and carbon monoxide comprising the step of contacting a gas (gas) containing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide and carbon monoxide dehydrogenase (Carbon monoxide dehydrogenase) and formic acid dehydrogenase (Formate dehydrogenase) and A method for removing at least one molecule selected from the group consisting of carbon dioxide is provided.
  • the "gas”, carbon monoxide dehydrogenase, "formic acid dehydrogenase”, etc. may be within the above-described range.
  • carbon monoxide and/or carbon dioxide By contacting the gas with the carbon monoxide dehydrogenase and the formate dehydrogenase, carbon monoxide and/or carbon dioxide can be removed, and the enzymes can be reused without deterioration in removal efficiency.
  • a specific carbon monoxide and/or carbon dioxide removal mechanism may be within the range described above.
  • waste gas treatment comprising the step of contacting a gas (gas) containing at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide and carbon dioxide to carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase.
  • gas may be within the above-described range.
  • the waste gas By contacting the gas with the carbon monoxide dehydrogenase and the formate dehydrogenase, the waste gas can be treated by removing carbon monoxide and/or carbon dioxide, and the enzymes can be reused in a state where the removal efficiency is not reduced.
  • a specific carbon monoxide and/or carbon dioxide removal mechanism may be within the range described above.
  • Another aspect is air purification comprising the step of contacting a gas comprising at least one molecule selected from the group consisting of carbon monoxide and carbon dioxide with carbon monoxide dehydrogenase and Formate dehydrogenase.
  • the "gas”, carbon monoxide dehydrogenase, "formic acid dehydrogenase”, etc. may be within the above-described range.
  • carbon monoxide and/or carbon dioxide By contacting the gas with the carbon monoxide dehydrogenase and the formate dehydrogenase, carbon monoxide and/or carbon dioxide can be removed to purify the air, and the enzymes can be reused in a state where the removal efficiency is not reduced.
  • a specific carbon monoxide and/or carbon dioxide removal mechanism may be within the range described above.
  • the method for producing formic acid it is possible to convert toxic carbon monoxide and / or carbon dioxide in waste gas into formic acid without by-products at room temperature and pressure using carbon monoxide dehydrogenase and formic acid dehydrogenase, and the enzymes are efficient It can be reused without falling off.
  • the manufacturing method of formic acid according to an aspect is a cigarette filter, an air purifier, a household cooking appliance suction filter, a gas boiler, etc. It can be removed through the bar, so it can be used in various ways.
  • EV is ethyl viologen, a compound used as a kind of electron mediator.
  • 2 is a diagram schematically illustrating free energy values according to the types of electron transporters (Md ox : an oxidized electron mediator, assuming that the free energy in the initial state of the reaction is 0).
  • Figure 4 is a view showing the time-dependent change of formic acid concentration of the CO hydration enzyme reaction tested by continuously introducing gas into a 100 mL bubble column reactor (50% CO, 50% CO 2 gas is used).
  • FIG. 5 is a view showing the change with time of formic acid generated when performing the CO hydration reaction using a crude gas (black) containing 50% CO and an actual waste gas (red) emitted from the steel industry.
  • the free energy difference of formic acid production in the reaction of Scheme 3 is a negative value of -8.7 kJ/mol, which means that the reaction can proceed without external energy input.
  • these electron transporters In order to perform a smooth reaction, in addition to the enzymes that catalyze the reaction (CO dehydrogenase, formate dehydrogenase), these electron transporters must be able to transfer electrons between these two enzymes. In order to transfer electrons, the electron transporter must be able to react with the enzyme, and at the same time, the reducing power generated by oxidizing CO must be preserved and used in a state sufficient to reduce CO 2 .
  • ChCODH II (SEQ ID NO: 1), ChCODH IV (SEQ ID NO: 2), ToCODH (SEQ ID NO: 3) (types II and IV CODH from Carboxydothermus hydrogenoformans and CODH from Thermococcus onnurineus , respectively), MeFDH I (MeFDH I ⁇ ) subunit: SEQ ID NO: 4; MeFDH I ⁇ subunit: SEQ ID NO: 5), TsFDH (SEQ ID NO: 6) and RcFDH (RcFDH ⁇ subunit: SEQ ID NO: 7; RcFDH ⁇ subunit: SEQ ID NO: 8; RcFDH ⁇ subunit: SEQ ID NO: 9) ( The expression and purification procedures of type I FDH derived from Methylobacterium extorquens , FDH derived from Thiobacillus sp. KNK65MA and FDH derived from Rhodobacter capsulatus , respectively) were as follows.
  • CODHs (ChCODH II, ChCODH IV and ToCODH)
  • the CODH genes (ChCODH II gene: SEQ ID NO: 11; ChCODH IV gene: SEQ ID NO: 12; ToCODH gene: SEQ ID NO: 13) were each cloned together with a vector containing a His-tag.
  • These plasmids (ChCODH II + His-tag containing plasmid: SEQ ID NO: 14; ChCODH IV + His-tag containing plasmid: SEQ ID NO: 15; ToCODH + His-tag containing plasmid: SEQ ID NO: 16) were each combined with pRKISC After transformation into Escherichia coli BL21 (DE3), it was expressed.
  • the FDH gene (fdh1A: SEQ ID NO: 17; fdh1B: SEQ ID NO: 18) was cloned into pCM110 vector (SEQ ID NO: 19) together with a His-tag. And this plasmid (MeFDH I gene + His-tag containing plasmid: SEQ ID NO: 20) was transformed into Methylobacterium extorquens AM1 in which the FDH gene was deleted.
  • TsFDH is a plasmid (TsFDH gene + His-tag containing plasmid: SEQ ID NO: 22) created by cloning the FDH gene (SEQ ID NO: 21) with His-tag into pET-23b(+) vector in E. coli BL21 (DE3). After transformation (transformation) was expressed.
  • ChCODH II, ChCODH IV and ToCODH were all expressed in the same manner.
  • strains prepared in LB medium containing 50 ⁇ g/mL of kanamycin and 10 ⁇ g/mL of tetracycline were cultured in a shaking incubator at 37° C., 200 rpm for 16 hours.
  • 0.02 mM NiCl 2 , 0.1 mM FeSO 4 , 2 mM and TB medium containing the same concentration as before (12 g/L trypton, 24 g/L Yeast extract, 10 g/L NaCl, 11 g/L glycerol, 12.3 g/LK 2 HPO 4 , 2.2 g/L KH 2 PO 4 ) 5 mL of the cultured strain was added to 400 mL. Thereafter, incubated in a 1 L Erlenmeyer flask at 37° C. and 200 rpm until an OD 600 of 0.4 to 0.6 was reached. The cultured bacteria were transferred to a 500 mL serum bottle and purged with nitrogen for 1 hour to exchange dissolved gas.
  • the strain prepared in the above medium was cultured in a shaking incubator at 30° C. and 200 rpm for 72 hours.
  • 200 mL of the same medium except Rifamycin was placed in a 1 L Erlenmeyer flask, 2 mL of the cultured strain was added, and cultured under the same conditions until OD 600 of 0.4 to 0.6 was reached.
  • Protein expression was induced by adding 0.5 wt% of methanol, then cultured for 24 hours, harvested and stored.
  • the portion to be used for driving the 10 L reactor was incubated through a 100 L incubator with reference to this method.
  • the pre-culture was incubated in 3 mL of LB medium containing 50 ⁇ g/mL of ampicillin in a shaking incubator at 37°C and 200 rpm.
  • the pre-cultured cells were placed in 300 mL of medium supplemented with 1 mM IPTG, and expressed in a shaking incubator at 37°C and 200 rpm for 24 hours.
  • lysis buffer of 50 mM KH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM dithioerythritol (DTE), 2 ⁇ M resazurin, pH 8.0, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 2 mM DTE , 2 ⁇ M resazurin, pH 8.0 wash buffer, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, 2 mM DTE, 2 ⁇ M resazurin, pH 8.0 elution buffer was prepared.
  • Buffer A containing 50 mM MOPS, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 7.0 and buffer B containing 50 mM MOPS, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole, pH 7.0 were prepared. 20 mL of buffer A per 1 g of the harvested cell pellet in an anaerobic chamber was mixed and released with a pipette. Then, while checking the OD 600 , the cells were lysed by ultrasonication until the value became 30% or less of the initial value, and centrifuged at 11000 rpm and 4° C. for 20 minutes to take only the supernatant.
  • MeFDH I had an absorbance of 8.94 L/gm-cm (at 340 nm), and RcFDH had an absorbance at 340 nm of 169500 L/mol-cm at Nanodrop.
  • a buffer of 50 mM HEPES, 2 mM DTE, pH 8.0 was prepared in an anaerobic chamber. This buffer was placed in a serum bottle and purged with 100% CO gas for 1 hour. In an anaerobic chamber, 20 mM EV was added to the above buffer, 0.1 ⁇ g of CODH was injected, and the activity was measured by measuring the change in absorbance at 578 nm while maintaining 30 °C.
  • MeFDH I 20 ⁇ g was added to 2 mL of a buffer of 50 mM MOPS, 30 mM sodium formate, 0.5 mM NAD + , pH 7.0, and the change in absorbance was measured at 340 nm at 30 ° C to measure the activity of the formic acid oxidation reaction. .
  • the CO hydratase reaction was basically performed under conditions based on 200 mM Bis-Tris propane, 2 mM DTE, 2 ⁇ M resazurin, pH 6.5 buffer, and although the type and amount varied depending on the experiment, all of them contained CODH, FDH and electron mediators. was used Unless gas was continuously introduced, the reaction was performed using 100% CO gas. In the experiment to select the types of CODH, FDH and electron mediator, 75 nM of CODH, 150 nM of FDH, and 5 mM of the electron mediator were used in a serum bottle. Activity measurement according to pH was tested by changing the pH with 200 mM Bis-Tris propane buffer with a wide pH buffering range.
  • MeFDH I the CO 2 reduction reaction was measured, and the EV and 50 mM sodium bicarbonate, which had been previously reduced with zinc, were added to make CO 2 and the experiment was carried out.
  • CODH 12000 U, FDH 400 U, and 5 mM EV were used, and in subsequent experiments, 1 mM EV was used.
  • LDG LDG was used, after the experiment to obtain the appropriate EV concentration, it was carried out at 0.1 mM.
  • 150 U of CODH and 5 U of FDH were put into a 10 mL serum bottle, and 500 kU of CODH and 90 kU of FDH were used in a 10 L reactor.
  • the CO hydration reaction system configured in Example 2 was used, and the CO hydration reaction was carried out by changing the CODH and FDH combinations used (based on the formic acid concentration measured 2 hours after the reaction, 5 mM ethyl viologen (EV) was used as the electron carrier. used).
  • EV ethyl viologen
  • FDH type CODH type Formic acid production concentration (mM) MeFDH I ChCODH II 40 MeFDH I ChCODH IV 2 MeFDH I ToCODH 7 RcFDH ChCODH II 0 RcFDH ChCODH IV 0 RcFDH ToCODH 0 TsFDH ChCODH II 0 TsFDH ChCODH IV 0 TsFDH ToCODH 0
  • Example 4 Comparison of formic acid production according to the type of electron transporter
  • Example 3 Under the conditions carried out in Example 3, the enzymes were ChCODH-II and MeFDH I, and experiments were conducted using various electron transporters, and the results are shown in Table 2 below (measured formic acid concentration after 2 hours of reaction).
  • Methyl viologen MV
  • Ethyl viologen EV
  • Benzyl viologen BV
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • FAD Flavin adenine dinucleotide
  • thermodynamic state is very favorable for the CO oxidation reaction, but the reaction in which CO 2 is reduced to formic acid is thermodynamically disadvantageous because free energy is increased on the contrary, whereas in the case of EV, Both CO oxidation and CO 2 reduction can be interpreted as thermodynamically favorable for formic acid production because the free energy is continuously reduced.
  • Example 6 Time-dependent increase in the concentration of formic acid produced when CO-containing gas is continuously injected in a 100 mL bubble column reactor
  • a 100 mL bubble column reactor was operated while continuously introducing a mixed gas (using 50% CO, 50% CO 2 gas) and adjusting the pH (pH 6.5, titrated with 2 N NaOH).
  • Example 7 Formic acid productivity change test in the CO hydration reactor according to the increase in the flow rate of the gas containing CO input
  • Example 8 Formic acid conversion test using actual waste gas from the steel industry
  • Example 5 the result of an experiment for generating formic acid using the actual steel industry waste gas having the composition of Table 4 was shown in FIG. 5 .
  • a little formic acid production rate was slow, but it could be confirmed that formic acid was generated almost similarly to the case of pure crude gas.
  • FIG. 5 it was confirmed that the activity of enzymes related to the CO hydration reaction was not significantly reduced by the unknown components contained in the waste gas, and formic acid was smoothly generated at a similar level.

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Abstract

일 양상은 일산화탄소 탈수소효소 및 포름산 탈수소효소를 이용하여 상온 및 상압에서 폐가스 중 독성이 있는 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 부산물 없이 개미산으로 전환시킬 수 있으며, 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능한 조성물, 장치, 필터, 방법 등을 제공한다. 상기 조성물, 장치, 필터, 방법 등을 활용하여, 석유화학, 철강산업 등의 산업체, 담배 연소, 가정용 취사기구, 각종 보일러 연소 시 다량 배출되는 일산화탄소를 담배필터, 공기정화기, 가정용 취사기구 흡입필터, 가스보일러 등을 통해 제거가 가능한 바, 다양한 활용이 가능하다.

Description

일산화탄소 탈수소효소 및 포름산 탈수소효소를 이용한 개미산의 제조 방법
일산화탄소 탈수소효소 및 포름산 탈수소효소를 이용한 개미산의 제조 방법에 관한 것이다.
철강산업, 석유화학산업 등의 산업체에서 배출하는 폐가스에는 상당량의 독성을 가지는 CO(carbon monoxide: 일산화탄소)가 포함되어 있다. 순수하게 분리된 일산화탄소는 다양한 화합물을 만들 수 있는 출발 원료가 될 수 있다. 그러나 폐가스에는 다양한 불순물이 포함되어 있어 산업폐가스에 포함되어 있는 일산화탄소를 직접적으로 화학반응의 원료로 이용하는 것은 상당히 기술적으로 어려운 문제이다. 이러한 이유로 대부분의 산업체는 일산화탄소가 포함된 산업폐가스를 연소시켜 일부 열에너지를 회수하는 방법을 사용하고 있다. 그러나 이 방법은 일산화탄소 연소를 통하여 이산화탄소가 다량 생성 배출되기에 최근 온실가스 저감에 대한 사회적인 관심이 커져서 이산화탄소 다량 배출에 대한 규제가 이루어지고 있어서 다른 대안 마련이 필요한 상황이다. 이리하여 폐가스에 포함된 일산화탄소를 단순 연소가 아니라 귀중한 탄소 자원으로 이용하려는 요구가 커지고 있다.
한편, 화학산업 중에 오랫동안 사용되어 오고 있는 water gas shift reaction을 통하여 일산화탄소가 포함된 폐가스를 전환하는 연구가 있으며, 그 반응식은 하기 반응식 1과 같다:
[반응식 1]
CO + H2O -> CO2 + H2.
상기 반응식 1에서 제시된 것은 일산화탄소를 물 분자와 반응시켜 수소 한 분자를 생성하는 것이다. 그러나 이 반응식에서 볼 수 있듯이 일산화탄소 연소 반응과 동일하게 동량의 이산화탄소가 발생하는 문제가 있어 일산화탄소를 탄소자원으로 이용하지 못하는 문제점이 있다. 또한 불순물이 다량 포함된 폐가스 전환은 상대적으로 어려워 사전에 폐가스로부터 일산화탄소를 순수 분리해야 하기에 경제적으로 부담이 가중될 수 있다.
이에 반하여 초산 생성 미생물(acetogen)을 이용하여 폐가스 중의 일산화탄소를 에탄올로 만들려는 시도가 상당히 있어 왔다. 미생물의 대사과정을 이용하는 반응식은 하기 반응식 2와 같다:
[반응식 2]
6CO + 3H2O -> C2H5OH + 4CO2.
상기 반응식 2에서 알 수 있듯이 일산화탄소의 탄소는 일부는 에탄올의 탄소로 전환되어 제품이 되나 대부분은 제품 속에 포함되지 않고 이산화탄소로 배출되는 문제가 있다. 그리고 이 반응은 이론상 반응식이고 미생물의 성장과 생존에는 더 많은 에너지가 필요하고 이를 이산화탄소 생성에서 발생하는 에너지를 이용하기 때문에 훨씬 더 많은 이산화탄소 배출이 발생하게 된다. 또한 미생물의 경우 폐가스에 포함된 일산화탄소에 대한 선택성을 가지기는 하나 불순물에 의하여 쉽게 생존율이 영향을 받을 수 있어 안정적으로 에탄올 생산이 어려운 단점이 존재한다.
이에, 폐가스 내 일산화탄소를 제거하는 새로운 반응인 CO 수화 반응을 통하여 개미산을 생산하는 반응식을 실제로 구현하여 폐가스 중의 일산화탄소를 탄소원으로 이용하면서 이산화탄소 생성없이 완전하게 새로운 부가가가치가 높은 개미산으로 재탄생시키는 기술을 제시하고자 한다.
일 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 개미산 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자 제거용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 폐가스 처리용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 공기 정화용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 개미산 제조용 장치를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자 제거용 장치를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 폐가스 처리용 장치를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 공기 정화용 장치를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 필터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 개미산의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 폐가스 처리 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 공기 정화 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 개미산 제조용 조성물을 제공한다.
상기 개미산은 포름산(Formic acid)를 의미하며, 상기 조성물은 일산화탄소 및/또는 이산화탄소와 접촉하여 개미산으로 전환시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 일산화탄소를 하기 반응식 4를 통해 이산화탄소로 전환시킬 수 있다:
[반응식 4]
CO + H2O + EM(산화된 상태) -> CO2 + 2H+ + EM(환원된 상태).
또한, 상기 포름산 탈수소효소는 이산화탄소를 하기 반응식 5를 통해 포름산으로 전환시킬 수 있다:
[반응식 5]
CO2 + 2H+ + EM(환원된 상태) -> HCOOH + EM(산화된 상태).
따라서, 상기 조성물은 일산화탄소 또는 일산화탄소를 포함하는 가스(gas)에서 이산화탄소로 전환시키고, 상기 이산화탄소를 개미산으로 전환시켜 개미산을 제조하는 것일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 가스(gas)에서 상기 이산화탄소를 개미산으로 전환시켜 개미산을 제조하는 것일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 개미산 제조 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다.
상기 일산화탄소 탈수소효소는 천연으로부터 유래될 수도 있고, 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 단백질 합성 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오티드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 단백질 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다. 또한, 일례로서, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물, 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있다.
용어 "단백질(Protein)”는 아마이드 결합 (또는 펩티드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다.
용어 '발현(expression)'은 폴리펩티드(polypeptide)이 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 유전자(폴리뉴클레오티드)의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩티드(단백질)(들)로의 해독을 포함한다.
용어 '재조합'은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다.　재조합　세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는　유전자　또는　유전자　절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한　재조합　세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는　유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기　유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
상기 일산화탄소 탈수소효소는 일산화탄소 탈수소효소의 아미노산 서열과 각각 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 일산화탄소 탈수소효소는 일산화탄소 탈수소효소의 동질효소일 수 있고, 예를 들어, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 무렐라속(Moorella sp.), 로드스피릴룸속(Rhodospirillum sp.), 메타노코쿠스속(Methanococcus sp.), 메타노사르시나속(Methanosarcina sp.), 메타노써모박터속(Methanothermobacter sp.), 클로스티리듐속(Clostridium sp.), 올리고트로파속(Oligotropha sp.), 에르피룸속(Aeropyrum sp.), 페로글로버스속(Ferroglobus sp.) 및 써모코커스속(Thermococcus sp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 속의 미생물 유래일 수 있다.
구체적으로, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans), 메타노코쿠스 바니엘리(Methanococcus vannielii), 메타노사르시나 바커리(Methanosarcina barkeri), 메타노써모박터 써마우토트로피커스(Methanothermobacter thermautotrophicus), 클로스티리듐 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum), 올리고트로파 카르복시도보란스(Oligotropha carboxidovorans), 에르피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix), 페로글로버스 플라씨더스(Ferroglobus placidus), 클로스티리듐 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스티리듐 리융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스티리듐 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 클로스티리듐 아세토뷰틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스티리듐 베이예린키(Clostridium beijerinckii), 클로스티리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스티리듐 써모셀룸(Clostridium thermocellum), 클로스티리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스티리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum) 및 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 미생물 유래 일산화탄소 탈수소효소일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소 II, 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소 IV 및 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus) 유래 일산화탄소 탈수소효소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 일산화탄소 탈수소효소일 수 있다.
상기 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소 II는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있고, 상기 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소 IV는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있고, 상기 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus) 유래 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 상기 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소 II는 서열번호 11의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드일 수 있고, 상기 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소 IV는 서열번호 12의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드일 수 있고, 상기 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus) 유래 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 13의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드일 수 있다.
용어 "상동성(Homology)"은 야생형 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 개질, 특히 일산화탄소 탈수소효소의 안정성을 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함될 수 있다.
상기 용어 "안정성"은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 상기 일산화탄소 탈수소효소를 보호하는 인 비보(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미하는 것일 수 있다.
아울러, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기를 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있고, 구체적으로 His-tag 말단의 단백질과 결합된 형태일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 포름산 탈수소효소는 천연으로부터 유래될 수도 있고, 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 단백질 합성 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오티드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 단백질 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다. 또한, 일례로서, 상기 포름산 탈수소효소는 펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물, 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있다.
상기 포름산 탈수소효소는 포름산 탈수소효소의 아미노산 서열과 각각 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 포름산 탈수소효소는 포름산 탈수소효소의 동질효소일 수 있고, 예를 들어, 상기 포름산 탈수소효소는 메틸로박테리움속(Methylobacterium sp.), 싸이오바실러스속(Thiobacillus sp.) 및 로도박터속(Rhodobacter sp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 속의 미생물 유래일 수 있다.
구체적으로, 상기 포름산 탈수소효소는 메틸로박테리움 엑스토쿠엔스(Methylobacterium extorquens), 싸이오바실러스속(Thiobacillus sp.) KNK65MA 및 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobacter capsulatus)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 미생물 유래일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 포름산 탈수소효소는 메틸로박테리움 엑스토쿠엔스(Methylobacterium extorquens) 유래 포름산 탈수소효소 I, 싸이오바실러스속(Thiobacillus sp.) KNK65MA 유래 포름산 탈수소효소 및 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobacter capsulatus) 유래 포름산 탈수소효소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 포름산 탈수소효소일 수 있다.
상기 메틸로박테리움 엑스토쿠엔스(Methylobacterium extorquens) 유래 포름산 탈수소효소 I는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 MeFDH I α subunit 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 MeFDH I β subunit으로 이루어질 수 있고, 상기 싸이오바실러스속(Thiobacillus sp.) KNK65MA 유래 포름산 탈수소효소는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있고, 상기 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobacter capsulatus) 유래 포름산 탈수소효소는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 RcFDH α subunit, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 RcFDH β subunit 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 RcFDH γ subunit으로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 메틸로박테리움 엑스토쿠엔스(Methylobacterium extorquens) 유래 포름산 탈수소효소 I는 서열번호 17의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 fdh1A 및 서열번호 18의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 fdh1B가 코딩하는 폴리펩티드일 수 있고, 상기 싸이오바실러스속(Thiobacillus sp.) KNK65MA 유래 포름산 탈수소효소는 서열번호 21의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드일 수 있고, 상기 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobacter capsulatus) 유래 포름산 탈수소효소는 서열번호 23의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 fdsA, 서열번호 24의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 fdsB, 서열번호 25의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 fdsG, 서열번호 26의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 fdsC 및 서열번호 27의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 fdsD가 코딩하는 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 상기 포름산 탈수소효소의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 상기 포름산 탈수소효소의 개질, 특히 포름산 탈수소효소의 안정성을 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함될 수 있다.
아울러, 상기 포름산 탈수소효소는 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기를 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있고, 구체적으로 His-tag 말단의 단백질과 결합된 형태일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 개미산 제조용 조성물은 전자전달체를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물은 전자전달체를 추가로 포함할 경우, 보다 개미산 제조 효율이 증가될 수 있다.
상기 전자전달체는 천연 전자전달체 또는 인공 전자전달체일 수 있다. 또한, 상기 전자전달체는 바이올로젠(viologen)기를 가지는 전자전달체 및 아데닌 디뉴클레오티드(adenine dinucleotide)기를 가지는 전자전달체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 전자전달체일 수 있고, 예를 들어, 알킬 바이올로젠(alkyl viologen), 벤질 바이올로젠(benzyl viologen), NAD(nicotinamide adenine dinucleotide) 및 FAD(Flavin adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 전자전달체일 수 있고, 상기 알킬 바이올로젠(alkyl viologen)은 메틸 바이올로젠(methyl viologen), 에틸 바이올로젠(ethyl viologen), 프로필 바이올로젠(propyl viologen) 등을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 전자전달체는 메틸 바이올로젠(Methyl viologen), 에틸 바이올로젠(Ethyl viologen), 벤질 바이올로젠(Benzyl viologen), NAD(nicotinamide adenine dinucleotide) 및 FAD(Flavin adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 전자전달체일 수 있고, 보다 구체적으로, 메틸 바이올로젠(methyl viologen) 및 에틸 바이올로젠(ethyl viologen)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 전자전달체일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 조성물 내 상기 일산화탄소 탈수소효소 및 상기 포름산 탈수소효소는 1:1 내지 1:3의 비율로 존재할 수 있다.
구체적으로, 상기 조성물 내 상기 일산화탄소 탈수소효소 및 상기 포름산 탈수소효소는 1:1 내지 1:3, 1:1 내지 1:2.5, 1:1 내지 1:2.25, 1.5:1 내지 1.5:3, 1.5:1 내지 1.5:2.5, 1.5:1 내지 1.5:2.25, 1.75:1 내지 1.75:3, 1.75:1 내지 1.75:2.5 또는 1.75:1 내지 1.75:2.25의 비율로 존재할 수 있으며, 상기 비율은 구체적으로 몰비일 수 있다.
상기 조성물 내 상기 일산화탄소 탈수소효소 및 상기 포름산 탈수소효소의 존재 비율이 1:1 내지 1:3인 경우, 개미산이 최대로 생산될 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 조성물의 pH는 5.0 내지 8.0, 5.0 내지 7.5, 5.0 내지 7.0, 5.5 내지 8.0, 5.5 내지 7.5, 5.5 내지 7.0, 6.0 내지 8.0, 6.0 내지 7.5 또는 6.0 내지 7.0일 수 있다.
상기 조성물의 pH가 5.0 미만인 경우, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 활성이 저하될 수 있고, 상기 조성물의 pH가 8.0 초과인 경우, 상기 포름산 탈수소효소의 활성이 저하되어, 개미산 제조 효율이 저하될 수 있다.
다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자 제거용 조성물을 제공한다.
상기 "일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 조성물은 일산화탄소 및/또는 이산화탄소와 접촉하여 개미산으로 전환시킴으로써, 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 제거시킬 수 있으며, 제거 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적인 일산화탄소 및/또는 이산화탄소의 제거 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 폐가스 처리용 조성물을 제공한다.
상기 "일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 폐가스는 석유화학, 철강산업 등의 산업체, 담배 연소, 가정용 취사기구, 각종 보일러 연소 시 다량 배출되는 폐가스일 수 있고, 구체적으로 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 다량 함유하는 폐가스일 수 있다.
상기 조성물은 폐가스 내 일산화탄소 및/또는 이산화탄소와 접촉하여 개미산으로 전환시킴으로써, 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 제거시켜 폐가스를 처리할 수 있으며, 처리 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적인 일산화탄소 및/또는 이산화탄소의 제거 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 공기 정화용 조성물을 제공한다.
상기 "일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 조성물은 공기 중 일산화탄소 및/또는 이산화탄소와 접촉하여 개미산으로 전환시킴으로써, 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 제거시켜 공기를 정화할 수 있으며, 공기 정화 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적인 일산화탄소 및/또는 이산화탄소의 제거 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 개미산 제조용 장치를 제공한다.
상기 "일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소", "개미산" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 장치는 일산화탄소 및/또는 이산화탄소와 접촉하여 개미산으로 전환시킬 수 있으며, 제조 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적으로, 상기 장치는 일산화탄소 또는 일산화탄소를 포함하는 가스(gas)에서 이산화탄소로 전환시키고, 상기 이산화탄소를 개미산으로 전환시켜 개미산을 제조하는 것일 수 있다.
또한, 상기 장치는 이산화탄소 또는 이산화탄소를 포함하는 가스(gas)에서 상기 이산화탄소를 개미산으로 전환시켜 개미산을 제조하는 것일 수 있다. 구체적인 개미산 제조 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자 제거용 장치를 제공한다.
상기 "일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 장치는 일산화탄소 및/또는 이산화탄소와 접촉하여 개미산으로 전환시킴으로써, 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 제거시킬 수 있으며, 제거 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적인 일산화탄소 및/또는 이산화탄소의 제거 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 폐가스 처리용 장치를 제공한다.
상기 "일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소", "폐가스" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 장치는 폐가스 내 일산화탄소 및/또는 이산화탄소와 접촉하여 개미산으로 전환시킴으로써, 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 제거시켜 폐가스를 처리할 수 있으며, 처리 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적인 일산화탄소 및/또는 이산화탄소의 제거 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 공기 정화용 장치를 제공한다.
상기 "일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 장치는 공기 중 일산화탄소 및/또는 이산화탄소와 접촉하여 개미산으로 전환시킴으로써, 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 제거시켜 공기를 정화할 수 있으며, 공기 정화 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적인 일산화탄소 및/또는 이산화탄소의 제거 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 필터를 제공한다.
상기 "일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 필터는 일산화탄소 및/또는 이산화탄소와 접촉하여 개미산으로 전환시킴으로써, 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 제거시킬 수 있으며, 제거 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적인 일산화탄소 및/또는 이산화탄소의 제거 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 필터는 담배 필터, 공기청정기 필터 등 일산화탄소 및/또는 이산화탄소가 발생되는 장소에서 다양한 필터에 적용될 수 있으며, 나아가 유해 가스 처리 기술이 필요한 산업 현장, 공기 내 유해 물질 살균/제거 정화기술 및 시스템, 차량, 열차 등 이동수단 내 실내 공기질 관리를 위한 처리시설 및 관련기술, 환기효율 및 경제적 환기를 위한 기술 및 장치, 공기청정기, 에어컨, 환풍기 등과 같은 실내공기 정화장치 등에 포함될 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 개미산의 제조 방법을 제공한다.
상기 "일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소", "개미산" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시켜 개미산을 상온, 상압에서 쉽게 효율적으로 제조할 수 있다.
구체적으로, 상기 일산화탄소 탈수소효소가 일산화탄소 및/또는 일산화탄소를 포함하는 가스(gas)에서 일산화탄소를 이산화탄소로 전환시키고, 상기 포름산 탈수소효소가 이산화탄소를 개미산으로 연속적으로 전환시켜 개미산을 제조하는 것일 수 있다.
또한, 상기 포름산 탈수소효소가 이산화탄소 및/또는 이산화탄소를 포함하는 가스에서 이산화탄소를 개미산으로 전환시켜 개미산을 제조하는 것일 수 있다. 구체적인 개미산 제조 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
또한, 상기 일산화탄소 탈수소효소 및/또는 포름산 탈수소효소는 개미산 제조 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 가스를 일산화탄소 탈수소효소에 접촉시키는 단계; 및
상기 일산화탄소 탈수소효소와 접촉된 가스를 포름산 탈수소효소에 접촉시키는 단계로 이루어진 것일 수 있다.
상기 개미산의 제조 방법은 상기 가스를 일산화탄소 탈수소효소 및 포름산 탈수소효소를 동시에 접촉시킬 수도 있으나, 순차적으로 일산화탄소 탈수소효소에 먼저 접촉시킨 후, 포름산 탈수소효소에 접촉시킬 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 가스는 연속적으로 공급되는 가스일 수 있다.
상기 가스가 연속적으로 공급되는 경우, 일산화탄소 탈수소효소 및/또는 포름산 탈수소효소는 재사용이 가능하므로 연속적으로 개미산을 생성할 수 있다.
상기 연속적으로 공급되는 가스의 양이 증가되는 경우, 개미산 생성 속도도 증가할 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 가스는 전자전달체와 동시에 일산화탄소 탈수소효소 및 포름산 탈수소효소에 접촉되는 것일 수 있다.
상기 "전자전달체"는 전술한 범위 내일 수 있으며, 상기 전자전달체를 추가적으로 접촉시키는 경우, 보다 개미산 제조 효율이 증가될 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 제거하는 방법을 제공한다.
상기 "가스", 일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 가스를 상기 일산화탄소 탈수소효소 및 상기 포름산 탈수소효소에 접촉시킴으로써 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 제거시킬 수 있으며, 상기 효소들은 제거 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적인 일산화탄소 및/또는 이산화탄소의 제거 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 폐가스 처리 방법을 제공한다.
상기 "가스", "일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소", "폐가스" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 가스를 상기 일산화탄소 탈수소효소 및 상기 포름산 탈수소효소에 접촉시킴으로써 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 제거시켜 폐가스를 처리할 수 있으며, 상기 효소들은 제거 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적인 일산화탄소 및/또는 이산화탄소의 제거 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 공기 정화 방법을 제공한다.
상기 "가스", 일산화탄소 탈수소효소", "포름산 탈수소효소" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 가스를 상기 일산화탄소 탈수소효소 및 상기 포름산 탈수소효소에 접촉시킴으로써 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 제거시켜 공기를 정화할 수 있으며, 상기 효소들은 제거 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 구체적인 일산화탄소 및/또는 이산화탄소의 제거 메커니즘은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 따른 개미산의 제조 방법에 따르면, 일산화탄소 탈수소효소 및 포름산 탈수소효소를 이용하여 상온 및 상압에서 폐가스 중 독성이 있는 일산화탄소 및/또는 이산화탄소를 부산물 없이 개미산으로 전환시킬 수 있으며, 상기 효소들은 효율이 떨어지지 않은 상태로 재사용이 가능하다. 일 양상에 따른 개미산의 제조 방법은 석유화학, 철강산업 등의 산업체, 담배 연소, 가정용 취사기구, 각종 보일러 연소 시 다량 배출되는 일산화탄소를 담배필터, 공기정화기, 가정용 취사기구 흡입필터, 가스보일러 등을 통해 제거가 가능한 바, 다양한 활용이 가능하다.
도 1은 CO 수화반응을 촉매하는 효소와 개미산 생산 개념도를 나타낸다(EV는 ethyl viologen으로 일종의 electron mediator로 사용되는 화합물임).
도 2는 전자전달체의 종류에 따른 자유에너지값을 도식화한 도이다(Mdox: 산화된 형태의 전자 매개체, 반응 초기 상태의 자유 에너지를 0으로 가정하였음).
도 3은 반응 pH에 따른 ChCODH II(검은색)와 MeFDH I(빨간색)의 상대적인 활성 변화를 측정한 도이다.
도 4는 100 mL 기포 탑 반응기에 지속적인 가스 유입을 하여 실험한 CO 수화 효소 반응의 개미산 농도의 시간 별 변화를 나타낸 도이다(50% CO, 50% CO2 가스를 사용함).
도 5는 CO 50%를 포함하는 조제 가스(검정색)와 실제 제철산업 배출 폐가스(붉은색)를 이용하여 CO 수화반응을 수행할 때 생성되는 개미산의 시간에 따른 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 CO 수화 효소 반응의 반복 사용 가능성을 확인한 도이다(검은색: 50% CO, 50% CO2 가스, 빨간색: 실제 제철산업 발생 폐가스 LDG).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참조예
실시예에서는 하기 반응식 3과 같은 새로운 일산화탄소 수화 반응을 제시한다:
[반응식 3]
CO + H2O -> HCOOH.
상기 반응식 3을 보면 일산화탄소 분자에 물 분자가 결합되어 개미산이 생성되며, 어떠한 이산화탄소 생성없이 일산화탄소에 원래 포함되어 있는 탄소원자가 개미산의 탄소 원자로 완전하게 전환되는 것을 알 수 있다. 이러한 반응을 진행하기 위하여 두가지 효소가 하단의 반응식 4 및 5와 같이 연계되어 반응을 진행한다:
[반응식 4]
CO + H2O + EM(산화된 상태) -> CO2 + 2H+ + EM(환원된 상태)
[반응식 5]
CO2 + 2H+ + EM(환원된 상태) -> HCOOH + EM(산화된 상태)
EM: electron mediator (전자전달체).
상기 반응식 4의 반응은 CO를 산화하는 효소인 CO dehydrogenase가 촉매하며, 상기 반응식 5의 반응은 formate dehydrogenase가 촉매한다. 이를 개념도로 나타내면 도 1과 같다.
도 1에서 확인할 수 있듯이 상기 반응식 3의 반응에서 개미산 생성의 자유에너지 차이는 음의 값인 -8.7 kJ/mol이기에 외부 에너지 투입없이 반응을 진행할 수 있다는 것을 의미한다. 원활한 반응 수행을 위해서는 반응을 촉매하는 효소(CO dehydrogenase, formate dehydrogenase) 외에 이들 전자전달체체가 이들 두 효소 간에 전자를 전달할 수 있어야 한다. 전자를 전달하기 위해서는 전자전달체가 효소와 결합 반응을 할 수 있어야 하며 동시에 CO를 산화하면서 생긴 환원력을 CO2를 환원하는데 충분한 상태로 보전하여 이용할 수 있어야 한다.
실시예
실시예 1. CODH(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 FDH(formate dehydrogenase)의 제조
(1) CODH와 FDH의 클로닝
ChCODH II(서열번호 1), ChCODH IV(서열번호 2), ToCODH(서열번호 3)(각각 Carboxydothermus hydrogenoformans에서 유래된 II, IV 유형의 CODH 및 Thermococcus onnurineus에서 유래된 CODH), MeFDH I(MeFDH I α subunit: 서열번호 4; MeFDH I β subunit: 서열번호 5), TsFDH(서열번호 6) 및 RcFDH(RcFDH α subunit: 서열번호 7; RcFDH β subunit: 서열번호 8; RcFDH γ subunit: 서열번호 9)(각각 Methylobacterium extorquens에서 유래된 I 유형의 FDH, Thiobacillus sp. KNK65MA에서 유래된 FDH 및 Rhodobacter capsulatus에서 유래된 FDH)의 발현과 정제 과정은 하기와 같았다.
CODH들(ChCODH II, ChCODH IV 및 ToCODH)의 경우, 우선 pET-28a(+) 벡터(vector)(서열번호 10)에 실험하고자 하는 CODH 유전자들(ChCODH II 유전자: 서열번호 11; ChCODH IV 유전자: 서열번호 12; ToCODH 유전자: 서열번호 13)을 히스택(His-tag)을 함유하는 벡터와 함께 각각 클로닝(cloning)하였다. 이 플라스미드(plasmid)들(ChCODH II + His-tag 포함 플라스미드: 서열번호 14; ChCODH IV + His-tag 포함 플라스미드: 서열번호 15; ToCODH + His-tag 포함 플라스미드: 서열번호 16)을 각각 pRKISC와 함께 Escherichia coli BL21(DE3)에 넣어 형질전환(transformation)시킨 후 발현시켰다.
MeFDH I의 경우, FDH 유전자(fdh1A: 서열번호 17; fdh1B: 서열번호 18)를 His-tag과 함께 pCM110 vector(서열번호 19)에 cloning하였다. 그리고 이 plasmid(MeFDH I 유전자 + His-tag 포함 플라스미드: 서열번호 20)를 FDH 유전자가 삭제된 Methylobacterium extorquens AM1에 넣어 형질전환(transformation)시켰다.
TsFDH는 FDH 유전자(서열번호 21)를 His-tag과 함께 pET-23b(+) vector에 cloning하여 만든 plasmid(TsFDH 유전자 + His-tag 포함 플라스미드: 서열번호 22)를 E.coli BL21(DE3)에 형질전환(transformation)시킨 후 발현시켰다.
RcFDH는 FDH 유전자(fdsA: 서열번호 23; fdsB: 서열번호 24; fdsG: 서열번호 25; fdsC: 서열번호 26; fdsD: 서열번호 27)를 His-tag과 함께 pTrcHis vector(서열번호 28)에 cloning하여 만든 plasmid(RcFDH 유전자 + His-tag 포함 플라스미드: 서열번호 29)를 E.coli MC1061에 형질전환(transformation)시킨 후 발현시켰다.
(2) CODH의 발현
ChCODH II, ChCODH IV와 ToCODH을 모두 동일한 방법으로 발현시켰다. 먼저 50 μg/mL의 카나마이신(kanamycin)과 10 μg/mL의 테트라사이클린(tetracycline)이 포함된 LB 배지에서 준비된 균주를 37℃, 200 rpm의 진탕 배양기에서 16 시간 동안 배양하였다. 이 후 0.02 mM NiCl2, 0.1 mM FeSO4, 2 mM 과 이전과 동일한 농도의 항생제가 들어있는 TB 배지(12 g/L trypton, 24 g/L Yeast extract, 10 g/L NaCl, 11 g/L glycerol, 12.3 g/L K2HPO4, 2.2 g/L KH2PO4) 400 mL에 배양된 균주 5 mL를 넣었다. 이 후 1 L 삼각 플라스크에서 OD600 0.4 ~ 0.6에 도달할 때까지 37℃, 200 rpm에서 배양하였다. 500 mL serum bottle로 배양된 균을 옮기고 1 시간 동안 질소로 퍼징하여 용존 기체를 교환하였다. 기체 교환 과정에서 30분이 경과했을 때, 0.5 mM NiCl2, 1 mM FeSO4, 50 mM KNO3, 0.2 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 넣어 단백질을 발현시켰다. 기체 교환 후 30℃, 200 rpm에서 24 시간 동안 배양하였고, 배양된 세포들을 harvest하여 보관하였다. 10 L 반응기의 구동에 사용할 분량은 이 방법을 참조하여 100 L 배양기를 통해 배양되었다.
(3) FDH의 발현
1) MeFDH I의 발현
1.62 g/L NH4Cl, 0.2 g/L MgSO4, 2.21 g/L K2HPO4, 1.25 g/L NaH2PO42H2O, 15 mg/L Na2EDTA2H2O, 4.5 mg/L ZnSO47H2O, 0.3 mg/L CoCl26H2O, 1 mg/L MnCl24H2O, 1 mg/L H3BO3, 2.5 mg/L CaCl2, 0.4 mg/L Na2MoO42H2O, 3 mg/L FeSO47H2O, 0.3 mg/L CuSO45H2O, 30 μM Na2WO4, 16 g/L succinate, 50 μg/mL 리파마이신(rifamycin)과 10 μg/mL tetracycline의 조성을 가진 배지를 준비하였다. 상기 배지에서 준비한 균주를 72 시간 동안 30℃, 200 rpm의 진탕 배양기에서 배양하였다. Rifamycin을 제외한 동일 배지 200 mL을 1 L 삼각 플라스크에 넣고 2 mL의 배양된 균주를 넣고 같은 조건에서 OD600 0.4 ~ 0.6에 도달할 때까지 배양하였다. 0.5 wt%의 메탄올을 넣어 단백질 발현을 유도하였고, 이후 24 시간 동안 배양하고 harvest하여 보관하였다. 10 L 반응기의 구동에 사용할 분량은 이 방법을 참조하여 100 L 배양기를 통해 배양되었다.
2) TsFDH의 발현
사전 배양은 50 μg/mL 의 암피실린(ampicillin)이 포함된 3 mL의 LB 배지에서 37℃, 200 rpm의 진탕 배양기로 배양되었다. 사전 배양된 cell을 1 mM IPTG가 추가된 배지 300 mL에 넣고 37℃, 200 rpm의 진탕 배양기에서 24 시간 동안 발현시켰다.
3) RcFDH의 발현
1 mM molybdate, 20 μM IPTG, 150 μg/mL ampicillin의 첨가물이 있는 LB 배지에서 12 시간 동안 37℃로 preculture를 하였다. 1:500 비율로 사전 배양한 균주를 같은 조성의 배지에 넣어 본 배양을 수행하였다. 본 배양 시 30℃, 130 rpm으로 진탕 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다.
(4) CODH의 정제
50 mM KH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTE(dithioerythritol), 2 μM resazurin, pH 8.0의 lysis buffer, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 2 mM DTE, 2 μM resazurin, pH 8.0의 wash buffer, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, 2 mM DTE, 2 μM resazurin, pH 8.0의 elution buffer를 준비하였다. 혐기성 챔버에서 harvest된 cell pellet 1 g 당 10 mL의 lysis buffer를 섞고 피펫으로 풀어주었다. Cell pellet 1 g 당 30 분씩 초음파로 세포를 용해시키고, 11000 rpm, 4℃에서 20 분 동안 원심 분리하여 supernatant만 취하였다. Cell pellet 1 g 기준으로 1 mL의 Ni-NTA agarose와 supernatant를 섞고 피펫팅하여 발현된 단백질을 15 분 동안 binding시켰다. Binding된 용액을 컬럼에 붓고 10 cv의 wash buffer를 부어 washing하였다. 지속적 가스 유입을 하는 실험에는 이 중 일부만 elution buffer로 elution하여 농도와 활성을 측정하고 나머지 효소는 binding 된 채로 사용하였다. 이 외 실험은 elution buffer로 elution하여 사용하였으며, 10 L 반응기를 구동할 때는 예외적으로 호모게나이저를 이용하여 세포를 용해시켰다.
(5) FDH의 정제
1) MeFDH I의 정제
50 mM MOPS, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 7.0 인 buffer A와 50 mM MOPS, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole, pH 7.0 인 buffer B를 준비하였다. 혐기성 챔버에서 harvest된 cell pellet 1 g 당 20 mL의 buffer A를 섞고 피펫으로 풀어주었다. 이 후, OD600을 확인해가며 값이 초기의 30% 이하가 될 때까지 초음파로 세포를 용해시키고, 11000 rpm, 4℃에서 20 분 동안 원심 분리하여 supernatant만 취하였다. Cell pellet 1 g 기준으로 1 mL의 Ni-NTA agarose와 supernatant를 섞고 피펫팅하여 발현된 단백질을 15 분 동안 binding시켰다. Binding된 용액을 컬럼에 붓고 10 cv의 buffer A를 부어 washing하였다. 지속적 가스 유입을 하는 실험에는 이 중 일부만 buffer B로 elution하여 농도와 활성을 측정하고 나머지 효소는 binding 된 채로 사용하였다. 이 외 실험은 buffer B로 elution하여 사용하였고, 10 L 반응기를 구동할 때는 예외적으로 호모게나이저를 이용하여 세포를 용해시켰다.
2) TsFDH의 정제
50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 7.0의 lysis buffer, 40 mM imidazole, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 7.0의 wash buffer, 250 mM imidazole, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 7.0의 elution buffer를 준비하였다. 혐기성 챔버에서 harvest된 cell pellet 1 g 당 20 mL의 lysis buffer를 섞고 피펫으로 풀어주었다. 이 후, OD600을 확인해가며 값이 초기의 30% 이하가 될 때까지 초음파로 세포를 용해시켰고, 11000 rpm, 4℃에서 20 분 동안 원심 분리하여 supernatant만 취하였다. Cell pellet 1 g 기준으로 1 mL의 Ni-NTA agarose와 supernatant를 섞고 피펫팅하여 발현된 단백질을 15 분 동안 binding시켰다. Binding 된 용액을 컬럼에 붇고 10 cv의 wash buffer를 부어 washing하였다. Elution buffer로 elution하여 이 후 실험에 사용하였으며, 10 L 반응기를 구동할 때는 예외적으로 호모게나이저를 이용하여 세포를 용해시켰다.
3) RcFDH의 정제
50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0의 lysis buffer, 20 mM imidazole, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0의 wash buffer, 250 mM imidazole, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0의 elution buffer를 준비하였다. 혐기성 챔버에서 harvest된 cell pellet 1 g 당 20 mL의 lysis buffer를 섞고 피펫으로 풀어주었다. 5분 동안 초음파로 세포를 용해시켰고, 11000 rpm, 4℃에서 20 분 동안 원심 분리하여 supernatant만 취하였다. Cell pellet 1 g 기준으로 1 mL의 Ni-NTA agarose와 supernatant를 섞고 피펫팅하여 발현된 단백질을 15 분 동안 binding시켰다. Binding된 용액을 컬럼에 붇고 10 cv의 wash buffer를 부어 washing하였다. Elution buffer로 elution하여 이 후 실험에 사용하였다.
(6) CODH와 FDH의 농도 측정
CODH와 TsFDH는 Bradford assay를 이용해 농도를 측정하였다. MeFDH I은 흡광도를 8.94 L/gm-cm으로 하여(340 nm 기준), RcFDH는 흡광도를 340 nm에서 169500 L/mol-cm을 기준으로 Nanodrop에서 측정하였다.
(7) CODH의 활성 측정
혐기성 챔버에서 50 mM HEPES, 2 mM DTE, pH 8.0의 buffer를 준비하였다. 이 buffer를 serum bottle에 넣고 1 시간 동안 100 % CO 가스에 퍼징시켰다. 혐기성 챔버에서 위의 buffer에 20 mM의 EV를 넣고 0.1 μg의 CODH를 주입한 후 30℃를 유지하며 578 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 활성을 측정하였다.
(8) FDH의 활성 측정
1) MeFDH I의 활성 측정
50 mM MOPS, 30 mM sodium formate, 0.5 mM NAD+, pH 7.0의 buffer 2 mL에 20 μg의 MeFDH I을 넣고 340 nm에서 30℃를 유지하며 흡광도의 변화를 측정하여 개미산 산화 반응의 활성을 측정하였다.
2) TsDFH의 활성 측정
100 mM sodium phosphate, 200 mM sodium formate, 2 mM NAD+, pH 6.5의 buffer 2 mL에 20 μg의 TsFDH를 넣고 25℃의 조건에서 340 nm의 흡광도 변화를 측정하여 활성을 측정하였다.
3) RcFDH의 활성 측정
100 mM Tris-HCl, 6 mM sodium formate, 2 mM NAD+, pH 9.0 buffer에서 100 nM의 RcFDH를 주입하고 30℃의 조건에서 340 nm의 흡광도 변화를 측정하여 활성을 측정하였다.
실시예 2. CO 수화 효소 반응의 구성
CO 수화 효소 반응은 기본적으로 200 mM Bis-Tris propane, 2 mM DTE, 2 μM resazurin, pH 6.5 buffer를 바탕으로 한 조건에서 이루어졌으며 실험에 따라 종류와 양이 달라졌지만 모두 CODH, FDH와 전자 매개체가 사용되었다. 지속적으로 가스를 유입하는 경우가 아니면 100% CO 가스를 이용하여 반응을 진행하였다. CODH, FDH와 전자 매개체의 종류를 선별하는 실험에서는 CODH 75 nM, FDH 150 nM, 전자 매개체 5 mM을 사용하여 serum bottle에서 실험하였다. pH에 따른 활성 측정은 pH 버퍼링 범위가 넓은 200 mM Bis-Tris propane buffer로 pH를 바꿔가며 실험하였다. MeFDH I의 경우, CO2 환원 반응을 측정하였는데, 아연으로 미리 환원시킨 EV와 50 mM의 sodium bicarbonate를 넣어 CO2를 만들어서 실험을 진행하였다. 100 mL 기포 탑 반응기(bubble column reactor)를 사용한 실험에서는 CODH 12000 U, FDH 400 U, 5 mM EV를 사용했고 이후 실험에서는 1 mM의 EV를 사용하였다. LDG가 사용된 실험에서, EV 적정 농도를 구하는 실험 이후로는 0.1 mM에서 진행하였다. 재사용성 관련 실험에서는 CODH 150 U, FDH 5 U을 10 mL serum bottle에 넣어 진행하였고, 10 L 반응기에서는 CODH 500 kU, FDH 90 kU가 사용되었다.
실시예 3. CODH와 FDH 종류에 따른 CO 수화 반응 결과
상기 실시예 2에서 구성된 CO 수화반응계를 이용하였으며, 사용된 CODH, FDH 조합을 달리하여 CO 수화반응을 진행하였다(반응 2시간 후 측정된 개미산 농도 기준, 5 mM ethyl viologen(EV)을 전자전달체로 이용함).
FDH 종류 CODH 종류 개미산 생산농도 (mM)
MeFDH I ChCODH II 40
MeFDH I ChCODH IV 2
MeFDH I ToCODH 7
RcFDH ChCODH II 0
RcFDH ChCODH IV 0
RcFDH ToCODH 0
TsFDH ChCODH II 0
TsFDH ChCODH IV 0
TsFDH ToCODH 0
그 결과, 상기 표 1에서 볼 수 있듯이 오직 MeFDH I을 FDH로 이용한 경우만 개미산 생성 결과를 보였으며, 다른 FDH는 전혀 개미산 생성이 측정되지 않았다. 이를 미루어 볼 때 모든 FDH가 CO 수화반응을 촉매로 작용할 수는 없으며, 특정 FDH만이 이러한 작용을 할 수 있음을 알 수 있었다.
다만 CODH는 시험된 모든 CODH에서 개미산이 생성되는 것을 확인할 수 있으나, 본 실시예에서는 ChCODH II가 가장 우수한 개미산 생성 능력을 보였다. 따라서 이 후 실시예에서는 MeFDH1과 ChCODH II를 기본 효소로 사용하여 실험을 진행하였다.
실시예 4: 전자전달체 종류에 따른 개미산 생산 비교
실시예 3에서 실행한 조건에서 효소를 ChCODH-II와 MeFDH I을 이용하고 다양한 전자전달체를 이용하여 실험을 실시하였으며 그 결과를 하기 표 2에 표시하였다(반응 2시간 후 개미산 농도 측정).
전자전달체 종류 개미산 생산 농도 (mM)
Methyl viologen (MV) 38
Ethyl viologen (EV) 40
Benzyl viologen (BV) 0
nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 0
Flavin adenine dinucleotide (FAD) 0
그 결과, 상기 표 2에서 볼 수 있듯이 전자전달체의 종류에 따라서도 CO 수화반응을 매개하는 성능차이가 매우 큰 것을 볼 수 있었다. 이러한 차이는 도 2에서 나타난 자유에너지 변화를 살펴보면 설명이 가능하였다.
도 2에서 볼 수 있듯이 BV, NAD의 경우에는 CO 산화반응에는 매우 유리한 열역학적 상태를 보이나 CO2가 환원되어 개미산이 되는 반응은 도리어 자유에너지가 증가되기에 열역학적으로 불리하게 되는 반면, EV의 경우는 CO 산화와 CO2 환원 모두 지속적으로 자유에너지가 감소하게 되기에 열역학적으로 개미산 생산이 자발적으로 유리하게 된다고 해석할 수 있었다.
실시예 5. ChCODH-II 와 MeFDH-I 의 최적 활성 조건 분석
CO 수화 반응이 하나의 조건하에서 이루어져야 하기에 두가지 효소의 활성이 반응 조건에 받는 영향을 고려하여 초기 효소의 투입 활성을 결정하는 것이 필요하였다. 그렇지 않으면 효소 간의 활성 불균형으로 원활한 개미산 생성이 어려울 수 있었다. 이를 해결하기 위하여 도 3에서와 같이 수소이온농도(pH)에 변화에 따른 활성을 측정하여 표기하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이 알칼리 조건하에서는 ChCODH II(검은색)의 활성이 올라가나 MeFDH I(빨간색)의 활성은 급격히 감소함을 확인하였다. CO2의 경우 수중에 용해될 때 pH 6.5 이상에서는 CO2 상태로 존재하지 못하고 중탄산이온이나 탄산 이온의 형태로 존재하며, 이러한 이온화된 형태의 이산화탄소 분자는 MeFDH1에 의하여 개미산으로 전환이 어려웠다. 따라서 반응 pH는 6.5 이하로 유지되어야 하는 데, 이 때 ChCODH-II의 활성의 급격한 감소가 있기 때문에 이를 고려하여 CO 수화반응을 pH 6.5 이하의 환경 하에서 실행할 경우 초기 ChCODH-II의 투입 활성을 크게 하여 진행하여야 원활한 개미산 생산을 기대할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. 100 mL 기포 탑 반응기에서 연속적으로 CO 함유 기체를 주입할 때 생성되는 개미산의 시간 별 농도 증가
지속적인 혼합 가스(50% CO, 50% CO2 가스 사용) 유입과 pH 조정을 하며(pH 6.5로 설정, 2 N NaOH로 적정함) 100 mL 기포 탑 반응기를 운용하였다.
그 결과, 최종적으로 1 M이 넘는 개미산이 ChCODH II와 MeFDH I에 의해 촉진되는 CO 수화 효소 반응으로 생산되었다(도 4).
실시예 7. 투입되는 CO 포함 기체 유량 증가에 따른 CO 수화반응기에서의 개미산 생산성 변화 시험
실시예 6의 조건하에서 투입되는 기체의 유량을 증가시켜 가면서 개미산 생산성을 측정한 결과를 하기 표 3에 나타내었다(반응기 부피 100 mL 이용). 투입되는 기체에 포함된 일산화탄소는 수중에 용해된 후 CO 수화 반응에 관계되는 효소들에 의하여 개미산으로 전환되었다.
표 3에서 볼 수 있듯이 기체의 유량을 증가시키면, 기체에서 용액으로 용해되어 전달되는 CO 물질전달속도가 커져서 이를 이용하여 개미산이 생성되는 속도 역시 커짐을 알 수 있다.
기체 투입 유량 (mL/min) 개미산 생성 속도 (mM/hr)
200 10
500 43
1,000 78
실시예 8. 제철산업 실제 배출 폐가스 이용 개미산 전환 시험
실시예 5와 같은 실험을 진행할 때 기존 순수 CO 포함 가스 대신에 실제 제철산업에서 배출되는 폐가스를 이용하여 CO 수화반응을 수행하였다. 이를 위하여 사용된 실제 제철산업 배출 폐가스 (LDG)의 가스 조성 성분을 분석하여 하기 표 4에 나타내었다. 하기 표 4를 보면 주 함유 조성 성분은 CO, CO2임을 알 수 있으며 기타 알기 어려운 소량의 다양한 화합물이 포함되어 있음을 알 수 있었다.
포함 물질 함량 (%)
CO 53.17
CO2 18.51
H2 1.43
O2 0.11
N2 26.77
기타 0.01
실시예 5와 같이 상기 표 4의 조성을 가지는 실제 제철산업 폐가스를 이용하여 개미산 생성을 실험한 결과 도 5와 같았다. 도 5를 살피면 실제 폐가스의 경우 약간의 개미산 생성 속도가 느리나 거의 순수 조제 가스의 경우와 유사하게 개미산이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 도 5의 실험 결과를 통하여 폐가스에 포함된 미지의 성분들에 의하여 CO 수화 반응에 관계하는 효소들의 활성이 크게 저하되지 않고 원활하게 유사한 수준으로 개미산이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 사용된 효소의 반복 사용을 통하여 CO 수화 반응 효소의 재사용성 확인
실시예 7에서와 같은 조건하에서 반복적으로 효소를 사용할 수 있는 지를 확인하였다.
그 결과, 도 6에서 나타낸 바와 같이 효소를 반복하여 실제 제철산업 발생 가스에 적용한 경우에도 효소의 활성 저하가 거의 관찰되지 않고 개미산이 생성되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명에서 제안한 효소들이 매우 안정하여 상당히 상업적 적용성이 높은 상태로 전 처리없이 제철산업 발생 폐가스를 개미산으로 전환할 수 있음을 나타낸다.

Claims (24)

  1. 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 개미산 제조용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 카르복시도써머스속(Carboxydothermus sp.) 및 써모코커스속(Thermococcus sp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 속의 미생물 유래인, 개미산 제조용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소 II, 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소 IV 및 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus) 유래 일산화탄소 탈수소효소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 일산화탄소 탈수소효소인, 개미산 제조용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 포름산 탈수소효소는 메틸로박테리움속(Methylobacterium sp.), 싸이오바실러스속(Thiobacillus sp.) 및 로도박터속(Rhodobacter sp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 속의 미생물 유래인, 개미산 제조용 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 포름산 탈수소효소는 메틸로박테리움 엑스토쿠엔스(Methylobacterium extorquens) 유래 포름산 탈수소효소 I, 싸이오바실러스속(Thiobacillus sp.) KNK65MA 유래 포름산 탈수소효소 및 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobacter capsulatus) 유래 포름산 탈수소효소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 포름산 탈수소효소인, 개미산 제조용 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 전자전달체를 더 포함하는 개미산 제조용 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 전자전달체는 메틸 바이올로젠(Methyl viologen), 에틸 바이올로젠(Ethyl viologen), 벤질 바이올로젠(Benzyl viologen), NAD(nicotinamide adenine dinucleotide) 및 FAD(Flavin adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 전자전달체인, 개미산 제조용 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물 내 상기 일산화탄소 탈수소효소 및 상기 포름산 탈수소효소는 1:1 내지 1:3의 비율로 존재하는 것인, 개미산 제조용 조성물.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 조성물의 pH는 5.0 내지 8.0인, 개미산 제조용 조성물.
  10. 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자 제거용 조성물.
  11. 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 폐가스 처리용 조성물.
  12. 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 공기 정화용 조성물.
  13. 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 개미산 제조용 장치.
  14. 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자 제거용 장치.
  15. 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 폐가스 처리용 장치.
  16. 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 공기 정화용 장치.
  17. 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)를 포함하는 필터.
  18. 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 개미산의 제조 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 가스를 일산화탄소 탈수소효소에 접촉시키는 단계; 및
    상기 일산화탄소 탈수소효소와 접촉된 가스를 포름산 탈수소효소에 접촉시키는 단계로 이루어진 것인, 개미산의 제조 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 가스는 연속적으로 공급되는 가스인, 개미산의 제조 방법.
  21. 청구항 18에 있어서, 상기 가스는 전자전달체와 동시에 일산화탄소 탈수소효소 및 포름산 탈수소효소에 접촉되는 것인, 개미산의 제조 방법.
  22. 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 제거하는 방법.
  23. 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 폐가스 처리 방법.
  24. 일산화탄소 및 이산화탄소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 포함하는 가스(gas)를 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase) 및 포름산 탈수소효소(Formate dehydrogenase)에 접촉시키는 단계를 포함하는 공기 정화 방법.
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