KR20170118755A

KR20170118755A - 레베르 선천성 흑암시 치료용 올리고뉴클레오타이드

Info

Publication number: KR20170118755A
Application number: KR1020177023328A
Authority: KR
Inventors: 패트리샤 코로모토 비아수또; 희 람 찬
Original assignee: 프로큐알 테라퓨틱스 Ⅱ 비.브이.
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2017-10-25
Also published as: KR102368918B1; AU2016223336B2; WO2016135334A1; EP3262170A1; JP2018507711A; GB201503408D0; US11920132B2; US10889817B2; CA2976601A1; AU2016223336A1; US20210139905A1; US20200063134A1; BR112017018335A2; JP6813506B2; EA036791B1; US20180030439A1; MX2017011013A; US10421963B2; CN107406852B; EA201791820A1

Abstract

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 CEP290 유전자의 인트론 26에서 변이를 표적으로 하고 비정상 엑손의 CEP290 mRNA로의 내포를 감소시킨다. 올리고뉴클레오타이드는 3개 이하의 연속적인 구아노신을 포함하고, 60% 이하의 구아노신 핵산염기를 지니며, 최대 하나의 CpG 서열을 포함하고 및/또는 3개 이상의 연속적인 상보적인 염기쌍을 포함하는 헤어핀을 형성할 잠재적 서열을 지니지 않는다.

Description

레베르 선천성 흑암시 치료용 올리고뉴클레오타이드 {Oligonucleotide therapy for leber congenital amaurosis}

본 출원은 2015년 2월 27일자로 출원된 영국 특허 출원 제1503408.5호의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 모든 목적으로 본 명세서 내에 참고문헌으로 통합되어 있다.

본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 분야에 관한 것으로 질병의 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 레베르 선천성 흑암시의 치료에 사용될 수 있는 신규한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.

레베르 선천성 흑암시(LCA)는 선천적인 소아 실명의 가장 흔한 형태로 전 세계적으로 50,000명의 신생아 중 약 1명의 유병률을 지닌 것으로 추산된다 (Koenekoop 등, 2007; Stone, 2007). 망막 이영양증이 동반된다. 질병 증상의 발병시기는 생후 1개월 또는 1년 이내로 이른 것이다 (Leber, T., 1869). 유전적으로 LCA는 이형성 질병으로 현재까지 15개 유전자의 변이가 LCA의 원인으로 확인되고 있다 (den Hollander 등, 2008; Estrada-Cuzcano 등, 2011). 가장 흔한 변이 LCA 유전자는 중심체와 섬모 발달에 중요한 역할을 하는 중심체(Centrosomal) 단백질 290를 코딩하는 12번 염색체의 Q 암에 위치한 유전자 CEP290 이다. CEP290 유전자의 변이는 모든 LCA 임상 예의 약 15%를 차지한다 (Stone, 2007; den Hollander, 2008; den Hollander, 2006; Perrault 등, 2007).

특히 유럽과 미국에서 망막 이영양증과 관련된 가장 빈번하게 발생하는 CEP290 변이는 CEP290 유전자의 인트론 26 (c.2991 + 1655A> G)의 변이이다 (Stone, 2007; den Hollander 등, 2006; Perrault 등, 2007; Liitink 등, 2010). 이 변이는 변이체 CEP290 mRNA에 128 bp의 비정상적인 엑손을 포함시키고, 미성숙 정지 코돈(p.C998X)을 삽입하는 인트론 26에 크립틱 스플라이스 공여 부위를 생성한다 (도 1 참조). 이 변이를 지닌 환자에서 비정상적(aberrant) 엑손이 결실된 야생형 전사체가 여전히 생성되어 이 변이체의 하이포모르픽(hypomorphic) 특성을 나타낸다(Estrada-Cuzcano 등, 2011).

WO 2013/036105(네이메헨 가톨릭 대학교) 및 WO 2012/168435(Inserm 등)는 CEP290에서 이러한 인트론 돌연변이를 표적으로 하는 LCA의 치료 또는 억제를 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 개시한 바 있다.

WO 2013/036105 및 WO 2012/168435에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변이와 관련된 크립틱 스플라이스 부위의 선택을 감소시키지만 비정상적 128bp 엑손 서열을 함유하는 스플라이스된 CEP290 mRNA의 생성("엑손 스킵핑"이라고 칭함)도 감소시킴에 따라 올리고뉴클레오타이드 자체는 제조 가능성 및/또는 면역학적 관점에서 일정한 제한을 지니며 이는 인간 치료용 기법으로 사용 가능성의 제한을 초래할 수 있다.

따라서 본 발명의 목적은 종래 기술의 올리고뉴클레오타이드의 결점을 해소시킨 CEP290 유전자의 인트론 26에서 변이를 표적으로 하는 신규한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것으로 CEP290 mRNA 내로 비정상적 엑손의 내포를 효과적으로 감소시킨 것이다.

따라서 본 발명은 인간 CEP290 유전자의 인트론 26에서의 c.2991+1655A>G 변이와 관련된 비정상적 스플라이스 부위의 스플라이스 부위 선택을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것으로 이때 상기 유전자는 인간 세포에서 발현되는 것이다.

하기 특성 (a) 내지 (d) 중 하나 이상을 지님을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 서열:

(a) 3개 이하의 연속적인 구아노신을 포함하는 것;

(b) 60% 이하의 구아노신 핵산 염기를 지니는 것;

(c) 많아야 하나의 CpG 서열을 포함하는 것; 및/또는

(d) 3개 또는 그 이상의 연속적인 상보적 염기쌍을 포함하는 헤어핀을 생성할 잠재적 가능성을 지니지 않는 것;

단 올리고뉴클레오타이드는 (ⅰ) 서열번호: 16으로 구성되지 않음; 및/또는 (ⅱ) 21개 또는 그보다 적은 뉴클레오타이드로 구성되고, 바람직하게는 20개 또는 그보다 적은 뉴클레오타이드로 구성된다.

이론에 제한되지 않고 본 발명자는 인간 CEP290 pre-mRNA에 대한 올리고뉴클레오타이드의 상보성은 비정상적 스플라이스 부위의 선택에 영향을 미치는 영역 내에서 생리학적 조건하에 올리고뉴클레오타이드와 결합할 수 있음을 의미하는 것으로 판단된다. 따라서 상기 영역에 결합함에 따라 세포의 스플라이싱 기작에 의해 스플라이스 부위의 선택을 감소시키는 것이다.

올리고뉴클레오타이드는 상기 정의된 특성 (a) 내지 (d)의 2개, 3개 또는 4개의 조합을 지닐 수 있다. 이러한 조합에 대해서는 아래에서 자세히 설명한다.

올리고뉴클레오타이드 길이는 일반적으로 30개 뉴클레오타이드보다 짧으며 예를 들면 25개, 21개, 20개 보다 짧다. 올리고뉴클레오타이드 길이는 16 내지 19개, 예를 들면 17개일 수 있다.

특정 올리고뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 2 내지 서열번호: 12이다.

올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 야생형 RNA와 비교할 때 화학적 변형 예를 들면 포스포로티오에이트 골격, 2'-O-저급알킬-변형 리보스 모이어티 등을 포함할 수 있다.

올리고뉴클레오타이드는 세포에 직접적으로 제공될 수 있거나 예를 들면 바이러스 벡터와 같은 제 자리(in situ) 전사에 의해 간접적으로 제공될 수 있다. 그러나 그들이 공급될 때 CEP290 유전자의 인트론 26 내에서 게놈의 변이(c. 2991+1655A>G)를 전달하여 생체 내에서 인간 치료 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 128bp 크립틱 엑손(밑줄, 서열번호: 1)과 30bp 다운스트림을 포함하는 인간 게놈의 센스 스트랜드(서열번호: 30)이다. 선행기술의 AON(서열번호: 13-22) 뿐만 아니라 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 위치(서열번호: 2-12) 또한 나타내었다. 크립틱 엑손의 다운스트림인 c.2991+1655A>G 변이는 게놈 서열 내의 소문자로 표시하였다.
도 2는 처치되지 않은 환자 세포(NT)의 CEP290 mRNA 스플라이싱 프로파일을 나타낸다. 환자의 세포는 종래 기술의 AON과 비교되는 본 발명에 따른 비-상보적 (센스) 올리고뉴클레오타이드(SON-3, 서열 번호: 29) 또는 상보적 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AONP)로 처치시킨다.
야생형 단편은 약 109bp에서 이동하는 밴드에 상응하는 반면 변이된 단편은 약 237bp에서 이동하는 밴드에 상응된다. 237bp 단편 상에서 이동하는 단편은 비정상 스플라이싱의 다른 형태의 것으로 여겨진다. 건강한 대조군은 야생형 프로파일만을 나타내는 반면에 환자는 야생형과 변이된 단편을 모두 나타낸다. 지정된 올리고뉴클레오타이드는 표적화된 변이 서열의 엑손 스킵핑을 효율적으로 유도할 수 있으며 따라서 야생형 mRNA 프로파일을 복원시킬 수 있다.
도 3은 x-축 상에 나타난 AON으로 처치한 후 환자 샘플에서 CEP290 mRNA의 발현을 나타낸 것이다. 폴드 변화(y 축)는 비교 Ct 방법을 사용하여 계산되었다. 야생형 mRNA(흑색 바) 및 변이 mRNA(회색 바)의 수준을 비-처치 샘플과 비교하였다. 에러 바는 평균의 표준 편차를 나타낸다. 처치되지 않은 환자 샘플과 처치된 환자 샘플을 사용하여 비교한 야생형 전사체 수준 차이에 대한 통계적 분석은 페어 t-테스트를 사용하여 수행되었다. 결과는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처치 후에 야생형 전사체 수준의 유의미한 차이(p <0.05)를 나타내나, 동일한 센스 올리고뉴클레오타이드로 처치한 후에는 유의미한 차이를 나타내지 않았다(SON-3 p=0.2507, AONP4 p=0.0002, AONP13 p=0.0001, AONP26 p<0.0001, AON-3 p=0.0034, ESE(+50+70) p=0.0193).

놀랍게도, CEP290 pre-mRNA에서 크립틱 128bp 엑손의 비정상 스플라이싱을 차단하거나 감소시킬 수 있으며 인간 치료용 요건을 충족시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)가 디자인될 수 있다는 것이 규명되었다.

따라서 본 발명에 따른 AON은 기능적이고 - 균등한 중요성을 지니며 선행 기술의 엑손 스킵핑 AON과는 대조되게 - 정제(불순물) 및 대량 생산 후 분석, 용해도(예를 들면 G-tetrad의 적층으로 인한), 생체 분포, 세포 흡수, 면역원성 및/또는 전반적인 기능 손실과 같은 문제를 야기시킬 수 있는 반복적인 G'(G-tetrads 또는 quadruplexes라 칭하는 3개 이상의 G', 4개 이상의 G'을 포함하는)와 같은 응집체 또는 다중 형성을 생성하기 쉬운 서열이 존재하지 않는다.

본 발명에 따른 AON은 60% 이상의 구아노신 뉴클레오타이드를 함유하지 않으며 구아노신 뉴클레오타이드의 함량은 바람직하게는 50% 이하, 보다 바람직하게는 40% 이하이다.

또한 본 발명의 AON은 하나 이상의 CpG 서열을 함유하지 않으며 바람직하게는 CpG 서열을 전혀 함유하지 않으며 TLR9 매개 반응을 통해 인간 면역체계를 유도하는 것으로 알려져 있다.

또한 선행 기술에 개시된 일부 엑손 스킵핑 AON과는 달리 본 발명의 AON은 정제 및 분석에 문제를 야기시킬 수 있고 면역원성, 감소된 세포 흡수 및/또는 전반적인 기능 손실에 관련된 긴 인버트(invert) 반복 서열(헤어핀 또는 다른 이중 가닥 구조를 생성시킬 수 있는 서열)을 포함하지 않는다.

따라서 첫 번째 측면에서 본 발명은 인간 세포 내에서 발현될 때 인간 CEP290 유전자의 인트론 26에서 c.2991+1655A>G 변이와 관련된 비정상 스플라이스 부위의 스플라이스 부위 선택을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. 이때 상기 올리고 뉴클레오타이드는 비정상 스플라이싱 부위의 선택에 영향을 미치는 영역에서 인간 CEP290 pre-mRNA에 상보적이며 생리적 조건 하에서 결합할 수 있고, 상기 영역에 결합시 상기 세포 내의 스플라이싱 기작에 의해 상기 스플라이싱 부위의 선택을 감소시킨다.

하기 특성 (a) 내지 (d) 중 하나 이상을 지님을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 서열;

(a) 3개 이하의 연속적 구아노신을 포함하는 것;

(b) 60% 이하의 구아노신 핵산염기를 지니는 것;

(c) 최대 하나의 CpG 서열을 포함하는 것; 및/또는

(d) 3개 이상의 연속적인 상보적 염기쌍을 포함하는 헤어핀을 생성할 잠재성이 없는 것이며,

단 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 16으로 구성되지 않는다.

특성 (a)에 따르면 올리고뉴클레오타이드는 GpG 디뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으나 서열 내에 3개 이하의 연속적인 구아노신 핵산염기 만이 존재한다. 따라서 구아노신 반복의 긴 연장(stretch)으로서 구아노신 tetrads는 존재하지 않는다.

특성 (b)에 따르면 올리고뉴클레오타이드는 구아노신 핵산염기를 포함할 수 있으나 올리고뉴클레오타이드 개별 핵산염기 중에 구아노신은 60% 이하이다. 이상적으로 구아노신 함량은 핵산염기의 50% 이하이며 바람직하게는 40% 이하이다.

특성 (c)에 따르면 올리고뉴클레오타이드는 하나의 CpG 디뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으나 더 이상은 포함할 수 없다. 일부 실시형태에서 올리고뉴클레오타이드는 CpG 디뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다.

특성 (d)에 따르면 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 내에서 서로 혼성화하여 3개 염기쌍 또는 그 이상으로 헤어핀(분자간 듀플렉스)을 형성하기 위한 서로 다른 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 또는 분자간 듀플렉스를 형성할 수 있는 서로 다른 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화가 가능한 자가 상보적인 3개 이상의 서열을 포함하지 않는다.

올리고뉴클레오타이드의 서열은 3개 이하의 연속적인 시티딘(cytidine) 핵산염기를 포함하는 것이 바람직하다. 보다 일반적으로 일부 실시형태에서 올리고뉴클레오타이드 서열은 3개 이상의 연속적인 동일한 핵산염기의 스트레치를 포함하지 않으며 예를 들면 ApApA, CpCpC, GpGpG 또는 UpUpU 트리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.

두 번째 측면에서 본 발명은 인간 세포 내에서 발현될 때 인간 CEP290 유전자의 인트론 26에서 c.2991+1655A>G 변이와 관련된 비정상적인 스플라이스 부위의 스플라이스 부위 선택을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. 이때 상기 올리고뉴클레오타이드는 비정상적 스플라이스 부위의 선택에 영향을 미치는 영역에서 인간 CEP290 pre-mRNA에 상보적이며 생리적 조건 하에서 결합할 수 있고, 상기 서열에 결합시 상기 세포 내의 스플라이싱 기작에 의해 상기 스플라이스 부위의 선택을 감소시킨다.

21개 또는 그 이하의 뉴클레오타이드(바람직하게는 20개 또는 그 이하)로 구성되며 서열이 특성 (a) 내지 (d) 중 하나 이상을 지님을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드;

(a) 3개 이하의 연속적 구아노신을 포함하는 것;

(b) 60% 이하의 구아노신 핵산염기를 지니는 것;

(c) 최대 하나의 CpG 서열을 포함하는 것; 및/또는

(d) 3개 이상의 연속적인 상보적 염기쌍을 포함하는 헤어핀을 형성할 잠재성을 지니지 않는 것이다.

또한 세 번째 측면에서 본 발명은 인간 세포 내에서 발현될 때 인간 CEP290 유전자의 인트론 26에서 c.2991+1655A>G 변이와 관련된 비정상 스플라이스 부위의 스플라이스 부위 선택을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. 이때 상기 올리고뉴클레오타이드의 5' 또는 3' 말단 뉴클레오타이드는 c.2991+1655A>G 변이에 대해 안티센스 위치에서 시티딘이다. 이 올리고뉴클레오타이드는 또한 특성 (a) 내지 (d) 중 하나 이상을 지닐 수 있다.

네 번째 측면에서 본 발명은 인간 세포 내에서 발현될 때 인간 CEP290 유전자의 인트론 26에서 c.2991+1655A>G 변이와 관련된 비정상적 스플라이스 부위의 스플라이스 부위 선택을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. 이때 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-atggtgtcgatctcctgaactcgtga-3'(서열번호: 31, 서열번호: 1의 31~56번째 뉴클레오타이드)의 적어도 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

따라서 이 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 31의 어느 부분에도 어닐링될 수 있으나 잠재적 스플라이싱 인핸서 서열인 5'-atctcctg-3'(서열번호: 32)으로 칭하는 그의 중심 8-머에 상보적인 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 항상 포함한다.

AONP 11, 12 및 13은 이와 같은 올리고뉴클레오타이드의 예시이며 중심 8-머 5'-caggagat-3'(서열번호: 36, 도 1 참조)로부터의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 각각 포함한다. 이 올리고뉴클레오타이드는 또한 특성 (a) 내지 (d) 중 하나 이상을 지닐 수 있다.

이상적으로 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 상기 특성 (a) 내지 (d) 중 하나 이상을 지닌다. 예를 들어, 하기 특성을 지닐 수 있다. (a) 및 (b); (a) 및 (c); (a) 및 (d); (b) 및 (c); (b) 및 (d); (a), (b) 및 (c); (a), (b) 및 (d); (a), (c) 및 (d); 또는 (a), (b), (c) 및 (d)의 4가지 전부.

하기 표는 선행 기술의 AON을 제공하며 제조, 정제, 분석, 응집체 형성, 면역원성 및/또는 이와 관련된 기능의 상실과 관련된 문제를 방지하기 위해 피해야 하는 특성을 강조(굵은 글씨)한다.

본 발명에 따른 바람직한 AON은 하기 표에 제공된다: AONP2 (서열번호: 2), AONP3 (서열번호: 3), AONP4 (서열번호: 4), AONP11 (서열번호: 5), AONP12 (서열번호: 6), AONP13 (서열번호: 7), AONP19 (서열번호: 8), AONP20 (서열번호: 9), AONP23 (서열번호: 10), AONP24 (서열번호: 11) 및 AONP26 (서열번호: 12).

표의 AON에서 실질적으로 모든 리보스 모이어티는 2'-O-메틸화되고 모든 인터뉴클레오사이드 연결은 실질적으로 포스포로티오에이트이다.

본 발명에 따른 더욱 바람직한 AON은 AONP4, AONP13 및 AONP26의 서열을 지닌 것이며 실질적으로 모든 2'-O-메틸-리보스 모이어티를 지니고 모든 인터뉴클레오사이드 연결은 실질적으로 포스포로티오에이트인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 모든 실시형태에서, "조절(modulating) 스플라이싱" 및 "엑손 스킵핑"라는 용어는 동의어이다. CEP290과 관련하여 "조절 스플라이싱" 또는 "엑손 스킵핑"은 CEP290 mRNA로부터 비정상적인 128 뉴클레오타이드 엑손(서열번호: 1 또는 이의 대립형질)을 배제하는 것으로 해석되어야 한다(도 1 참조). 엑손 스킵핑이라는 용어는 본 명세서에서 성숙한 mRNA에 존재하는 엑손 스킵핑 없이도 특정 엑손을 배제한 성숙한 mRNA의 세포 내에서의 유발(induction)로서 정의된다.

엑손 스킵핑은 예를 들면 스플라이싱의 생화학적 과정을 허용하는데 요구되는 (크립틱) 스플라이스 공여체 또는 (크립틱) 스플라이스 수용체 서열을 간섭할 수 있는 분자; 또는 성숙한 mRNA에 포함될 엑손으로서 뉴클레오타이드의 스트레치의 인식에 필요한 엑손 삽입 신호를 간섭할 수 있는 분자;를 지닌 상기 성숙한 mRNA의 pre-mRNA를 발현시키는 세포를 제공하는 것으로 달성될 수 있다. 여기에서 이와 같은 분자들을 엑손 스킵핑 분자로서 칭한다.

pre-mRNA라는 용어는 전사에 의해 세포 내에서 DNA 주형으로부터 합성되는 비-처리 또는 부분적으로 처리된 전구체 mRNA를 의미한다.

용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 pre-mRNA 분자, hnRNA(이종 핵 RNA) 또는 mRNA 분자에서 표적 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로 이해되며 따라서 그의 상응하는 목적 서열과 어닐링할 수 있다.

본 출원에 사용된 용어 "상보적"은 "완전히 상보적"및 "실질적으로 상보적"을 포함하며 이는 일반적으로 올리고뉴클레오타이드와 그의 상응하는 표적 서열 사이에 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상의 상보성을 지닌 것이며 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다. 예를 들어 20개 길이 뉴클레오타이드 길이 중 그의 서열과 표적 서열 사이에서 하나의 미스매치를 지니는 올리고뉴클레오타이드에 있어서 상보성의 정도는 95%이다.

안티센스 서열의 상보성 정도는 바람직하게는 안티센스 서열을 포함하는 분자가 생리적 조건 하에서 RNA 분자 내의 표적 뉴클레오타이드 서열에 어닐링할 수 있는 안티센스 서열을 포함하는 분자이며 엑손 스킵핑을 용이하게 한다. 다른 것에 비해서 AON과 표적 서열 사이의 용융 온도 또는 Tm의 관점에서 표현된 바와 같이 결합 강도에 특정 미스 매치가 덜 영향을 미치기 때문에 특정 미스 매치가 다른 것에 비해 허용 가능하다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다.

특정 비-상보적 염기쌍은 완전한 미스매치보다 어느 정도까지 전체 결합을 파괴하는 워블(wobble)을 형성할 수 있다. AON의 길이는 또한 결합의 강도에 있어서 중요한 역할을 하며 더 긴 길이의 AON은 더 짧은 AON에 비해서 높은 용융 온도를 지닌다. 또한 올리고뉴클레오타이드의 G/C 함량은 결합의 강도를 결정하는 요소이며 어떠한 길이에서도 G/C 의 높은 함량은 높은 용융온도를 나타낸다.

본 발명에 의해 고려되는 핵산염기 또는 당-인산 골격의 특정 화학적 변형은 또한 결합 강도에 영향을 미칠 수 있기 때문에 상보성의 정도는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 설계할 때 고려되어야할 오직 유일한 요소이다.

하나의 올리고뉴클레오타이드에서 하나의 CpG 또는 다수(2개 이상)의 CpG가 존재하면 일반적으로 상기 올리고뉴클레오타이드의 증가된 면역원성과 관련이 있다(Dorn 및 Kippenberger, 2008). 이 증가된 면역원성은 치료될 조직, 즉 눈의 손상을 유도할 수 있기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명은 수용 가능한 RNA 결합 동역학 및/또는 열역학 특성을 지니는 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있게 한다. RNA 결합 동역학 및/또는 열역학 특성은 올리고뉴클레오타이드의 용융 온도(Tm; 기본 Tm과 가장 가까운 이웃 모델을 사용한 단일 가닥 RNA에 대한 올리고뉴클레오타이드 특성 계산기(www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html)를 이용하여 계산됨) 및/또는 AON-표적 엑손 복합체의 자유 에너지(RNA 구조 버전 4.5를 사용)에 의해 적어도 부분적으로 결정된다.

Tm이 너무 높으면 올리고뉴클레오타이드는 덜 특이적일 것으로 예상된다. 수용 가능한 Tm 및 자유 에너지는 올리고뉴클레오타이드의 서열, 골격의 화학적 특성(포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트, 펩타이드-핵산 등), 당 모이어티의 특성(리보스, 데옥시리보스, 치환된 리보스, 분자 내 다리) 및 핵산염기의 화학적 변형에 의존한다. 따라서, Tm의 범위는 광범위하게 변할 수 있다.

본 발명은 특정 길이의 올리고로 전체 크립틱 엑손을 마이크로워킹 함으로써 본 발명에 따른 AON을 설계하는 방법을 제공한다. 본 발명자들에 의해 선택된 올리고의 길이는 17 뉴클레오타이드였으나 다른 길이도 가능하다. 타겟 RNA와의 안정한 상호 작용 및 표적 서열에 대한 특이성을 허용하기 위해 충분히 긴 길이를 지닌 것이 바람직하나 긴 올리고뉴클레오타이드는 제조 비용이 높고 분석적 관점으로 보면 더 복잡하기 때문에 필요 이상으로 길 필요가 없다.

이어서, 실시예에 예시된 바와 같이 엑손 스킵핑 효과의 시험관 내 분석으로 시험되는 일련의 중첩 올리고뉴클레오타이드를 제조함으로써 효율적인 엑손 스킵핑 분자에 대해 전체 크립틱 엑손 또는 그의 일부를 조사할 수 있다. 대안적인 접근 방법으로 잠재적 스플라이싱 강화 모티프를 찾기 위해 크립틱 엑손이 탐색되고, AON의 범위는 이들 모티프에 대해 설계된다. 만족스러운 엑손 스킵핑 유효성을 확립하는 AON은 본 발명에서 제공되는 제조 가능성, 면역원성 및 기타 이용 가능성 기준에 기초하여 추가로 선택된다.

반대의 전략도 가능하다. 이 전략에 따라 올리고는 제조 가능성, 면역원성 및 본 발명에 의해 제공되는 다른 유용성 기준에 기초하여 우선적으로 설계되고 이어서 엑손 스킵핑 효능을 시험한다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 기능적 활성은 비정상적인 128 뉴클레오타이드 CEP290 엑손(서열번호: 1)의 스킵핑을 특정 정도까지 및/또는 적어도 부분적으로 비정상적인 CEP290 mRNA의 생성을 감소시킴으로써 야생형 CEP290 mRNA의 생성을 증가시키는 것이 바람직하다.

바람직한 실시형태에서 올리고뉴클레오타이드는 실시간 정량적 RT-PCR로 비정상적인 128 뉴클레오티드 CEP290 엑손(서열번호: 1)의 스킵핑 비율을 측정한 바와 같이 비정상적인 128 뉴클레오티드 CEP290 엑손(서열번호: 1)의 스킵핑을 유도한다고 언급하고 있다(적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%).

스킵핑 백분율(또는 스플라이스 부위 스킵핑의 효율)은 증폭된 야생형 밴드의 농도를 결정하고 증폭된 변이주 밴드의 농도로 나누어 계산된다. 주어진 프라이머 세트에 대하여 주어진 PCR 사이클 횟수와 100% 시간 경과 후, 증폭이 여전히 대수적 상태 내에 존재하도록 사이클 수를 제한한다.

본 발명에 따른 바람직한 AON은 RT-PCR 분석에 의해 측정된 바와 같이 처리되지 않은 세포와 비교하여 AON-처리된 세포에서 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 스킵핑 비율을 나타내는 것이다.

바람직하게는 서열번호: 1에 나타난 바와 같은 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 포함하는 본 발명에 따른 AON은 상보적인 부분이 적어도 80% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 목적 서열에 대한 상보적이다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 부분의 길이는 바람직하게는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29 또는 30 뉴클레오타이드 길이이다.

보다 바람직한 실시형태에 따르면 상보적인 부분의 길이는 약 12 내지 약 25 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 14 내지 약 20 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오타이드이다. 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 부분의 길이는 올리고뉴클레오타이드의 길이와 동일하며 이는 목적 RNA와 염기쌍을 형성하지 않는 올리고뉴클레오타이드가 5' 또는 3' 말단이 존재하지 않음을 의미한다. 따라서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 바람직한 길이는 30 뉴클레오타이드 또는 그 이하이며 예를 들면 <25, <20 또는 16~19개의 뉴클레오타이드 길이이다.

따라서 상보성 영역의 모든 염기가 반대 가닥의 염기와 혼성화될 수 있는 것을 절대적으로 요구하지는 않는다. 예를 들어 올리고뉴클레오타이드를 설계할 때 상보적 가닥상의 염기와 염기쌍을 이루지 않는 잔기를 통합시키고자 할 수 있다. 미스 매치는 어느 정도까지는 허용 될 수 있으며 세포의 상황에 따라 뉴클레오타이드의 스트레치가 상보적인 부분에 충분히 혼성화될 수 있다.

이러한 맥락에서 '충분히'는 본 발명에 따른 AON이 크립틱 128bp 엑손의 엑손 스킵핑을 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 목적 (크립틱) 엑손을 스킵핑하는 것은 RT-PCR에 의해 편리하게 평가될 수 있다. 상보적 영역은 결합될 때 pre-mRNA 내의 엑손에 특이성을 지니도록 설계하는 것이 바람직하다.

이러한 특이성은 시스템의 다른 (pre-) mRNA 분자의 실제 서열에 의존하기 때문에 다양한 길이의 상보적인 영역으로 생성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 다른 pre-mRNA 분자와 혼성화할 수 있는 가능성은 올리고뉴클레오타이드의 크기가 증가함에 따라 감소한다. 상보성 영역에서 미스매치를 포함하지만 pre-mRNA 내의 목적 영역에 혼성화 및/또는 결합하는 능력을 보유하는 올리고뉴클레오타이드를 본 발명에서 사용할 수 있음이 명백하다.

그러나 적어도 상보적 부분은 미스매치를 포함하지 않는 것이 바람직하며 이는 하나 이상의 상보적 영역에서 이러한 미스매치를 지니는 뉴클레오타이드 보다 높은 효율성 및 높은 특이성을 지니기 때문이다. 보다 높은 혼성화 강도(즉 반대 가닥과의 상호작용의 수를 증가시킴)는 시스템의 스플라이싱 기작을 저해하는 과정을 증가시키는데 바람직한 것으로 생각된다.

상보성은 바람직하게는 90% 내지 100%이다. 일반적으로 이는 20개 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드에서 1 또는 2개의 미스매치, 40개 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드에서 1, 2, 3 또는 4개의 미스매치, 60개 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드에서 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 미스매치 등을 허용하는 것이다.

본 발명의 엑손 스킵핑 분자는 바람직하게는 서열번호: 1에 상보적인 (안티센스) 올리고뉴클레오타이드이다.

c.2991+1655A>G 변이를 포함하는 서열번호: 1의 적어도 일부에 상보적이거나 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하거나 구성된 엑손 스킵핑 분자를 특징으로 하는 본 발명의 실시형태에 있어서 상기 엑손 스킵핑 분자는 바람직하게는 서열번호: 1 내에서 변이된 G 뉴클레오타이드에 상보적인 위치에서 'C' 뉴클레오타이드를 포함한다.

특정 실시형태에서 본 발명은 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11 및 서열번호: 12로 구성된 군으로부터 선택되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하거나 바람직하게 구성되는 엑손 스킵핑 분자를 제공하는 것이다.

보다 바람직한 실시형태에서 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열번호: 4, 서열번호: 7 또는 서열번호:11을 포함하거나 바람직하게 구성되는 엑손 스킵핑 분자를 제공하는 것이다. 이들 AON은 비정상적 128 뉴클레오타이드 CEP290 엑손의 스플라이싱을 조절하는데 매우 효율적이라고 밝혀졌다. 반면에 이들은 G-tetrad, 60%(50% 또는 40%) 이상의 구아노신 핵산염기 조성물, 하나(이상의) CpG 서열 또는 3개의 연속적인 염기쌍 이상으로 구성되어 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 16으로 구성되어 있지 않다. 일부 실시형태에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 16을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 서열 gcgguggcucacaucuguaauc(서열번호: 33), gggcgcgguggcucacaucugua(서열번호: 34) 또는 cgcgguggcucacaucugu(서열번호: 35)로 구성된 RNA가 아니다.

본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 하기에서 상세하게 설명하는 바와 같이 하나 이상의 DNA 잔기(결과적으로 RNA "u" 잔기는 DNA 대응관계로서 "t" 잔기가 된다), 또는 하나 이상의 RNA 잔기, 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 등가물을 함유할 수 있다. 서열번호: 2 내지 12는 RNA 서열이나 본 발명은 또한 이들 각각 서열의 DNA 형태, 또한 이들 서열의 DNA/RNA 혼성체를 포함한다.

본 발명의 엑손 스킵핑 분자는 뉴클레아제 내성을 증가시키거나 및/또는 목적 서열에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 친화성을 증가시키기 위해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 따라서 바람직한 실시형태에서 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체 또는 등가물은 변형된 염기 및/또는 변형된 골격 및/또는 비-천연 인터뉴클레오티드 결합 또는 이들의 조합을 포함한다.

바람직한 실시형태에서 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물은 변형된 골격을 포함한다. 이러한 골격의 예는 모르폴리노 골격, 카바메이트 골격, 실록산 골격, 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격, 메틸렌포름아세틸 골격, 리보아세틸 골격, 알켄 함유 골격, 설파메이트, 설포네이트 및 설폰아미드 골격, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격 및 아미드 골격을 들 수 있다.

포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머는 이전에 안티센스 작용제로 연구된 변형된 골격 올리고뉴클레오타이드이다. 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 DNA의 데옥시리보스 당이 6원 고리로 대체되고 포스포디에스테르 결합이 포스포로디아미데이트 결합으로 대체된 전하를 지니지 않는 골격을 지닌다. 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 효소 분해에 내성을 지니며 RNase H를 활성화시키는 것보다는 번역을 정지시키거나 pre-mRNA 스플라이싱을 간섭함으로써 안티센스 작용제로 기능하는 것으로 보인다.

모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 세포막을 물리적으로 파괴하는 방법으로 조직 배양 세포에 성공적으로 전달되었으며, 이러한 몇 가지 방법을 비교한 한 연구는 스크랩(scrape) 로딩이 가장 효율적인 전달 방법이라는 것을 발견하였다. 그러나 모르폴리노 골격은 전하를 지니지 않기 때문에 양이온성 지질은 세포에서 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 흡수의 효과적인 매개자가 아니다.

최근 보고서는 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드에 의한 삼중체 형성을 보고하였으며, 비이온성 골격으로 인해 이 연구에서 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 마그네슘이 없을 때 삼중체를 형성할 수 있음을 보여 주었다.

예를 들면 단사슬 알킬 또는 시클로알킬 인터뉴클레오사이드 결합, 혼성 헤테로 원자 및 알킬 또는 시클로알킬 인터뉴클레오사이드 결합, 또는 하나 이상의 단사슬 헤테로 원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드 결합으로 형성된 결합과 같은 골격 내의 잔기 사이의 결합은 인 원자를 포함하지 않는 것이 바람직하다.

바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물은 변형된 폴리아미드 골격을 지니는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다(Nielsen 등, (1991) Science 254, 1497-1500). PNA 기반 분자는 염기-쌍 인식의 관점에서 DNA 분자의 진정한 모방품(mimic)이다. PNA의 골격은 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성되며, 핵산염기는 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 골격에 연결된다.

대안적인 골격은 1-탄소 연장된 피롤리딘 PNA 단량체를 포함한다(Govindaraju 및 Kumar (2005) Chem. Commun, 495497). PNA 분자의 골격은 전하를 지니는 인산염 그룹을 포함하지 않기 때문에 PNA-RNA 혼성화는 각각 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 혼성화보다 일반적으로 안정하다(Egholm 등, (1993) Nature 365, 566-568).

추가의 바람직한 골격은 리보오스 또는 데옥시리보스 당이 6-원 모르폴리노 고리로 치환된 모르폴리노 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물을 포함하는 것이다. 가장 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물은 리보스 또는 데옥시리보스 당이 6-원 모르폴리노 고리로 치환되고 인접한 모르폴리노 고리 사이의 음이온성 포스포디에스테르 결합이 비이온성 포스포로디아미데이트로 대체된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)를 포함한다.

또 다른 실시형태에서 본 발명의 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물은 포스 포디에스테르 결합에서 비-가교 산소 중 하나의 치환을 포함한다. 이 변형은 염기쌍을 약간 불안정하게 만들지만 뉴클레아제 분해에 대한 상당한 저항성을 부여한다.

바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, H-포스포네이트, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 또는 보라노포스페이트를 포함한다.

본 발명의 추가의 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물은 -OH와 같이 2', 3' 및/또는 5' 위치에서 1치환 또는 2치환된 하나 이상의 당 모이어티; -F; 치환 또는 비치환된 하나 이상의 헤테로원자에 의해 방해될 수 있는 선형 또는 분지형 저급(C1-C10) 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 알릴 또는 아르알킬; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; O-, S- 또는 N-알릴; O-알킬-O-알킬, -메톡시, -아미노프로폭시; 메톡시에톡시; -디메틸아미노옥시에톡시; 및 -디메틸아미노에톡시에톡시 등을 포함한다.

당 모이어티는 퓨라노스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시라노스 또는 이의 유도체, 바람직하게는 리보스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시리보스 또는 유도체일 수 있다.

바람직한 유도체화 당 모이어티는 2'-탄소 원자가 당 고리의 3 ' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어 바이사이클릭 당 모이어티를 형성하는 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid, LNA)을 포함한다. 바람직한 LNA는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산을 포함한다(Morita 등, 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1 : 241-242). 이러한 치환은 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물에 RNase H 및 뉴클레아제 내성을 부여하고 표적 RNA에 대한 친화성을 증가시킨다.

또 다른 실시형태에서 본 발명의 뉴클레오타이드 유사체 또는 등가물은 하나 이상의 염기 변형 또는 치환을 포함한다. 변형된 염기는 합성 또는 천연 염기를 포함하며 이는 이노신, 크산틴, 하이포크산틴 및 다른 -아자, 데아자, -하이드록시, -할로, -티오, 티올, -알킬, -알케닐, -알키닐, 피리미딘의 티오알킬 유도체 및 또는 당 업계에 공지된 퓨린 염기이다.

당업자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없다는 것을 이해한다. 또한 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 내의 단일 위치에 전술한 유사체 또는 등가물 중 하나 이상을 혼입시킬 수 있다. 특정 실시형태에서 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2종 이상의 상이한 유형의 유사체 또는 등가물을 지닌다.

또 다른 실시형태에 따르면 본 발명에 따른 AON은 2'-O-메틸 변형 리보스 (RNA), 2-O-메톡시에틸 변형 리보스, 2'-O-에틸 변형 리보스, 2'-O-프로필 변형 리보스 및/또는 이들 변형체의 치환된 유도체, 예를 들면 할로겐화 유도체를 포함한다.

본 발명에 따른 효과적이고 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 실질적으로 모든 리보스 모이어티가 2-O-메틸이고 실질적으로 모든 뉴클레오시드간 결합이 포스포로티오에이트 결합인 포스포로티오에이트 골격을 지니는 2-O-메틸 변형 리보스 모이어티를 포함한다.

또한 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 CEP290의 이상적인 128 뉴클레오타이드 엑손을 효율적으로 스킵핑하기 위해 결합될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 2개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 2개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 조합은 2개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 3개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 4개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 5개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 같으며 이는 크립틱 엑손의 동일하거나 상이한 영역을 목표로 한다(도 1).

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포, 바람직하게는 망막 세포에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 흡수를 증가시키는 부분에 연결될 수 있다. 그러한 모이어티의 예로는 콜레스테롤, 탄수화물, 비타민, 비오틴, 지질, 인지질, 안테나페디아(antennapedia)를 포함하나 이에 한정되지는 않는 세포-침투 펩타이드, TAT, 트랜스포르탄(transportan) 및 올리고아르기닌, 폴리-아르기닌, 올리고라이신 또는 폴리라이신과 같은 양 전하를 띤 아미노산, 항체에 의해 제공되는 것과 같은 항원-결합 도메인, 항체의 Fab 단편, 또는 낙타 단일 도메인 항원-결합 도메인과 같은 단일 사슬 항원 결합 도메인을 들 수 있다.

본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 당 업계에 공지된 적절한 수단을 사용하여 간접적으로 투여 될 수 있다. 엑손 스킵핑 분자가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 예를 들어 개체 또는 상기 개체의 세포, 조직 또는 기관에 발현 벡터의 형태로 제공될 수 있으며 이때 발현 벡터는 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 전사체를 코딩한다. 발현 벡터는 바람직하게는 유전자 전달 비히클을 통해 세포, 조직, 기관 또는 개체 내로 도입된다. 바람직한 실시형태에서 본 발명에서 확인된 바와 같은 엑손 스킵핑 분자의 발현 또는 전사를 유도하는 발현 카세트 또는 전사 카세트를 포함하는 바이러스성 발현 벡터가 제공된다.

따라서 본 발명은 엑손 스킵핑 분자의 발현에 도움이 되는 조건하에 놓일 때 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 발현하는 바이러스 벡터를 제공한다. 세포에는 필수 서열을 간섭할 수 있는 엑손 스킵핑 분자가 제공되어 아데노바이러스- 또는 아데노-관련 바이러스성 벡터에 의해 제공되는 플라스미드-유도 안티센스 올리고뉴클레오타이드 발현 또는 바이러스 발현에 의해 비정상 128 뉴클레오타이드 CEP290 엑손의 매우 효율적인 스킵핑을 초래한다.

발현은 U1, U6 또는 U7 RNA 프로모터와 같은 중합효소 Ⅲ 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 바람직한 전달 비히클은 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV)와 같은 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터와 같은 레트로 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

또한 플라스미드, 인공 염색체, 표적 동종 재조합 및 세포의 인간 게놈에서의 통합에 사용할 수 있는 플라스미드는 본원에서 정의된 올리고뉴클레오타이드의 전달에 적합하게 적용될 수 있다. 현재 발명에서 바람직한 것은 전사가 PolⅢ 프로모터로부터 유도되는 벡터이고, 및/또는 전사체는 U1 또는 U7 전사체와의 융합 형태로 존재하며, 작은 전사체 전달에 양호한 결과를 제공하는 벡터이다.

적합한 전사체를 설계하는 것은 당업자의 기술범위 내에 존재한다. 바람직하게는 PolⅢ로 유도된 전사체이다. 바람직하게는 U1 또는 U7 전사체를 지니는 융합 전사체의 형태로 존재한다. 그러한 융합은 기술된 바와 같이 생성될 수 있다(Gorman L 등, 1998 또는 Suter D 등, 1999).

하나의 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 발현 시스템은 아데노바이러스 관련 바이러스(AAV)-기반 벡터이다. 단일 사슬 및 이중 사슬 AAV-기반 벡터가 개발되어 비정상 128 뉴클레오타이드 CEP290 엑손의 고효율 스킵핑을 위한 작은 안티센스 뉴클레오타이드 서열의 연장된 발현에 사용될 수 있다.

예를 들어 바람직한 AAV-기반 벡터는 중합효소 Ⅲ-프로모터(PolⅢ)에 의해 구동되는 발현 카세트를 포함한다. 바람직한 PolⅢ 프로모터는 예를 들어, U1, U6 또는 U7 RNA 프로모터이다.

따라서 본 발명은 또한 비정상 128 뉴클레오타이드 CEP290 엑손의 스킵핑을 유도하기 위한 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 발현을 위한 Pol Ⅲ-프로모터 구동 발현 카세트를 포함하는 바이러스성 벡터를 제공한다.

본 발명에 따른 AAV 벡터는 재조합 AAV 벡터이며, 본 명세서의 다른 곳에 도시된 바와 같은 AAV 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질의 단백질 쉘 내에 캡시드화된 본 발명에 따른 코드화된 엑손 스킵핑 분자를 포함하는 AAV 게놈의 일부를 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. AAV 게놈의 일부는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 등과 같은 아데노-관련 바이러스 혈청형에서 유래된 역위 말단 반복(ITR)을 포함할 수 있다.

캡시드 단백질로 구성된 단백질 쉘은 AAV1, 2, 3, 4, 5, 8, 9 등과 같은 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 단백질 쉘은 또한 캡시드 단백질 쉘로 명명될 수 있다. AAV 벡터는 하나 또는 바람직하게는 모든 야생형 AAV 유전자가 결실되어 있으나 여전히 기능적 ITR 핵산 서열을 포함할 수 있다. 기능적 ITR 서열은 AAV 비리온의 복제, 복구(rescue) 및 패키징에 필요하다.

ITR 서열은 야생형 서열이거나 야생형 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 서열 상동성을 지닌 서열이거나, 그의 기능을 유지하는 한 예를 들면 뉴클레오타이드의 삽입, 변이, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 상기 설명에서 기능성은 게놈의 캡시드 쉘 에게로 직접적 패키징이 가능한 능력을 의미하며 감염된 숙주 세포 또는 목적 세포 내의 발현을 가능하게 하는 것이다. 본 발명과 관련하여 캡시드 단백질 쉘은 AAV 벡터 게놈 ITR과 상이한 혈청형일 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 AAV 벡터는 예를 들어 AAV 혈청형 2와 같은 하나의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질(VP1, VP2 및/또는 VP3)을 포함하는 캡시드 단백질 쉘, 즉 20 면체 캡시드로 구성될 수 있다. 이때 AAV5 벡터에 포함된 ITR 서열은 AAV2 벡터를 포함하는 상기에서 기재된 임의의 AAV 혈청형 중 하나일 수 있다. "AAV2 벡터"는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하는 반면에 "AAV5 벡터"는 AAV 혈청형 5의 캡시드 단백질 쉘을 포함하며 이로써 본 발명에 따른 어떠한 AAV 벡터 게놈 ITR도 캡시드화 할 수 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2, 5, 8 또는 AAV 혈청형 9의 캡시드 단백질 쉘을 포함하며 상기 AAV 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 2, 5, 8 또는 AAV 혈청형 9로부터 유래된 것이다. 이러한 AAV 벡터는 AAV2/2, AAV 2/5, AAV2/8, AAV2/9, AAV5/2, AAV5/5, AAV5/8, AAV 5/9, AAV8/2, AAV 8/5, AAV8/8, AAV8/9, AAV9/2, AAV9/5, AAV9/8 또는 AAV9/9 벡터로서 언급된다.

더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하고, 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 5에서 유래되었으며 상기 벡터를 AAV 2/5 벡터라고 칭한다.

더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하고, 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 8에서 유래되었으며 상기 벡터를 AAV 2/8 벡터라고 칭한다.

더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하고, 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 9에서 유래되었으며 상기 벡터를 AAV 2/9 벡터라고 칭한다.

더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하고, 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 2에서 유래되었으며 상기 벡터를 AAV 2/2 벡터라고 칭한다.

선택된 핵산 서열에 의해 나타내어지는 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 코딩하는 핵산 분자는 바람직하게는 상기에서 확인된 바와 같이 AAV 게놈 또는 ITR 서열 사이에 바람직하게 삽입되며 예를 들면 코딩 서열 및 3' 종결 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 요소를 포함하는 발현 컨스트럭트이다.

"AAV 헬퍼 기능"은 일반적으로 전환 중에(in trans) AAV 벡터에 공급된 AAV 복제 및 패키징에 필요한 상응 AAV 기능을 나타낸다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터에서 누락된 AAV 기능을 보완하지만 AAV 벡터 게놈에 의해 제공되는 AAV ITR은 결핍되어 있다. AAV 헬퍼 기능은 AAV의 2개의 주요 ORF, 즉 rep 코딩 영역 및 cap 코딩 영역 또는 이들의 기능적으로 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.

Rep 및 Cap 영역은 당 업계에 잘 공지되어 있으며 예를 들어 문헌 Chiorini 등.(1999, J. of Virology, Vol 73(2): 1309-1319) 또는 미국 특허 제5,139,941호에 기술되어 있고 본 명세서 내에 통합되어 있다. AAV 헬퍼 기능은 플라스미드일 수 있는 AAV 헬퍼 컨스트럭트 상에 제공될 수 있다. 헬퍼 구조의 숙주 세포로의 도입은 예를 들면 형질 전환, 형질 감염 또는 형질 도입에 의해 본 명세서에서 확인된 바와 같은 AAV 벡터에 존재하는 AAV 게놈의 도입 이전에 또는 동시에 도입될 수 있다.

따라서, 본 발명의 AAV 헬퍼 구조는 한편으로는 AAV 벡터 캡시드 단백질 쉘 및 AAV 벡터 복제 및 패키징에 존재하는 AAV 게놈에 대한 바람직한 혈청형의 조합을 생성하도록 선택될 수 있다.

"AAV 헬퍼 바이러스"는 AAV 복제 및 패키징에 필요한 추가 기능을 제공한다. 적합한 AAV 헬퍼 바이러스는 아데노 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스(예를 들면 HSV 유형 1 및 2) 및 백시니아 바이러스를 포함한다. 헬퍼 바이러스에 의해 제공되는 추가 기능은 또한 본 명세서 내에 참고문헌으로 통합된 미국 특허 제6,531,456호에 기재된 바와 같이 벡터를 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터에 존재하는 AAV 게놈은 AAV의 rep(복제) 또는 cap(캡시드) 유전자와 같은 바이러스 단백질을 코딩하는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. AAV 게놈은 항생제 내성 유전자, 형광 단백질(예, gfp) 또는 당업계에 알려진 화학적으로 효소적으로 또는 기타 검출 가능한 및/또는 선택 가능한 생성물(예를 들어 lacZ , aph 등)을 코딩하는 유전자와 같은 마커 또는 리포터 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 AAV 벡터는 AAV 벡터, 바람직하게는 AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 또는 AAV2/2 벡터이며 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 발현한다. 이때 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11 또는 서열번호: 12로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 서열로 구성된다,

본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자로 개체 또는 세포, 조직, 상기 개체의 기관을 제공하는 수단의 개선은 이미 지금까지 달성된 개량을 고려하여 예상될 수 있다. 이러한 미래의 개선은 물론 본 발명의 방법을 사용하여 mRNA의 재구성에 대한 언급된 효과를 달성하기 위해 통합될 수 있다. 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 그대로 상기 개체의 개체, 세포, 조직 또는 기관에 전달될 수 있다.

본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 투여할 때 상기 분자는 전달 방법과 배합 가능한 용액에 용해되는 것이 바람직하다. 망막 세포는 수용액에서 플라스미드를 제공함으로써 안티센스 올리고뉴클레오타이드 발현을 위한 플라스미드를 제공 할 수 있다. 대안적으로 플라스미드는 공지된 트랜스펙션 제제를 사용하여 트랜스펙션 시킴으로써 제공될 수 있다. 정맥, 피하, 근육 내, 뇌척수액 및/또는 뇌실 내 투여 투여를 위해서는 용액이 생리 식염 용액인 것이 바람직하다.

본 발명에서 특히 바람직한 것은 세포로 및/또는 세포 내로, 바람직하게는 망막 세포로 본 발명에서 정의된 바와 같은 조성을 전달하기 위한 부형제 또는 트랜스펙션 제제의 사용이다. 세포막을 통해 소포체 또는 리포솜에 복합화 되거나 포획된 본 발명에서 정의된 바와 같은 각각의 조성을 전달하는 복합체, 나노 입자, 마이셀, 비시클 및/또는 리포솜을 형성할 수 있는 부형제 또는 트랜스펙션 제제가 바람직하다.

이들 부형제 중 많은 것이 당 업계에 공지되어 있다. 적합한 부형제 또는 트랜스펙션 제제는 폴리에틸렌이민(PEI; ExGen500 (MBI Fermentas)), LipofectAMINE^TM 2000(Invitrogen) 또는 이의 유도체, 폴리프로필렌이민 또는 폴리에틸렌이민 공중합체(PEC) 및 유도체를 포함하는 유사 양이온성 고분자, 합성 양친매성 물질(SAINT-18), 리포펙틴^TM, DOTAP 및/또는 세포, 바람직하게는 망막 세포 내로 본 발명에 정의된 바와 같이 각각의 조성을 전달할 수 있는 입자 내로의 자가 조립이 가능한 바이러스 캡시드 단백질을 포함한다.

이러한 부형제는 망막 세포를 비롯한 다양한 배양 세포에 안티센스 핵산과 같은 올리고뉴클레오타이드를 효율적으로 전달하는 것으로 나타났다. 이들의 높은 트랜스펙션 가능성은 전반적인 세포 생존의 관점에서 예외적인 저급 내지 중간 정도의 독성과 결합된다. 추가적 변형 및 이들의 추가적인 (생체 내) 핵산 전달 특성 및 독성 분석을 가능하게 하는데 구조적 변형을 용이하게 적용될 수 있다.

리포펙틴은 리포좀성 트랜스펙션 제제의 예를 나타낸다. 그것은 2개의 지질 성분으로 구성되어 있으며 이는 양이온성 지질인 N-[1-(2,3 디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)(메틸황산염인 DOTAP와 비교)와 중성 지질인 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)이다. 중성 요소는 세포 내 방출을 매개한다. 또 다른 전달 시스템의 그룹은 중합체성 나노 입자이다.

DNA 트랜스펙션 시약으로 잘 알려져 있는 디에틸아미노에틸아미노에틸(DEAE)-덱스트란과 같은 폴리 양이온(Polycation)은 세포막을 가로 질러 세포 내로 본 발명에 정의된 바와 같은 각각의 조성, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 양이온성 나노입자를 제조하기 위한 부틸시아노아크릴레이트(PBCA)와 헥실시아노아크릴레이트(PHCA)와 결합할 수 있다.

이러한 일반적인 나노 입자 물질 외에도 양이온성 펩타이드 프로타민은 올리고뉴클레오타이드를 콜로이드로 제형화 하기 위한 대안적인 접근법을 제공한다. 이 콜로이드성 나노 입자 시스템은 소위 프로티클(proticle)이라고 불리는 입자를 형성할 수 있으며 이는 올리고뉴클레오타이드의 세포 내 방출을 패키지화하고 조절하는 간단한 자가-조립 과정에 의해 제조될 수 있다.

당업자는 본 발명에서 사용하기 위한 엑손 스킵핑 분자를 패키지화하고 전달하기 위한 상기한 것 또는 상업적으로 이용 가능한 다른 부형제 및 전달 시스템 중 임의의 것을 선택하고 적용할 수 있으며 이는 CEP290에 관련된 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연을 목적으로 이를 전달하기 위한 것이다. "CEP290 관련 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연"은 본 발명에서 바람직하게는 CEP290 유전자의 유전적 결함에 의해 야기되는 부분적 또는 완전한 시각 장애 또는 실명의 예방, 중지, 진행의 중단 또는 역류로 정의된다.

또한 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 세포, 세포질 및/또는 그의 핵으로의 흡수를 용이하게 하도록 특별히 고안된 표적 리간드에 공유 결합 또는 비공유 결합될 수 있다. 이러한 리간드는 (i) 세포 내 흡수를 촉진시키는 세포, 조직 또는 기관 특이적인 요소를 인식하는 화합물(펩타이드 유사 구조를 포함하나 이에 한정하지는 않음) 및/또는 (ii) 예를 들면 엔도좀 또는 라이소좀과 같은 비시클로부터 올리고뉴클레오타이드의 세포로 및/또는 세포 내로 방출되는 것의 흡수를 용이하게 할 수 있는 화학적 화합물을 포함할 수 있다.

따라서 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 조성물 또는 약제 또는 조성물 내에 제형화되어 있으며 적어도 부형제 및/또는 전달을 위한 목적 리간드 및/또는 세포로의 전달 및/또는 그의 세포 내 전달 강화를 위한 기구와 함께 제공될 수 있다.

조성물이 본 발명에서 후술하는 보조 화합물과 같은 부가적인 조성을 포함하는 경우, 조성물의 각 조성은 하나의 단일 조합 또는 조성물 또는 제제로 제형화될 필요가 없다는 것을 이해해야 한다. 그들의 제형에 따라 당업자는 본 발명에서 정의된 바와 같이 각각의 성분에 대해 어느 유형의 제제가 가장 적합한지를 인지할 수 있다. 바람직한 실시형태에서 본 발명은 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자 및 본 발명에서 후술하는 추가의 보조 화합물을 포함하는 키트 형태인 조성물 또는 제형을 제공할 수 있다.

필요에 따라 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자 또는 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 발현하는 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 첨가함으로써 약제학적으로 활성인 혼합물로 통합될 수 있다.

따라서 본 발명은 조성물, 바람직하게는 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 제공하는 것이다. 이러한 조성물은 본 발명에 따른 단일 엑손 스킵핑 분자를 포함할 수 있으며 본 발명에 따른 다수의 별개의 엑손 스킵핑 분자를 또한 포함할 수 있다.

이러한 제약 조성물은 담체, 충전제, 방부제, 보조제, 용해제 및/또는 희석제를 비롯한 임의의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 충진제, 방부제, 보조제, 용해제 및/또는 희석제는 예를 들어 Remington, 2000에서 찾을 수 있다. 상기 조성물의 각 특징은 앞서 본 발명에 정의되어 있다.

본 발명에 따른 다수의 별개의 엑손 스킵 분자가 사용되는 경우, 본 발명에서 정의된 농도 또는 용량은 사용된 모든 올리고뉴클레오타이드의 총 농도 또는 투여량 또는 사용되거나 첨가된 개별 엑손 스킵핑 분자의 농도 또는 투여량을 지칭할 수 있다. 따라서 하나의 실시형태에서 사용된 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자의 개별 또는 총 함량은 0.0001 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 0.01 내지 20 mg/kg의 함량으로 투여되는 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 바람직한 엑손 스킵핑 분자는 개체의 CEP290 관련 질환 또는 상태의 치료를 위한 것이다. 본 발명의 모든 실시형태에서 "치료"라는 용어는 CEP290 관련 질환 또는 상태의 예방 및/또는 지연을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 사용하여 치료될 수 있는 개체는 이미 CEP290 관련 질환 또는 상태를 지니는 것으로 진단되었을 수 있다.

대안적으로 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자를 사용하여 치료될 수 있는 개체는 CEP290 관련 질환 또는 상태를 지니는 것으로 아직 진단되지는 않았으나 그 또는 그녀의 주어진 유전적 배경으로 인해 미래에 CEP290 관련 질환 또는 상태를 발병할 증가된 위험을 지니는 개체일 수 있다. 바람직하게는 개체는 인간이다. 바람직한 실시형태에서 CEP290 관련 질환 또는 상태는 레베르 선천성 흑암시이다.

따라서 본 발명은 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물을 제공한다. 이는 CEP290의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 CEP290 관련 질환 또는 상태의 치료 및 CEP290 관련 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연을 위한 약제로의 용도를 위한 것이다. 바람직한 CEP290 관련 질환 또는 상태는 레베르 선천성 흑암시이다. 상기 용도의 각각의 특징은 본 발명에서 앞서 정의되었다.

본 발명은 또한 CEP290의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 CEP290 관련 질병 또는 상태의 치료를 위한 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다. 바람직한 실시형태에서 CEP290 관련 질환 또는 상태는 레베르 선천성 흑암시이다.

본 발명은 추가로 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물을 제공한다.

본 발명은 추가로, 그의 게놈에서 CEP290 유전자의 인트론 26 내의 변이(c. 2991+1655A>G)를 지니는 인간을 치료하기 위한 방법을 제공하며 이 방법은 AON, 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 인간에 투여하는 것을 포함한다. 이 환자들은 레베르 선천성 흑암시로 고통받을 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 AON, AON을 코딩하는 바이러스 벡터 및 그의 게놈에서 CEP290 유전자의 인트론 26 내의 변이(c. 2991+1655A>G)를 지니는 인간을 치료하기 위한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 AON을 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 발명의 추가의 실시형태에 따르면 세포에서 CEP290의 스플라이싱을 조절하기 위한 시험관 내 및/또는 생체 외 방법이 제공되며, 상기 방법은 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물과 상기 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자는 (수성) 용액, 현탁액, (오일-인-워터) 에멀젼, 연고, 로젠지, 정제 등의 형태로 삼키기, 주사, 흡입, 주입, 분무에 의해 경구, 안구 내, 폐 내, 비강 내, 근육 내, 피하, 피내, 직장 내로 전체적 부분적 국소적으로 투여될 수 있다.

바람직한 투여 경로는 수용액의 유리체내 주입 또는 안구내 투여용으로 특별히 개조된 제형이다. 예를 들어 유럽특허 제2,425,814호는 펩타이드 또는 핵산 약물의 안구내(유리체내) 투여에 특히 적합한 오일-인-워터 에멀젼을 개시하였다. 이 에멀젼은 유리체 액보다 밀도가 낮기 때문에 유리체 상부에 부유하여 주입된 약물이 시력을 손상시키는 것을 방지한다.

투약은 투여 경로와 환자의 필요에 따라 매일, 주간, 월간, 분기 별, 1년에 한 번일 수 있다.

질병의 조기 발병으로 인해 LCA가 있거나 LCA의 증상이 나타날 위험이 있는 환자(소아 실명 포함)는 자궁 내에서(in utero), 출생 직후에, 1, 2, 3, 6개월령 부터, 1세 부터, 3세 부터, 5세 부터 치료할 수 있으며 증상이 나타나기 전 또는 직후에 질병의 증상을 완화, 발달 지연, 중지 또는 역전시킬 수 있다.

본 발명에 따른 사용 또는 방법에서의 치료는 일주일 이상, 1개월 이상, 몇 개월 이상, 1년 이상, 2, 3, 4, 5, 6년 이상 또는 환자의 일생동안 지속된다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 본 발명에서 정의된 엑손 스킵핑 분자 또는 엑손 스킵핑 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 등가물은 CEP290 관련 질병 또는 상태에 이미 영향을 받거나 또는 발병 위험이 있는 개체의 생체 내에서 세포, 조직 및/또는 기관에 직접 투여하기에 적합할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드, 조성물, 화합물 또는 보조 화합물의 투여 빈도는 환자의 연령, 엑손 스킵핑 분자의 성질(예를 들면 gymnotic AON 또는 벡터화 AON, 즉 AAV 또는 렌티바이러스 벡터 발현 AON), 투여량, 상기 분자의 제형 등을 포함하는 여러 요소에 의해 결정된다.

엑손 스킵핑 분자, 바람직하게는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 투여량 범위는 엄격한 프로토콜 요건이 존재하는 임상 시험(생체 내 사용)에서 증가하는 투여량 연구에 기초하여 바람직하게 설계된다. 본 발명에서 정의된 올리고뉴클레오타이드는 0.0001 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 20 mg/kg의 투여량 범위에서 사용될 수 있다. 투여량 및 치료 방법은 많은 요소에 의해 다양하게 변화할 수 있으며 이는 투여 경로(예를 들어 전신 대 국소, 예를 들면 안구 내로 직접), 올리고가 gymnotic AON으로 또는 벡터화된 AON으로 투여되는지의 여부, 투약 요법, 환자의 연령 및 체중 등을 포함하며 이에 한정되지는 않는다.

바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 분자를 위한 전달 비히클로서의 바이러스 벡터, 바람직하×게는 본 발명에서 이전에 개시된 바와 같은 AAV 벡터는 주사 당 1×10⁹ ~ 1×10¹⁷ 바이러스 입자, 바람직하게는 1×10¹⁰ ~ 1×10¹⁴, 가장 바람직하게는 1×10¹⁰ ~ 1×10¹² 바이러스 입자이다.

본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 올리고뉴클레오타이드(들)의 서열 및 화학적 성질, 예를 들면 투여 경로, 제형, 투여량, 투약 요법, 형태(바이러스 벡터 또는 gymnotic 올리고뉴클레오타이드), 환자의 연령 및 체중, 질병의 단계 등과 같은 요인에 따라 치료의 세부사항이 수립되어야 한다는 것이 명백할 것이며 추가적 비-임상적 및 임상적 조사를 필요로 할 수 있다.

본 발명은 세포, 바람직하게는 망막 세포를 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 CEP290의 스플라이싱을 조절하는 방법을 추가로 제공한다. 이 측면의 특징은 바람직하게는 본 발명에서 앞서 정의된 특징이다.

세포를 본 발명에 따른 엑손 스킵핑 분자, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 것은 당업자에게 공지 된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 본 발명에 개시된 엑손 스킵핑 분자, 바이러스 벡터 및 조성물의 전달을 위한 방법의 사용이 포함된다. 접촉은 직접적으로 또는 간접적으로 이루어질 수 있으며 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내 일 수 있다.

다르게 지시되지 않는 한, 본 발명에 기재된 바와 같은 각각의 실시형태는 본 발명에 기술된 다른 실시형태와 결합될 수 있다.

인간 세포 내에서 발현될 때 인간 CEP290 유전자의 인트론 26 내의 c.2991+1655A>G 변이와 관련된 비정상 스플라이스 부위의 스플라이스 부위 선택을 감소시키는 올리고뉴클레오타이드 능력과 비정상 스플라이스 부위의 선택에 영향을 미치는 영역에서 생리적 조건 하에서 인간 CEP290 pre-mRNA에 결합하여 세포 스플라이싱 기작에 의해 비정상 스플라이스 부위의 선택을 저하시키는 올리고뉴클레오타이드의 능력은 본 발명의 실험 섹션에 개시된 분석을 사용하여 편리하게 평가할 수 있다.

특히 올리고는 c.2991+1655A>G 변이를 함유하는 세포와 함께 인큐베이션될 수 있으며 비정상 엑손을 포함하는 mRNA의 세포에 의한 생성을 감소시키는 올리고의 능력은 예를 들면 RT-PCR에 의해 평가될 수 있다.

본 명세서의 실험 섹션에서 볼 수 있는 바와 같이, RNA 수준에서 비정상 CEP290 엑손을 표적으로 하는 다양한 AON의 첨가는 비정상 스플라이스된 CEP290 mRNA가 정확하게 스플라이스된 CEP290 mRNA로 전환되는 것을 실질적으로 초래하였다. 이 전환은 야생형 CEP290 단백질의 증가된 합성과 일치할 것이다.

섬유아세포(피부 세포에서 유도될 수 있음)에서는 CEP290이 풍부하게 발현된다. 따라서 LCA 환자의 배양된 섬유아세포에 AON을 첨가하면 웨스턴 블롯에서 검출 가능한 야생형 CEP290 단백질의 양이 증가할 것으로 예상되며 따라서 AON-기반 치료법은 CEP290 mRNA의 정상적인 스플라이싱 뿐만 아니라 CEP290 단백질 기능 회복을 가져올 것이라는 것을 입증할 것이다.

아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실 및 하이포크산틴(이노신의 핵산염기)이라는 용어는 핵산염기를 의미한다.

아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘, 우리딘 및 이노신이라는 용어는 (데 옥시) 리보스 당과 연결된 핵산염기를 의미한다.

뉴클레오사이드라는 용어는 (데옥시) 리보스 당에 연결된 핵산염기를 의미한다.

본 명세서와 그 청구항에서 "~을 포함한다"라는 동사와 그의 활용은 그 단어 뒤에 오는 항목이 포함되지만 특별히 언급되지 않은 항목은 제외되지 않는다는 것을 의미하는 제한적이지 않은 의미로 사용된다. 또한 부정관사 "a"또는 "an"에 의한 하나의 요소에 대한 언급은 문맥 상 하나의 요소만이 명백하게 요구되는 경우를 제외하고는 하나 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정관사 "a"또는 "an"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.

숫자 값(예를 들어, 약 10)과 관련하여 사용되는 약 또는 대략의 단어는 값이 소정 값(10)의 ±5% 일 수 있음을 의미한다.

본 명세서에 제공된 서열 정보는 잘못 식별된 염기를 포함할 수 있도록 너무 좁지 않게 해석하여야 한다. 당업자는 이러한 잘못 식별된 염기를 식별할 수 있으며 이러한 오류를 수정하는 방법을 알고 있다. 서열 오류의 경우, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 서열번호: 1에 존재하는 유전자의 발현에 의해 수득 가능한 폴리펩타이드의 서열이 우선하여야 한다.

재료 및 방법

[1] 세포

모든 세포주는 피부 생검으로 생성된 인간 섬유아세포이다. LFB1(CL10-00008) 및 LFB2(CL12-00027)는 야생형이며 대조군 세포주를 나타내고, LFB3(CL12-00035) 및 LFB4(CL12-00036)는 모두 CEP290(c.2991+1655A>G) 변이에 대한 동형 접합체 변이이다.

[2] AON

AON은 17mer AON이 크립틱 128bp 엑손을 커버할 수 있도록 설계된 genewalk 접근 방식을 사용하여 설계되었으며 AON 사이에 약 10bp의 중복 영역이 존재한다. 설계된 RNA AON은 2-O-메틸포스포로티오에에트 화학성질을 지니며 통합 DNA 기술(IDT)에서 수득되었다.

[3] 세포 배양 및 트랜스펙션

모든 세포주는 20% FBS 및 1% 피루브산나트륨이 보충된 DMEM-AQE 배지(시그마)에서 배양되었다. 트랜스펙션하기 하루 전, 세포를 2.5㎖의 배지에서 6-웰 플레이트 상에 2×10⁵/웰의 밀도로 접종하였다. 트랜스펙션 당일, 트랜스펙션 제제로서 maxPEI(Poliscience)를 사용하여 AON을 100nM의 최종 농도로 각 웰에 분주하고(모두 PBS 내), 올리고:maxPEI의 질량비는 1:4였다. 24시간 후 세포를 PBS로 세척하고 ReliaPrep RNA Cell Miniprep System 키트(Promega)와 함께 제공된 BL+TG 완충액을 사용하여 세포 용해물을 수집하였다. 세포 용해물은 추가 사용까지 -80℃에서 동결시켰다.

[4] 시료에서 야생형 및 변이체 CEP290의 프로파일링

a) RNA 분리 : 제조자 프로토콜에 따라 ReliaPrep RNA Cell Miniprep System 키트(Promega)를 사용하여 -80℃로 유지된 세포 용해물로부터 RNA를 분리하였다. 총 RNA는 Nanodrop 2000 분광 광도계(Nanodrop Technologies)를 사용하여 -80℃에서 저장하기 전에 정량화 하였다.

b) cDNA 합성 : 400ng의 RNA를 oligodT 프라이머와 함께 Verso cDNA 합성 키트(Thermoscientific)를 사용하여 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용하였다. 비-실시간 시료(효소 없음)를 대조군으로 포함시키고 나머지 시료와 함께 분석하였다.

c) PCR : 샘플에 존재하는 CEP290의 메신저 RNA의 상이한 프로파일을 시각화하고 정량화하기 위해 엑손 26 내지 엑손 27을 포함하는 CEP290 mRNA 단편을 PCR을 사용하여 특이적으로 증폭시켰다. 이 목적을 위해, cDNA (2.5㎕의 희석액 2㎕)를 주형으로 사용하여 표적 서열의 증폭을 하기 프라이머를 사용하여 수행 하였다 :

엑손26_정방 : 5-TGCTAAGTACAGGGACATCTTGC-3 (서열번호: 23)

엑손27_역방 : 5-AGACTCCACTTGTTCTTTTAAGGAG-3 (서열번호: 24).

AmpliTaq Goldㄾ 360 DNA 폴리머라제(Life technologies, 카탈로그 번호 : 4398833)를 사용하여 반응을 수행하였다.

PCR 단편은 Bioanalyzer 2100(DNA 1000 키트, Agilent Technologies)을 사용하여 분석하였다. 2100 Expert 소프트웨어(Agilent Technologies)를 사용하여 결과를 분석하였다.

d) RT-qPCR : CEP290 전령 RNA의 발현 수준을 측정하기 위해 야생형 및 변이 전사체를 각각 93bp 및 117bp 단편으로 증폭시켰다. 인간 P0 대형 리보솜 단백질 mRNA(RPLP0)을 일반화를 위해 사용하였다. 이를 위해 SYBR 선별 마스터 믹스(Life Technologies) 및 400nM의 순방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 25 내지 28)를 함유하는 qPCR 버퍼(18ul)에서 cDNA(10배 희석액의 2ul)를 증폭시켰다.

증폭에 사용된 시스템은 CFX96 실시간 PCR 검출 시스템(Biorad)이었고 조건은 다음과 같다 : 50℃에서 2분 동안 UDG 활성화 단계, 다음으로 95℃에서 2분 동안 최초 변성 단계를 거친 후 95℃ 15초 및 62.5℃ 1분의 50 사이클이다. 용융 곡선 분석은 증폭 생성물의 특이성을 결정하기 위해 각 실험의 마지막에 수행되었다. Bio-rad 소프트웨어를 사용하여 데이터를 시각화하고 처리하였으며 폴드 변화 계산은 비교 Ct 방법(2(-Delta Delta C(T)) 방법이라고도 함)을 사용하여 수행되었다.

사용된 프라이머는 다음과 같다 :

야생형_정방: 5- TGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTG-3 (서열번호: 25)

야생형-역방: 5- AGGAGATGTTTTCACACTCCAGGT-3 (서열번호: 26)

변이_정방: 5- CTGGCCCCAGTTGTAATTTGTGA-3 (서열번호: 27

변이_역방: 5- CTGTTCCCAGGCTTGTTCAATAGT-3 (서열번호: 28)

이 반응을 위해 SYBR은 마스터 믹스(Life Technologies)와 함께 10배 희석된 cDNA를 주형으로 선택한다.

결과 및 논의

설계된 올리고뉴클레오타이드의 RNA 조절에 대한 영향을 트랜스펙션 효율 및 처리 시간 및 농도 최적화 후 평가하였다(데이터는 나타내지 않음).

설계된 2'-O-메틸-포스포로티오에이트 AON에 의해 유도된 엑손 스킵핑의 효율을 엑손 26 내지 엑손 27을 포함하는 CEP290 단편의 선택된 증폭을 사용하여 스크리닝 하였다. Bioanalyzer 2100을 사용하여 PCR 단편의 시각화 및 정량화를 수행하였다.

본 발명자들은 이전 기술에 개시된 AON보다 높거나 동등한 효율을 지니는 반면에 그들의 제조 또는 치료적 사용을 저해하는 구조를 지니지 않으면서 엑손 스킵핑을 유발하는 AON을 설계할 수 있는지를 스스로 질문하였다. 이는 야생형 스플라이스된 mRNA와 비교하여 변이 스플라이스된 mRNA에 상응하는 PCR 단편의 수준을 결정함으로써 수립되는 것이다. 이러한 작업으로 상기 기준을 충족시키는 11개의 올리고뉴클레오타이드를 확인하였다(도 1, 표 1 및 표 2 참조).

qPCR을 통한 CEP290 메신저 RNA의 야생형 및 변이 전사체의 발현 수준의 분석은 Bioanalyzer 2100으로 수득한 결과로써 확인하였다. 폴드 변화 계산은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리가 이전 기술에서 개시된 AON에 의해 달성되는 것보다 우수하거나 동등한 수준으로 야생형 전사체의 발현을 복구하는 것을 나타내는 것이다.

본 발명의 AON이 종래 기술의 것보다 엑손 스킵핑(excon skipping)의 관점에서 더 양호하게 수행되는 것을 요구하지 않기 때문에 엑손 스킵핑을 유도하기에 충분한 성능이면 충분하다. 실시예에 개시된 본 발명에 따른 AON은 단지 본 발명의 바람직한 실시형태이다. 본 발명의 청구범위 요건을 만족시킬 수 있는 다른 AON이 설계될 수 있으며 이는 본 발명에 통합된다.

밴드 1 및 밴드 2는 비정상 스플라이싱의 명백한 부산물이다.

SON-3은 cgcaccuggccccaguu(서열번호: 29, 이전에 WO 2013/036105호 및 Collin 등, 2012에 의해 개시됨)이다.

SEQUENCE LISTING <110> PROQR THERAPEUTICS II B.V. <120> OLIGONUCLEOTIDE THERAPY FOR LEBER CONGENITAL AMAUROSIS <130> P065863WO <140> PCT/EP2016/______ <141> 2016-02-26 <150> GB-1503408.5 <151> 2015-02-27 <160> 36 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 128 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tagagatggg gtttcacctt gttagccagg atggtgtcga tctcctgaac tcgtgatcca 60 cccgcctcgg cctcctaaag tgctgggatt acagatgtga gccaccgcac ctggccccag 120 ttgtaatt 128 <210> 2 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 2 gcgguggcuc acaucug 17 <210> 3 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 3 gguggcucac aucugua 17 <210> 4 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 4 ggcucacauc uguaauc 17 <210> 5 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 5 ucaggagauc gacacca 17 <210> 6 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 6 cacgaguuca ggagauc 17 <210> 7 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 7 gguggaucac gaguuca 17 <210> 8 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 8 uggcucacau cuguaau 17 <210> 9 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 9 ugcgguggcu cacaucu 17 <210> 10 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 10 cucacaauua caacugg 17 <210> 11 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 11 gguaugagau acucaca 17 <210> 12 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 12 ggauagguau gagauac 17 <210> 13 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 13 cuggggccag gugcgguggc ucacaucugu a 31 <210> 14 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 14 gggauaggua ugagauacuc acaau 25 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 15 ccgaggcggg uggaucacga g 21 <210> 16 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 16 gguaugagau acucacaauu ac 22 <210> 17 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 17 gguaugagau acucacaauu acaacugggg c 31 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 18 taatcccagc actttaggag 20 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 19 gggccaggtg cggtgg 16 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 20 aactggggcc aggtgcg 17 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 21 tacaactggg gccaggtg 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 22 actcacaatt acaactgggg 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tgctaagtac agggacatct tgc 23 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 agactccact tgttctttta aggag 25 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tgactgctaa gtacagggac atcttg 26 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 aggagatgtt ttcacactcc aggt 24 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ctggccccag ttgtaatttg tga 23 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ctgttcccag gcttgttcaa tagt 24 <210> 29 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense oligonucleotide <400> 29 cgcaccuggc cccaguu 17 <210> 30 <211> 158 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 tagagatggg gtttcacctt gttagccagg atggtgtcga tctcctgaac tcgtgatcca 60 cccgcctcgg cctcctaaag tgctgggatt acagatgtga gccaccgcac ctggccccag 120 ttgtaattgt gaatatctca tacctatccc tattggca 158 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 atggtgtcga tctcctgaac tcgtga 26 <210> 32 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 32 atctcctg 8 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Micro RNA <400> 33 gcgguggcuc acaucuguaa uc 22 <210> 34 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Micro RNA <400> 34 gggcgcggug gcucacaucu gua 23 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 35 cgcgguggcu cacaucugu 19 <210> 36 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 caggagat 8

Claims

인간 세포 내에서 발현될 때 인간 CEP290 유전자의 인트론 26에서 c.2991+1655A>G 변이와 관련된 비정상 스플라이스 부위의 스플라이스 부위 선택을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드 서열은
(a) 3개 이하의 연속적인 구아노신을 포함하는 것;
(b) 60% 이하의 구아노신 핵산 염기를 지니는 것;
(c) 최대 하나의 CpG 서열을 포함하는 것; 및/또는
(d) 3개 이상의 연속적인 상보적 염기쌍을 포함하는 헤어핀을 생성할 잠재성이 없는 것이며,
단 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 16으로 구성되지 않음
을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 50% 이상의 구아노신 핵산 염기를 지니지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
선행항 중 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 40% 이상의 구아노신 핵산 염기를 지니지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 구아노신, 구아노신 테트라드(tetrad) 또는 60% 이상의 구아노신을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
선행항 중 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 구아노신, 구아노신 테트라드(tetrad) 또는 하나 이상의 CpG 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 구아노신, 구아노신 테트라드(tetrad) 또는 3개 이상의 연속적인 상보적 염기쌍을 포함하는 헤어핀을 생성할 잠재성이 있는 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 구아노신, 구아노신 테트라드(tetrad) 또는 CpG 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 60% 이상의 구아노신 핵산 염기 또는 하나 이상의 CpG 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 CpG 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 60% 이상의 구아노신 핵산 염기 또는 3개 이상의 연속적인 상보적 염기쌍을 포함하는 헤어핀을 생성할 잠재성이 있는 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 구아노신, 구아노신 테트라드(tetrad), 60% 이상의 구아노신 핵산 염기 또는 하나 이상의 CpG 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 구아노신, 구아노신 테트라드(tetrad), 60% 이상의 구아노신 핵산 염기 또는 3개 이상의 연속적인 상보적 염기쌍을 포함하는 헤어핀을 생성할 잠재성이 있는 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 구아노신, 구아노신 테트라드(tetrad), 하나 이상의 CpG 서열 또는 3개 이상의 연속적인 상보적 염기쌍을 포함하는 헤어핀을 생성할 잠재성이 있는 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 구아노신, 구아노신 테트라드(tetrad), 60% 이상의 구아노신 핵산 염기, 하나 이상의 CpG 서열 또는 3개 이상의 연속적인 상보적 염기쌍을 포함하는 이중가닥 구조를 생성할 잠재성이 있는 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 구아노신, 구아노신 테트라드(tetrad), 60% 이상의 구아노신 핵산 염기, CpG 서열 또는 3개 이상의 연속적인 상보적 염기쌍을 포함하는 이중가닥 구조를 생성할 잠재성이 있는 서열을 포함하지 않음을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
선행항 중 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 길이는 뉴클레오타이드 30개 보다 짧으며 예를 들면 뉴클레오타이드 25개보다 짧으며, 바람직하게는 뉴클레오타이드 21개보다 짧으며, 더욱 바람직하게는 뉴클레오타이드 20개보다 짧으며 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 16개 내지 19개 임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
선행항 중 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 길이는 17개 뉴클레오타이드 임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
하기 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열로 구성됨을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
선행항 중 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 골격을 지님을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
선행항 중 한 항에 있어서, 올리고리보뉴클레오타이드는 2'-O-저급 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시-변형 리보스 모이어티, 바람직하게는 2'-O-메틸을 포함함을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
선행항, 특히 제 19항 또는 제 20항 중 한 항에 있어서, 상기 올리고리보뉴클레오타이드는 서열번호: 7 또는 서열번호: 12로 구성된 서열을 지니고 선택적으로 모든 리보스는 2'-O-메틸화임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
인간 세포 내에서 분자의 발현을 유도하는 조건하에 놓일 때 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에서 정의된 올리고뉴클레오타이드를 발현하는 바이러스 벡터
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 제 21항에 따른 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오타이드, 제 21항에 따른 바이러스 벡터 또는 의약으로 사용하기 위한 제 22항에 따른 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오타이드, 제 21항에 따른 바이러스 벡터 또는 CEP290 유전자의 인트론 26에서 변이(c. 2991+1655A>G)를 게놈 내에 지니는 인간을 치료하기 위해 의약으로 사용하기 위한 제 22항에 따른 약제학적 조성물.
세포에서 CEP290의 스플라이싱을 조절하기 위한 시험관 내 및/또는 생체 외 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 세포와 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오타이드, 제 21항에 따른 바이러스 벡터 또는 제 22항에 따른 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.