JP5717030B2 - 有核赤血球の脱核方法及び脱核誘導剤 - Google Patents

有核赤血球の脱核方法及び脱核誘導剤 Download PDF

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Description

本発明は、プロオピオメラノコルチン（POMC）由来の化合物を未分化（有核）赤血球に添加することで、短時間に赤血球分化の最終段階である脱核を誘導する方法及び該化合物を含む脱核誘導剤に関する。
なお、本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願の特願2009-040781からの優先権を請求する。
医療分野では現在献血による輸血が主体であるが、その供給を確保するには収集、感染等の検査、保存、に多大な労力や費用が必要となっている。医療や研究の分野において血液を十分量供給する為には、短時間かつ効率的に培養造血系幹細胞から成熟赤血球を誘導する方法が必要である。将来的に、iPS細胞やES細胞などを含む全能性又は多能性幹細胞から造血幹細胞の培養技術と応用が可能となれば、すべての行程を人工的に培養でき、感染のリスクが低くかつ安定的に血液の供給が可能となり医療への貢献は高い。また、工業的に多量の血液培養が可能となり、低コストでの生産と医療産業としての発展が期待できる。
赤血球は、酸素を運ぶ重要な血液成分であるが、それ自身は核を持たないために増えることはできない。よって、生体内では、赤血球の前段階の赤血球前駆細胞が増殖し、核を排出する「脱核」を経て成熟する。
従って、大量に赤血球を製造するには、赤血球前駆細胞の大量増殖が必要で、そのためには、「細胞株（赤血球前駆細胞株）」の樹立が必要であった。
また、造血に関する研究では、Ihleらのグループにより、「SOCS3が胎児肝臓での造血に必須であること」が報告されている（参照：非特許文献１）。
さらに、長田らのグループにより、「DNase IIノックアウトマウスの胎児では成熟赤血球が出来ず、重篤な貧血を引き起こし、胎児肝臓のマクロファージDNase IIは赤血球分化のサポートとして重要であること」が報告されている（参照：非特許文献２）。
一方、独立行政法人理化学研究所のグループによりマウスES細胞から赤血球前駆細胞株が樹立され、赤血球前駆細胞の試験管内での大量培養が可能となった（参照：非特許文献３）。
該大量培養が可能になったことにより、赤血球前駆細胞を直接体内に輸血する方法も考えられる。しかし、該前駆細胞は有核であるため癌化の問題など安全性の面が非常に危惧される。実際には、該前駆細胞をさらに分化させて脱核し、無核となった成熟赤血球を得るための誘導方法が必要である。
また、Miharadaらによって報告されている臍帯血を利用した成熟赤血球の製造方法（非特許文献４）では、「赤血球前駆細胞から脱核した成熟赤血球の生成まで20日間の培養日数を必要とし、最終の脱核細胞は77％であること」を開示している。
前記成熟赤血球の製造方法では、脱核を誘導する因子は培地に添加されておらず、培養初期に添加される分化誘導因子により赤血球前駆細胞を分化させ、それに伴う自然な成熟として脱核が誘導されている。
前述のとおり、赤血球前駆細胞の製造方法はすでにいくつか知られているが、その過程で有核赤血球を短時間かつ高効率に脱核させる技術については、ほとんど知られていない。しかし、脱核を誘導する因子を培地に添加しない方法であるが下記の報告がある（参照：特許文献１）。
特許文献１は、「造血系幹細胞を、エリスロポエチンの非存在下で培養することにより脱核を誘導する方法」を開示している。しかし、脱核率は、11日目では、1〜5％であり、15日目では65〜80％である。すなわち、脱核誘導時間が長くそして脱核割合も十分であるとは言えない。
以上の背景から、現状の製造方法で得られた赤血球では、有核赤血球が約20〜30％残存し、さらに該赤血球を体内に投与すると癌化の危険性を有することが問題となっている。
加えて、今後、ヒトiPS又はＥＳ細胞から大量の有核赤血球を誘導可能となり、短時間で赤血球の脱核を誘導するための方法が必要になると考えられる。
国際公開WO2005/118780
Jean-Christophe et al., Cell. 1999;98(5):617-27. Kawane K. et al., Science. 2001;292(5521):1546-9. Hiroyama T. et al., PLoS ONE. 2008;3(2):e1544. Miharada K. et al.,Nat Biotechnol. 2006 ;24(10):1255-6.
本発明は、以上の背景から、新たに積極的かつ短時間に脱核を誘導する方法及び脱核誘導剤を提供することを課題とする。
より詳しくは、短時間に赤血球分化の最終段階である脱核を誘導する因子を提供することを課題とする。
本発明は、上記の課題を解決するものとして以下のことを特徴としている。
「１．分離した有核赤血球をプロオピオメラノコルチン（POMC）由来の化合物を含む培養液で培養することを特徴とする有核赤血球の脱核方法。
２．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項１に記載の有核赤血球の脱核方法。
（１）POMC
（２）ACTH
（３）MSH
（４）LPH
（５）エンドルフィン
（６）CLIP
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
３．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項１に記載の有核赤血球の脱核方法。
（１）ACTH
（２）α-MSH
（３）CLIP
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
４．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項１に記載の有核赤血球の脱核方法。
（１）配列番号１に記載のペプチド
（２）配列番号２に記載のペプチド
（３）配列番号３に記載のペプチド
（４）配列番号４に記載のペプチド
（５）配列番号５に記載のペプチド
（６）配列番号６に記載のペプチド
（７）配列番号７に記載のペプチド
（８）配列番号８に記載のペプチド
（９）配列番号９に記載のペプチド
（１０）配列番号１０に記載のペプチド
（１１）配列番号１１に記載のペプチド
（１２）配列番号１２に記載のペプチド
（１３）配列番号１３に記載のペプチド
（１４）配列番号１４に記載のペプチド
（１５）配列番号１５に記載のペプチド
（１６）配列番号１６に記載のペプチド
（１７）配列番号１７に記載のペプチド
（１８）配列番号１８に記載のペプチド
（１９）配列番号１９に記載のペプチド
（２０）上記（１）〜（１９）のいずれか１を含むペプチド
（２１）上記（１）〜（１９）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
（２２）上記（１）〜（１９）のいずれか１のペプチドと90％以上の相同性を有し、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
（２３）上記（１）〜（１９）のいずれか１のペプチドにおいて、1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
５．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項１に記載の有核赤血球の脱核方法。
（１）配列番号１に記載のペプチド
（２）配列番号２に記載のペプチド
（３）配列番号３に記載のペプチド
（４）配列番号１１に記載のペプチド
（５）配列番号１２に記載のペプチド
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１を含むペプチド
（７）上記（１）〜（５）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
（８）上記（１）〜（５）のいずれか１のペプチドと90％以上の相同性を有し、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
（９）上記（１）〜（５）のいずれか１のペプチドにおいて、1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
６．前記化合物の培養液中の濃度が、0.01〜20.0μMであることを特徴とする前項１〜５のいずれか１に記載の有核赤血球の脱核方法。
７．前項１〜６のいずれか１に記載の脱核方法で得られた脱核赤血球。
８．POMC由来の化合物を含む脱核誘導剤。
９．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項８に記載の脱核誘導剤。
（１）POMC
（２）ACTH
（３）MSH
（４）LPH
（５）エンドルフィン
（６）CLIP
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
１０．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項８に記載の脱核誘導剤。
（１）ACTH
（２）α-MSH
（３）CLIP
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
１１．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項８に記載の脱核誘導剤。
（１）配列番号１に記載のペプチド
（２）配列番号２に記載のペプチド
（３）配列番号３に記載のペプチド
（４）配列番号４に記載のペプチド
（５）配列番号５に記載のペプチド
（６）配列番号６に記載のペプチド
（７）配列番号７に記載のペプチド
（８）配列番号８に記載のペプチド
（９）配列番号９に記載のペプチド
（１０）配列番号１０に記載のペプチド
（１１）配列番号１１に記載のペプチド
（１２）配列番号１２に記載のペプチド
（１３）配列番号１３に記載のペプチド
（１４）配列番号１４に記載のペプチド
（１５）配列番号１５に記載のペプチド
（１６）配列番号１６に記載のペプチド
（１７）配列番号１７に記載のペプチド
（１８）配列番号１８に記載のペプチド
（１９）配列番号１９に記載のペプチド
（２０）上記（１）〜（１９）のいずれか１を含むペプチド
（２１）上記（１）〜（１９）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
（２２）上記（１）〜（１９）のいずれか１のペプチドと90％以上の相同性を有し、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
（２３）上記（１）〜（１９）のいずれか１のペプチドにおいて、1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
１２．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項８に記載の脱核誘導剤。
（１）配列番号１に記載のペプチド
（２）配列番号２に記載のペプチド
（３）配列番号３に記載のペプチド
（４）配列番号１１に記載のペプチド
（５）配列番号１２に記載のペプチド
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１を含むペプチド
（７）上記（１）〜（５）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
（８）上記（１）〜（５）のいずれか１のペプチドと90％以上の相同性を有し、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
（９）上記（１）〜（５）のいずれか１のペプチドにおいて、1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
１３．造血系幹細胞又は赤血球前駆細胞をPOMC由来の化合物を含む培養液で培養することを特徴とする脱核赤血球の培養及び／又は増幅方法。
１４．前記培養液にはサイトカインを含んでいることを特徴とする前項１３に記載の脱核赤血球の培養及び／又は増幅方法。
１５．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項１３又は１４に記載の脱核赤血球の培養及び／又は増幅方法。
（１）POMC
（２）ACTH
（３）MSH
（４）LPH
（５）エンドルフィン
（６）CLIP
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
１６．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項１３又は１４に記載の脱核赤血球の培養及び／又は増幅方法。
（１）ACTH
（２）α-MSH
（３）CLIP
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
１７．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項１３又は１４に記載の脱核赤血球の培養及び／又は増幅方法。
（１）配列番号１に記載のペプチド
（２）配列番号２に記載のペプチド
（３）配列番号３に記載のペプチド
（４）配列番号４に記載のペプチド
（５）配列番号５に記載のペプチド
（６）配列番号６に記載のペプチド
（７）配列番号７に記載のペプチド
（８）配列番号８に記載のペプチド
（９）配列番号９に記載のペプチド
（１０）配列番号１０に記載のペプチド
（１１）配列番号１１に記載のペプチド
（１２）配列番号１２に記載のペプチド
（１３）配列番号１３に記載のペプチド
（１４）配列番号１４に記載のペプチド
（１５）配列番号１５に記載のペプチド
（１６）配列番号１６に記載のペプチド
（１７）配列番号１７に記載のペプチド
（１８）配列番号１８に記載のペプチド
（１９）配列番号１９に記載のペプチド
（２０）上記（１）〜（１９）のいずれか１を含むペプチド
（２１）上記（１）〜（１９）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
（２２）上記（１）〜（１９）のいずれか１のペプチドと90％以上の相同性を有し、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
（２３）上記（１）〜（１９）のいずれか１のペプチドにおいて、1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
１８．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項１３又は１４に記載の脱核赤血球の培養及び／又は増幅方法。
（１）配列番号１に記載のペプチド
（２）配列番号２に記載のペプチド
（３）配列番号３に記載のペプチド
（４）配列番号１１に記載のペプチド
（５）配列番号１２に記載のペプチド
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１を含むペプチド
（７）上記（１）〜（５）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
（８）上記（１）〜（５）のいずれか１のペプチドと90％以上の相同性を有し、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
（９）上記（１）〜（５）のいずれか１のペプチドにおいて、1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ該ペプチドと実質的同質の有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
１９．前項１３〜１８のいずれか１に記載の脱核赤血球の培養及び／又は増幅方法で得られた脱核赤血球。
２０．In vitroにおいて、有核赤血球に発現しているメラノコルチンレセプターのMC1R, MC2R, MC3R, MC4R及び／又はMC5Rに作用して脱核を誘導することを特徴とする脱核誘導剤。
２１．In vitroにおいて、有核赤血球に発現しているメラノコルチンレセプターのMC1R, MC2R, MC3R, MC4R及び／又はMC5Rに作用して脱核を誘導することを特徴とする有核赤血球の脱核方法。」
本発明は、POMC由来の化合物を未分化（有核）赤血球に添加することで、短時間に赤血球分化の最終段階の脱核を誘導する方法及び該化合物を含む脱核誘導剤を提供することができた。
これにより、血液の製造期間の短縮が可能になり、有核赤血球の輸血に伴う癌化の危険性を除くことが可能となる。すなわち、安全な血液を短時間かつ安定して得ることができ、医療技術への貢献は非常に大きい。
POMCの構造 ACTH1-24によるラット胎児由来の有核赤血球の脱核率 ACTH1-39によるラット胎児由来の有核赤血球の脱核率 ACTH1-39をラット胎児由来の有核赤血球に添加後、6時間培養した試料中の画像 CLIP及びα-MSH（1μM）によるラット胎児由来の有核赤血球の脱核率 CLIP及びα-MSH（5μM）によるラット胎児由来の有核赤血球の脱核率 ACTH1-24、CLIP及びα-MSH（5μM）でのヒト臍帯血由来の有核赤血球の脱核率 ACTH1-24、ACTH1-39、CLIP及びα-MSH（0.5μM）でのヒト臍帯血由来の有核赤血球の脱核率 ACTH1-24によるヒト臍帯血由来の成熟赤血球の脱核誘導効率 メラノコルチンレセプターであるMC2R及びMC5Rのヒト臍帯血由来の赤血球前駆細胞での発現確認
本発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下に、その実施の形態について説明する。
（造血系幹細胞）
本発明の「造血系幹細胞」は、あらゆる種類の血球に分化する能力を有するとともに造血再構築能を有する細胞である。主に骨髄、臍帯血、脾臓あるいは肝臓中に存在し、微量ながら末梢血にも存在する。なお、「幹細胞」は、多能性造血系幹細胞及びこれから分化した骨髄系幹細胞（CFU−GEMM）を意味する。これら細胞はCD34、CD133陽性細胞である。
造血系幹細胞は、自体公知の方法で得ることができる。例えば、上記記載の骨髄、臍帯血、脾臓、肝臓又は末梢血に存在する造血系幹細胞を細胞分離装置（フローサイトメトリー等）から分離することで得られることができる。
より詳しくは、造血系幹細胞は、造血系幹細胞表面抗原（例えば、CD34）に結合する市販の抗体を用い、当業者に周知の方法を用いて単離することができる。例えば、該抗体は、磁性ビーズに結合され、そして免疫学的方法が、所望の細胞型を回収するために利用される。好ましくは、造血系幹細胞は、CD34陽性細胞の形態である。実際、CD34は、造血系幹細胞の標準マーカーとして知られている。
CD34陽性細胞の分離は、多くの様々な方法により達成できる。最も広く使用されるものは、固体支持体上に固定された抗CD34抗体(Cellpro, Baxter, Myltenyi)に当該細胞を結合させることに基づく陽性免疫学的選別である。他の選別方法は、細胞系列特異的細胞表面抗原の発現に基づいてCD34陽性細胞から、CD34を発現しない細胞の全てを単離するネガティブ選別を含む。加えて、培養される造血系幹細胞は、胚性幹細胞からex vivoで産生することもできる(参照：WO 01/34776、US 6,613,568)。
また、例えば、ヒト臍帯血CD34陽性細胞（独立行政法人理化学研究所のCell Bankから入手可能）を利用することができる。
（赤血球前駆細胞）
本発明の「赤血球前駆細胞」は、造血系幹細胞から各系統の血液細胞が分化形態学的には同定できないが、すでに赤血球系の一方向の血液細胞にしか分化し得ない細胞を意味する。
具体的には血小板コロニー形成細胞（CFU−MEG）、好酸球コロニー形成細胞（CFU−EO）、顆粒球単球コロニー形成細胞（CFU−GM）、赤血球形成細胞（BFU−E、CFU−E）、T前駆細胞、B前駆細胞などである。これらはいずれもCD34陽性細胞である。
赤血球前駆細胞は、自体公知の方法で得ることができる。例えば、上記記載の骨髄、臍帯血、脾臓、肝臓又は末梢血に存在する赤血球前駆細胞を細胞分離装置（フローサイトメトリー等）から分離することで得られる。
加えて、マウスES細胞から赤血球前駆細胞に誘導する方法も知られている（参照：非特許文献３）。
加えて、造血系幹細胞または赤血球前駆細胞を大量に増幅するために、各種の方法及び最適な培養条件への開発が試みられてきている。そして、下記のようにいくつかの報告がされている。
よって、本発明で使用する造血系幹細胞または赤血球前駆細胞は、下記記載の方法を利用して得ることもできる。
（１）哺乳動物由来のストローマ細胞と造血系幹細胞を共培養することにより造血系幹細胞を増殖する方法（参照：特開平10-295369）。
（２）ヒト臍帯血から得られる造血支持能を有する細胞を体外で増幅させて造血系幹細胞を得る方法（参照：特開2002-6520）。
（３）ヒト造血系幹細胞または赤血球前駆細胞を、ヒト胎盤組織または臍帯組織由来のストローマ細胞の共存下で培養する方法（参照：特開2004-222502）。
（４）子宮内膜細胞を用いた造血系幹細胞または赤血球前駆細胞の培養及び増幅方法（参照：特表2007-525231）。
（有核赤血球）
本発明の「有核赤血球」は、脱核をした赤血球（成熟赤血球）と区別するために使用する。
有核赤血球の調製方法は、多種報告されており自体公知の方法が利用することができる。例えば、国際公開WO2004/012750に記載の「採集した全血に水溶性高分子化合物を添加して選択促進的に赤血球を凝集沈降させる方法」を利用することができるが、特に限定されない。
加えて、臍帯血由来の造血幹細胞又は赤血球前駆細胞を有核赤血球に分化させる方法も知られている（参照：非特許文献４）。
上記造血系幹細胞、赤血球前駆細胞又は有核赤血球の由来は、哺乳類由来であれば特に限定されない。好ましくは、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ等が例示されるが、より好ましくはヒトである。なお、ヒト由来の上記造血系幹細胞、赤血球前駆細胞又は有核赤血球は、生体から分離されたものを対象とする。
（POMC由来の化合物）
本発明の「POMC由来の化合物」は、POMC、MSH（α-、β-、γ-MSH）、ACTH、LPH（γ-、β-LPH）、エンドルフィン（α、β、γ-エンドルフィン）若しくはCLIP、又はそれらの保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体を対象とする。
なお、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体は、自体公知の方法で得ることができる。
POMCは、下垂体において産生する分子量約31,100の糖タンパク質（プロホルモン）であり、宿主に対して多くの効果をもたらす一連のコルチコトロピン性ホルモンの前駆体である。
なお、POMC は、メラノサイト刺激ホルモン（MSH）、アドレノコルチコトロピン（ACTH）、リポトロピン（LPH）、CLIP並びにβエンドルフィンの前駆体である。これら全てのホルモンは、ただ１つの大きな前駆体POMCから切断されて、生成される（参照：図１）。
ACTH｛（adrenocorticotropic hormone）、アドレノコルチコトロピン：副腎皮質刺激ホルモン｝は、視床下部ホルモンである副腎皮質刺激ホルモン放出因子（CRF）の作用を受け、下垂体前葉ACTH産出細胞で産出、分泌される。なお、ACTHは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。加えて、本明細書において、ACTHは、以下のACTHの断片配列と区別するために、ACTH1-39と称する場合がある。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe（配列番号１）
加えて、様々なACTHの断片配列が知られている。これらの断片配列自体が脱核作用を有すると考えられる。
ACTH1-24（ACTHの1番から24番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro（配列番号２）
ACTH1-10（ACTHの1番から10番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly（配列番号１３）
ACTH1-14（ACTHの1番から14番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly（配列番号１４）
ACTH1-16（ACTHの1番から16番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys（配列番号１５）
ACTH1-17（ACTHの１番から17番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg（配列番号１６）
ACTH4-10（ACTHの4番から10番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly（配列番号１７）
ACTH7-38（ACTHの7番から38番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu（配列番号１８）
ACTH4-9（ACTHの4番から9番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp（配列番号１９）
MSH｛（melanocyte-stimulating hormone）、メラノサイト刺激ホルモン｝は、脳下垂体中葉で生成されるペプチドホルモンであり、α-MSH、β-MSH、γ-MSHが存在している。
α-MSHは、Acetyl基を含む以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Acetyl-(N)-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2（配列番号３）
β-MSHは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ala-Glu-Lys-Lys-Asp-Glu-Gly-Pro-Tyr-Arg-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Ser-Pro-Pro-Lys-Asp（配列番号４）
γ-MSHは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly（配列番号５）
LPH｛（lipotropin）、脂肪動員ホルモン｝は、下垂体前葉および中葉で生成される単鎖のポリペチドであり、γ-LPH，β-LPHがある。
γ-LPHは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu（配列番号６）
β-LPHは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr（配列番号７）
エンドルフィン（endorphin）は、哺乳類の脳及び下垂体に存在する内因性オピオイドペプチドで、α、β、γの3種類が知られている。
α-エンドルフィンは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr（配列番号８）
β-エンドルフィンは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu（配列番号９）
γ-エンドルフィンは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu（配列番号１０）
CLIP（カルジオトロピン様ペプチド）は、下記のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe（配列番号１１）
なお、上記のＭＳＨ（α-、β-、γ-MSH）、ACTH、LPH（γ-、β-LPH）、エンドルフィン（α、β、γ-エンドルフィン）又はCLIPは、各種間において一部のアミノ酸が異なる場合がある。
例えば、ACTHにおいて、クジラは配列番号１と同じ配列であるが、ブタでは配列番号の１の31番目のSerがLeuになっており、ヒツジ、ウシでは配列番号１の33番目のGluがGlnになっている。
本発明では、各種間において異なるＭＳＨ（α-、β-、γ-MSH）、ACTH、LPH（γ-、β-LPH）、エンドルフィン（α、β、γ-エンドルフィン）及びCLIPもPOMC由来の化合物として含める。
また、下記実施例１〜５の結果により、ACTH1-39、ACTH1-24及びCLIPは、赤血球の脱核誘導作用を有することを確認している。よって、ACTH1-39、ACTH1-24及びCLIPに共通する下記のアミノ酸残基を有するペプチドが赤血球の脱核誘導作用を担っていると考えられる。よって、下記ペプチドもPOMC由来の化合物として含める。
Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro（配列番号１２）
また、本発明は、上記いずれかに記載のペプチドを含むペプチド、上記いずれかに記載のペプチドと90％以上の相同性を有しかつ該ペプチドと実質的同質の赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド又は、上記いずれかに記載のペプチドに対して、1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しておりかつ実質的同質の赤血球の脱核誘導作用を持つペプチドもPOMC由来の化合物として含める。
「配列番号１に記載のペプチドを含むペプチド」とは、配列番号１に記載のペプチドの赤血球の脱核作用を実質的に維持し、Ｎ末端及び／又はＣ末端に1〜30、1〜20、1〜10、1〜5個の任意のアミノ酸を付加したペプチドを意味する。
「配列番号１に記載のペプチドと実質的に同質の脱核誘導作用」とは、該ペプチドの有核赤血球の脱核作用を有することを意味し、その程度が該ペプチドの脱核作用と比較して強くても弱くてもよい。
「配列相同性」とは、通常、アミノ酸配列の全体で70％以上、好ましくは80％、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上であることが適当である。
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと配列相同性を有するペプチドとして、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、例えば1〜15個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、さらにより好ましくは1個〜3個、またさらに好ましくは1個〜2個、最も好ましくは1個のアミノ酸の変異、例えば欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表されるペプチドが例示できる。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと実質的に同質の脱核作用を有するものである限り特に制限されない。
変異を有するペプチドは、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応（以下、PCRと略称する）などを単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法（サムブルック（Sambrook）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、1988年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ulmer, K.M.）、「サイエンス（Science）」、1983年、第219巻、p.666-671）を利用することもできる。ペプチドの場合、変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
ペプチドの製造は、遺伝子工学的手法、化学合成、および無細胞タンパク質合成により実施できる。ペプチドは、製造された後に、さらに精製して用いることができる。
ペプチドの製造は、該ペプチドをコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的な遺伝子工学的手法｛サムブルック（Sambrook）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、1988年、丸善株式会社；ウルマー（Ulmer, K.M.）、「サイエンス（Science）」、1983年、第219巻、p. 666-671；エールリッヒ（Ehrlich, H.A.）編、「PCRテクノロジー，DNA増幅の原理と応用」、1989年、ストックトンプレス｝により実施できる。
ペプチドの製造は、一般的な化学合成法でも製造できる。ペプチドの化学合成方法として、例えば、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれも利用できる。かかる蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含する。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従って実施できる。縮合法として、アジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、N−ヒドロキシサクシンアミド、N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド等）法、およびウッドワード法等を例示できる。
ペプチドの精製および／または分離は、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により実施できる。分離操作方法として、硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーおよび透析法等の公知の方法を例示できる。これら方法は単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、ペプチドのアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作製し、該抗体により特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティークロマトグラフィーが推奨される。
（脱核誘導剤）
本発明の「脱核誘導剤」は、上記いずれか１以上のPOMC由来の化合物を含む。なお、該誘導剤は、脱核誘導作用を維持するため又は誘導剤の安定化のために、必要に応じて、下記担体を含むこともできる。
上記担体は、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤を例示できる。より具体的には、水、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースを例示できる。これらは、本誘導剤の剤形に応じて適宜1種類または2種類以上を組み合せて使用される。その他、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびpH調整剤等を適宜使用することもできる。安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のL−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体を例示できる。L−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を例示できる。等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンを例示できる。キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸を例示できる。
本発明に係る脱核誘導剤に含まれる有効成分であるPOMC由来の化合物量は、広範囲から適宜選択される。通常約0.00001〜70重量％、好ましくは0.0001〜5重量％程度の範囲とするのが適当である。
｛培養液（培地）｝
本発明の「培養液（培地）」については、ES細胞、造血系幹細胞、赤血球前駆細胞、有核赤血球、網状赤血球、若しくは成熟赤血球が維持・生存でき、又はES細胞、造血系幹細胞若しくは赤血球前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ、如何なる培養液（培地）を用いることができる。
例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素などの無機物、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、サイトカイン、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有することもできる。
一例として DMEM 10%FBS （細胞培養のための抗生物質を含む）等を使用することができる。
（培養条件）
本発明の「培養条件」は、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、及び酸素、炭酸ガス、pH、酸化還元電位などの化学的環境条件のいずれについても、ES細胞、造血系幹細胞、赤血球前駆細胞、有核赤血球、網状赤血球、若しくは成熟赤血球が維持・生存でき、又はES細胞、造血系幹細若しくは赤血球前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ、如何なる環境条件であってもよい。
温度については、20〜40℃、好ましくは約37℃である。
浸透圧については具体的には生理条件における浸透圧であり、好ましくは生理食塩水と等しい浸透圧である。
光としては暗室ほどの暗い条件であってもよいし、晴天時の外の明るさほどに明るくてもよい。
酸素濃度としては具体的には培養系が気相中の酸素濃度が10％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度、又は気相中の酸素濃度が30％の気相と接触している状態での酸素濃度であってもよく、好ましくは気相中の酸素濃度が20％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度の気相と接触している状態での酸素濃度である。
培養系における一般的なpHは、6.0〜8.0であり、好ましくは生理条件と同等のpHである。pHをコントロールするには二酸化炭素を用いてもよいし、他のいかなる緩衝液を用いてもよい。
炭酸ガスの濃度としては具体的には培養が5％の気相と接触している状態での溶存炭酸ガス濃度である。
本発明の「有核赤血球の脱核方法」は、以下の方法を利用することができるが、赤血球の脱核を誘導できるならば特に限定されない。
細胞濃度（有核赤血球を含む）を培養液1ml中に1.0×103〜1.0×1010、好ましくは1.0×104〜1.0×109、より好ましくは1.0×105〜1.0×107、最も好ましくは約1.0×106に調製する。
そして、POMC由来の化合物を培養液中の最終濃度が0.1〜50μＭ、好ましくは0.5〜30μＭ、より好ましくは0.7〜20μＭ、最も好ましくは1.0〜10μＭになるように添加する。なお、該化合物の添加時期は、培養開始時点でもよいが、培養途中に適宜追加しても良い。
培養温度は、33〜38℃が好ましく、CO2濃度は、約3〜7％が好ましい。
ラット胎児由来の有核赤血球における脱核誘導のための培養時間は、2〜24時間、好ましくは3〜12時間、より好ましくは4〜8時間である。
また、ヒト臍帯血由来の造血幹細胞の培養から脱核赤血球へは20日間を要するが（参照 非特許文献４）、本方法においては15日目頃から脱核を導き、16日目には半数以上の脱核を誘導できる。
なお、ヒトとラットにおけるに脱核に要する時間の違いは、胎児の発生に要する時間や赤血球の生存日数の違いによるものと考えられる。
本発明の「脱核赤血球の培養／及び増幅方法」は、以下の方法を利用することができるが、有核赤血球の脱核を誘導できるならば特に限定されない。
造血系幹細胞又は赤血球前駆細胞を上記記載の方法により有核を有する赤血球に分化する。なお、分化の過程において、必要に応じて各種サイトカインを培養液中に導入する。次に、有核を有する赤血球が培養液中に存在する時期に、POMC由来の化合物を培養液中の最終濃度が0.1〜50μＭ、好ましくは0.5〜30μＭ、より好ましくは0.7〜20μＭ、最も好ましくは1.0〜10μＭになるように添加する。なお、該化合物の添加時期は、培養開始時点でもよいが、培養途中に適宜追加しても良い。
（サイトカイン）
本発明の「サイトカイン」は、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子で、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖・分化の調節作用などを示す物質を意味する。具体的には、インターロイキン−１（IL−1）、インターロイキン−２（IL−2）、インターロイキン−３（IL−3）、インターロイキン−４（IL−4）、インターロイキン−５（IL−5）、インターロイキン−６（IL−6）、インターロイキン−７（IL−7）、インターロイキン−８（IL−8）、インターロイキン−９（IL−9）、インターロイキン−１０（IL−10）、インターロイキン−１１（IL−11）、インターロイキン−１２（IL−12）、インターロイキン−１３（IL−13）、インターロイキン−１４（IL−14）、インターロイキン−１５（IL−15）、インターロイキン−１６（IL−16）、インターフェロンα（IFN−α）、インターフェロンβ（IFN−β）、インターフェロンγ（IFN−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（G−CSF）、顆粒球-単球コロニー刺激因子（GM−CSF）、単球コロニー刺激因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、好酸球コロニー刺激因子、血小板コロニー刺激因子、幹細胞因子（SCF）、幹細胞増殖因子、flk2/flt3-リガンド、白血病阻害（阻止）因子、エリスロポエチン（EPO）、マクロファージ由来炎症性タンパク１α（MIP−1α）などが挙げられ、好ましくはインターロイキン−３、幹細胞因子（SCF）、Flt-3L、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、flk2/flt3-リガンド、MIP-1αまたはエリスロポエチンなどが挙げられる。
（脱核赤血球の保存方法）
脱核赤血球を保存（長期間も含む）する場合、自体公知の方法を用いることができる。保存の方法として、例えば凍結保存法が挙げられ、この場合必要に応じてセルバンカー(C)（日本全薬工業株式会社）、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ショ糖、グルコース、ポリビニルピロリドン（PVP）、トレハロースなどの凍結防御剤を加え、プログラムフリーザーなどを用い緩速凍結を行い、その後液体窒素などの中に保存すればよい。
（アゴニスト）
有核赤血球の表面には、ACTHの標的受容体であるメラノコルチンレセプターのMC2R及びMC5Rが発現していることが知られている。
本発明では、下記実施例６の結果より、ヒト由来の赤血球前駆細胞では、メラノコルチンレセプターであるMC1R, MC2R, MC3R, MC4R及び／又はMC5Rが発現していることを確認した。
よって、本発明では、有核赤血球のメラノコルチンレセプターのMC1R, MC2R, MC3R, MC4R及び／又はMC5Rに作用（結合）して脱核を誘導するアゴニストを含む。
加えて、本発明では、有核赤血球のメラノコルチンレセプターのMC2R及び／又はMC5Rに作用（結合）して脱核を誘導する有核赤血球の脱核方法も含む。
以下に具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
（ACTH1-24によるラット胎児由来の有核赤血球の脱核率の確認）
本実施例では、ACTH1-24がラット胎児由来の有核赤血球の脱核を誘導するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
（実験方法）
実験飼育用ラットを交配させ、着床後13日齢の胎児12匹から末梢血を採取した。
採取した末梢血を室温、1,000×gで5分間遠心（遠心機； HITACHI／05PR-22）した。そして、クリーンベンチ内で血清を除去し、培養液10ml[10% FBS（SIGMA ／CR1211）／RPMI−1640 Medium(c)（SIGMA ／R8578）／1％ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA／P4333）添加 ]に懸濁後、再度遠心し、上清を除き培養液に懸濁した。この作業を2回行い、最終的に10ml培養液に懸濁した末梢血培養用試料を作成した。
本試料を約10μl採取し、血球計算盤（Burker−Turk Deep 1/10mm／Erma Tokyo／7787）を用いて血球（細胞）濃度を確認後、計算値を基に希釈を行い2×106個／mlとなるように調整した。
本試料を培養液にて細胞濃度が1×106個／mlとなるよう調整し、これにACTH1-24（配列番号２：製造元：SIGMA社）を最終濃度1μM 、5μMとなるように添加し被験培養液とした。なお、ACTH1-24無添加画分をコントロールとした。
４穴チャンバー付スライドガラス（Chamber SlideTM System／Lab-Tek（登録商標）／177380）に前記の各種被験培養液を1mlずつ分注し、37℃、5％CO2の条件でインキュベーター（サクラ炭酸ガス培養器／SAKURA／IC−160）にて所定の時間培養した。
培養時間0時間、3時間、6時間ごとに最終濃度2％のグルタールアルデヒド（25％グルタールアルデヒド溶液／和光純薬工業株式会社／073-00536）で各種被験培養液を固定した。該培養液に核を染色するDAPI（DAPI solution 1 mg/ml／DOJINDO／340-07971）を総体積の1/20,000量滴下し、5分間振とう後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS IX70）を用いてUV光源にて励起し、定点10か所を写真撮影した。そして、該写真の画面中の細胞をカウントした。
なお、脱核率は以下の通りに算出した。
脱核率（％）＝｛脱核赤血球数／全細胞数（有核細胞[有核赤血球、間葉系幹細胞を含む]数＋脱核赤血球数）｝
（結果）
上記実験結果を図２に示す。
1μM及び5μMのACTH1-24添加のどちらの画分でも6時間後には脱核を誘導できた。すなわち、ACTH1-24は短時間において赤血球の脱核を誘導することができる。
（ACTH1-39によるラット胎児由来の有核赤血球の脱核率の確認）
本実施例では、ACTH1-39がラット胎児由来の有核赤血球の脱核を誘導するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
（実験方法）
実験飼育用ラット(♀)を2匹交配させ、着床後13日齢の胎児24匹から末梢血を採取した。採取した末梢血を室温、1,000×gで5分間遠心した。そして、クリーンベンチ内で血清を除去し、培養液10ml[10% FBS（SIGMA CR1211）／RPMI-1640 Medium(c)（SIGMA R8578） ／1％ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA P4333）添加 ]に懸濁後、再度遠心し、上清を除き培養液に懸濁した。この作業を2回行い、最終的に10ml培養液に懸濁した末梢血培養用試料を作成した。
本試料を約10μl採取し、血球計算盤を用いて血球（細胞）濃度を確認後、計算値を基に希釈を行い2×106個／mlとなるように調整した。
本試料を培養液にて細胞濃度が1×106個／mlとなるよう調整し、これにACTH1-39（配列番号１：製造元：SIGMA社）を最終濃度5μMとなるように添加し被験培養液とした。なお、ACTH1-39無添加画分をコントロールとした。
培養皿（MULTIWELLTM 48well／FALCON／35-3078 ）に前記２種の被験培養液を250μlずつ分注し、37℃、5％CO2の条件でインキュベーターにて培養した。
添加（または無添加）後、培養3時間にて試料を採取し、最終濃度2％のグルタールアルデヒドで固定した。本被験培養液に核を染色するDAPIを滴下し、5分間振とう後、80μlを採取し、シランコーティングのスライドグラス（シランコーティングスライドグラス／DAKO／S3003）に載せ、蛍光顕微鏡を用いて検鏡した。液滴中央を中心として周辺を一定間隔で移動し、定点9か所を定め写真撮影した。この写真画像中の細胞をカウントし、9枚の平均値を算出した。
脱核率は実施例1と同様に算出した。
（結果）
上記実験結果を図３に示す。
5μMのACTH1-39添加画分では、培養時間3時間でコントロールと比較して、脱核率が高かった。すなわち、ACTH1-39は添加後3時間で有核赤血球の脱核を誘導することができる。
また、5μMのACTH1-39の添加後、3時間培養した試料中の画像を図４に示す。
有核細胞（図４中の「a」）、脱核途中の細胞（図４中の「b」）及び脱核後の赤血球（図４中の「c」）を確認することができた。なお、本試料は、有核赤血球及び間葉系幹細胞が混在している時期であり、顕微鏡下の形態観察では有核細胞（図４中の「a」）は、有核赤血球又は間葉系幹細胞のどちらであるかは区別できない。
（CLIP及びα-MSHによるラット胎児由来の有核赤血球の脱核率の確認）
本実施例では、CLIP及びα-MSHがラット胎児由来の有核赤血球の脱核を誘導するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
（実験方法）
実験飼育用ラット(♀)を2匹交配させ、着床後13日齢の胎児24匹から末梢血を採取した。採取した末梢血を室温、1,000×gで5分間遠心した。クリーンベンチ内で血清を除去し、培養液10ml[10% FBS（SIGMA CR1211）／RPMI-1640 Medium(c) （SIGMA R8578）／1％ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA P4333）添加]に懸濁後、再度遠心し、上清を除き培養液に懸濁した。この作業を2回行い、最終的に10ml培養液に懸濁した末梢血培養用試料を作成した。
本試料を約10μl採取し、血球計算盤を用いて血球（細胞）濃度を確認後、計算値を基に希釈を行い2×106個／mlとなるように調整した。
本試料を培養液にて細胞濃度が1×106個／mlとなるよう調整し、CLIP（配列番号１１、製造元：SIGMA社）、α-MSH（配列番号３、製造元：SIGMA社）をそれぞれ最終濃度1μM 、5μMとなるように添加し、これを被験培養液とした。なお、無添加画分をコントロールとした。
８穴チャンバー付スライドガラス（Chamber Slide TM System／Lab-TekR／177402）に前記の各種被験培養液を250μlずつ分注し、37℃、5％CO2の条件でインキュベーターにて所定の時間培養した。3時間、6時間、9時間（5μMのみ）ごとに各種被験培養液を採取し、最終濃度2％のグルタールアルデヒドで該培養液を固定した。前記培養液に核を染色するDAPIを滴下し、5分間振とう後、蛍光顕微鏡を用いて検鏡し、無作為に視野像10か所を定め写真撮影した。この写真の画像中の細胞をカウントし、平均値を算出した。脱核率は実施例１と同様の方法で算出した。
（結果）
1μMのCLIP添加画分及びα-MSH添加画分の結果を図５に示す。1μMのCLIP及びα-MSHの添加により、培養6時間から脱核を誘導することができた。
5μMのCLIP添加画分及びα-MSH添加画分の結果を図６に示す。5μMのCLIP及びα-MSHの添加により、培養3時間から脱核を誘導することができた。
（ACTH1-24、ACTH1-39、CLIP及びα-MSHによるヒト胎児由来の有核赤血球の脱核率の確認）
本実施例では、ACTH1-24、ACTH1-39、CLIP又はα-MSHがヒト由来赤血球の脱核を誘導するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
（培養方法）
ヒト由来のCD34陽性造血幹細胞（臍帯血由来、CD34陽性90%以上：Lonza社製品：http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100004262）を用い、HPGM培養液で培養した。最初の7日間は2×104〜2×105 Cell/mlの密度で、Stem cell factor 25 ng/ml, トロンボポイエチン 50 ng/ml及び Flt-3 ligand 50 ng/mlを添加して培養した。これを第Iフェーズとする。
次に、2×105 Cell/mlの密度で、エリスロポイエチン 3 U/ml, stem cell factor 25 ng/ml, IL3 10 ng/ml及びIL6 10 ng/ml添加して培養した。これを第IIフェーズとする。該第IIフェーズの4日目に5.0μM濃度のACTH1-24、ACTH1-39、CLIP又はα-MSHを添加して培養し、又は、0.5μM濃度のACTH1-24を添加して培養した。
（DAPI染色による脱核率の測定方法）
上記ACTH1-24、ACTH1-39、CLIP及びα-MSHを添加して培養した第IIフェーズの9日目の赤血球を10％ホルマリンにて固定し、4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)で染色した。蛍光顕微鏡下でランダムに10枚の写真を撮影し、有核赤血球と脱核赤血球を目視にカウントした。測定はブラインドで行った。脱核率は実施例１と同様の方法で算出した。この結果を図７に示す。
（フローサイトメトリーによる脱核率の測定方法）
上記同様にACTH1-24、CLIP及びα-MSHを添加して培養した第IIフェーズ9日目血球のグリコホリンA(Gly A)と核(propidium iodide, PI)に対する二重染色を行い、フローサイトメトリー（自動細胞解析分離装置ファックスキャリバー/ベクトン・ディッキンソン社）にてGly A陽性／PI陰性（図９Bのフローサイトメトリーのデータで、4分割されたドットブロットのうち、左上のエリアがこれに相当する）の細胞を脱核細胞とし、前細胞数に対する脱核を測定した。この結果を図８に示す。
（結果）
5.0 μM濃度のACTH1-24、ACTH1-39、CLIP又はα-MSHを添加して培養し、DAPI染色によって脱核率を算出した結果を図７に示す。
同様に、5.0 μM濃度のACTH1-24、CLIP又はα-MSHを添加して培養し、フローサイトメトリーによって脱核率を算出した結果を図８に示す。
図７及び図８の結果により、ACTH1-24、ACTH1-39、CLIP又はα-MSHをヒト胎児由来の有核赤血球に添加することにより、該有核赤血球の脱核を誘導させることができた。
（ヒト臍帯血由来の脱核効率の確認）
本実施例では、「赤血球へ分化する細胞」中の「脱核赤血球」のパーセンテージを確認した。詳細は、以下の通りである。
（脱核効率の確認方法）
実施例４と同様の培養方法において0.5 μM濃度のACTH1-24を添加し、フローサイトメトリーにより脱核率を測定した。
Gly Aは、赤芽球、網状赤血球及び成熟赤血球の表面マーカーである。そのため、未熟な赤血球も含まれるような血球細胞の集団において、「脱核赤血球」／「赤血球へ分化する細胞」のパーセンテージを測定する方法として、今回の方法を引用した（参照：Peng J. et al, 10; 314-321, Nat Cell Biol, 2008）。
（結果）
上記測定結果を図９に示す。図９Aの結果から明らかなように、赤血球へ分化する細胞中の約70％が脱核していることを確認した。
（赤血球のメラノコルチンレセプターの発現確認）
メラノコルチンレセプター(MC1R, MC2R, MC3R, MC4R, MC5R)は、ACTH及びα-MSHのレセプターとなることが知られている。また、ACTHは、MC1〜4Rと反応し、また、α-MSHはMC1〜5Rと反応することが知られている (参照：Raffin-Sanson et al, J Endocri, 149; 79-90, 2003, Entrez Gene in NCBI)。加えて、マウス胎児の血球にMC5Rが発現していること(参照：Nimura et al, 211; 1096-117, Anat Embryol, 2006)が知られている。
そこで、実施例４のヒト臍帯血由来のCD34陽性造血幹細胞から誘導された赤血球前駆細胞においても、各メラノコルチンレセプターが発現しているかを確認した。より詳しくは、赤血球前駆細胞のメラノコルチンレセプターのmRNA発現をRT-PCRにて確認した。詳細は、以下の通りである。
（実験方法）
実施例４と同様に培養し、第IIフェーズ4日目の細胞を遠心分離にて採取した。トータルRNAを抽出し（RNAeasy, キアゲン社製品）、1μｇのRNAよりRT-PCRを行った（Takara Ex Taq Hot Start Version, タカラバイオ社製品）。なお、プライマーと得られるproduct size は以下のとおりである。
MC2R: forward：ggcaaagacttgctttcctg（配列番号２０）
reverse：cccacatgggaactaaatgg（配列番号２１）
product size：467
MC5R: forward：tggcagtggcggacatgctg（配列番号２２）
reverse：ggcgatgatggcccctgagc（配列番号２３）
product size：260
（結果）
上記mRNA発現結果を図１０に示す。
図１０の結果から明らかなように、赤血球前駆細胞では、メラノコルチンレセプターであるMC2R及び／又はMC5Rが発現していることを確認した。さらに、赤血球前駆細胞では、MC１R, MC3R,及びMC4Rが発現していることも確認した（図なし）。
以上により、本発明のプロオピオメラノコルチン（POMC）由来の化合物が有核赤血球のメラノコルチンレセプターのMC1R, MC2R, MC3R, MC4R及び／又はMC5Rに作用（結合）して脱核を誘導すると考えられる。
すなわち、有核赤血球のメラノコルチンレセプターのMC1R, MC2R, MC3R, MC4R及び／又はMC5Rに作用（結合）するアゴニストは、脱核誘導剤の有効成分となり得る。
（総論）
以上の実施例１〜５の結果により、POMC由来の化合物であるACTH1-39、ACTH1-24、CLIP及びα-MSHでは、短時間で脱核を誘導することができた。
よって、本発明のPOMC由来の化合物は、短時間に哺乳類由来赤血球分化の最終段階の脱核を誘導することができた。
本発明は、短時間に赤血球分化の最終段階の脱核を誘導する方法及び該化合物を含む脱核誘導剤を提供することができた。
これにより、血液の製造期間を短縮可能になり、有核赤血球の輸血に伴う癌化の危険性を除くことが可能となる。すなわち、安全な血液を短時間・かつ安定して得ることができ、医療技術への貢献は非常に大きい。

Claims (3)

  1. 下記化合物のいずれか１以上を含む培養液で培養することを特徴とする有核赤血球の脱核方法。
    （１）配列番号１に記載のペプチド
    （２）配列番号２に記載のペプチド
    （３）配列番号３に記載のペプチド
    （４）配列番号１１に記載のペプチド
    （５）配列番号１に記載のペプチドと98％以上の相同性を有し、かつ有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
    （６）配列番号１に記載のペプチドにおいて、１〜２個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
    （７）上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
    （８）上記（１）〜（６）のいずれか１を含むペプチド
  2. 下記化合物のいずれか１以上を含む脱核誘導剤。
    （１）配列番号１に記載のペプチド
    （２）配列番号２に記載のペプチド
    （３）配列番号３に記載のペプチド
    （４）配列番号１１に記載のペプチド
    （５）配列番号１に記載のペプチドと98％以上の相同性を有し、かつ有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
    （６）配列番号１に記載のペプチドにおいて、１〜２個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
    （７）上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
    （８）上記（１）〜（６）のいずれか１を含むペプチド
  3. 造血系幹細胞又は赤血球前駆細胞を下記化合物のいずれか１以上を含む培養液で培養することを特徴とする脱核赤血球の培養及び／又は増幅方法。
    （１）配列番号１に記載のペプチド
    （２）配列番号２に記載のペプチド
    （３）配列番号３に記載のペプチド
    （４）配列番号１１に記載のペプチド
    （５）配列番号１に記載のペプチドと98％以上の相同性を有し、かつ有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
    （６）配列番号１に記載のペプチドにおいて、１〜２個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ有核赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド
    （７）上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
    （８）上記（１）〜（６）のいずれか１を含むペプチド
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