CN115684311A - 一种固定化酶薄膜电极、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固定化酶薄膜电极，包括：电极，及覆盖于所述电极表面的固定化酶薄膜，其中，所述固定化酶薄膜包括：N‑芴甲氧基羰基二苯丙氨酸薄膜及分散固定于所述N‑芴甲氧基羰基二苯丙氨酸薄膜中的甲酸脱氢酶和二烯丙基紫精。本发明提供的固定化酶薄膜电极不仅能够高效地电催化还原CO₂生产甲酸盐，而且可以重复使用、制备过程简单，自组装易于调控。

Description

一种固定化酶薄膜电极、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及薄膜电极制备技术领域，尤其涉及一种固定化酶薄膜电极、其制备方法及其应用。

背景技术

大量温室气体，特别是CO₂的产生会引起全球变暖、酸雨等一系列异常气候现象，对人类社会的发展造成了威胁。因此，如何降低大气中CO₂含量成为了人们共同面对的难题。电化学CO₂还原是一种可以将太阳能或风能发电与碳基燃料化学键中的能量储存相结合的方法，可以实现更清洁的能量循环，因此更为受到研究者们的关注。为了提供更好地产物选择性，生物催化剂(例如酶)受到了研究者们的关注。酶具有使用条件温和、化学选择性高等优点，可以被用于CO₂还原的商业规模应用。

在自然界中，甲酸脱氢酶(FDH)是一种在辅酶因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)协同下可以催化甲酸脱氢生成CO₂的酶。而事实上，这个酶促反应的逆反应也可以在NADH的氧化型NAD⁺的协同下发生，成为电催化CO₂还原的一种途径。但正因为以NADH/NAD⁺作为辅酶因子可以同时催化正反应和逆反应，所以采用这种方式的CO₂还原效率受到限制。

紫精类衍生物是一种常见具有氧化还原性物质，由于其具有良好的显色效率、循环寿命、对比度等优点，被广泛应用于信息加密、防伪等领域。研究者们发现，当使用紫精类衍生物的自由基阳离子形态(V^·+)作为人工辅酶因子时，其对FDH还原CO₂生成甲酸的催化效果明显。

在这方面，Jayathilake等(Acc.Chem.Res.2019,52,676，以下简称文献1)公开了使用人工辅酶因子甲基紫精(MV)催化甲酸脱氢酶(FDH)电化学还原CO₂生成甲酸盐的方法，具体地，该文献将FDH和MV联合使用，在液相体系中进行电化学催化反应，FDH和MV均存在于溶液中。然而，生物酶，尤其是FDH的价格十分昂贵，每克高达上万元，而在液相体系中进行电化学催化反应的FDH无法回收重复利用，这导致液相中的电化学催化还原CO₂生成甲酸盐的方法成本很高。

Szczesny等(ACS Energy Lett.2020,5,321-327，以下简称文献2)公开了一种能够进行CO₂的电催化还原的碳布电极，该电极上固定有紫精聚合物，即1-(3-氨丙基)-1'-甲基-4,4'联吡啶(vio)修饰聚(4-苯乙烯磺酸酯-共-甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-丙烯酸丁酯)(P(SS-GMA-BA)-vio)和钨依赖的甲酸脱氢酶(DvH-W-FDH)。但是，该文献中的工艺涉及多种材料的合成和改性、在具有气体扩散层的碳布电极大孔侧和微孔侧分别修饰了三层功能性材料，即共修饰了4层含有vio人工辅酶的聚合物和2层含有酶FDH的聚合物薄膜，不仅合成繁琐，薄膜修饰操作步骤也复杂且时间冗长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于CO₂还原的固定化酶薄膜电极。本发明的其它目的还在于提供该固定化酶薄膜电极的制备方法及其在还原CO₂中的应用。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案。

本发明首先提供了一种固定化酶薄膜电极，包括：

电极，及

覆盖于所述电极表面的固定化酶薄膜，其中，所述固定化酶薄膜包括：N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸薄膜及分散固定于所述N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸薄膜中的甲酸脱氢酶和二烯丙基紫精。

在本发明的一些实施方式中，所述二烯丙基紫精和甲酸脱氢酶的质量比为1：(0.5-1.5)，优选为1：(1-1.2)。

在本发明的一些实施方式中，在所述固定化酶薄膜中，所述二烯丙基紫精的负载量为5×10^-7-1×10^-6mol/cm²，优选为9×10^-7-1×10^-6mol/cm²，最优选为9.1×10^-7mol/cm²，和/或

所述甲酸脱氢酶的负载量为0.1-0.4mg/cm²，优选为0.2-0.3mg/cm²，最优选为0.24mg/cm²。

在本发明的一些实施方式中，所述电极选自ITO电极、FTO电极、玻碳电极、金电极、碳电极或碳布电极。

本发明还提供了前述的固定化酶薄膜电极的制备方法，包括：

获得含有N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸的第一准备液，

获得含有甲酸脱氢酶和二烯丙基紫精的第二准备液，

将第一准备液与第二准备液混合，静置后得到预凝胶，

将所述预凝胶涂覆在所述电极上，静置后得到所述固定化酶薄膜电极。

在本发明的一些实施方式中，在所述预凝胶中，所述二烯丙基紫精与甲酸脱氢酶的质量比为1：(1-1.5)，优选为1：(1-1.2)。

在本发明的一些实施方式中，在所述预凝胶中，N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸与甲酸脱氢酶的质量比为1：(2-3)。

在本发明的一些实施方式中，所述第二准备液由以下方法制得：

在pH 7-8的第一缓冲溶液中加入甲酸脱氢酶和二硫苏糖醇混合孵育，之后加入DAV二烯丙基紫精得到第二准备液，优选地，所述第一缓冲溶液选自磷酸缓冲溶液(PBS)、HEPES缓冲溶液、Tris缓冲溶液、Britton-Robinson缓冲溶液。

本发明还提供了前述的固定化酶薄膜电极在还原CO₂中的应用。

在本发明的一些实施方式中，将所述固定化酶薄膜电极置于第二缓冲溶液中在相对于SCE为-0.8V的工作电压下还原CO₂的并生产甲酸盐；

优选地，所述第二缓冲溶液为含有NaHCO₃的50mM的PBS，其中NaHCO₃的浓度为100mM。

有益效果

本发明提供的固定化酶薄膜电极，以N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸(Fmoc-FF)作为凝胶因子形成凝胶薄膜，将人工辅酶因子二烯丙基紫精(DAV)和甲酸脱氢酶(FDH)分散固定在薄膜中，在电极表面一步自组装得到具有固定化酶的分子凝胶薄膜。本发明提供的固定化酶薄膜电极不仅能够高效地电催化还原CO₂生产甲酸盐，而且其制备过程简单，自组装易于调控。

此外，本发明将天然FDH酶和二烯丙基紫精共同固定在薄膜相中，通过固定化酶提高催化剂稳定性，同时实现了产品的重复利用，有利地降低了CO₂的还原成本。

附图说明

图1示出了各材料的傅里叶变换红外光谱图，其中，(a)代表Fmoc-FF粉末,(b)代表Fmoc-FF薄膜，(c)代表FDH粉末,(d)代表Fmoc-FF/FDH薄膜,(e)代表DAV粉末，(f)代表Fmoc-FF/DAV薄膜，(g)代表实施例1制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极；

图2示出了在pH 6.0缓冲溶液中进行的循环伏安曲线(扫速0.1V/s)，其中，(a)代表Fmoc-FF/FDH薄膜电极，(b)代表裸电极(存在于含有20mM DAV的溶液中)，(c)代表实施例1制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极；

图3示出了DAV在不同氧化还原状态之间转换的示意图；

图4示出了对比例4制备的Fmoc-FF/MV/FDH薄膜玻碳电极(a)和实施例2制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜玻碳电极(b)在pH 6.0缓冲溶液中的循环伏安曲线(扫速5mV/s)；

图5A示出了实施例1制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极的CV曲线(5mV/s，pH6.0的PBS，100mM NaHCO₃)，其中(a)代表N₂氛围，(b)代表CO₂氛围；

图5B为计时电流曲线：在-0.8V恒电压下以气体扩散模式检测(黑色箭头表示鼓入CO₂)；

图6A示出了实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH碳布电极的CV曲线(5mV/s，pH 6.0的PBS，100mM NaHCO₃)，其中：(a)代表N₂，(b)代表CO₂氛围，图6A中的插图为对比例5制备的Fmoc-FF/FDH薄膜碳布电极的CV曲线(5mV/s，pH 6.0的PBS，100mM NaHCO₃)：其中：(a)代表N₂，(b)代表CO₂氛围；

图6B为计时电流曲线：在-0.8V恒电压下以气体扩散模式检测(黑色箭头表示鼓入CO₂)；

图7示出了实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极在pH 6.0的PBS中的线性扫描伏安(LSV)曲线(扫速50mV/s)，其中，(a)代表N₂氛围，(b)代表CO₂氛围，(c)代表N₂+100mM NaHCO₃；(d)代表CO₂+100mM NaHCO₃；(e)为Fmoc-FF/FDH薄膜碳布电极在CO₂氛围下的含有100mM NaHCO₃的溶液中的LSV曲线；

图8A示出了实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH碳布电极在不同电压下的安培法曲线(CO₂，pH 6.0的PBS，100mM NaHCO₃)；

图8B示出了实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH碳布电极的电流信号I的电压依赖性(CO₂，100mM NaHCO₃，pH 6.0)，误差棒代表三次平行实验的标准差；

图9示出了以下物质的离子色谱图：(a)pH 6.0的PBS(CO₂，100mM NaHCO₃)；(b)20μg/mL甲酸钠(混标，另含乙酸钠、丙酸钠、乳酸钠等)；(c)对Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极施加-0.8V恒电压2h后收集的电解产物(CO₂，pH 6.0的PBS，100mM NaHCO₃)。

具体实施方式

为了对本发明的技术方案、目的和效果有更清楚的理解，现结合附图说明本发明的具体实施方式。

需要说明的是，以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极的制备

本实施例在ITO电极(0.8×3.3cm²)上自组装得到固定化酶薄膜电极。

(1)首先，将ITO电极依次在含有3.95％ KOH的乙醇溶液、乙醇、水中超声清洗各5min，吹干备用。

(2)将Fmoc-FF粉末超声溶解在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，得到Fmoc-FF浓度为30mg/mL的第一储备液。

(3)在pH 7.4的HEPES缓冲溶液中加入FDH和二硫苏糖醇(DTT)混合孵育10min，之后加入DAV得到第二储备液，其中，FDH、DTT、DAV的终浓度分别为11.2mg/mL、100mM、10mg/mL。

(4)用移液枪吸取V₁体积的第一储备液快速注入到V₂体积第二储备液中(V₁∶V₂＝2∶13)，静置得到预凝胶(含有4mg/mL的Fmoc-FF)。

(5)将40μL预凝胶滴涂在ITO电极表面，在4℃放置过夜，在ITO电极表面形成Fmoc-FF薄膜，该薄膜中分散固定有FDH和DAV，从而得到固定化酶薄膜电极，称为Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极。

实施例2Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜玻碳电极的制备

将实施例1中的ITO电极替换为玻碳电极(GCE，d＝3mm)，采用与实施例1相同的方法在玻碳电极表面形成分散固定有FDH和DAV的Fmoc-FF薄膜，从而得到固定化酶薄膜电极，称为Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜玻碳电极。

实施例3Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极的制备

将实施例1中的ITO电极替换为碳布(CC，几何面积为0.8×4.0cm²)电极，采用与实施例1相同的方法在碳布电极表面形成分散固定有FDH和DAV的Fmoc-FF薄膜，从而得到固定化酶薄膜电极，称为Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极。

对于本实施例所制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极，其中，DAV的负载量为9.1×10^-7mol/cm²，FDH的负载量为0.24mg/cm²。

在本文中，术语“DAV的负载量”是指在工作电极的单位面积上固定的DAV的物质的量；“FDH的负载量”指在工作电极的单位面积上固定的FDH的质量。

实施例4Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极的制备

实施例4与实施例1的区别在于在步骤(3)所制备的第二储备液中，FDH、DTT、DAV的终浓度分别为5mg/mL、100mM、10mg/mL。

实施例5Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极的制备

实施例5与实施例1的区别在于在步骤(3)所制备的第二储备液中，FDH、DTT、DAV的终浓度分别为15mg/mL、100mM、10mg/mL。

对比例1Fmoc-FF薄膜ITO电极的制备

首先，按照实施例1的步骤(1)和(2)准备ITO电极和第一储备液。

然后，用移液枪吸取V₁体积的第一储备液快速注入到V₂体积的水中(V₁∶V₂＝2∶13)，形成预凝胶。

将40μL预凝胶滴涂在ITO电极表面，在4℃放置过夜，在ITO电极表面形成Fmoc-FF薄膜，从而得到Fmoc-FF薄膜电极。

对比例2Fmoc-FF/FDH薄膜ITO电极的制备

首先，按照实施例1的步骤(1)和(2)准备ITO电极和第一储备液。

然后在pH 7.4的HEPES缓冲溶液中加入11.2mg/mL的FDH和100mM的二硫苏糖醇(DTT)混合孵育10min得到第二储备液。

按照实施例1的步骤(4)和(5)制备预凝胶并将其滴涂在ITO电极表面，在ITO电极表面形成分散固定有FDH的Fmoc-FF薄膜，从而得到Fmoc-FF/FDH薄膜电极。

对比例3Fmoc-FF/DAV薄膜ITO电极的制备

首先，按照实施例1的步骤(1)和(2)准备ITO电极和第一储备液。

然后在pH 7.4的HEPES缓冲溶液中加入DAV(10mg/mL)得到第二储备液。

按照实施例1的步骤(4)和(5)制备预凝胶并将其滴涂在ITO电极表面，在ITO电极表面形成分散固定有DAV的Fmoc-FF薄膜，从而得到Fmoc-FF/DAV薄膜电极。

对比例4Fmoc-FF/MV/FDH薄膜玻碳电极的制备

如前所述，Jayathilake等使用甲基紫精(MV)作为人工辅因子(媒介体)辅助FDH进行CO₂的还原。

本对比例在此采用实施例1的制备方法，仅将ITO电极替换为玻碳电极，并将DAV等物质的量浓度替换为MV，制备出Fmoc-FF/MV/FDH薄膜玻碳电极。

对比例5Fmoc-FF/FDH薄膜碳布电极的制备

将实对比例2中的ITO电极替换为碳布(CC，几何面积为0.8×4.0cm2)电极，采用与对比例2相同的方法制备出Fmoc-FF/FDH薄膜碳布电极。

上述实施例及对比例所制备的电极在使用之前均先用去离子水洗去表面可溶的试剂。

固定化酶薄膜电极的表征与分析

(1)Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜电极的表征

使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)表征实施例1中的Fmoc-FF/DAV/FDH分子凝胶薄膜的成功制备。如图1所示，在DAV粉末样品的红外吸收光谱(图1中的曲线e)中，可以观察到DAV的吡啶环在1600-1430cm^-1的C＝C、C＝N伸缩振动峰。DAV粉末样品在1560cm^-1、1508cm^-1、1452cm^-1处存在的几个尖峰，在Fmoc-FF/DAV薄膜和Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜中也可以观察到(图1中的曲线f、g)，而在样品Fmoc-FF粉末、Fmoc-FF薄膜、FDH粉末、Fmoc-FF/FDH薄膜样品中均未被观察到(图1中的曲线a、b、c、d)，由此可以证明DAV已经成功地被固定在了Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜中。Fmoc-FF粉末位于3306cm^-1处的N-H伸缩振动峰(图1中的曲线a)在Fmoc-FF薄膜、Fmoc-FF/FDH薄膜、Fmoc-FF/DAV/FDH(图1中的曲线b、d、g)薄膜样品的红外谱图中蓝移到了3325cm^-1附近，这反映了Fmoc-FF在薄膜中自组装形成了链间氢键。

(2)循环伏安(CV)法分析

采用CH Instruments公司CHI 660A型电化学工作站进行循环伏安(CV)实验，进一步证明固定化酶薄膜电极的成功制备。测试均在在典型的三电极体系进行，其中实施例或对比例制备的薄膜电极、裸ITO电极和Fmoc-FF薄膜电极分别用作工作电极，将饱和甘汞电极(SCE)用作参比电极，铂片电极用作对电极。检测结果如下。

将实施例1制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极放入pH 6.0的磷酸缓冲溶液PBS中，可以在-0.6V附近看到一对可逆的CV峰(图2中曲线c)，与裸ITO电极在含有20mM DAV的pH 6.0溶液中的峰位置非常接近(图2中曲线b)，符合DAV²⁺和DAV^·+这一对氧化还原电对的特征峰，而在-0.8V左右出现的小尖峰对应于DAV^·+和DAV中性分子这一对氧化还原电对的电子转移。这两个电极反应都是可逆的，如图3所示，其中的二价阳离子DAV²⁺对应于二烯丙基紫精的氧化态，阳离子自由基DAV^·+是二烯丙基紫精的第一个还原态，中性分子DAV则是二烯丙基紫精的第二个还原态。而在Fmoc-FF/FDH薄膜中却没有这样的信号(图2中曲线a)，这有力佐证了DAV在薄膜中的成功固定。

此外，将实施例2和对比例4制备的薄膜玻碳电极进行对比，结果如图4所示。从图4中可以看出，实施例2制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜玻碳电极的还原电位为-0.62V，对比例4制备的Fmoc-FF/MV/FDH薄膜玻碳电极的还原电位-0.70V，相比于后者，前者的还原电位更正。换言之，含有DAV的电极可以在相比于含有MV的电极更高的电位下进行CO₂还原，这可以有效地避免析氢反应的发生，有利于提高甲酸盐的产率。

为了使CO₂达到更高的平衡浓度，且使缓冲溶液更接近FDH的最适pH，向pH 6.0的PBS缓中加入100mM NaHCO₃以提供充足的HCO₃ ^-，此时PBS的实际pH约为7.2，当向缓冲溶液中鼓入CO₂形成CO₂氛围(pH约为6.6)，可以观察到实施例1制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极在鼓入CO₂后的还原电流相较于在N₂氛围下的电流显著增大(图5A)，这一定程度上可以反映出Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜电极对CO₂的催化还原，对应的机理如下所示：

2DAV²⁺+2e^-→2DAV^·+ 电极处 (1)

FDH(Ox)+2DAV^·+→FDH(Red)+2DAV²⁺ (2)

FDH(Red)+H⁺+CO₂→FDH(Ox)+HCOO^- (3)

首先，薄膜中的DAV²⁺在电极上被电化学还原为DAV^·+(式1)，形成的DAV^·+可以作为人工辅酶因子，将薄膜中FDH(Ox)还原为FDH(Red)，同时DAV^·+又变回DAV²⁺(式2)，而FDH(Red)可以对CO₂进行催化还原，得到产物甲酸盐(式3)。

之后在恒电压-0.8V条件下进行了计时电流测试，当向含有100mMNaHCO₃的缓冲溶液中鼓入CO₂时，电流显著增大，且可以稳定保持10min以上，表明还原反应体系可以在一定时间内稳定运行(图5B)。

进一步地，对实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极的催化还原效率进行考察。具体地，将ITO电极更换为碳布电极(浸入面积为0.8×2cm²)进行实验。可以观察到在通入CO₂后，电极在-0.62V的还原电流显著提升(图6A)，意味着在Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极表面也可以实现对CO₂的电催化还原。Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极的还原电流几乎是Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极的还原电流(图5A)的10倍，可能是由于碳布电极本身可以作为气体扩散层使用，对于气体反应物CO₂具有更高的催化效率。作为对照，Fmoc-FF/FDH碳布电极在-0.6V左右没有氧化还原峰被观察到(图6A中的插图)。图6B示出了在恒电压-0.8V条件下对Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极进行的计时电流测试，当向含有100mMNaHCO₃的缓冲溶液中鼓入CO₂时，电流显著增大，且电流密度约为使用ITO电极时的10倍，进一步说明说明使用碳布电极时对CO₂的催化效率更高(图6B)。

(3)线性扫描伏安法(LSV)分析

用线性扫描伏安法(LSV)评估实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极的电催化还原CO₂活性。结果如图7所示。

首先，在N₂和CO₂氛围下的pH 6.0的PBS中分别对Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极进行LSV曲线扫描(图7中的曲线a、b)，可以观察到在CO₂氛围下，电流显著增大。而在含有100mM NaHCO₃的pH 6.0缓冲溶液中得到的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极电流值无论是在在N₂还是CO₂氛围下均高于不含有NaHCO₃的pH 6.0缓冲溶液(图7中的曲线c、d)，这意味着HCO₃ ^-的存在确实显著提升了反应效率，这一现象的原因可能是CO₂平衡浓度的提高以及在较碱性pH下FDH自身活性的提升。而作为对照，在CO₂氛围下含有100mM NaHCO₃的pH 6.0缓冲溶液中对Fmoc-FF/FDH薄膜碳布电极进行LSV曲线测试(图7中的曲线e)，得到的电流值远远小于Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极，这表明Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极中的DAV组分在FDH电催化还原CO₂的过程中发挥了重要作用。

(4)安培法测试

在不同电压下对实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极进行安培法测试，Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极的还原电位为-0.65V，将其设置为起始电压，之后逐渐增加电压到-1.2V，还原电流随着电压的增加逐渐增加。可以观察到在-0.8V恒电压下，Fmoc-FF/DAV/FDH碳布电极的还原电流相较于-0.65V恒电压下产生了显著提升(图8A、图8B)，这意味着在-0.8V条件下电催化CO₂的效率较高。但催化还原电流在大于-1.0V后不再明显增长。此后，在-1.2V恒电压下Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极的电流要比-1.0V和-1.1V条件下大很多，分析可能与不希望的析氢反应相关。为了尽可能避免析氢反应的影响，我们将工作电压设置为-0.8V进行后续测试。

之后，在CO₂氛围下含有100mM NaHCO₃的pH 6.0的PBS中对Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极施加-0.8V电压2h，收集反应后的电解液，使用离子色谱法对电解液中的甲酸盐进行检测，测试条件如表1所示，测试结果如图9所示。混标中甲酸盐保留时间为7.6min(图9中的曲线b)。Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极电解2h后的产物在此保留时间也有明显出峰(图中的曲线c)，而在电解前的缓冲液中则没有在此保留时间出峰(图9中的曲线a)，表明产物中的甲酸盐是由电催化反应生成的。使用外标法计算样品中甲酸盐的浓度约为42.4μg mL^-1。

表1

可见，本发明将人工辅酶因子(DAV)和酶(FDH)共同固定到Fmoc-FF薄膜内，可以获得很高的CO₂还原催化效率。根据法拉第定律可以估计出采用实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极在催化还原过程中的法拉第效率约为54.7％。

在前述的文献1中，其公开的使用MV在液相中作为人工辅酶因子时的法拉第效率61％，略高于本法的薄膜电极。

但是，需要说明的是，在实施例3中，Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极上的DAV负载量为9.1×10^-7mol/cm²(物质的量为1.5×10^-6mol)。

而对于文献1公开的技术方案中，液相体系中MV的浓度4.0×10^-5mol/mL(物质的量为3.0×10^-4mol，文献1中报道的溶液体积为7.5mL)。可见，本发明的技术方案使用的DAV的摩尔量显著低于文献1中使用的MV的摩尔量。而且，在实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极中，固定化的FDH的用量为0.39mg，也远低于文献1中FDH的用量147mg(文献1中报道2.4μM，根据Roche提供的FDH分子量74000Da或8140000g/mol估算出质量)。

由此可见，本发明提供的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极在DAV和FDH的使用量基本上比文献1中的MV和FDH的使用量低两个数量级的情况下，还能取得仅比文献1略少的法拉第效率，这实际上表明本发明将人工辅酶因子DAV和酶FDH共同固定到薄膜内的实际催化效率要远高于文献1的催化效率。

在文献2中，如前所述，其合成紫精聚合物：1-(3-氨丙基)-1'-甲基-4,4'联吡啶(vio)修饰聚(4-苯乙烯磺酸酯-共-甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-丙烯酸丁酯)(P(SS-GMA-BA)-vio)，并与钨依赖的甲酸脱氢酶(DvH-W-FDH)共同固定到碳布电极表面，进行CO₂的电催化还原。在接近的工作电压下，(本文是-0.8V vs SCE，文献2中采用-0.59V vs SHE，换算后即-0.83V vs SCE)，本发明提供的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极在不同电解时间下的催化电流密度J发明(根据图6B获得)远高于文献2的电流密度J_R2，(参见表2，文献2中的数据来源于文献2中Figure.2(b)的数据，电极的面积为0.636cm²)，且都高出10倍左右。

表2.不同时间下电流密度对比

虽然文献2经过进一步改性后，其催化电流密度有了显著的提升(参见文献2的Figure.3(b))，但其工艺中涉及多种材料的合成和改性、在具有气体扩散层的碳布电极大孔侧和微孔侧分别修饰了三层功能性材料，即共修饰了4层含有vio人工辅酶的聚合物和两层含有酶FDH的聚合物薄膜，不仅合成繁琐，薄膜修饰操作步骤也复杂且时间冗长。

此外，文献2中紫精类物质的负载量为1.3×10^-6mol/cm²，高于本发明前述的DAV负载量(9.1×10^-7mol/cm²)。由此可见，本发明将人工辅酶因子DAV和酶FDH共同固定到Fmoc-FF薄膜内的实际催化效率要远高于文献2的催化效率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域中的技术人员来说，本发明可以有各种修改和变化。凡在本发明的主旨和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种固定化酶薄膜电极，其特征在于，包括：

电极，及

覆盖于所述电极表面的固定化酶薄膜，其中，所述固定化酶薄膜包括：N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸薄膜及分散固定于所述N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸薄膜中的甲酸脱氢酶和二烯丙基紫精。

2.根据权利要求1所述的固定化酶薄膜电极，其特征在于，所述二烯丙基紫精和甲酸脱氢酶的质量比为1：(0.5-1.5)，优选为1：(1-1.2)。

3.根据权利要求1所述的固定化酶薄膜电极，其特征在于，在所述固定化酶薄膜中，所述二烯丙基紫精的负载量为5×10^-7-1×10^-6mol/cm²，优选为9×10^-7-1×10^-6mol/cm²，最优选为9.1×10^-7mol/cm²，和/或

所述甲酸脱氢酶的负载量为0.1-0.4mg/cm²，优选为0.2-0.3mg/cm²，最优选为0.24mg/cm²。

4.根据权利要求1所述的固定化酶薄膜电极，其特征在于，所述电极选自ITO电极、FTO电极、玻碳电极、金电极、碳电极或碳布电极。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的固定化酶薄膜电极的制备方法，其特征在于，包括：

获得含有N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸的第一准备液，

获得含有甲酸脱氢酶和二烯丙基紫精的第二准备液，

将第一准备液与第二准备液混合，静置后得到预凝胶，

将所述预凝胶涂覆在所述电极上，静置后得到所述固定化酶薄膜电极。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述预凝胶中，所述二烯丙基紫精与甲酸脱氢酶的质量比为1：(1-1.5)，优选为1：(1-1.2)。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述预凝胶中，N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸与甲酸脱氢酶的质量比为1：(2-3)。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第二准备液由以下方法制得：

在pH 7-8的第一缓冲溶液中加入甲酸脱氢酶和二硫苏糖醇混合孵育，之后加入二烯丙基紫精得到第二准备液，优选地，所述第一缓冲溶液选自磷酸缓冲溶液(PBS)、HEPES缓冲溶液、Tris缓冲溶液、Britton-Robinson缓冲溶液。

9.权利要求1-4中任一项所述的固定化酶薄膜电极在还原CO₂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述固定化酶薄膜电极置于第二缓冲溶液中在相对于SCE为-0.8V的工作电压下还原CO₂的并生产甲酸盐；

优选地，所述第二缓冲溶液为含有NaHCO₃的50mM的PBS，其中NaHCO₃的浓度为100mM。

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