KR20020001519A - 아세트산의 전기화학적 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생촉매를 사용하여 전기화학적으로 이산화탄소로부터 아세트산을 제조하는 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 아세트산을 생성시키는 균체 및 상기 균체로 부터 추출된 여러가지 효소를 사용하여 전기화학적으로 이산화탄소로부터 아세트산을 제조하는 방법에 대한 것이다.

Description

아세트산의 전기화학적 제조 방법{ Electro-chemical Preparation of Acetic acid}

본 발명은 생촉매를 사용하여 전기화학적으로 이산화탄소로부터 아세트산을 제조하는 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 아세트산을 생성시키는 균체 및 상기 균체로 부터 추출된 여러가지 효소를 사용하여 전기화학적으로 이산화탄소로부터 아세트산을 제조하는 방법에 대한 것이다.

온실효과의 주범으로 지목되는 이산화탄소는 현재 환경라운드 등의 국제적인 제약과 규범속에 포함되며, 이의 처리 및 감축은 국가적으로 시급한 상황에 있다. 특히 우리나라와 같이 지속적으로 산업이 성장하는 나라의 경우에는 이산화탄소 배출량 감소를 위한 이산화탄소의 처리 및 변환에 관한 기술 개발은 시급한 형편이다.

따라서 이산화탄소를 화학적으로 메탄올, 연료등으로 변환시키는 방법 (Masuda, S. Energy Conv. Mgmt. 1995, 36, 567-572; Kakumoto, T. Energy Conv. Mgmt. 1995, 36, 661-664; Souma, Y.; Ando, H.; Fujiwara, M.; Kieffer, R. Energy Conv. Mgmt. 1995, 36, 593-596), 생물학적으로 유기물로 변환시키는 방법 등이 활발히 연구되고 있다(Michiki, H. Energy Conv. Mgmt. 1995, 36, 701-705; Murakami, M.; Ikenouchi. M. Energy Conv. Mgmt. 1997, 36, S493-S497).

또 다른 방법 방법으로 전기화학적인 환원에 의해 유용한 유기물로 변환시키는 것인데, 무기화합물, 효소 등이 반응의 촉매로 이용되고 있다.

예를 들어, 효소를 이용하여 이산화탄소를 전기화학적으로 변환시킨 경우는 이소시트르산 탈수소효소(Isocitrate Dehydrogenase; ICDH)를 이용하여 이산화탄소를 옥소글루타르산(oxoglutaric acid)에 결합시켜 이소시트르산(isocitric acid)을 생성시킨 경우(Sugimura, K.; Kuwabata, S.; Yoneyama, H. J.Am. Chem. Soc. 1989,111,2361-2362), 피루브산 탈수소효소(Pyruvate Dehydrogenase;PDH)를 이용하여 피부르산(pyruvic acid)으로(Kuwabata, S., Morishita, N., Yoneyama, H.,Chem. Lett.1990, 1151-1154), 개미산 탈수소효소(Formate Dehydrogenase;FDH)와 메탄올 탈수소효소(Methanol Dehydrogenase;MDH)를 이용하여 개미산(formate)이나 메탄올로 변환시킨 예(Kuwabata, S., Tsuda, R., Yoneyama, H.,J. Amer. Chem.Soc.1994,116, 5437-5443), 일산화탄소 탈수소효소(Carbon MonoxideDehydrogenase;CODH)를 이용하여 일산화탄소로 변화시킨 예(신준원 석사학위논문, 서강대학교 1998, 이상희 석사학위논문, 서강대학교 1997)가 보고되어 있다.

그러나, 상기와 같이 효소를 이용한 이산화탄소의 전기화학적인 변환은 아직 학문적 차원의 연구에만 머물러 있을 뿐, 상용화되거나 현장에서의 적용은 전무한 상황이며, 효소를 이용하여 이산화탄소를 전기화학적 방법으로 직접 아세트산으로 변환시킨 예는 알려진 바가 없다.

현재까지, 아세트산을 공업적으로 제조하는 방법 중 몬산토(Monsanto) 공정의 메탄올 카보닐화를 통한 방법은 경제적인 측면에서 가장 성공적인 공정으로 알려져 있으나(Forster, D. J. J. Am. Chem. Soc. 1976, 98, 846-848; Forster, D. J. Adv. Organomet. Chem. 1979, 17, 255-266) 촉매로 사용되는 로듐의 높은 가격과 히드로포르밀레이션(hydroformylation)공정의 부반응 때문에, 원료나 유틸리티의 손실이 적으면서도 원부재료의 재활용이 가능한 새로운 공정의 개발이 요구되고 있다.

따라서, 상기 몬산토 공정의 개량법에 대한 다양한 연구가 진행되고 있는 바, 예를 들면, 메탄올의 카보닐화에 대해서 rhodium-based 촉매의 활성과 안전성에 대한 연구(Blasio, N. D.; Tempesti, E.; Kaddouri, A.; Mazzocchia, C.; Cole-Hamilton, D. J. J. Cat. 1998, 176, 253-259; Blasio, N. D.; Wright, M. R.; Tempesti, E.; Mazzocchia, C.; Cole-Hamilton, D. J. J. Organomet. Chem. 1998, 551, 229-234; Protzmann, G.; Luft, G. Appl. Cat. A: Gen. 1998, 172, 159-163), 메탄올을 구리 산화 전극 위에서 전기화학적으로 카보닐화 시키는 경우(Kiyoshi,O.; Toshikazu, Y.; Ichiro, Y. J. Electrochem. Soc. 1995. 142, 130-135), 그리고 니켈 합성물(nickel complex)를 이용해서 메탄올을 카보닐화 시키는 경우(Kellar, A. A.; Ubale, R. S.; Deshpande, R. M.; Chaudhari, R. V. J. Cat. 1995, 156, 290-294; Moser, W. R.; Marshik-Guerts, B. J.; Okrasinski, S. J. J. Mol. Cat. A; Chem. 1999, 143, 71-83) 등의 연구가 보고된 바 있다.

한편, 생물학적인 방법으로 아세트산을 제조하는 방법의 연구가 진행되고 있는 바, 예를들면, 클로스트리디움 계열의 박테리아를 이용하여, 아세트산을 제조하는 방법으로서 폐가스(Waste gas)나 생체 폐기물(waste biomass)을 아세트산으로 전환시키는 방법, 효과적인 발효법이나 효소(fermenter)의 개발, 돌연변이를 통한 환경에 적응한 변종 개발, 클로스트리디움 써모아세티쿰(Clostridium thermoaceticum)을 통해 일반 유기물질 전환 등 다양한 연구가 진행되고 있다(Gaddy. J. L. US Patent. 5,593,886, January 14, 1997; Grady. J. L.; Chen. G. J. US Patent. 5,821,111, October 13, 1998; Gaddy. J. L. US Patent. 5,807,722, September 15, 1998; Schwartz. R. D. US Patent. 4,371,619, February 1, 1983; Brumm. P. J.; Datta. R. US Patent. 4,814,273, March 21, 1989; Gaddy. J. L.; Clausen. E. C. US Patent. 5,173,429, December 22, 1992). 그러나 이산화탄소를 원료물질로 사용하여 아세트산을 제조하는 방법은 현재까지 보고된 바 없다.

따라서, 당업계에는 온실효과의 주범으로 지목되고 있는 이산화탄소를 처리함과 동시에 상기 이산화탄소를 원료로 하여 산업상 유용한 물질인 아세트산으로변환시키는 신규한 방법의 개발이 시급하게 요청되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 이산화탄소를 원료로 하여 아세트산을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이산화탄소를 처리함에 있어서, 생촉매를 이용하여 환경 오염 문제를 최소화 하면서도 이산화탄소에서 직접 아세트산으로 변환시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기화학적인 방법을 통하여 이산화탄소를 아세트산으로 전환시키는데 사용되는, 전자전달체와 균체가 서로 공유결합을 통하여 연결된 균체/전자전달체 결합체를 제공하는 것이다.

도 1의 A는 박테리아 아세트산 합성의 아세틸-CoA 또는 Wood 경로

도 1의 B는 본 발명에 의한 전기화학적 이산화탄소의 환원경로를 보여주는 개념도

도 2는 CO₂의 전기화학적 환원 및 생성물 분석을 위한 실험장치의 개략도

도 3은 순환전압전류 및 전기분해를 위한 전기화학적 셀의 개략도

도 4는 실온에서 CODH 활성 DEAE 분획에 의한 CO₂환원의 순환전압전류그림

도 5는 실온에서 수행한 본 발명의 일 실시예에 의한 아세트산 생성 그래프

도 6은 55℃에서 CODH 활성 DEAE 분획에 의한 CO₂환원의 순환전압전류그림

도 7은 55℃에서 수행한 본 발명의 일 실시예에 의한 아세트산 생성 그래프

도 8은 55℃의 다른 조건에서 수행한 본 발명의 일 실시예에 의한 아세트산 생성 그래프

도 10은 클로스트리디움 써모아세티쿰 조추출물에 의한 CO₂환원의 순환전압전류그림

도 11은 55℃에서 클로스트리디움 써모아세티쿰 조추출물을 이용하여 수행한본 발명의 일 실시예에 의한 아세트산 생성 그래프

도 12는 55℃에서 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체에 의한 CO₂환원의 순환전압전류그림

도 13은 55℃에서 수행한 본 발명의 일 실시예에 의한 CO₂의 전기분해

도 14는 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체에 DAPV를 연결시키는 개념도

도 15는 55℃에서 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체에 연결된 DAPV에 의한 CO₂환원의 순환전압전류그림

도 16은 55℃에서 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체에 연결된 DAPV 존재하의 CO₂의 전기분해 그래프

상기와 같은 본 발명의 목적들은 아세트산을 형성하는 균체 및/또는 상기 균체로 부터 추출된 여러가지 효소를 사용하여 전자전달체 존재하에서, 전기화학적으로 이산화탄소를 아세트산으로 변환시킴으로써 달성된다.

본 발명의 방법의 화학식을 나타내면 아래와 같다.

2 CO₂+ 8 H⁺+ 8 e^----------> CH₃COOH + 2 H₂O

본 발명의 방법의 출발물질은 이산화탄소이며, 촉매는 일산화탄소 탈수소효소이다. 바람직하게는, 적절한 전자전달체가 사용되며, 전극을 통하여 전류가 공급되는 것이 적절하다. 본 발명의 방법에 촉매로 사용되는 일산화탄소 탈수소효소는 다양한 미생물로부터 얻어질 수 있으며, 클로스트리디움 써모아세티쿰으로 부터 분리된 것이 특히 적합하다.

상기 클로스트리디움 써모아세티쿰은 혐기성이며 호열성 박테리아로서, 혐기적 조건에서 성장하며 아세트산만을 생성하는 호모아세토젠이다. 또한 이산화탄소와 잘 결합하여 반응성을 좋게하므로 이산화탄소에서 아세트산으로 환원시 요구되는 활성화 에너지를 낮추는 촉매로써 사용하기에 바람직하다.

클로스트리디움 써모아세티쿰은 한 분자의 글루코오스(C6)로 부터 세 분자의 아세트산(C2)을 생성시키는데, 이는 글루코오스(C6)를 먼저 두 분자의 피루브산(C3)으로 분해시킨 후 각각 한 분자의 아세트산(C2)과 한 분자의 이산화탄소(C1)를 생성시키는 과정에 따른 도합 두 분자의 아세트산을 생성하는 호기성 미생물 및 대부분의 생물들의 대사과정과는 다른 결과를 나타낸다.

클로스트리디움 써모아세티쿰등의 혐기성 미생물은 두 분자의 이산화탄소로부터 환원 및 탄소-탄소 결합 형성에 의해 아세트산을 생성하는 아세틸-CoA 경로 혹은 Wood 경로라 알려진 경로가 존재하기 때문이고, 상기 경로에서 중요한 역할을 하는 효소는 일산화탄소 탈수소효소(CODH)로서 이산화탄소와 반응성이 좋은 니켈(Ni), 철(Fe)등으로 이루어진 활성 자리를 갖고 있는 금속이온 함유 효소(metallo-protein)이다. 일산화탄소 탈수소효소 (CODH)는 이산화탄소의 일산화탄소로의 환원 뿐 아니라 여러 가지 다른 효소들에 의해 형성되어 전달되는 메틸기와 이산화탄소의 환원에 의해 생성된 일산화탄소를 CoA와 같이 결합시켜 아세트산의 전구체인 아세틸-CoA를 합성해 내는데 가장 중요한 역할을 하는 효소로서,ACS(Acetyl-CoA Synthase)라 부르기도 한다. (Ragsdale, S. W.; Clark, J. E.; Ljungdahl, L. G.; Drake, H. L. J. Biol. Chem. 1983, 258, 2364-2369; Diekert, G.; Ritter, M. FEBS Lett. 1983, 151, 41-44; Pezacka, E.; Wood, H. G. J. Biol. Chem. 1988, 263, 16000-16006; Ragsdale, S. W. Biochem. & Mol. Biol. 1991, 26, 261-300; Barondeau, D. P.; Lindahl, P. A. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 3959-3970).

클로스트리디움 써모아세티쿰 및 일산화탄소 탈수소효소(CODH)는 50 내지 60℃에서도 안정하고, 고온에서 오히려 좋은 촉매 효과를 나타내며 전극 반응 등에 의해 열이 발생하더라도 문제되지 않는 장점을 가지고 있다.

또한 공장에서 배출되는 배기가스에는 항상 황화합물이 포함되어 있어 배기가스의 처리시 그 다음 공정에서 사용되는 촉매를 쉽게 불활성시켜 버리는데, 클로스트리디움 써모아세티쿰 및 이로부터 추출된 효소들은 황화합물에 대하여 내성을 가지고 있기 때문에 황화합물 때문에 이산화탄소 혹은 일산화탄소의 처리에 문제가 되는 경우에 유용하게 쓰일 수 있다.

또한, 상기 미생물은 일산화탄소(CO) 및 수소(H₂)에도 좋은 활성이 있기 때문에 이산화탄소(CO₂), 일산화탄소(CO), 수소(H₂)의 혼합형태로 나오는 공장배기 가스를 직접 이용할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 전자전달체는 전극과 생촉매 사이의 전자 전달을 용이하게 하기 위한 것으로써, - 300 mV 내지 - 700 mV(NHE:Normal HydrogenElectrod 기준)의 전위에서 가역적인 환원/산화 반응이 일어나는 물질을 사용할 수 있으며, 특히 이산화탄소의 환원전위와 비슷한 물질이 바람직하며, 예를 들면 메틸 바이올로겐(methyl viologen or N, N-dimethyl-4,4'-bipyridyl) 또는 이의 유도체를 포함하는 알킬 바이올로겐 화합물이 바람직하다.

메틸 바이올로겐의 환원전위(E0 = - 440 mV)는 이산화탄소의 환원전위(E0 = - 480 mV at pH 6.3)와 가까워 이산화탄소의 환원과정의 전자전달체로 적합하다. 본 발명의 방법에 전자전달체로 사용될 수 있는 물질은 테트라메틸 바이올로겐 (tetramethyl viologen), N,N-디에틸-4,4'-비피리딜(N,N-diethyl-4,4'-bipyridyl), N,N-디이소프로필일-4,4'-비피리딜(N,N-diisopropylyl-4,4'-bipyridyl), triquat등의 4,4'-비피리딜(4,4'-bipyridyl) 구조에 알킬기가 연결된 것들이다.

메틸 바이올로겐은 전극표면에서 전자를 받아 MV²⁺가 MV⁺로 환원되고 다시 MV⁺가 클로스트리디움 써모아세트쿰 균체 자체 또는 산화 형태의 CODH와 관련된 효소들에게 전자를 전달하여 다시 환원형태가 된다. 환원형의 효소들은 다시 산화되면서 이산화탄소를 일산화탄소로 환원시키며 탄소-탄소 결합의 형성 등 여러 반응을 거쳐 아세트산이 만들어지게 된다.

또한 본 발명은 일산화탄소 탈수소효소를 포함하는 군체를 촉매로 사용하여 이산화탄소를 아세트산으로 전환시키는 방법에 대한 것이다. 이 방법은 균체로부터 일산화탄소 탈수소효소 및 조효소를 분리해내지 아니한 채 배양된 균체 자체를 촉매로 사용한다는 점에서 효소 분리 공정을 거치지 아니하고 필요한 촉매를 얻을수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명은 일산화탄소 탈수소효소를 포함하는 균체에 전자전달체를 공유결합시킨 균체/전자전달체 결합체 및 이를 사용하여 이산화탄소를 아세트산으로 전환시키는 방법에 대한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리의 범위가 하기 실시예의 내용으로 한정되는 것은 아니다.

전기화학적 실험 장치 및 실험 방법

일산화탄소를 전기화학적으로 환원시키는 CODH(Carbon Monoxide Dehydrogenase, 일산화탄소 탈수소효소)와 같이 클로스트리디움 써모아세티쿰에 내포된 여러 효소들 및 클로스트리디움 써모아세티쿰은 미량의 산소에 의해서도 활성에 치명적인 손상을 입는다. 따라서 본 발명에서 행해지는 모든 전기 화학 실험은 장갑 상자(glove box, Vacuum Atmosphere Co, HE-243-2, MO-20-SSG purifier)안에서 진행시켰다(도2 참조).

전기분해 셀은 불순물에 의한 영향이 가장 작도록 작업전극, 기준전극이 바이코 유리로 대전극과 분리된 2-compartment 셀을 사용하였다(도 3). 작업전극이 있는 쪽은 효소와 MV²⁺(methyl viologen)이 녹아 있는 pH=7.0, 0.1 M 인산완충용액 7.0 mL로 구성하였다. 작업전극으로서 금전극을 사용하였는데, 깃발모양(16 mm x 6 mm)전극과 원판 전극(직경 2 mm)의 두 가지를 사용하였다.

전극은 도 3에 있는 것처럼 O-링(ring)이 있는 어댑터(adaptor)를 사용하여기체가 새어 나가거나 들어오지 않도록 셀에 연결하였다. 이산화탄소는 주사바늘을 이용하여 그림에 나타난 격막(septum)을 통해 포화시켰다. 이때 용액의 pH는 이산화탄소로 포화시켰을 때 녹아 들어간 이산화탄소에 의하여 7.0에서 6.3으로 떨어졌다.

대전극이 있는 쪽은 0.1M 인산 완충용액(pH 7.0)으로만 채우고 같은 방법으로 이산화탄소로 채워주었다. 나선형의 니크롬선( 지름 0.6 mm, 길이 20 cm)을 대전극으로 사용하였고 작업전극이 있는 쪽과 마찬가지로 O-링(ring)이 있는 어댑터(adaptor)를 이용하여 셀에 연결하였다. 기준전극은 Ag/AgCl(3M NaCl, BAS)을 사용하였으며, 이 기준 전극은 + 0.200 V vs. NHE로서 본 발명에서 모든 전위는 NHE를 기준으로 표시하였다.

용액의 pH를 변화시키고자 할 때에는 이산화탄소로 포화된 인산완충용액에 2.5 M H₃PO₄, 혹은 2 M KOH를 사용하여 조절하였다. 온도를 변화시켜야 할 경우에는 장갑 상자 내에서 파라핀 오일 배스(paraffin oil bath)를 설치하여 핫 플레이트(hot plate)로 온도를 조절하였다.

반응생성물의 정성 및 정량분석

전기분해 중 생성되는 아세트산 및 유기산 등 수용액상의 물질을 분석하기 위해 LC(Liquid chromatography)를 사용할 경우에는 기체 밀폐 주사기(gas tight syringe)를 사용하여 20 ㎕씩 취하였고, 프로피온산(propionic acid)을 내부 기준 용액으로 사용하여 정량하였다.

시료는 주사기 필터(Whatman PVDF) 또는 centricon을 이용하여 단백질을 제거하였다. 이때 사용된 액체 크로마토그래피는 YoungIn Model 910이었고, 40℃로 온도를 맞춘 Shodex, RSpak KC-811(7.8 x 300 mm) 칼럼과 UV detector (215 nm, YoungIn M-720)를 사용하였고, 0.05 M H₂SO₄용액으로 1.0 mL/분의 속도로 용출하였다.

아세트산은 또한 GC(Gas chromatography; HP5892, FFAP column, FID detector)로도 정량하였는데, LC의 결과와 유사한 결과를 보였다.

또한, CO₂, CO 등 기체상 생성물 및 반응물은 기체 크로마토그래피(Varian 3700, Pora Q column, thermal conductivity detector)를 이용하여 분석하였다. 시료는 가스 밀폐 주사기를 사용하여 100∼200 ㎕ 씩 장갑 상자 안에서 채취한 후 밖으로 가지고 나와 GC에 주입했다. 정량을 위해서는 미리 측정한 CO 검정선을 이용하였다.

실시예 1 : 클로스트리디움 써모아세티쿰의 배양 및 CODH의 활성 부분의 정제

클로스트리디움 써모아세티쿰(ATCC 35608)는 이미 잘 알려진 혐기적 배양법(Lundie, L. L. Jr.; Drake, H. L. J. Bacteriol. 1984, 159, 700-703)을 이용하였으며, 균체의 수집시에도 산소가 닿지 않도록 O-링(ring)이 있는 원심분리병과 장갑상자를 이용하였다.

효소의 정제는 이미 공지된 방법(Ragsdale, S. W., Clark, J. E.,Ljungdahl, L. G., Drake, H. L.J. Biol. Chem. 1983,258, 2364-2369; Shin, W., Lindahl, P. A.Biochim. Biophys. Acta 1993,1161, 317-322)에 따라 수행하였다.

먼저 수집된 균체를 장갑상자 안에서 초음파 분쇄기로 균체를 분쇄한 후 수용성의 조추출물(crude extract)을 얻은 후 조추출물을 음이온교환용 DEAE(디에틸아미노에틸) 세파셀 칼럼으로 정제하였다.

본 실시예에서 사용한 CODH 및 다른 효소들은 DEAE 세파셀 칼럼을 이용하여 분획한 CODH 활성이 나타나는 모든 용리액을 모은 것이다.

실시예 2 : 상온에서 DEAE 분획을 이용한 이산화탄소의 환원

어떤 물질이 산화/환원 반응의 촉매로 작용하는지는 순환 전압전류실험(CV, Cyclic Voltammetry)을 통하여 관찰할 수 있다. 만약 촉매로 작용한다면 이와 관련된 산화/환원 전위의 위치가 활성화 에너지가 감소하는 방향으로 이동할 것이고(전기화학적으로 환원의 경우에는 전위가 높아지는 방향, 즉, + 방향으로 이동함.), 같은 전위에서 더 큰 환원전류가 흐를 것이다.

CODH 활성이 있는 DEAE 분획이 이산화탄소의 전기화학적인 환원반응에 있어서 촉매로 작용하는지에 대해 순환전압전류(CV)를 비교하여 알아보았다(도 4).

질소 분위기 하에서는 -400 내지 -500 mV 근처에서, 전자전달체인 MV²⁺만의 전형적인 가역적인 형태의 환원/산화 모양을 보인다. -600 mV 근처부터 증가하는 전류는 주로 용매인 물이 수소로 환원되는 바탕전류(background current)이다. 이용액을 이산화탄소로 포화시키면 MV²⁺의 환원 전류가 약간 증가하는 것이 관찰되고, -600 mV부터 그 이하의 전류가 많이 증가하는 것이 관찰된다. 이는 1) 이산화탄소가 CODH 등의 효소에 의해 환원되는 전류와 2) 이산화탄소의 포화에 따른 용액의 pH의 감소(질소분위기에서는 pH = 7.0인데, 이산화탄소를 포화시키면 pH = 6.3으로 떨어짐)에 따른 수소 생성 전류의 증가가 섞인 현상이다.

두 번째 반응인 수소의 생성은 전위가 낮을수록(음전위 쪽으로 갈수록) 훨씬 많은 부분을 차지하게 되며, -550 내지 -600 mV 근처의 전위에서는 수소의 생성 없이 이산화탄소의 효소에 의한 환원만 일어난다. 상기한 바와 같이 -600 mV 이하의 음전위에서는 부반응인 수소의 발생이 많이 일어나게 되므로, 전기분해 전위는 효소의 촉매효과에 의한 이산화탄소의 환원만 일어나는 영역에서 -550 내지 -600 mV를 선택하였다.

효소를 이용한 이산화탄소의 환원은 메틸 바이올로겐을 매개로 한 전자전달반응이므로 충분한 양의 MV²⁺가 MV⁺로 환원된 후에야 CODH를 환원시킬 수 있을 것이므로 초기에 흐르는 전하량은 이산화탄소의 환원과 관련되지 않은 MV²⁺의 환원이 포함되어 있게 된다. 따라서, MV²⁺의 환원에 초기의 전하량이 사용되기 때문에 이 부분을 보정한 후, 아세트산의 생성에 대한 전류 효율등을 계산하였다. 전기분해 하면서, 시간에 따라 흐른 전하량을 측정하고 반응생성물을 분석한 결과는 도 5에 나타내었다.

LC 및 GC로 액체상을 정량한 결과 이산화탄소가 환원되면서 흐르는 전하량과 비례하여 아세트산의 농도가 증가함을 관찰할 수 있었고, 다른 부반응에 의한 물질들은 검출되지 않았다. 흐른 전하량과 생성된 아세트산의 양으로부터 전류 효율을 계산하였더니, 약 95 내지 100 % 정도로 매우 높게 나왔다. 이것은 CODH 활성이 있는 DEAE 분획이 선택적으로 이산화탄소를 아세트산으로 환원시켜 주는 좋은 촉매 시스템임을 확인시켜 주는 데이타이다. 전류효율 계산 등의 정량적인 결과는 표 1에 나타내었다.

아세트산의 생성은 초기 한 시간 정도는 직선적으로 증가하여 7 mM 정도의 농도에 이른 후 더 이상 증가되지 않는 것으로 관찰된다. 이는 아세트산 생성에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 CODH가 MV⁺등이 존재하는 환원 상태의 조건에서 불안정해지며 효소 효과를 잃기 때문이다. 상온에서는 초기 30분 동안 4.3 mM의 아세트산이 생성되었으므로, 4.3 (mM) x 7.0 (mL) / 30 (min) = 1.0 μmol/min 의 속도로 아세트산이 생성됨을 알 수 있다.

실온에서 CO₂포화 0.1 M 인산완충액 7.0mL 에서 1.0mM MV²⁺, CODH 활성 DEAE 분획 단백질 12 mg/mL를 이용하여 -550 mV vs. NHE에서 CO₂를 전기분해하였을 때 사용된 전하량과 생성된 아세트산 양 및 이로부터 계산된 전류 효율

시간(분)	생성된 아세트산의 양 (mM)	전하량(C)	전류효율(%)
10	1.8	9.78	99.1
20	2.8	15.7	96.2
30	4.3	25.1	96.8
60	5.4	30.7	95.1
120	5.9	32.6	97.9
180	6.4	34.7	99.7

실시예 3 : 55 ℃에서 DEAE 분획을 이용한 이산화탄소의 환원

클로스트리디움 써모아세티쿰은 고열성 미생물로서 생장의 최적 조건이 55 ℃이기 때문에, 이 온도 조건에서 실시예 2의 실험을 반복하여 비교하였다.

순환전압전류(CV) 상으로 MV²⁺의 환원전류는 상온에 비하여 약 2 배정도 증가하며, 정량적인 비교는 어렵지만, 이산화탄소의 환원에 의한 촉매 전류도 증가함을 확인할 수 있다(도 6). 또한, 고온에서 반응이 쉬워지며 전위도 20 mV 정도 양의 방향으로 증가함을 관찰할 수 있었다.

-550 mV에서 전기분해하며 흐르는 전하량과 생성되는 아세트산의 양을 측정하여 비교하였다(도 7, 표 2). 전류효율 95 내지 100 % 정도로 이 경우도 선택적으로 아세트산이 생성됨이 확인되었고, 생성된 아세트산의 양은 25 mM 정도로서 상온에 비해 3 배 이상의 아세트산이 생성됨을 알 수 있었다. 초기 30분 동안 14.3 mM의 아세트산이 생성되었으므로, 14.3 (mM) x 7.0 (mL) / 30 (min) = 3.3 μmol/min 의 속도, 즉, 상온보다 3.3 배의 속도로 아세트산이 생성되었다. 상온과 고온에서 거의 비슷하게 1시간 이후에는 아세트산의 생성이 이루어지지 않는 것으로 미루어 보아, 효소의 활성도가 1시간이 지나면 거의 없어짐을 알 수 있고, 그 시간 내에 고온에서 아세트산의 생성 속도가 빠르기 때문에 그에 해당하는 양 만큼의 아세트산의 생성이 이루어지는 것으로 생각할 수 있다.

55℃에서 CO₂포화 0.1 M 인산 완충액 7.0mL에서 1.0mM MV²⁺, CODH 활성 DEAE 분획 단백질 12 mg/mL를 이용하여 -550 mV vs. NHE에서 CO₂를 전기분해하였을 때 사용된 전하량과 생성된 아세트산 양 및 이로부터 계산된 전류 효율

시간(분)	생성된 아세트산의 양 (mM)	전하량(C)	전류효율(%)
5	2.1	12.1	93.4
10	3.5	19.1	98.9
15	4.1	22.9	96.9
20	6.8	37.0	99.2
25	8.9	48.5	99.2
30	14.3	77.6	99.6
35	17.2	93.2	99.7
40	17.8	96.8	99.4
45	19.3	107	97.8
50	20.4	112	98.7
60	21.3	120	96.2
90	22.8	126	97.8
120	23.4	129	97.9
180	24.1	136	96.1

실시예 4 : 55 ℃, 0.1 mM MV ²⁺ 에서 DEAE 분획을 이용한 이산화탄소의 환원

메틸 바이올로겐이 효소를 불안정화시키므로 메틸 바이올로겐의 농도를 1/10로 낮춘 0.1 mM 용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일하게 실험하였다.

이산화탄소의 환원에 따른 촉매 전류의 흐름을 CV를 통해 확인할 수 있지만, 전자전달체의 농도가 작기 때문에 이에 비례하여 1/10 정도의 작은 전류가 흐름을 알 수 있었다(도 8). 마찬가지로 -550 mV에서 전기분해하여 보았는데, 흐르는 전하량이 1/5 정도인 것으로, 1 mM MV²⁺를 사용한 경우보다 전자전달이 효과적으로 일어나지 않음을 알 수 있었다(도 9, 표 3).

이상의 결과로 보아 낮은 농도의 MV²⁺를 사용하는 경우 효소의 안정도가 약간은 증가하는 것처럼 보이지만, 1시간 이후의 전하량 증가 속도가 미미함을 알 수 있다.

55℃에서 CO₂포화 0.1 M 인산완충액 7.0mL에서, 0.1mM MV²⁺, CODH 활성 DEAE 분획 단백질 12 mg/mL를 이용하여 -550 mV vs. NHE에서 CO₂를 전기분해 하였을 때사용된 전하량과 생성된 아세트산 양 및 이로부터 계산된 전류효율

시간(분)	생성된 아세트산의 양 (mM)	전하량(C)	전류효율(%)
5	0.8	5.1	97.0
10	1.2	7.3	98.2
15	1.8	10.2	97.4
20	3.1	17.4	99.2
25	3.5	19.5	98.3
30	4.1	23.4	97.2
35	4.4	24.9	96.9
40	4.8	27.3	97.1
45	5.2	29.8	96.3
50	5.7	32.4	98.2
60	6.1	34.5	97.2
90	6.4	35.8	95.3
120	6.8	37.4	98.4
180	7.2	40.4	97.3

실시예 5 : 상온에서 효소 조추출물을 이용한 이산화탄소의 환원

클로스트리디움 아세티쿰의 조추출물을 이용한 경우에도 이산화탄소의 환원에 의한 아세트산의 생성 가능성을 확인하였다.

순환전압전류(CV) 상으로 이산화탄소의 환원에 의한 촉매 전류가 흐르는지 거의 관찰할 수 없었지만(도 10), -580 mV에서 전기분해 하였을 때, 아세트산이 정량적으로 생성됨을 확인할 수 있었다(도 11, 표 4). 이 경우에 초기의 아세트산 농도는 32.5 mM로 크게 나타나는데, 이는 박테리아 세포를 centricon을 이용하여 완충용액으로 깨끗이 치환시킨 후, 초음파처리(sonication)에 의해 조추출물을 만들더라도, 세포 내에 머금고 있던 아세트산이 나오기 때문이다.

55℃에서 CO₂포화 0.1 M 인산완충액 7.0mL에서 1.0mM MV²⁺, 클로스트리디움 써모아세티쿰 조추출물 14 mg/mL를 이용하여 -550 mV vs. NHE에서 CO₂를 전기분해 하였을 때 사용된 전하량과 생성된 아세트산 양 및 이로부터 계산된 전류효율

시간(분)	측정된 아세트산의 양 (mM)	생성된 아세트산의 양(mM)	전하량(C)	전류효율(%)
20	33.1	0.6	3.31	96.7
30	35.8	3.3	19.0	93.7
60	36.7	4.2	23.1	98.3
120	37.1	4.6	25.4	98.0
180	37.9	5.4	30.1	97.0
300	38.1	5.6	31.2	97.1
350	38.4	5.9	32.4	98.5

실시예 6 : 용액상의 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체와 전자전달체를 이용한 이산화탄소의 아세트산으로의 전기화학적 변환

클로스트리디움 써모아세티쿰을 키우던 배지를 장갑 상자 안으로 들여온 뒤,클로스트리디움 써모아세티쿰 균체를 centricon(Amicon. Inc., Centricon YM-30, cut off 30,000)에 나누어 담고 0.1 M 인산 완충용액 (pH 7.0)을 이용하여 여러 번 세척해 주었다. 이렇게 세척된 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체에 소량의 0.1 M인산 완충용액(pH 7.0)을 넣고 균일하게 만들어 주었을 때 660 nm에서 측정된 O.D의 값은 1.8로서 0.61 g/mL의 균체가 있음을 알 수 있었다(이상희 석사학위논문 서강대학교 1997). 이 용액 1.00 mL를 취해 전기분해 셀에 담고 0.1 M 인산 완충용액 (pH 7.0) 3.00 mL를 넣어 전체 부피를 4.00 mL로 만든 이산화탄소 분위기 하에서 다음 균체와 완충용액이 잘 섞이도록 교반해 준 후, 순환전압전류그림을 관찰하였다(도 12). 이를 바탕으로 - 570 mV에서 4 시간 동안 전기 분해를 하였을 때 45C 의 전하량의 흐름을 알 수 있었고(도 13), 액체 크로마토그래피로 아세트산을 정량한 결과 전류 효율 92 %로 72 mM의 아세트산이 생성되었음을 확인, 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체로 전자 전달이 가능함과 이를 이용하여 이산화탄소를 전기화학적으로 변환시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 7: 전자전달체의 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체에의 연결 및 이를 이용한 이산화탄소의 아세트산으로의 전기화학적인 변환

본 실시예의 전자전달체로서 사용되어진 메틸 바이올로겐(MV)는 제초제나 제충제에 사용되는 것으로서 강한 독성을 가지고 있어 공정에 사용하게 되면 환경 문제를 유발시킬 뿐 아니라 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체의 활성을 떨어뜨리기 때문에 이 문제를 최소화하기 위해 균체에 메틸 바이올로겐(MV)을 직접 공유결합에 의해 연결시켜 보았다.

균체 표면에 아미노산의 카르복시기 그룹과 전자전달체의 말단부에 아민 그룹이 있다면 아미드 결합이 가능하게 되어 쉽게 균체에 전자전달체를 연결 시킬 수 있을 것이다(도 14). 그래서 본 실시예에서는 전자전달체인 메틸 바이올로겐(MV)의 말단부에 아민 그룹을 가지고 있는 디-(3-아미노프로필)-바이올로겐{Di-(3-aminopropyl)-viologen; DAPV)을 이용하였다. 이때 DAPV는 하기의 반응식 1과 같은 방법으로 합성하였다.

이는 메틸아미노프로필바이올로겐(methylaminopropylviologen)을 합성한 방법을 이용한 것이다(Katz, E.; de Lacey, A. L.; Fierro, J. L. G.; Palacios, J. M.; Fernandez, V. M. J. Electroanal. Chem. 1993, 358, 247-259). 4,4'-비피리딘 (4,4'-bipyridine) 10 mmol 을 3-브로모프로필아민 히드로브로마이드 (bromopropylamine hydrobromide) 22 mmol과 함께 30 mL의 아세토니트릴(acetonitrile) 용매상에서 12시간 동안 교반하며 환류시켜 주었다. 용매를 감압 제거 후 얻어진 DAPV 고체는 미량의 에탄올을 첨가한 후 과량의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)의 용매로 3회 재결정하였다.

다음으로 상기의 방법으로 제조되어진 DAPV를 균체에 연결시키기 위해 몇가지 과정을 거쳤는데 우선 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체를 centricon을 이용하여 0.1 M 인산 완충용액(pH 7.0)으로 세척하였다. 다음으로 균체의 카르복시기 그룹을 활성화시키기 위해 N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸 카르보디이미드{N-(3'-dimethylaminopropyl)-N'-ethyl carbodiimide;EDC} 1mM 용액에 넣어 30분 동안저어주었다. 다음으로 DAPV를 1mM가 되도록 넣고 균체와 잘 결합하도록 30분 동안 저어주었다. 그 다음 centricon을 이용하여 0.1 M 인산 완충용액(pH 7.0)으로 여러 번 세척해 주었다. 이렇게 얻어진 DAPV가 연결된 균체는 전기화학적으로 환원 및 산화가 일어나는 것을 순환전압전류법으로 확인할 수 있었다(도 15). 일반적으로 메틸 바이올로겐(MV)의 전압전류그림과 다른 모습, 즉 봉우리간의 전위차(△Ep)가 커지고, 환원/산화 전위가 양전위로 약간 이동한 모습이 관찰되는데, 이는 큰 분자량을 가진 균체의 확산한계에 의해 측정되는 전류이기 때문일 것이다. 즉, 산화/환원 반응은 균체에 연결된 DAPV에 의해 관찰되지만 확산한계전류는 균체 자체의 이동에 의한 것으로서 균체의 확산한계이동을 고정된 DAPV에 의해 간접적으로 측정한 것이다.

전기분해는 -610mV에서 실시하였는데 2시간 전기분해 하였을 때 흐른 전하량은 67C으로서(도 16), LC분석 결과 20 mM의 아세트산이 생성되었음을 확인하였다.

본 발명의 방법은 이산화탄소를 원료로 사용하고, 전극을 통하여 환원력을 제공받으며, 이산화탄소를 아세트산으로 환원시킬때의 큰 활성화 에너지를 낮추는 촉매로 생촉매를 사용하기 때문에 이산화탄소를 선택적으로 아세트산으로 변환시킬 수 있으며, 다량의 환원제를 사용해야 하는 종래의 방법에 비해 환경오염 문제를 최소화하면서도 높은 수율로 아세트산을 제조할 수 있다.

또한, 균체 자체를 이용하여 아세트산을 제조할 경우, 셀의 분쇄 및 컬럼을 통한 정제과정을 거치지 아니하므로, 공업적으로 생산할 때 비용 절감의 효과도 얻을 수 있다.

Claims (14)

1. 일산화탄소 탈수소효소와 전자전달체를 촉매로 사용하여 이산화탄소로부터 아세트산을 제조하는 하기 반응식의 아세트산 제조방법.

   2 CO₂+ 8 H⁺+ 8 e^----------> CH₃COOH + 2 H₂O
2. 제 1항에 있어서, 상기 일산화탄소 탈수소효소가 클로스트리디움 써모아세티쿰으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 아세트산 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 전자 전달체가 -300 내지 -700 mV의 전위에서 가역적인 환원/산화 반응이 일어나는 전자전달체인 것임을 특징으로 하는 아세트산 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 전자전달체가 테트라메틸 바이올로겐, N,N-디에틸-4,4'-비피리딜, N,N-디이소프로필일-4,4'-비피리딜, 4,4'-비피리딜 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 아세트산 제조방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 전자전달체가 N,N-디에틸-4,4'-비피리딜인 것임을 특징으로 하는 아세트산 제조방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 반응은 20℃ 내지 70℃ 에서 수행되는 것임을 특징으로 하는 아세트산 제조방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 반응이 -450 내지 -700mV의 전위에서 수행되는 것임을 특징으로 하는 아세트산 제조방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 반응이 pH 6 내지 pH 8에서 진행되는 것임을 특징으로 하는 아세트산 제조방법.
9. 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체 그리고 상기 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체로 부터 얻어지는 일산화탄소 탈수소효소를 함유하는 추출물들로 이루어진 군에서 선택되는 것과 전자전달체를 촉매로 사용하여 이산화탄소로부터 아세트산을 제조하는 하기 반응식의 아세트산 제조방법.

   2 CO₂+ 8 H⁺+ 8 e^----------> CH₃COOH + 2 H₂O
10. 제 9항에 있어서, 상기 전자전달체가 테트라메틸 바이올로겐, N,N-디에틸-4,4'-비피리딜, N,N-디이소프로필일-4,4'-비피리딜, 4,4'-비피리딜 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 아세트산 제조방법.
11. 제 9항에 있어서, 상기 전자전달체가 N,N-디에틸-4,4'-비피리딜인 것임을 특징으로 하는 아세트산 제조방법.
12. 디-(3-아미노프로필)-바이올로겐{di-(3-aminopropyl)-viologen}이 결합된 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체를 촉매로 사용하여 이산화탄소로부터 아세트산을 제조하는 하기 반응식의 아세트산 제조방법.

    2 CO₂+ 8 H⁺+ 8 e^----------> CH₃COOH + 2 H₂O
13. 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체 표면의 카르복시기와 디-(3-아미노프로필 )-바이올로겐의 아민기의 반응에 의해 형성된 공유결합으로 연결된 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체와 디-(3-아미노프로필)-바이올로겐 결합체.
14. i) 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체를 N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸 카르보디이미드 용액에 넣는 단계;

    ii)상기 i)에서 얻어진 용액에 디-(3-아미노프로필)-바이올로겐을 넣는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 써모아세티쿰 균체의 표면에 디-(3-아미노프로필)-바이올로겐을 공유결합시키는 방법.