CN106913855B - 从鲎试剂废料中提取抑菌组合物制备妇科洗液的方法 - Google Patents
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本发明涉及一种从鲎试剂废料中提取抑菌组合物制备妇科洗液的方法，方法包括：第一步，在鲎试剂废料中提取抑菌组合物，具体包括：(1)收集鲎试剂生产工艺中丢弃的乳化物沉淀及丢弃的血浆；(2)由丢弃的乳化物沉淀制备鲎素肽粗提液；(3)由丢弃的血浆制备血蓝蛋白粗提液；(4)由丢弃的血浆制备SOD粗提液；(5)三种粗提液混合制备抑菌组合物；第二步，(1)按质量百分比抑菌组合物：50％～60％，甘油：0.5％～1.5％，柠檬酸：0.5％～1.5％，十二烷基葡萄糖苷：1％～2％，去离子水：余量配置妇科洗液组份，(2)按制备工艺得到妇科洗液成品。本方法获得的妇科洗液能有效的抑制各类细菌及真菌的生长，较传统化学妇科洗液更为安全、温和、无毒副作用，避免耐药性和过敏现象，较传统中药妇科洗液有更加明显的抑菌效果，同时，产品成本较低，适合市场推广。
Description
技术领域
本发明涉及妇科洗液技术领域，具体是一种从鲎试剂废料中提取抑菌组合物制备妇科洗液的方法。
背景技术
鲎，又称马蹄蟹，是一种生活在海洋中的大型底栖节肢动物,从早古生代的奥陶纪出现至今已有4亿多年的历史,是动物界具有独特进化地位的“活化石”之一。鲎是无脊椎动物血液学研究的绝好材料,也是目前鲎资源开发利用和鲎试剂研制的主要原材料,一直受到日、美等国学者的高度重视。随着对鲎血淋巴的免疫功能研究以及和其他无脊椎动物血淋巴的免疫学比较研究,尤其是从鲎血淋巴中分离出许多具有抗菌、抗病毒的活性物质。总体而言，鲎作为一种具有巨大医药开发潜力的重要资源，为世界各国高技术产业所瞩目。
目前鲎的主要用途是制备鲎试剂。鲎血细胞中的颗粒细胞中含有能与内毒素起凝集作用的酶系统。根据此原理，世界各国研究人员经不懈努力，开发出了用于药品细菌内毒素检测的鲎试剂。同时，鲎试剂还能被β-葡聚糖激活，而1-3-β-D葡聚糖是真菌细胞壁的特有成分，从而鲎试剂亦被开发应用于检测深度真菌感染。但鲎试剂的提取过程中仅利用到了鲎血细胞，剩余的其他成分并未得到有效开发利用。鲎试剂的提取过程包括：
a鲎细胞裂解液的配制：裂解液为Tris-HCl,NaCl缓冲液。其中，所述缓冲液为pH7-8，NaCl，Tris-HCl可根据实际情况调节，一般为50mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl；
b鲎细胞的裂解乳化：取全血离心后的鲎细胞，按1:5-1:8.5的比例加入鲎细胞裂解液，使用高速匀浆机匀浆5-20分钟，既得鲎细胞裂解乳化物。
c鲎细胞裂解液分离提纯：将上述乳化物低温离心25-30分钟，取上清液，分装备用，即为鲎细胞裂解液。向裂解液中以1:1-1:2的比例加入氯仿溶液，低温搅拌离心后，仔细取出上清液备用。
d制剂：取c步骤中最终上清液，各生产厂家根据自身情况，向其中添加多肽显色基质，低温搅拌分装后，真空冷冻干燥后即得鲎试剂。
另外，由上述鲎试剂的提取过程，也可看出，作为鲎全血的另一组成部分，鲎血浆并未得到有效利用，而是直接被废弃。
同时，鲎素是一类存在于鲎血细胞中的具有抗菌活性的阳离子多肽，它的发现被医学界称为“抗生素”研究的一个里程碑，是后抗生素时代到来的标致。自1988年日本学者NakamuraT从东方鲎中分离提取鲎素以来，鲎素的研究引起了人们的广泛关注，研究表明，鲎素具有以下抗菌特性：(1)杀菌活力高，致死浓度均在μmol/L级，(2)作用迅速，往往在几秒或几分钟内可将99％以上的病原杀灭，(3)对真核生物细胞无毒性，(4)活性稳定，比较耐热，100℃处理30min不丧失其抗菌活性，(5)在高盐环境下同样具有抗菌活性，鲎素的抗微生物作用远远超过目前抗生素药物的作用范畴，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及囊膜病毒均能产生有效的杀伤作用，对人宫颈癌细胞也具有很好的抑制作用，且没有耐药性问题。
调查显示，全世界约87％的成年女性不同程度的感染过妇科炎症。妇科炎症是妇科疾病中的临床常见病，一半为病菌感染所致，必须在医生的指导下进行治疗。而目前医药厂家纷纷推出的洗液，是在病症明确后的辅助保健措施。大多数属于中药制剂，能起到杀菌清洁的作用，但中药制剂生产成本较高，工艺复杂且疗效不甚理想。而其他洗液中则含有西药成分，副作用大，可诱发耐药性同时复发率高。
发明内容
本发明的目的在于丰富目前妇科洗液的种类，提供一种从鲎试剂废料中提取抑菌组合物制备妇科洗液的方法，以实现妇科洗液天然绿色，且具有较好的抗菌、消炎、滋养、修复等多重功效。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种从鲎试剂废料中提取抑菌组合物制备妇科洗液的方法，该方法包括步骤如下：
第一步，在鲎试剂废料中提取抑菌组合物
(1)原料处理
收集鲎血细胞及血浆，作为原料备用；其中，所述鲎血细胞是鲎试剂生产工艺中丢弃的乳化物沉淀，所述血浆是鲎试剂生产过程中丢弃的血浆；
(2)鲎素肽粗提液的制备
a.酸解：将鲎细胞乳化物离心后的下层沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入到20mmol/L的酸液中，低温超声破碎，破碎条件为：每100ml超声波输出功率为700W，超声波总作用时间为10min,每次超声作用时间为10S，反复超声3次，收集上清液即为细胞酸抽提液；
b.调pH去沉淀：将抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心除沉淀，得上清液；
c.热变性处理：上清液沸水浴处理5-10min,4℃下离心弃沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜过滤得鲎素肽粗提液；
(3)血浆中血蓝蛋白粗提液的制备
将上述步骤(1)中的血浆经300000g超离心3.5h，即得到初步提纯的血蓝蛋白沉淀，将沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸缓冲液中，即为血蓝蛋白粗提液；
(4)血浆中SOD粗提液的制备
按质量份数计，取100份上述步骤(1)中的鲎血浆，加入34份0.05mol/L磷酸盐缓冲液和100份0.9％NaCl溶液，轻轻搅拌混匀，将混合液置于65℃水浴锅中，恒温20min后，急冷至10℃，离心去除沉淀，取上清液，即为SOD粗提液；
(5)粗提液的混合
将上述三种粗提液按60-80份的鲎素肽粗提液，10-20份的血蓝蛋白提取液，10-20份的SOD提取液混合，使用pH调节剂调节pH值4-5后过滤，得到最终形式的抑菌组合物；
第二步，由上述抑菌组合物制备妇科洗液
(1)按质量百分比配置包括如下组份的妇科洗液：
(2)得到妇科洗液成品
a.将上述妇科洗液组份中甘油和十二烷基葡萄糖苷进行混合搅拌；
b.调整上述搅拌混合液至35～40℃，再加入抑菌组合物，柠檬酸调节pH至5.0-6.0，体系经加去离子水搅拌均匀后完成操作，然后灌装得妇科洗液成品。
而且，所述第一步中步骤(5)的pH调节剂为柠檬酸、柠檬酸钠、乳酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硼酸、硼砂中的一种或多种的组合。
而且，所述第一步中步骤(5)的抑菌组合物中鲎素肽粗提液﹕血蓝蛋白粗提液﹕SOD粗提液的最佳配比为：8﹕1﹕1或6﹕2﹕2。
而且，在所述第二步的步骤(1)的妇科洗液组份中进一步加入0.1％～2％的赋形增稠剂，当加入赋形增稠剂后，妇科洗液组份中就包括油相的赋形增稠剂、水相的甘油和十二烷基葡萄糖苷及抑菌组合物，制备妇科洗液时，先使妇科洗液原料的油相和水相进行初步乳化，调整乳化体系的温度至35～40℃后再再加入抑菌组合物，柠檬酸调节pH至5.0-6.0，体系经加去离子水搅拌均匀后完成操作。
本发明的优点和效果是：
1、本专利原料抑菌组合物对鲎试剂生产废料进行了充分提取。主要提取了鲎血细胞提取废料中的鲎素肽及血浆中的血蓝蛋白及超氧化物歧化酶(SOD)等成分，将其混合后用于妇科洗液的制备。
2、本专利方法获得的洗液能有效的抑制各类细菌及真菌的生长。较传统化学洗液产品而言，更为安全温和有效，无毒副作用，能避免常规化学产品耐药性和过敏现象的发生。较传统中药洗液产品而言，抑菌效果更加明显。
3、由于本发明发法的最终抑菌组合物应用的领域为一般性日常抗菌，消炎，防腐性领域，因此，鲎素肽的提取采用的是快速，便捷的低成本提取方式，提取出的鲎素肽粗提液完全能够满足日常性抗菌，消炎，防腐性用品的需要。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。
一种从鲎试剂废料中提取抑菌组合物制备妇科洗液的方法，该方法包括步骤如下：
第一步，在鲎试剂废料中提取抑菌组合物
(1)原料处理
收集鲎血细胞及血浆，作为原料备用；其中，所述鲎血细胞是鲎试剂生产工艺中丢弃的乳化物沉淀，所述血浆是鲎试剂生产过程中丢弃的血浆；
(2)鲎素肽粗提液的制备
a.酸解：将鲎细胞乳化物离心后的下层沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入到20mmol/L的酸液中，低温超声破碎，破碎条件为：每100ml超声波输出功率为700W，超声波总作用时间为10min,每次超声作用时间为10S，反复超声3次，收集上清液即为细胞酸抽提液；
b.调pH去沉淀：将抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心除沉淀，得上清液；
c.热变性处理：上清液沸水浴处理5-10min,4℃下离心弃沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜过滤得鲎素肽粗提液；
(3)血浆中血蓝蛋白粗提液的制备
将上述步骤(1)中的血浆经300000g超离心3.5h，即得到初步提纯的血蓝蛋白沉淀，将沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸缓冲液中，即为血蓝蛋白粗提液；
(4)血浆中SOD粗提液的制备
按质量份数计，取100份上述步骤(1)中的鲎血浆，加入34份0.05mol/L磷酸盐缓冲液和100份0.9％NaCl溶液，轻轻搅拌混匀，将混合液置于65℃水浴锅中，恒温20min后，急冷至10℃，离心去除沉淀，取上清液，即为SOD粗提液；
(5)粗提液的混合
将上述三种粗提液按60-80份的鲎素肽粗提液，10-20份的血蓝蛋白提取液，10-20份的SOD提取液混合，使用pH调节剂调节pH值4-5后过滤，得到最终形式的抑菌组合物；
其中，所述pH调节剂为柠檬酸、柠檬酸钠、乳酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硼酸、硼砂中的一种或多种的组合。
第二步，由上述抑菌组合物制备妇科洗液
(1)按如下质量百分比配置包括如下组份的妇科洗液：
在本发明的具体实施中，在上述妇科洗液中进一步加入：0.1％～2％的赋形增稠剂，以便本产品在使用中与皮肤接触的时间更长，效果更佳。
(2)得到妇科洗液成品
a.上述妇科洗液组份中包括油相的赋形增稠剂、水相的甘油、十二烷基葡萄糖苷和本发明所述的抑菌组合物，先使妇科洗液原料的油相和水相进行初步乳化；
b.调整上述乳化体系的温度，降温至35～40℃，再加入抑菌组合物，柠檬酸调节pH至5.0-6.0，体系经搅拌均匀后完成操作，然后灌装得妇科洗液成品。
抑菌组合物的抑菌效果实验
1组成
抑菌组合物由鲎素肽粗提液，血蓝蛋白提取液，SOD提取液按一定配比组合而成。
2抑菌试验
A实验材料
由鲎素肽粗提液、血蓝蛋白提取液、SOD提取液组合的抑菌组合物。
B受试菌种
细菌：金黄色葡萄球菌：(Staphylococcus aureus)ATCC 6538
大肠埃希氏菌：(Escherichia coli)ATCC 8739
铜绿假单胞菌：(Pseudomonas.aeruginosa)ATCC 9027
注：上述菌株均由中科院典型培养物保藏委员会微生物菌种库提供。
C培养基
细菌培养基：卵磷脂吐温80-营养琼脂培养基，121℃高压灭菌20min后制成斜面备用。
D菌悬液的制备
实验前将各个菌株分别接种到相应的培养基斜面，细菌(金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌)均于36±1℃恒温培养箱中培养36～48小时。分别挑取适量菌落于无菌生理盐水中混匀，制成一定浓度的混合菌悬液。混合细菌悬液总浓度约为1.0×108cfu/ml。置于4℃贮存备用。
E抑菌组合物抑菌液的的制备
按照正交设计法确定各提取液组合的配比，将四种提取液按表1的方案分别进行配制后，用纯净水以1:1比例进一步稀释至洗液中添加浓度。备用。
表1复合提取液抑菌作用考察因素及水平
F提取液的抑菌试验
采用滤纸片扩散法，无菌条件下进行，将滤纸用打孔器打成直径6mm的圆形滤纸片，置于洁净干净的小烧杯，121℃干热灭菌20min后，分别放入4种不同比例提取液复配液中充分浸泡，每只试管放入8片备用。将已配制好的固体培养基融化，分别倒入培养皿中，121℃灭菌20min，待冷却凝固后，吸取0.1ml菌悬液于平板上涂布均匀。用无菌镊子分别夹取已在提取物原液中浸泡过的直径为6mm圆形滤纸片，贴在含菌平板上，每个平板内贴5片，以无菌水浸泡的滤纸片作为空白对照，将各培养皿置于37℃恒温培养箱中平板倒置培养24h，测定抑菌圈直径的大小，设3个重复，取其平均值。混合细菌悬液的抑菌圈直径见表2
表2
由抑菌圈大小可以看出，提取液配比为8：1：1或6：2：2时，抑菌作用明显。
妇科洗液抑菌性能测定
实验1，与品牌中药型妇科洗液做实验对比
抑菌性能测定设三组，分别为:对照组，某品牌中药型妇科洗液组(A组)和本发明的妇科洗液组(B组)。每个处理组8个重复。对照组的培养皿加15mL冷却至50℃左右培养基。取1mL某品牌中药型妇科洗液与15mL冷却至50℃左右的培养基充分混匀之后，加入到A组的培养皿中。将1mL的本发明的妇科洗液与15mL冷却至50℃左右的培养基充分混匀，加入到B组的培养皿中。将活化的大肠杆菌转接并培养至OD600＝0.6时，取200μL的菌液涂板。将培养皿放置于37℃的培养箱中培养24h，用平板菌落计数法进行菌落计数，并记录数据，取平均值，结果如表3。
其中抑菌效率计算公式为:
抑菌效率＝(对照菌落总数-A或B菌落总数)/CK菌落总数﹡100％
表3妇科洗液抑菌效果
根据表3可以看出，本发明的妇科洗液抑菌效率达到90.3％，比某品牌中药型妇科洗液的抑菌效率要高，说明本发明的妇科洗液具有良好的抑菌效果。
实验2，与品牌含有西药成分妇科洗液做实验对比
抑菌性能测定设三组，分别为:对照组，某品牌含有西药成分妇科洗液组(A组)和本发明的妇科洗液组(B组)。每个处理组8个重复。对照组的培养皿加15mL冷却至50℃左右培养基。取1mL某品牌含有西药成分妇科洗液与15mL冷却至50℃左右的培养基充分混匀之后，加入到A组的培养皿中。将1mL的本发明的妇科洗液与15mL冷却至50℃左右的培养基充分混匀，加入到B组的培养皿中。将活化的大肠杆菌转接并培养至OD600＝0.6时，取200μL的菌液涂板。将培养皿放置于37℃的培养箱中培养24h，用平板菌落计数法进行菌落计数，并记录数据，取平均值，结果如表4。
其中抑菌效率计算公式为:(对照菌落总数-A或B菌落总数)/CK菌落总数﹡100％
表4妇科洗液抑菌效果
根据表4可以看出，本发明的妇科洗液抑菌效率达到90.3％，比某品牌含有西药成分妇科洗液的抑菌效率略低，说明本发明的妇科洗液具有良好的抑菌效果，但本发明产品为天然绿色，长期使用不惧抗药性，同时兼具滋养，修护等功能。
Claims (1)
1.一种从鲎试剂废料中提取抑菌组合物制备妇科洗液的方法，其特征在于该方法包括步骤如下：
第一步，在鲎试剂废料中提取抑菌组合物
(1)原料处理
收集鲎血细胞及血浆，作为原料备用；其中，所述鲎血细胞是鲎试剂生产工艺中丢弃的乳化物沉淀，所述血浆是鲎试剂生产过程中丢弃的血浆；
(2)鲎素肽粗提液的制备
a.酸解：将鲎细胞乳化物离心后的下层沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入到20mmol/L的酸液中，低温超声破碎，破碎条件为：超声波输出功率为700W，超声波总作用时间为10min,每次超声作用时间为10S，反复超声3次，收集上清液即为细胞酸抽提液；
b.调pH去沉淀：将抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心除沉淀，得上清液；
c.热变性处理：上清液沸水浴处理5-10min,4℃下离心弃沉淀收集上清液，上清液用0.22μM膜过滤得鲎素肽粗提液；
(3)血浆中血蓝蛋白粗提液的制备
将上述步骤(1)中的血浆经300000g超离心3.5h，即得到初步提纯的血蓝蛋白沉淀，将沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸缓冲液中，即为血蓝蛋白粗提液；
(4)血浆中SOD粗提液的制备
按质量份数计，取100份上述步骤(1)中的鲎血浆，加入34份0.05mol/L磷酸盐缓冲液和100份0.9％NaCl溶液，轻轻搅拌混匀，将混合液置于65℃水浴锅中，恒温20min后，急冷至10℃，离心去除沉淀，取上清液，即为SOD粗提液；
(5)粗提液的混合
将上述三种粗提液按60-80份的鲎素肽粗提液，10-20份的血蓝蛋白粗提液，10-20份的SOD粗提液混合，使用pH调节剂调节pH值4-5后过滤，得到最终形式的抑菌组合物；
第二步，由上述抑菌组合物制备妇科洗液
(1)按质量百分比配置包括如下组份的妇科洗液：
(2)得到妇科洗液成品
a.上述妇科洗液组份中包括油相的赋形增稠剂、水相的甘油、十二烷基葡萄糖苷和本发明所述的抑菌组合物，先使妇科洗液原料的油相和水相进行初步乳化；
b.调整上述乳化体系的温度，降温至35～40℃，再加入抑菌组合物，柠檬酸调节pH至5.0-6.0，体系经搅拌均匀后完成操作，然后灌装得妇科洗液成品；
所述第一步中步骤(5)的pH调节剂为柠檬酸、柠檬酸钠、乳酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硼酸、硼砂中的一种或多种的组合；
所述第一步中步骤(5)的抑菌组合物中鲎素肽粗提液﹕血蓝蛋白粗提液﹕SOD粗提液的配比为：8﹕1﹕1或6﹕2﹕2。
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