CN106591274B - 一种固定化核酸酶p1及其制备方法与其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定化核酸酶P1的制备方法，包括如下步骤：(1)改性树脂：以表面修饰剂改性介孔树脂，得到表面改性的介孔树脂载体，所述的表面改性剂为伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一种或几种的混合物；所述的介孔树脂为环氧基树脂、氨基树脂、磺酸基树脂或者羧基化树脂；(2)核酸酶P1固定化：将步骤(1)得到的介孔树脂载体加入到0.5~6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1与树脂的质量比为10~250mg：1g，混合，在25℃振荡反应时间2~12h，抽滤得到树脂固定化核酸酶P1。本发明提供的表面改性介孔树脂微球固定化方法，核酸酶P1的催化性能高，可使RNA水解率达到95%以上。

Description

一种固定化核酸酶P1及其制备方法与其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体设计一种固定化核酸酶P1及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，由于生物催化反应具有底物特异性、反应效率高等优势而备受关注。然而生物酶在工业环境下稳定性差、耐受性差、重复利用性差及分离困难，难以实现连续化。而解决酶催化工业应用的关键技术就是固定化。
核苷酸具有很高的经济价值，广泛应用于生物医药、食品、饲料和营养保健等领域。目前生产核苷酸的方法有水解法、微生物发酵法、化学合成法及自溶法等，化学合成法着重于核苷的磷酸化，生产成本高效率低，且用到有毒的化工原料，与提倡绿色产品的理念相违背；微生物发酵法生产成本低效率高，但核苷酸生产难度较大，目前仅有肌苷酸和鸟苷酸实现了工业化生产；自溶法产物浓度低，总收率较低，提取困难；酶解法利用酶水解RNA，该方法生产核苷酸成本低、收率高、操作简单，是目前主要的核苷酸生产方法。
核酸酶P1是一种含锌金属酶，由桔青霉发酵生成，具有磷酸二酯酶特性，能将单链DNA和RNA水解为5’-核苷酸，是核苷酸工业化生产中最常用的一种酶。研究表明游离酶利用率低、产物底物双抑制、产品分离纯化困难，导致工业生产中难以实现连续化，因此固定化酶连续生产核苷酸的研究成为重点。
树脂作为一种人工合成的介孔多聚物，具有机械强度高、稳定性好、载酶量大、易于分离、可重复使用等优点，已经被广泛用作固定化酶载体。然而该固定酶存在固定量及酶活性偏低、稳定性不够等问题，因此需要选择合适的表面修饰剂对树脂表面进行改性以提高固定化酶的固载量、酶活性及热稳定性。
伴刀豆蛋白A（ConA）作为一种凝集素，对含有甘露糖或者葡萄糖的糖蛋白具有特异性的亲和力，实现酶的定向固定化，使酶在载体表面按照一定的方向排列，使底物易进入到酶的活性位点，从而改善酶的酶学性质。利用戊二醛将ConA和载体交联在一起，然后核酸酶P1的糖基部分和ConA连接起来，通过核酸酶P1的糖基部分实现酶的定向固定化，没有必须氨基酸残基参与共价结合，且避免了固定化过程中由于酶分子与交联剂直接接触对酶分子造成的化学损伤。
聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)简称PVP，是一种非离子型水溶性高分子化合物，由N-乙烯基吡咯烷酮在一定条件下聚合而成，由于其良好的水溶性、化学稳定性、生物相容性和生物惰性，在材料表面改性中逐渐表现出较好的应用前景。PVP改性载体表面具有良好的抗蛋白质吸附能力，选择性的吸附特定的蛋白，且PVP的包覆和空间位阻作用可抑制酶的团聚，使酶在载体表面均匀分布，进一步提高酶的稳定性。
聚乙二醇（PEG）分子末端有两个能被活化的-OH基团，能够与水形成氢键，使其具有良好的水溶性，是一种被广泛使用的化学修饰材料。PEG无毒、无免疫原性、具有良好的生物相容性，且其生物相容性已通过美国食品和药物管理局(FDA)认证。
多巴胺是一种生物神经递质，具有优良分散性、粘附性、亲水性及生物相容性等优点,在碱性有氧条件下可在几乎所有材料表面发生自聚合反应，形成一层强力黏附在固体材料表面的聚多巴胺层，成为用于酶固定化领域的一种理想材料。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种固定化核酸酶P1，以解决现有技术中游离酶利用率低、产物底物双抑制、产品分离纯化困难的问题。
本发明还要解决的技术问题是提供上述固定化核酸酶P1的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题提供上述固定化核酸酶P1在水解RNA制备核苷酸中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种固定化核酸酶P1的制备方法，包括如下步骤：
(1) 改性树脂：以表面修饰剂改性介孔树脂，得到表面改性的介孔树脂载体，所述的表面改性剂为伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一种或几种的混合物；所述的介孔树脂为环氧基树脂、氨基树脂、磺酸基树脂或者羧基化树脂；
(2) 核酸酶P1固定化：将步骤(1)得到的介孔树脂载体加入到0.5~6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1与树脂的质量比为10~250mg:1g，核酸酶P1与树脂的质量比优选100mg:1g，在25℃振荡反应时间2~12h，抽滤得到树脂固定化核酸酶P1。
步骤(1)中，利用伴刀豆蛋白改性介孔树脂的方法如下：
(1a) 伴刀豆蛋白活化：将伴刀豆蛋白溶于缓冲液中，所述的缓冲液包括如下组分：0.1mol/L KCl、0.01 mol/L CaCl2、0.01 mol/L MnCl2、0.1mol/L KH2PO4、0.1mol/LK2HPO4、pH7.0，得到伴刀豆蛋白溶液；
(1b) 戊二醛活化介孔树脂：将50~200g介孔树脂加入400mL、0.1mol/L pH 8.0的磷酸缓冲液，搅拌15~60min，得到戊二醛活化的介孔树脂；
(1c) 伴刀豆蛋白修饰介孔树脂：将戊二醛活化的介孔树脂加入伴刀豆蛋白溶液中，在25℃、150rmp下震荡6~18h，去除上清，水洗介孔树脂，得到伴刀豆蛋白修饰的介孔树脂。
步骤(1)中，利用聚乙二醇、聚多巴胺、聚乙烯吡咯烷酮改性介孔树脂的方法如下：
(2a) 配制改性剂溶液：0.05~5g/g聚乙二醇溶液、0.1~3g/L盐酸多巴胺Tris溶液、1~5g/L聚乙烯吡咯烷酮溶液；
(2b) 取1~5g介孔树脂于反应容器中，加入50~300mL相应的改性剂溶液，置于25℃、120~180rmp恒温摇床中震荡，去除上清，水洗介孔树脂，得到改性的介孔树脂。
步骤(2)中，所述的核酸酶P1的氨基酸序列如SEQ ID NO. ：1所示。
上述述固定化核酸酶P1的制备方法制备得到的树脂固定化核酸酶P1在本发明的保护范围之内。
上述树脂固定化核酸酶P1在水解RNA制备核苷酸中的应用在本发明的保护范围之内。
本发明所提供的表面改性的树脂微球可以用于固定化核酸酶P1，进行连续催化水解RNA制备核苷酸，实验表明，本发明制备的固定化酶可使RNA的转化率保持在95%以上。
本发明的优点和有益效果在于：（1）本发明提供的介孔树脂微球表面改性方法工艺简单，利用表面改性介孔树脂微球固定化酶效果明显；（2）本发明提供的表面改性介孔树脂微球固定化方法，核酸酶P1的催化性能高，可使RNA水解率达到95%以上；（3）本发明提供的表面改性介孔树脂微球固定化方法，核酸酶P1性质稳定，可重复使用。
附图说明
图1是本发明的介孔树脂微球形貌结构表征的FESEM图谱。通过FESEM表征可看出树脂微球样品呈球状形貌，直径约0.5mm。图1(b)为树脂微球横截面的FESEM图，可见微球内部结构蓬松、孔道丰富。图1(c，d)分别是对微球表面和截面的放大，可清晰看出孔道和内部多孔结构的存在。
图2是戊二醛活化的介孔树脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA-E的FTIR图。
图3是戊二醛活化的介孔树脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA-E的热重分析图。
图4是戊二醛活化的介孔树脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA-E的氮气吸附-脱附等温线。
图5是戊二醛活化的介孔树脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA-E的孔径分布曲线。
图6是两种介孔树脂固定核酸酶P1的酶的活力对比图，其中HA-GA-E表示固定化酶所用载体为不添加任何修饰剂的戊二醛活化的介孔树脂，HA-GA-ConA-E表示固定化酶所用载体为伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂。
图7是ConA修饰介孔树脂固定核酸酶P1的热稳定性。
图8是表面改性介孔树脂固定核酸酶P1在水相中催化核糖核酸水解反应的水解率。其中，none表示利用不添加任何修饰剂的介孔树脂作为载体，ConA表示利用伴刀豆蛋白修饰的介孔树脂作为载体，PEG表示利用聚乙二醇修饰的介孔树脂作为载体，PVP表示利用聚乙烯吡咯烷酮修饰的介孔树脂作为载体，pDopa表示利用聚多巴胺修饰的介孔树脂作为载体。
图9是表面改性介孔树脂固定核酸酶P1在水相中催化核糖核酸水解反应的的操作稳定性。其中，none表示利用不添加任何修饰剂的介孔树脂作为载体，ConA表示利用伴刀豆蛋白修饰的介孔树脂作为载体，PEG表示利用聚乙二醇修饰的介孔树脂作为载体，PVP表示利用聚乙烯吡咯烷酮修饰的介孔树脂作为载体，pDopa表示利用聚多巴胺修饰的介孔树脂作为载体。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明的使用的介孔树脂微球形貌结构表征的FESEM图谱如图1所示。
实施例1：伴刀豆蛋白A（ConA）修饰氨基树脂固定化核酸酶P1的制备。
1、ConA修饰氨基树脂的制备。
(1) ConA活化：将一定质量的ConA溶于0.1mol/LKCl、0.01mol/LCaCl2、0.01mol/LMnCl2 pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液中，4℃活化6h；
(2) 戊二醛活化氨基树脂：100g氨基树脂加入400mL、0.1mol/L pH 8.0的磷酸缓冲液，搅拌15分钟后，测pH，维持 pH 7.8~8.2，1小时后过滤抽干，该步骤是为了清洗氨基树脂。然后将得到的氨基树脂，加入400mL 2％(w/w)的戊二醛磷酸缓冲液，25℃下，搅拌1小时，过滤，用去离子水洗涤载体至水清得到戊二醛活化的氨基树脂HA-GA；
(3) ConA修饰氨基树脂：取2g步骤(2)得到的氨基树脂于三角瓶中，加入活化的ConA溶液，置于恒温摇床中震荡，一定时间后分离上清并用水洗去表面结合的松散ConA，抽滤得到ConA表面改性氨基树脂HA-GA-ConA，冰箱4℃保存。图2为ConA修饰的氨基树脂的FTIR图，图3是ConA修饰的氨基树脂的热重分析图。图2表明，ConA修饰氨基树脂后-C=O峰强度减弱，-C=N峰强度增加，说明ConA的氨基通过与氨基树脂上醛基相互作用形成shiff碱，证明了ConA修饰氨基树脂的可行性。
1、ConA修饰氨基树脂固定化核酸酶P1的制备。
取1g上述空白载体于三角瓶中，加入100mL、0.2mg/mL的酶液，并调节酶液pH至5.8~6.2，120rpm室温搅拌，10h后分离上清并用水洗去表面结合松散的蛋白，抽滤干燥，冰箱4℃保存。同时考察不同酶量、酶浓度、酶液pH及固定时间对酶固定化效果的影响，收集剩余固定液以备检测蛋白浓度，得到的固定酶。图4是氨基树脂氮气吸附-脱附等温线和孔径分布曲线，HA表示氨基树脂，HA-ConA表示伴刀豆蛋白A修饰的氨基树脂，HA-ConA-E表示固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修饰氨基树脂。图4、图5是戊二醛活化的氨基树脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修饰的氨基树脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修饰的氨基树脂HA-GA-ConA-E的氮气吸附-脱附等温线和孔径分布曲线。从图4可以看出样品的氮气吸附等温线是Ⅰ型和IV型的耦合，说明具有氨基和微孔复合结构；从图5中可看出ConA修饰及固定化核酸酶P1后，由于ConA和核酸酶P1的添加会使大孔变小孔，造成孔分布区间中小孔的比例大幅提升。
2、ConA修饰氨基树脂固定化核酸酶P1生产核苷酸中的应用
(1) 与利用不添加任何修饰剂的氨基树脂作为载体进行固定化核酸酶P1（HA-GA-E）相比，ConA改性氨基树脂作为载体固定化核酸酶P1（HA-GA-ConA-E）酶载量提高20%，酶活回收率高达75%。
从图6可以看出利用ConA修饰氨基树脂后固定化酶活有所提高，从图7中可以看出，相同温度下，利用ConA修饰氨基树脂作为载体固定化核酸酶P1（HA-GA-ConA-E）酶活比利用不添加任何修饰剂的氨基树脂直接固定化核酸酶P1（HA-GA-E）的酶活高近20%。
(2) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述ConA修饰氨基树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，水解率高达95%，结果见图8。
(3) 在每一次反应完成后，将固定化酶取出，用去离子水洗涤，用于下一批次的催化。结果表明：ConA修饰氨基树脂固定化核酸酶P1重复使用10次后，水解率仍能达到初始水解率的97%，结果见图9。
4、采用紫外法测定固定化核酸酶P1的活力
将一定体积的底物溶液（5%RNA与0.2mol/L pH5.0的醋酸缓冲液1:1混合）于70℃恒温水浴，10min后加入一定量的固定酶，70℃反应15min后加入等体积核酸沉淀剂（0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸），冰水浴10min后离心、取上清液，蒸馏水稀释一定倍数，测定其260nm处的吸光值A260。以先加沉淀剂者作为对照。在上述条件下，每分钟所生成的核苷酸在260nm处的吸光值的差值为1.0时定义为1个酶活力单位。其计算公式如下：
U为固定酶酶活(U·g-1)，V为反应液的总体积(mL)，α为游离酶的稀释倍数，β为离心上清夜的稀释倍数，m为加入固定酶的质量(g)。
ConA修饰氨基树脂固定化核酸酶P1酶活相比较未经修饰的树脂固定酶提高20%。
参照酶活测定方法，调节反应温度30~90℃，其余操作不变，考察温度对ConA修饰氨基树脂固定化核酸酶P1催化效果的影响。结果表明ConA修饰氨基树脂固定化核酸酶P1温度耐热性增加。
实施例2：聚乙二醇（PEG）修饰氨基树脂固定化核酸酶P1的制备。
1、PEG修饰氨基树脂
(1) 将分子量10KDa的PEG溶于0.1mol/L的磷酸缓冲液中，配制成PEG溶液；
(2) 取2g氨基树脂于三角瓶中，加入一定量的PEG溶液，置于恒温摇床中震荡，一定时间后分离，抽滤得到PEG表面改性氨基树脂，冰箱4℃保存。
2、PEG修饰氨基树脂固定化核酸酶P1的制备
取1g上述空白载体于三角瓶中，加入100mL、0.1mg/mL的酶液，并调节酶液pH5.5，100rpm室温搅拌，6~8h后分离上清并用水洗去表面结合松散的蛋白，抽滤干燥得到PEG改性氨基树脂作为载体的固定化核酸酶P1，冰箱4℃保存。同时考察不同酶量、酶浓度、酶液pH及固定时间对酶固定化效果的影响，收集剩余固定液以备检测蛋白浓度，得到的固定酶。
3、PEG修饰氨基树脂固定化核酸酶P1生产核苷酸中的应用
(1) 参照上述酶活测定方法，结果表明：PEG修饰氨基树脂固定化核酸酶P1酶活相比较未经修饰的树脂固定酶提高30%，酶活回收率高达65%。
(2) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述PEG修饰氨基树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，水解率高达95%，结果见图8。
(3) 在每一次反应完成后，将固定化酶取出，用去离子水洗涤，用于下一批次的催化。结果表明：PEG修饰氨基树脂固定化核酸酶P1重复使用10次后，水解率仍能达到初始水解率的97%，结果见图9。
实施例3：聚多巴胺（pDopa）修饰磺酸基化树脂固定化核酸酶P1的制备。
1、聚多巴胺修饰磺酸基化树脂
(1) Tris缓冲液中添加一定量的盐酸多巴胺，调节溶液pH7.8~8.2。
(2) 取2g磺酸基化树脂三角瓶中，加入50mL的盐酸多巴胺Tris缓冲液，置于25℃、180rmp恒温摇床中震荡，3~5h分离树脂，洗去未结合的盐酸多巴胺，抽滤得到聚多巴胺表面改性磺酸基化树脂，4℃冰箱保存。
2、聚多巴胺修饰磺酸基化树脂固定化核酸酶P1的制备
取1g上述载体于三角瓶中，加入50mL、0.1mg/mL的酶液，并调节酶液pH5.5~6.5，120rpm室温搅拌，一定时间后分离上清并用水洗去表面结合松散的蛋白，抽滤干燥得到聚多巴胺改性磺酸基化树脂作为载体的固定化核酸酶P1，冰箱4℃保存。同时考察不同酶量、酶浓度、酶液pH及固定时间对酶固定化效果的影响，收集剩余固定液以备检测蛋白浓度，得到的固定酶。
3、聚多巴胺修饰磺酸基化树脂固定化核酸酶P1生产核苷酸中的应用
(1) 参照上述酶活测定方法，结果表明：聚多巴胺修饰磺酸基化树脂固定化核酸酶P1酶活回收率高达70%，单位载体酶活为20000U·g-1。
(2) 考马斯亮蓝方法检测树脂载酶量，结果表明：聚多巴胺修饰磺酸基化树脂固定化核酸酶P1载酶量可达50mg/g。
(3) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述聚多巴胺修饰磺酸基化树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，水解率高达95%，结果见图8。
(4) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述聚多巴胺修饰磺酸基化树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，反应10批次后，水解率仍为初始水解率的97%以上，结果见图9。
实施例4：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）环氧基树脂固定化核酸酶P1的制备。
1、PVP修饰环氧基树脂
(1) 去离子水配制一定浓度的PVP溶液，磷酸盐调节溶液pH；
(2) 取2g戊二醛活化的环氧基树脂于三角瓶中，加入一定体积的PVP溶液，置于25℃、150rmp恒温摇床中震荡，5h后分离，抽滤得到PVP表面改性环氧基树脂，4℃冰箱保存。
2、PVP修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1的制备
取1g上述空白载体于三角瓶中，加入50mL、0.25mg/mL酶液，并调节酶液pH5.8~6.2，120rpm室温搅拌，10h后分离上清并用水洗去表面结合松散的蛋白，抽滤干燥得到PVP改性环氧基树脂作为载体的固定化核酸酶P1，冰箱4℃保存。同时考察不同酶量、酶浓度、酶液pH及固定时间对酶固定化效果的影响，收集剩余固定液以备检测蛋白浓度，得到的固定酶。
3、PVP修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1生产核苷酸中的应用
(1) 参照上述酶活测定方法，结果表明：PVP修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1酶活回收率高达60%。
(2) 参照酶活测定方法，调节反应温度30~80℃，其余操作不变，考察温度对PVP修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1催化效果的影响。结果表明PVP修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1温度耐热性增加。
(3) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述PVP修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，水解率高达95%，结果见图8。
(4) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述PVP修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，反应10批次后，水解率为初始水解率的95%以上，结果见图9。
实施例5：聚多巴胺（pDopa）修饰氨基树脂固定化核酸酶P1的制备。
1、聚多巴胺修饰氨基树脂
(1) Tris缓冲液中添加一定量的盐酸多巴胺，调节溶液pH7.8~8.2。
(2) 取2g氨基树脂三角瓶中，加入50mL盐酸多巴胺Tris缓冲液，置于25℃、100rmp恒温摇床中震荡，6~8h后分离树脂，洗去未在树脂表面自聚的盐酸多巴胺，抽滤得到聚多巴胺表面改性氨基化树脂，4℃冰箱保存。
2、聚多巴胺修饰氨基树脂固定化核酸酶P1的制备
取1g上述载体于三角瓶中，加入50mL、0.1mg/mL的酶液，并调节酶液pH6.0，120rpm室温搅拌，一定时间后分离上清并用水洗去表面结合松散的蛋白，抽滤干燥得到聚多巴胺改性氨基树脂作为载体的固定化核酸酶P1，冰箱4℃保存。同时考察不同酶量、酶浓度、酶液pH及固定时间对酶固定化效果的影响，收集剩余固定液以备检测蛋白浓度，得到的固定酶。
3、聚多巴胺修饰氨基树脂固定化核酸酶P1生产核苷酸中的应用
(1) 参照上述酶活测定方法，结果表明：聚多巴胺修饰氨基树脂固定化核酸酶P1酶活回收率高达70%，单位载体酶活为20000U·g-1。
(2) 考马斯亮蓝方法检测树脂载酶量，结果表明：聚多巴胺修饰氨基树脂固定化核酸酶P1载酶量可达40mg/g。
(3) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述聚多巴胺修饰氨基树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，水解率高达95%。
(4)参照酶活测定方法，调节反应温度30~80℃，其余操作不变，考察温度对聚多巴胺修饰氨基树脂固定化核酸酶P1催化效果的影响。结果表明聚多巴胺修饰氨基树脂固定化核酸酶P1温度耐热性增加。
实施例6：伴刀豆蛋白A（ConA）修饰羧基化树脂固定化核酸酶P1的制备。
1、ConA修饰羧基化树脂的制备。
(1) ConA活化：将一定质量的ConA溶于0.1mol/LKCl、0.01mol/LCaCl2、0.01mol/LMnCl2 pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液中，4℃活化6h；
(2) ConA修饰羧基化树脂：取5g羧基化树脂于MES缓冲液（0.1M，pH5.6，50mL），然后缓慢加入EDC（192mg），混合物超声15min后加入NHS（54.25mg），随后加入100mL活化的ConA溶液，调整pH至7.2，室温下反应过夜。分离上清并用水洗去表面结合的松散ConA，抽滤得到ConA表面改性羧基化树脂，冰箱4℃保存。
2、ConA修饰羧基化树脂固定化核酸酶P1的制备。
取1g上述空白载体于三角瓶中，加入100mL、0.2mg/mL的酶液，并调节酶液pH5.8~6.2，120rpm室温搅拌，10h后分离上清并用水洗去表面结合松散的蛋白，抽滤干燥，冰箱4℃保存。同时考察不同酶量、酶浓度、酶液pH及固定时间对酶固定化效果的影响，收集剩余固定液以备检测蛋白浓度，得到的固定酶。
3、ConA修饰羧基化树脂固定化核酸酶P1生产核苷酸中的应用
(1) 与利用不添加任何修饰剂的羧基化树脂作为载体进行固定化核酸酶P1相比，ConA改性羧基化树脂作为载体固定化核酸酶P1酶载量提高15%，酶活回收率高达70%。
(2) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述ConA修饰羧基化树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，水解率高达98%。
(3) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述ConA修饰羧基化树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，反应10批次后，水解率仍为初始水解率的95%以上。
(4)参照酶活测定方法，调节pH4~7.5，其余操作不变，考察pH对ConA修饰羧基化树脂固定化核酸酶P1催化效果的影响。结果表明ConA修饰羧基化树脂固定化核酸酶P1温度耐碱性增加。
实施例7：聚乙二醇（PEG）修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1的制备。
1、PEG修饰环氧基树脂
(1) 将分子量5KDa的PEG溶于0.1mol/L的PBS缓冲溶液液中，配制成PEG溶液；
(2) 取2g环氧基树脂于三角瓶中，50mL、pH7.0的PEG溶液，置于150rmp恒温摇床中震荡过夜，然后分离，抽滤得到PEG表面改性环氧基树脂，冰箱4℃保存。
2、PEG修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1的制备
取1g上述空白载体于三角瓶中，加入50mL、0.1mg/mL的酶液，并调节酶液pH5.5，100rpm室温搅拌，6~8h后分离上清并用水洗去表面结合松散的蛋白，抽滤干燥得到PEG改性环氧基树脂作为载体的固定化核酸酶P1，冰箱4℃保存。同时考察不同酶量、酶浓度、酶液pH及固定时间对酶固定化效果的影响，收集剩余固定液以备检测蛋白浓度，得到的固定酶。
3、PEG修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1生产核苷酸中的应用
(1) 参照上述酶活测定方法，结果表明：PEG修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1酶活相比较未经修饰的树脂固定酶提高25%，酶活回收率高达60%。
(2) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述PEG修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，水解率高达96%。
(3) 在每一次反应完成后，将固定化酶取出，用去离子水洗涤，用于下一批次的催化。结果表明：PEG修饰环氧基树脂固定化核酸酶P1重复使用10次后，水解率仍能达到初始水解率的97%。
实施例8：伴刀豆蛋白A（ConA）修饰磺酸基树脂固定化核酸酶P1的制备。
1、 ConA修饰磺酸基树脂的制备。
(1) ConA活化：将一定质量的ConA溶于0.1mol/LKCl、0.01mol/LCaCl2、0.01mol/LMnCl2 pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液中，4℃活化6h；
(2) ConA修饰磺酸基树脂：取5g磺酸基树脂于200mL活化ConA溶液中，盐酸调整pH至4.5，室温下反应过夜。分离上清并用水洗去表面结合的松散ConA，抽滤得到ConA表面改性磺酸基树脂，冰箱4℃保存。
(3)ConA修饰磺酸基树脂固定化核酸酶P1的制备。
取1g上述空白载体于三角瓶中，加入100mL、0.2mg/mL的酶液，并调节酶液pH4.5-5.0，150rpm室温搅拌过夜，分离上清并用水洗去表面结合松散的蛋白，抽滤干燥，冰箱4℃保存。同时考察不同酶量、酶浓度、酶液pH及固定时间对酶固定化效果的影响，收集剩余固定液以备检测蛋白浓度，得到的固定酶。
2、ConA修饰磺酸基树脂固定化核酸酶P1生产核苷酸中的应用
(1) 与利用不添加任何修饰剂的磺酸基树脂作为载体进行固定化核酸酶P1相比，ConA改性磺酸基树脂作为载体固定化核酸酶P1酶载量提高25%，酶活回收率高达60%。
(2) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述ConA修饰磺酸基树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，水解率高达95%。
(3) 在70℃下，将一定浓度的RNA溶液与上述ConA修饰磺酸基树脂固定化核酸酶P1装入到三角瓶内，在水相中催化核糖核酸水解反应，反应10批次后，水解率仍为初始水解率的95%以上。
(4) 参照酶活测定方法，调节反应温度30~80℃，其余操作不变，考察温度对ConA修饰磺酸基树脂固定化核酸酶P1催化效果的影响。结果表明ConA修饰磺酸基树脂固定化核酸酶P1温度耐热性增加。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京工业大学
<120> 一种固定化核酸酶P1及其制备方法与其应用
<130> SG20161228001
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 270
<212> PRT
<213> 核酸酶P1
<400> 1
Trp Gly Ala Leu Gly His Ala Thr Val Ala Tyr Val Ala Gln His Tyr
1 5 10 15
Val Ser Pro Glu Ala Ala Ser Trp Ala Gln Gly Ile Leu Gly Ser Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Ser Ile Ala Ser Trp Ala Asp Glu Tyr Arg
35 40 45
Leu Thr Ser Ala Gly Lys Trp Ser Ala Ser Leu His Phe Ile Asp Ala
50 55 60
Glu Asp Asn Pro Pro Thr Asn Cys Asn Val Asp Tyr Glu Arg Asp Cys
65 70 75 80
Gly Ser Ser Gly Cys Ser Ile Ser Ala Ile Ala Asn Tyr Thr Gln Arg
85 90 95
Val Ser Asp Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asn His Ala Glu Ala Leu Arg
100 105 110
Phe Leu Val His Phe Ile Gly Asp Met Thr Gln Pro Leu His Asp Glu
115 120 125
Ala Tyr Ala Val Gly Gly Asn Lys Ile Asn Val Thr Phe Asp Gly Tyr
130 135 140
His Asp Asn Leu His Ser Asp Trp Asp Thr Tyr Met Pro Gln Lys Leu
145 150 155 160
Ile Gly Gly His Ala Leu Ser Asp Ala Glu Ser Trp Ala Lys Thr Leu
165 170 175
Val Gln Asn Ile Glu Ser Gly Asn Tyr Thr Ala Gln Ala Ile Gly Trp
180 185 190
Ile Lys Gly Asp Asn Ile Ser Glu Pro Ile Thr Thr Ala Thr Arg Trp
195 200 205
Ala Ser Asp Ala Asn Ala Leu Val Cys Thr Val Val Met Pro His Gly
210 215 220
Ala Ala Ala Leu Gln Thr Gly Asp Leu Tyr Pro Thr Tyr Tyr Asp Ser
225 230 235 240
Val Ile Asp Thr Ile Glu Leu Gln Ile Ala Lys Gly Gly Tyr Arg Leu
245 250 255
Ala Asn Trp Ile Asn Glu Ile His Gly Ser Glu Ile Ala Lys
260 265 270

Claims (4)

1.一种固定化核酸酶P1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）改性树脂：以表面修饰剂改性介孔树脂，得到表面改性的介孔树脂载体；
其中，所述的表面改性剂为伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一种或几种的混合物；
所述的介孔树脂为环氧基树脂、氨基树脂、磺酸基树脂或者羧基化树脂；
（2）核酸酶P1固定化：将步骤（1）得到的介孔树脂载体加入到0.5～6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1与树脂的质量比为5～20mg：lg，混合，在25℃振荡反应时间2～12h，抽滤得到树脂固定化核酸酶P1；
步骤（1）中，利用伴刀豆蛋白改性介孔树脂的方法如下：
（1a）伴刀豆蛋白活化：将伴刀豆蛋白溶于缓冲液中，所述的缓冲液包括如下组分：
0.1mol/L KC1、0.01mol/LCaC12、0.01mol/ L MnC12、0.1mol/L KH2PO4、0.1mol/LK2HPO4，pH7.0，得到伴刀豆蛋白溶液；
（1b）戊二醛活化介孔树脂：将50~200g介孔树脂加入成二醛溶液中，所述的戊二醛溶液为戊二醛质量分数为2%的0.1mol/L，pH8.0的磷酸缓冲液，搅拌15~60min，得到戊二醛活化的介孔树脂；
（1c）伴刀豆蛋白修饰介孔树脂：将戊二醛活化的介孔树脂加入伴刀豆蛋白溶液中，在25℃、150rmp下震荡6~18h，去除上清，水洗介孔树脂，得到伴刀豆蛋白修饰的介孔树脂；
步骤（1）中，利用聚乙二醇、聚多巴胺、聚乙烯吡咯烷酮改性介孔树脂的方法如下：
（2a）配制改性剂溶液：0.05~5g/L聚乙二醇溶液、0.1~3g/L盐酸多巴胺Tris溶液、1~5g/L聚乙烯吡咯烷酮溶液；
（2b）取1~5g介孔树脂于反应容器中，加入50～300mL相应的改性剂溶液，置于25℃、120~180rmp恒温摇床中震荡，去除上清，水洗介孔树脂，得到改性的介孔树脂。
2.根据权利要求1所述的固定化核酸酶P1的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的核酸酶P1的氨基酸序列如 SEQ ID NO．：1所示。
3.权利要求1～2任一所述固定化核酸酶P1的制备方法制备得到的树脂固定化核酸酶P1。
4.权利要求3所述树脂固定化核酸酶P1在水解RNA制备核苷酸中的应用。
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氨基树脂表面活化提高固定化核酸酶P1连续催化性能;何林姣等;《化工学报》;20160930;第67卷(第9期);摘要及第3852页第1.2-1.3、1.5节

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