JPH07501688A - ヒト筋肉細胞の単離、増殖、分化及び遺伝子工学の方法及び細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １６、筋肉組織内の胚芽細胞及び筋管内で転写を行うことができる問題のＤＮＡ 構築物によりそのゲノムを修飾する方法であって：その筋肉組織を、このＤＮＡ 構築物を含んで成る複製欠陥ウィルスと接触させ、これにより、このウィルスが そのＤＮＡ構築物によりその胚芽細胞を形質転換させるような方法。

１７、前記のウィルスが、レトロウィルスである、請求項１６に記載の方法。

１８　筋肉組織の遺伝的能力を変更する方法であって：損傷筋肉組織中に、胚芽 細胞であってその筋肉組織とはゲノムとして異なっているものを注射し：これに より、その胚芽細胞がその組織中に組み込まれる、ことを含んで成る方法。

＋９．前記の胚芽細胞が、ＤＮＡ構築物により形質転換されている、請求項１８ に記載の方法。

２０、胚芽細胞のゲノム中へのＤＮＡ構築物の組み込みの結果としての、減少さ れたレベルのＨＬＡ発現をもつヒト胚芽細胞。

明細書 ヒト筋肉細胞の単離、増殖、分化及び遺伝子工学の方法及び細胞関連出願に対す るクロス−リファランス本出現は、１９８９年１月１３日に出願された、出願番 号第０７／３６５．３７４号の一部継続出願である。

本発明の技術分野は、神経筋疾患の治療における使用のための、そして様々な病 因学の疾患又は症状の細胞治療のための遺伝子工学のための、胚芽細胞（ｍｙｏ ｂｌａｓｔ）の開発である。

背景技術 胚芽細胞は、筋形成（ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）にあずかる中胚葉（ｍｅｓｏｄｅ ｒｍ）の前駆体細胞である。この予定された胚芽細胞は、分化した筋骨（ｍｙ。

ｔｕｂｅ）の生産を導く他の胚芽細胞を認識し、そして同時にこれと融合するこ とができる。この多核節管は、もはや、分裂し又はＤＮＡを合成することはない が、大量に筋蛋白を生産する。これらは、収縮装置の構成物及び神経筋伝達に不 可欠な特殊化した細胞表面成分を含む。実際、この分化筋細胞は、特徴的な横絞 （ｓｔｒｉａｔｉｏｎｓ）及び律動的収縮を示す。この経路に於ける更なる段階 は、成熟である１発達の様々な段階における収縮装置及び筋肉は、異なる数の多 遺伝子ファミリーによりコードされている、筋蛋白の明確な相同形態、例えば、 ミオシン及びアクチンを含む。

胎児及び成人の組織からの胚芽細胞の生産のための方法が開発されている。これ らの方法の成功は、他の細胞から実質的に自由である成人筋組織から大容量の胚 芽細胞を作ることができるということを示唆している。それ故、治療目的のため に、そして筋組織に影響を与える疾患の病因の理解のために胚芽細胞を使用する ことができるような方法を開発することに於いて実質的な興味がある。この胚芽 細胞は、様々な方法において使用されるための能力をもっている。

第一に、この胚芽細胞は、筋組織を含む遺伝的又は非遺伝的欠陥に関連する様々 な疾患の治療のための細胞療法として役立つことができる。また、この胚芽細胞 は、問題の生成物を提供するために１以上の遺伝子をその胚芽細胞に導入するこ とができる場合に、遺伝子治療のための媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）としても有 用であることができる。

これらの遺伝子は、筋肉若しくは非筋肉疾患の治療のための又は新たな苦しくは 強化された遺伝子能力を提供するための、筋肉遺伝子又は非筋肉遺伝子であるこ とができる。

ト筋細胞の単離及びクローニングについて記載している。Ｂｌａｕ　ｅｔａｌ、 、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ０：４８５６−４８６０は、デュシエーヌ筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ 　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）患者から培養された細胞のクローン 分析における、胚芽細胞（付随体細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｃｅｌｌｓ））、 すなわち、成熟筋繊維の単核前駆体に特異的な増殖能力における欠陥ついて記載 しており二上記の筋組織からの繊維芽細胞（ｆ　１ｂｒｏｂｌａｓｔｓ）は普通 の増殖能力をもっている。Ｂｌａｕ　ｅＧｒａｖｅ’　ｓ疾患の細胞仲介性細胞 毒性の研究における検死（ａｕｔｏｐｓｙ）における死体から得られたヒト眼球 外の（ｅｘｔｒａｏｃｕｌａｒ）胚芽細胞の１ｏｐｓｉｅｓ）からの純粋な筋芽 細胞クローンの生産及びその性質の分析について記載している。Ｂｌａｕ　ｅｔ 　ａｌ、、　（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０ニア５８−７６６は、多数 の正常ヒト非筋肉細胞タイプにおけるヒト筋肉遺伝子発現の活性化による非筋肉 細胞と筋肉細胞との融合について記載している。Ｗｅｂｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 、（１９８６）　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７４＋７４−８０は、デュシ エーヌ筋芽細胞の増殖欠陥が、そのＤＶＤ突然変異の初期発現ではなく：代わり に、その胚芽細胞が変性された筋繊維（ｍｕｓｃｌｅ　ｆｉｂｅｒＳ）を再生産 することを企てるときの細胞分裂の消耗に対し副次的を特徴付けするための、検 死における７０歳から得られた胚芽細胞のに対する及びインシュリン及びインシ ュリン様成長因子に対する培養ヒト筋細胞のレセプタ及び反応について記載して いる。Ｇｕｎｎｉｎｇｅｔ　ａｌ、、　（１９８９）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　 Ｂｉｏｌ、７＋　４１００−４１１４は、分化ヒト筋芽細胞内の崩形成性転写集 積の分化パターンについて記載している。

Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８８）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、　８：２２９５−２３０１は、腫瘍壊死因子によるヒト筋芽細胞分化の阻害 について記載している。Ｗｅｂｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８８）　Ｅｘ ｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　１７４：２５２−２６５は、蛍光活性化セル・ソー ターを使用したヒト筋芽細胞の精製について記載していは、ヒト筋付随体細胞の クローン増殖のための血清不合培地について記載している。Ｗｅｂｓｔｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、、　（１９８８）　Ｃｅ１ｌ　５２：５０３−５１３は、デュシエー ヌ筋ジストロフィーにおいて変性する、第一繊維である速い収縮のために特殊化 された骨格の筋繊維のサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）について記載している（本明 細書中に引用された文献をも参照のこさせることにおけるステロイド類の効果及 び自己免疫性失調、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ　ｇｒａｖｉｓ）をも つ患者のためのそれらの生理学的及び治療的な関わり合いについて記載している 。Ｈｕｇｈｅｓ　ａｎｄ　Ｂｌａｕ、　（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　３４５： ３５０−３５３は、基底膜（ｂａｓａｌ　ｌａｍｉｎａ）を横切っての遺伝子操 作された胚芽細胞の移植について記載している。Ｗｅｂｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｂｌ ａｕ、（１９９０）　Ｓｏｍａ、　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、１６ ：５５７−５６５は、正常ドナーからの筋芽細胞当たりに得られることができる 多数の細胞：正常筋ドナーの年齢に依存する細胞して、３０〜６０分裂又は１０ １＠細胞／細胞と同じくらい多くののちについて記載しており：反対に、デュシ エーヌ患者からの胚芽細胞は、非常に若い患者からの胚芽細胞のみが遺伝子操作 されることができるであろうということを示す、非常に加速された複製寿命にお ける年齢関連の減少を示している。

５ｃｈａｅｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　３４４：４ ５４−４５８は、ヒト繊維芽細胞か、安定したトランスフェクション又はレトロ ウィルス感染によりＭｙｏＤ遺伝子を導入することにより、筋肉遺伝子を発現し 、そして筋肉に典型的な器官が分配されている胚芽細胞に、遺伝的に変換され・ インターフェロンによる処理によりヒト筋芽細胞内て誘導されることを示してい る。

発明の要約 細胞を、培養液中で増殖させ、クローニングにより又は流動細胞計測器（ｆｌｏ ｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＦＡＣ３）により精製することができ、そして細胞 治療のために、野性型細胞又は遺伝的に変更された細胞のどちらかとして使用す ることができるような、胚芽細胞及び使用方法を提供する。二〇筋芽細胞は、特 に、損傷の部位に移植され、前に現存する繊維に融合されることができ、そして 遺伝的欠損を修復し、表面膜蛋白を供給し、又は生成物を分泌し、又は筋肉の発 達に関連する機構の解明を可能にする、遺伝子のための担体として役立つことが できる。この胚芽細胞は、少しの注射のみにより、比較的広い範囲を治療するこ とができるように、基底膜を横切って、移植される。

図面の簡単な説明 図１は、レトロウィルス・ベクターα−８Ｇｃのマツプであり：そして図２は、 レトロウィルス・ベクターＭＦＧのマツプである。

特定の態様の説明 疾患の治療のための又は蛋白等の源を提供するための、細胞治療における使用の ための方法及び細胞を提供する。クローンとして純粋であり又は実質的に強化さ れた胚芽細胞を、栄養培地中の血清の非存在又は実質的な非存在中において大量 に生産する方法を記載する。得られた細胞を、筋組織と関連する様々な疾患の治 療、又は生成物の生産、特に、溶解因子に関連する他の組織の治療のために、使 用することがでる。

使用される細胞は、正常な胚芽細胞である。これは、胎児（ｆｅｔｕｓｅｓ）　 、新生児（ｎｅｏｎａｔｅｓ）又はそれより歳をとったヒトからの組織でを含む 組織サンプルであって生体から又は検死において得られたものを含むことができ るものから得られることができる。これらの細胞は、新鮮な状態で使用され、数 日量水の上で組織として維持され、又は１週間培養液中に解離され、そしてブレ ーティングされ、そして次に、凍結されることができる。それらは、約５からそ して普通には約６０集団倍加以下まで増殖された純粋な筋芽細胞のクローン培養 物であり、又は実質的に強化された筋芽細胞であってセル・ソーターにより精製 されそして次に使用のために凍結して保存されたもの、であることができる。幾 つかの目的のために、非制限寿命の永久マウス筋形成性細胞系であって、細胞系 が新形成の（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）の幾つかの特徴をもつものを、実験的に使 用することができる。しかしながら、正常ヒト筋肉組織から単離され、そして治 療的に使用される細胞は、抜型（ｋａｒｙｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ）として安定で あり、そして限定された寿命をもち、そして新形成でないであろう。

ヒト筋芽細胞の純粋な（９９％）の集団を、大量に得て、凍結して保存して、そ して必要なものとしての複製実験又は臨床試験において使用することができる。

ヒト筋芽細胞の単離及び増殖のためのこれらの方法を、様々な筋肉、例えば、四 肢（ｌｉｍｂ）、体幹（ｔｒｕｎｋ）及び眼球外のものに：胎児、新生児及び少 なくとも７０歳までの成人を含む発達の様々な段階に：デュシエーン及びベラカ ー（Ｂｅｃｋｅｒ）筋ジストロフィ′−１皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉ ｔｉｓ）　、を髄部萎縮症（ｓｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒ　ａｔｒｏｐｈｙ） Ｉ及び１１及び脱神経萎縮症（ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｔｒｏｐｈｙ）に： ４°Ｃにおける生理食塩中の生検後７８目の組織に：そして検死における死体組 織に、適用することができる。したがって、ヒト筋芽細胞は、頑丈な（ｈａｒｄ ｙ）組織源であって、容易に移すことができ、そしてあらゆる目的にかなう（ｕ ｎｉｖｅｒｓａｌ）　ドナー源を、死後に得ることができるであろう。デュシエ ーヌ筋芽細胞は、限定された増殖能力をもっており、そして非常に若い年齢の患 者から得られたときを除き容易に遺伝子操作されることができない。しかしなが ら、ディシエーヌ繊維芽細胞は、歳をとった患者から得られたときでさえそれら の増殖能力を保持しており、モしてＭｙｏＤ又はミオゲニン（ｍｙ。

ｇｅｎｉｎ）により筋芽細胞に変換され、そして次に、そのシストロフィン遺伝 子（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ　ｇｅｎｅ）により遺伝子操作されることができるで あろう。遺伝子操作された筋芽細胞は、正常な発達において又は筋肉組織への注 射後に基底膜を横切り、そして成熟筋繊維に融合する。

筋芽細胞の増殖及び精製 細胞を、最適条件としての、細胞培養インキュベーター（３７℃、空気中５％Ｃ Ｏ□、飽和湿度）内で、その検体の培地中で増殖させる。

所望により他の条件を使用することができる。選んだ培地は、有意な分化を伴わ ずに増殖を提供する。したがって、その培地は、筋芽細胞の成熟レベルを保持し 、そして必要なときに、この筋芽細胞は、それらが分化しそして成熟するであろ う環境に導入されることができる。

この筋芽細胞を増殖させるために、接種物を、適切な培地に導入し、そしてその 細胞は、先に示した条件下で増殖される。この接種物の添加後、低い密度におけ る未分化細胞としての増殖のためのその細胞の均一な分散を確保するために、穏 やかな攪拌を使用することができる。細胞を、いずれかの便利な方法により収穫 することができる。組織を、一定攪拌を伴う、Ｗｈｅａｔｏｎ段階的トリプシン 化フラスコ内での、３７℃における、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡによる、 ２又は３回の連続処理により、全体として４０〜６０分間で、解離させることが できる。それぞれのトリプシン処理後にその上澄液中に集められた細胞を、プー ルし、そして氷上で４°Ｃまで冷却する。ウシ血清を、さらなるプロテアーゼ活 性を終止させるために、１０％（ｖｏｌ／ν０１）の最終濃度まで、添加する。

次に、この解離した細胞を、遠心分離（２分間、２５℃）シ：　この細胞ペレッ トを、ならし培地（２４時間後の集密ヒト繊維芽細胞の培養物から回収し、０． ４５μｍで濾過し、そして新たな培地でｌ：ｌに希釈した培地）中に再懸濁し、 そして培養物中にブレーティングするか又は１ｍｌ当たり約０．１ｃｍ’組織の 密度において液体窒素内で凍結させるかのどちらかを行う。細胞収率は、細胞が 凍結に先立ち数日間培養において増殖される場合に増加する。

筋芽細胞は、筋肉ＮＣＡＭ（５，ＩＨＩ　ｌ）に対するモノクロナール抗体によ り標識付けをし、その後、第二のフルオレセイン結合抗体の又は３段階のＴｅｘ ａｓ　ｒｅｄアビジン標識付けの手順を行った後、蛍光活性化セル・ソーターを 使用して濃縮されることがてきる。（この３段階手順においては、ＮＣＡＭに特 異的な抗体、ビオチン化された第二抗マウス［ｇＧ　、及びシグナルの大きな増 幅を提供するＴｅｘａｓ　ｒｅｄアビジンを使用する。）全細胞の２４％と同じ ほど少しのものを含んで成る筋芽細胞を、９９％純度よりも大きく濃縮し、そし てこの濃縮は、培養において１力月までの間維持される。

筋芽細胞が大量に得られない場合には、例えば、デュシエーン筋ジストロフィー 患者からの筋肉組織の場合には、正常増殖能力をもつ同一組織からの繊維芽細胞 を、それらの代わりに使用することができる。ヒト繊維芽細胞は、遺伝的に、筋 肉遺伝子を発現し、そして筋肉細胞構造物：器官、例えば、ゴルジ体（Ｇｏｌｇ ｉ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）、微小管結合中心（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ　ｏｒｇ ａｎｉｚｉｎｇ　ｃｅｎｔｅｒ）　、及び中心小体（ｃｅｎｔｒｉｏｌｅｓ）を もつ。これは、外来遺伝子（構成的プロモーターとの相同的組換え）の発現によ り又はＭｙｏＤ又はミオゲニン又は構成的発現のためのこの遺伝子ファミリーの 他のメンバーをコードしている導入された遺伝子の発現により達成される。この ように遺伝子操作された”筋芽細胞′は、以下に記載する操作の全てにおいて真 の筋芽細胞の代わりとして役立つ。

あらゆる目的にかなうドナー筋芽細胞 所望により、上記の細胞は、主要組織適合性複合体ＭＨＣ抗原について、同−又 は類似のＭＭＣ抗原プロフィールをもつヒトから、又は同種免疫の（ａｌｌｏｇ ｅｎｅｉｃ）ＭＨＣ抗原に耐性の患者から、同種であるか又は異種であるかのど ちらかによりマツチングされるであろう。他方において、ＭＨＣクラス１及び／ 又はＩＩを欠く細胞を作ることにより、上記と同一の結果を達成し、そしてこの タイプの個々の患者の治療を回避することを可能にすることができるかもしれな い。このアプローチにおいては、１人のドナー、すなわち″すべでの目的のかな うドナー”からの細胞を、複数の患者の治療のために使用することができるであ ろう。クラス］陰性細胞を、そのα−鎖の発現及び／又は伝達を妨害することに より達成することができ、一方、クラス１１陰性細胞は、α及びβ鎖の両方の発 現及び／又は伝達による妨害を必要とするであろう。

上記のクラス■及び／又はクラスＩＩのＭＨＣ抗原の不活性化を、様々な方法に より達成することができる。例えば、クラス■により、その蛋白かクラス１のＭ ＨＣ分子と効率的に複合体を作りそしてその膜内のクラスｒ　ＭＨＣ抗原の挿入 を防止するおとり（ｄｅｃｏｙ）として作用するところの、単一の修飾β２−マ イクログロブリン遺伝子を過剰発現させることができる。類似の”優勢陰性（ｄ ｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ）”のアプローチを、それらを非機能的にす る宿主細胞のサブユニットと複合体を形成する欠損α又はβサブユニットをコー ドしている修飾遺伝子を過剰発現させることにより、クラスＩＩのために使用す ることができるであろう。修飾されたＭＨＣ又はβ２マイクログロブリン遺伝子 の発現又は遺伝子の不活性化を、トランスフェクション、レトロウィルス感染又 は相同的組換えのいずれかにより達成することができる。

あるいは、その細胞表面上のクラス■抗原のレベルを、トランスフェクション又 はレトロウィルス感染により、アデノウィルスＥ１９蛋白をコードしている配列 を、筋芽細胞に導入することにより、減少させることができる。この蛋白は、ク ラス１分子のその形質膜（ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）　ヘの正常な伝達 を防止する粗面小胞体（ｒｏｕｇｈ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌ ｕｍ）内て、ＭＨＣクラス１抗原と特異的に複合体を１５１−１６３を参照のこ と。）。クラスＩ及びＥ１９分子以外の蛋白は、これらの複合体と全く関連がな いよってある。発現の１８時間内に、クラス１発現は、７０％程、減少されるこ とができる。８１９蛋白は、細胞を認識する細胞毒性のＴリンパ球の能力を減少 させる。他のアデノウィルス蛋白と比べて、Ｅ１９は、腫瘍性でない。このＥ１ ９遺伝子により操作された細胞は、ウィルス感染細胞と同様に、免疫監視から逃 れることができる。

筋芽細胞の遺伝子操作 培養においては、筋芽細胞は、融合、トランスフェクション、リボフェクション （Ｉｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）　、感染、エレクトロポレーション、ＤＮＡ被覆粒 子による生物分解、等を含む、多種多様方法のいずれかにおいて、遺伝子操作さ れることができる。外来遺伝子を導入するための特定の方法は、本発明には決定 的てない。ＤＮＡの導入のための目的に依存して、特異的相同的（適法な組み込 み）組換え又は非合法的な組換えをもつことに興味があることができる：Ｓｍ１ ｔｈｉｅｓ、　ｅ５２を参照のこと。特異的組み込みのためには、問題の遺伝子 を、普通には、少なくとも約ＩＯ塩基対、しばしば５０塩基対により、その組み 込みのための側に相同的なりＮＡをもつ少な（とも１つの剥土において、普通に は、ｌＯＯ塩基対において、隣接されるであろうし、そして問題の相同的なりＮ Ａの全体が、ｌＯｋ塩基対と同じ程高く、普通には、約５に塩基対以下であるこ とができ、適切には、このフランキング領域は、はとんど上記と同一のサイズで あろう。様々な技術を、その標的遺伝子が不活性化又は修飾されていることを確 認するための、特異的組み込み又は相同的な組換えのために使用することができ る。発現された遺伝子は、その標的遺伝子のプロモーターが活性のまま残りそし て作られた融合蛋白が６４１８、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、 蛍光活性化セル・ソーター等による選択を許容するときに、相同的組換えにより ７０〜８５％の頻度において不活性化され又は突然変異されている（Ｒｉｅｌｅ 　ｅｔ　ａｌ、、　（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　３４８：６４９−６５１：Ｊ ａｓｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９９０）Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖ、４：１５ ７−１６６）。

組み込みのだめの領域は、特定の筋肉欠陥と関連するＤＮＡ配列を含むことがで きる。したがって、宿主の筋芽細胞を、宿主から取り出し、相同的組換えにより 遺伝子操作し、そして細胞をクローン化し、そしてその欠陥の部位における相同 的な組換えについてスクリーニングすることができる。あるいは、天然の誘導遺 伝子であって筋芽細胞又は成熟筋組織内で正常に抑制されているものが関連する 場合には、その転写開始調節配列、例えば、エンハンサ−をもつか又はもたない プロモーターが誘導のための異なる基礎又は構成的な転写を提供するために修飾 されているような相同的組換えを提供することかできる。したがって、上記の筋 芽細胞を、外来遺伝子（宿主に対して生来のものでない）又は異種のものであっ て正常には筋肉組織内で発現されないものの発現のために使用することができる 。

例えば、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）　、成長因子（例えば、ＥＧＦ　 、　ＰＧＦ等）、コロニー刺激因子、インターフェロン、表面膜レセプタ、イン ツユリン等の提供を欲することができる。転写開始調節領域を修飾することによ り、筋芽細胞は、発現生成物の構成的な生産を提供することができ、又は、二者 択一的に又は組み合わせとして、可溶化生成物であって細胞の誘導性転写を提供 するもの、例えば、細胞質、核、等、蛋白質のためのレセプタを誘導することが できる。

このレセプタを活性化することにより、筋芽細胞は、その関連リガンドの誘導下 て、その発現生成物を生産するように誘導されることができる。その領域が、生 来のものであることができ、そして筋芽細胞内て転写活性があることがてき、又 は異種のものであることができ、又は筋肉細胞、筋芽細胞及び筋骨内で発現され ない遺伝子と関連することができる場合に、様々な調節領域を、転写開始のため に使用することができる。この開始領域は、普通には、強いプロモーターである てあろう、そして筋肉細胞内で活性なエンハンサ−を含むことかできる。問題の プロモーター・は、ベーターアクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）プロモーター、 アルファーアクチン・プロモーター、チュープリン（ｔｕｂｕｌ　ｉｎ）プロモ ーター、ミオシン（ｍｙｏｓｉｎ＞プロモーター、ウィルス、例えば、５１ｍ１ ａｎウイルス、アデノウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、乳頭腫（ｐａｐｉｌ ｌｏｍａ）ウィルス、サイトメガロウィルス（ｃｙｓｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕ ｓ）等のプロモーターを含む。

様々な媒介物又はベクター構築物を、筋芽細胞の遺伝子操作のために使用するこ とができる。トランスフェクション又は感染のための特定の興味のあるものは、 複製欠陥ウィルス・ベクター、ＤＮＡウィルス又はレトロウィルス（ＲＮＡ）ベ クターであって、細胞中に導入することができるものである。このベクターは、 正常にいは、いずれの原核生物ＤＮＡを実質的に含まないであろうし、そして多 数の異なる機能的配列を含んで成ることができる。既に討議したように、この機 能的配列の中の１つは、転写及び翻訳の開始及び終止の調節配列を含んで成るＤ ＮＡ領域、問題の蛋白をコードしているオーブン・リーディング・フレームであ ることができ、そしてさらに、部位特異的組み込みのためのフランキング領域を 含んで成ることができる。いくつかの状況においては、既に示したように、この ５−フランキング領域は、その転写開始領域の性質を変更するための相同的組換 えを提供するであろう。例えば、エンハンサ−の存在の有無を、誘導性転写又は 非誘導性転写を提供するために、転写等のレベルを減少又は増加させるために、 変更することができる。同様に、このプロモーター領域を、誘導に対する感受性 を増加又は減少させるように、転写等のレベルを減少又は増加させるために、変 更することができる。

使用される構造遺伝子は、細胞内生成物を、すなわち、細胞内、細胞質又は器官 、例えば、核内に保持されているものを、膜、細胞内の膜又は細胞膜のいずれか の膜に対する輸送中のものを、又はその構造遺伝子内に存在する天然のシグナル 配列又はその構造遺伝子内に天然には存在しないシグナル配列を提供することに よる分泌のためのものを、もたらすことができる。いくつかの状況においては、 問題の可溶化蛋白がより大きな蛋白の断片である場合には、分泌及びそのプロセ シング部位におけるプロセシングの間に、所望の蛋白が天然の配列をもつであろ うような蛋白質を、シグナル配列に提供することが必要かもしれない。例は、成 長ホルモン、因子Ｖｌｌ！、因子１ｘ、サイトカイン、心血管新生（ｃａｒｄｉ ａｃ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を促進する血管新生促進因子（ａｎｇ ｉｏｇｅｎｉｃ　ｆａｃｔｏｒｓ）、サイトヵイン・レセプタの拮抗体、グルコ ース輸送体、インシュリン・レセプタ、避妊薬、又は特異的な部位への癒着及び 転移を促進するアトレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｓ）を含むこおとができた。以 下の表は、問題の様々な遺伝子及び適切なものとしての関連疾患を示している。

・因子１ｘ及び因子ＶＩＩ［（血友病（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｓ）　：血液凝固 失調）・アルファー１−抗トリプシン（気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ））・成長ホ ルモン（先天性及び後天性成長ホルモン欠陥）・その他のホルモン欠陥 ・アデノシン・デアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ）（そ の他の免疫欠陥失調） ・酵素欠損（代謝失調） ・シストロフィン（ｄｉｓｔｒｏｐｈｉｎ）（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ及びＢｅｃｋｅ ｒ筋ジストロフィー） ２、　卑： ・インターロイキン（白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ））・インターロイキン−２（ Ｔ−細胞活性化剤：腫瘍の縮みを導く）・ロイプロリド（Ｉｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ）　：　ヒト・ゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏ　ｔ　ｒ。

ｐｉｎ）の類似体（卵巣（ｏｖａｒｉａｎ）及び精巣（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ） ）・アスパラギナーゼ（白血病） ・特異的蛋白に対するモノクロナール抗体（特異的［ｇＧ）・キメラのマウス・ ヒト抗体を含む腫瘍細胞の表面・顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）コロニー刺 激因子（全ての癌：化学両方のより高い投与量を許容する） ３、　シ： ・脳へのアクセスが可能な場合：脳内に筋肉を移植する・グルコセレブロシダー ゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅＸ他のりリゾーム保存失調；Ｔａｙ 　５ａｃｈｓ） ・レボドパ（Ｌｅｖｏｄｏｐａ）　（パーキンソン症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’　 ｓ））・神経成長因子（アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’　ｓ））・幾 つかの神経伝達失調 ・遺伝性の、発達の、変性の、外傷性の、又は感染性の、種類の機能不全（ｄｙ ｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）の哺乳類ＣＮＳの治療における、その他の遺伝子生成物及 び代謝物 ４、　調節発現が達成される場合： ・インシュリン（糖尿病） ・グルコース輸送体（糖尿病） ・成長因子：　ＩＧＦ−［及びＩＧＦ−１ｔ５、　感染性疾患： ・病因の遺伝子の作用の発現を妨害するための、卿胞中への、アンチセンス配列 、毒素遺伝子、又は他の遺伝子の配達６・　二廷 ・ヒト絨毛膜（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ）のゴナドトロピンに対する抗体・透明帯（ ｚｏｎａ　ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）抗原又は精子抗原に対する抗体−ＲＵ−４８６ 黄色体ホルモン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）拮抗質７、１ニ ーｘノンドルフィン類ｅｎｄｏｒｐｈｉｎｓＸダイノルフィン（ｄｙｎｏｒｐｈ ｉｎ））：内因性のアヘン誘導体（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｐｉａｔｅｓ）８ 、　血液凝固失調： ・因子ｖｔ＋ｒ及び因子［Ｘ（血友病）・組織プラスミノーゲン（ｐｌａｓｍｉ ｎｏｇｅｎ）活性化剤・ＣＤ４（ＨＬＡ）に対する抗体 １０、材匹： ・リンパ球増殖を刺激するための成長ホルモン・ウィルスがＣＤＪ＋細胞と相互 作用することを防ぐための、おとりとしてのＣＤ４蛋白 Ｉｌ、その他・ ・ホルモン、血清蛋白、他のホルモンの又は拡散しうる蛋白、及び低分子量の代 謝生成物 マーカーは、媒介物構築物を含む細胞の選択のために存在することかできる。正 常には、このマーカーは、１以上の細胞毒性剤からの保護を提供することにおい て、陽性の選択を許容するであろう。

例えば、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）耐性を、細胞がＧ４１８により選択 されることができる場合に、使用することができ、ジヒドロ葉酸レダクターセを 、メトトラキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）に対する耐性につぃて使用す ることができ、セル・ソーターを、ＬａｃＺ等を発現する細胞を選択するために 使用することができる。このマーカーは、選択が誘導下で又は誘導を伴わずに生 じるように、誘導性又は非誘導性の遺伝子であることができる。

ベクターは、複製起点、及び宿主内の複製に必要なその他の遺伝子をも含むこと かできる。この複製起点並びに特定のウィルスによりコートされている複製と関 連する蛋白のいずれかを含んで成る複製系が、構築物の一部として含まれること ができる。複製をコードしている遺伝子が筋芽細胞の形質転換を提供しないよう に、その複製系を選択することにおいて、注意しなければならない。例示的な特 に、複製欠陥レトロウィルス・ベクターを使用することができる。

により記載されている。最後の媒介物構築物は、１以上の、問題の遺伝子をもっ てもよい。ｃＤＮＡ遺伝子又は染色体遺伝子のどちらかを、使用することができ る。

あるいは、細胞を、感染性の複製欠陥ウィルス・ベクターの注射により、インビ ボにおいて遺伝子操作することができる。このベクターを、両バゲージング（ａ ｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ）のためのレトロウィルス生産細胞 中に導入することができる。次に、このウィルスを回収し、濾過し、そして遠心 分離により濃縮し、そしてそのウィルス株を、次に、インビボにおいである部位 に注射するうことができる。本筋芽細胞は転移するであろうことが判明している ので、問題の部位における筋繊維中への比較的少量の注射のみが必要である。

なぜなら、この筋芽細胞が、隣接領域中に拡がるであろうからであ筋芽細胞転移 は損傷部位へのアクセスを許容する本筋芽細胞は、注射の元の部位から、他の部 位、特に損傷部位、例えば、変性した病巣（ｆｏｃｉ）まで、転移することが判 明している。

したがって、筋芽細胞を、宿主、特に組織中に、普通には筋肉組織であってその 損傷に近いものの中に注射することにより、損傷部位の治療を可能にする帰巣現 象（ｈｏ制ｎｇｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）が存在するよってある。但し、その循環 への注射が可能でもある場合に限る。遺伝子操作された筋芽細胞を使用すること により、その損傷領域への筋芽細胞の注射を行う必要を伴わずに、その損傷領域 への可溶化蛋白生成物の特異的適用を提供することができる。この損傷組織への 筋芽細胞の帰巣は、筋肉損傷の治療のために新たな治療的門戸を開いている。こ の筋肉組織の修飾のために使用される剤、すなわち、筋芽細胞又は複製欠陥ウィ ルス・ベクターのいずれかに依存して、投与の方法か異なることができる。細胞 のためには、普通には、この注射は、処理されるべき筋肉組織のＣｍ’当たり約 １０５〜１０’細胞であるであろう。上記のウィルス・ベクターのためには、こ の濃度は、その用途に依存するであろう。このベクターは、便利には、生理学的 に許容される培地、例えば、生理食塩水、リン酸バッファー生理食塩水、等巾の 注射により投与されるであろう。存在してもよい他の添加物は、ポリプレン（ｐ ｏｌｙｂｒｅｎｅ）を含む。

組織に対する外傷は、問題の領域内に比較的少量の注射をすることにより、実質 的に最小化される。特に、患者が広い範囲の治療の必要性があるかもしれない場 合には、特定範囲内で多数の注射をする必要性は明白である。

以下の例を、説明として提供し、そして限定としては提供しない。

寒穐男 （１）　ＢＡＧ（Ｐｒｉｎｃｅ　ｅｔａｌ、、　（１９８７）Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：１５６−１６０）は、レトロウ ィルスであって、Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスのロング・ターミナル・ リピート（ＭＭｕＬＶ　５’　ＬＴＲ）及びｇａｇ　ｐｒ６５翻訳開始コドンの 転写制御下の大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＬａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ をコードしている）、並びにＳＶ４０初期プロモーターの制御下のネオマイシン 耐性遺伝子を、発現するものである。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：６７９５−６７９９）は、レトロウィルスであって、 その上でＳＶ４０　Ｔ抗原の１０アミノ酸の核局在化シグナルがそのＮ−末端に おいて操作されているところの修飾された大腸菌（Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉ　）　Ｌ ａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼをコードしている）を発現するものである 。このＬａｃＺ遺伝子は、Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスの５゛及び３′ のロング・ターミナル・リピート内に埋め込まれており、そしてＳＶ４０初期プ ロモーターの制御下にある。

上記の毀及びＭＭｕＬＶＳＶｎｌｓＬａｃＺのレトロウィルスは、それぞれ、Ｄ ｒ、　Ｃｅｐｋｏ（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕ、）及び叶、　Ｎ１ｃｏｌａｓ（Ｉｎｓ ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ）により、十分に提供された。感染のために、ＣＲ ＥＢＡＧ２レトロウィルス生産細胞からの上澄液を、ＢＡＧを曹ＣＲＥパッケー ジング細胞系であっｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８５：６４６０−６４６４）に トランスフェクションし、濾過し、そして濃縮した後に、得た。この關ｕＬＶＳ Ｖｎ　１ｓＬａｃＺベクターを、ＭＭｕＬＶＳＶｎｌｓＬａｃＺを、ｖ２パッケ ージング細胞系（Ｂｏｎｎｅｒｏｔ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８７）、　ｏｐ、 　ｃｉｔ、）にトランスフェクションすることにより作った。

筋肉組織中に実質的に注射された培養液中の筋形成細胞のレトロウィルス感染に よる遺伝子（ＬａｃＺ　、　ｈＧＨ、及びａｄｅｎｏ　ＥＩ９）の導入（５）α −５ＧＣ（図１を参照のこと。）は、ＣＭＶエンハンサ−及びα−グロビン（ｇ ｌｏｂｉｎ）の基礎プロモーターの制御下で大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＬａｃＺ遺 伝子を発現する自己−不活性化（ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）として 言及されるレトロウィルスである。この内部プロモーターからの高いレベルのＩ ａｃＺ発現は、細胞の感染後、転写不能の５°ＬＴＲをもたらすウィルスの３° ＬＴＲ内の欠失により可能になる。このベクターのための生産細胞系（３Ｔ３マ ウス細胞系）は、ＷＣＲＩＰであり、そしてα３８として知られている。（Ｃｏ ｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６．９５４　（１９８７）＋　Ｄ ａｎｏｓ　ａｎｄ　Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．６４６０　（１９８８））。この構築物の利点は・ （ａ）ＬＴＲの制御要素によるプロウィルス挿入における内因性遺伝子の活性化 により引き起こされる、挿入突然変異誘発の減少された可能性、及び、 （、ｂ）　ｌ！能的な５’　ＬＴＲ及びＴパッケージング・シグナルがそのウィ ルス転写物を欠いていることによる、感染細胞内の内因性レトロウィルスによる 感染ウィルス中へのウィルスＲＮＡのパッケージングの減少された見込み、 である。

（６）　ＭＦＧ　（図２を参照のこと。）は、ウィルスＬＴＲの制御下で、ヒト 成長ホルモン遺伝子を発現するレトロウィルスである。このヒト成長遺伝子は、 レトロウィルスＧＡＧ遺伝子の断片の下流に挿入される。初期転写物のスプライ シング及びｈＧＨ発現ｍＲＮＡの効率的な生産を可能にするために、スプライス 供与部位及びスプライス受容部位は、Ｖパッケージング配列に隣接する。また、 スプライシングは、宿主内に新たな感染ウィルスを作るためにウィルス転写物が 内因性のレトロウィルスにより使用されることができないということを確認する ための曹パッケージング配列の除去をも導く。このベクターのための生産細胞系 は、ｖｃＲｒｐてあり、Ｓ４０．３として知られている。

（７）　ｐＥ３ＴＵ　ハ、ＣＭＶプロモーター（７）制御下チアゾ／　Ｅ１９を 、そしてＳＶ４０プロモーターの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を発現するプ ラスミドである。

（８）　ｐＬＸＳＮ−Ｅ１９は、Ｍｏ１ｏｎｅｙウイルスＬＴＲの制御下でＥ１ ９遺伝子を、そしてＳＶ４０プロモーターの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を 発現するレトロウィルスである。

（９）　ｐＬＸＳＨ−ＥＩ９は、ウィルスのＭｏ１ｏｎｅｙ　ＬＴＲの制御下で ＥＩ９＋９遺伝子そしてＳＶ４０プロモーターの制御下でハイグロマイシン（ｈ ｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を発現するレトロウィルスである。

ｐＥ３ＴＵを、アデノウィルス２　ｇｐ　＋９遺伝子の６５３　ＢａｍＨＩ断片 を、プラスミドｐＣＢ６（Ｄ、　Ｒｕ５ｓｅ１１．　Ｍ、　Ｒｏｔｈ及びＣ，Ｂ ｒｅｗｅｒからの贈り物）のポリリンカー内のＢａｍＨ１／Ｈｉｎｄ［［１部位 中に挿入することにより構築した。このアデノＥ１９断片を、ｄ１７１２プラス ミド（Ｂｈａｔ　ａｎｄＷｏｌｄ、　（１９８７）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１ ：３９−３９４５）であって、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位にクローン化され たアデノ２　Ｅ３　転写ユニットを含むものを消化することにより得た。その親 レトロウィルスｐＬＸＳＮは、Ａ、　Ｄ、　Ｍｉｌｉｅｒ　（Ｈａｃｋ、　ｅｔ 　ａｌ、、　（１９８９）　Ｂｌｏｏｄ　７４：８７６−８８１）により提供さ れた。

ｐＬＸＳＮ−Ｅ１９を、以下のように構築した。ｐＥ３ＴＵのＣ１ａ［／Ｂａｍ 旧断片を、ｐＢＲ３２２中に伝達した。得られたプラスミドからの断片を含むＥ ｃｏＲ［−ＢａｍＨＩ　Ｅ１９を、次に、ｐＬＳＸＮレトロウィルスのＥｃｏＲ ［−ＢａｍＨ［部位（ＭｏＭＳＶ　ＬＴＲ）に結合した。

ｐＬＸＳＨ−ＥＩ９を、５ｔｕｌ及びＸｂａ　ｌ　［消化によりネオマイシン耐 性遺伝子を除去し、そしてそれを、ｐＬＨＬ（Ｐａｌｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８７）　８４ ：１０５５−１０５９）から単離されたハイグロマイノン遺伝子と置き換えるこ とにより構築した。

ａ−５ＧＣ及びＭＦＧレトロウィルスは、Ｒ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＳｏｍａｔ ｉｘにより我々に十分に提供され、そしてｐＥ３ＴＵプラスミド及びｐＬＸＳＮ −Ｅ１９及びｐＬＸＳＨ−Ｅ１９レトロウィルスは、Ｗ、　Ｗｒｉｇｈｔ　（Ｉ Ｊ、　ｏｆ　Ｔｅｘａｓ）により十分に提供された。

Ｂ、　正常な発達における胚芽細胞の転移の証拠本目的のだあめに１、レトロウ ィルス・ベクターを、筋肉組織中に直接的に注射した。筋肉組織内の分裂筋形成 細胞の感染にわたり行なった。ウィルス株（５０〜２００μｌ）を、活性炭粒子 及び１０μＫ（のポリブレンと混合し、そして麻酔したＷｉｓｔａｒラット後肢 の外側の背部表面中に２６ゲージ張りから注射した。動物を、約２週間の間、発 達に供した。３０〜６０分後、後肢の低部を、皮膚を含まないように解剖し、冷 凍イソペンタン中で凍結させ、そして低温槽上て連続した３０μｍ切片に切断し た。切片を、４％パラホルムアルデヒド中で後固定し、洗浄し、そして３７°Ｃ て一夜、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ　Ｘ−ｇａｌ、５ｍＭフェリシアン化及びフェ ロシアン化カリウム、１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ中で染色し、グリセロール：ＰＢＳ（ ９：Ｉ）中に載せ、そして青色のＸ−ｇａ１反応生成物の存在についてＺｅｉｓ ｓ　ＡｘｉｏｐｈｏｔｌＪｌ微鏡により明るい視野の下で検査した。青色に染色 された筋繊維のクラスターは、この後肢の低部の全体にわたり散らばっていた。

活性炭粒子は、一般的に、ヒラメ筋（ｓｏｌｅｕｓ）と腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ ｎｅｍｉｕｓ）との間に位置し、そして感染の部位を同定するために使用される 。標識された筋肉細胞のクラスターの分布又はサイズにおける差異は、ＢＡＧ又 はＭＭｕＬＶＳＶｎｌｓＬａｃＺベクターのいずれによっても全く観察されなか った。このベクターを、日Ｐ９（Ｐ・生後（ｐｏｓｔｎａｔａｌ））と日Ｐ２０ との間の様々な加齢において注射し、そして日Ｐ２３〜Ｐ３７０間に分析した。

さらに、活性炭粒子の近くの標識細胞のクラスターは、数ミリメーター離れたも のと検出できる程の違いはなく、このことは、この注射が、付近の組織の発達を 混乱させていないことを示唆している。

後方腓腹筋内の染色筋繊維のクラスターは、この胚芽細胞が感染されることがで き、そして多核繊維への融合後でさえβ−ガラクトシダーゼを発現することがで きていたことを証明していた。観察された多くのクラスターは、単一細胞から生 じたクローンを現しており、その子孫のいくつかは、与えられた筋繊維の基底膜 を横切り転移し、そして隣接する筋繊維に融合した。それぞれの胚芽細胞が感染 時において単一の繊維と関連するので、このデータは、胚芽細胞が繊維から繊維 まで基底膜を通して転移することができることを示している。その上、感染事件 の大部分（７実験中５９％の平均）は、多数の筋繊維に拡がるクローンを作り出 したので、転移は、比較的頻度の高い事件のよってある。

感染ラットの足甲のβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞のそれぞれのクラスターが、 単一のレトロウィルスにより感染した胚芽細胞からクローン化により生したこと を証明するために、２つのベクターの混合物であって明瞭なβ−ガラクトンダー ゼ染色パターン　核及び細胞質を作るものを、注射した。クローンの数及びサイ ズを最大化するために、この２つのベクターの混合物を、日ＰＯのラットの後肢 に注射した、この時、広範囲の増殖及び繊維形成が生じている。その中の２３が 細胞質β−ガラクトシダーゼを含んでいた８７のの別個のβ−ガラクトシダーゼ −陽性クラスターにより重く感染された２つの肢において、２つの場合において のみ、細胞質染色された繊維に隣接する繊維が核染色を含んでいた。したがって 、それにより隣接筋芽細胞か独立して感染されるところの頻度は、後肢低部の当 たり４０〜５０クローンのレベルにおいて感染された動物において１５％未満で ある。より低いウィルス感染頻度をもつより歳をとった動物における同様の実験 は、両方によらず核又は細胞質β−ガラクトシダーゼのいずれかによりマークさ れた標識繊維のクラスターを作った。

したかって、より少ない重く感染したより高齢の後肢においては、そのクラスタ ーのいずれもが２以上の別個の感染から生してはいないよってある。大多数は、 単一の感染事件から生したクローンである。

新たな繊維は、本調査の期間にわたり形成されていないよってある。なぜなら、 繊維の平均数が一定で変わりないからである。さらに、クローン内の繊維の平均 直径は、その筋肉についての総平均繊維直径と同様であった。このデータは、そ れにより胚芽細胞が異なる繊維に含まれるであろうような機構としての、基底膜 を通しての胚芽細胞の転移を強く支持している。Ｈｕｇｈｅｓ　ａ口ｄ　Ｂｌａ ｕ　（１９９０）、前記を参照のこと。

上記のレトロウィルス・ベクター漂識付は技術は、生後げっ歯頚において個々の 胚芽細胞が筋肉繊維、例えば、速い又は遅い収縮に特殊化した繊維の特定の集団 の形成に委ねられていないということを証明するために使用された。ＭＭｕＬＶ ＳＶｎｌｓＬａｃＺの注射により標識されたクローンは、それらの環境における 全てのタイプの繊維に貢献する。この発見は、様々な筋肉中に注射されたときト ランスフェクトされた胚芽細胞の単一クローンが全てのタイプの筋肉に寄与する ことができそしてその再生産に参加することができるであろうと１１つことを示 唆している。（以下をも参照のこと）。

本目的のために、筋形成細胞を、クラスター内でマーク（遺伝子操作）し、そし て続いて筋肉組織に注射した。ベクターＬＰ３２８とＢＡＧとの両方を、筋肉特 異的プロモーター例えば、ＬＰ３２８中のＨＣＡがＢＡＧ内のウィルスＭＭｕＬ Ｖ　ＬＴＲよりも筋肉組織内でより安定な長期間の発現を提供するようにするた めに、本目的のために使用した。永久確立マウス筋形成細胞系、Ｃ２Ｃｌ２を、 Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ修飾Ｅａｇｌｅ’　ｓ培地及び１５％ウシ血清及び５％ ウン胎児血清中で増殖させた。Ｃ２Ｃｌ２筋芽細胞を、ＢＡＧレトロウィルス（ Ｃ２ＢＡＧ）により感染させるか又はＬＰ３２８プラスミド及びネオマイシン耐 性プラスミド（Ｃ２ＡｃｔＬａｃ）の混合物により共同トランスフェクトし、そ してネオマイシン類似体Ｇ４１８の存在中で増殖させた。Ｘ−ｇａｌによる染色 に基づく高いレベルのβ−ガラクトシダーゼを発現したＧ４１８耐性Ｃ２ＢＡＧ 又はＣ２ＡｃｔＬａｃクローンをサブクローニングし、そして実験において使用 した。

遺伝子操作された胚芽細胞を、生後２６〜３２日目のマウス（Ｃ３Ｈ雄）に注射 した。異なるプロモーター構築物を含む胚芽細胞につし）で同一の環境を提供す るために、右及び左の両方の後方腓腹筋を注射した。それぞれのマウスの１つの 腓腹筋の筋肉に、１０μｌ　ＰＢＳ中の５Ｘ　ｔｏ’　Ｃ２ＢＡＧ筋芽細胞を注 射し、そして対側性の腓腹筋の筋肉に、ｌＯμｌ　ＰＢＳ中の５　ｘ　１０’　 Ｃ２ＡｃｔＬａｃ筋芽細胞を注射した。注射した側をマークするために、活性炭 を注射に先立ってそれぞれの細胞懸濁液に添加した。

インビボにおけるβ−ガラクトシダーゼの経過時間を測定するために、２匹のマ ウスを、ランダムに選び、そしてそれぞれの時間点：注射後ｌ０１１９．４０． ５４、及び７７日目において殺した。分析のために、その膝において脚を切断し 、そして脛骨（ｔｉｂｉａ）を除去した。

肢低部をＯ，Ｃ，Ｔ、（Ｍｉｌｅｓ、　Ｉｎｃ）内に載せ、そして融点イソペン タン中で一１５０°Ｃまで急速冷凍した。それぞれの凍結ブロックを、連続して ３０μｍ切片に切断した。切片を、Ｘ−ｇａｌ染色によりβ−ガラクトシダーゼ 活性について組織化学的に分析し、そして光学顧微鏡により可視化した。

両方のタイプの胚芽細胞（Ｃ２ＢＡＧ及びＣ″ＡｃｔＬａｃ）は、大きな繊維直 径を特徴とする前現存内因性筋肉繊維中に融合した。さらに、この胚芽細胞は、 新たな小さな直径の繊維を作るための他の注射された細胞と融合した。これらは 、脚を切片に分け、そして上記の最も早い時間点、注射後１０日目におけるβ− ガラクトシダーゼについて染色されたときに既に明らかであった。注射された細 胞は、その組織内に残り、そして１８０８０日目、より大きな繊維直径の筋肉繊 維中で外来遺伝子を発現し続けた。

注射された胚芽細胞は、全てのタイプの筋肉繊維：速い又は遅い収縮のために特 殊化したものに融合した。マウス筋芽細胞の単一クローン、すなわち、永久筋形 成細胞系及び生後マウス後肢から単離した主要マウス筋芽細胞クローンの両方を 、ＬａｃＺ発現レトロウィルス・ベクターで感染させ、そして注射により同系の マウスの脚に戻した。この注射された胚芽細胞は、その胚芽細胞の筋肉起源又は その標的筋肉の性質に係わらず、テストされた全ての筋肉における全ての繊維タ イプの筋肉繊維中に融合した。その上、その注射された細胞が寄与するところの 繊維の性質は、その注射された胚芽細胞がインビボにおけるその標的筋肉により 発現されたものとは異なるミオシン重鎮相同形態をインビトロにおいて発現する ときでさえ、上記の手順により変更されることはなかった。これらの結果は、胚 芽細胞の単一クローンが遺伝子操作されることができ、そしてその動物に戻され たものが全てのタイプの筋肉繊維に寄与するであろうということを示唆している 。したがった、単一の修飾ヒト筋芽細胞クローンは、所望の標的ヒト筋肉のいず れの中の繊維に効果的に寄与することができる。

Ｄ、　同種筋芽細胞に対する免疫反応の証拠遺伝子操作されたＣ２Ｃｌ２細胞（ Ｃ２ＢＡＧ）を、同系（ｓｙｎｇｅｎｅ　ｉｃ）の、同種（ａｔ　Ｉｏｇｅｎｅ ｉｃ）の、免疫抑制された又は免疫不全の（ｓｃｉｄ）マウスに注射した。先に 記載したように、注射した胚芽細胞は、前現存の内因性筋肉繊維及び互いに融合 することにより形成された新たな筋肉繊維の両方と融合した。注射した胚芽細胞 は、同系のＣ３Ｈ宿主（Ｈ−２ｋ）内で研究の期間（６力月）にわたり維持され た。反対に、細胞は、同種のＣ５７マウス（Ｈ−２ｂ）中への注射後１０日目に 急速に減少した。シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ　ＡＸ２４ｍｇ ／ｋｇではなく　７５ｍｇ／ｋｇ）の毎日の１．ｐ、注射は、この急速な損失を 防止し、そしてその細胞は、その３０日の処理期間にわたり維持され、そして同 系の又は５ｃｉｄマウス内の細胞と反対のよってあった。この時間にわたり、注 射された胚芽細胞を含む繊維は、胎児ミオシン重鎮の損失及びその−供与体ハブ ロタイブ（ｈａｐｌｏｔＹＰｅ）のＨ−２により証明されるように、シクロスポ リン処理終了後２週間口に、有意な繊維の損失及び免疫細胞、主に細胞毒性Ｔ− 細胞による筋肉の浸潤が観察された。５週間口において、供与体含有繊維は、は とんとなくなった。これらの結果は、注射された胚芽細胞が前現存筋肉繊維中に 融合するので、過渡的な免疫抑制が初期の破壊の間に健康な筋肉を標的とすると いうことを示している。胚芽細胞の転移にわたり、筋肉前駆体細胞が拒絶の標的 になるというさらなる証拠が、組換えヒト・インターフェロン−ガンマ（ｒ−Ｈ −ＩＦＮ−γ）による研究において得られた。これらの研究において、我々は、 ｒ−Ｈ−［ＦＮ−γによる処理後のＭＨＣ抗原の発現を見つけた。ＦＡＣＳ貯蔵 ヒ貯蔵ヒト筋合細胞ンビトロにおいてｒ−Ｈ−ＩＦＮ−γにより処理し、そして ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＱ、及びＤＰの表面発現を、フロー・サトメーター及びＰＣＨ により分析した。全てのＭＨＣクラス目分子分子−Ｈ−ＩＦＮ−γにより誘導さ れることが示された。これらの結果は、ヒト筋芽細胞が、移植片拒絶の経過にお いて発現されるインターフェロン−γ、サイトカインにより刺激されるとき、高 いレベルのＭＨＣＨＣクラス抗原を発現することができるということを示してい る。

注射された同種筋芽細胞の研究と関連して、他の発見（Ｍｏｎｔｅｇａｚｚａ　 ｅｔ　ａｌ、、　（１９９１）　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　４１：１１２８ −１１３２）は、ヒト筋肉失調の細胞治療における同種筋芽細胞の使用が、他の 細胞及び臓器の移植と同様に、患者の免疫抑制又は耐性（ｔｏｌｅｒｉｚａｔｉ ｏｎ）の幾つかの形態のいずれかのマツチングを必要とすることを示した。ある いは、胚芽細胞は、それらが免疫監視を逃れるように遺伝子操作されることがて きる。

Ｅ、　筋肉損傷部位への注射された胚芽細胞の標的転移の証拠本目的のために、 ヒト筋芽細胞を、ＬａｃＺをコードしている複製欠陥レトロウィルス・ベクター （ＢＡＧ及びα−５ＧＣ）を使用して遺伝子操作し、そして続いてｍｄｘ／５ｃ ｉｄマウス宿主の筋肉細胞中に注射した。

ネズミ筋ジストロフィー（ｍｕｒｉｎｅ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｄｙｓｔｒｏｐｈ ｙ（ｍａｒい及び重症複合免疫不全症（ｓｅｖｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｉｍ ｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ｓｃｉｄ））の突然変異のためのマウス倍加ホ モ接合を、これらの実験のために特に作り、ヒトの遺伝的筋肉変性失調、デュシ エーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びＢｅｃｋｅｒ筋ジストロフィー（ＢＭＤ ）の治療においてヒト筋芽細胞をテストするための便利な宿主を提供した。これ らのマウスにおける筋障害（ｍｙｏｐａｔｈｙ）は、多数の異なる筋肉内で発達 する変性の病巣を特徴とする。筋肉細胞をジストロフィー筋肉中に導入するため の変動を評価し、そしてその条件を最適化するために、ジストロフィー・マウス 筋肉中への注射後の個々のマウス筋肉の運命を、β−ガラクトシダーゼの発現に より監視した。

主要なヒト筋芽細胞を、Ｈａｍ’ｓ　ＦＩＯ、すなわち、１０％ウシ胎児血清、 ５％所定添加ウシ血清、０．５％ニワトリ胚油抽出液硫酸ストレプトマイシン（ ２００μｇ／ｍｌ）及びペニシリンＧ（２００単位／ｍｌ）中で、増殖させた。

複製筋芽細胞として細胞を維持するために、その細胞を、それらが６０〜７０％ 集密に達しそしてｌ：４希釈において再ブレーティングされた後に、トリプシン 処理する。

ヒト筋芽細胞を、レトロウィルス生産細胞からの上澄を集めることによりＢＡＧ 及びα−レトロウィルスのどちらかで遺伝子操作する。

生産細胞を、高グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ修飾Ｅａｇｌｅ培地及び１０ ％ウシ血清中で培養した。ヒト筋芽細胞のレトロウィルス感染における使用のた めの上澄を得るために、この生産細胞を、２　ｘ　１０＠／１００ｍｍ皿におい てブレーティングする。翌日、この培地を、１０ｍ１の新たな培地で置き換える 。２４時間後、この培地を収穫し、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、そ して８μｇ／ｍｌのポリブレンを添加する。この培地を、２０〜３０％集密であ るヒト筋芽細胞の集落上に入れる。この感染を、３７°Ｃて１０％ＣＯ２で一夜 、行う。ウィルス粒子を含む培地を、吸引し、そしてその培養物を、新たな筋芽 細胞培養基で飼養する。

この細胞を、そのレトロウィルス構築物によりコードされている問題の遺伝子の 発現について検定する前最低４８時間にわたり培養する。

またネオマイシン耐性遺伝子がレトロウィルス構築物（例えば、ＢＡＧ）により コードされている場合には、筋芽細胞を、耐性コロニー形成まで、２００〜４０ ０μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を含む培養基に移す。次に、この筋芽細胞を、筋形成で あるが繊維芽性でない細胞タイプ上に存在する細胞表面蛋白Ｎ−ＣＡＭに対する 抗体で標識し、そして蛍光活性化セル・ソーターを使用して９５％まで濃縮する 。

筋芽細胞を、筋肉組織中に注射し、そして注射の部位を、細胞懸濁液中の活性炭 の含みによりマークする。注射後２〜３．５週間口に、脚を集め、連続切片とし 、そして異なる筋肉内のβ−ガラクトシダーゼ標識細胞について分析する。遺伝 子マークされた筋芽細胞の位置を同定するために、その組織を、低倍率において 明るい視野により、そして次に、Ｘ−ｇａｌ基質によるβ−ガラクトシダーゼに より提供された青色染色について高倍率においてＮｏｍａｒｓｋｉ３！１１微鏡 により、検査した。

１０ｍｄｘ／５ｃｉｄ脚内のヒト筋芽細胞の転移を、以下のように要約する。

１０の脚の中の９つが、胸当たりに数が２〜１５から変動しながら、変性病巣を 含んでいた。β−ガラクトシダーゼ発現細胞は、注射の部位においてか又は変性 病巣内にいずれかにおいて見つかった。１つの肺内の５８％と同じくらい多い病 巣が、β−ガラクトシダーゼ標識細胞を含んでいた。全ての標識病巣の５０％が 、その脚の反対側上にあった。これに対して、筋肉変性を全くもたない対照５ｃ ｉｄ／５ａｉｄ動物においては、標識筋芽細胞は、注射の部位においてのみ見つ かった。

Ｆ、　遺伝子操作された筋芽細胞の筋肉組織中への注射による、循環筋芽細胞が 、その循環に非筋肉遺伝子生成物を配達することができるかどうかを調査するた めに、我々は、研究のためにｈＧＨを選んだ。高感度検定は、マウスとヒトのホ ルモンを区別し、そしてｈＧＨは、血清中で４分間の短い半減期をもっており、 これは、時間にわたる、循環への連続した生産、分泌、及びアクセスについての ストリンジェントなテストを提供する。筋芽細胞中へｈＧＨ遺伝子を導入するた めに、ＭＦＧレトロウィルス・ベクターを使用した。このアプローチによるＤＮ Ａの筋芽細胞への安定した導入の効率は、プラスミドの安定なトランスフェクシ ョンによるよりも、少なくとも３オーダー大きなものである。他のベクター、α ＳＧＣを、β−ガラクトシダーゼをコードしている大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の Ｚ遺伝子（β−ｇａｌ）を上記と同一の筋芽細胞に導入するために使用し、移植 された細胞の数及び位置の独立した細胞内マーカーを提供した。組換えＭＦＧ及 びα−３ＧＣウイルスを、マウス及びヒト細胞の感染を可能にする、両宿主レン ジをもつ非コンピテント・レトロウィルスの複製を作り出す曹ＣＲ１Ｐ系内で作 った。二〇Ｃ２Ｄ１２マウス筋形成系の細胞を、ＭＦＧとα−３ＧＣとの混合物 で、２４時間以内に２回感染させ、筋芽細胞ブールＡを作り出した。ＭＦＧ感染 の効率は高かった二ランダムに選ばれたクローンの１４の中の１３（９３％）が 、ｈＧＨを発現し、そして分泌した。このプールについての分泌の平均速度は、 ４０００１ｇ／１０　’細胞７日であり、今まで記載されたインビトロにおける 組換えｈＧＨの分泌における最も効率的な細胞タイプの速度と同等であった。

いくつかのしｌ・ロウイルス・ベクターが、細胞分化又は移植後に発現が停止し たので、我々は、形質導入された筋芽細胞がインビトロにおける節管形成の間に ｈＧＨを分泌し続けるかどうか調査した。

幾つかの判定基準により、ｈＧＨ発現筋芽細胞が分化した。この細胞は、融合し 、多核節管を形成した。ノーザン分析は、筋肉α−アクチン、ミオシン重鎖、及 びミオシン軽鎖についての転写における典型的な増加を現した。分化は、分泌に 先立ちｈＧ）ｌが集積するところのゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ　ａｐｐａｒａｔｕｓ ）の位置における変更を伴っており：筋芽細胞内では、それは、極（ｐｏｌａｒ ）にあり、そして筋骨内では、それは、特徴的に核周辺（ｃｉｒｃｕｍｎｕｃｌ ｅａｒ）にあった。分化状態におけるこれらの変更にもかかわらず、このｈＧＨ 分泌速度は変わらなかった。したがって、筋肉は、一般的には分泌組織ではない と考えられているけれとも、増殖筋芽細胞と分化筋芽細胞との両方が、その培養 基中にｈＧＩ（を分泌することができる。

形質導入された筋芽細胞がインビトロにおいて効果的にｈＧＨを配達することが できるかどうかについて決定するために、筋芽細胞の単一コロニーを１２匹のマ ウスの後肢に注射した、我々は、クローン６を選んだ。なぜなら、それが、ｈＧ ）Ｉの最も高い生産者であり、そしてそれが、注射された細胞の運命が組織化学 的により、そして以下に記載するように組織のβ−ｇａｌ活性の検定により監視 されることを許容するβ−ｇａｌをも発現するからである。それぞれの所定の時 間点において、血１ｒｔｈＧＨをＲＩＡにより検定した。最初の減少後、血清の ｈＧＨレベルは、プラトーとなり、そして３５日間約０．５ｎｇ／ｍｌにおいて 残存した。このレベルは、注射されていないか又はβ−ｇａｌのみを発現する細 胞を注射されたかのいずれかである対照動物のものを有意に超えた。実験の第ニ ジリーズにおいては、プールＡと名付けた、形質導入された筋芽細胞の混合集団 を、クローン分析により選択されていない細胞か循環にｈＧＨを効果的に配達す ることができるかどうか決定するために、マウス後肢に注射した。２４匹のマウ スのそれぞれに、１０”の筋芽細胞を注射し、そして時間にわたり監視した。

この結果は、クローン６により得られたものと同様であり：Ｒ初の減少の後、ｈ ＧＨのレベルは、３０日間の期間にわたり１．　Ｏｎｇ／ｍｌにおいて血清中に 残存した。これらの結果は、ＭＦＧレトロウィルスによりコードされているｉＧ Ｈが連続して作られ、そしてインビトロにおいて筋肉組織内に移植された筋芽細 胞により分泌されることができるということを示している。

移植された細胞の運命を監視するために、我々は、高感度のβ−ｇａｌの蛍光形 成検定（Ｒｏｅｄｅｒｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ、　１９９１）　、すなわち、分泌蛋白ｈＧＨ の発現から独立したマーカーを使用した。β−ｇａｌ活性を、注射された筋肉に ついて検定し、そして培養液中で形質導入された筋芽細胞の既知数と比較した。

表 実験　筋芽細胞移植　血清　推定細胞数後の時間（日間’）　ｈＧＨネ　＋ （ｎｇ／ｍｌ）　（ｘ　１０　＠） プールＡ　１２　１．１±０．５　２．８±０．３３０　１．０±０．６　３． ５±０．５クローン６　１４　０．８±０．４　５．７±１．５３５　０、４± ０．１　４．０±１．１表の説明、β−ｇａｌ活性は、血清ｈＧＨと相関があり 、そして細胞数の推定を提供する。

本血清ｈＧＨ（平均上標準誤差）を、以下のように検定した：ｈＧＨ分泌を、固 相２一部位ラジオイムノアッセイ（Ｎｉｃｈｏｌｓ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｉ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｓａｎ　Ｊｕａｎ　Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ、　Ｃａ１ｉｆ ｏｒｎｉａ）により検定した。上澄を、２４時間のインキュベーション後に集め 、２０倍に希釈し、そして２連で検定した。標準曲線を、上記製造者により供給 された精製ｈＧＨ標準により作成し、そして２階多項式補間を使用して引いた。

十細胞数を、高感度の蛍光検定β−ｇａｌを使用して、β−ｇａｌの作用として 推定した。ここでは、この非蛍光基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガ ラクトシダーゼ（ＭＵＧ）を、β−ガラクトシダーゼにより特異的に解裂させ、 高い蛍光性の生成物、４−メチル・ウンベリフェロン（４−ｍｅｔｈｙｌ　ｕｍ ｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）を作り出す。標準曲線を、既知数の形質導入細胞細胞 （クローン６又はプールＡのどちらか）から作成し、そして細胞数（平均値上標 準誤差）を、注射された筋肉内のβ−ｇａｌ活性から推定した。

２５の同じくらいすくないしａｃＺ形質導入細胞を、検出することができた。全 ての検定を、２連で実施した。筋肉組織の抽出物を、プロチーアゼ阻害剤（９０ μｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ　、０．２単位／ｍｌアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ）　、０．１ｍＭ　ロイペプチン）を含むＯ，ＩＭ　リン酸ナトリウムｐＨ７， ０中での音波破砕（４℃における５　Ｘ　１０秒のパルス）により調製した。ｌ Ｏ〜２０μｇの蛋白を含む組織抽出物の一部を、Ｏ，ＩＭ　リン酸ナトリウムｐ Ｈ７，０、０，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，ＩＭ　β−メルカプトエタ ノール中で、１００〜１０００倍に希釈した。基質（ＭＵＧ：　Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＩＪＯ）を、０．６６ｍＭ の最終濃度まで添加した。室温において３０分後、この反応を、１２０ｍＭグリ シン、６　ｍＭ　ＥＤＴＡの最終濃度までグリシン−ＥＤＴＡ　ｐＨ１１，２を 添加することにより終了させ、そしてβ−ｇａＩ活性により生じた蛍光を、３５ ５　ｎｍ励起及び４６０ｎｍ放出波長を使用してＦｌｕｏｒｏｓｋａｎマイクロ タイター・プレート・リーダー（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ）内で測定した。非注射動 物からの対照組織サンプルは、終始一貫して、注射動物の検定の少なくとも３０ 倍下方にあった。

この外挿は、正確ではない。なぜなら、インビボ及びインビトロにおけるβ−ｇ ａｌの発現は類似していると推定されるからであり、クローン化筋芽細胞による 実験及び筋芽細胞のプールによる実験の両方において、０．５〜１．Ｏｎｇ／ｍ ｌのｈＧＨを血清に配達するのに必要な細胞の推定数が約４　Ｘ　１０”であっ たことは注目に値する。表中に示すように、プール及びクローンの両方について 、β−ｇａｌ活性の相対レベルは、異なる時間点において血清ｈＧＨについての 値と平行であった。これらの結果は、いずれかの与えられた時間における血清中 にｈＧＨ１１度が、主に、移植された細胞数により決定されている組織の形態を 、筋芽細胞移植後の時間点における単一クローン又はプールのどちらかからの筋 芽細胞を注射した後肢内のβ−ｇａ１分散の組織化学的分析により分析した。多 くのβ−ｇａｌ標識繊維は、その周囲組織に関して典型的な比較的大きな直径を もっており、移植された細胞が前現存筋芽細胞に融合し、そして寄与することを 示唆している。また、互いに融合した移植細胞から生じているような小さな直径 の繊維も観察される。いくつかの標識繊維は再−生産筋肉に関して典型的な中心 に位置する核をもっているけれども、一般的に、個々の繊維の形態及び全体とし ての組織の構造は、ｈＧＨの安定Ｃ２Ｃｌ２細胞系の注射された筋芽細胞は、マ ウス中に移植された後３つの運命をもっているようである：あるものは失われ、 あるものは繊維に組み込まれ、そしであるものは増殖する。最後の時間点、すな わち、筋芽細胞注射後５６及び８５日目において分析された４匹のマウスは、そ れぞれ５．８±２，６及び１６．１±１０．　ｌ　ｏｇ／ｍｌの増加した血清ｈ Ｇ）Ｉレベルを、そして豊富な単核筋芽細胞クラスターをもっていた。増殖は永 久Ｃ２Ｃｌ２マウス筋形成細胞系の特徴であるようであり１、このことは、移植 後数カ月間は明らかであり；これは、初代マウス又は初代ヒト筋芽細胞がマウス に移植された後、数週間は観察されなかった。

本実験は、筋芽細胞が、分泌組換え遺伝子生成物の長期間配達のための有効な媒 介物であることを支持している。注射された遺伝子操作された筋芽細胞は、この 目的のためには有利である、なぜなら、それらは、成熟した筋肉繊維と融合する ことができ、そしてインビボにおいて多核の異核共存体を形成することができる からである。

内因性の構造の組み込み部分のように、これらの注射された細胞は、広範囲の転 写及び翻訳の装置へのアクセスをもち、循環に接しており、そして神経活動によ り維持されている。したがって、移植された筋芽細胞は、保持されるだけでなく 、育成されている。

筋芽細胞が残存することは、それらのｈＧＨの分泌だけによらずβ−ｇａｌ活性 に基づく細胞数の測定によっても証明される。この発見は、その中で循環蛋白が 検出されなくなるような他の細胞タイプを使用した組換え遺伝子配達の殆どの研 究に対して著しい対比にある。

組換え遺伝子配達のいくつかの場合において、循環蛋白を欠くことの根拠：ベク ター発現の消滅、抗体の蛋白分解、循環へのアクセスの欠如、又は移植拒絶、を 決定したのだけれども、他の場合においては、それはなかった。移植細胞の運命 を評価するために本明細書中に表した二重標識法は、他のものにより、注射され た細胞の数、位置、及び形態が治療的遺伝子生成物の発現と独立して監視される ことを可能にすることにより、使用された定量的ＰＣＲを補足する。

要約 以上の結果から明らかなことは、本発明か、筋肉組織と関連する疾患の治療にお ける筋肉形成細胞の使用を、又は宿主内での可溶性又は他の蛋白の生産を、可能 にするということである。本筋芽細胞は、新たな筋肉組織を形成することができ 、又は繊維の形成に参加することができ、ここでは、細胞は、有用な性質を提供 し、欠陥等を直すことができる。さらに、細胞をマーカーにより修飾し、天然に 存在する細胞に対する形質導入細胞の選択有利性を可能にする。

筋芽細胞が損傷部位中に又は隣接組織に注射されることができ、又は血液流れ中 に、特にその損傷部位に供給しそしてこのような部位から上流の血管中に導入さ れることができる場合に、筋芽細胞が、損傷組織から比較的遠くに転移すること が今発見された。上記の結果は、筋芽細胞が損傷部位に”帰巣（ｈｏｍｅ）“す ることを示しており、このことは、修復のために筋芽細胞が損傷部位に送られる ための特異的な機能を示している。さらに、患者を治療するとき、生来の又は外 来の因子、例えば、成長因子、化学親和体（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｓ ）等の治療的な量を提供するために、本筋芽細胞を修飾し、表面膜、細胞癒着分 子、ＭＭＣ抗原等の発現又は利用性を増加又は減少させることができる。

本明細書中で引用した全ての刊行物及び特許出願を、あたかもそれぞれの個々の 刊行物又は特許出願が引用により特異的に且つ個々に取り込まれるということを 示すように、引用により本明細書中に取り込む。

以上に述べた発明を、理解の明瞭さを目的として説明及び例によりいくぶん詳細 に記載したが、添付の請求の範囲の範囲の核心から外れることなく本発明に特定 の変更及び修正を行うことができるということは、本発明の技術の視点において いわゆる当業者には容易に明らかになるであろう。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成６年２月ユ１日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．筋芽細胞又はそれらの子孫を含んで成る哺乳類宿主内の哺乳類筋肉組織であ って、この筋芽細胞が、培養において成長し、そして精製され、そしてその培養 物からその筋肉組織中へのこの筋芽細胞の導入の結果として存在している筋肉組 織。
2. ２．前記の筋芽細胞又はそれらの子孫が、前記組織の１以上の部位において導入 され、そしてこの筋芽細胞又はそれらの子孫が、この導入の部位から離れた部位 において存在している、請求項１に記載の哺乳類の筋肉組織。
3. ３．前記の細胞が、少なくとも実質的に血清を含まない培養基中での培養におい て成長する、請求項１に記載の哺乳類の筋肉組織。
4. ４．前記の筋芽細胞が、ＤＮＡ構築物のその筋芽細胞中へのインビトロにおける 導入の結果としてのＤＮＡ構築物を含んで成る、請求項２に記載の哺乳類の筋肉 組織。
5. ５．前記の筋芽細胞が、ＤＮＡ構築物のその筋芽細胞中へのインビトロにおける 導入の結果としてのＤＮＡ構築物を含んで成る、請求項１に記載の哺乳類の筋肉 組織。
6. ６．前記の構築物が、筋芽細胞のゲノム中への組み込みに基づき、又は筋芽細胞 の組み込み及び分化に基づき、筋芽細胞内で発現される遺伝子を含んで成る、請 求項５に記載の哺乳類の筋肉組織。
7. ７．インビトロにおける構築物の合成及びその構築物の筋芽細胞のゲノムへの組 み込みの結果としてのＤＮＡ構築物を含んで成る非−新形成の哺乳類の筋芽細胞 又は筋管であって、この構築物を含んで成る筋芽細胞が、正常な野性型の筋芽細 胞から生じ、そしてこの筋芽細胞が、約５〜６０集団倍加の、生きた若しくは凍 結した組織又はクローン培養物から得られ、そして増殖及び筋管形成の能力をも っているような、筋芽細胞又は筋管。
8. ８．前記の構築物が、トランスフェクションにより筋芽細胞に導入されている、 請求項７に記載の筋芽細胞又は筋管。
9. ９．前記の構築物が、感染により筋芽細胞に導入されている、請求項７に記載の 筋芽細胞又は筋管。
10. １０．前記の感染が、複製−欠陥レトロウイルスによるものである、請求項９に 記載の筋芽細胞又は筋管。
11. １１．前記の構築物が、筋芽細胞及び／又は筋管内で発現することができる遺伝 子を含んで成り、そしてこの遺伝子が、この筋芽細胞及び／又は筋管内で発現し ている、請求項７に記載の筋芽細胞又は筋管。
12. １２．前記の遺伝子が、ホルモンをコードしている、請求項１１に記載の筋芽細 胞又は筋管。
13. １３．前記のホルモンが、ヒト成長ホルモンである、請求項１２に記載の筋芽細 胞又は筋管。
14. １４．前記の遺伝子が、ジストロフィンをコードしている、請求項１１に記載の 筋芽細胞又は筋管。
15. １５．前記の筋芽細胞が、成人の筋芽細胞である、請求項７に記載の筋芽細胞。
16. １６．筋肉組織内の筋芽細胞及び筋管内で転写を行うことができる問題のＤＮＡ 構築物によりそのゲノムを修飾する方法であって：その筋肉組織を、このＤＮＡ 構築物を含んで成る複製欠陥ウイルスと接触させ、これにより、このウイルスが そのＤＮＡ構築物によりその筋芽細胞を形質転換させるような方法。
17. １７．前記のウイルスが、レトロウイルスである、請求項１６に記載の方法。
18. １８．筋肉組織の遺伝的能力を変更する方法であって：損傷筋肉組織中に、萌芽 細胞であってその筋肉組織とはゲノムとして異なっているものを注射し；これに より、その筋芽細胞がその組織中に組み込まれる、ことを含んで成る方法。
19. １９．前記の筋芽細胞が、ＤＮＡ構築物により形質転換されている、請求項１８ に記載の方法。
20. ２０．筋芽細胞のゲノム中へのＤＮＡ構築物の組み込みの結果としての、減少さ れたレベルのＨＬＡ発現をもつヒト筋芽細胞。