SE526490C2 - Hematopoietisk differentiering av humana embryonala stamceller - Google Patents

Description

526 490 härstamningar. Dessa celler kan inkludera, men är inte begränsat till, hematopoietiska stamceller.

Hematopoietiska stamcellspopulationer har isolerats direkt från benmärg. Se C. Baum et al. 89.PNAS USA 2804-2808 (1992). Detta förlitar sig emellertid på en tillgång pá benmärg för att erhålla cellerna.

Det har också gjorts försök att styra murina embryonala cellpopulationer mot hematopoietiska celler. Se t.ex. U.S. patent 5,914,268; G. Keller, 7 Current Opinion ln Cell Biology, 862-869 (1995); och T. Nakano et al. 265 Science 1098-1101 (1994). Se också M. Weiss, 11 Aplastic Anemia And Stem Cell Biology, 1185-1195 (1997); och S. Morrison et al., 11 Annu. Rev. Cell Dev.

Biol.,35-71 (1995).

Att tillämpa detta på primater har emellertid visat sig vara svårt. T.ex. i F. Li et al., 92 Blood 368a (1998) var det en diskussion om tekniker för differentiering av rhesus embryonala stamcellslinjer användande en stromal cellinje och exogena cytokiner. Emellertid har denna grupp mer nyligen rapporterat att deras tekniker gav inadekvat bildning av kolonier.

Behandlingen av olika sjukdomar med vävnadstransplantation har blivit rutin.

Emellertid kan det vara en kö för att erhålla naturliga donerade organ, celler, eller vävnader. Även när det naturliga givarmaterialet har blivit tillgängligt är det ofta problem med avstötning. Traditionella sätt för att nedtrycka ett immunsvar hos mottagaren har nackdelar. T.ex. är immunsuppresiva läkemedel efte dyra och her bieffekter. i I WO 98/07841 diskuterades tekniker för att erhålla embryonala stamceller vilka är MHC-kompatibla med en utvald givare (t.ex. att transplantera en givarcellkärna i en avkärnad oocyt, följt av bildandet av stamcellerna därifrån). Ansökningen föreslog att de resulterande cellerna kunde användas 526 490 ~ Q I Q o u . , . ._ för att erhålla MHC-kompatibla hematopoietiska stamceller för användning i medicinsk behandling som erfordrar benmärgstransplantationer.

Emellertid inbegriper en del sjukdomar såsom typ 1 diabetes mellitus eller multipel skleros en autoimmun reaktion. Att, tex., bara transplantera pankreatiska öceller (vilka är MHC-kompatibla med den sjuka individen) för att ersätta förstörda pankreatiska öceller kommer inte att ge tillräcklig reducering på lång sikt i typ 1 diabetes mellitus, eftersom immunsystemet hos värden fortfarande kommer att attackera de transplanterade öcellerna.

Därigenom kan man se att ett behov existerar för tekniker som får humana embryonalstamcellskulturer att differentiera till önskade hematopoietiska kolonier. Vidare är det önskvärt att utveckla förbättrade användningar av hematopoietiska celler.

KORT SAMMANFATTNING AV UPPFlNNlNGEN En aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahåller en metod för att erhålla humana hematopoietiska celler. Genom att utsätta en human embryonal stamcellskultur för mammala hematopoietiska stromalceller så att det därigenom bildas humana hematopoietiska celler. Åtminstone en del av de humana hematopoietiska cellema som så bildas är CD34* och/eller är förmögna att bilda hematopoietiska cellkoloni-bildande enheter i metylcellulosakultur.

CD34 är en standardmarkör för hematopoietiska stamceller, såsom beskrivits l C. Baum et al. 89 PNAS USA 2804-2808 (1992) och S. Morrison et al., 11 Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 35-71 (1995). Förmågan att bilda en Kolonibildande enhet är en egenskap som är indikativ på att cellema har de önskade egenskaperna att bilda mer differentierade hematopoietiska härstamningar. , 526 490 De stromala cellerna är företrädesvis härledda från benmärgsceller eller embryonala gulesäcksceller. Murina stromalceller kan användas för detta syfte. Emellertid skall även primatstromal- och andra mammalstromalceller vara lämpliga. l en annan aspekt av uppfinningen tillhandahålls en human hematopoietisk cell som var härledd från en human embryonal stamcellskultur in vitro, och är förmögen att bilda hematopoietiska cellkolonibildande enheter i metylcellulosakultur. Termen "härledd" som används i detta patent är avsedd att betyda erhållen direkt eller indirekt (t.ex. genom en eller flera lntermediärer eller passager). l ytterligare en annan aspekt tillhandahåller uppfinningen en metod för att transplantera humant cellulärt material in i en human mottagarvärd. Humana hematopoietiska celler erhålls vilka har blivit härledda Ligg från en embryonal stamcellskultur. Ett urvalt humant cellulärt material annat en hematopoietiska celler erhålls då, det urvalda icke hematopoietiska materialet som har ”major histocompatibility complex"-kompatibi|itet till hematopoietiska celler. Därefter transplanteras både de hematopoietiska cellerna och urvalt humant icke hematopoietiskt cellulärt material in i den humana värden.

T.ex. kan man erhålla humana hematopoietiska celler som har blivit härledda in_vit¿q från en embryonal stamcellskultur (t.ex. genom användning av Äfï* 25 tekniken som beskrivs nedan). Man erhåller också humana pankreatiska öceller som har MHC-kompatibilitet till hematopoietiska celler. Både de 'ff hematopoietiska cellerna och de pankreatiska öcellema transplanteras sedan ° in i den humana värden (företrädesvis efter att mottagarens egen benmärg har inaktiverats).

De pankreatiska öcellerna kan erhållas direkt från en givare vilkens celler __ användes för att bilda den embryonala stamcellskulturen. Alternativt kan en 526 490 enkel embryonal stamcellskultur differentieras utmed två olika banor. l en process kan tekniken ovan användas för att bilda hematopoietiska stamceller. Dessa celler skall utvecklas till multipla hematopoietiska härstamningar när de transplanteras in i lämpliga värdar. Dessa härstamningar skall inkludera lymfocyter vilka skall vara toleranta mot andra celler som härletts från samma parentala embryonala stamceller. l en annan process kan stamcellerna ledas mot att bli pankreatiska öceller.

I ett ytterligare exempel kan man ge oligodendrocyter till en människa som har ett tillstånd av multipel skleros. Man erhåller humana hematopoietiska celler som har härletts in vitro från en embryonal stamcellskultur (t.ex. genom att använda en teknik som beskrivs nedan). Man erhåller också humana oligodendrocyter som har MHC-kompatibilitet till benmärgsceller och transplanterar både benmärgscellerna och oligodendrccytema in i människan.

Samma människa vilkens genetiska material användes för att bilda de - embryonala stamcellerna kan bli givare för oligodendrocytema. Alternativt kan samma embryonala stamcellskultur differentieras utmed två separata banor för att ge de två transplanterbara materialen.

Med avseende på respektive sjukdom (och potentiella andra autoimmuna sjukdomar) skall det immuna och autoimmuna avstötningsproblemen reduceras med denna teknik. För detta ändamål kan mottagarens 1,522 25 ursprungliga benmärg helt eller delvis inaktiveras genom strålning eller pà ' kemisk väg före transplantationen. Därefter ersätts den åtminstone delvis av de transplanterade hematopoietiska cellerna. Elimineringen/reduceringen av den ursprungliga benmärgen reducerar kroppens förmåga att skapa ett autoimmunt svar. Passningen mellan MHC hos den ersatta benmärgen och det andra transplanterbara materialet försäkrar att det andra materialet inte avstöts av den transplanterade benmärgen. _ 526 490 .oo I O 0 0 0 . ' . ,.

Vidare kan samtransplantering av hematopoietiska celler och annan vävnad göras för att gynna accepterande av den andra våvnaden (t.ex. hjärtmuskel plus hematopoietiska celler för behandling av hjärtsjukdomar; hepatocyter plus hematopoietiska celler för behandling av leversjukdomar). Genom att bilda hematopoietiska kimerer kan förbättrat godtagande av vävnad med passning av liknande MHC-typer erhållas.

Föreliggande uppfinning är lämplig för att erhålla en mängd olika intressanta hematopoietiska celler, såsom erytroidceller, granulocytceller, macrofager, lymfocytprekursorer, monocyter, B-celler, T-celler och liknande. l detta avseende utvecklas kolonier av differentierade ES-celler till hematopoietiska kolonier när de skördas och separeras till enkla celler, och formad till lämplig kultur. Dessa kolonier visar på utvecklingen av Kolonibildande celler som växer till Kolonibildande enheter (inkluderande Kolonibildande enhet-erytroid (CFU-E), blastbildande enhet-erytroid (BFU-E), kolonibildande enhet- macrofag (CFU-M), kolonibildande enhet-granulocyt/macrofag (CFU-GM) och kolonibildande enhet-"high porliferative potential” (CFU-HPP)). ldentifleringen av kolonibildande celler indikerar på differentiering av embryonala stamceller till hematopoietiska celler förmögna att expandera till definierade hematopoietiska härstamningar under definierade förhållande.

Syftena med föreliggande uppfinning inkluderar därför: (a) Metoder av ovan slag för att erhålla hematopoietiska celler; (b) Celler härledda användande dessa metoder; och =_§:= 25 (c) Metoder för att använda sådana härledda celler för transplantation, z transfusion och andra syfte.

Dessa och ytterligare andra syften och fördelar av föreliggande uppfinning kommer att vara uppenbart från beskrivningen av föredragna utföringsformer som följer. Det är emellertid patentkraven som ska ses till för att bedöma 00:e: uppfinningens hela omfång. 0000 po .g I 0 0 0 U 0 0 00 0000 001 O l O o 0 A 0 0 to IOIO O! II 526 490 øuo 0 0 0 a ln DETALJERAD BESKRIVNING Embryonal stamcellskultur Den förut beskrivna human ES-cellinjen H1 användes för majoriteten av experiment, även om några av de följande studierna utfördes med den förut beskrivna ES-cellinjen H9 (eller H9.2) med liknande resultat. Dessa celler avlägsnades från frusna (flytande kväve) förråd av celler härledda från den ursprungligen isolerade och förökande cellinjen. H1 ES-cellerna odlades i sex brunnkulturplattor (Nunclon, Fisher).

Plattan täcktes först med O,1% gelatinlösning (Sigma) och fick vara en eller flera dagar i en 37°C/5% C02 inkubator. Efter nämnda en eller flera dagar, avlägsnades gelatinlösningen och brunnama hos plattan täcktes dämäst med bestrålade musembryonala fibroblastceller (MEF). MEF-celler härleddes från dag 12-13 musembyon i medium bestående av DMEM (GibcoBRL) med tillsatt 10% fetal bovinserum (Hyclone eller Harlan), 2 mM l-glutamin (GibcoBRL), och 100 enheter/ml. Penicillin, 100 mglml streptomycin (Sigma).

MEF-cellerna bestràlades med 5500 cGy från en cesiumkälla före placeringen i brunnama. MEF-cellerna tillsattes vid en densitet av 5x104 celler/ml, 2,5 ml/brunn. Plattan som är täckt med MEF-celler placerade sedan i 37°C/5% C02 inkubator i en eller flera dagar tills tillsatsen av ES-celler.

ES-celler tillfördes på nya MEF-celler med ungefärligen 5-8 dagars intervall.

Tiden berodde på celldensitet och morfologiskt utseende på differentleringen.

För tillsatts avlägsnades medlumet fràn en brunn med ES-celler och 1-2 ml av medium innehållande 1 mg/ml kollagenas IV i DMEM (GibcoBRL) tillsattes. Plattan placerade sedan vid 37°C/5% C02 i 5-20 minuter tills kolonierna av ES-celler började rundas upp.

Brunnen skrapades därefter med en 5 ml pipett för att lösgöra ES-cellerna från plattan. Innehållet av den skördade brunnen placerades i ett 15 ml 0 o 00 uno OI I CCI O I OI II OIOU I O II OQO! OI O c 0 00 o I O Oo 90 oc 0 c n 0 Q 0 I 0 o 0 0 n in 0000 00 526 490 c a I n u; koniskt rör (Fisher) och centrifugerades i en centrifug vid 1000 rpm i 5 minuter. Mediet avlägsnades och 10 ml av färskt medium tillsattes. Detta ES- cell medium består av F12/DMEM (GibcoBRL) med tillsatt 20%-igt serumsersåttningsmedium (GibcoBRL), 8 nglml av bFGF (GibcoBRL), 1% icke-essentiella aminosyralösning (GibcoBRL), 1 mM 1-giutamin (GibcoBRL), och 0,1 M ß-merkaptoetanol.

Cellema centrifugerades igen (5 min/1000 rpm), mediumet avlägsnades och återsuspenderades vid en koncentration av 2,5 ml av medium för varje (typiskt 15 ml medium för plätering in i 6 nya brunnar, detta är en 1:6 tillsatts).

Cellerna pipetterades sedan in i brunnarna av plattan vilka brunnar tidigare har täckts av MEF-celler såsom beskrivits ovan. Cellerna tillfördes jämnt in i varje brunn och plattan placerades i en inkubator vid 37°C/5% C02.

Vid tillfällen om det fanns kolonier av ES-celler som visade ett morfologiskt utseende av differentiering före celltillsatts, så avlägsnades dessa kolonier genom en försiktig skrapning med en dragen glaspipett. Detta gjordes genom observation genom ett dissektionsmikroskop. Efter avlägsnande av differentierade celler tillsattes återstående kolonier som ovan.

Efter tillsatts "matades" varje brunn med ES-celler med färskt medium i ett 24-48 timmars intervall. Hår avlägsnades mediumet i varje brunn och färskt ES-medium tillsattes. All matning och tillsatts av ES-celler gjordes i en steril miljö.

Differentiering av ES-celler För att gynna hematopoietisk differentiering av de humana ES-cellerna så Cellerna pläterades sedan i 6 brunnsplattor täckta med en mammal stromalcell. I ett experiment använde vi C166-celler som tidigare hade bestrålats med 2500 cGy. C166-cellerna hade ursprungligen erhållits från gulsåcken hos mus vid embryonal dag 12 och tillhandahölls storsint av Dr Robert Auerbach (UW-Madison). skördades ES~cellerna som ovan. 0000 000 526 490 I ett annat experiment användes S17-celler. De erhölls ursprungligen från musbenmärg och var storsint tillhandahàllna av Dr. Kenneth Dorshkind (då vid UC-Riverside, nu vid UCLA).

C166- eller S17-cellerna pläterades vid en densitet av 1x1O5 celler/ml, 2,5 ml/brunn. ES-cellerna pläterades antingen på S17- eller C166-cellema och fick sedan växa i ett medium bestående av DMEM (GibcoBRL) med tillsatt % fetalt bovinserum (Hyclone), 1% icke-essentiella aminosyralösning, 0,1 M ß-merkaptoetanol, och 1 mM 1-glutamin. Detta medium utbyttes i varje brunn vid ett 24-72 timmars intervall med färskt medium. Vid valet av ett lämpligt medium behöver man bara erhålla konventionella förhållanden för celltillväxt, även om man tillsätter de specifika stromalcellerna.

Efter 3-7 dagar från pläteringen på S17- eller C166-cellema började ES- cellema att visuellt synas differentierade så att de inte hade samma enhetliga utseende som de odifferentierade ES-cellema hållna på MEF-matarceller.

Kolonierna av ES-celler började att bilda multipelt olika celltyper. Några av dessa kolonier hade regioner som verkade bestå av celler med en kullerstensmorfologi vilket indikerar på kolonier av tidiga hematopoietiska stamfaderceller.

Bekräfta blodrelaterade celler En metod att bestämma närvaro av riktiga hematopoietiska celler är att analysera för hematopoietiskt Kolonibildande celler (CFCs) i ett halvfast metylcellulosainnehållande medium. Här tilläts ES-cellerna att differentiera på antingen C166- eller Sl7-celler i 2-3 veckor, hållna som beskrivits ovan.

Efter denna tid avlägsnades mediumet. 2,5 ml av kalcium- och magneslumfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tillsattes i 2-5 minuter, avlägsnades, och 1,5 ml av trypsin (O,125%)-EDTA (1mM) medium tillsattes.

I c nu agg nu n .g o a o a g o oo como one 1 0 0 IÛOII I I 000 OO n 526 490 Cellerna placerades sedan vid 37°C/5% C02 i 10 minuter. Efter denna tid började kolonierna att dela sig. Cellerna delades ytterligare genom pipettering och skrapande av brunnarna. Cellerna placerades i ett 15 ml koniskt rör, centrifugerades i 5 min/1000 rpm, medium avlägsnades och 10 ml färskt medium (DMEM + 10% FBS + 1-glutamin + pen/strep) tillsattes och centrifugerades igen. Cellerna suspenderades sedan i 5 ml medium och passerades genom ett 100 mM nytex-filter för att avlägsna klumpar av celler.

Filtret tvättades med ytterligare 5 ml medium. De deladelfiltrerade cellerna räknades sedan på en hemacytometer och 1x10° (vanligtvis, men inte alltid så många celler) celler placerades i ett nytt 15 ml koniskt rör. Dessa celler centrifugerades och medium avlägsnades och 5 ml medium bestående av IMDM (GibcoBRL) med tillsatt 2% fetalt bovinserum (Hyclone) tillsattes.

Cellema centrifugerades, medium avlägsnades och 250 pl medium (IMDM + 2% FBS) tillsattes. l enlighet med de specificerade testförhàllandena, tillsattes dessa celler till 2,5 ml av Methocult GF+H4435 medium (StemCell Technologies). Detta medium bestående av 1,0% metylcellulosa, med tillsatt 30% FBS, 20 ng/ml lL-3, 20 ng/ml lL-6, 50 ng/ml stamcellsfaktor, 3 enheter/ml erytropoietin, 20 ng/ml GM-CSF, 20 ng/ml G-CSF, 2 mM 1-glutamine, 0,1 mM ß- merkaptoetanol, 1 % bovint serumalbumin. Cellerna i vortexades sedan kraftfullt och sedan pläterades 1,1 ml av blandningen pà metylcellulosan en P35 plastplatta (StemCell Technologies), spreds jämnt pà plattan och placerades vid 37°C/5% C02.

Dublettplattor av varje prov pläterades typiskt med 4x1O5 celler/platta. Efter 14-21 dagar analyserades plattorna under ett mikroskop för närvaro av hematopoietiska kolonier. Kolonierna identifierades genom jämförelse i ett koloniatlas (StemCell Technologies) eller boken: Culture of Hematopoietic Cells, RI Freshney, IB Pragnell, MG Freshney, eds., Vlñley-Liss, Inc. 1994. 526 490 11 Kolonier identifierades som en av de följande: kolonibildande enhet-erytroid (CFU-E), blastbildande enhet-erytroid (BFU-E), Kolonibildande enhet- macrofag (CFU-M), Kolonibildande enhet-granulocyt/macrofag (CFU-GM) eller kolonibildande enhet-”high poliferative potential” (CFU-HPP).

Närvaron av önskade hematopoietiska celler kan också bekräftas genom flödescytometri. Man kan söka efter specifierade cellytantigen genom flödescytometri. Här skördades ES-celler differentierade på S17-celler eller C166-cel|er såsom beskrivits ovan i 14-21 dagar med trypsin/EDTA såsom beskrivits ovan och passerades genom ett 100 mM nytex-filter. De filtrerade cellerna räknades med en hemacytometer, alikvotterades sedan i 15x75 plaströr (Fisher) i ungefär 1x105 celler/rör. Cellerna centrifugerades, medium avlägsnades och 2-3 ml av FACS medium tillsattes. (FACS medium är PBS med 0,5% BSA (Sigma), 0,1% natriumazid (Sigma)).

Cellema centrifugerades igen och mediumet avlägsnades. Därefter tillsattes en antikropp som var direkt länkad till en fluorescerande markör (F lTC eller PE) till brunnama vid en koncentration såsom rekommenderats av leverantören. Celler har analyserats med följande antikroppar: CD34-FITC (lmmunotech), CD45-PE (Pharmingen). lgG1-FITC och lgG1-PE användes som isotopkontroller för icke specifik färgning av celler. Cellerna inkuberades med lämplig antikropp i ungefär 30 minuter på is, tvättades 1-2 gånger med 2-3 ml FACS medium och centrifugerades åter i ungefär 0,5 ml FACS medium. _ _ De antikroppmärkta cellema analyserades sedan med en FACScan (Becton Dickinson) som leverantören rekommenderade. Närvaron av döda celler bestämdesgenom tillsats av propidium iodide (1 mg/ml lösning, 5 pl tillsatt per rör) eller 7-AAD (Calbiochem) (0,2 mg/ml, 5 ul/rör). Mjukvara för analys var antingen PC Lysis eller Cellquest. 0 00000 526 490 I o 0 n to c c o o Q O o oo 12 De följande experimentella tekniker användes för att analysera antigensexpression genom immunhistokemi (IHC). Här skördades differentierade ES-celler som hade samodlats med antingen C166 eller S17 som ovan med trypsin/EDTA som ovan. Cellema återsuspenderades i medium innehållande DMEM med tillsatt 10% FBS vid en koncentration av ungefär 1x10“ - 1x105. ”Cytospin"-tillverkningar av dessa celler gjordes sedan genom att centrifugera 1x10° - 1x10“ celler på en glasskiva (Superfrost/plus, Fisher) med en Cytospin ll centrifug (Shanndon).

Dessa skivor fixerades sedan med kall aceton och lagrades frusna vid -20°C.

För IHC-färgning tinades skivoma vid rumstemperatur och cellpelleten urskiljdes med en vaxpenna (DAKO). Cellerna färgades sedan såsom följer med användande av Vectastain ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA), alla inkubationer gjordes vid rumstemperatur. 100-200 pl PBS tillsattes till cellema i 5 minuter och avlägsnades sedan. Vectastain blockerande antikroppslösning (hästserum) tillsattes sedan pä cellerna i 15 minuter.

Cellema torrblottades sedan och 100-200 pl av primär antikroppslösning tillsattes. De primära antikroppama var: lgG1 (1 pg/prov, Sigma), anti-CD34 (0,5 pglprov, lmmunotech), anti-CD45 (1 pg/prov, DAKO), anti-klass I (1 pg/prov, gåva från Dr. Paul Leibson, Mayo Clinic), anti-CD14 (1 ug/prov, Pharmingen), anti-CD31 (1 pg/prov, Pharmingen).

Primär antikropp tillsattes i 30 minuter följt av PBS i 10 minuter. Därefter tillsattes biotinylerade anti-lgG antikroppar (Vectastain kit, lösning B) i 30 minuter följt av PBS i 10 minuter. Därefter tillsattes Vectastain ABC-lösning i minuter vid rumstemperatur följt av PBS i 10 minuter. Därefter tillsattes DAB-lösning (Vectastain) i 5 minuter följt av tvätt under rinnande kranvatten i minuter. I några experiment motfärgades sedan skivorna med Gills hematoxylin-lösning (Vector labs) i 3 minuter följt av tvätt under rinnande kranvatten i 10 minuter. Skivorna fick sedan lufttorka. Celler som är färgningspositiva synes bruna. 526 490 Q ~ u q - a en o a a o o o o a o o o o ao 13 C034* påvisades i en blandad population av celler (ungefär 1%) efter 2-3 veckor. Ännu mer viktigt visades differentierade ES-celler att bildas till hematopoietiska kolonier när de skördades, separerades till celler och pläterades i metylcellulosa (halvfast) kulturer.

Transplantation Nuvarande hematopoietiska celltransplantationer utförs kliniskt för patienter som har mottagit höga doser av kemoterapi för behandling av maligniteter.

Dessa patienter mottager vanligen en heterogen blandning av hematopoietiska celler antingen från autologa eller allogena källor. Humana ES-härledda tillhandahålla en mer hematopoietiska stamceller kommer att åtminstone homogen cellpopulation för hematopoietisk celltransplantation.

Vidare kan, såsom diskuterats ovan, MHC-egenskapema hos transplantationen nu kontrolleras och därigenom möjliggöra behandling av autoimmuna sjukdomar. T.ex. kunde både hematopoietiska stamceller (HSCs) och en andra härstamning (t.ex. pankreatiska öceller för diabetes eller oligodendrocyter för multipel skleros) härledas fràn samma parentala ES-cellinje. Med båda härstamningarna tillgängliga kunde ett hematopoietiskt kimär först bildas genom att utföra ett fullt allogeniskt hematopoietiskt celltransplantat (HCT). Det erhållna tillståndet av kimerism skulle tillåta mottagarens immunsystem att ”se” det efterföljande transplantatet av den andra celltypen (t.ex. pankreatiska öceller eller oligodendrocyter) såsom "egna" och den skulle ej avstötas.

Lägg märke till att t.ex. oligodendrocyter har erhållits från mus ES-celler (O Brustle et al, 285 Science 754-6 (1999)), såsom cardiära muskelceller (M Klug et al, 98 J. Clin. Invest. 216-224 (1996)). 526 490 nu o o o o n Q o o u n ø o 0 nu 14 Denna metod för att bilda hemotopoietiska kimärer kan också gynna acceptans av vävnad transplanterad för andra anledningar än autoimmunitet. l detta avseende avstöter inte möss mottagande allogena hematopoietiska stamceller andra vävnader med samma genetiska bakgrund som de hematopoietiska cellerna, men kommer att fortfarande avstöta tredje parts transplantat. Se K. Gandy et al., 65 Transplantation 295-304 (1998).

I tillägg till djurstudier finns det nu kliniska fallrapporter av humana patienter som har tidigare erhàllit ett hematopoietiskt celltransplantat och senare krävande ett fast organ (njure) transplantat. Vid dessa tillfällen är g njurtransplantatet från samma person som har tidigare tillhandahållit benmårgstransplantatet accepterat utan ytterligare immunosuppresion. Se T.

Spitzer et al., 68 Transplantation 480-484 (1999).

Arbete i hundmodeller och mer nyligen i humana kliniska försök har visat att mildare icke-myelablativa förberedande förhållanden kan användas för att bättre förbereda värden för allogenisk HCT.

Här används bara måttliga doser av totalkroppsbestràlning och en kort behandling av immunosuppresion för att förbereda värdarna innan erhàllandet av allogeniska HCTs. Även om de föredragna utföringsformerna har beskrivits ovan så förstår fackmannen pà området att andra modifieringar kan göras inom omfånget av uppfinningen. T.ex. emedan tvâ specifika stromaltypceller har urvalts för användning sà är många andra också lämpliga. T.ex. är en allmänt tillgänglig stromalcellinje M2-10B4 cellinjen som har ATCC-designeringsnummer CRL- 1972.

Ytterligare emedan beskrivningen ovan fokuserar på bildandet av prekursorer för röda blodceller och benmärg så kan olika andra blodrelaterade celler av intresse erhållas i kvantitet genom att använda teknikerna ovan. Se också 526 490 Q Q 0 ø no c v US patent 5 914 268. Således hänvisas till patentkraven för att bedöma uppfinningens hela omfång.

Industriell tillämgbarhet uppfinningen tillhandahåller blodrelaterade celler användbara för transplantation, forskning och andra syften.

Claims (6)

10 15 20 25 526 490 16 PATENTKRAV

1. En metod för att erhålla humana hematopoietiska celler, innefattande att utsätta en human embryonal stamcellskultur för mammala hematopoietiska stromala celler i medium under konventionella förhållanden så att därigenom bilda humana hematopoietiska celler.

2. Metoden enligt krav 1, varvid åtminstone några av de humana hematopoietiska cellema som så bildas är CD34*.

3. Metoden enligt krav 1, varvid åtminstone några av de humana cellerna bildas bildar cellkolonibildande enheter i metylcellulosakultur. hematopoietiska som så hematopoietiska

4. Metoden enligt krav 1, varvid de stromala cellerna är urvalda från gruppen bestående av benmärgsceller och embryonala gulesäcksceller.

5. En metod för att erhålla humana hematopoietiska celler, innefattande exponerande av en human embryonal stamcellskultur in vitro för mammala hematopoietiska stromalceller så att det därigenom bildas humana hematopoietiska celler, varvid åtminstone några av de humana hematopoietiska cellema som så bildas bildar erytroidblastbildande enheter i metylcellulosakultur.

6. Metoden enligt krav 5, varvid cellkulturen har åtminstone några hematopoietiska celler som är CD34*.