CN103233010B

CN103233010B - 一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子序列及其应用

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Publication number: CN103233010B
Application number: CN201310172759.3A
Authority: CN
Inventors: 陈新华; 汪玉华; 敖敬群
Original assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2033-05-10
Also published as: CN103233010A

Abstract

一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子序列及其应用，涉及一种抗菌肽基因启动子。克隆与活性分析方法：构建4种限制性内切酶的大黄鱼基因组单酶切文库；从上述基因组单酶切文库中扩增出大黄鱼hepcidin基因启动子区序列，将扩增的PCR产物连接到pMD18T-Simple载体；将基因启动子区片段插入绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1中，使载体所带增强型绿色荧光蛋白基因位于该启动子区的控制下，构建得到的重组载体命名为pEGFP-Phepcidin；采用双荧光素酶报告基因检测系统定量分析该启动子的活性以及细菌脂多糖LPS和病毒双链RNA类似物polyI:C刺激对其活性的影响。

Description

一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽基因启动子，尤其是涉及一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子序列及其应用。

背景技术

Hepcidin是近年来新发现的一类具有独特性质的小分子抗菌肽。Krause等（1.Krause A,Neitz S,HJ,et al.LEAP-1,a novel highly disulfide-bonded human peptide,exhibits antimicrobial activity[J].FEBS Lett,2000,480:147-150）首次从人血液中分离纯化了一条小分子抗菌肽，并将其命名为肝脏表达的抗菌肽(LEAP1)。随后，Park等（2.Park C H,Valor e E V,Waring A J,et al.Hepcidin,a urinary antimicrobial peptidesynthesized in the liver[J].J Biol Chem,2001,276(11):7806-7810）从人尿液中也分离到这条小分子抗菌肽，并将其命名为hepcidin。目前，编码hepcidin的基因已从包括鱼类在内的各种脊椎动物中相继得到克隆。与其他抗菌肽不同，hepcidin在各物种间具有较高的结构保守性，一般在成熟肽区域含有8个保守的半胱氨酸，可形成4对二硫键，使其分子结构高度紧缩（3.Hunter H N,Fulton D B,Ganz T,et al.The solution structure of humanhepcidin,a peptide hormone with antimicrobial activity that is involved in ironuptake and hereditary hemochromatosis[J].J Biol Chem,2002,277(40):37597-37603）。研究表明，hepcidin具有广泛的抗细菌、病毒、真菌和原生动物的生物学活性（4、Cuesta A，Meseguer J，Esteban M A.The antimicrobial peptide hepcidin exerts an important rolein the innate immunity against bacteria in the bony fish gilthead seabream[J].MolImmunol，2008，45(8):2333–2342）。最近研究表明，hepcidin在维持机体铁平衡中起着关键性的调控作用，参与多种代谢疾病的发病过程（5.Nemeth E and T Ganz.Regulationof iron metabolism by hepcidin[J].Annu Rev Nutr,2006,26;323-42.）。鉴于hepcidin功能的重要性，研究其基因表达调控机制以实现对其基因表达的准确控制显得尤为重要。Courselaud等（6、Courselaud B，Troadec MB，Fruchon S，et al.Strain and gender modulatehepatic hepcidin1and2mRNA expression in mice[J].Blood Cell Mol Dis，2004，32：283-289）对人和鼠hepcidin基因5’侧翼序列的启动子活性进行了分析，发现它们在人肝细胞瘤及鼠肝细胞中具有很强的启动子活性。进一步研究发现hepcidin启动子区域存在多个转录因子结合位点，其具有复杂的表达调控机制。

目前，hepcidin基因已从近20个鱼种中相继得到克隆。与人类及其他哺乳类动物只存在一个hepcidin基因拷贝不同（除鼠具有两个hepcidin基因拷贝外），鱼类hepcidin基因存在多个基因拷贝，如真鲷Pagrosomus major、鲈鱼Lateolabrax japonicus、石斑鱼Epinephelusdrummondhayi、黑鲷Sparus macrocephlus等鱼种hepcidin均存在多个基因拷贝（7、王克坚，海洋鱼类和青蟹抗菌肽hepcidin和scygonadin的研究[J].厦门大学学报(自然科学版)，2011，50(2)：418-424）。一些鱼类hepcidin基因的组织表达谱及在免疫刺激条件下的表达调控也已明确。然而，目前对鱼类hepcidin基因的表达调控机制仍不清楚。

本申请人前期通过对病毒类似物poly(I:C)诱导大黄鱼脾脏组织cDNA文库的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）分析，发现了多条编码大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的EST序列（8、Zheng W，Liu G，Ao J，et al.Expression analysis of immune-relevant genes in the spleenof large yellow croaker Pseudosciaena crocea stimulated with poly I:C[J].Fish Shellfish Immunol，2006，21(4):414-30）。进一步研究发现，这些EST序列由不同的hepcidin基因拷贝所编码。由于启动子是决定基因表达及其调控的关键因素，为了了解大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的表达调控机制，我们采用基因组步移的方法克隆了一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子区序列，经报告基因分析实验证明了该大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子区具有较强的启动子活性。该大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子的克隆及其强启动子活性的验证，在理论上将为研究大黄鱼hepcidin基因的表达调控机理提供良好的实验系统，在应用方面为利用该强启动子构建表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造了条件，具有重要的理论和实际意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子序列。

本发明的目的之二在于提供一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子的克隆与活性分析方法。

本发明的目的之三在于提供一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子的应用。

本发明所述一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子序列为：

ATAAATCCCAACAAATGTGGAGCCATCGTAGTTGTATTTGTTGACTTTTGATGTTGTGGTCACCCAAAGCAAGCAAGCAGGCCAGCTGGGTTATCAGTGAACGAGACAGACTGACGCAGGGGTCCCGCGGCATGTTGTTTCACTAATTGAGTCAGCCCGGGCAATTTGGATAGACTTTGAAGATATAATGAGAATTCAAATGGCCCATGATTTTATCAGCATGCTCAGTCCACCGTTTATCAGTTTGTACCTTTATTTTGCCTTTTCTGTTATTTCATTTCCACCATTATTGATTTTCGGATTTATTCACAGCCTGATGTTGTTCTCGAATTGTTTTCCTACTCTGACAGATTAATTAATCTTAAAGTGTTTATCGCCGCTTCACTGATAAGAGGAAAAATAATCCTCACAATCTTGAGTAGAGTTCTTGGGTTTTTTTTCTATGCACATGTAACAATCTGGATTATTATCATTATGTAACTGTCATTACATTCACACGGTTGTAATTTCACACTGTTAATATATTTATGAACCTAACATGCTGTGTGGCAGGAAATTAGTAATGATATTTTAATGAAACAAGCAGCTGTCCTTTGTCTGGATTTCAATATATCATTCTTACATAATGAAGAACCTAACATGCACAATATAGAAAATGACAGGGAATATATATATAAAGATACAAAATATATAATGATATAGGCTAGATTTGTATTGTAAAAAAAAAAACTTGGGGCAATGCACTTCTTCGCTTTCCAGACATAAACATAATCACATTACATTATATTCGTTTTTATCTAATGCATATTGAAACACCTTGACTCTGAAATGGGAGGTTTTTAATCCTGGCTACTATTCCGCTGCTCTCAAAGGGATGTAATTTGGTTCAACTGCAGGTTCCTGTGTATTATGCAAAAACTGAATGTGTTGAAAATGAGGGGCTAATTATTCCATTTGAGAGGTTGTAATTACATCCTTTAGACTGAGCAATGGATATTCCAAAGTGGCTCCCTCTCTCCTTAGTGAAGGATTTCCTGGGTCGAAGCAAGTGCAGCTCACTCATCCGTGCAATAGATTGACCCGAGCAGTCTTGGCCTTTGCTGTGGGAATCCCCAGTTTCCAGTTTGTTCCAGCAAAAGTCATATTTCTACATGACTCTATAGAGCGCTGCCTCAATACAGGATACATATTGCTTTCTCATATATTGTAAAAACGATGTCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTTGTTCATGTGTGGAATTATGTGTCCTGTCTGCGGAAAGTAATTTAATTTAAAAGTTCATAGTTGATTTGATATTGTTGAACAGACGGTGGAGCCCACAATCAAAAATAGATCAGAGAATTTCCACCAGTGTTGCAGCATTTAAAAAAAAAAAAAAAAGAGGAGAAAATGAGGAGGTCAAAATTTCCCCAGTGGAGTTAGGTAACTGCTGCCAGGAAGGGGTTGGGCCTCCCGGAGTGATGAGGCAACACTGAGCTCAAGTGTGTATAAATACCAGAACACTCTGCATGCTCAACCATCAGACAGCAGGAAGGAGTTGACAAGGGTCACCAAAAGATCTGAAGAAATCCTCTTGACTAGACGATCACCATCCATCACTGGAGCTGAAAAAATAAATTGAAGATATTGTGGTGCTCTTTGGTGGCCTGACACCCATGAGAAAAAAGACCCATCAGGTCTAATCTGCAAAGGATTTAATAACTAAACCATTTTTTCCAAAAAAAGCTAAAATGAAGGCATTCAGCATTGCAGTT。

本发明所述一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子的克隆与活性分析方法，包括以下步骤：

1）采用Clontech公司GenomeWalker Universal Kit试剂盒分别构建4种限制性内切酶的大黄鱼基因组单酶切文库，所用的4种DNA核酸内切酶为Dra I、EcoR V、PvμII和StμI；

2）采用两轮降落PCR方法从上述基因组单酶切文库中扩增出大黄鱼hepcidin基因启动子区序列，将扩增的PCR产物连接到TaKaRa公司pMD18T-Simple载体并测序；

3）将大黄鱼hepcidin基因启动子区片段插入Clontech公司绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1中，使载体所带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因位于该启动子区的控制下，构建得到的重组载体命名为pEGFP-Phepcidin；通过脂质体介导转染法将重组载体pEGFP-Phepcidin转入鲤鱼上皮瘤细胞EPC中，24h后在荧光显微镜下可观察到转染重组质粒pEGFP-Phepcidin的细胞呈现强的绿色荧光，而转染空载体pEGFP-1的细胞无绿色荧光出现，从而证明了所克隆的大黄鱼hepcidin基因启动子区能够有效驱动绿色荧光蛋白在EPC细胞中的表达，因而具有启动子活性；

4）采用Promega公司双荧光素酶报告基因检测系统定量分析该启动子的活性以及细菌脂多糖LPS和病毒双链RNA类似物polyI:C刺激对其活性的影响，将该大黄鱼hepcidin基因启动子区片段插入Promega公司荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中，使萤火虫荧光素酶基因位于该启动子的控制下，构建得到重组载体pGL3-Phepcidin；用重组载体pGL3-Phepcidin和海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共同转染EPC细胞，48h后收集转染细胞用双荧光素酶报告基因检测系统分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，通过计算二者酶活性值的比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性；同时，以空载体pGL3-Basic和海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共同转染EPC细胞的荧光素酶相对活性作为对照，计算出该启动子的相对活性；进一步用不同浓度的LPS和polyI:C刺激重组载体pGL3-Phepcidin转染的EPC细胞，通过比较刺激前后重组载体pGL3-Phepcidin转染的EPC细胞中荧光素酶相对活性的变化，确定该大黄鱼hepcidin基因启动子的活性是否受到LPS和polyI:C免疫刺激的影响。

本发明所述一种大黄鱼hepcidin基因启动子的应用如下：

1）所述大黄鱼hepcidin基因启动子的克隆及其启动子活性的验证，为研究大黄鱼hepcidin基因的表达调控机理提供良好的实验系统；

2）所述大黄鱼hepcidin基因启动子可用于构建表达真核载体在鱼类细胞或哺乳动物细胞中高效表达外源基因；

3）所述大黄鱼hepcidin基因启动子具有活性强、稳定好等优点，可应用于转基因鱼构建。

本发明的突出优点和技术效果如下：

本发明采用基因组步移的方法克隆了一种大黄鱼hepcidin基因启动子，提供了一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子序列；经报告基因分析实验证明了该大黄鱼hepcidin基因启动子具有活性强、稳定好等优点。因此，该大黄鱼hepcidin基因启动子的克隆及其强启动子活性的验证，在理论上将为研究大黄鱼hepcidin基因的表达调控机理提供良好的实验系统，在应用方面为利用该强启动子构建表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造了条件，具有重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为重组载体pEGFP-Phepcidin转染EPC细胞的荧光显微镜观察图(100×)。在转染细胞中可观察到强的绿色荧光，说明了大黄鱼hepcidin基因启动子能够驱动绿色荧光蛋白在EPC细胞中的表达。

图2为重组载体pEGFP-Phepcidin转染EPC细胞的普通光学显微镜观察图(100×)。可观察到细胞生长良好。

图3为采用双荧光素酶报告基因检测系统定量分析大黄鱼hepcidin基因启动子的活性以及免疫刺激对其活性的影响。在图3中，pGL3-Basic表示空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的荧光素酶相对活性（作为对照）；U为重组载体pGL3-Phepcidin转染EPC细胞的荧光素酶相对活性；LPS-6、LPS-8分别表示在6μg/mL、8μg/mL LPS刺激条件下重组载体pGL3-Phepcidin转染EPC细胞的荧光素酶相对活性；polyI:C-10、polyI:C-100分别表示在10ng/mL、100ng/mL polyI:C刺激条件下重组载体pGL3-Phepcidin转染EPC细胞的荧光素酶相对活性；纵坐标表示以空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的荧光素酶相对活性作为1倍，重组载体转染EPC细胞中荧光素酶相对活性的增加倍数。从图3可知，重组载体pGL3-Phepcidin转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的10.7倍，说明了该大黄鱼hepcidin基因启动子具有较强的转录活性，而且其启动子活性不受LPS和polyI:C刺激的影响，具有稳定启动基因表达的特性。

具体实施方式

1.大黄鱼hepcidin基因启动子的克隆

1.1采用Clontech公司的GenomeWalker Universal Kit试剂盒分别构建4种限制性内切酶的大黄鱼基因组单酶切文库，所用的4种DNA核酸内切酶为Dra I、EcoR V、PvμII和StμI。具体操作为：

1.1.1基因组纯度分析。

A：取1μL大黄鱼基因组DNA在0.6%的琼脂糖凝胶上电泳。

B：用核酸内切酶Dra I试切。体系为：

1.1.2基因组酶切消化。

A：标记5个1.5mL的离心管DL1，DL2，DL3，DL4和一个阳性对照。

B：各内切酶酶切体系组分包括：

C：低速涡旋5～10s并瞬时离心，37℃过夜消化。

1.1.3基因组DNA纯化。

A：在上述每一个反应管中加入等体积的苯酚。

B：低速涡旋5～10s并瞬时离心。

C：把上层水相转移至另外一个1.5mL离心管中，并加入等体积的氯仿。

D：低速涡旋5～10s并瞬时离心，转移上层水相至另外一个新的离心管中，并向水相加入2倍体积冰冷的95%乙醇，1/10体积的乙酸钠（pH=4.5）和20μg的糖苷。

E：低速涡旋5～10s并在4℃条件下以14000r/min离心15min。

F：弃上清并用100μL冰冷的80%乙醇洗涤，然后在4℃条件下以14000r/min离心10min。

G：弃上清并在空气中干燥后用20μL TE缓冲液(pH=7.5)溶解。

1.1.4接头Adaptor连接到经上述4种限制性内切酶分别消化的基因组片段上。

B：连接条件：16℃过夜连接。

C：终止连接条件：70℃5min。

D：每管加入75μL TE缓冲液(pH=7.5)，即获得4种限制性内切酶的大黄鱼基因组单酶切文库，用于启动子的克隆。

1.2采用两轮降落PCR方法扩增出大黄鱼hepcidin基因启动子序列，具体步骤按GenomeWalker Universal Kit试剂盒说明书进行。具体步骤如下：

1.2.1第一轮降落PCR反应体系：

1.2.2第二轮降落PCR：分别以第一轮PCR产物为模板，利用巢式接头引物AP2和基因特异引物GSP2进行，其他成分和反应体系与第一轮相同。

1.3扩增得到的PCR产物连接到TaKaRa公司pMD¹⁸T-Simple vector载体进行序列测定与组装，从而获得该大黄鱼hepcidin基因启动子序列。

2.大黄鱼hepcidin基因启动子的活性分析

2.1采用绿色荧光蛋白报告基因载体检测启动子活性

2.1.1含大黄鱼hepcidin基因启动子区片段的重组载体pEGFP-Phepcidin的构建将大黄鱼hepcidin基因启动子区片段插入Clontech公司绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1中，使载体所带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因处于该启动子区的控制下，构建得到的重组载体命名为pEGFP-Phepcidin。具体步骤：

A:合成带有限制性核酸内切酶Xho I位点的正向引物：

5'-AAGCTCGAGATAAATCCCAACAAATGT-3'；带有Hind III位点的反向引物：

5'-CCCAAGCTTAACTGCAATGCTGAAT-3'。

B:用TAKARA公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase聚合酶体系进行PCR扩增。

PCR反应体系为：

PCR程序如下：

C:用Omega公司胶回收试剂盒进行PCR产物回收。

D:回收后的PCR产物和载体pEGFP-1分别进行Xho I/Hind III双酶切。酶切体系：

E:用胶回收试剂盒分别回收上述经Xho I/Hind III双酶切的PCR产物和载体pEGFP-1，并用TAKARA公司T4DNA连接酶连接经双酶切的PCR产物和载体pEGFP-1，连接体系：

F：上述连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR筛选阳性克隆，用小量质粒试剂盒提取质粒，并经测序确认启动子区片段插入的正确性，从而获得含大黄鱼hepcidin基因启动子区片段的重组载体pEGFP-Phepcidin。

2.1.2重组载体pEGFP-Phepcidin转染EPC细胞及荧光显微镜观察

A：将EPC细胞以1×10⁵个/mL的细胞密度接种于24孔细胞培养板，每孔0.5mL细胞悬液，于25℃生化培养箱培养过夜。

B：用Invitrogen公司Lipofectamine^TM2000转染试剂分别将重组载体pEGFP-Phepcidin和空载体pEGFP-1转入EPC细胞，每孔各0.4μg质粒。转染24h后在荧光显微镜下观察，结果可发现转染重组质粒pEGFP-Phepcidin的细胞呈现强的绿色荧光（图1和2），而转染空载体pEGFP-1的细胞无绿色荧光出现，从而证明了所克隆的大黄鱼hepcidin基因启动子区能够有效驱动绿色荧光蛋白在EPC细胞中的表达，因而具有启动子活性。

2.2采用双荧光素酶报告基因检测系统定量分析大黄鱼hepcidin基因启动子的活性

2.2.1含大黄鱼hepcidin基因启动子区片段的重组载体pGL3-Phepcidin的构建

将大黄鱼hepcidin基因启动子区片段插入Promega公司荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中，使萤火虫荧光素酶基因位于该启动子的控制下，构建得到重组载体pGL3-Phepcidin。具体步骤与2.1.1重组载体pEGFP-Phepcidin的构建步骤相同。获得的含大黄鱼hepcidin基因启动子区片段的重组载体pGL3-Phepcidin经测序进行确认。

2.2.2细胞转染与荧光素酶酶活分析

B：用Invitrogen公司Lipofectamine^TM2000转染试剂将0.4μg重组载体pGL3-Phepcidin和2ng海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共转染EPC细胞。同时，用0.4μg空载体pGL3-Basic和2ng海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共转染的EPC细胞作为对照。48h后收集转染细胞，用双荧光素酶报告基因检测系统分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，通过计算二者酶活性值的比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性。同时，以空载体pGL3-Basic和海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共同转染的EPC细胞作为对照，计算出该启动子的相对活性。荧光素酶酶活测定的方法参考Promega公司双萤光素酶报告基因检测系统说明书进行，具体步骤为：

a.转染EPC细胞48h后，用无钙离子的磷酸盐缓冲液洗涤2次；

b.每孔加入100μL PLB裂解液(Passive Lysis Buffer，试剂盒提供)于室温下裂解细胞15min，期间轻缓晃动培养板，使其裂解完全，离心收集细胞裂解液上清；

c.在检测管中将100μL荧光素酶测试试剂II LARII和20μL上述细胞裂解液上清混合，萤火虫荧光素酶的活性立即用化学发光检测仪LuminometerTD20/20测量；

f.向检测管中加入100μL Stop&Glo试剂，将上述反应猝灭，同时启动海肾荧光素酶反应，测量海肾荧光素酶活性；

g.分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，计算二者酶活性值的比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性。同时，以空载体pGL3-Basic和海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共同转染的EPC细胞作为对照，计算出该启动子的相对活性（图3）。

C：对于免疫刺激实验，在上述重组载体pGL3-Phepcidin和海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共转染EPC细胞24h后，分别在细胞培养基中加入终浓度为6μg/mL和8μg/mL的LPS，及10ng/mL和100ng/mL的polyI:C，继续培养24h，收集转染细胞，用上述双荧光素酶报告基因检测系统分别计算在不同浓度LPS和polyI:C刺激条件下转染细胞中荧光素酶相对活性，并与未经处理转染细胞中荧光素酶相对活性相比较。从图3可以发现，不同浓度LPS和polyI:C的刺激不能明显地改变转染细胞中荧光素酶的相对活性，说明了该大黄鱼hepcidin基因启动子不受LPS和polyI:C免疫刺激的影响，具有稳定启动基因表达的的特性。

Claims

1.一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子，其特征在于其序列为：

2.如权利要求1所述一种大黄鱼hepcidin基因启动子在构建表达真核载体中的应用。

3.如权利要求1所述一种大黄鱼hepcidin基因启动子在转基因鱼构建中的应用。