CN103990108A - 鲎素在制备抗脑胶质瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鲎素在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。根据倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态；台盼蓝细胞拒染计数，Hoechst33442/PI荧光染色检测细胞凋亡，AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒结合流式细胞术检测鲎素对细胞周期、凋亡的影响，表明鲎素具有抗脑胶质瘤作用。

Description

鲎素在制备抗脑胶质瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及含肽物质在医用配制品中的应用，特别涉及鲎素在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。 

背景技术

脑胶质瘤亦称胶质细胞瘤，简称胶质瘤，是发生于神经外胚层的肿瘤，故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。脑胶质瘤的发生部位往往与肿瘤类型有关，约半数以上位于大脑半球白质，并向深部或表浅浸润性生长，主要为星形细胞瘤，少枝胶质细胞瘤；其次为脑室系统，近1/4，大多数是室管膜瘤，脉络丛乳头状瘤；再者为小脑，其半球主要为星形细胞瘤，蚓部多是髓母细胞瘤。另脑干、视神经、透明隔、胼胝体、松果体亦可发生胶质瘤。 

脑胶质瘤的常规治疗手段是手术切除加上放疗和化疗，近年来，免疫治疗、抗血管形成及基因治疗等新疗法也开始从实验研究向临床应用过渡。然而，任何单一的手段都难以达到真正的治愈，特别是广泛浸润生长的恶性胶质瘤。因此，提高脑胶质瘤治疗效果寄希望于综合治疗。目前全世界尚无有效药物治疗脑胶质瘤，患者死亡率和术后复发率极高。寻找有效的靶向治疗药物是当今胶质瘤研究的重点、热点和难点。 

研究者发现，与正常细胞膜相比，肿瘤细胞膜含有较多的带负电荷的分子，如磷脂酰丝氨酸和糖基化粘液素等，呈电负性，易受阳离子肽攻击(结合)。因阳离子活性肽靠静电引力结合膜上的阴离子分子，从而主要破坏细胞膜，因此避开了肿瘤细胞的抗药机制的问题。 

鲎也称马蹄蟹，属肢口纲(Merostomata)剑尾目(Xiphosura)的海洋节肢动物，共4种，分布于亚洲和北美东海岸，具有很高的药用价值。鲎的血液中含 有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否感染细菌；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。 

鲎素是从海洋节肢动物--中国鲎的血细胞分离得到的一种含17个氨基酸残基的多肽(KWCFRVCYRGICYRRCR)，分子量2269，pI9.93，在人体生理条件下呈碱性，带正电荷，属阳离子多肽，分子中有两个二硫键，可以较好抵抗体内酶解。各种研究资料显示鲎素肽具有强烈抗菌作用，抑制革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌，真菌生长，同时还发现鲎素具有抗肿瘤作用，国内外均有文献报道鲎素肽对白血病细胞，肺癌细胞，肝癌细胞，胃癌细胞具有抑制作用，毒副作用低。但是，还没有考察鲎素对脑胶质瘤是否具有较好的抑杀效果。 

本发明旨在研究鲎素对脑胶质瘤的抑制。 

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种鲎素在制备抗脑胶质瘤药物中的应用，鲎素可以影响脑胶质瘤细胞结构。 

本发明提供一种鲎素在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。 

本发明提供一种抗脑胶质瘤药物，其有效活性组份为鲎素。 

进一步地，本发明提供一种抗脑胶质瘤药物，其鲎素的半抑制浓度为35.33ug/ml。 

本发明鲎素在制备抗脑胶质瘤药物中的应用，根据倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态；台盼蓝细胞拒染计数，Hoechst33442/PI荧光染色检测细胞凋亡，AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡结合流式细胞术(FCM)检测鲎素对细胞周期、凋亡的影响，表明鲎素具有抗脑胶质瘤作用。 

附图说明

图1为本发明光学倒置显微镜下不同浓度的鲎素与BCNU作用U251细胞的放大示意图。 

图2为本发明加鲎素作用及不加鲎素的细胞透射电镜的细胞示意图。 

图3为本发明鲎素、BCNU对U251细胞增殖抑制作用的示意图。 

图4为本发明鲎素、BCNU作用U251细胞的荧光示意图。 

图5为本发明通过流式细胞仪检测鲎素、BCNU作用细胞凋亡的示意图。 

具体实施方式

以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 

本发明鲎素在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。通过选取不同浓度的鲎素、常规临床药物BCNU(卡莫司汀)对脑胶质瘤细胞U251进行作用，与空白对照组进行比对；将不同浓度的鲎素、BCNU进行倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态；进行台盼蓝细胞拒染计数；通过Hoechst33442/PI荧光染色检测U251细胞凋亡；通过AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒结合流式细胞术(FCM)检测鲎素对细胞周期、凋亡的影响。以此证明，鲎素对脑胶质瘤具有抑制作用。 

结果表明：镜下观察鲎素及BCNU作用的U251细胞出现凋亡小体，鲎素能够诱导U251细胞凋亡；台盼蓝法U251的活细胞计数药物组(鲎素及BCNU组)少于空白对照组；Hoechst33442/PI荧光检测药物组(鲎素及BCNU组)发生凋亡，鲎素对细胞周期产生阻滞作用，并发生不同程度的凋亡；AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒检测时，流式细胞仪结果表明，鲎素及BCNU均可诱导U251细胞凋亡。 

以下通过实验来证明鲎素鲎素作为有效活性组份，可以在制备抗脑胶质瘤药物中应用。 

实验1：倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态。 

请参阅图1，将浓度分别为128ug/ml、64ug/ml的鲎素及BCNU加入U251细胞中作用，并通过倒置显微镜观察细胞形态(A-鲎素浓度128μg/Ml；B-鲎素 浓度64μg/mL；C-BCNU浓度128μg/mL；D-BCNU浓度64μg/mL；E-不加任何药物)。在显微镜观察下可见，未加药对照组细胞数目较多，呈贴壁生长，形态主要为长梭形或多形性，有较多突起，胞体折旋光性好，其增殖快速。加入鲎素及BCNU实验组细胞密度明显减小，细胞间隙变宽，部分细胞变圆，脱落漂浮于培养液中。 

请参阅图2(A鲎素浓度35.33μg/mL，B不加鲎素)，经鲎素作用的U251细胞体积缩小，胞浆浓缩，细胞突触减少，微绒毛减少或消失，细胞核极不规则，核膜不清，异染质浓缩凝聚，沿核膜排列，胞浆内线粒体肿胀、空化，线粒体脊断裂，内质网肿胀、扩张细胞。由此可见，鲎素对U251的细胞内部结构影响显著。 

请参阅图3，在显微镜观察下可见，随着鲎素及BCNU药物浓度的增加，细胞存活率降低。鲎素作用U251细胞，细胞成活率与药物浓度呈明显的剂量关系，U251细胞较为敏感。BCNU作为脑胶质瘤化疗药物之一，对U251细胞有着明显的抑制作用。在质量浓度10μg/mL～640μg/mL下，鲎素与BCNU作用U251细胞后，与对照组比较，差异极显著(P﹤0.01)，细胞存活率见图3。 

上述表明鲎素对脑胶质瘤的作用效果类似BCNU，为制备抗脑胶质瘤药物的有效活性组份。 

实验2：台盼蓝细胞拒染法观察鲎素对U251细胞的作用。 

台盼蓝拒染法是利用台盼蓝只能将死细胞染成蓝色而活细胞不能被染上的方法检测细胞存活率的一种快速简便的方法。 

为进一步确认鲎素对U251细胞的影响，根据CCK-8(Cell Counting Kit-8试剂盒，采用水溶性四唑盐-WST-8,可检测细胞增殖、细胞毒性。)的实验结果筛选出三个浓度分别为20、40、80μg/mL(毫克/毫升)进行台盼蓝实验，根据镜下观察蓝色细胞(凋亡细胞)及活细胞数目。进行了三个平行试验，与对照组进行比较。鲎素质量浓度>40μg/mL时，对细胞的抑制率均极显著(P﹤0.01)，U251细胞更为敏感(如表1)。 

表1  台盼蓝细胞拒染法测定不同浓度鲎素、BCNU对U251增殖的影响

Note：与对照组比较，*P<0.05，**P﹤0.01 

由表1可以看出，台盼蓝法U251的活细胞计数药物组(鲎素)少于对照组(BCNU)。 

实验3：Hoechst33342/PI荧光检测鲎素对脑胶质细胞U251增殖影响。 

Hoechst33342/PI为双染色试剂，可以检测细胞凋亡，Hoechst33342与DNA结合后，凋亡细胞中的凝聚染色质会比正常细胞中的染色质染色更深、更加明亮。PI只能渗透进入死亡细胞，两种染料同时使用，通过荧光显微镜检测或者流式细胞仪检测就可以区分出正常细胞，凋亡细胞和死亡细胞。 

请参阅图4(A-对照组；B-鲎素35.33μg/mL；C-BCNU35.33μg/mL)，配制质量浓度35.33μg/mL的鲎素及BCNU溶液，此处质量浓度是根据实验计算出来的半抑制浓度。半抑制浓度(或称半抑制率)，即IC50，为药物对培养细胞的最小致死剂量的平均值，作为反映药效的定量指标。上述鲎素及BCNU溶液作用细胞6h后，Hoechst33342/PI产生染色结果。活细胞对PI染料拒染，药物作用组(B、C)与对照组(A)相比，细胞发生了凋亡，对照组为不加药物。 

鲎素、BCNU对细胞周期产生一定的影响，当鲎素质量浓度为35.33μg/mL时，与对照组相比，G0/G1变化不大，S期DNA含量明显增加(P<0.01)，有极显著性意义，因此，鲎素作用U251细胞有可能在S期产生阻滞，即对细胞周期产生阻滞。鲎素质量浓度为8.83-17.67μg/mL时，G0/G1期DNA含量增加(P<0.01)，有极显著意义，在G0/G1期产生阻滞(如表2)。 

表2  鲎素作用U251细胞周期分布 

Note：与对照组比较，*P<0.05，**P﹤0.01 

当BCNU质量浓度为35.33μg/mL时，与对照组相比，G0/G1期DNA含量增加，(P<0.05)有显著性意义，有可能在G0/G1期产生阻滞，BCNU质量浓度在低浓度8.83μg/mL时，S期明显增多，G0/G1、G2/M变化不大，有可能在S期产生阻滞，即对细胞周期产生阻滞(如表3)。 

表3  BCNU作用U251细胞周期分布 

Note：与对照组比较，*P<0.05，**P﹤0.01 

上述实验表明，鲎素浓度为35.33μg/mL时，阻滞细胞周期于S期，鲎素诱导U251细胞S期阻滞，是抗脑胶质瘤作用的分子机制之一。 

实验4：AnnexinV-FITC/PI染色与流式细胞术结合检测细胞凋亡。 

通过AnnexinV-FITC/PI法分析细胞凋亡，细胞膜的重排发生在凋亡的早期，这种重排导致磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。这一事件可通过AnnexinV的染色来检测。AnnexinV是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，可与凋亡细胞膜上外翻的PS相结合，采用荧光(如FITC)标记的AnnexinV来与凋亡细胞结合。PI(碘化丙啶)是一种核酸染料，在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 

流式细胞术(FCM)，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量 转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。 

请参阅图5，本实验用AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡发生的情况。将不同浓度的鲎素、BCNU溶液作用于U251细胞，露于凋亡细胞外的磷脂酰丝氨酸(PS)可与膜联蛋白V(AnnexinV)有较强的结合能力。通过流式细胞仪分析(依次为U251对照组、鲎素17.67μg/mL、鲎素35.33μg/mL、BCNU17.67μg/mL、BCNU35.33μg/mL)，在双变数流式细胞仪的散点图上，右下象限(Annexin-V+/PI-)表示早期凋亡细胞；右上象限(Annexin-V+/PI+)显示是晚期凋亡及坏死细胞。 

流式细胞仪结果表明，鲎素及BCNU均可诱导U251细胞凋亡，鲎素、BCNU质量浓度35.33μg/mL(半抑制浓度)时，其凋亡率分别为25.8％和32.9％，与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。 

本发明鲎素在制备抗脑胶质瘤药物中的应用，即抗脑胶质瘤药物中，鲎素作为有效活性组份。根据倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态；台盼蓝细胞拒染计数，Hoechst33442/PI荧光染色检测细胞凋亡，AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡结合流式细胞术(FCM)检测鲎素对细胞周期、凋亡的影响，表明鲎素具有抗脑胶质瘤作用。 

Claims (3)

1.一种鲎素在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。

2.一种抗脑胶质瘤药物，其有效活性组份为鲎素。

3.如权利要求2所述的抗脑胶质瘤药物，其特征在于，所述鲎素的半抑制浓度为35.33ug/ml。