CN104232613B - 一种固定化核酸酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种固定化核酸酶及其制备方法。本发明的固定化核酸酶由核酸酶和固相载体组成，核酸酶通过共价键与固相载体上的基团相连接。本发明的固定化核酸酶活性大于500U/g，作用的pH范围为6～8，最适作用温度为37℃。本发明还公开了一种制备固定化核酸酶的方法。本发明的固定化核酸酶应用于医药产品的工艺中，在产品分离纯化过程中避免了核酸酶残留在终产品中，提高了产品质量。

Description

一种固定化核酸酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种核酸酶及其制备方法，尤其涉及一种固定化核酸酶及其制备方法。

背景技术

生物技术产品在高效表达时宿主细胞或菌体也大量增殖，这一过程中往往伴随着大量的宿主或菌体核酸的扩增，在后续的分离过程中大量的核酸释放会给目标产品的分离纯化增加难度，同时部分残留宿主DNA与产品结合也很难去除。宿主细胞的DNA同药物一起进入人体会产生不可预料的副作用，残留DNA可能造成机体DNA的插入突变，导致抑癌基因失活、癌基因被激活等，有可能造成药物使用者致癌，因此宿主细胞DNA残留量是产品质量控制的重要指标之一。

许多机构都对重组蛋白类药物的DNA残留制定了严格的标准，1984年的国际会议上采纳了残余DNA的临时限度标准，即来自连续传代细胞系的生物制品每人份剂量DNA残留不能超过10pg。1986年WHO会议一致认为不高于100pg/剂量的细胞DNA对于非口服途径的产品，其危险性是可以忽略不计的。1987年，美国FDA建议每人份剂量残余细胞DNA的可接受限度为10pg。1997年，美国FDA将生物制品可以允许的残余DNA限度修改为不超过100pg。欧洲药典通则中对于残余DNA的限度规定为不超过10ng/剂量，但针对个别疫苗(如甲型肝炎灭活疫苗残余DNA应不超过100pg/剂量；乙型肝炎疫苗DNA残留量应不超过10pg/剂量)会有所不同。

1990年2月，卫生部颁布的《人用重组DNA制品质量控制要点》3.3.1.6条款规定，必须用敏感的方法测定来源于宿主细胞的残余DNA含量，这对于用哺乳动物传代细胞(转化的细胞系)生产的制品尤为重要。一般认为残余DNA含量小于100pg/剂量是安全的。《中国药典》三部(2005年版)对CHO细胞表达的重组乙型肝炎疫苗提出CHO细胞残余DNA含量不高于10pg/剂量。近几年，我国采用Vero细胞生产灭活疫苗逐渐增多，疫苗的种类包括人用狂犬病纯化疫苗、肾综合征出血热纯化疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、乙型脑炎纯化疫苗。《中国药典》(2005年版三部)及(2010年版三部)对于Vero细胞培养疫苗一般要求残余外源DNA不超过100pg/剂量。

非特异性核酸内切酶是一类高活性的水解酶，其最大特点是能非特异性地降解几乎所有形式的核酸。来自粘质沙雷氏菌非特异性核酸内切酶(Serratia marcescens non-specific endonuclease，SMNE，E.C.3.1.30.2)是其中的典型代表，该酶能降解各种形式核酸的核酸内切酶，包括单链，双链，线性和环状DNA和RNA以及基因组DNA，对核酸的序列没有严格要求，并且没有蛋白酶活性。该酶在广泛条件范围具有很高的核酸降解活性，能将核酸完全消化成杂交限度以下的2-5个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸。

该酶由分子量为30kDa的两个亚基组成，作用的pH范围为6～10，温度0～42℃，酶发挥活性需要1～2mM Mg2+。在离子型及非离子型表面活性剂和1mM PMSF，1mM EDTA，尿素存在下，核酸酶仍具有活性。大于150mM的单价阳离子，大于100mM的磷酸根，大于100mM硫酸铵和大于100mM盐酸胍抑制酶的活性。

核酸酶具有广阔的应用前景，适合从生物制品中去除核酸，其主要应用于以下几个方面：

1、提高产品质量：核酸酶通过降低生物制品，尤其是病毒类产品外源性核酸的含量，减少过敏反应，提高制品安全性；

2、改善重组蛋白工艺：工程细胞裂解后加入核酸酶可降低料液的黏度，缩短处理时间，提高蛋白产量，离心时有利于沉淀和上清液的分离，超滤时有利于各成分的分离，提高柱层析纯化时的有效性；

3、颗粒(病毒、包涵体等)预处理：有助于颗粒的纯化；

4、生物分析样品的处理：在ELISA、柱层析、二维电泳和印迹分析中，通过核酸酶的作用可提高分辨率和回收率。

目前市场上销售的核酸酶产品主要是德国Merck公司的endonuclease。该产品是将Serratia marcescens核酸酶基因克隆到pNUC1质粒载体，转化大肠杆菌W3310实现核酸酶基因的分泌表达，生产工艺保证了产品的纯度和活性，使该产品同自然提取酶相比，最大限度地降低了蛋白酶活性和病毒污染。

美国Acambis公司的ChimeriVaxTM Platform疫苗研究平台系统，采用黄热病毒载体研究生产登革热、WN和JE脑炎疫苗，Benzonase核酸酶已经用于这些疫苗的开发和生产。2007年，薛惠斌在腺病毒CNHK200-hEndostatin的质量控制及其大规模扩增一纯化的初步研究中应用Benzonase提高重组腺病毒的质量，重组复制型溶瘤腺病毒p53产品工艺中也使用了benzonase酶，质量标准制定了相应的残留量检测项目。《Vaccine》杂志2007年发表了关于人用罗斯河病毒感染(Ross River virus)疫苗的临床前试验文章，其中疫苗制备工艺首先是40升反应器中病毒的微载体培养，然后收获培养上清进行过滤，滤液中加入Benzonase核酸酶处理，浓度2000U/L，37℃，1小时以消化残留的Vero细胞DNA。后续病毒经甲醛灭活24小时后再加入Benzonase核酸酶1000U/L以进一步处理残留的核酸。

2009年发表于《THE JOURNAL OF GENE MEDICINE》的一项关于腺病毒载体纯化的研究(Purification of adenoviral vectors by combined anion exchange and gelfiltration chromatography)中应用Benzonase的条件为：1200U Benzonase加到12.5ml(98U/ml)粗裂解物，37℃保温1小时，然后2-8℃条件3000g离心10分钟后进一步纯化。结果病毒颗粒的收率有很大改善，在超滤后纯化的第一步97％的Benzonase核酸酶能够去除。

2010年《Gene Therapy》杂志报道了通过单纯疱疹病毒互补系统生产、纯化腺相关病毒的工作，其中重组病毒颗粒释放后采用Benzonase核酸酶(25U/L，MgCl₂2mmol/L).处理，37℃振荡保温2～4小时，这样便于在后续的工艺中有效地去除残留DNA。

2011年，Langfield K.K.等在《Methods Mol Biol.》杂志发表了关于制备麻疹病毒的文章。麻疹病毒作为具有肿瘤治疗前景的溶瘤病毒，正在进行临床试验，但溶瘤病毒的活性依赖于高浓度具有感染性的病毒颗粒。在纯化中，病毒培养上清过滤后采用Benzonase核酸酶处理来消化其中的核酸以便于后续的制备工作。

2012年，Bandeira V.等在纯化慢病毒颗粒载体(Lentiviral vector)的工艺过程中使用了Benzonase核酸酶，结果能去除99％的DNA残留。美国食品药品监督管理局网站(www.fda.gov)公开了病毒载体的生产工艺过程，其中有Benzonase核酸酶的处理步骤，通过37℃保温1小时，就能有效去除细胞及质粒DNA。宫颈癌疫苗GARDASIL的工艺过程中使用Benzonase核酸酶4℃处理病毒颗粒过夜以帮助消化DNA从而使宿主残留DNA在后续纯化过程中容易去掉，降低终产品中宿主DNA的残留量。

Benzonase核酸酶的应用使细胞基质DNA被水解成小片段甚至寡核苷酸后在疫苗的纯化过程中很容易去除，大大降低了残留DNA的含量，提高了疫苗产品的质量。保证了产品的安全性。同时与疫苗颗粒相比，Benzonase核酸酶是小分子蛋白质，在去除血清蛋白的过程中也很容易去除。然而Benzonase核酸酶的使用是直接加入到疫苗溶液中，终产品可以控制含量，但无法完全避免。Benzonase核酸酶是外源性蛋白，极微量的残留都有可能引发个别接种者出现过敏反应，导致临床不测事件发生。

固定化酶是二十世纪发展起来的一项新技术，1916年Nelson和Griffin最先发现了酶的固定化现象后，科学家们就开始了固定化酶的研究工作，1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。

固定化酶与游离酶相比，具有不可比拟的优点，主要表现在：首先，酶与产物易于分开，因而可以回收再利用；其次，在一定程度上可以改善酶的操作性能和稳定性；第三，可以多次反复使用和连续操作，降低生产成本；第四，酶不混入产物，可以精简分离工序等。酶经过固定化后对酶的催化性能产生影响，其本身的结构必将受到扰动，同时其参与的催化反应也由均相体系变为固一液两相体系。通常认为酶分子本身以及载体性质等各种因素均能影响固定化酶的催化性能，例如：

(1)构象效应。构象效应是指固定化过程中，由于酶和载体之间的相互作用导致酶的活性中心或三维结构发生改变，从而使酶和底物之间的结合能力或酶催化底物转化的能力发生改变。在大多数情况下，固定化操作会造成酶活力有不同程度的下降，这在共价结合法制备固定化酶时表现得尤为突出。

(2)空间位阻效应。空间位阻效应主要是由于载体提供的空间太小或者酶在固定化过程中空间取向不当造成的。当存在空间位阻效应时，底物较难与酶的活性中心接触，从而导致酶的催化效率降低。

(3)微环境扰动。微环境扰动是由于载体的余疏水性或电荷性质等影响酶的构象及催化能力的一种效应，这种效应可以通过改变载体与介质的性质来进行调控。

(4)分配效应。分配效应主要是由于固定化载体的余疏水性或静电作用使反应底物、产物以及体系中的其它组分在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶催化体系的组成平衡，从而影响酶的催化速率。

(5)扩散限制效应。扩散限制效应是指底物、产物以及体系中其它组分的运动速度受到限制的一种效应。扩散限制具体可分为两种类型：一种是外扩散，是指反应体系组分从宏观体系到酶颗粒表面过程中所受到的限制；另一种是内扩散，是指反应体系组分从酶颗粒表面到颗粒内部酶所在位置所受到的限制。外扩散限制往往可通过提高搅拌或混合速率来减轻或消除，而内扩散限制则主要取决于载体的性质。

影响固定化酶表观活性的因素主要是酶的结合量以及载体的结构等。当载体上结合的酶较少时，固定化酶的比活力较高，反之则较低。载体结构对酶的表观活力有着极其重要的影响，通常情况下，固定化酶的活力较游离酶低，其原因可能有以下几个方面：酶分子在固定化过程中，其三维空间构象甚至是活性中心区域发生改变；固定化后，由于空间位阻效应影响了酶活性中心对底物的有效定位；包埋固定化酶被高分子材料包裹，增加了底物与酶接近的难度。有时，酶在固定化后其活力会有所提高，其原因可能是固定化过程使酶被化学修饰，或者使酶产生了有利的催化构象，或者酶的稳定性被改善。

大多数固定化酶的稳定性，如热稳定性、pH稳定性、对有机试剂及酶剂的稳定性、贮存稳定性以及操作稳定性等会比游离酶有所提高，这也是固定化酶适应工业应用的最关键的优势之一。对于游离酶而言，随着温度的升高，维持酶分子稳定结构的作用力，如疏水相互作用，氢键，离子相互作用以及范德华力等会被减弱，导致酶分子结构展开，进而造成酶的失活。而将酶进行固定化后，由于载体的限制作用，酶分子的伸展变形受到阻碍，因此其稳定性得到了提高。

温度对酶的活力具有双重影响。一方面，同化学反应一样，升高温度可以提高反应速率；另一方面，由于酶本身是蛋白质，随着温度的升高，酶会逐渐变性失活。由于大多数情况下酶经过固定化后的热稳定性增强，因此其最适反应温度往往会升高，这在实际应用中具有重要意义。

酶被固定化后，其催化反应的最适pH值常常发生偏移。其原因主要是微环境，如酶和载体表面电荷性质的影响导致酶的微环境与主体溶液之间的氢离子浓度产生差异。一般来说，带负电荷的载体如阴离子聚合物所制备的固定化酶，其最适pH要比游离酶偏高，这是因为阴离子聚合物载体会吸引溶液中的阳离子〔包括H十)附着于它的表面，结果使固定化酶周围H十的浓度比外部主体溶液高，即偏酸，这样外部溶液的PH值必须向碱性方向偏移才能抵消微环境的作用，使酶表现出最大活力。反之，使用带正电荷的载体对酶进行固定化时，其固定化酶的最适pH值往往向酸性偏移。

酶在固定化过程中，载体的结构以及酶与载体之间的结合方式都会使酶蛋白的高级结构或底物一酶之间的亲合力发生变化，进而导致酶催化反应米氏常数发生改变。

固定化对酶的底物选择性也会产生影响。例如，酶经过固定化后，由于立体障碍显著增加，大分子底物与酶的接触受到阻碍，使酶的催化活力难以发挥出来。如用CM一纤维素对糖化酶进行共价结合固定化后，所得固定化酶对分子量为8000的直链淀粉的催化活力下降23％，对分子量为500000的直链淀粉活力下降85-87％，但对小分子底物化合物的催化活力则几乎没有变化。

另外，酶固定化后，其立体选择性也会发生改变。通过固定化技术来提高酶的立体选择性在手性化合物的合成领域具有十分重要的意义。

固定化酶的制备方法分为载体结合法、包埋法、交联法三种。随着固定化酶技术的发展，越来越多的研究者致力于酶固定化的研究

共价键结合法：共价键结合法是将酶与不溶性载体以共价键结合的方法，此法研究较为成熟。最常见的共价键结合反应基团包括氨基、羧基或酪氨酸和组氨酸的芳环。此法的优点是酶与载体结合牢固，不易脱落，但因反应条件较为剧烈，易引起酶蛋白空间构象变化，破坏酶的活性部位，因此往往不能得到比活高的固定化酶。

共价键结合法可分为以下几种：

(1)重氮化法：重氮化法的原理为，具有芳香族氨基的水不溶性载体先在稀盐酸和亚硝酸钠中进行反应，称为重氮盐化合物，然后再与酶发生偶合反应，得到固定化酶。酶蛋白中的游离氨基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基等参与此反应。尤其是酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡聚糖氧化酶、碱性磷酸酯酶、β-葡萄糖苷酶等能与多种重氮化载体连接，获得活性较高的固定化酶。常用的载体有：多糖类的芳族氨基衍生物，氨基酸的共聚体，聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、乙烯二马来酸共聚体，多孔玻璃、陶瓷等。

(2)烷基化和芳基化法：该法是以卤素为功能基团的载体与酶蛋白的氨基或巯基发生烷基化或芳基化反应而形成固定化酶。常用的载体为卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基衍生物。

(3)溴化氰法：溴化氰法原理是多糖类载体在碱性条件下用溴化氰活化时，产生少量不活波的氨基甲酸衍生物和大量的亚氨基碳酸酯衍生物，后者再与酶共价结合为固定化酶，其中异脲型是主要生成物。它不局限于酶，可以广泛应用于机体成分的固定化。天然高分子材料一般无毒性、传质性能好，常见的有琼脂、海藻酸钠、壳聚糖等。1978年，Subramanian等用径CNBr活化和碱处理的纤维素载体固定青霉素酰化酶，青霉素酰化酶的固定化效率为80～85％。固定化酶裂解60g/L的青霉素G钾盐10次以上，没有观察到活性损失。合成的高分子材料主要有聚丙烯氰类、聚丙烯酰胺、凝胶聚丙烯酸类聚合物等。1998年，韩辉对青霉素酰化酶在聚丙烯纤维上的固定化进行了许多研究，将巨大芽胞杆菌青霉素酰化酶以共价键结合的方式偶联于聚丙烯氰纤维载体制成固定化青霉素酰化酶，水解青霉素G活性高达2000U/g，重复使用20次，保留活性80％，合成头孢羟氨苄的活性达153U/g，重复50批次，保留活性为83.9％。

(4)载体交联法：载体交联法的原理为载体与酶蛋白发生共价结合或在双(多)功能试剂存在下载体与酶直接发生交联反应而形成固定化酶。常用的载体有氨基乙基纤维素、DEAE-纤维素、琼脂糖的氨基衍生物、壳聚糖、氨基乙基聚丙烯酰胺等。最常用的双功能试剂为戊二醛，此外还可使用甲苯-2，4-二异氰酸酯等。

(5)其它固定化方法

除上述固定化方法外，还可以采用肽键结合法、钛螯合法、硫醇-二硫化物的互换反应等方法来进行酶的固定化。

交联法：交联法是使用双功能试剂或多功能试剂与酶分子间进行交联的固定化方法。作为交联剂的有形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或N，N，-乙烯双马来亚胺等，其中戊二醛最为常用。交联法存在酶与载体结合牢固的优点，但是由于交联反应比较剧烈，固定化酶活回收率一般比较低。

核酸酶的应用使细胞基质DNA被水解成小片段甚至寡核苷酸片段后在疫苗的纯化过程中很容易去除，大大降低了残留DNA的含量，提高了疫苗产品的质量。保证了安全性。同时与疫苗颗粒相比，核酸酶是小分子蛋白质，在去除血清蛋白的过程中也很容易去除。然而核酸酶的使用是直接加入到疫苗溶液中，终产品可以控制含量，但无法完全避免。核酸酶是外源性蛋白，极微量的残留都有可能引发个别接种者出现过敏反应，导致临床不测事件发生。

因此非常有必要开发一种既能有效分解核酸，降低产品中细胞DNA的残留量，又能避免核酸酶残留在终产物中的固定化核酸酶产品。

发明内容

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种固定化核酸酶，由核酸酶和固相载体组成，固定化核酸酶由核酸酶通过共价键与固相载体上的基团相连接而成。

本发明采用的核酸酶是具有水解各种核酸分子，如DNA、RNA、染色体DNA、病毒核酸的多功能核酸酶，特别是粘质沙雷氏菌非特异性核酸内切酶，尤其是适合于大量制备的重组粘质沙雷氏菌非特异性核酸内切酶。

本发明的固定化核酸酶，采用的固相载体包括有机高分子，如纤维素、琼脂糖、离子交换树脂；天然高分子，如海藻酸、角叉菜胶、胶原、几丁质、壳聚糖；合成高分子，如聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚氨酯；无机载体。优选的是交联琼脂糖凝胶，如琼脂糖Sepharose4B，琼脂糖SepharoseCL-6B。

本发明的固定化核酸酶的粒径为10～200μm，核酸酶与载体的结合比例为0.1～20mg/1g凝胶，优选的5～15mg/1g凝胶，特别优选的8～12mg/1g凝胶。

本发明的固定化核酸酶的活性大于500U/g，作用的pH范围为6～8，最适作用温度为37℃。

本发明一种固定化核酸酶的方法，首先取带有活泼基团的载体，用活化剂活化载体，将核酸酶氨基与活化载体相连接得到固定化核酸酶。

本发明固定化核酸酶的制备方法，核酸酶与载体结合反应的比例为5～50mg/1g载体，优选的是10～20mg/1g载体，特别优选的是10～15mg/1g载体。。

本发明固定化核酸酶的制备方法，载体的活化采用溴化氰。

本发明固定化核酸酶的制备方法，载体的活化采用环氧氯丙烷。

本发明固定化核酸酶的制备方法，核酸酶与载体结合的温度为4℃～30℃，优选的是4℃～25℃，特别优选的是4℃～8℃。

本发明固定化核酸酶的制备方法，核酸酶与载体结合的时间为12～36小时，优选的为16～24小时。

具体实施例

下面结合具体实施例进一步说明本发明，但是并非限定本发明。

实施例一核酸酶与琼脂糖Sepharose-4B的结合

取适量的Sepharose-4B凝胶，于G3砂芯漏斗内抽去保护液，抽滤用真空泵，称湿重50g凝胶Sepharose-4B，用500ml，0.5mol/L NaCL溶液淋洗，除去凝胶内的保护剂，用蒸馏水洗净。

在通风厨内，戴上橡皮手套，小心称取15g BrCN，加入15ml乙腈将其溶解。

将50g凝胶转移到一个500ml的烧杯中，加入75ml0.2mol/L，pH10.0的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，然后将烧杯放置冰浴中，用搅拌器缓慢搅拌。取一支滴管向烧杯内滴加BrCN溶液使它与Sepharose-4B凝胶反应，同时取另一支滴管向烧杯内滴加6mol/L NaOH，使反应液中的pH维持在10.0左右，用pH计测定，将BrCN加完后继续反应5分钟。此时反应液中的pH不再下降，维持在10.0，停止反应。

将活化反应物迅速转移到G3砂芯漏斗内抽滤，抽滤瓶内预先加入一定量的固体硫酸亚铁，以破坏滤液中未反应的BrCN，用1000ml预冷的蒸馏水淋洗，最后浸泡在100ml0.1mol/L，pH9.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中准备偶联。

将核酸酶溶液浓缩到10mg/ml以上，对0.1mol/L，pH9.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液充分透析，测定蛋白浓度10mg/ml。

将已经活化处理好的Sepharose-4B凝胶转移到一个250ml的锥形瓶内，加入50ml核酸酶溶液，混匀，在4℃的振荡偶联20～24小时，终止偶联。

将偶联物转移到G3砂芯漏斗内，用500ml，0.5mol/LNaCL溶液抽滤，淋洗，以除去未被偶联的核酸酶，取一个干净的抽滤瓶收集滤液，测定蛋白浓度0.02mg/ml，根据体积计算未偶联的核酸酶量，计算偶联效率98％，核酸酶结合量9.8mg/g凝胶。凝胶用500ml蒸馏水洗，用150ml0.1mol/L甲酸-0.5mol/L氯化钾，pH2.5甲酸混合液洗，最后用蒸馏水洗至约pH6.5即可。

将凝胶转移到250ml小烧杯内，用150ml0.5mol/L氯化钾-0.05mol/L氯化钙-0.1mol/LTris-CL，pH7.8缓冲液浸泡20分钟后置4℃冰箱备用。

实施例二核酸酶与琼脂糖SepharoseCL-6B的结合

取保存于20％乙醇中的Sepharose CL-6B介质50mL，用过量蒸馏水反复洗涤除去乙醇后，置于G3烧结玻璃漏斗中真空抽干5min；称取10g抽滤后的介质，依次用20％，50％和70％的二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)水溶液清洗，每次清洗后真空抽于清洗液；向处理后的介质中加入6.5ml2mol/L NaOH、1，5ml环氧氯丙烷(ECH)、15ml56％1，4-二氧六环。介质的悬浮液于恒温空气浴摇床上在170r/min下振荡反应2h，反应温度为45℃.反应完后用大量去离子水冲洗，直至清洗液中无环氧基检出。清洗液中环氧基采用硫代硫酸盐测定，以酚酞为指示剂，如清洗液变红，说明有氢氧根离子生成，清洗液中存在游离的环氧基，需要再加去离子水冲洗至溶液不变色为止。用20ml0.1mol/L，pH9.5碳酸钠缓冲液淋洗后备用。

将已经活化处理好的Sepharose-CL-6B10g凝胶转移到一个250ml的锥形瓶内，加入已对0.1mol/L，pH9.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液充分透析，浓度为8.5mg/ml的核酸酶溶液12ml，混匀，在室温振荡偶联16～24小时，终止偶联。

将偶联物转移到G3砂芯漏斗内，用200ml，0.5mol/L NaCL溶液抽滤，淋洗，以除去未被偶联的核酸酶，取一个干净的抽滤瓶收集滤液，测定蛋白浓度为0.06mg/ml，根据体积计算未偶联的核酸酶量，计算偶联效率88.23％。核酸酶结合量为9mg/g凝胶。凝胶用500ml蒸馏水洗，用100ml0.1mol/L甲酸-0.5mol/L氯化钾，pH2.5甲酸混合液洗，最后用蒸馏水洗至约pH6.5即可。

将凝胶转移到100ml小烧杯内，用50ml0.5mol/L氯化钾-0.05mol/L氯化钙-0.1mol/LTris-CL，pH7.8缓冲液浸泡20分钟后置4℃冰箱备用。

实施例三环氧基修饰密度的定量分析

琼脂糖凝胶的环氧基修饰密度采用硫代硫酸钠滴定法测定，经去离子水清洗后的活化介质置于G3漏斗中真空抽干5min，随后称取0.5g置于磨口锥形瓶中并加入约3mL1.3mol/L硫代硫酸钠和酚酞指示剂1～2滴，锥形瓶封口后于室温下振荡反应30min.反应后的溶液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定，直至溶液由红色变为无色为止.根据消耗的盐酸标准溶液的体积，计算环氧基修饰密度：S＝M*(V₀-V₁)/W/ρ＝91.2

其中：S为环氧基修饰密度(mol/mL)；

M为HCl浓度(mol/L)；

V0，V1为滴定前、后HCl的体积(mL)；

ρ为介质密度(1.02g/mL)。

实施例四纤维素载体固定化核酸酶

在室温用10ml0.5mol/L的NaOH浸泡微晶纤维3h，然后用去离子水漂洗至中性，吸干载体水分后再用丙酮进一步干燥。加入吡啶，并在25℃、250r/min恒温水浴振荡器中作用3h，之后向载体吡啶混合物中加入甲苯磺酰氯(1g甲苯磺酰氯溶解于2ml丙酮)，继续在25℃、100r/min恒温水浴振荡器中作用3h，接着用丙酮清洗，最后用5mmol/L的HCL洗去多余的甲苯磺酰氯和吡啶。处理后的载体保存于5mmol/L的HCL放4℃冰箱备用。

10g活化载体用水清洗3次，缓冲液洗涤，将载体加入20ml核酸酶溶液中，酶浓度6.7mg/ml(pH4.5乙酸缓冲液)，于100r/min，18℃的恒温水浴振荡器中固定12～24h，缓冲液洗涤3次，共收集100ml，测定蛋白浓度为0.17mg/ml，酶的回收率为12.7％。核酸酶结合量11.7mg/g纤维素。

实施例五壳聚糖载体固定化核酸酶

30g壳聚糖溶解在600mL0.25mol/L的乙酸溶液中，室温下剧烈搅拌4h，粘稠状液体通过三层棉布过滤除去不溶性杂质，然后逐渐滴加1mmol/L NaOH2L，碱性条件下(pH8.0～10.0)使壳聚糖沉淀，混合液在去离子水中透析3d，离心分离使绝大部分的壳聚糖沉淀下来，双蒸水洗脱，真空冷冻干燥，在研钵中将其粉碎成粉末状，备用。

取50ml核酸酶溶液，加入10g处理好的脱乙酰壳聚糖中，磁力搅拌30min，滴加一定浓度的戊二醛溶液60mL，恒温搅拌一定时间，与4℃冰箱中交联12h，最后用相应pH值的缓冲溶液淋洗，抽干，即得固定化核酸酶。

实施例六固定化核酸酶的活性分析

核酸酶能够将DNA消化分解为3～8b的寡核苷酸链。采用分光光度法进行酶活性测定。配制以下活性测定试剂：

溶液A：称取3.0gTris溶解于450ml蒸馏水中，用1.0mol/LHCL调pH为8.0，定容至500ml，即为50mM Tris-HCL pH8.0的溶液。取100ml50mM Tris-HCL pH8.0，加入20mgMgCl₂，10mg BSA，完全溶解后4℃冰箱备用。

溶液B：10mg鱼精DNA用10ml溶液A溶解，鱼精DNA的浓度为1mg/ml。并经超声处理。

溶液C：0.8ml高氯酸加蒸馏水至20ml。

取溶液B25ml，置于37℃水浴中，加入固定化核酸酶50mg，振荡保温15、30、45、60分钟，分别取样0.5ml，加入已含有0.5ml高氯酸溶液的小管中，混匀后置冰浴30-60分钟，然后4℃离心(10,000rpm，5分钟)，转移上清液1ml置于新的小管中，以空白管上清液调零，测定OD260nm的吸收值。

活性单位定义为37℃，30分钟，鱼精DNA吸光值A260增加1.0所需的酶量为一个活性单位(相当于完全消化37μg鱼精DNA的酶量)。

琼脂糖凝胶Sepharose4B固定化核酸酶的活性512U/g凝胶，琼脂糖凝胶SepharoseCL-6B固定化核酸酶的活性770U/g，纤维素固定化核酸酶活性677U/g纤维素，壳聚糖载体固定化核酸酶活性550U/g壳聚糖。

实施例七固定化核酸酶的的应用

取琼脂糖凝胶Sepharose4B固定化核酸酶25ml装柱，层析柱16/20，装好后用37℃预热的20mM Tris，2mM MgCL₂，pH7.0的缓冲液平衡5个柱床体积，流速5ml/min。灭活的狂犬病毒疫苗收获液50ml调pH7.0，37℃预热后过柱，流速1ml/min，收集流出液，取样测定过柱前后DNA含量，结果过柱前样品DNA含量200ng/ml，过柱后DNA残留量小于100pg/ml，说明固定化核酸酶具有降解样品核酸的作用。

实施例八固定化核酸酶的脱落率

分别取5g琼脂糖凝胶Sepharose4B固定化核酸酶和琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B固定化核酸酶用10ml1XPBS悬浮，每种取5ml分别置于4℃冰箱和37℃，4℃样品每个月取上清500μl，共进行3个月。37℃样品每2小时取一次样，共考察10小时。实验结束后用重组核酸酶ELISA kit检测核酸酶含量。用试剂盒稀释液将标准重组核酸酶稀释成1280、640、320、160、80、40、20pg/ml，每孔分别加100μL，样品每孔100μL，平行2孔，然后于37℃保温2h。倒掉样品孔中的反应液，用蒸馏水将洗涤液20倍稀释后每孔200μL振荡洗涤1～3min，洗板5次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。用稀释液将酶标抗体稀释1000倍后每孔加入100μL，然后于37℃反应1.5h。倒掉未结合的酶标抗体，每孔加入200μL稀释后的洗涤液振荡洗涤，每次1～3min，共5次。然后加入显色液置37℃，20min。每孔加入100μL终止液终止反应。将96孔板放入酶标仪中，进行读数，结果样品中检测不到核酸酶，即固定化核酸酶ELISA检测结果脱落量小于40pg/g凝胶。

实施例九固定化核酸酶的最适pH和温度

取载体Sepharose4B固定化核酸酶1g，用5ml50mMTris-HCL pH8.0，2mM MgCl₂溶液悬浮，放置于20℃、30℃、37℃、45℃、50℃水浴中保温10分钟后，然后按实施例六方法测定酶活性，酶反应的温度分别为20℃、30℃、37℃、45℃、50℃，结果酶活性分别为350U/g、413U/g、550U/g、406U/g、277U/g、37℃测定的酶反应活性最高，酶最适反应温度为37℃。

用不同pH的50mM缓冲溶液：柠檬酸-柠檬酸三钠(pH5.0，6.0)；KH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH7.0)；Tris-HCL(pH8.0)；HBO₃-KCL-NaOH(pH9.0)各5ml悬浮1g载体Sepharose CL-6B固定化核酸酶，并补加终浓度为2mM MgCl₂，按实施例六方法在不同pH条件下测定酶活性，结果pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下的酶活性分别为258U/g、515U/g、587U/g、686U/g、432U/g，结果酶的最适pH为8.0，在pH6.0～8.0具有较好的酶活性。

本发明的上述实施例并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本发明说明书后可以根据需要对实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (2)

1.一种制备固定化酶的方法，其特征在于：Sepharose-4B凝胶，于G3砂芯漏斗内抽去保护液，称湿重50g凝胶Sepharose-4B，用500ml，0.5mol/LNaCL溶液淋洗，用蒸馏水洗净；称取15g BrCN，加入15ml乙腈将其溶解；50g凝胶加入75ml 0.2mol/L，pH10.0的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，置冰浴中，缓慢搅拌；向烧杯内滴加BrCN溶液使它与Sepharose-4B凝胶反应，同时滴加6mol/L NaOH，使反应液中的pH维持在10.0；将BrCN加完后继续反应5分钟，此时反应液中的pH不再下降，维持在10.0，停止反应；将活化反应物迅速转移到G3砂芯漏斗内抽滤，预冷的蒸馏水淋洗，最后浸泡在100ml 0.1mol/L，pH9.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中准备偶联；核酸酶溶液浓缩到10mg/ml以上，对0.1mol/L，pH9.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液充分透析，测定蛋白浓度10mg/ml；50ml核酸酶溶液加入已经活化处理好的Sepharose-4B凝胶，混匀，在4℃振荡偶联24小时，终止偶联；将偶联物转移到G3砂芯漏斗内，用500ml，0.5mol/LNaCL溶液抽滤，淋洗；凝胶用500ml蒸馏水洗，用150ml0.1mol/L甲酸-0.5mol/L氯化钾，pH2.5甲酸混合液洗，最后用蒸馏水洗至pH6.5，其中所述的核酸酶为粘质沙雷氏菌非特异性核酸内切酶。

2.一种制备固定化核酸酶的方法，其特征在于：Sepharose CL-6B凝胶50mL，用过量蒸馏水反复洗涤除去乙醇后，置于G3烧结玻璃漏斗中真空抽干5min；称取10g抽滤后凝胶，依次用20％，50％和70％的二甲基亚砜水溶液清洗，每次清洗后真空抽干清洗液；向处理后的介质中加入6.5ml 2mol/L NaOH、1,5ml环氧氯丙烷(ECH)、15ml 56％1，4-二氧六环，恒温振荡反应2h，反应温度为45℃，反应结束后用大量去离子水冲洗，直至清洗液中无环氧基检出；用20ml 0.1mol/L，pH9.5碳酸钠缓冲液淋洗后备用；将已经活化处理好的Sepharose-CL-6B 10g凝胶转移到一个250ml的锥形瓶内，加入已对0.1mol/L，pH9.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液充分透析，浓度为8.5mg/ml的核酸酶溶液12ml，混匀，在室温振荡偶联16小时，终止偶联；将偶联物转移到G3砂芯漏斗内，用200ml，0.5mol/L NaCL溶液抽滤，淋洗；凝胶用500ml蒸馏水洗，用100ml 0.1mol/L甲酸-0.5mol/L氯化钾，pH2.5甲酸混合液洗，最后用蒸馏水洗至pH6.5，其中所述的核酸酶为粘质沙雷氏菌非特异性核酸内切酶。