CN109370907B

CN109370907B - 一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法

Info

Publication number: CN109370907B
Application number: CN201811249584.0A
Authority: CN
Inventors: 鲁亮; 肖水冰; 秦伏波; 张永霞
Original assignee: Pujian Bio Wuhan Technology Co ltd
Current assignee: Pujian Bio Wuhan Technology Co ltd
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2038-10-25
Also published as: CN109370907A

Abstract

本发明公开了一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法，通过以正硅酸乙酯、Fe₃O₄磁性纳米粒子为原料，先制备出表面包裹一层Fe₃O₄磁性纳米粒子的二氧化硅纳米粒，然后再在表面进行接枝改性，将核酸酶固定在表面，制的一种特殊的固定化核酸酶。相比于市面上常见的磁珠式核酸酶，利用这种固定化核酸酶澄清大肠杆菌裂解液，水解能力更强，水解后的大肠杆菌裂解液粘度大大降低，能够稳定性好，储存时间可达2年以上；活力高，反复使用活性扔保持较高水品。

Description

一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法。

背景技术

在生物技术领域中，大肠杆菌重组蛋白表达系统以其遗传背景清楚，细胞繁殖快，产量高，易于发酵放大，价格低廉等优势成为最常用的重组蛋白表达系统。胞内表达的重组蛋白在大肠杆菌细胞裂解之后需要进行过滤澄清之后才可用于下一步的层析纯化。为了能够提取出某一种微生物或动植物组织细胞中的成分(DNA、蛋白质等)，往往需要对大肠杆菌的细胞先进行大量增殖，然后采用超声波破碎或化学破碎，使细胞破裂，细胞中的各种物质释放出来，形成细胞裂解液。

生物组织或菌体裂解后，由于大量的核酸释放出来，裂解液的粘度迅速升高，这是由于大量核酸悬浊在液体中导致的，给后期的膜过滤造成很大的负担，过滤效率严重降低，使过滤澄清变得极为困难。

核酸酶是一种能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，有些核酸酶只能作用于DNA，有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA。

发明内容

将核酸酶加至裂解液中，能够一定程度降低裂解液的粘度，但是其效果并不十分理想。为了进一步降低大肠杆菌裂解液粘度，本发明在核酸酶的固定化上进行研究，采用一种具有较高稳定性的固定化核酸酶，将其用于大肠杆菌裂解液的水解澄清方法中，不仅有效降低了裂解液的粘度，其稳定性也大大增强，并能反复多次使用而活性降低程度极小。具体通过以下技术实现。

一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法，采用固定化核酸酶水解大肠杆菌裂解液中的核酸；

其中，所述固定化核酸酶的制备方法为：

A1、取正硅酸乙酯、蒸馏水和无水乙醇混匀，且体积比为1～2.5:1:1，得混合液Ⅰ；

A2、取Fe₃O₄磁性纳米粒子加至混合液Ⅰ中，加入质量分数为26％的氨水催化，在磁场中搅拌8～12h，得混合液Ⅱ；

A3、取混合液Ⅱ于磁力架上静置10min，过滤取滤渣用超纯水反复洗涤至洗涤液为中性，在40～60℃条件下真空干燥6～10h，得磁性二氧化硅纳米粒；

A4、取3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷的乙醇溶液加至磁性二氧化硅纳米粒中，同时加入偶氮二异丁腈，反复搅拌2～4h，静置3～6h，得表面改性接枝处理的磁性二氧化硅纳米粒溶液，即溶液Ⅰ；

A5、在溶液Ⅰ中加入核酸酶，在37℃下超声波振荡反应10～15min，再过滤取沉淀物在45～55℃下烘干，冷却得固定化核酸酶。

上述固定化核酸酶中，通过在二氧化硅表面覆盖一层Fe₃O₄，然后在进行表面接枝改性的方式，使核酸酶在磁性二氧化硅纳米粒表面结合更稳定牢固，储存时间可达2年以上，在利用固定化核酸酶澄清裂解液后，回收的固定化核酸酶在再次使用是，酶的活性仍能保持较高水平，仅仅降低约1～3％，因此能够反复多次使用。

优选地，步骤A5中,所述超声波振荡的频率为20kHz～30kHz。

优选地，步骤A5中,烘干温度为45℃。

更优选地，所述核酸酶的氨基酸序列为：

MRFNNKMLALVALLFAAQASADTLESIDNCAVGCPTGGSSNVSIVRHAYTLNNNSTTKFANWVAYHITKDTPASGKTRNWKTDPALNPADTLAPADYTGANAALKVDRGHQAPLASLAGVSDWESLNYLSNITPQKSDLNQGAWARLEDQERKLIDRADISSVYTVTGPLYERDMGKLPGTQKAHTIPSAYWKVIFINNSPAVNHYAAFLFDQNTPKGADFCQFRVTVDEIEKRTGLIIWAGLPDDVQASLKSKPGVLPELMGCKN。

上述核酸酶是一种全能核酸酶，它可以高效降解所有形式(包括单链、双链、线状、环状、天然以及变性)的核酸，将其水解成3～8个碱基长度的寡核苷酸，且不具有碱基识别特异性。这种全能核酸酶在非常广泛条件下都能保持很高的稳定性和消化活力，非常适用于作为各类科学研究以及疫苗、蛋白、多糖类制药工业的首选酶制剂。

本发明中用于大肠杆菌裂解液澄清的方法，包括以下步骤：

B1、按每100mL大肠杆菌裂解液加入4～8g的量加入固定化核酸酶，在37℃下恒温水浴2～4h并不断搅拌；

B2、采用磁力架进行磁分离2～5min，得溶液Ⅱ；

B3、将溶液Ⅱ过滤，取滤渣用超纯水洗涤，将洗涤水倒入滤液中混匀，洗涤后的滤渣和混匀后滤液即分别为回收的固定化核酸酶和澄清后的大肠杆菌裂解液。

优选地，步骤B1中，按每100mL大肠杆菌裂解液加入5.8g的量加入固定化核酸酶。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

1、固定化核酸酶中，通过在二氧化硅表面覆盖一层Fe₃O₄，然后在进行表面接枝改性的方式，使核酸酶在磁性二氧化硅纳米粒表面结合更稳定牢固，储存时间可达2年以上；

2、在利用固定化核酸酶澄清裂解液后，回收的固定化核酸酶在再次使用是，酶的活性仍能保持较高水平，每次使用后酶的活性仅仅降低约1～3％，因此能够反复多次使用；

3、全能核酸酶可以高效降解所有形式的核酸，对大肠杆菌裂解液的澄清效果更好，经水解后的裂解液在过滤时比未水解的裂解液在过滤时间上至少缩短了30％。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例1～4，比较例1、2，空白对照中，大肠杆菌裂解液的制备方法如下：

C1、菌体培养

配制4升LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH7.0)，培养基配好后于121℃温度下湿热消毒灭菌30min。灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加Amp使其终浓度为100mg/L，冷却后置4℃冰箱中备用。

无菌操作条件下在平板中挑取pET-22a-NU-nc单菌落于100mlLB培养基(含Aamp)中，然后置于37℃下，180rpm摇床培养过夜。从培养过夜的种子培养物按2％接种量转接于LB培养基中，于37℃、250rpm培养4小时，培养液的OD600约为0.8，然后加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L。继续培养4小时，离心收集菌体(5,000rpm×10min)。菌体用洗涤液20mMTris-HCl，pH7.0，0.15MNaCl洗涤2-3次。

C2、菌体破碎

取约10g湿菌体，按1g湿菌体加20ml破菌缓冲液(50mM Tris-HCl buffer，0.1MNaCl，pH8.5)悬浮菌体，即用200mL破菌缓冲液悬浮菌体，然后冰浴超声破碎(超声功率5000W，每次超声5s，间歇5s，即占空比50％，共进行90个循环)，收集破菌上清：10,000rpm离心10min，收集上清液，得大肠杆菌裂解液。

以下实施例1～4，比较例1中，固定化核酸酶的制备方法为：

A1、取正硅酸乙酯、蒸馏水和无水乙醇混匀，且体积比为2:1:1，得混合液Ⅰ；

A2、取Fe₃O₄磁性纳米粒子加至混合液Ⅰ中，加入质量分数为26％的氨水催化，在磁场中搅拌9h，得混合液Ⅱ；

A3、取混合液Ⅱ于磁力架上静置10min，过滤取滤渣用超纯水反复洗涤至洗涤液为中性，在55℃条件下真空干燥8h，得磁性二氧化硅纳米粒；

A4、取3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷的乙醇溶液加至磁性二氧化硅纳米粒中，同时加入偶氮二异丁腈，反复搅拌3.5h，静置5.5h，得表面改性接枝处理的磁性二氧化硅纳米粒溶液，即溶液Ⅰ；

A5、在溶液Ⅰ中加入核酸酶，在37℃下超声波振荡反应15min，再过滤取沉淀物在45下烘干，冷却得固定化核酸酶。

实施例1

B1、按每100mL大肠杆菌裂解液加入5.8g的量加入固定化核酸酶，在37℃下恒温水浴4h并不断搅拌；

B2、采用磁力架进行磁分离5min，得溶液Ⅱ；

实施例2

B1、按每100mL大肠杆菌裂解液加入8g的量加入固定化核酸酶，在37℃下恒温水浴2～4h并不断搅拌；

B2、采用磁力架进行磁分离5min，得溶液Ⅱ；

实施例3

B1、按每100mL大肠杆菌裂解液加入4g的量加入固定化核酸酶，在37℃下恒温水浴4h并不断搅拌；

B2、采用磁力架进行磁分离5min，得溶液Ⅱ；

实施例4

B2、采用磁力架进行磁分离5min，得溶液Ⅱ；

本实施例的固定化核酸酶中，核酸酶的氨基酸序列为：

比较例1

B1、按每100mL大肠杆菌裂解液加入4～8g的量加入普通核酸酶，在37℃下恒温水浴2～4h并不断搅拌；

B2、采用磁力架进行磁分离2～5min，得溶液Ⅱ；

比较例2

B1、按每100mL大肠杆菌裂解液加入4～8g的量加入固定化核酸酶S，在37℃下恒温水浴2～4h并不断搅拌；

B2、采用磁力架进行磁分离2～5min，得溶液Ⅱ；

B3、将溶液Ⅱ过滤，取滤渣用超纯水洗涤，将洗涤水倒入滤液中混匀，洗涤后的滤渣和混匀后滤液即分别为回收的固定化核酸酶S和澄清后的大肠杆菌裂解液。

本实施例选用的固定化核酸酶S，是选用常州天地人和生物科技有限公司的普通硅基磁性微球核酸酶。

应用例1：采用固定化核酸酶水解后大肠杆菌裂解液的粘度的测定

设立空白组对照，选用便携式粘度计分别测定采用实施例1～4，比较例1、2的方法澄清后的大肠杆菌裂解液的粘度，结果如下表1所示。

表1澄清后的大肠杆菌裂解液的粘度表

注：蒸馏水的粘度为1cp。

由上表1可知，采用本发明提供的固定化核酸酶对大肠杆菌裂解液进行澄清，对裂解液中的DNA、RNA的水解效果更好，能显著降低裂解液的粘度。采用市面上常用的磁性微球核酸酶，其水解效果没有本发明的固定化核酸酶好。选用实施例4所述的具有特定氨基酸序列的核酸酶制备的固定化核酸酶，由于对各种形式的DNA、RNA片段均具有非常好的水解效果，水解后的裂解液粘度最低。

应用例2：检测固定化核酸酶的活性

(1)检测固定化核酸酶的活性的方法

取0.1g待测核酸酶，放入离心管中，加入0.05mL巯基乙醇、1mL酵母RNA以及0.35mLpH值为4.8的HAc混合均匀，在37℃下水浴保温30min。

然后将离心管冰浴4min，加入1.5mL冷的硝酸镧-HCl溶液，强烈震荡后置于冷冻离心机中离心15min(5000rpm/min)，测定上清液的体积。

最后取上清液0.3mL和2.7mL蒸馏水定容至3mL；用紫外分光光度计在260nm下测定OD值，活力单位＝10×OD值。

(2)待测核酸酶分组

取未使用过的固定化核酸酶、固定化核酸酶S，记为原始组和原始组S；

按照实施例1和比较例2的方法分别利用固定化核酸酶、固定化核酸酶S后，取回收后的固定化核酸酶、固定化核酸酶S，记为回收1组、回收S1组；

按照实施例1的大肠杆菌裂解液的澄清方法进行试验，回收固定化核酸酶、固定化核酸酶S再利用2次，即固定化核酸酶、固定化核酸酶S分别利用了3次，记为回收2组、回收S2组。

(3)将分好组的待测核酸酶按照上述方法测定各组核酸酶的OD值，进而计算出活力单位，如下表2所示.

表2带测定核酸酶活力单位表

组名	活力单位
		原始组	1.09
原始组S	1.08
		回收1组	1.07
回收S1组	1.01
		回收2组	1.04
回收S2组	9.89

由上表2可知，其经过多次回收再利用，本发明所用的固定化核酸酶，其活性降低成都非常小，因而可以反复多次使用。

序列表

<110> 普健生物(武汉)科技有限公司

<120> 一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法

<141> 2018-10-25

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Phe Asn Asn Lys Met Leu Ala Leu Val Ala Leu Leu Phe Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ala Ser Ala Asp Thr Leu Glu Ser Ile Asp Asn Cys Ala Val

20 25 30

Gly Cys Pro Thr Gly Gly Ser Ser Asn Val Ser Ile Val Arg His Ala

35 40 45

Tyr Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Thr Lys Phe Ala Asn Trp Val Ala

50 55 60

Tyr His Ile Thr Lys Asp Thr Pro Ala Ser Gly Lys Thr Arg Asn Trp

65 70 75 80

Lys Thr Asp Pro Ala Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala Asp

85 90 95

Tyr Thr Gly Ala Asn Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly His Gln Ala

100 105 110

Pro Leu Ala Ser Leu Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn Tyr

115 120 125

Leu Ser Asn Ile Thr Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala Trp

130 135 140

Ala Arg Leu Glu Asp Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ser Ser Val Tyr Thr Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met Gly

165 170 175

Lys Leu Pro Gly Thr Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr Trp

180 185 190

Lys Val Ile Phe Ile Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala Ala

195 200 205

Phe Leu Phe Asp Gln Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln Phe

210 215 220

Arg Val Thr Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile Trp

225 230 235 240

Ala Gly Leu Pro Asp Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro Gly

245 250 255

Val Leu Pro Glu Leu Met Gly Cys Lys Asn

260 265

Claims

1.一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法，其特征在于，采用固定化核酸酶水解大肠杆菌裂解液中的核酸；

其中，所述固定化核酸酶的制备方法为：

A2、取Fe3O4磁性纳米粒子加至混合液Ⅰ中，加入质量分数为26%的氨水催化，在磁场中搅拌8～12h，得混合液Ⅱ；

A5、在溶液Ⅰ中加入核酸酶，在37℃下超声波振荡反应10～15min，再过滤取沉淀物在45～55℃下烘干，冷却得固定化核酸酶，所述核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的用于大肠杆菌裂解液澄清的方法包括以下步骤：

B2、采用磁力架进行磁分离2～5min，得溶液Ⅱ；

2.根据权利要求1所述的用于大肠杆菌裂解液澄清的方法，其特征在于，步骤A5中,所述超声波振荡的频率为20kHz～30kHz。

3.根据权利要求1所述的用于大肠杆菌裂解液澄清的方法，其特征在于，步骤A5中,烘干温度为45℃。

4.根据权利要求1所述的用于大肠杆菌裂解液澄清的方法，其特征在于，步骤B1中，按每100mL大肠杆菌裂解液加入5.8g的量加入固定化核酸酶。