WO2023199641A1 - 哺乳動物細胞凍結保存液 - Google Patents

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WO2023199641A1
WO2023199641A1 PCT/JP2023/008060 JP2023008060W WO2023199641A1 WO 2023199641 A1 WO2023199641 A1 WO 2023199641A1 JP 2023008060 W JP2023008060 W JP 2023008060W WO 2023199641 A1 WO2023199641 A1 WO 2023199641A1
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cells
cell
dextran
trehalose
thawing
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PCT/JP2023/008060
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English (en)
French (fr)
Inventor
益浩 西村
奈月 小森
Original Assignee
株式会社大塚製薬工場
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention provides a mammalian cell cryopreservation solution (hereinafter referred to as “the present cryopreservation solution”) containing 2.5 to 8.75 (v/v)% propylene glycol (hereinafter sometimes referred to as "PG"). ), a method for cryopreserving mammalian cells (hereinafter sometimes referred to as “the cryopreservation method”), etc., which includes the step (a) of cryopreserving the cryopreservation solution containing mammalian cells. Regarding.
  • Cryopreservation of cells has been widely used as an essential technique in cell biology research.
  • cell cryopreservation technology has been used not only for the preservation of various cell lines in cell banks around the world, but also for the preservation of seeds in the livestock industry, the cryopreservation of sperm, eggs, or fertilized eggs for increasing livestock production, It is applied to cryopreservation of germ cells in reproductive medicine.
  • Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells), have unlimited proliferation ability and multipotency into various tissue cells. It is a cell. Human pluripotent stem cells are expected to be applied to regenerative medicine by utilizing their properties, and in order to realize this, high-quality cell freezing technology, that is, high cell survival rate and undifferentiated state after thawing, is required. It is essential to establish a cell freezing technology that guarantees this.
  • Cell cryopreservation methods are generally divided into slow freezing methods and quick freezing methods (vitrification methods).
  • the slow freezing method uses a cryopreservation solution containing glycerin, dimethyl sulfoxide (hereinafter sometimes referred to as "DMSO"), keratin hydrolyzate, hydrolyzed gelatin, serum, serum albumin, etc. as a cryoprotectant (Patent Documents 1 to 5). ) in which cells are suspended and gradually frozen by lowering the temperature to about 1°C per minute.
  • Slow cooling replaces intracellular water molecules with the cryoprotectant and dehydrates the cells, suppressing the growth of ice crystals inside and around the cells, causing damage to cell membranes and intracellular structures, and denaturation and denaturation of proteins.
  • Non-Patent Document 1 Prevents cutting (Non-Patent Document 1).
  • general cells can be cryopreserved using Styrofoam boxes or commercially available cell freezing boxes, without the need to use a programmed freezer to tightly control the temperature.
  • slow freezing can be achieved by using Since such a method is simple, it is also called a simple slow freezing method, and is widely used in laboratories, cell banks, and the like.
  • the vitrification method is a method of freezing cells into a glass-like state by rapid cooling in order to suppress the formation of ice crystals inside and outside cells due to freezing.
  • the vitrification method was first reported in 1937 and took a long time to develop until it was put to practical use, but in 1985 it was developed using highly concentrated DMSO, acetamide, PG, and polyethylene glycol (hereinafter referred to as "PEG").
  • PEG polyethylene glycol
  • a method using a vitrification preservation solution containing a cryoprotectant was developed. The development of this method has made it possible to cryopreserve early mouse embryos, as well as cow and pig embryos, which was difficult to do using slow freezing methods.
  • the vitrification method is used in many institutions including embryo banks.
  • Non-Patent Document 3 when human ES cells and iPS cells are suspended in cryopreservation solution (STEM-CELLBANKER [manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.]) and cryopreserved using a simple slow freezing method, the cell survival rate after thawing increases. It has also been reported (Non-Patent Document 3).
  • a cell cryopreservation solution contains sugars such as trehalose and PG, but does not contain DMSO, thickeners, or natural animal-derived components (Patent Document 6). Furthermore, an animal cell cryopreservation solution containing at least one selected from the group consisting of taurine, glycine, and derivatives thereof, a cryoprotectant other than DMSO, a water-soluble polysaccharide, and an oligosaccharide has also been proposed. (Patent Document 7).
  • An object of the present invention is to provide a cell cryopreservation solution that can effectively suppress cell death caused by freezing and thawing of mammalian cells, and that can effectively increase the proliferation ability of mammalian cells after freezing and thawing.
  • An object of the present invention is to provide a method for cryopreserving mammalian cells using a cell cryopreservation solution.
  • the present invention is as follows.
  • Cell cryopreservation solution [3] The mammalian cell according to [1] or [2] above, further comprising a polymer compound selected from dextran, a derivative thereof, or a salt thereof; and hydroxyethyl starch, a derivative thereof, or a salt thereof; Cryopreservation solution.
  • the mammalian cell cryopreservation solution according to [8] above, wherein the mammalian cells are mesenchymal stem cells, T cells, or hematopoietic stem cells.
  • a method for cryopreserving mammalian cells comprising the step (a) of cryopreserving the mammalian cell cryopreservation solution according to any one of [8] to [10] above. [12] The method according to [11] above, further comprising a step (b) of freezing and thawing the mammalian cells and culturing them for 5 days or more after step (a).
  • a cell cryopreservation solution containing a concentration of PG other than 2.5-8.75% Compared to the case where mammalian cells are cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 2.5 to 5% PG, cell death caused by freezing and thawing of mammalian cells can be effectively suppressed.
  • cryopreserving cells mammalian cells are cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing a concentration of PG other than 2.5-5%, or in a cell cryopreservation solution containing 2.5-5% DMSO.
  • Figure 1B shows four types of cell cryopreservation solutions containing 1.25-10% PG (LR containing 1.25% PG, 2.7% trehalose, and 4.5% dextran [in the figure "1.25% PG + Tre + D”]; LR containing 2.5% PG, 2.7% trehalose, and 4.5% dextran ["2.5% PG + Tre + D” in the figure]; 5% PG, LR containing 2.7% trehalose and 4.5% dextran [“5% PG+Tre+D” in the figure]; and LR containing 10% PG, 2.7% trehalose, and 4.5% dextran Diagram showing the results of cryopreserving hAD-MSCs in [“10%PG+Tre+D” in the figure] for 31 days and analyzing the cell proliferation ability of hAD-MSCs after thawing (
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of a comparison of cell cryopreservation solutions containing the same concentration of DMSO and PG based on the results of FIG. 1.
  • "**” and “***” in the figure indicate that there is a statistically significant difference (p ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.001), respectively, between samples cultured for the same number of days.
  • Trehalose and dextran-containing cell cryopreservation solution containing 4% PG or 4% DMSO were cryopreserved for 23 days in LR containing 4% DMSO, 2.88% trehalose, and 4.8% dextran [4% DMSO+Tre+D] in the figure, and after thawing.
  • FIG. 1 shows that Trehalose and dextran-containing cell cryopreservation solution containing 4% PG or 4% DMSO (LR containing 4% PG, 2.88% trehalose, and 4.8% dextran ["4% PG+Tre+D" in the figure] hAD-MSCs were cryopreserved for 23 days in LR containing 4% DMSO, 2.88% trehalose, and 4.8% dextran [4% DMSO+Tre+D] in the figure, and after thawing.
  • FIG. 6C shows the results in Ringer's acetate solution containing 5% PG ("PG/AR" in the figure) or Ringer's acetate solution containing 5% PG and 4.75% dextran ("PG+D/AR" in the figure).
  • FIG. 6D shows the results in lactated Ringer's solution containing 5% PG ("PG/LR” in the figure) or lactated Ringer's solution containing 5% PG and 4.75% dextran (“PG+D/LR” in the figure).
  • Cell cryopreservation solutions containing 1.25 to 10% PG and dextran that is, 8 types of cell cryopreservation solutions (LR containing 1.25% PG and 4.94% dextran ["1.25%” in the figure]) ; LR containing 2.5% PG and 4.88% dextran ["2.5%” in the figure]; LR containing 3.75% PG and 4.81% dextran ["3.75%” in the figure] ; LR containing 5% PG and 4.75% dextran ["5%” in the figure]; LR containing 6.25% PG and 4.69% dextran ["6.25%” in the figure]; 7.5 LR containing %PG and 4.63% dextran ["7.5%” in the figure]; LR containing 8.75%
  • FIG. "*" in the figure indicates that there is a statistically significant difference (p ⁇ 0.05) by Dunnett's test, and " ⁇ " and “ ⁇ ” in the figure indicate that there is a statistically significant difference (p ⁇ 0.05) by Dunnett's test. This indicates that there is a scientifically significant difference (p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.01).
  • FOG. 11A cell survival rate
  • FIG. 11B viable cell recovery rate
  • FIG. 11C annexin V positivity rate
  • “*" and "**” in the figure indicate statistically significant differences (p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.01), respectively, according to Dunnett's test
  • " ⁇ " in the figure indicates that there is a statistically significant difference (p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.01), respectively.
  • “*”, “**”, and “***” in the figure indicate that there is a statistically significant difference from “PG+Med” (p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, and p ⁇ 0.001), and " ⁇ ", " ⁇ ", and “ ⁇ ” in the figure indicate statistically significant differences in the two-group comparison of "PG+Tre” and "PG", respectively. (p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, and p ⁇ 0.001).
  • FIG. 17B is a diagram showing the results of analyzing the annexin V positivity rate (FIG.
  • the mammalian cell cryopreservation solution of the present invention is a solution containing 2.5 to 8.75 (v/v)% propylene glycol (i.e., This cryopreservation solution).
  • the present cryopreservation solution with a propylene glycol concentration of 2.5 to 5.0 (v/v)% is a cell cryopreservation solution containing propylene glycol at a concentration other than 2.5 to 5.0 (v/v)%.
  • cryopreservation solution which has a propylene glycol concentration of 2.5 to 5.0 (v/v)%, was specified for use "to increase the proliferation ability of mammalian cells after freezing and thawing.” It may be something.
  • the present cryopreservation solution (a solution containing 2.5 to 8.75 (v/v)% propylene glycol) can be used in cell cryopreservation solutions containing DMSO and 2.5 to 8.75 (v/v)% propylene glycol.
  • cell viability can be maintained at a high value when stored at room temperature (1°C to 30°C) after thawing. . Therefore, the present cryopreservation solution may be used specifically for "increasing the cell survival rate of mammalian cells after freezing and thawing.”
  • the method of cryopreserving mammalian cells of the present invention includes the step (a) of cryopreserving the cryopreservation solution containing the mammalian cells (in other words, cryopreserving the mammalian cells in the cryopreservation solution). ) (i.e., the present cryopreservation method), there are no particular limitations on the method, and in step (a), mammalian cells may be frozen using a slow freezing method and then stored, or may be stored rapidly. It may be frozen using a freezing method (vitrification method) and then stored.
  • Such slow freezing methods include, for example, transferring the subject cryopreservation solution containing mammalian cells to a cell storage tube or vial and placing it in a low-temperature freezer or ultra-low temperature freezer (usually within the range of -20°C to -150°C). Examples include a method of freezing and then storing in liquid nitrogen (usually within the range of -150°C to -196°C).
  • a quick freezing method for example, after suspending mammalian cells in the present cryopreservation solution, if necessary, transfer them into a straw, and rapidly freeze them in liquid nitrogen (usually within the range of -150°C to -196°C). Examples include freezing and preserving methods.
  • the concentration of propylene glycol may be within the range of 2.5 to 8.75 (v/v)%, for example, 2.5-7.5%, 2.5-6.25%, 2.5-5.0%, 2.5-4.9%, 2.5-4.8%, 2.5-4 .6%, 2.5-4.4%, 2.5-4.2%, 2.5-4.0%, 2.5-3.8%, 2.5-3.6%, 2 .5-3.4%, 2.5-3.2%, 2.5-3.0%, 2.5-2.8%, 2.5-2.6%, 2.6-8. 75%, 2.8-8.75%, 3.0-8.75%, 3.2-8.75%, 3.4-8.75%, 3.6-8.75%, 3.
  • the cryopreservation solution of the present invention preferably further contains a polymer compound.
  • a polymer compound means a compound having a weight average molecular weight (Mw) of 1 ⁇ 10 4 or more.
  • Such polymer compounds include, for example, dextran or its derivatives or salts thereof (hereinafter sometimes referred to as "dextrans”); hydroxyethyl starch (also referred to as hydroxyethyl starch) or its derivatives or salts thereof (hereinafter referred to as "dextrans”);Albumin; carboxymethyl cellulose or its salt; xanthan gum or its salt; gelatin; amylopectin or its salt; Preferred examples include polymer compounds selected from dextrans and hydroxyethyl starches, since their effects have been demonstrated in this example, which will be described later.
  • the cryopreservation solution may or may not contain polymeric compounds other than dextran and hydroxyethyl starch.
  • Mw weight average molecular weight of the dextran
  • These dextran can be produced by any known method such as chemical synthesis, microbial production, enzymatic production, etc., but commercially available products can also be used.
  • Dextran 40 manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.
  • Dextran 70 manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.
  • Examples of the dextran derivatives among the above dextrans include carboxylated dextran, diethylaminoethyl (DEAE)-dextran, and the like.
  • Hydroxyethyl starch in the above hydroxyethyl starches is composed of amylose in which ⁇ -D-glucose is linearly linked ( ⁇ -1,4 linkage) and amylopectin having branches ( ⁇ -1,6 linkage).
  • the mixture is not particularly limited as long as one or more of C2, C3, and C6 of the glucose units are hydroxyethylated (amylopectin derivative), and the Mw of hydroxyethyl starch is, for example, A range of 5 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 6 (eg, 7 ⁇ 10 4 , 2 ⁇ 10 5 ) can be mentioned.
  • the degree of substitution (the number of hydroxyethyl groups per glucose unit) of the hydroxyethyl starch is not particularly limited, and is, for example, within the range of 0.4 to 0.8 (for example, 0.50 to 0.55). can be mentioned.
  • These hydroxyethyl starches can be produced by any known method such as chemical synthesis, production by microorganisms, production by enzymes, etc., but commercially available products can also be used. For example, commercially available products such as HES (manufactured by Fresenius Kabi Austria GmbH) can be used.
  • hydroxyethyl starch derivatives in the above hydroxyethyl starches include DEAE-hydroxyethyl starch.
  • the concentration of the polymer compound in the cryopreservation solution is not particularly limited as long as the combined effect with PG is recognized, and the lower limit of the concentration of the polymer compound is, for example, 1.0 (w/v)%, 1.2 (w/v)%, 1.4 (w/v)%, 1.6 (w/v)%, 1.8 (w/v)%, 2.0 (w/v)%, 2.2 (w/v)%, 2.4 (w/v)%, 2.6 (w/v)%, 2.8 (w/v)%, 3.0 (w/v)%, 3.2 (w/v)%, 3.4 (w/v)%, 3.6 (w/v)%, 3.8 (w/v)%, 4.0 (w/v)%, Examples include 4.2 (w/v)%, 4.4 (w/v)%, 4.6 (w/v)%, and 4.8 (w/v)%.
  • the upper limit of the concentration of the polymer compound in the cryopreservation solution is, for example, 20 (w/v)%, 16 (w/v)%, 13 (w/v)%, 10 (w/v). %, 9.8 (w/v)%, 9.6 (w/v)%, etc.
  • the concentration of the polymer compound is, for example, 1.0-20%, 1.2-20%, 1.4-20%, 1.6-20%, 1.8-20%, 2.0-20%, 2.2-20%, 2 .4-20%, 2.6-20%, 2.8-20%, 3.0-20%, 3.2-20%, 3.4-20%, 3.6-20%, 3.
  • the range of the weight ratio of propylene glycol and the polymer compound in the cryopreservation solution further containing the polymer compound is, for example, 1:0.1 to 1:10, 1:0.1 to 1:8, 1:0. .1 ⁇ 1:6, 1:0.1 ⁇ 1:4, 1:0.2 ⁇ 1:10, 1:0.2 ⁇ 1:8, 1:0.2 ⁇ 1:6, 1:0 .2 ⁇ 1:4, 1:0.3 ⁇ 1:10, 1:0.3 ⁇ 1:8, 1:0.3 ⁇ 1:6, 1:0.3 ⁇ 1:4, 1:0 .4 ⁇ 1:10, 1:0.4 ⁇ 1:8, 1:0.4 ⁇ 1:6, 1:0.4 ⁇ 1:4, 1:0.5 ⁇ 1:10, 1:0 .5 to 1:8, 1:0.5 to 1:6, 1:0.5 to 1:4, etc., and when the polymer compound is dextran, 1:0.1 to 1:
  • the ratio is preferably 4, more preferably 1:0.3 to 1:4, even more preferably 1:0.5 to 1:4.
  • the present cryopreservation solution preferably further contains trehalose, a derivative thereof, or a salt thereof (hereinafter sometimes referred to as "trehalose”).
  • trehalose includes ⁇ , ⁇ -trehalose, which is a disaccharide in which two ⁇ -glucoses are linked together in a 1,1-glycosidic bond, and trehalose, which is a disaccharide in which two ⁇ -glucoses are linked together in a 1,1-glycoside bond.
  • Examples include ⁇ , ⁇ -trehalose, which is a saccharide, and ⁇ , ⁇ -trehalose, which is a disaccharide in which two ⁇ -glucoses are linked with a 1,1-glycoside bond, and among these, ⁇ , ⁇ -trehalose is preferred.
  • These trehaloses can be produced by any known method such as chemical synthesis, microbial production, enzymatic production, etc., but commercially available products can also be used. For example, commercially available products such as trehalose dihydrate (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be mentioned.
  • the trehalose derivatives in the trehaloses mentioned above are not particularly limited as long as they are glycosyltrehaloses in which one or more sugar units are bonded to the disaccharide trehalose. Contains trehalose, etc.
  • the concentration of trehalose in the cryopreservation solution is not particularly limited as long as the combined effect with PG is recognized, and the lower limit of the concentration of trehalose is, for example, 0.7 (w/v)%, 0. 8 (w/v)%, 0.9 (w/v)%, 1.0 (w/v)%, 1.1 (w/v)%, 1.2 (w/v)%, 1. Examples include 3 (w/v)%, 1.4 (w/v)%, and the like.
  • the upper limit of the concentration of trehalose in this cryopreservation solution is, for example, 40 (w/v)%, 35 (w/v)%, 30 (w/v)%, 25 (w/v)%. , 20 (w/v)%, 15 (w/v)%, 12 (w/v)%, 6.0 (w/v)%, and the like.
  • the concentration of the above-mentioned trehaloses is, for example, 0.7-40%, 0.8-40%, 0.9-40%, 1.0-40%, 1.1-40%, 1.2-40%, 1.3-40%, 1 .4-40%, 0.7-35%, 0.8-35%, 0.9-35%, 1.0-35%, 1.1-35%, 1.2-35%, 1.
  • the range of the weight ratio of propylene glycol and trehalose in the cryopreservation solution further containing trehalose is, for example, 1:0.08 to 1:16, 1:0.08 to 1:14, 1:0.08.
  • the cryopreservation solution in question is a solution (e.g., isotonic solution, hypotonic solution, hypertonic solution) that contains 2.5 to 8.75 (v/v)% propylene glycol and is capable of cryopreservation of mammalian cells.
  • An isotonic solution containing 2.5-8.75 (v/v)% propylene glycol is preferred.
  • isotonic fluid means a fluid that has approximately the same osmotic pressure as that of body fluids or cell fluids, and specifically, a fluid that has an osmotic pressure within the range of 250 to 380 mOsm/L. means.
  • hypotonic solution refers to a solution that has an osmotic pressure lower than that of body fluids or cell fluids, and specifically refers to a solution that has an osmotic pressure of less than 250 mOsm/L. do.
  • a hypotonic solution is preferably a hypotonic solution that does not cause cell rupture (specifically, a solution having an osmotic pressure within a range of 100 to less than 250 mOsm/L).
  • hypothermic solution means a solution having an osmotic pressure higher than that of body fluids or cell fluids, and specifically, the osmotic pressure is more than 380 mOsm/L (preferably 380 mOsm/L). (within the range of more than 1000 mOsm/L).
  • the above-mentioned isotonic solution is not particularly limited as long as it is an isotonic solution whose salt concentration and sugar concentration are adjusted using sodium ions, potassium ions, calcium ions, etc. so that the osmotic pressure is almost the same as that of body fluids and cell fluids.
  • physiological saline physiological saline with a buffering effect (e.g., PBS, Tris Buffered Saline; TBS, HEPES buffered saline), Ringer's solution, lactated Ringer's solution, acetate Ringer's solution, Ringer's bicarbonate solution, 5% glucose aqueous solution, basal medium for animal cell culture (e.g.
  • DMEM fetal calf serum
  • EMEM fetal calf serum
  • F-12, F-10 M-199
  • isotonic agent e.g. glucose , D-sorbitol, D-mannitol, lactose, sodium chloride
  • lactated Ringer's solution physiological saline, Ringer's solution
  • a suitable example is an isotonic solution selected from Ringer's acetate solution.
  • Isotonic solutions may be commercially available or self-prepared.
  • Otsuka raw food injection manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.
  • physiological saline solution Ringer's solution "Otsuka” (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (Ringer's solution)
  • Lactech registered trademark
  • Injection manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.
  • Veen registered trademark
  • F infusion manufactured by Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
  • Otsuka sugar solution 5% manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory
  • 5% glucose aqueous solution 5% glucose aqueous solution
  • Bikanate registered trademark
  • the cryopreservation solution may contain cryoprotective components other than PG (for example, DMSO; glycerol; ethylene glycol; PEG; sericin; isomalto-oligosaccharide; serum derived from human, bovine, etc.); Those containing no cryoprotective components other than PG are preferred because they alone can effectively enhance the proliferation ability of mammalian cells after freezing and thawing.
  • cryoprotective components other than PG for example, DMSO; glycerol; ethylene glycol; PEG; sericin; isomalto-oligosaccharide; serum derived from human, bovine, etc.
  • the cryopreservation solution may contain oligosaccharides other than trehalose (for example, disaccharides such as sucrose, lactose, and maltose; trisaccharides such as maltotriose, raffinose, and melezitose; tetrasaccharides such as acarbose and stachyose), and monosaccharides.
  • oligosaccharides other than trehalose for example, disaccharides such as sucrose, lactose, and maltose; trisaccharides such as maltotriose, raffinose, and melezitose; tetrasaccharides such as acarbose and stachyose
  • monosaccharides for example, glucose, fructose, galactose
  • glucose, fructose, galactose may or may not be included.
  • the cryopreservation solution of the present invention usually does not contain a substance selected from taurine or a derivative thereof, or a salt thereof; and glycine or a derivative thereof or a salt thereof.
  • taurine derivatives include, for example, N-substituted taurine (for example, N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, -Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid, 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid, 2-morpholinoethanesulfonic acid, piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) (acid), N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid, etc.), hypotaurine, thiotaurine, etc.
  • Examples of the above glycine derivatives include sarcosine (N-methylglycine), N-ethylglycine, N-propylglycine, N,N-diethylglycine, N,N-dimethylglycine, N-amidinoglycine, N-amidino-N - Methylglycine, glycylglycine, phenacetulic acid, glycine methyl ester, glycine ethyl ester, glycine n-butyl ester, glycine t-butyl ester, glycine n-propyl ester, glycine n-pentyl ester, glycine benzyl ester, etc.
  • taurine, taurine derivatives, glycine, and "salts" of glycine derivatives include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate, acetate, propionate, Toluenesulfonate, succinate, oxalate, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, malate
  • acid addition salts such as, metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, ammonium salts, alkylammonium salts, and the like.
  • salts include, for example, hydrochloride, hydrobromide, etc.
  • hydroiodide phosphate, nitrate, sulfate, acetate, propionate, toluenesulfonate, succinate, oxalate, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate , acid addition salts such as butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, malate, metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, ammonium salt, alkylammonium salt. etc. can be mentioned.
  • salts are used as a solution, and their effects are the same as when using dextran, dextran derivatives, hydroxyethyl starch, hydroxyethyl starch derivatives, trehalose, trehalose derivatives, carboxymethylcellulose, xanthan gum, and amylopectin. Preferably something that is effective.
  • the "salts" of (dextran, dextran derivatives, hydroxyethyl starch, hydroxyethyl starch derivatives, trehalose, trehalose derivatives, carboxymethylcellulose, xanthan gum, and amylopectin) may form hydrates or solvates, and Either one can be used alone or two or more kinds can be used in an appropriate combination.
  • Optional ingredients in the cryopreservation solution include, for example, vitamins (e.g., choline chloride, pantothenic acid, folic acid, nicotinamide, pyridoxal hydrochloride, riboflavin, thiamine hydrochloride, ascorbic acid, biotin, inositol), chelating agents (e.g., EDTA , EGTA, citric acid, salicylate), antibiotics (eg, penicillin, streptomycin), proteins, antioxidants (eg, polyphenols, quercetin), and the like.
  • vitamins e.g., choline chloride, pantothenic acid, folic acid, nicotinamide, pyridoxal hydrochloride, riboflavin, thiamine hydrochloride, ascorbic acid, biotin, inositol
  • chelating agents e.g., EDTA , EGTA, citric acid, salicylate
  • antibiotics
  • mammalian cells include, for example, stem cells (for example, stem cells administered via blood vessels for regenerative medicine, etc.); pancreatic islet cells (for example, pancreatic islet cells administered intravenously to type I diabetic patients); Lymphoid cells such as T cells, natural killer (NK) cells, and B cells; Antigen presenting cells such as monocytes, macrophages, and dendritic cells; Granules such as neutrophils, eosinophils, basophils, and mast cells.
  • T cells can be suitably exemplified because their effects have been demonstrated in the present example described below.
  • T cells can include alpha beta T cells, gamma delta T cells, CD8 positive T cells, CD4 positive T cells, tumor infiltrating T cells, memory T cells, naive T cells, and NKT cells.
  • T cells can be collected from mammalian bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood, etc. by known general methods.
  • mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, lagomorphs such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats, horses, and sheep, dogs, cats, etc.
  • lagomorphs such as rabbits
  • ungulates such as pigs, cows, goats, horses, and sheep, dogs, cats, etc.
  • primates such as cats, humans, monkeys, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees, among which mice, pigs, and humans are preferred.
  • stem cell means an immature cell that has self-renewal ability and differentiation/proliferation ability.
  • Stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells (pluripotent stem ce11), multipotent stem cells (multipotent stem ce11), and unipotent stem cells (unipotent stem ce11), depending on their differentiation ability.
  • pluripotent stem cell refers to a cell that cannot become an individual by itself, but has the ability to differentiate into all tissues and cells that make up a living body.
  • Multipotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, although not all types.
  • Unipotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into specific tissues or cells.
  • pluripotent stem cells examples include embryonic stem cells (ES cells), EG cells, iPS cells, and the like.
  • ES cells can be produced by culturing the inner cell mass on feeder cells or in a medium containing LIF. Methods for producing ES cells are described, for example, in WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718, and the like.
  • EG cells can be produced by culturing primordial germ cells in a medium containing mSCF, LIF, and bFGF (Ce11, 70:841-847, 1992).
  • iPS cells are produced by introducing reprogramming factors such as Oct3/4, Sox2, and Klf4 (and further c-Myc or n-Myc as necessary) into somatic cells (e.g., fibroblasts, skin cells, etc.) (Ce11,126:p.663-676,2006;Nature,448:p.313-317,2007;Nat Biotechno1,26;p,101-106,2008;Cel1 131:p.861-872, 2007;Science,318:p.1917-1920,2007;Ce11 Stem Cells 1:p.55-70,2007;Nat Biotechnol,25:p.1177-1181,2007;Nature,448:p.318-324, 2007;Cell Stem Cells 2:p.10-12,2008;Nature451:p.141-146,2008;Science,318:p.1917-1920,2007).
  • somatic cells e.g., fibroblasts,
  • stem cells established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei are also preferred as pluripotent stem cells (Nature, 385, 810 (1997); Science, 280, 1256 (1998); Nature Biotechnology, 17, 456 (1999); Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999)), Rideout III et al. 2000)).
  • Multipotent stem cells include mesenchymal stem cells that can differentiate into cells such as adipocytes, osteocytes, and chondrocytes; hematopoietic stem cells that can differentiate into blood cells such as white blood cells, red blood cells, and platelets (e.g., CD34, CD110 , CD111, CD112, and CD117 (preferably CD34-positive hematopoietic stem cells); nervous system cells capable of differentiating into cells such as neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.
  • mesenchymal stem cells that can differentiate into cells such as adipocytes, osteocytes, and chondrocytes
  • hematopoietic stem cells that can differentiate into blood cells such as white blood cells, red blood cells, and platelets (e.g., CD34, CD110 , CD111, CD112, and CD117 (preferably CD34-positive hematopoietic stem cells)
  • nervous system cells capable of differentiating into cells such as neurons,
  • so mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells can be preferably exemplified.
  • Multipotent stem cells can be isolated from a living body by a method known per se.
  • mesenchymal stem cells can be collected from mammalian bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, umbilical cord blood, etc. by known general methods.
  • human mesenchymal stem cells can be isolated by culturing and passage of hematopoietic stem cells etc.
  • hematopoietic stem cells can be collected from mammalian bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood, etc. by known general methods. Multipotent stem cells can also be obtained by culturing the above-mentioned pluripotent stem cells under appropriate induction conditions.
  • the mesenchymal stem cells are preferably human adipose-derived mesenchymal stem cells.
  • the hematopoietic stem cells are preferably human-derived CD34-positive hematopoietic stem cells.
  • the present cryopreservation solution may be in a form that does not contain mammalian cells or in a form that contains mammalian cells, and when implementing the present cryopreservation method, it may be in a form that contains mammalian cells (i.e., a form that contains mammalian cells).
  • the present cryopreservation solution containing animal cells is preferred.
  • the cryopreservation solution containing mammalian cells can be prepared by any method.
  • the mammalian cell-containing solution is centrifuged to separate the supernatant (liquid) and precipitate (mammalian cells); 2) A method in which the cryopreservation solution is prepared by removing the supernatant (liquid) and adding the subject cryopreservation solution to the precipitate (mammalian cells), or 2) when mixed with the mammalian cell-containing solution, A solution that has been adjusted so that the final concentration of the components contained in the solution is the desired concentration (for example, 2.5 to 8.75 (v/v)% in the case of PG) is mixed with a solution containing mammalian cells.
  • a method for preparing the same can be mentioned.
  • the present cryopreservation solution containing umbilical cord blood is preferred.
  • the present cryopreservation solution containing umbilical cord blood can be obtained by mixing umbilical cord blood (i.e., a solution containing mammalian cells such as hematopoietic stem cells) and a solution containing PG in an arbitrary ratio (for example, according to method 2) above. 10:1 to 1:10 [for example, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, etc.]).
  • adherent cells An example of mammalian cells to be preserved in the present cryopreservation solution is adherent cells.
  • adherent cells refer to anchorage-dependent cells that can survive, proliferate, and produce substances by adhering to the scaffold.
  • adherent stem cells include pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, bone marrow stem cells, and germline stem cells.
  • Adherent stem cells are preferably mesenchymal stem cells.
  • the mammalian cells (population) to be preserved in this cryopreservation solution may be isolated from the living body or subcultured in vitro, but they may be isolated or purified. It is preferable.
  • isolated or purification means that an operation is performed to remove components other than the target component.
  • the purity of the isolated or purified mammalian cells is usually 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more, More preferably, it is 90% or more (for example, 100%).
  • the mammalian cells (population) to be stored in the present cryopreservation solution are preferably in the state of a single cell (single cell).
  • single cell state means that the cells do not gather together with other cells to form a mass (ie, a non-aggregated state).
  • Mammalian cells in a single cell state can be obtained by treating mammalian cells cultured in vitro with enzymes such as trypsin/EDTA, and then suspending the cells by methods well known in the art such as pipetting and tapping. It can be prepared.
  • the percentage of single-cell mammalian cells contained in mammalian cells is usually 70% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 99% or more (for example, 100%). be.
  • mammalian cells are dispersed in PBS, observed under a microscope, and a plurality of randomly selected cells (for example, 1000 cells) are examined for the presence or absence of aggregation. It can be determined by
  • the present cryopreservation method preferably includes a step (b) of freezing and thawing the mammalian cells and culturing them after the step (a).
  • Examples of the culture period include 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, 8 days or more, but 5 days or more preferable.
  • the method of freezing and thawing the mammalian cells is not particularly limited, and the container containing the cryopreservation solution containing frozen mammalian cells (cell storage tube, cell storage vial, straw) etc.) may be naturally thawed at room temperature (for example, within the range of 10 to 28 °C), but from the viewpoint of preventing refreezing, soak it in warm water (for example, water within the range of 30 to 40 °C), Rapid thawing is preferred.
  • step (b) above the mammalian cells after freezing and thawing are cultured in an appropriate container (culture plate, culture dish, culture flask, etc.) in the presence of an appropriate culture medium.
  • culture media include animal cell culture media (DMEM, EMEM, IMDM, RPMI1640, ⁇ MEM, F-12, F-10, M-199, AIM-V, etc.), MyeloCult H5100 medium (manufactured by STEMCELL Technologies, ST-05150), and the like.
  • serum-free culture solution for example, an appropriate amount of a serum substitute such as the above-mentioned commercially available B27 supplement (-insulin), N2 supplement, B27 supplement, Knockout Serum Replacement, etc.
  • a serum substitute such as the above-mentioned commercially available B27 supplement (-insulin), N2 supplement, B27 supplement, Knockout Serum Replacement, etc.
  • examples include the above-mentioned culture solution for animal cell culture, in which 1% to 30%) have been added.
  • the culture temperature of the mammalian cells after freezing and thawing is usually within the range of about 30 to 40°C, preferably 37°C.
  • the CO 2 concentration during culture is usually within the range of about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • the humidity during culturing is usually within the range of about 70 to 100%, preferably within the range of about 95 to 100%.
  • the O 2 concentration during culture may be normal oxygen concentration (18-22% O 2 ) or low oxygen concentration (0-10% O 2 ).
  • LR containing 10 (v/v)% PG was prepared by mixing Lactech Injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory) and the above PG at a ratio of 9:1.
  • Lactech Injection manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory
  • 5(v/v)% PG-containing LR, 2.5(v/v)% PG-containing LR, and 1.25(v/v)% PG-containing LR are v)% PG-containing LR'' was prepared by diluting it with Lactech Injection in a 2-fold common ratio.
  • LR containing 10 (v/v)% PG and 2.7 (w/v)% trehalose was prepared using 0.5 mL of the above PG and 0.5 mL of Cellstore (registered trademark) W (Otsuka Pharmaceutical Factory). Co., Ltd.) (i.e., lactated Ringer's solution containing 3 (w/v)% trehalose).
  • AR containing 5 (v/v)% PG and 4.75 (w/v)% dextran was prepared by first dissolving 500 mg of the above Dextran 40 in 10 mL of Veen F infusion, )% dextran-containing AR was prepared by mixing 0.5 mL of the above PG and 9.5 mL of 5 (w/v) % dextran-containing AR.
  • LR containing 5 (v/v)% PG and 4.75 (w/v)% dextran was prepared by first dissolving 500 mg of the above Dextran 40 in 10 mL of Lactech Injection, % dextran-containing LR was prepared by mixing 0.5 mL of the above PG and 9.5 mL of 5 (w/v) % dextran-containing LR.
  • 7.5 (v/v)% PG and 4.63 (w/v)% dextran-containing LR is the above-mentioned “5 (v/v)% PG and 4.75 (w/v)% and the above-mentioned "LR containing 10 (v/v)% PG and 4.5 (w/v)% dextran" at a ratio of 1:1. 3) LR containing 3.75 (v/v)% PG and 4.81 (w/v)% dextran was )% dextran-containing LR" and the above-mentioned "5 (v/v)% PG and 4.75 (w/v)% dextran-containing LR" in a 1:1 ratio.
  • the 6.25 (v/v)% PG and 4.69 (w/v)% dextran-containing LR is the same as the above “5 (v/v)% PG and 4.75 (w/v)% and the above-mentioned "LR containing 7.5 (v/v)% PG and 4.63 (w/v)% dextran" at a ratio of 1:1. 5) LR containing 8.75 (v/v)% PG and 4.56 (w/v)% dextran was )% dextran-containing LR" and the above-mentioned "10 (v/v)% PG and 4.5 (w/v)% dextran-containing LR" in a 1:1 ratio.
  • the LR containing 4 (v/v)% PG and 4.8 (w/v)% dextran is the same as the above-mentioned “10 (v/v)% PG and 4.5 (w/v)% dextran.” It was prepared by mixing the above-mentioned "LR containing 5 (w/v)% dextran” and the above "LR containing 5 (w/v)% dextran” at a ratio of 4:6.
  • 4 (v/v)% PG and 4.8 (w/v)% HES-containing LR is the above-mentioned “10 (v/v)% PG and 4.5 (w/v)% HES It was prepared by mixing the above-mentioned "LR containing 5 (w/v)% HES” and the above "LR containing 5 (w/v)% HES” at a ratio of 4:6. 7) LR containing 10 (v/v)% PG and 2.7 (w/v)% trehalose was prepared in 5) of [Preparation of cell cryopreservation solution used in Study 3] above. there was.
  • 4 (v/v)% PG and 2.88 (w/v)% trehalose-containing LR is the above-mentioned “10 (v/v)% PG and 2.7 (w/v)% trehalose It was prepared by mixing "Containing LR" and Cellstore W at a ratio of 4:6. 9) LR containing 10 (v/v)% PG, 2.7 (w/v)% trehalose, and 4.5 (w/v)% dextran was prepared by first adding 500 mg of the above Dextran 40 to 10 mL.
  • Lactated Ringer's solution (LR) containing 2.5 (v/v)% PG was prepared by mixing Lactec Injection and PG in a ratio of 39:1.
  • LR containing 2.5 (v/v)% PG and 2.925 (w/v)% trehalose was prepared by mixing Cellstore W and the above PG at a ratio of 39:1.
  • LR containing 2.5 (v/v)% PG, 2.925 (w/v)% trehalose, and 4.875 (w/v)% dextran contains Cellstore S and the above PG at 39 It was prepared by mixing at a ratio of :1.
  • LR containing 4 (v/v)% PG and 1.44 (w/v)% fructose is prepared by first adding 150 mg of D(-)-fructose (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to 10 mL of After preparing LR containing 1.5 (w/v)% fructose by dissolving it in Lactec Injection, mix 0.4 mL of the above PG and 9.6 mL LR containing 1.5 (w/v) % fructose.
  • LR containing 4 (v/v)% PG and 2.88% sucrose was prepared by first dissolving 300 mg of sucrose (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 10 mL of Lactech Injection, and then preparing the LR containing 3% sucrose. After preparing the LR, it was prepared by mixing 0.4 mL of the above PG and 9.6 mL of LR containing 3% sucrose. 6) For LR containing 4 (v/v)% PG and 2.88 (w/v)% lactose, first add 316 mg of lactose monohydrate (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to 10 mL of Lactech Injection. After preparing 3 (w/v)% lactose-containing LR by dissolving it in the following, 0.4 mL of the above PG and 9.6 mL of 3 (w/v)% lactose-containing LR were mixed.
  • LR containing 2 (v/v)% PG, 2.7 (w/v)% trehalose, and 4.5 (w/v)% dextran; 3 (v/v)% PG, 2.7 LR containing (w/v)% trehalose, and 4.5 (w/v)% dextran; 4 (v/v)% PG, 2.7 (w/v)% trehalose, and 4.5% dextran; LR containing (w/v)% dextran; LR containing 5 (v/v)% PG, 2.7 (w/v)% trehalose, and 4.5 (w/v)% dextran; and LR containing 7.5 (v/v)% PG, 2.7 (w/v)% trehalose, and 4.5 (w/v)% dextran; first, Cellstore S and the above PG were mixed.
  • hAD-MSCs Human adipose-derived mesenchymal stem cells (manufactured by Lonza Walkersville) were cultured according to Lonza Walkersville's human adipocyte-derived stem cell culture procedure manual. Specifically, hAD-MSCs were seeded in a 75 cm 2 flask with 15 mL of a medium prepared from a medium kit (PT-4505, ADSC BulletKit, manufactured by Lonza Walkersville) (hereinafter referred to as "MSC medium”), and incubated at 37°C. , and cultured under a 5% CO 2 incubator. Medium exchange was performed every 3 or 4 days.
  • hAD-MSCs were prepared according to the following procedures [1] to [11].
  • a personal incubator PIC-100, manufactured by As One Corporation
  • PBS product number: 14190-144, manufactured by GIBCO
  • trypsin/EDTA product code: CC-5012, manufactured by Lonza Walkersville
  • trypsin/EDTA product code: CC-5012, manufactured by Lonza Walkersville
  • hCD8-positive T cells 1.5 x 106 human CD8-positive T cells (hCD8-positive T cells) (manufactured by STEMCELL Technologies) were placed in a flask containing culture medium for T lymphocyte culture (product name: TLY CULTURE Kit 25, TLY-FK25, GC). (manufactured by Lymphotec) and culture was started in a 37° C., 5% CO 2 incubator. On the third day after culturing, the cells were transferred to 8 or 10 25 cm 2 flasks. Thereafter, the flasks on the 9th day of culture were used in the method described in the following section [Preparation of hCD8-positive T cells (Studies 11 and 12)].
  • hCD8-positive T cells were prepared according to the following procedures [1] to [4]. [1] hCD8-positive T cells were transferred from the flask to 50 mL Proteosave (MS-52550, manufactured by Sumitomo Bakelite). [2] Cells were collected by centrifugation at 300 ⁇ g for 10 minutes at room temperature. [3] The supernatant was aspirated and suspended in Lactech Injection.
  • hCD8-positive T cells or hCD4-positive T cells were transferred to three 75 cm 2 flasks, respectively.
  • one flask each was used in the method described in the following section [Preparation of hCD8-positive T cells and hCD4-positive T cells (Studies 13 and 14)].
  • the cells were collected from the remaining flask and divided into three 75 cm 2 flasks, and each flask was filled with T cell medium (product name: X-VIVO15 serum-free lymphocytes). 10 mL of culture medium (04-418Q, manufactured by Lonza Walkersville) was added. Thereafter, three flasks on the 11th day after culture were used in the method described in the following section [Preparation of hCD8-positive T cells and hCD4-positive T cells (Studies 13 and 14)].
  • hCD8-positive T cells were prepared according to the following procedures [1] to [5]. [1] hCD8-positive T cells or hCD4-positive T cells were transferred from the flask to 50 mL Proteosave (MS-52550, manufactured by Sumitomo Bakelite). [2] Cells were collected by centrifugation at 300 ⁇ g for 10 minutes at room temperature. [3] The supernatant was aspirated and suspended in Cell Store W.
  • Hematopoietic progenitor cell proliferation culture solution XF (manufactured by Takara Bio) containing 2 ⁇ 10 4 cells/mL of cord blood-derived human CD34-positive hematopoietic stem cells (hCD34-positive hematopoietic stem cells) (manufactured by Takara Bio) was added to a 75 cm 2 The seeds were seeded in a suspension culture flask (product name: Super Quality Suspension Cell Culture Flask 75 cm 2 Filter Caps, MS-2325RS, manufactured by Sumitomo Bakelite), and culture was started in a 37° C., 5% CO 2 incubator.
  • a suspension culture flask product name: Super Quality Suspension Cell Culture Flask 75 cm 2 Filter Caps, MS-2325RS, manufactured by Sumitomo Bakelite
  • hematopoietic progenitor cell proliferation culture medium XF was added and cultured for an additional 3 days.
  • the culture solution was transferred to 50 mL Proteosave (MS-52550, manufactured by Sumitomo Bakelite) and centrifuged at 240 ⁇ g for 10 minutes at room temperature to collect cells.
  • the supernatant was aspirated, fresh hematopoietic progenitor cell proliferation culture medium XF was added, the cells were suspended, and then seeded in a new 75 cm 2 suspension culture flask.
  • the above operations 1) and 2) were repeated every 2 to 3 days, and the flask on the 12th day was used in the method described in the following section [Preparation of hCD34-positive hematopoietic stem cells (Study 15)].
  • hCD34-positive hematopoietic stem cells were prepared according to the following procedures [1] to [4]. [1] The hCD34-positive hematopoietic stem cells were transferred from the flask to 50 mL Proteosave (MS-52550, manufactured by Sumitomo Bakelite). [2] Cells were collected by centrifugation at 240 ⁇ g for 10 minutes at room temperature. [3] The supernatant was aspirated and suspended in Lactech Injection.
  • Four types of mammalian cells hAD-MSCs, hCD8-positive T cells, hCD4-positive T cells, and hCD34-positive hematopoietic stem cells
  • hAD-MSCs hCD8-positive T cells
  • hCD4-positive T cells hCD4-positive T cells
  • hCD34-positive hematopoietic stem cells were cryopreserved according to the following procedures [1] to [4].
  • Various mammalian cells suspended in Cell Store W or Lactech Injection were transferred to 15 mL Stemful (product number MS-90150, size 15 mL, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).
  • [Cell sample preparation after freezing and thawing] Evaluate the survival rate of four types of mammalian cells (hAD-MSC, hCD8-positive T cells, hCD4-positive T cells, and hCD34-positive hematopoietic stem cells) after freezing and thawing according to the following steps [1] to [6].
  • a sample was prepared for this purpose.
  • a constant temperature bath water bath was set at 37°C and heated.
  • Vials containing frozen cell cryopreservation solutions containing various mammalian cells were taken out of the liquid nitrogen tank and transferred to a container containing dry ice.
  • hCD34-positive hematopoietic stem cell suspension 800 ⁇ L was collected. In addition, in order to carry out Studies 11 and 12, the fractionated cell suspension was stored at room temperature with shaking (100 rpm, 25 mm).
  • Annexin V staining solution 400 ⁇ L was added, transferred to a round-bottomed standard tube through a cell strainer, and the Annexin V positivity rate was immediately evaluated using flow cytometry (Gallios, manufactured by Beckman Coulter). Annexin V positive rate was analyzed and calculated using Kaluza Analysis Software (Ver. 1.5a, manufactured by Beckman Coulter).
  • FBS Stain Buffer
  • hAD-MSCs cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 1.25-10% DMSO showed no difference in cell proliferation efficiency due to differences in DMSO concentration. ( Figure 1A and Table 1).
  • hAD-MSCs cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 2.5-5% PG were significantly more efficient than hAD-MSCs cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 10% PG. It was shown that the cells proliferated well (FIG. 1B and Table 1).
  • hAD-MSCs cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 2.5-5% PG were compared to hAD-MSCs cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 2.5-5% DMSO. , was shown to grow significantly more efficiently (FIGS. 2B and 2C).
  • hAD-MSCs cryopreserved in cell cryopreservation solution containing trehalose and dextran containing 4% DMSO were Compared to hAD-MSCs that were not preserved, the proliferation level was shown to be significantly reduced from the 3rd day of culture onwards (FIG. 3 and Table 3).
  • hAD-MSCs cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 2.5 to 5% PG did not contain 10% PG. It was shown that hAD-MSCs proliferated more efficiently compared to hAD-MSCs cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing the following (Fig. 4 and Table 4). In particular, when three types of base solutions (LR containing dextran; LR containing trehalose; and LR containing trehalose and dextran) were used, the cell proliferation ability of hAD-MSCs was significantly higher ( Figures 4B to D and Table 4). .
  • the cell survival rate of hAD-MSC when using a cell cryopreservation solution containing 5% PG and 4.75% dextran is as follows:
  • the cell survival rate of hAD-MSCs was higher than that obtained when a solution was used, and was particularly significantly higher when Ringer's solution or Ringer's acetate solution was used as the base solution (FIG. 5A and Table 5).
  • the survival rate of hAD-MSCs had a similar tendency, and was significantly higher especially when Ringer's acetate solution was used as the base solution (FIG. 5B and Table 5).
  • the annexin V positive rate of hAD-MSCs was as follows: The cell survival rate was lower than that when a preservation solution was used (FIG. 5C and Table 5).
  • Cell cryopreservation solution (LR containing 2.5% PG and 4.88% dextran; LR containing 3.75% PG and 4.81% dextran; LR containing 5% PG and 4.75% dextran; 6.25% hAD-MSCs cryopreserved in cell cryopreservation solution containing 10% PG (LR containing PG and 4.69% dextran; and LR containing 7.5% PG and 4.63% dextran) hAD-MSCs were shown to proliferate more efficiently than hAD-MSCs cryopreserved in 4.5% dextran-containing LR), especially when the concentration of PG in the cell cryopreservation solution was 2.5-5%. It was shown that the cells proliferated ( Figure 8 and Table 8).
  • hAD-MSCs were cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 4% PG and 1.2-9.6% dextran
  • hAD-MSCs were cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 4% PG without dextran.
  • the annexin V positivity rate of hAD-MSCs immediately after freezing and thawing was lower than when the cells were cryopreserved, especially when the concentration of dextran in the cell cryopreservation solution was 4.8 to 9.6% ( Figures 9A and 9B, Table 9).
  • hAD-MSCs were frozen in cell cryopreservation solution containing PG and HES (LR containing 4% PG and 4.8% HES; and LR containing 10% PG and 4.5% HES).
  • hAD-MSCs are cryopreserved in cell cryopreservation solution containing PG and dextran (LR with 4% PG and 4.8% dextran; and LR with 10% PG and 4.5% dextran).
  • hAD-MSCs immediately after freezing and thawing were The cell survival rate and viable cell recovery rate were high, and the annexin V positive rate was low ( Figure 10 and Table 10).
  • the PG concentration in the cell cryopreservation solution containing PG and HES was 4%, the cell survival rate and viable cell recovery rate of hAD-MSCs immediately after freezing and thawing were lower than when the PG concentration was 10%.
  • the annexin V positive rate was low (FIG. 10 and Table 10).
  • LR containing 2.5% PG, 2.925% trehalose, and 4.875% dextran When cryopreserved, the cell viability and viable cell recovery rate of hAD-MSCs immediately after thawing were higher than when hAD-MSCs were cryopreserved in 2.5% PG-containing LR.
  • These values were significantly higher when using LR containing PG, 2.925% trehalose, and 4.875% dextran (FIGS. 12A and 1B, Table 12).
  • LR containing 2.5% PG, 2.925% trehalose, and 4.875% dextran Upon storage, the annexin V positivity rate of hAD-MSCs immediately after thawing was significantly lower than when hAD-MSCs were cryopreserved in 2.5% PG-containing LR (FIG. 12C, Table 12).
  • LR containing 72% trehalose; LR containing 4% PG and 1.44% trehalose; LR containing 4% PG and 2.88% trehalose; LR containing 4% PG and 5.76% trehalose; and hAD-MSCs were cryopreserved in LR containing 4% PG and 11.52% trehalose, and the cell viability, viable cell recovery rate, and annexin V positivity rate of hAD-MSCs were analyzed immediately after thawing.
  • cell cryopreservation solution containing 4% PG and 0.72-11.52% trehalose (LR containing 4% PG and 0.72% trehalose; containing 4% PG and 1.44% trehalose) LR; LR containing 4% PG and 2.88% trehalose; LR containing 4% PG and 5.76% trehalose;
  • MSCs are cryopreserved, cell survival of hAD-MSCs immediately after freezing and thawing is improved compared to when hAD-MSCs are cryopreserved in 4% PG-containing cell cryopreservation solution (LR containing 4% PG) without trehalose.
  • hAD-MSCs were cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 4% PG and 0.72-11.52% trehalose
  • hAD-MSCs were cryopreserved in a cell cryopreservation solution containing 4% PG without trehalose.
  • the annexin V positivity rate of hAD-MSCs immediately after freezing and thawing was lower than that when the hAD-MSCs were cryopreserved ( Figure 14C, Table 14).
  • hCD8-positive T cells were frozen in three types of cells. Cryopreserve in storage solution (serum-containing culture medium containing 4% PG; trehalose-containing LR containing 4% PG; and LR containing 4% PG) immediately after thawing, 1 hour after thawing, 3 hours after thawing, Then, the cell survival rate and viable cell recovery rate of hCD8-positive T cells for 6 hours were analyzed.
  • hCD8-positive T cells were cryopreserved in serum-containing culture medium containing 4% PG or trehalose-containing LR containing 4% PG, hCD8-positive T cells were cryopreserved in LR containing 4% PG.
  • the cell survival rate and viable cell recovery rate of hCD8-positive T cells immediately after or after thawing were higher than in the case of thawing (FIG. 15 and Table 15).
  • the hCD8-positive T cells were cryopreserved in LR containing PG, 2.7% trehalose, and 4.5% dextran, and the cell viability and viable cell recovery rate of hCD8-positive T cells were analyzed immediately after thawing and 3 hours after thawing.
  • hCD4-positive T cells are cryopreserved in the above four types of cell cryopreservation solutions containing 3 to 7.5% PG
  • hCD4-positive T cells are Compared to when cells were cryopreserved, the annexin V positivity rate of hCD4-positive T cells immediately after freezing and thawing was significantly lower, especially when the concentration of PG in the cell cryopreservation solution was 4 to 5% ( Figures 18C and 18C). Table 18)
  • cell death caused by freezing and thawing of mammalian cells can be effectively suppressed, and the proliferation ability of mammalian cells after freezing and thawing can be effectively increased, so transplantation therapy in regenerative medicine etc. It is useful in the field and cancer treatment field.

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Abstract

本発明は、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死を効果的に抑制でき、かつ、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を効果的に高めることができる細胞凍結保存液や、当該細胞凍結保存液を用いた哺乳動物細胞の凍結保存方法を提供することを課題とする。　２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコールを含む液を、哺乳動物細胞凍結保存液として用いる。

Description

哺乳動物細胞凍結保存液
　本発明は、２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコール（以下、「ＰＧ」ということがある）を含む哺乳動物細胞凍結保存液（以下、「本件凍結保存液」ということがある）や、哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液を、凍結保存する工程（ａ）を含む、哺乳動物細胞を凍結保存する方法（以下、「本件凍結保存方法」ということがある）等に関する。
　細胞の凍結保存は、細胞生物学の研究において必要不可欠な技術として広く利用されてきた。近年、細胞凍結保存技術は、世界中の細胞バンクにて種々の株化細胞の保存のみならず、畜産業界における種の保存、家畜増産のための精子、卵子、又は受精卵の凍結保存や、生殖医療における生殖細胞の凍結保存等に応用されている。
　胚性幹細胞（Embryonic Stem cell；ＥＳ細胞)や人工多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem cell；ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞は、無限の増殖能力と多様な組織細胞への多分化能を有する細胞である。ヒト多能性幹細胞は、その性質を利用して再生医療への応用が期待されており、それを実現するためには質の高い細胞凍結技術、すなわち解凍後に高い細胞生存率や未分化性を保障する細胞凍結技術の確立は必須である。
　細胞の凍結保存方法は、一般に緩慢凍結法と急速凍結法（ガラス化法）に大別される。緩慢凍結法は、グリセリン、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」ということがある）、ケラチン加水分解物、加水分解ゼラチン、血清、血清アルブミン等を凍結保護剤として含む凍結保存液（特許文献１～５）中に細胞を懸濁し、１分に１℃程度に温度を下げて徐々に凍結する方法である。緩慢に冷却することにより細胞内の水分子が凍結保護剤と置換し、脱水され、細胞内や細胞周辺部の氷結晶の成長が抑えられ、細胞膜及び細胞内構造の損傷や、タンパク質の変性及び切断を防ぐ（非特許文献１)。最近では、胚を凍結保存する場合は除き、一般的な細胞を凍結保存する場合は、プログラムフリーザーを用いて温度調節を厳密に制御しなくても、発砲スチロールの箱や市販の細胞凍結ボックスを用いて緩慢に凍結できることがわかってきた。このような方法は簡便であることから、簡易緩慢凍結法とも呼ばれ、研究室や細胞バンク等で広く用いられている。
　他方、ガラス化法は、凍結による細胞内外の氷結晶生成を抑制するため、急速な冷却によりガラス状に凍結させる方法である。ガラス化法は、１９３７年に報告されてから実用化までの技術開発に長い期間を要したが、１９８５年に高濃度のＤＭＳＯ、アセトアミド、ＰＧ、及びポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）からなる凍結保護剤を含むガラス化保存液を用いる方法が開発された。この方法の開発により、マウス初期胚の凍結保存や、緩慢凍結法では困難であったウシ胚やブタ胚の凍結保存が可能となった。現在、胚バンクをはじめ多くの機関でガラス化法が用いられている。
　最近、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の凍結保存液の開発や、凍結保存方法の改良が盛んに行なわれている。例えば、ヒトＥＳ細胞を５％ＤＭＳＯ、１０％ウシ胎児血清（Fetal bovine serum；ＦＢＳ）、及び１０％エチレングリコール（ＥＧ）を含む凍結保存液中に懸濁し、簡易緩慢凍結法を用いて凍結保存すると、融解後の細胞生存率が高まることが報告されている（非特許文献２）。また、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を凍結保存液（STEM-CELLBANKER［日本全薬工業社製］）中に懸濁し、簡易緩慢凍結法を用いて凍結保存すると、融解後の細胞生存率が高まることも報告されている（非特許文献３）。
　また、トレハロース等の糖類と、ＰＧを含み、かつ、ＤＭＳＯ、増粘剤、及び天然の動物由来成分を含まない細胞凍結保存用溶液が提案されている（特許文献６）。また、タウリン、グリシン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一つと、ＤＭＳＯを除く凍結保護剤と、水溶性多糖類と、オリゴ糖類とを含む動物細胞凍結保存液も提案されている（特許文献７）。
国際公開第２００３／０６４６３４号パンフレット 特開平６－４６８４０号公報 特開平７－２５５４６９号公報 特開平８－３２５１０１号公報 特開２００２－２３３３５６号公報 国際公開第２０１９／１７２１１２号パンフレット 特開２０２１－０００２７号公報
J. R. Dobrinsky，Theriogenology， 45，17-26 (1996） Y. S. Ha et al., Human Reprod., 20, 1779-1785 (2005) F. Holm et al., Human Reprod., 25, 1271-1279 (2010)
　本発明の課題は、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死を効果的に抑制でき、かつ、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を効果的に高めることができる細胞凍結保存液や、当該細胞凍結保存液を用いた哺乳動物細胞の凍結保存方法を提供することにある。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、２．５～５％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、２．５～５％のＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能が高いことを見いだした（例えば、後述する実施例の図１～３）。また、２．５～５％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、２．５～５％以外の濃度のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を効果的に高めることができることを確認した（例えば、後述する実施例の図４及び図８）。さらに、２．５～８．７５％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、２．５～８．７５％以外の濃度のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死をより効果的に抑制できることを確認した（例えば、後述する実施例の図７）。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコールを含む哺乳動物細胞凍結保存液。
〔２〕プロピレングリコールの濃度が２．５～５．０（ｖ／ｖ）％であり、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を高めるために用いられる、上記〔１〕に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔３〕デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩；及び、ヒドロキシエチルデンプン若しくはその誘導体又はそれらの塩；から選択される高分子化合物をさらに含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔４〕トレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩をさらに含む、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔５〕２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコールを含む等張液である、上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔６〕等張液が、乳酸リンゲル液、生理食塩水、リンゲル液、及び酢酸リンゲル液から選択される、上記〔５〕に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔７〕哺乳動物細胞が、間葉系幹細胞、Ｔ細胞、又は造血系幹細胞である、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔８〕哺乳動物細胞を含む、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔９〕哺乳動物細胞が、間葉系幹細胞、Ｔ細胞、又は造血系幹細胞である、上記〔８〕に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔１０〕臍帯血を含む、上記〔９〕に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔１１〕上記〔８〕～〔１０〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液を、凍結保存する工程（ａ）を含む、哺乳動物細胞を凍結保存する方法。
〔１２〕工程（ａ）の後、哺乳動物細胞を凍結融解し、５日間以上培養する工程（ｂ）をさらに含む、上記〔１１〕に記載の方法。
　本発明によると、２．５～８．７５％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、２．５～８．７５％以外の濃度のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死を効果的に抑制でき、かつ、２．５～５％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、２．５～５％以外の濃度のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合や、２．５～５％のＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を効果的に高めることができるため、再生医療における良質な移植用哺乳動物細胞含有液を提供することができる。
図１Ａは、１．２５～１０％のＤＭＳＯを含む、４種類の細胞凍結保存液（１．２５％のＤＭＳＯ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「１．２５％ＤＭＳＯ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］；２．５％のＤＭＳＯ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「２．５％ＤＭＳＯ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］；５％のＤＭＳＯ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「５％ＤＭＳＯ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］；並びに、１０％のＤＭＳＯ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「１０％ＤＭＳＯ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］）中にｈＡＤ－ＭＳＣを３１日間凍結保存し、融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図中の「＊」及び「＊＊」は、「１０％ＤＭＳＯ」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）を示す。図１Ｂは、１．２５～１０％のＰＧを含む、４種類の細胞凍結保存液（１．２５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「１．２５％ＰＧ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］；２．５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「２．５％ＰＧ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］；５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「５％ＰＧ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］；並びに、１０％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「１０％ＰＧ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］）中にｈＡＤ－ＭＳＣを３１日間凍結保存し、融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図中の「＊」及び「＊＊」は、「１０％ＰＧ」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）を示す。 図１の結果を基に、ＤＭＳＯとＰＧが同じ濃度の細胞凍結保存液について比較した結果を示す図である。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、培養日数が同じサンプル間で、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）を示す。 ４％のＰＧ又は４％のＤＭＳＯを含むトレハロース及びデキストラン含有細胞凍結保存液（４％のＰＧ、２．８８％のトレハロース、及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「４％ＰＧ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］；並びに、４％のＤＭＳＯ、２．８８％のトレハロース、及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「４％ＤＭＳＯ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］）中にｈＡＤ－ＭＳＣを２３日間凍結保存し、融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能と、凍結保存しなかったｈＡＤ－ＭＳＣ（図中の「－」）の細胞増殖能を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝６）を示す図である。図中の「＊」及び「＊＊＊」は、培養日数が同じ「－」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１）を示す。 １．２５～１０％のＰＧを含む、４種類の基液（ＬＲ［図４Ａ］；デキストラン含有ＬＲ［図４Ｂ］；トレハロース含有ＬＲ［図４Ｃ］；並びに、トレハロース及びデキストラン含有ＬＲ［図４Ｄ］）中にｈＡＤ－ＭＳＣを４４日間（図４Ａ及び４Ｂ）又は２９日間（図４Ｃ及び４Ｄ）凍結保存し、融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、培養日数が同じサンプル間で、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）を示す。 ５％のＰＧを含む、４種類の基液（生理食塩水［ＰＧ／Ｓ］、リンゲル液［ＰＧ／Ｒ］、酢酸リンゲル液［ＰＧ／ＡＲ］、及び乳酸リンゲル液［ＰＧ／ＬＲ］）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存するか（それぞれ、図中の黒色棒グラフ）、又は、５％のＰＧ及び４．７５％のデキストランを含む、上記４種類の基液（それぞれ「ＰＧ＋Ｄ／Ｓ」、「ＰＧ＋Ｄ／Ｒ」、「ＰＧ＋Ｄ／ＡＲ」、及び「ＰＧ＋Ｄ／ＬＲ」）中にｈＡＤ－ＭＳＣを３３日間凍結保存し、融解直後の細胞生存率（図５Ａ）、生存細胞回収率（図５Ｂ）、及びアネキシンＶ陽性率（図５Ｃ）を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図中の「＊」は、それぞれに対応する「ＰＧ」に対して統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５）を示す。 図６Ａは、５％のＰＧを含む生理食塩水（図中の「ＰＧ／Ｓ」）又は５％のＰＧ及び４．７５％のデキストランを含む生理食塩水（図中の「ＰＧ＋Ｄ／Ｓ」）中にｈＡＤ－ＭＳＣを７０日間凍結保存し、融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図６Ｂは、５％のＰＧを含むリンゲル液（図中の「ＰＧ／Ｒ」）又は５％のＰＧ及び４．７５％のデキストランを含むリンゲル液（図中の「ＰＧ＋Ｄ／Ｒ」）中にｈＡＤ－ＭＳＣを７０日間凍結保存し、融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図６Ｃは、５％のＰＧを含む酢酸リンゲル液（図中の「ＰＧ／ＡＲ」）又は５％のＰＧ及び４．７５％のデキストランを含む酢酸リンゲル液（図中の「ＰＧ＋Ｄ／ＡＲ」）中にｈＡＤ－ＭＳＣを７０日間凍結保存し、融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図６Ｄは、５％のＰＧを含む乳酸リンゲル液（図中の「ＰＧ／ＬＲ」）又は５％のＰＧ及び４．７５％のデキストランを含む乳酸リンゲル液（図中の「ＰＧ＋Ｄ／ＬＲ」）中にｈＡＤ－ＭＳＣを７０日間凍結保存し、融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。 １．２５～１０％のＰＧ及びデキストラン含有細胞凍結保存液、すなわち、８種類の細胞凍結保存液（１．２５％ＰＧ及び４．９４％デキストラン含有ＬＲ［図中の「１．２５％」］；２．５％ＰＧ及び４．８８％デキストラン含有ＬＲ［図中の「２．５％」］；３．７５％ＰＧ及び４．８１％デキストラン含有ＬＲ［図中の「３．７５％」］；５％ＰＧ及び４．７５％デキストラン含有ＬＲ［図中の「５％」］；６．２５％ＰＧ及び４．６９％デキストラン含有ＬＲ［図中の「６．２５％」］；７．５％ＰＧ及び４．６３％デキストラン含有ＬＲ［図中の「７．５％」］；８．７５％ＰＧ及び４．５６％デキストラン含有ＬＲ［図中の「８．７５％」］；並びに、１０％ＰＧ及び４．５％デキストラン含有ＬＲ［図中の「１０％」］）中にｈＡＤ－ＭＳＣを４０日間凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率（図７Ａ）、生存細胞回収率（図７Ｂ）、及びアネキシンＶ陽性率（図７Ｃ）を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝４）を示す図である。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、「１０％」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）を示す。 図７における８種類の細胞凍結保存液中にｈＡＤ－ＭＳＣを２８日間凍結保存し、融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図中の「＊」及び「＊＊」は、「１０％ＰＧ及び４．５％デキストラン含有ＬＲ」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）を示す。 ４％のＰＧ及び０～９．６％のデキストラン含有細胞凍結保存液、すなわち、６種類の細胞凍結保存液（４％のＰＧ含有ＬＲ［図中の「０％」］；４％のＰＧ及び１．２％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「１．２％」］；４％のＰＧ及び２．４％のデキストラン含有ＬＲ［図中の２．４％］；４％のＰＧ及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ［図中の４．８％］；４％のＰＧ及び７．２％のデキストラン含有ＬＲ［図中の７．２％］；並びに、４％のＰＧ及び９．６％のデキストラン含有ＬＲ［図中の９．６％］）中にｈＡＤ－ＭＳＣを３８日間凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率（図９Ａ）、生存細胞回収率（図９Ｂ）、及びアネキシンＶ陽性率（図９Ｃ）を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝４）を示す図である。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、「０％」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）を示す。 ６種類の細胞凍結保存液（４％のＰＧ含有ＬＲ［図中の「４％ＰＧ」］；１０％のＰＧ含有ＬＲ［図中の「１０％ＰＧ」］；４％のＰＧ及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「４％ＰＧ＋Ｄ」］；１０％のＰＧ及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「１０％ＰＧ＋Ｄ」］；４％のＰＧ及び４．８％のＨＥＳ含有ＬＲ［図中の「４％ＰＧ＋ＨＥＳ」］；並びに、１０％のＰＧ及び４．５％のＨＥＳ含有ＬＲ［図中の「１０％ＰＧ＋ＨＥＳ」］）中にｈＡＤ－ＭＳＣを２４日間凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率（図１０Ａ）、生存細胞回収率（図１０Ｂ）、及びアネキシンＶ陽性率（図１０Ｃ）を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図中の「＊」は、Dunnett's testにより統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５）を示し、図中の「†」及び「††」は、Student’s t testにより、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）を示す。 ６種類の細胞凍結保存液（４％のＰＧ及び２．８８％のトレハロース含有ＬＲ［図中の「４％ＰＧ＋Ｔｒｅ」］；１０％のＰＧ及び２．７％のトレハロース含有ＬＲ［図中の「１０％ＰＧ＋Ｔｒｅ」］；４％のＰＧ、２．８８％のトレハロース、及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「４％ＰＧ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］；１０％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「１０％ＰＧ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］；４％のＰＧ、２．８８％のトレハロース、及び４．８％のＨＥＳ含有ＬＲ［図中の「４％ＰＧ＋Ｔｒｅ＋ＨＥＳ」］；並びに、１０％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のＨＥＳ含有ＬＲ［図中の「１０％ＰＧ＋Ｔｒｅ＋ＨＥＳ」］）中にｈＡＤ－ＭＳＣを２４日間凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率（図１１Ａ）、生存細胞回収率（図１１Ｂ）、及びアネキシンＶ陽性率（図１１Ｃ）を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図中の「＊」及び「＊＊」は、Dunnett's testにより、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）を示し、図中の「†」は、Student’s t testにより統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５）を示す。 ３種類の細胞凍結保存液（２．５％のＰＧ含有乳酸リンゲル液［図中の「ＰＧ」］；２．５％のＰＧ及び２．９２５％のトレハロース含有乳酸リンゲル液［図中の「ＰＧ＋Ｔｒｅ」］；並びに２．５％のＰＧ、２．９２５％のトレハロース、及び４．８７５％のデキストラン含有乳酸リンゲル液［図中の「ＰＧ＋Ｔｒｅ＋Ｄ」］）中にヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）を２８日間凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率（図１２Ａ）、生存細胞回収率（図１２Ｂ）、及びアネキシンＶ陽性率（図１２Ｃ）を解析した結果（平均値±標準偏差［ＳＤ］、ｎ＝４）を示す図である。図中の「＊」及び「＊＊＊」は、「ＰＧ」に対してそれぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１）を示す。 ５種類の糖類（グルコース、フルクトース、トレハロース、スクロース、又はラクトース）を含む、４％のＰＧ含有細胞凍結保存液（それぞれ、図中の「＋Ｇｌｕ」、「＋Ｆｌｕ」、「＋Ｔｒｅ」、「＋Ｓｕｃ」、及び「＋Ｌａｃ」）、又はこれら糖類不含の４％のＰＧ含有細胞凍結保存液（図中の「－」）中にｈＡＤ－ＭＳＣを３５日間凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率（図１３Ａ）及び生存細胞回収率（図１３Ｂ）を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝４）を示す図である。図中の「＊」は、「－」に対して、統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５）を示す。 ４％のＰＧ及び０～１１．５２％のトレハロース含有細胞凍結保存液、すなわち、６種類の細胞凍結保存液（４％のＰＧ含有ＬＲ［図中の「０％」］；４％のＰＧ及び０．７２％のトレハロース含有ＬＲ［図中の「０．７２％」］；４％のＰＧ及び１．４４％のトレハロース含有ＬＲ［図中の「１．４４％」］；４％のＰＧ及び２．８８％のトレハロース含有ＬＲ［図中の「２．８８％」］；４％のＰＧ及び５．７６％のトレハロース含有ＬＲ［図中の「５．７６％」］；並びに、４％のＰＧ及び１１．５２％のトレハロース含有ＬＲ［図中の「１１．５２％」］）中にｈＡＤ－ＭＳＣを３２日間凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率（図１４Ａ）、生存細胞回収率（図１４Ｂ）、及びアネキシンＶ陽性率（図１４Ｃ）を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝４）を示す図である。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、「０％」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）を示す。 ４％のＰＧを含む、３種類の基液（血清含有培養液［図中の「ＰＧ＋Ｍｅｄ」］、トレハロース含有ＬＲ［図中の「ＰＧ＋Ｔｒｅ」］、及びＬＲ［図中の「ＰＧ」］）に懸濁したｈＣＤ８陽性Ｔ細胞について、凍結保存前の細胞生存率（図１５Ａ）と、４６～１６７日間凍結保存し、融解直後（０時間）、融解後１時間、３時間、及び６時間の細胞生存率（図１５Ａ）並びに生存細胞回収率（図１５Ｂ）とを解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝４）を示す図である。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、「ＰＧ＋Ｍｅｄ」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）を示し、図中の「†」、「††」、及び「†††」は、「ＰＧ＋Ｔｒｅ」と「ＰＧ」の２群比較において、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）を示す。 ２～７．５％のＰＧ含有細胞凍結保存液、すなわち、５種類の細胞凍結保存液（２％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「２」］；３％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「３」］；４％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「４」］；５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「５」］；並びに、７．５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ［図中の「７．５」］）に懸濁したｈＣＤ８陽性Ｔ細胞について、凍結保存前の細胞生存率（図１６Ａ）と、５４～７４日間凍結保存し、融解直後（０時間）及び融解後３時間の細胞生存率（図１６Ａ）及び生存細胞回収率（図１６Ｂ）とを解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝４）を示す図である。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、「２」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）を示し、図中の「†」及び「†††」は、「７．５」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１）を示す。 図１６で使用した２～７．５％のＰＧ含有細胞凍結保存液中にｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を４６日間凍結保存し、融解直後のｈＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞生存率（図１７Ａ）、生存細胞回収率（図１７Ｂ）、及びアネキシンＶ陽性率（図１７Ｃ）を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、「２％」に対して、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）を示す。 図１６で使用した２～７．５％のＰＧ含有細胞凍結保存液中にｈＣＤ４陽性Ｔ細胞を４０～４４日間凍結保存し、融解直後のｈＣＤ４陽性Ｔ細胞の細胞生存率（図１８Ａ）、生存細胞回収率（図１８Ｂ）、及びアネキシンＶ陽性率（図１８Ｃ）を解析した結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝６）を示す図である。図中の「＊＊＊」は、「２％」に対して、統計学的に有意差があること（ｐ＜０．００１）を示す。図中の「††」は、「７．５％」に対して、統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０１）を示す。 凍結保存前のｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞の細胞生存率及びＣＤ３４陽性率を解析するとともに、図１６で使用した２～７．５％のＰＧ含有細胞凍結保存液中にｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞を１４日間凍結保存し、融解直後のｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞の細胞生存率及びＣＤ３４陽性率を解析し、細胞生存率（図１９Ａ）及びＣＤ３４陽性率の比（凍結保存前に対する凍結融解直後のＣＤ３４陽性率の比）（図１９Ｂ）の結果（平均値±ＳＤ、ｎ＝４）を示す図である。図中の「＊」は、「２％」に対して、統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５）を示す。
　本発明の哺乳動物細胞凍結保存液は、「哺乳動物細胞を凍結保存するため」という用途に特定された、２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコールを含む液（すなわち、本件凍結保存液）である。プロピレングリコールの濃度が２．５～５．０（ｖ／ｖ）％である本件凍結保存液は、２．５～５．０（ｖ／ｖ）％以外の濃度のプロピレングリコールを含む細胞凍結保存液中や、ＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を効果的に高めることができる。このため、プロピレングリコールの濃度が２．５～５．０（ｖ／ｖ）％である本件凍結保存液は、「凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を高めるため」という用途に特定されたものであってもよい。
　また、本件凍結保存液（２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコールを含む液）は、ＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液中や、２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％以外の濃度のプロピレングリコールを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、解凍後の室温（１℃～３０℃）保存において細胞生存率を高値に保つことができる。このため、本件凍結保存液は、「凍結融解後の哺乳動物細胞の細胞生存率を高めるため」という用途に特定されたものであってもよい。
　本発明の哺乳動物細胞を凍結保存する方法としては、哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液を、凍結保存する（換言すると、哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に凍結保存する）工程（ａ）を含む方法（すなわち、本件凍結保存方法）であれば特に制限されず、かかる工程（ａ）において、哺乳動物細胞を、緩慢凍結法を用いて凍結し、その後保存してもよいし、急速凍結法（ガラス化法）を用いて凍結し、その後保存してもよい。かかる緩慢凍結法としては、例えば、哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液を、細胞保存用チューブやバイアルに移し、低温フリーザーや超低温フリーザー（通常－２０℃～－１５０℃の範囲内）中で凍結し、その後、液体窒素（通常－１５０℃～－１９６℃の範囲内）中で保存する方法を挙げることができる。上記急速凍結法としては、例えば、哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に懸濁後、必要に応じてストロー内に移し、液体窒素（通常－１５０℃～－１９６℃の範囲内）中で急速冷凍し、保存する方法を挙げることができる。
　本明細書において、プロピレングリコールの濃度としては、２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％の範囲内であればよく、例えば、
２．５～７．５％、２．５～６．２５％、２．５～５．０％、２．５～４．９％、２．５～４．８％、２．５～４．６％、２．５～４．４％、２．５～４．２％、２．５～４．０％、２．５～３．８％、２．５～３．６％、２．５～３．４％、２．５～３．２％、２．５～３．０％、２．５～２．８％、２．５～２．６％、２．６～８．７５％、２．８～８．７５％、３．０～８．７５％、３．２～８．７５％、３．４～８．７５％、３．６～８．７５％、３．８～８．７５％、４．０～８．７５％、４．２～８．７５％、４．４～８．７５％、４．６～８．７５％、４．８～８．７５％、５．０～８．７５％、６．２５～８．７５％、７．５～８．７５％、２．６～７．５％、２．６～６．２５％、２．６～５．０％、２．６～４．９％、２．６～４．８％、２．６～４．６％、２．６～４．４％、２．６～４．２％、２．６～４．０％、２．６～３．８％、２．６～３．６％、２．６～３．４％、２．６～３．２％、２．６～３．０％、２．６～２．８％、２．８～７．５％、２．８～６．２５％、２．８～５．０％、２．８～４．９％、２．８～４．８％、２．８～４．６％、２．８～４．４％、２．８～４．２％、２．８～４．０％、２．８～３．８％、２．８～３．６％、２．８～３．４％、２．８～３．２％、２．８～３．０％、３．０～７．５％、３．０～６．２５％、３．０～５．０％、３．０～４．９％、３．０～４．８％、３．０～４．６％、３．０～４．４％、３．０～４．２％、３．０～４．０％、３．０～３．８％、３．０～３．６％、３．０～３．４％、３．０～３．２％、３．２～７．５％、３．２～６．２５％、３．２～５．０％、３．２～４．９％、３．２～４．８％、３．２～４．６％、３．２～４．４％、３．２～４．２％、３．２～４．０％、３．２～３．８％、３．２～３．６％、３．２～３．４％、３．４～７．５％、３．４～６．２５％、３．４～５．０％、３．４～４．９％、３．４～４．８％、３．４～４．６％、３．４～４．４％、３．４～４．２％、３．４～４．０％、３．４～３．８％、３．４～３．６％、３．６～７．５％、３．６～６．２５％、３．６～５．０％、３．６～４．９％、３．６～４．８％、３．６～４．６％、３．６～４．４％、３．６～４．２％、３．６～４．０％、３．６～３．８％、３．８～７．５％、３．８～６．２５％、３．８～５．０％、３．８～４．９％、３．８～４．８％、３．８～４．６％、３．８～４．４％、３．８～４．２％、３．８～４．０％、４．０～７．５％、４．０～６．２５％、４．０～５．０％、４．０～４．９％、４．０～４．８％、４．０～４．６％、４．０～４．４％、４．０～４．２％、４．２～７．５％、４．２～６．２５％、４．２～５．０％、４．２～４．９％、４．２～４．８％、４．２～４．６％、４．２～４．４％、４．４～７．５％、４．４～６．２５％、４．４～５．０％、４．４～４．９％、４．４～４．８％、４．４～４．６％、４．６～７．５％、４．６～６．２５％、４．６～５．０％、４．６～４．９％、４．６～４．８％、４．８～７．５％、４．８～６．２５％、４．８～５．０％、４．８～４．９％、４．９～７．５％、４．９～６．２５％、４．９～５．０％、５．０～７．５％、５．０～６．２５％、６．２５～７．５％等を挙げることができる。
　本件凍結保存液としては、高分子化合物をさらに含むものが好ましい。本明細書において、高分子化合物とは、重量平均分子量（Ｍｗ）が１×１０４以上の化合物を意味する。かかる高分子化合物としては、例えば、デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「デキストラン類」ということがある）；ヒドロキシエチルデンプン（ヒドロキシエチルスターチともいう）若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「ヒドロキシエチルデンプン類」ということがある）；アルブミン；カルボキシメチルセルロース又はその塩；キサンタンガム又はその塩；ゼラチン；アミロペクチン又はその塩；等から選択される高分子化合物を挙げることができ、これらの中でも、後述する本実施例においてその効果が実証されているため、デキストラン類及びヒドロキシエチルデンプン類から選択される高分子化合物を好適に例示することができる。本件凍結保存液としては、デキストラン類及びヒドロキシエチルデンプン類以外の高分子化合物を含むものであってもよいが、含まないものであってもよい。
　上記デキストラン類におけるデキストランとしては、Ｄ－グルコースからなる多糖（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎであって、α１→６結合を主鎖とするものであれば特に制限されず、デキストランの重量平均分子量（Ｍｗ）としては、例えば、１×１０４～５×１０５の範囲内（例えば、デキストラン４０［Ｍｗ＝４００００］、デキストラン７０［Ｍｗ＝７００００］）を挙げることができる。これらデキストランは、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法で製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、デキストラン４０（東京化成工業社製）、デキストラン７０（東京化成工業社製）等の市販品を挙げることができる。
　上記デキストラン類におけるデキストラン誘導体としては、例えば、カルボキシル化デキストラン、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－デキストラン等を挙げることができる。
　上記ヒドロキシエチルデンプン類におけるヒドロキシエチルデンプンとしては、α－Ｄ－グルコースが直鎖状に結合（α－１，４結合）したアミロースと、分枝（α－１，６結合）を有するアミロペクチンとの混合物であって、グルコースユニットのＣ２、Ｃ３、及びＣ６の１又は２以上がヒドロキシエチル化されている物質（アミロペクチンの誘導体）であれば特に制限されず、ヒドロキシエチルデンプンのＭｗとしては、例えば、５×１０４～５×１０６（例えば、７×１０４、２×１０５）の範囲内を挙げることができる。また、上記ヒドロキシエチルデンプンの置換度（１グルコース単位当たりのヒドロキシエチル基数）としては、特に制限されず、例えば、０．４～０．８の範囲内（例えば、０．５０～０．５５）を挙げることができる。これらヒドロキシエチルデンプンは、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、ＨＥＳ（Fresenius Kabi Austria GmbH社製）等の市販品を挙げることができる。
　上記ヒドロキシエチルデンプン類におけるヒドロキシエチルデンプン誘導体としては、例えば、ＤＥＡＥ－ヒドロキシエチルデンプン等を挙げることができる。
　本件凍結保存液における高分子化合物の濃度としては、ＰＧとの併用効果が認められる限り特に制限されず、高分子化合物の濃度の下限値としては、例えば、１．０（ｗ／ｖ）％、１．２（ｗ／ｖ）％、１．４（ｗ／ｖ）％、１．６（ｗ／ｖ）％、１．８（ｗ／ｖ）％、２．０（ｗ／ｖ）％、２．２（ｗ／ｖ）％、２．４（ｗ／ｖ）％、２．６（ｗ／ｖ）％、２．８（ｗ／ｖ）％、３．０（ｗ／ｖ）％、３．２（ｗ／ｖ）％、３．４（ｗ／ｖ）％、３．６（ｗ／ｖ）％、３．８（ｗ／ｖ）％、４．０（ｗ／ｖ）％、４．２（ｗ／ｖ）％、４．４（ｗ／ｖ）％、４．６（ｗ／ｖ）％、４．８（ｗ／ｖ）％等を挙げることができる。また、本件凍結保存液における高分子化合物の濃度の上限値としては、例えば、２０（ｗ／ｖ）％、１６（ｗ／ｖ）％、１３（ｗ／ｖ）％、１０（ｗ／ｖ）％、９．８（ｗ／ｖ）％、９．６（ｗ／ｖ）％等を挙げることができる。
　したがって、上記高分子化合物の濃度としては、例えば、
１．０～２０％、１．２～２０％、１．４～２０％、１．６～２０％、１．８～２０％、２．０～２０％、２．２～２０％、２．４～２０％、２．６～２０％、２．８～２０％、３．０～２０％、３．２～２０％、３．４～２０％、３．６～２０％、３．８～２０％、４．０～２０％、４．２～２０％、４．４～２０％、４．６～２０％、４．８～２０％、１．０～１６％、１．２～１６％、１．４～１６％、１．６～１６％、１．８～１６％、２．０～１６％、２．２～１６％、２．４～１６％、２．６～１６％、２．８～１６％、３．０～１６％、３．２～１６％、３．４～１６％、３．６～１６％、３．８～１６％、４．０～１６％、４．２～１６％、４．４～１６％、４．６～１６％、４．８～１６％、１．０～１３％、１．２～１３％、１．４～１３％、１．６～１３％、１．８～１３％、２．０～１３％、２．２～１３％、２．４～１３％、２．６～１３％、２．８～１３％、３．０～１３％、３．２～１３％、３．４～１３％、３．６～１３％、３．８～１３％、４．０～１３％、４．２～１３％、４．４～１３％、４．６～１３％、４．８～１３％、１．０～１０％、１．２～１０％、１．４～１０％、１．６～１０％、１．８～１０％、２．０～１０％、２．２～１０％、２．４～１０％、２．６～１０％、２．８～１０％、３．０～１０％、３．２～１０％、３．４～１０％、３．６～１０％、３．８～１０％、４．０～１０％、４．２～１０％、４．４～１０％、４．６～１０％、４．８～１０％、１．０～９．８％、１．２～９．８％、１．４～９．８％、１．６～９．８％、１．８～９．８％、２．０～９．８％、２．２～９．８％、２．４～９．８％、２．６～９．８％、２．８～９．８％、３．０～９．８％、３．２～９．８％、３．４～９．８％、３．６～９．８％、３．８～９．８％、４．０～９．８％、４．２～９．８％、４．４～９．８％、４．６～９．８％、４．８～９．８％、１．０～９．６％、１．２～９．６％、１．４～９．６％、１．６～９．６％、１．８～９．６％、２．０～９．６、２．２～９．６％、２．４～９．６％、２．６～９．６％、２．８～９．６％、３．０～９．６％、３．２～９．６％、３．４～９．６％、３．６～９．６％、３．８～９．６％、４．０～９．６％、４．２～９．６％、４．４～９．６％、４．６～９．６％、４．８～９．６％等を挙げることができ、高分子化合物がデキストラン類の場合、１．２～９．６％が好ましく、２．４～９．６％がより好ましく、４．８～９．６％がさらに好ましい。
　高分子化合物をさらに含む本件凍結保存液におけるプロピレングリコール及び高分子化合物の重量比の範囲としては、例えば、１：０．１～１：１０、１：０．１～１：８、１：０．１～１：６、１：０．１～１：４、１：０．２～１：１０、１：０．２～１：８、１：０．２～１：６、１：０．２～１：４、１：０．３～１：１０、１：０．３～１：８、１：０．３～１：６、１：０．３～１：４、１：０．４～１：１０、１：０．４～１：８、１：０．４～１：６、１：０．４～１：４、１：０．５～１：１０、１：０．５～１：８、１：０．５～１：６、１：０．５～１：４等を挙げることができ、高分子化合物がデキストラン類の場合、１：０．１～１：４が好ましく、１：０．３～１：４がより好ましく、１：０．５～１：４がさらに好ましい。
　本件凍結保存液としては、トレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「トレハロース類」ということがある）をさらに含むものが好ましい。トレハロース類におけるトレハロースとしては、２つのα-グルコースが１，１－グリコシド結合した二糖類であるα，α－トレハロースの他に、α-グルコースとβ－グルコースとが１，１－グリコシド結合した二糖類であるα，β－トレハロースや、２つのβ－グルコースが１，１－グリコシド結合した二糖類であるβ，β－トレハロースを挙げることができるが、これらの中でもα，α－トレハロースが好ましい。これらトレハロースは、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、トレハロース二水和物（富士フィルム和光純薬社製）等の市販品を挙げることができる。
　上記トレハロース類におけるトレハロース誘導体としては、二糖類のトレハロースに１又は複数の糖単位が結合したグリコシルトレハロース類であれば特に制限されず、グリコシルトレハロース類には、グルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、マルトトリオシルトレハロース等が含まれる。
　本件凍結保存液におけるトレハロース類の濃度としては、ＰＧとの併用効果が認められる限り特に制限されず、トレハロース類の濃度の下限値としては、例えば、０．７（ｗ／ｖ）％、０．８（ｗ／ｖ）％、０．９（ｗ／ｖ）％、１．０（ｗ／ｖ）％、１．１（ｗ／ｖ）％、１．２（ｗ／ｖ）％、１．３（ｗ／ｖ）％、１．４（ｗ／ｖ）％等を挙げることができる。また、本件凍結保存液におけるトレハロース類の濃度の上限値としては、例えば、４０（ｗ／ｖ）％、３５（ｗ／ｖ）％、３０（ｗ／ｖ）％、２５（ｗ／ｖ）％、２０（ｗ／ｖ）％、１５（ｗ／ｖ）％、１２（ｗ／ｖ）％、６．０（ｗ／ｖ）％等を挙げることができる。
　したがって、上記トレハロース類の濃度としては、例えば、
０．７～４０％、０．８～４０％、０．９～４０％、１．０～４０％、１．１～４０％、１．２～４０％、１．３～４０％、１．４～４０％、０．７～３５％、０．８～３５％、０．９～３５％、１．０～３５％、１．１～３５％、１．２～３５％、１．３～３５％、１．４～３５％、０．７～３０％、０．８～３０％、０．９～３０％、１．０～３０％、１．１～３０％、１．２～３０％、１．３～３０％、１．４～３０％、０．７～２５％、０．８～２５％、０．９～２５％、１．０～２５％、１．１～２５％、１．２～２５％、１．３～２５％、１．４～２５％、０．７～２０％、０．８～２０％、０．９～２０％、１．０～２０％、１．１～２０％、１．２～２０％、１．３～２０％、１．４～２０％、０．７～１５％、０．８～１５％、０．９～１５％、１．０～１５％、１．１～１５％、１．２～１５％、１．３～１５％、１．４～１５％、０．７～１２％、０．８～１２％、０．９～１２％、１．０～１２％、１．１～１２％、１．２～１２％、１．３～１２％、１．４～１２％、０．７～６．０％、０．８～６．０％、０．９～６．０％、１．０～６．０％、１．１～６．０％、１．２～６．０％、１．３～６．０％、１．４～６．０％等を挙げることができる。
　トレハロース類をさらに含む本件凍結保存液におけるプロピレングリコール及びトレハロース類の重量比の範囲としては、例えば、１：０．０８～１：１６、１：０．０８～１：１４、１：０．０８～１：１２、１：０．０８～１：１０、１：０．０８～１：８、１：０．０８～１：６、１：０．０８～１：４、１：０．０８～１：２．４、１：０．１～１：１６、１：０．１～１：１４、１：０．１～１：１２、１：０．１～１：１０、１：０．１～１：８、１：０．１～１：６、１：０．１～１：４、１：０．１～１：２．４、１：０．１２～１：１６、１：０．１２～１：１４、１：０．１２～１：１２、１：０．１２～１：１０、１：０．１２～１：８、１：０．１２～１：６、１：０．１２～１：４、１：０．１２～１：２．４、０．１４～１：１６、１：０．１４～１：１４、１：０．１４～１：１２、１：０．１４～１：１０、１：０．１４～１：８、１：０．１４～１：６、１：０．１４～１：４、１：０．１４～１：２．４、０．１６～１：１６、１：０．１６～１：１４、１：０．１６～１：１２、１：０．１６～１：１０、１：０．１６～１：８、１：０．１６～１：６、１：０．１６～１：４、１：０．１６～１：２．４等を挙げることができる。
　本件凍結保存液は、２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコールを含む、哺乳動物細胞の凍結保存が可能な液（例えば、等張液、低張液、高張液）であり、２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコールを含む等張液が好ましい。本明細書において「等張液」とは、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じ浸透圧を有する液を意味し、具体的には、２５０～３８０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内の浸透圧を有する液を意味する。また、本明細書において「低張液」とは、体液や細胞液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する液を意味し、具体的には、２５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の浸透圧を有する液を意味する。かかる低張液としては、細胞が破裂しない程度の低張液（具体的には、１００～２５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の範囲内の浸透圧を有する液）が好ましい。また、本明細書において「高張液」とは、体液や細胞液の浸透圧よりも高い浸透圧を有する液を意味し、具体的には、浸透圧が３８０ｍＯｓｍ／Ｌ超（好ましくは３８０ｍＯｓｍ／Ｌ超～１０００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内）を意味する。
　上記等張液としては、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるようにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等によって塩濃度や糖濃度等を調整した等張液であれば特に制限されず、具体的には生理食塩水や、緩衝効果のある生理食塩水（例えば、ＰＢＳ、トリス緩衝生理食塩水［Tris Buffered Saline；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、５％グルコース水溶液、動物細胞培養用基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９）、等張剤（例えば、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム）等を挙げることができ、これらの中でも、後述する本実施例においてその効果が実証されているため、乳酸リンゲル液、生理食塩水、リンゲル液、及び酢酸リンゲル液から選択される等張液を好適に例示することができる。等張液は、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販のものとしては、大塚生食注（大塚製薬工場社製）（生理食塩液）、リンゲル液「オーツカ」（大塚製薬工場社製）（リンゲル液）、ラクテック（登録商標）注（大塚製薬工場社製）（乳酸リンゲル液）、ヴィーン（登録商標）Ｆ輸液（扶桑薬品工業社製）（酢酸リンゲル液）、大塚糖液５％（大塚製薬工場社製）（５％グルコース水溶液）、ビカネイト（登録商標）輸液（大塚製薬工場社製）（重炭酸リンゲル液）を挙げることができる。
　本件凍結保存液としては、ＰＧ以外の凍結保護成分（例えば、ＤＭＳＯ；グリセロール；エチレングリコール；ＰＥＧ；セリシン；イソマルトオリゴ糖；ヒト、ウシ等由来の血清）を含むものであってもよいが、ＰＧ単独で、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を効果的に高めることができるため、ＰＧ以外の凍結保護成分を含まないものが好ましい。
　本件凍結保存液としては、トレハロース類以外のオリゴ糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース等の二糖類；マルトトリオース、ラフィノース、メレジトース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類）や、単糖類（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース）を含むものであってもよいが、含まないものであってもよい。
　本件凍結保存液には、通常、タウリン若しくはその誘導体又はそれらの塩；及び、グリシン若しくはその誘導体又はそれらの塩；から選択される物質は含まれない。かかるタウリン誘導体としては、例えば、Ｎ－置換タウリン（例えば、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸、２－モルフォリノエタンスルホン酸、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸等）、ヒポタウリン、チオタウリンなどを挙げることができる。上記グリシン誘導体としては、例えば、サルコシン（Ｎ－メチルグリシン）、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－プロピルグリシン、Ｎ，Ｎ－ジエチルグリシン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、Ｎ－アミジノグリシン、Ｎ－アミジノ－Ｎ－メチルグリシン、グリシルグリシン、フェナセツル酸、グリシンメチルエステル、グリシンエチルエステル、グリシンｎ－ブチルエステル、グリシンｔ－ブチルエステル、グリシンｎ－プロピルエステル、グリシンｎ－ペンチルエステル、グリシンベンジルエステル等を挙げることができる。タウリン、タウリン誘導体、グリシン、及びグリシン誘導体の「塩」としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などを挙げることができる。
　本明細書において、（デキストラン、デキストラン誘導体、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン誘導体、トレハロース、トレハロース誘導体、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、及びアミロペクチン）の「塩」としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、デキストラン、デキストラン誘導体、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン誘導体、トレハロース、トレハロース誘導体、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、及びアミロペクチンを用いた場合と同効なものが好ましい。（デキストラン、デキストラン誘導体、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン誘導体、トレハロース、トレハロース誘導体、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、及びアミロペクチン）の「塩」は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
　本件凍結保存液における任意成分としては、例えば、ビタミン類（例えば、塩化コリン、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサル、リボフラビン、塩酸チアミン、アスコルビン酸、ビオチン、イノシトール）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、サリチレート）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）、タンパク質、抗酸化物質（例えば、ポリフェノール、ケルセチン）等を挙げることができる。本明細書において「任意成分」とは、含んでもよいし含まなくてもよい成分のことを意味する。
　上記哺乳動物細胞の具体的な細胞としては、例えば、幹細胞（例えば、再生医療等に血管経由で投与される幹細胞）；膵島細胞（例えば、Ｉ型糖尿病患者に経静脈投与される膵島細胞）；Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞等のリンパ球系細胞；単球、マクロファージ、樹状細胞等の抗原提示細胞；好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞等の顆粒球；等を挙げることができ、後述する本実施例でその効果が実証されているため、Ｔ細胞を好適に例示することができる。かかるＴ細胞としては、アルファ・ベータＴ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ＮＫＴ細胞を挙げることができる。Ｔ細胞は、哺乳動物の骨髄、末梢血、臍帯血等から公知の一般的な方法で採取することができる。
　本明細書において、「哺乳動物」としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を例示することができ、中でも、マウス、ブタ、ヒトを好適に例示することができる。
　上記「幹細胞」とは、自己複製能及び分化・増殖能を有する未熟な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem ce11）、複能性幹細胞（multipotent stem ce11）、単能性幹細胞（unipotent stem ce11）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、それ自体では個体になることができないが、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞等を挙げることができる。ＥＳ細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＬＩＦを含む培地中で培養することにより製造することができる。ＥＳ細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することができる（Ce11,70:841-847,1992）。ｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（必要に応じてさらにｃ－Ｍｙｃ又はｎ－Ｍｙｃ）等のリプログラミング因子を導入することにより製造することができる（Ce11,126:p.663-676,2006;Nature,448:p.313-317,2007;Nat Biotechno1,26;p,101-106,2008;Cel1 131:p.861‐872,2007;Science,318:p.1917-1920,2007;Ce11 Stem Cells 1:p.55-70,2007;Nat Biotechnol,25:p.1177-1181,2007;Nature,448:p.318-324,2007;Cell Stem Cells 2:p.10-12,2008;Nature451:p.141-146,2008;Science,318:p.1917-1920,2007）。また、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞として好ましい（Nature,385,810（1997）；Science,280,1256（1998）；Nature Biotechnology,17,456（1999）；Nature,394,369（1998）；Nature Genetics,22,127（1999）；Proc.Nat1. Acad.Sci.USA,96,14984（1999））、Rideout IIIら（Nature Genetics,24,109（2000））。
　複能性幹細胞としては、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等の細胞に分化可能な間葉系幹細胞；白血球、赤血球、血小板等の血球系細胞に分化可能な造血系幹細胞（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、及びＣＤ１１７から選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーが陽性の造血系幹細胞、好ましくはＣＤ３４陽性造血系幹細胞）；ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等の細胞に分化可能な神経系幹細胞；骨髄幹細胞、生殖幹細胞等の体性幹細胞；等を挙げることができ、後述する本実施例においてその効果が実証されているため、間葉系幹細胞や造血系幹細胞を好適に例示することができる。複能性幹細胞は、自体公知の方法により、生体から単離することができる。例えば、間葉系幹細胞は、哺乳動物の骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血等から公知の一般的な方法で採取することができる。また、骨髄穿刺後の造血幹細胞等の培養、継代によりヒト間葉系幹細胞を単離することができる（Journal of Autoimmunity，30（2008）163-171）。例えば、造血系幹細胞は、哺乳動物の骨髄、末梢血、臍帯血等から公知の一般的な方法で採取することができる。複能性幹細胞は、上記多能性幹細胞を適切な誘導条件下で培養することによっても得ることができる。間葉系幹細胞は、好ましくはヒト脂肪由来の間葉系幹細胞である。また、造血系幹細胞は、好ましくはヒト由来のＣＤ３４陽性造血系幹細胞である。
　本件凍結保存液としては、哺乳動物細胞を含まない態様であっても、哺乳動物細胞を含む態様であってもよく、本件凍結保存方法を実施する場合、哺乳動物細胞を含む態様（すなわち、哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液）が好ましい。哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液は、任意の方法で調製することができ、例えば、１）哺乳動物細胞含有液を、遠心処理により、上清（液）と沈殿（哺乳動物細胞）とに分離した後、上清（液）を除き、沈殿（哺乳動物細胞）に本件凍結保存液を添加することにより調製する方法や、２）哺乳動物細胞含有液と混合したときに、本件凍結保存液に含まれる成分の終濃度が目的の濃度（例えば、ＰＧの場合、２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％）となるように調整した液を、哺乳動物細胞含有液と混合することにより調製する方法等を挙げることができる。哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液としては、臍帯血を含む本件凍結保存液が好ましい。臍帯血を含む本件凍結保存液は、例えば、上記２）の方法に従って、臍帯血（すなわち、造血系幹細胞等の哺乳動物細胞を含む液）と、ＰＧを含む液とを任意の比率（例えば、１０：１～１：１０［例えば、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０等］）で混合することにより調製することができる。
　本件凍結保存液中に保存する哺乳動物細胞として、付着性の細胞を例示することができる。本明細書中、「付着性」細胞とは、足場に接着することで生存、増殖、物質の生産を行なうことができる足場依存性の細胞を意味する。付着性幹細胞としては、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等を挙げることができる。付着性幹細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞である。
　本件凍結保存液中に保存する哺乳動物細胞（集団）は、生体内から分離されたものであっても、インビトロで継代培養されたものであってもよいが、単離又は精製されていることが好ましい。本明細書中、「単離又は精製」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された哺乳動物細胞の純度（全細胞数に対する、哺乳動物幹細胞数等の目的とする細胞の割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば１００％）である。
　本件凍結保存液中に保存する哺乳動物細胞（集団）は、単一細胞（シングルセル）の状態であることが好ましい。本明細書において、「単一細胞の状態」とは、他の細胞と寄り集まって塊を形成していないこと（即ち、凝集していない状態）を意味する。単一細胞の状態の哺乳動物細胞は、インビトロで培養した哺乳動物細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ等で酵素処理した後、ピペッティングやタッピング等の当該技術分野における周知の方法により細胞を懸濁することにより調製することができる。哺乳動物細胞中に含まれる単一細胞の状態の哺乳動物細胞の割合は、通常７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上（例えば１００％）である。単一細胞の状態の細胞の割合は、哺乳動物細胞をＰＢＳに分散し、これを顕微鏡下で観察し、無作為に選択された複数個（例えば、１０００個）の細胞について凝集の有無を調べることにより決定することができる。
　本件凍結保存方法としては、上記工程（ａ）の後、哺乳動物細胞を凍結融解し、培養する工程（ｂ）をさらに含む方法が好ましい。培養期間としては、例えば、１日間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上、７日間以上、８日間以上等を挙げることができるが、５日間以上が好ましい。
　上記工程（ｂ）において、哺乳動物細胞を凍結融解する方法としては特に制限されず、凍結した、哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液を含む容器（細胞保存用チューブ、細胞保存用バイアル、ストロー等）を、常温（例えば、１０～２８℃の範囲内）で自然解凍してもよいが、再凍結を防ぐ観点から、温水（例えば、３０～４０℃の範囲内の水）中に浸し、急速解凍することが好ましい。
　上記工程（ｂ）において、凍結融解後の哺乳動物細胞の培養は、適切な容器（培養プレート、培養ディッシュ、培養フラスコ等）内で適切な培養液の存在下で行う。かかる培養液としては、例えば、０．１～３０（ｖ／ｖ）％の血清（ＦＢＳ、ＣＳ等）を含む動物細胞培養用培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、αＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９、ＡＩＭ－Ｖ等）、MyeloCult H5100培地（STEMCELL Technologies社製、ST-05150）などを挙げることができる。また、血清不含の培養液（無血清培養液）としては、例えば、前述した、市販のＢ２７サプリメント（－インスリン）、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Knockout Serum Replacement等の血清代替物を適量（例えば、１～３０％）添加した上記動物細胞培養用培養液などを挙げることができる。
　上記工程（ｂ）において、凍結融解後の哺乳動物細胞の培養温度は、通常約３０～４０℃の範囲内であり、好ましくは３７℃である。また、培養時のＣＯ２濃度は、通常約１～１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、通常約７０～１００％の範囲内であり、好ましくは約９５～１００％の範囲内である。また、培養時のＯ２濃度は、正常酸素濃度（１８～２２％Ｏ２）であっても、低酸素濃度（０～１０％Ｏ２）であってもよい。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．方法
［検討１に用いた細胞凍結保存液の調製］
１）１０（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、セルストアＳ（大塚製薬工場社製）（すなわち、３（ｗ／ｖ）％のトレハロース及び５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有乳酸リンゲル液）とCultureSure（登録商標）ＤＭＳＯ（富士フイルム和光純薬工業社製）を９：１の比率で混合することにより調製した。
２）５（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；２．５（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、１．２５（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；は、上記「１０％のＤＭＳＯ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」を、セルストアＳにて２倍公比で希釈することにより調製した。
３）１０（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコール（ＰＧ）（丸石製薬社製）、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、セルストアＳとＰＧを９：１の比率で混合することにより調製した。
４）５（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；２．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、１．２５（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；は、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」を、セルストアＳにて２倍公比で希釈することにより調製した。
［検討２に用いた細胞凍結保存液の調製］
１）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．８８（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．８（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、０．４ｍＬの上記ＰＧと、９．６ｍＬのセルストアＳを混合することにより調製した。
２）４（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯ、２．８８（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．８（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、０．４ｍＬの上記ＤＭＳＯと、９．６ｍＬのセルストアＳを混合することにより調製した。
［検討３に用いた細胞凍結保存液の調製］
１）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲは、ラクテック注（大塚製薬工場社製）と上記ＰＧを９：１の比率で混合することにより調製した。
２）５（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲ、２．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲ、及び１．２５（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲは、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲ」をラクテック注にて２倍公比で希釈することにより調製した。
３）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、まず、５００ｍｇのデキストラン４０（Ｍｗ＝４００００、東京化成工業社製）を、１０ｍＬのラクテック注に溶解し、５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲを調製した後、５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲと、上記ＰＧを９：１の比率で混合することにより調製した。
４）５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；２．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．８８（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、１．２５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．９４（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；は、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」を上記「５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」にて２倍公比で希釈することにより調製した。
５）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲは、０．５ｍＬの上記ＰＧと、０．５ｍＬのセルストア（登録商標）Ｗ（大塚製薬工場社製）（すなわち、３（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有乳酸リンゲル液）を混合することにより調製した。
６）５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．８５（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲ；２．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．９２５（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲ；並びに、１．２５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．９６２５（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲ；は、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲ」をセルストアＷにて２倍公比で希釈することにより調製した。
７）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、前述した、検討１の３）で調製したものを用いた。
８）５（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．８５（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；２．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．９２５（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．８７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、１．２５（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．９６２５（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．９３７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；は、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」をセルストアＳにて２倍公比で希釈することにより調製した。
［検討４に用いた細胞凍結保存液の調製］
１）５（ｖ／ｖ）％のＰＧを含む４種類の基液（生理食塩水［Ｓ］、リンゲル液［Ｒ］、酢酸リンゲル液［ＡＲ］、及び乳酸リンゲル液［ＬＲ］）は、０．５ｍＬの上記ＰＧと、９．５ｍＬの４種類の基液（大塚生食注［大塚製薬工場社製］、リンゲル液「オーツカ」［大塚製薬工場社製］、ヴィーンＦ輸液［扶桑薬品工業社製］、及びラクテック注）とを混合することにより調製した。
２）５％（ｖ／ｖ）のＰＧ及び４．７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有Ｓは、まず、５００ｍｇのデキストラン４０（Ｍｗ＝４００００、東京化成工業社製）を、１０ｍＬのラクテック注に溶解し、５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲを調製した後、０．５ｍＬの上記ＰＧと、９．５ｍＬの上記「５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」とを混合することにより調製した。
３）５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有Ｒは、まず、５００ｍｇの上記デキストラン４０を、１０ｍＬのリンゲル液「オーツカ」に溶解し、５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有Ｒを調製した後、０．５ｍＬの上記ＰＧと、９．５ｍＬの５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有Ｒとを混合することにより調製した。
４）５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＡＲは、まず、５００ｍｇの上記デキストラン４０を、１０ｍＬのヴィーンＦ輸液に溶解し、５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＡＲを調製した後、０．５ｍＬの上記ＰＧと、９．５ｍＬの５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＡＲとを混合することにより調製した。
５）５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、まず、５００ｍｇの上記デキストラン４０を、１０ｍＬのラクテック注に溶解し、５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲを調製した後、０．５ｍＬの上記ＰＧと、９．５ｍＬの５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲとを混合することにより調製した。
［検討５に用いた細胞凍結保存液の調製］
１）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；２．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．８８（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、１．２５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．９４（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；は、上記［検討３に用いた細胞凍結保存液の調製］の３）及び４）で調製したものを用いた。
２）７．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．６３（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、上記「５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」と、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」を１：１の比率で混合することにより調製した。
３）３．７５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．８１（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、上記「２．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．８８（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」と、上記「５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」を１：１の比率で混合することにより調製した。
４）６．２５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．６９（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、上記「５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」と、上記「７．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．６３（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」を１：１の比率で混合することにより調製した。
５）８．７５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．５６（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、上記「７．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．６３（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」と、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」を１：１の比率で混合することにより調製した。
［検討６に用いた細胞凍結保存液の調製］
１）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲは、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲ」とラクテック注を４：６の比率で混合することにより調製した。
２）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び９．６（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、まず、１ｇの上記デキストラン４０を、１０ｍＬのラクテック注に溶解し、１０（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲを調製した後、１０（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲと上記ＰＧを９６：４の比率で混合することにより調製した。
３）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．８（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．４（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び１．２（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；は、上記「４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び９．６（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」を上記「４（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲ」にて２倍公比で希釈することにより調製した。
４）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び７．２（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、上記「４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．８（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」と上記「４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び９．６（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」を１：１の比率で混合することにより調製した。
［検討７に用いた細胞凍結保存液の調製］
１）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲとして、上記［検討３に用いた細胞凍結保存液の調製］の１）で調製したものを用いた。
２）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲは、上記［検討６に用いた細胞凍結保存液の調製］の１）で調製したものを用いた。
３）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、上記「５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」と上記ＰＧを９：１の比率で混合することにより調製した。
４）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．８（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」と上記「５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」を４：６の比率で混合することにより調製した。
５）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．５％のヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）含有ＬＲは、まず、５００ｍｇのＨＥＳ（Ｍｗ＝２２２０３３９［実測値］）（Fresenius KabiAustria GmbH社製）を、１０ｍＬのラクテック注に溶解し、５（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有ＬＲを調製した後、５（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有ＬＲと上記ＰＧを９：１の比率で混合することにより調製した。
６）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．８（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有ＬＲは、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び４．５（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有ＬＲ」と上記「５（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有ＬＲ」を４：６の比率で混合することにより調製した。
７）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲは、上記［検討３に用いた細胞凍結保存液の調製］の５）で調製したものを用いた。
８）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．８８（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲは、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲ」とセルストアＷを４：６の比率で混合することにより調製した。
９）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、まず、５００ｍｇの上記デキストラン４０を、１０ｍＬのセルストアＷに溶解し、５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有セルストアＷを調製した後、５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有セルストアＷと上記ＰＧを９：１の比率で混合することにより調製した。　
１０）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．８８（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．８（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」と上記「５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有セルストアＷ」を４：６の比率で混合することにより調製した。１１）１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有ＬＲは、まず、５００ｍｇの上記ＨＥＳを、１０ｍＬのセルストアＷに溶解し、５（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有セルストアＷを調製した後、５（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有セルストアＷと上記ＰＧを９：１の比率で混合することにより調製した。
１２）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．８８（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．８（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有ＬＲは、上記「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有ＬＲ」と上記「５（ｗ／ｖ）％のＨＥＳ含有セルストアＷ」を４：６の比率で混合することにより調製した。
［検討８に用いた細胞凍結保存液の調製］
１）２．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有乳酸リンゲル液（ＬＲ）は、ラクテック注及びＰＧを３９：１の比率で混合することにより調製した。
２）２．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．９２５（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲは、セルストアＷ及び上記ＰＧを３９：１の比率で混合することにより調製した。
３）２．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．９２５（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．８７５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲは、セルストアＳ及び上記ＰＧを３９：１の比率で混合することにより調製した。
［検討９に用いた細胞凍結保存液の調製］
１）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲは、上記［検討６に用いた細胞凍結保存液の調製］の１）で調製したものを用いた。
２）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び１．４４（ｗ／ｖ）％のグルコース含有ＬＲは、まず、１５０ｍｇのＤ（＋）－グルコース（富士フイルム和光純薬工業社製）を１０ｍＬのラクテック注に溶解し、１．５（ｗ／ｖ）％のグルコース含有ＬＲを調製した後、０．４ｍＬの上記ＰＧと９．６ｍＬの１．５（ｗ／ｖ）％のグルコース含有ＬＲを混合することにより調製した。
３）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び１．４４（ｗ／ｖ）％のフルクトース含有ＬＲは、まず、１５０ｍｇのＤ（－）－フルクトース（富士フイルム和光純薬工業社製）を１０ｍＬのラクテック注に溶解し、１．５（ｗ／ｖ）％のフルクトース含有ＬＲを調製した後、０．４ｍＬの上記ＰＧと９．６ｍＬの１．５（ｗ／ｖ）％のフルクトース含有ＬＲを混合することにより調製した。
４）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．８８（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲは、まず、３３２ｍｇのトレハロース二水和物（富士フィルム和光純薬社製）を１０ｍＬのラクテック注に溶解し、３（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲを調製した後、０．４ｍＬの上記ＰＧと９．６ｍＬの３（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲを混合することにより調製した。
５）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．８８％のスクロース含有ＬＲは、まず、３００ｍｇのスクロース（富士フィルム和光純薬社製）を１０ｍＬのラクテック注に溶解し、３％のスクロース含有ＬＲを調製した後、０．４ｍＬの上記ＰＧと９．６ｍＬの３％のスクロース含有ＬＲを混合することにより調製した。
６）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．８８（ｗ／ｖ）％のラクトース含有ＬＲは、まず、３１６ｍｇのラクトース一水和物（富士フィルム和光純薬社製）を１０ｍＬのラクテック注に溶解し、３（ｗ／ｖ）％のラクトース含有ＬＲを調製した後、０．４ｍＬの上記ＰＧと９．６ｍＬの３（ｗ／ｖ）％のラクトース含有ＬＲを混合することにより調製した。
［検討１０に用いた細胞凍結保存液の調製］
１）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲは、上記［検討６に用いた細胞凍結保存液の調製］の１）で調製したものを用いた。
２）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び１１．５２（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲは、まず、１．３２８ｇの上記トレハロース二水和物を１０ｍＬのラクテック注に溶解し、１２（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲを調製した後、１２（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲと上記ＰＧを９６：４の比率で混合することにより調製した。
３）４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び５．７６（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲ；４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び２．８８（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲ；４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び１．４４（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲ；並びに、４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び０．７２（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲ；は、上記「４（ｖ／ｖ）％のＰＧ及び１１．５２（ｗ／ｖ）％のトレハロース含有ＬＲ」を上記「４（ｖ／ｖ）％のＰＧ含有ＬＲ」にて２倍公比で希釈することにより調製した。
［検討１１に用いた細胞凍結保存液の調製］
　４（ｖ／ｖ）％のＰＧを含む、３種類の基液（血清含有培養液、トレハロース含有ＬＲ、及びＬＲ）は、１０％のＦＢＳ（Gibco社製）含有ＭＥＭα（Gibco社製）、セルストアＷ、及びラクテック注を、それぞれ上記ＰＧと、２４：１の比率で混合することにより調製した。
［検討１２～１５に用いた細胞凍結保存液の調製］
　２（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；３（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；４（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；５（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、７．５（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ；は、まず、セルストアＳと上記ＰＧを９：１の比率で混合し、１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲを調製した後、セルストアＳと「１０（ｖ／ｖ）％のＰＧ、２．７（ｗ／ｖ）％のトレハロース、及び４．５（ｗ／ｖ）％のデキストラン含有ＬＲ」をそれぞれ４：１、７：３、３：２、及び１：１の比率で混合することにより調製した。
［ｈＡＤ－ＭＳＣの培養（検討１～１０）］
　ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）（Lonza Walkersville社製）の培養は、Lonza Walkersville社のヒト脂肪細胞由来幹細胞培養の手順書に従って行った。具体的には、ｈＡＤ－ＭＳＣを７５ｃｍ２フラスコに培地キット（PT-4505、ADSC BulletKit, Lonza Walkersville社製）から調製した培地（以下、「ＭＳＣ培地」という）１５ｍＬを入れて播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター下で培養した。培地交換は３日又は４日ごとに行った。細胞は、９０％コンフルエント程度（８０～１００％コンフルエント）で継代し、２～５回の継代後のフラスコを、以下の「ｈＡＤ－ＭＳＣの調製（検討１～１０）」の項目に記載の方法に用いた。
［ｈＡＤ－ＭＳＣの調製（検討１～１０）］
　以下の手順〔１〕～〔１１〕に従って、ｈＡＤ－ＭＳＣを調製した。
〔１〕パーソナルインキュベーター（PIC-100、アズワン社製）を３７℃に設定し、加温しておいた。
〔２〕ｈＡＤ－ＭＳＣを培養している７５ｃｍ２フラスコをＣＯ２インキュベーターから取り出した。
〔３〕顕微鏡下で細胞の状態を観察し、８０％～１００％コンフルエントのものを使用した。
〔４〕ＭＳＣ培地を吸引し、ＰＢＳ（－）（製品番号：14190-144、GIBCO社製）を各７５ｃｍ２フラスコに８ｍＬずつ添加した。
〔５〕ＰＢＳ（－）を吸引後、トリプシン／ＥＤＴＡ（製品コード：CC-5012、Lonza Walkersville社製）をフラスコに４ｍＬずつ添加し、パーソナルインキュベーターにて３７±２℃条件下で５分間インキュベートした。
〔６〕細胞が９０％程度剥離するまで顕微鏡下で観察しながら、ゆっくりと揺らした。
〔７〕ＴＮＳ（trypsin neutralizing solution、製品コード：CC-5002、Lonza Walkersville社製）を８ｍＬずつ加えてトリプシン反応を停止させ、ピペッティングにより細胞を剥離し、５０ｍＬプロテオセーブ（MS-52550、住友ベークライト社製）に移した。
〔８〕２１０×ｇ、５分間、室温で遠心して細胞を回収した。
〔９〕上清を吸引し、セルストアＷに懸濁した。
〔１０〕２０μＬの細胞懸濁液をとり、２０μＬの０．４％トリパンブルー（商品番号：15250-061、gibco社製）と混合し、細胞計数盤（ワンセルカウンター、商品番号：OCC01、バイオメディカルサイエンス社製）で細胞数（生細胞及び死細胞）を計測した。なお、計測細胞数はワンセルカウンターを用いて１カ所のエリアの四隅のエリアの細胞数とした。
〔１１〕全細胞濃度を以下の式にて算出した。式：全細胞濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）＝（計測した全細胞数×１０４）／４×２
［ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞の培養（検討１１及び１２）］
　１．５×１０６個のヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞（ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞）（STEMCELL Technologies社製）を、Ｔリンパ球培養用培養液入りフラスコ（製品名：TLY CULTUREキット25、TLY-FK25、GCリンフォテック社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養を開始した。培養後３日目に、８枚又は１０枚の２５ｃｍ２のフラスコに移した。その後、培養後９日目のフラスコを、以下の［ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製（検討１１及び１２）］の項目に記載の方法に用いた。
［ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製（検討１１及び１２）］
　以下の手順〔１〕～〔４〕に従って、ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を調製した。
〔１〕ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞をフラスコから５０ｍＬプロテオセーブ（MS-52550、住友ベークライト社製）に移した。
〔２〕３００×ｇ、１０分間、室温で遠心して細胞を回収した。
〔３〕上清を吸引し、ラクテック注に懸濁した。
〔４〕１００μＬの細胞懸濁液を分取し、Via2-Cassette（Chemometec社製）を用いてサンプリングし、ヌクレオカウンター（Chemometec社製）を用いて、全細胞数を測定した。
［ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞及びｈＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養（検討１３及び１４）］
　１．５×１０６個のヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞（ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞）（STEMCELL Technologies社製）又はヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞（ｈＣＤ４陽性Ｔ細胞）（Lonza Walkersville社製）を、それぞれＴリンパ球培養用培養液入りフラスコ（製品名：TLY CULTUREキット25、TLY-FK25、GCリンフォテック社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養を開始した。培養後３日目に、ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞又はｈＣＤ４陽性Ｔ細胞を３枚の７５ｃｍ２フラスコにそれぞれ移した。培養後７日目及び９日目に、それぞれフラスコ１枚ずつを、以下の［ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞及びｈＣＤ４陽性Ｔ細胞の調製（検討１３及び１４）］の項目に記載の方法に用いた。さらに、培養後１０日目に、残りの１枚のフラスコから細胞を回収し、３枚の７５ｃｍ２のフラスコに分割し、それぞれのフラスコにT cell培地（製品名：X-VIVO15無血清リンパ球培地、04-418Q、Lonza Walkersville社製）を１０ｍＬずつ添加した。その後、培養後１１日目のフラスコ３枚を、以下の［ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞及びｈＣＤ４陽性Ｔ細胞の調製（検討１３及び１４）］の項目に記載の方法に用いた。
［ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞及びｈＣＤ４陽性Ｔ細胞の調製（検討１３及び１４）］
　以下の手順〔１〕～〔５〕に従って、ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を調製した。
〔１〕ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞又はｈＣＤ４陽性Ｔ細胞をフラスコから５０ｍＬプロテオセーブ（MS-52550、住友ベークライト社製）に移した。
〔２〕３００×ｇ、１０分間、室温で遠心して細胞を回収した。
〔３〕上清を吸引し、セルストアＷに懸濁した。
〔４〕２０μＬの細胞懸濁液をとり、２０μＬの０．４％トリパンブルー（商品番号：15250-061、gibco社製）と混合し、細胞計数盤（ワンセルカウンター、商品番号：OCC01、バイオメディカルサイエンス社製）で細胞数（生細胞及び死細胞）を計測した。なお、計測細胞数はワンセルカウンターを用いて１カ所のエリアの四隅のエリアの細胞数とした。〔５〕全細胞濃度を以下の式にて算出した。式：全細胞濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）＝（計測した全細胞数×１０４）／４×２
［ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞の培養（検討１５）］
　２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの臍帯血由来ヒトＣＤ３４陽性造血系幹細胞（ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞）（タカラバイオ社製）を含む造血前駆細胞増殖培養液ＸＦ（タカラバイオ社製）を、７５ｃｍ２の浮遊培養用フラスコ（製品名：スーパークオリティ浮遊細胞培養用フラスコ７５ｃｍ２フィルターキャップ、MS-2325RS、住友ベークライト社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養を開始した。培養後２～３日目に、等量の造血前駆細胞増殖培養液ＸＦを加え、さらに３日間培養した。１）培養液を５０ｍＬプロテオセーブ（MS-52550、住友ベークライト社製）に移し、２４０×ｇ、１０分間、室温で遠心して細胞を回収した。２）上清を吸引し、新しい造血前駆細胞増殖培養液ＸＦを加え、細胞を懸濁した後、新しい７５ｃｍ２の浮遊培養用フラスコに播種した。２～３日毎に上記１）及び２）の操作を繰り返し、１２日目のフラスコを、以下の［ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞の調製（検討１５）］の項目に記載の方法に用いた。
［ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞の調製（検討１５）］
　以下の手順〔１〕～〔４〕に従って、ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞を調製した。
〔１〕ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞をフラスコから５０ｍＬプロテオセーブ（MS-52550、住友ベークライト社製）に移した。
〔２〕２４０×ｇ、１０分間、室温で遠心して細胞を回収した。
〔３〕上清を吸引し、ラクテック注に懸濁した。
〔４〕１００μＬの細胞懸濁液をとり、Via2-Cassette（Chemometec社製）を用いてサンプリングし、ヌクレオカウンター（Chemometec社製）を用いて、全細胞数を測定した。
［哺乳動物細胞の凍結保存］
　以下の手順〔１〕～〔４〕に従って、４種類の哺乳動物細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ、ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞、ｈＣＤ４陽性Ｔ細胞、及びｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞）を凍結保存した。
〔１〕セルストアＷ又はラクテック注に懸濁した各種哺乳動物細胞を１５ｍＬステムフル（品番ＭＳ－９０１５０、サイズ１５ｍＬ、住友ベークライト株式会社）に移した。
〔２〕遠心処理（ｈＡＤ－ＭＳＣの場合、２１０×ｇ、５分間、室温；ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞及びｈＣＤ４陽性Ｔ細胞の場合、３００×ｇ、１０分間、室温；ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞の場合、２４０×ｇ、１０分間、室温）し、上清を吸引した。
〔３〕各種哺乳動物細胞を、各種細胞凍結保存液で１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように再懸濁し、１ｍＬずつバイアル（Nunc CryoTube Vials、品番375418、サイズ1.8mL、Thermo Fisher Scientific社製）に入れた。
〔４〕バイアルをバイセル（凍結処理容器）（日本フリーザー社製）に入れ、－８０℃の冷凍庫で翌日まで保存し、その後、バイアルをバイセルからサンプルボックスに移して、液体窒素タンク（サーモラインローケータープラス液体窒素凍結保存容器タイプ509、CS509X21A-70、東栄社製）中に移して任意の期間保存した。
［凍結融解後の細胞のサンプル調製］
　以下の手順〔１〕～〔６〕に従って、凍結融解後の４種類の哺乳動物細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ、ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞、ｈＣＤ４陽性Ｔ細胞、及びｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞）の生存率を評価するためのサンプルを調製した。
〔１〕恒温槽（ウォーターバス）を３７℃に設定し、加温した。
〔２〕液体窒素タンクから、凍結した、各種哺乳動物細胞を含む各種細胞凍結保存液が入ったバイアルを取り出し、ドライアイスの入った容器に移動した。
〔３〕バイアルを素早く３７℃に設定した恒温槽に移し、軽く撹拌しながら少し氷のかけらが残る状態まで溶かした。
〔４〕素早くバイアル表面の水を除いた後、７０％エタノールで拭き、安全キャビネットに移した。
〔５〕解凍後、チップの先を底から目視で５ｍｍ程度の位置まで挿入した状態で、懸濁（１ｍＬのピペットを用いて、５００μＬの液量での緩やかに５回ピペッティング）した。
〔６〕アネキシンＶ陽性率評価用細胞懸濁液及びトリパンブルー染色用細胞懸濁液として、それぞれ５０μＬ及び２０μＬを分取し、ヌクレオカウンター解析用細胞懸濁液として、１００μＬを分取し、ＣＤ３４陽性率の評価用として、８００μＬのｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞懸濁液を分取した。なお、検討１１及び１２を実施するために、分取した細胞懸濁液を、室温で振盪保存（１００ｒｐｍ、２５ｍｍ）した。
［凍結融解後の哺乳動物細胞のアネキシンＶ陽性率］
　以下の手順〔１〕～〔６〕に従って、凍結融解後の４種類の哺乳動物細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ、ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞、ｈＣＤ４陽性Ｔ細胞、及びｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞）のアネキシンＶ陽性率を評価した。
〔１〕アポトーシス検出キット（Annexin V-FITC Kit、nacalai tesque社製）に同梱されているAnnexin Binding Buffer(×10)を大塚蒸留水で１０倍希釈し、アネキシンＶ染色用液を調整し、氷冷した。
〔２〕１００μＬの塩化Ｃａ補正液（１ｍＥｑ／ｍＬ）を、９００μＬの大塚蒸留水で１０倍希釈し、塩化Ｃａ希釈液を調整した。
〔３〕分取したアネキシンＶ陽性率評価用細胞懸濁液５０μＬをラウンドチューブに分取した。
〔４〕カルシウムイオン濃度が１．５ｍＭ以上となるように、塩化Ｃａ希釈液３μＬを各細胞懸濁液に添加した。
〔５〕１μＬのAnnexin V-FITCを添加して混合し、氷上暗所で１５分間染色した。
〔６〕染色後４００μＬのアネキシンＶ染色用液を加え、セルストレーナーを通して丸底スタンダードチューブに移し、速やかにフローサイトメトリー（Gallios、ベックマン・コールター社製）を用いてアネキシンＶ陽性率を評価した。アネキシンＶ陽性率は、Kaluza Analysis Software（Ver.1.5a、ベックマン・コールター社製)を用いて解析・算出した。
［トリパンブルー染色（検討２、４～１０、１３、及び１４）］
　分取したトリパンブルー染色用細胞懸濁液２０μＬと、トリパンブルー染色液２０μＬとを混合し、光学顕微鏡（ECLIPSE TS100、ニコン社製、及びOLYMPUS CKX53、オリンパス社製）を使用し、ワンセルカウンターにより全細胞数及び死細胞数を各々測定した。その上で、これら測定値を、それぞれ式（細胞生存率（％）＝［全細胞数－死細胞数］／全細胞数×１００）、及び式（生存細胞回収率（％）＝凍結後の各ポイントにおける１ｍＬ中の生存細胞数／凍結前の１ｍＬ中の生存細胞数×１００）に入力し、細胞生存率及び生存細胞回収率を算出した。
［ヌクレオカウンター解析（検討１１、１２、及び１５）］
　分取したヌクレオカウンター解析用細胞懸濁液１００μＬを、Via2-Cassette（Chemometec社製）を用いてサンプリングし、ヌクレオカウンター（Chemometec社製）を用いて、全細胞数及び死細胞数を各々測定した。その上で、これら測定値を、それぞれ式（細胞生存率（％）＝［全細胞数－死細胞数］／全細胞数×１００）、及び式（生存細胞回収率（％）＝凍結後の各ポイントにおける１ｍＬ中の生存細胞数／凍結前の１ｍＬ中の生存細胞数×１００）に入力し、細胞生存率及び生存細胞回収率を算出した。
［凍結融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能］
　凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣを、６ウェルプレートに５．６×１０３細胞／ｃｍ２（５．０×１０４細胞／９ｃｍ２／ウェル）の密度で播種し、ＭＳＣ培地を使用して培養した。培地交換は、播種後２４時間以内、及びその後３～４日目に行った。播種から１日目、３日目、５日目、及び７日目に、ｈＡＤ－ＭＳＣを培養した６ウェルプレートをＰＢＳ（－）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡで酵素処理し、ＴＮＳでトリプシン反応を停止し、ワンセルカウンターにより再培養後の細胞数を計測し、凍結融解後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能を評価した。
［ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞のＣＤ３４陽性率の評価］
　以下の手順〔１〕～〔９〕に従って、凍結融解後のｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞のＣＤ３４陽性率を評価した。
〔１〕８００μＬのｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞懸濁液を、５００μＬ（染色用サンプル）と３００μＬ（コントロール用サンプル）に分け、１．５ｍＬプロテオセーブ（MS4265M、住友ベークライト社製）に分取した。
〔２〕遠心処理（２４０×ｇ、１０分間、室温）し、上清を吸引した。
〔３〕Stain Buffer（ＦＢＳ）を、染色用サンプル及びコントロール用サンプルに、それぞれ４９μＬ及び３０μＬ添加し、懸濁した。
〔４〕１μＬのＰＥ－ＣＤ３４抗体（Milteny社製）を染色用サンプルに添加して混合した。
〔５〕冷蔵庫、遮光下で１０分間インキュベート（抗原抗体反応）した。
〔６〕染色用サンプル及びコントロール用サンプルに、それぞれ１ｍＬのStain Buffer（ＦＢＳ）を加え、遠心処理（２４０×ｇ、１０分間、４℃）した。
〔７〕上清を吸引後、染色用サンプル及びコントロール用サンプルに、それぞれ１ｍＬのStain Buffer（ＦＢＳ）を加え、遠心処理（２４０×ｇ、１０分間、４℃）した。
〔８〕上清を吸引後、５００μＬのStain Buffer（ＦＢＳ）を加えて懸濁し、セルストレーナーを通して丸底スタンダードチューブに移した。
〔９〕フローサイトメーター（Gallios、ベックマン・コールター社製）を用いて、ＰＥ由来の蛍光シグナルが陽性の細胞（すなわち、ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞）を検出し、解析ソフトウェアKaluza（Ver.1.5a、ベックマン・コールター社製）を用いて、全細胞数に対するＣＤ３４陽性細胞の割合（ＣＤ３４陽性率）を算出した後、凍結保存前の細胞におけるＣＤ３４陽性率を１としたときの相対値（図１９Ｂの縦軸の値）を算出した。
［計算方法及び統計処理］
　各群の平均値±標準偏差を求めた。統計解析は、SAS 9.4（EXSUS Version 10.0）を用いて行った。必要に応じて、Student’s t test、Dunnett's test及びTukey’s testを行い、有意水準５％未満を有意と判定した。
２．結果
２－１　検討１
　ＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と、ＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合で、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能に違いがあるかどうかを検討するために、１．２５～１０％のＤＭＳＯを含む基液（２．７％のトレハロース及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中と、１．２５～１０％のＰＧを含む上記基液中のそれぞれにｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、凍結融解後のｈＡＤ－ＭＳＣを１～７日間培養し、細胞数の経時的変化を解析した。
　その結果、培養５日目以降において、１．２５～１０％のＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣは、ＤＭＳＯの濃度の違いによる細胞増殖効率に違いは認められなかった（図１Ａ及び表１）。一方、２．５～５％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣは、１０％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣと比べ、有意に効率よく増殖することが示された（図１Ｂ及び表１）。また、２．５～５％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣは、２．５～５％のＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣと比べ、有意に効率よく増殖することが示された（図２Ｂ及び２Ｃ）。
　これらの結果は、２．５～５％のＰＧ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、２．５～５％以外の濃度のＰＧ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合や、ＤＭＳＯ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を効果的に高めることができることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２－２　検討２
　２．５～５％のＰＧを含む細胞凍結保存液の基液として、トレハロース及びデキストラン含有ＬＲを用いた場合の効果を、ＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液と比較・検討するために、４％のＰＧ又は４％のＤＭＳＯを含むトレハロース及びデキストラン含有細胞凍結保存液（４％のＰＧ、２．８８％のトレハロース、及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、４％のＤＭＳＯ、２．８８％のトレハロース、及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率及び生存細胞回収率と、凍結融解後の細胞増殖能を解析した。なお、比較対照として、凍結保存しなかったｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能についても同様に解析した。
　その結果、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率及び生存細胞回収率は、いずれの細胞凍結保存液中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合においても高かった（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、凍結融解後のｈＡＤ－ＭＳＣを１～７日間培養し、細胞数の経時的変化を解析した結果、４％のＰＧを含むトレハロース及びデキストラン含有細胞凍結保存液（４％のＰＧ、２．８８％のトレハロース、及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ）中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣは、凍結保存しなかったｈＡＤ－ＭＳＣと比べ、同レベルかそれ以上効率で増殖することが示された（図３及び表３）。一方、４％のＤＭＳＯを含むトレハロース及びデキストラン含有細胞凍結保存液（４％のＤＭＳＯ、２．８８％のトレハロース、及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ）中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣは、凍結保存しなかったｈＡＤ－ＭＳＣと比べ、培養３日目以降から有意に増殖レベルが低下することが示された（図３及び表３）。
　これらの結果は、４％のＰＧを含む細胞凍結保存液と４％のＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液は共に、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死抑制効果は同レベルで発揮するものの、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を高める効果は、４％のＰＧを含む細胞凍結保存液の方が高いことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
２－３　検討３
　２．５～５％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と、２．５～５％以外の濃度のＰＧを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合で、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能に違いがあるかどうかを検討するために、１．２５～１０％のＰＧを含む、４種類の基液（ＬＲ；デキストラン含有ＬＲ；トレハロース含有ＬＲ；並びに、トレハロース及びデキストラン含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、凍結融解後のｈＡＤ－ＭＳＣを１～７日間培養し、細胞数の経時的変化を解析した。
　その結果、検討１の結果と同様に、いずれの基液を用いた場合でも、２．５～５％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣは、１０％のＰＧを含む細胞凍結保存液中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣと比べ、効率よく増殖することが示された（図４及び表４）。特に、３種類の基液（デキストラン含有ＬＲ；トレハロース含有ＬＲ；並びに、トレハロース及びデキストラン含有ＬＲ）を用いた場合、ｈＡＤ－ＭＳＣの細胞増殖能が有意に高かった（図４Ｂ～Ｄ及び表４）。
　これらの結果は、２．５～５％のＰＧ含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、２．５～５％以外の濃度のＰＧ含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能をより効果的に高めることができることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
２－４　検討４
　ＰＧを含む細胞凍結保存液における基液について検討するために、８種類の細胞凍結保存液（５％のＰＧを含む、４種類の基液［生理食塩水、リンゲル液、酢酸リンゲル液、及び乳酸リンゲル液］、並びに、５％のＰＧ及び４．７５％のデキストランを含む、上記４種類の基液）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率、生存細胞回収率、アネキシンＶ陽性率、及び細胞増殖能を解析した。
　その結果、ｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率、生存細胞回収率、及びアネキシンＶ陽性率の全ての測定結果において、５％のＰＧを含む細胞凍結保存液と、５％のＰＧ及び４．７５％のデキストランを含む細胞凍結保存液を用いた場合、共に上記４種類の基液の間に有意な差は見られなかった（図５及び表５）。また、５％のＰＧ及び４．７５％のデキストランを含む細胞凍結保存液を用いた場合のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率は、上記４種類の基液共に、５％のＰＧを含む細胞凍結保存液を用いた場合のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率と比べ、高く、特に基液としてリンゲル液及び酢酸リンゲル液を用いた場合、有意に高かった（図５Ａ及び表５）。ｈＡＤ－ＭＳＣの生存細胞回収率も同様の傾向があり、特に基液として酢酸リンゲル液を用いた場合、有意に高かった（図５Ｂ及び表５）。一方、５％のＰＧ及び４．７５％のデキストランを含む細胞凍結保存液を用いた場合のｈＡＤ－ＭＳＣのアネキシンＶ陽性率は、上記４種類の基液共に、５％のＰＧを含む細胞凍結保存液を用いた場合の細胞生存率と比べ、低かった（図５Ｃ及び表５）。
　これらの結果は、ＰＧとデキストランとを併用した場合の効果（すなわち、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死抑制効果）は、細胞凍結保存液の基液の種類に関わらず、発揮されることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　また、凍結融解後のｈＡＤ－ＭＳＣを１～７日間培養し、細胞数の経時的変化を解析した結果、５％のＰＧ及び４．７５％のデキストランを含む、上記４種類の基液中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣは、５％のＰＧを含む、上記４種類の基液中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣと比べ、効率よく増殖することが示された（図６及び表６）。
　この結果は、ＰＧとデキストランとを併用した場合の効果（すなわち、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を高める効果）は、細胞凍結保存液の基液の種類に関わらず、発揮されることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
２－５　検討５
　ＰＧを含む細胞凍結保存液におけるＰＧの最適な濃度を解析するために、８種類の細胞凍結保存液（１．２５％ＰＧ及び４．９４％デキストラン含有ＬＲ；２．５％ＰＧ及び４．８８％デキストラン含有ＬＲ；３．７５％ＰＧ及び４．８１％デキストラン含有ＬＲ；５％ＰＧ及び４．７５％デキストラン含有ＬＲ；６．２５％ＰＧ及び４．６９％デキストラン含有ＬＲ；７．５％ＰＧ及び４．６３％デキストラン含有ＬＲ；８．７５％ＰＧ及び４．５６％デキストラン含有ＬＲ；並びに、１０％ＰＧ及び４．５％デキストラン含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率、生存細胞回収率、及びアネキシンＶ陽性率と、凍結融解後の細胞増殖能を解析した。
　その結果、２．５～８．７５％のＰＧを含む、６種類の細胞凍結保存液（２．５％ＰＧ及び４．８８％デキストラン含有ＬＲ；３．７５％ＰＧ及び４．８１％デキストラン含有ＬＲ；５％ＰＧ及び４．７５％デキストラン含有ＬＲ；６．２５％ＰＧ及び４．６９％デキストラン含有ＬＲ；７．５％ＰＧ及び４．６３％デキストラン含有ＬＲ；並びに、８．７５％ＰＧ及び４．５６％デキストラン含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存すると、１．２５％のＰＧを含む細胞凍結保存液（１．２５％ＰＧ及び４．９４％デキストラン含有ＬＲ）や、１０％のＰＧを含む細胞凍結保存液（１０％ＰＧ及び４．５％デキストラン含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率及び生存細胞回収率が高く、特に、細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が２．５～６．２５％のとき、細胞生存率が有意に高かった（図７Ａ及び７Ｂ、表７）。
　また、２．５～８．７５％のＰＧを含む、上記６種類の細胞凍結保存液中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存すると、１．２５％のＰＧを含む細胞凍結保存液や、１０％のＰＧを含む細胞凍結保存液中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣのアネキシンＶ陽性率が低く、特に、細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が２．５～６．２５％のとき、有意に低かった（図７Ｃ、表７）。
　これらの結果は、２．５～８．７５％（特に、２．５～６．２５％）のＰＧ及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、２．５～８．７５％（特に、２．５～６．２５％）以外の濃度のＰＧ及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死をより効果的に抑制できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　また、凍結融解後のｈＡＤ－ＭＳＣを１～７日間培養し、細胞数の経時的変化を解析した結果、培養５日目以降において、２．５～７．５％のＰＧを含む、５種類の細胞凍結保存液（２．５％ＰＧ及び４．８８％デキストラン含有ＬＲ；３．７５％ＰＧ及び４．８１％デキストラン含有ＬＲ；５％ＰＧ及び４．７５％デキストラン含有ＬＲ；６．２５％ＰＧ及び４．６９％デキストラン含有ＬＲ；及び７．５％ＰＧ及び４．６３％デキストラン含有ＬＲ）中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣは、１０％のＰＧを含む細胞凍結保存液（１０％ＰＧ及び４．５％デキストラン含有ＬＲ）中に凍結保存したｈＡＤ－ＭＳＣと比べ、効率よく増殖することが示され、特に、細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が２．５～５％のとき、有意に増殖することが示された（図８及び表８）。
　この結果は、２．５～５％のＰＧ及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、２．５～５％以外の濃度のＰＧ及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を効果的に高めることができることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
２－６　検討６
　２．５～５％のＰＧ及びデキストランを含む細胞凍結保存液におけるデキストランの最適な濃度を検討するために、６種類の細胞凍結保存液（４％のＰＧ含有ＬＲ；４％のＰＧ及び１．２％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ及び２．４％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ及び７．２％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、４％のＰＧ及び９．６％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率、生存細胞回収率、及びアネキシンＶ陽性率を解析した。
　その結果、４％のＰＧ及び１．２～９．６％のデキストラン含有細胞凍結保存液（４％のＰＧ及び１．２％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ及び２．４％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ及び７．２％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、４％のＰＧ及び９．６％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存すると、デキストラン不含の４％のＰＧ含有細胞凍結保存液（４％のＰＧ含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率及び生存細胞回収率が高く、特に、細胞凍結保存液におけるデキストランの濃度が１．２～９．６％のとき、細胞生存率が有意に高く、また、細胞凍結保存液におけるデキストランの濃度が２．４～９．６％のとき、生存細胞回収率が有意に高かった（図９Ａ及び９Ｂ、表９）。
　また、４％のＰＧ及び１．２～９．６％のデキストラン含有細胞凍結保存液中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存すると、デキストラン不含の４％のＰＧ含有細胞凍結保存液中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣのアネキシンＶ陽性率が低く、特に、細胞凍結保存液におけるデキストランの濃度が４．８～９．６％のとき、有意に低かった（図９Ａ及び９Ｂ、表９）。
　これらの結果は、２．５～５％のＰＧ及び少なくとも１．２％（特に、少なくとも２．４％［例えば、２．４～９．６％、４．８～９．６％］）のデキストランを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、デキストラン不含の２．５～５％のＰＧ含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死をより効果的に抑制できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
２－７　検討７
　デキストラン以外の高分子化合物として、ＨＥＳをＰＧと併用した場合にも、デキストランとＰＧを併用したときと同様の効果が発揮されるかどうかを検討するために、６種類の細胞凍結保存液（４％のＰＧ含有ＬＲ；１０％のＰＧ含有ＬＲ；４％のＰＧ及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ；１０％のＰＧ及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ及び４．８％のＨＥＳ含有ＬＲ；並びに、１０％のＰＧ及び４．５％のＨＥＳ含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率、生存細胞回収率、及びアネキシンＶ陽性率を解析した。
　その結果、ＰＧ及びＨＥＳを含む細胞凍結保存液（４％のＰＧ及び４．８％のＨＥＳ含有ＬＲ；並びに、１０％のＰＧ及び４．５％のＨＥＳ含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存すると、ＰＧ及びデキストランを含む細胞凍結保存液（４％のＰＧ及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ；並びに１０％のＰＧ及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と同様に、ＰＧのみを含む細胞凍結保存液（４％のＰＧ含有ＬＲ；及び１０％のＰＧ含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率及び生存細胞回収率が高く、また、アネキシンＶ陽性率が低かった（図１０及び表１０）。同様に、ＰＧ及びＨＥＳを含む細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が４％のとき、ＰＧの濃度が１０％のときと比べ、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率及び生存細胞回収率が高く、また、アネキシンＶ陽性率が低かった（図１０及び表１０）。
　これらの結果は、ＰＧとＨＥＳ（デキストランと同じ高分子化合物）を含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、ＰＧ及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と同様に、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死を効果的に抑制できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　また、凍結融解後のｈＡＤ－ＭＳＣを１～７日間培養し、細胞数の経時的変化を解析した結果、トレハロースを含む、上記６種類の細胞凍結保存液、すなわち、４％のＰＧ及び２．８８％のトレハロース含有ＬＲ；１０％のＰＧ及び２．７％のトレハロース含有ＬＲ；４％のＰＧ、２．８８％のトレハロース、及び４．８％のデキストラン含有ＬＲ；１０％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ、２．８８％のトレハロース、及び４．８％のＨＥＳ含有ＬＲ；並びに、１０％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のＨＥＳ含有ＬＲを用いて解析した場合も同様に、ＨＥＳとＰＧとの併用効果が確認された（図１１及び表１１）。
　これらの結果は、ＰＧと高分子化合物（デキストラン、ＨＥＳ等）とを併用した場合の効果（すなわち、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を高める効果）は、トレハロースを併用した場合にも発揮されることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
２－８　検討８
　細胞凍結保存液において、ＰＧと、トレハロースやデキストランとを併用した場合の効果を確認するために、３種類の細胞凍結保存液（２．５％のＰＧ含有ＬＲ；２．５％のＰＧ及び２．９２５％のトレハロース含有ＬＲ；並びに２．５％のＰＧ、２．９２５％のトレハロース、及び４．８７５％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率、生存細胞回収率、及びアネキシンＶ陽性率を解析した。
　その結果、２．５％のＰＧ及び２．９２５％のトレハロース含有ＬＲ；又は２．５％のＰＧ、２．９２５％のトレハロース、及び４．８７５％のデキストラン含有ＬＲ；中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存すると、２．５％のＰＧ含有ＬＲ中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と比べ、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率及び生存細胞回収率が高く、特に、２．５％のＰＧ、２．９２５％のトレハロース、及び４．８７５％のデキストラン含有ＬＲを用いた場合は、有意にこれらの値が高かった（図１２Ａ及び１Ｂ、表１２）。
　また、２．５％のＰＧ及び２．９２５％のトレハロース含有ＬＲ；又は２．５％のＰＧ、２．９２５％のトレハロース、及び４．８７５％のデキストラン含有ＬＲ；中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存すると、２．５％のＰＧ含有ＬＲ中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と比べ、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣのアネキシンＶ陽性率が有意に低かった（図１２Ｃ、表１２）。
　これらの結果は、ＰＧと、トレハロースやデキストランとを含む乳酸リンゲル液からなる細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、ＰＧのみを含む乳酸リンゲル液からなる細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死を効果的に抑制する作用があることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
２－９　検討９
　検討８の結果から、ＰＧとトレハロースの併用効果が認められたため、トレハロース以外の糖類との併用効果が認められるかどうかを検討するために、５種類の糖類（１．４４％のグルコース、１．４４％のフルクトース、２．８８％のトレハロース、２．８８％のスクロース、又は２．８８％のラクトース）を含む、４％のＰＧ含有ＬＲ中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率及び生存細胞回収率を解析した。なお、比較対照として、これら糖類不含の４％のＰＧ含有ＬＲを用いて同様に解析した。また、各糖類のモル濃度は全て０．０８Ｍで同じである。
　その結果、トレハロース以外の４種類の糖類（グルコース、フルクトース、スクロース、又はラクトース）含む、４％のＰＧ含有細胞凍結保存液中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存しても、４％のＰＧ含有細胞凍結保存液中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率及び生存細胞回収率はほとんど変わらなかった（図１３及び表１３）。
　この結果は、ＰＧとの併用効果は、トレハロース以外の糖類では認められないことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
２－１０　検討１０
　２．５～５％のＰＧ及びトレハロースを含む細胞凍結保存液におけるトレハロースの最適な濃度を検討するために、６種類の細胞凍結保存液（４％のＰＧ含有ＬＲ；４％のＰＧ及び０．７２％のトレハロース含有ＬＲ；４％のＰＧ及び１．４４％のトレハロース含有ＬＲ；４％のＰＧ及び２．８８％のトレハロース含有ＬＲ；４％のＰＧ及び５．７６％のトレハロース含有ＬＲ；並びに、４％のＰＧ及び１１．５２％のトレハロース含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存し、融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率、生存細胞回収率、及びアネキシンＶ陽性率を解析した。
　その結果、４％のＰＧ及び０．７２～１１．５２％のトレハロース含有細胞凍結保存液（４％のＰＧ及び０．７２％のトレハロース含有ＬＲ；４％のＰＧ及び１．４４％のトレハロース含有ＬＲ；４％のＰＧ及び２．８８％のトレハロース含有ＬＲ；４％のＰＧ及び５．７６％のトレハロース含有ＬＲ；並びに、４％のＰＧ及び１１．５２％のトレハロース含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存すると、トレハロース不含の４％のＰＧ含有細胞凍結保存液（４％のＰＧ含有ＬＲ）中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣの細胞生存率及び生存細胞回収率が高く、特に、細胞凍結保存液におけるトレハロースの濃度が１．４４～２．８８％及び１１．５２％のとき、細胞生存率が有意に高く、また、細胞凍結保存液におけるトレハロースの濃度が０．７２～５．７６％のとき、生存細胞回収率が有意に高かった（図１４Ａ及び１４Ｂ、表１４）。
　また、４％のＰＧ及び０．７２～１１．５２％のトレハロース含有細胞凍結保存液中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存すると、トレハロース不含の４％のＰＧ含有細胞凍結保存液中にｈＡＤ－ＭＳＣを凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＡＤ－ＭＳＣのアネキシンＶ陽性率が低かった（図１４Ｃ、表１４）。
　これらの結果は、２．５～５％のＰＧ及び少なくとも０．７２％（例えば、１．４４～１１．５２％、０．７２～５．７６％）のトレハロースを含む細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、トレハロース不含の２．５～５％のＰＧ含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死をより効果的に抑制できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
２－１１　検討１１
　ｈＡＤ－ＭＳＣ以外の哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に凍結保存した場合にも、ＰＧとトレハロースの併用効果が発揮されることを確認するために、ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を、３種類の細胞凍結保存液（４％のＰＧを含む血清含有培養液；４％のＰＧを含むトレハロース含有ＬＲ；及び４％のＰＧを含むＬＲ）中に凍結保存し、融解直後、融解後１時間、３時間、及び６時間のｈＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞生存率及び生存細胞回収率を解析した。
　その結果、４％のＰＧを含む血清含有培養液や、４％のＰＧを含むトレハロース含有ＬＲ中にｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を凍結保存すると、４％のＰＧを含むＬＲにｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を凍結保存した場合と比べ、融解直後又はその後のｈＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞生存率及び生存細胞回収率が高かった（図１５及び表１５）。
　この結果は、ＰＧを含むトレハロース含有乳酸リンゲル液は、ＰＧを含む血清含有培養液と同程度の細胞保存効果があることを示すとともに、ＰＧを含むトレハロース含有乳酸リンゲル液は、ＰＧを含む乳酸リンゲル液よりも細胞保存効果が高いことも示しており、上記検討７及び８の結果を支持している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
２－１２　検討１２
　ｈＡＤ－ＭＳＣ以外の哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に凍結保存した場合にも、上記検討１～１０で示す効果が発揮されることを確認するために、ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を、５種類の細胞凍結保存液（２％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；３％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、７．５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中に凍結保存し、融解直後及び融解後３時間のｈＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞生存率及び生存細胞回収率を解析した。
　その結果、３～７．５％のＰＧを含む、４種類の細胞凍結保存液（３％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、７．５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を凍結保存すると、２％のＰＧのＰＧを含む細胞凍結保存液（２％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を凍結保存した場合と比べ、融解直後又はその後のｈＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞生存率及び生存細胞回収率が高く、特に細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が３～５％のとき細胞生存率が高く、また、細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が４～５％のとき生存細胞回収率が高かった（図１６及び表１６）。
　この結果は、３～７．５％（特に、３～５％、さらに４～５％）のＰＧ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、３～７．５％（特に、３～５％、さらに４～５％）以外の濃度のＰＧ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死をより効果的に抑制できることを示しており、上記検討１～１０の結果を支持している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
２－１３　検討１３
　検討１２に続き、ｈＡＤ－ＭＳＣ以外の哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に凍結保存した場合にも、上記検討１～１０で示す効果が発揮されることを確認するために、ｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を、検討１２で使用した５種類の細胞凍結保存液中に凍結保存し、融解直後のｈＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞生存率、生存細胞回収率、及びアネキシンＶ陽性率を解析した。
　その結果、３～７．５％のＰＧを含む、４種類の細胞凍結保存液（３％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、７．５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を凍結保存すると、２％のＰＧのＰＧを含む細胞凍結保存液（２％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞生存率及び生存細胞回収率が高く、特に細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が４～５％のとき細胞生存率が高く、また、細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が３～５％のとき生存細胞回収率が高かった（図１７Ａ及び１７Ｂ、表１７）。
　また、３～７．５％のＰＧを含む、上記４種類の細胞凍結保存液中にｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を凍結保存すると、２％のＰＧのＰＧを含む上記細胞凍結保存液中にｈＣＤ８陽性Ｔ細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＣＤ８陽性Ｔ細胞のアネキシンＶ陽性率が有意に低く、特に細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が４～５％のとき最も低かった（図１７Ｃ及び表１７）
　これらの結果は、３～７．５％（特に、３～５％、さらに４～５％）のＰＧ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、３～７．５％（特に、３～５％、さらに４～５％）以外の濃度のＰＧ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死をより効果的に抑制できることを示しており、上記検討１～１０の結果を支持している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
２－１４　検討１４
　検討１２及び１３に続き、ｈＡＤ－ＭＳＣ以外の哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に凍結保存した場合にも、上記検討１～１０で示す効果が発揮されることを確認するために、ｈＣＤ４陽性Ｔ細胞を、検討１２及び１３で使用した５種類の細胞凍結保存液中に凍結保存し、融解直後のｈＣＤ４陽性Ｔ細胞の細胞生存率、生存細胞回収率、及びアネキシンＶ陽性率を解析した。
　その結果、３～７．５％のＰＧを含む、４種類の細胞凍結保存液（３％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、７．５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＣＤ４陽性Ｔ細胞を凍結保存すると、２％のＰＧのＰＧを含む細胞凍結保存液（２％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＣＤ４陽性Ｔ細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＣＤ４陽性Ｔ細胞の細胞生存率及び生存細胞回収率が有意に高く、特に細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が４～５％のとき、最も高かった（図１８Ａ及び１８Ｂ、表１８）。
　また、３～７．５％のＰＧを含む、上記４種類の細胞凍結保存液中にｈＣＤ４陽性Ｔ細胞を凍結保存すると、２％のＰＧのＰＧを含む上記細胞凍結保存液中にｈＣＤ４陽性Ｔ細胞を凍結保存した場合と比べ、凍結融解直後のｈＣＤ４陽性Ｔ細胞のアネキシンＶ陽性率が有意に低く、特に細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が４～５％のとき最も低かった（図１８Ｃ及び表１８）
　これらの結果は、３～７．５％（特に、３～５％、さらに４～５％）のＰＧ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、３～７．５％（特に、３～５％、さらに４～５％）以外の濃度のＰＧ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死をより効果的に抑制できることを示しており、上記検討１～１３の結果を支持している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
２－１５　検討１５
　検討１２～１４に続き、ｈＡＤ－ＭＳＣ以外の哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に凍結保存した場合にも、上記検討１～１０で示す効果が発揮されることを確認するために、ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞（凍結保存前の細胞生存率は７３．３±１．２％）を、検討１２～１４で使用した５種類の細胞凍結保存液中に凍結保存し、融解直後のｈＣＤ４陽性Ｔ細胞の細胞生存率及びＣＤ３４陽性率を解析した。
　その結果、３～７．５％のＰＧを含む、４種類の細胞凍結保存液（３％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；４％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ；並びに、７．５％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞を凍結保存すると、２％のＰＧのＰＧを含む細胞凍結保存液（２％のＰＧ、２．７％のトレハロース、及び４．５％のデキストラン含有ＬＲ）中にｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞を凍結保存した場合と比べ、融解直後のｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞の細胞生存率が高く、特に細胞凍結保存液におけるＰＧの濃度が３～５％のとき細胞生存率が高かった（図１９Ａ及び表１９）。
　この結果は、３～７．５％（特に、３～５％）のＰＧ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、３～７．５％（特に、３～５％）以外の濃度のＰＧ、トレハロース、及びデキストラン含有細胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存した場合と比べ、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死をより効果的に抑制できることを示しており、上記検討１～１４の結果を支持している。
　また、凍結保存後のｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞におけるＣＤ３４陽性率は、凍結保存前のｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞におけるＣＤ３４陽性率とほとんど変わらなかったことから（図１９Ｂ及び表１９）、細胞凍結保存液に含まれるＰＧ、トレハロース、及びデキストランは、ｈＣＤ３４陽性造血系幹細胞の性質に影響を及ぼすものではないことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　本発明によると、哺乳動物細胞の凍結融解により生じる細胞死を効果的に抑制でき、かつ、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を効果的に高めることができるため、再生医療等における移植医療分野やがん治療分野で有用である。

Claims (12)

  1. 　２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコールを含む哺乳動物細胞凍結保存液。
  2. 　プロピレングリコールの濃度が２．５～５．０（ｖ／ｖ）％であり、凍結融解後の哺乳動物細胞の増殖能を高めるために用いられる、請求項１に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  3. 　デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩；及び、ヒドロキシエチルデンプン若しくはその誘導体又はそれらの塩；から選択される高分子化合物をさらに含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  4. 　トレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩をさらに含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  5. 　２．５～８．７５（ｖ／ｖ）％のプロピレングリコールを含む等張液である、請求項１に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  6. 　等張液が、乳酸リンゲル液、生理食塩水、リンゲル液、及び酢酸リンゲル液から選択される、請求項５に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  7. 　哺乳動物細胞が、間葉系幹細胞、Ｔ細胞、又は造血系幹細胞である、請求項１～６のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  8. 　哺乳動物細胞を含む、請求項１～６のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  9. 　哺乳動物細胞が、間葉系幹細胞、Ｔ細胞、又は造血系幹細胞である、請求項８に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  10. 　臍帯血を含む、請求項９に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
  11. 　請求項８に記載の哺乳動物細胞凍結保存液を、凍結保存する工程（ａ）を含む、哺乳動物細胞を凍結保存する方法。
  12. 　工程（ａ）の後、哺乳動物細胞を凍結融解し、５日間以上培養する工程（ｂ）をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012235728A (ja) * 2011-05-11 2012-12-06 Univ Of Fukui 細胞の凍結保存液および凍結保存方法
WO2020149394A1 (ja) * 2019-01-17 2020-07-23 長瀬産業株式会社 細胞凍結保存液
JP2021000027A (ja) * 2019-06-21 2021-01-07 帝人株式会社 医療用細胞凍結保存液

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012235728A (ja) * 2011-05-11 2012-12-06 Univ Of Fukui 細胞の凍結保存液および凍結保存方法
WO2020149394A1 (ja) * 2019-01-17 2020-07-23 長瀬産業株式会社 細胞凍結保存液
JP2021000027A (ja) * 2019-06-21 2021-01-07 帝人株式会社 医療用細胞凍結保存液

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