JPH08193998A - ポリヌクレオチド測定試薬と方法 - Google Patents

ポリヌクレオチド測定試薬と方法

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JPH08193998A JP7220944A JP22094495A JPH08193998A JP H08193998 A JPH08193998 A JP H08193998A JP 7220944 A JP7220944 A JP 7220944A JP 22094495 A JP22094495 A JP 22094495A JP H08193998 A JPH08193998 A JP H08193998A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ポリヌクレオチドを検出する際の使用に対
し、先行技術に関連した限界を実質的に克服するような
診察システムおよび方法を提供すること。 【解決手段】 診断用試薬およびレポーター分子を有す
る、選択された標的塩基配列を含む一本鎖のポリヌクレ
オチド分析物を確定するための診断用系であり、診断用
試薬が、固体担体と該担体に付着した多数のポリマーと
からなり、ポリマー分子が、選択された結合条件下で標
的塩基配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに結合し；非
単独重合体で分枝してなく；実質的に立体規則性であ
り；次の構造を有する。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ポリヌクレオチド
診断システムおよび方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般的な２タイプのポリヌクレオチド診
断システムは、ポリヌクレオチドプローブの相補的な断
片と、一本鎖ポリヌクレオチド分析物との間のハイブリ
ダイゼーションに基づいて、ともに発展してきた。第一
のタイプでは、このポリヌクレオチド分析物が一本鎖に
され、ニトロセルロースフィルターのような固体担体に
固定されている。この担体は、次いで、相補鎖のアニー
リング条件下で、この分析物の標的塩基配列領域と相補
的なレポーターラベルされたプローブとの反応に供され
る。非結合プローブを除去するために、数回洗浄した
後、この固体担体のレポーターの存在が分析される。こ
のシステムは、測定の簡便さおよび感度が要求されるよ
うな特に医療的状況では、十分に満足のいくものではな
い。一本鎖のポリヌクレオチド物質をこの固体担体に固
定する際に用いられる手順は、ある程度複雑でかつ時間
がかかる。このシステムの感度は制限されている。通常
の場合では、各分析物分子は、単一のプローブ分子とハ
イブリダイズし、そして、各プローブは、一般に約 100
のレポーター部分を含んでいるからである。
【０００３】ポリヌクレオチド診断システムの第二のタ
イプは、この分析物ポリヌクレオチドの別々の領域に互
いに相補的な２つの分析物−特異的プローブを包含す
る。この第一のプローブは、固体担体に連結されてお
り、この第二のプローブは、溶液中に遊離していて、多
数のレポーター分子を持っている。実際には、この分析
物は、以下の条件で２つのプローブと混合される。この
条件では、ポリヌクレオチド分析物に対して、相補的な
ポリヌクレオチド鎖のアニーリング（このアニーリング
は、固定化されたプローブとレポーターを持ったプロー
ブの両方のアニーリング含む）により、このレポーター
の、分析物を介した固体担体への結合が可能となる。
【０００４】この２つのプローブシステムは、試験する
核酸物質を、固体担体に固定するべきであるという問題
点はとり除いたが、それにもかかわらず、この方法はま
だ多数の制約条件を有する。まず第一に、試験する核酸
物質が二本鎖核酸から誘導されるとき、多くの場合、こ
の分析物ポリヌクレオチドと、その相補鎖とのハイブリ
ダイズが、この分析物と２つのプローブとの間のハイブ
リダイズと競合する。さらに、この２つのプローブシス
テムは、単一プローブシステムの場合よりも、速度論に
依存するところが大きいので、２つのプローブシステム
は、本質的に単一プローブシステムよりも遅い。また、
２種の異なったプローブを必要とすることは、この系の
コストを増大させる。つまり、試験感度という点から言
えば、この２つのプローブシステムは、上で述べたよう
に、各分析物ポリヌクレオチドが唯一の“レポーター”
プローブと結合するので、単一プローブシステムと同様
の限界を持っている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の一般的な目的
は、ポリヌクレオチドを検出する際の使用に対し、上で
議論した問題や、先行技術に関連した限界を実質的に、
克服するような診察システムおよび方法を提供すること
である。
【０００６】本発明の他の目的としては、このようなシ
ステムにおいて、相補的なポリヌクレオチド鎖を一本鎖
状態で残すような条件下で、一本鎖のポリヌクレオチド
分析物と、塩基特異的な二本鎖構造を形成するべく適合
された、ポリヌクレオチド結合ポリマーを有する試薬を
提供することにある。それゆえ、この分析物の結合は、
測定反応混合物中でアニールしている分析物に相補的な
鎖と競合することなく、試薬ポリマーと分析物とが配列
特異的な対をなす条件下で、達成される。
【０００７】本発明のもう一つの目的は、このようなシ
ステムにおいて、レポーターが試薬ポリマーに結合する
ことのない条件下で、静電気的な力によって、分析物ポ
リヌクレオチドのバックボーンに結合するべく適合され
るレポーターを供給することにある。それゆえ、このシ
ステムは、比較的多数のレポーター分子が各ポリヌクレ
オチド分析物分子に結合し得るという長所によって、非
常に高い信号レベルの許容量を持っている。
【０００８】さらに、迅速で、便利でかつ感度の高いポ
リヌクレオチド診断方法を提供することも、本発明の他
の目的である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、選択された標
的塩基配列を含む一本鎖のポリヌクレオチド分析物を確
定するための診断用系であり、診断用試薬およびレポー
ター分子を有し、そのことにより上記目的を達成する。
この診断用試薬は、固体担体と該担体に付着した多数の
ポリマーとからなり、 (1) 該ポリマー分子は、選択された結合条件下で標的塩
基配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに結合し；非単独
重合体で分枝してなく；実質的に立体規則性であり；次
の構造を有する。
【００１０】
【化７】
【００１１】ここで、(a)Ｒ1〜Ｒnは、該標的配列の対
応内部配列塩基に、ワトソン／クリック対により結合す
るのに効果的なプリン、プリン類似、ピリミジンおよび
ピリミジン類似の複素環物から選択された認識部分であ
り、(b)ｎは、該ポリマー分子と該標的配列との間で形
成されるワトソン／クリック水素結合の総数であり少な
くとも約１５であり、(c)Ｂは、主として実質的に非荷
電でかつアキラルな連鎖により連結され得るバックボー
ン部分であり、(d)ユニットバックボーン長は５から７
原子の範囲であり、そして該バックボーン部分が次の基
から選択される環状構造を有し：
【００１２】
【化８】
【００１３】(e) 該バックボーン部分は該認識部分と該
標的配列の対応する内部配列塩基との間を水素結合させ
得る位置に該認識部分を支持し；そして該選択された条
件下で該分析物のバックボーン電荷密度よりも実質的に
小さいバックボーン電荷密度を有する。
【００１４】上記レポーター分子は、オリゴカチオン性
テイルおよび一つもしくはそれ以上のレポーター基から
成り、該テイルは、該テイルが該ポリマーのわずかしか
密に荷電していないか、もしくは非荷電のバックボーン
に結合しないあらかじめ選択された条件下で該ポリヌク
レオチド分析物の荷電したバックボーンに静電的に結合
するように適用され、該レポーター基は該テイルに付着
し、該レポーターの存在を検出する信号を生じるよう適
用される。
【００１５】本発明の好ましい実施態様においては、上
記レポーター中のテイルは、ポリヌクレオチド分析物の
バックボーン中の隣接リン酸基間の空間にほぼ相当する
間隔で正電荷の基を含む。
【００１６】本発明の好ましい実施態様においては、上
記テイルは、次の式を有するオリゴカチオン性部分を含
む。
【００１７】 ---N+(R1)(R2)-(CH2) n-m--N+(R3)(R4)(R5) ここで、 nは２〜５、 m＞０、そして、おのおののR1〜
R5は水素もしくはアルキル基である。
【００１８】本発明の好ましい実施態様においては、上
記レポーター中のレポーター基は、一つもしくはそれ以
上の螢光、発色団、酵素、もしくは放射性同位体基を含
む。
【００１９】本発明はまた、選択された標的塩基配列を
含むポリヌクレオチド分析物の確定方法であり、次の工
程を包含し、そのことにより上記目的が達成される： (1) 固体担体および該担体に付着した多数のポリマー分
子からなる診断用試薬を準備する工程、ここで、該ポリ
マー分子は、選択された結合条件下で標的塩基配列を含
む一本鎖ポリヌクレオチドに結合し；非単独重合体で分
枝してなく；実質的に立体規則性であり；次の構造を有
し：
【００２０】
【化９】
【００２１】ここで、(a)Ｒ1〜Ｒnは、該標的配列の対
応内部配列塩基に、ワトソン／クリック対により結合す
るのに効果的なプリン、プリン類似、ピリミジンおよび
ピリミジン類似の複素環物から選択された認識部分であ
り、(b)ｎは、該ポリマー分子と該標的配列との間で形
成されるワトソン／クリック水素結合の総数であり少な
くとも約１５であり、(c)Ｂは、主として実質的に非荷
電でかつアキラルな連鎖により連結され得るバックボー
ン部分であり、(d)ユニットバックボーン長は５から７
原子の範囲であり、そして該バックボーン部分が次の基
から選択される環状構造を有し：
【００２２】
【化１０】
【００２３】(e) 該バックボーン部分は該認識部分と該
標的配列の対応する内部配列塩基との間を水素結合させ
得る位置に該認識部分を支持し；そして該選択された条
件下で該分析物のバックボーン電荷密度よりも実質的に
小さいバックボーン電荷密度を有する、工程、 (2) 該選択された条件下で該診断用試薬と分析物含有試
料とを混合して、該分析物を試薬ポリマーに配列特異的
に結合させる工程、 (3) レポーターを準備する工程、 ここで、該レポーターはオリゴカチオン性テイルおよび
一つもしくはそれ以上のレポーター基から成り；該テイ
ルは、該テイルが該ポリマーのわずかしか密に荷電して
いないか、もしくは非荷電のバックボーンに結合しない
あらかじめ選択された条件下で該ポリヌクレオチド分析
物の荷電したバックボーンに結合するように適用され；
該レポーター基は該テイルに付着し；そして該レポータ
ーの存在を検出する信号を生じるよう適用されている、
工程、 (4) 該レポーターを該選択された条件下で該試薬に加え
る工程、 (5) 該レポーターを加える前もしくは後もしくは前およ
び後に該試薬を未結合物質から分離する工程、および (6) 分析物に結合したレポーターのレポート信号を確定
する工程。
【００２４】本発明の好ましい実施態様においては、上
記混合は、二価のカチオンキレート剤の存在下でかつ該
二重鎖分析物の融点以上の温度で、約 0.2M の一価のカ
チオンよりも小さい選択されたイオン強度にてなされ
る。
【００２５】本発明の好ましい実施態様においては、上
記方法は、さらに所定温度でレポーター試料結合ポリヌ
クレオチドへの適当な結合が起きる最も高い塩濃度であ
るようなあらかじめ選択された条件を確立することを含
む。
【００２６】本発明は、さらに選択された標的塩基配列
を含む一本鎖のポリヌクレオチド分析物を確定するため
の診断用系である。この診断用系は、診断用試薬および
レポーター分子を有し、該診断用試薬は、固体担体と該
担体に付着した多数のポリマーとからなり、 (1) 該ポリマー分子は、選択された結合条件下で標的塩
基配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに結合し；非単独
重合体で分枝してなく；実質的に立体規則性であり；次
の構造を有し：
【００２７】
【化１１】
【００２８】ここで、(a)Ｒ1〜Ｒnは、該標的配列の対
応内部配列塩基に、ワトソン／クリック対により結合す
るのに効果的なプリン、プリン類似、ピリミジンおよび
ピリミジン類似の複素環物から選択された認識部分であ
り、(b)ｎは、該ポリマー分子と該標的配列との間で形
成されるワトソン／クリック水素結合の総数であり少な
くとも約１５であり、(c)Ｂは、主として実質的に非荷
電でかつアキラルな連鎖により連結され得るバックボー
ン部分であり、(d)ユニットバックボーン長は５から７
原子の範囲であり、そして該バックボーン部分が次の環
状構造を有し：
【００２９】
【化１２】
【００３０】(e) 該バックボーン部分は該認識部分と該
標的配列の対応する内部配列塩基との間を水素結合させ
得る位置に該認識部分を支持し；そして該選択された条
件下で該分析物のバックボーン電荷密度よりも実質的に
小さいバックボーン電荷密度を有する。
【００３１】上記レポーター分子は、オリゴカチオン性
テイルおよび一つもしくはそれ以上のレポーター基から
成り、該テイルは、該テイルが該ポリマーのわずかしか
密に荷電していないか、もしくは非荷電のバックボーン
に結合しないあらかじめ選択された条件下で該ポリヌク
レオチド分析物の荷電したバックボーンに静電的に結合
するように適用され、該レポーター基は該テイルに付着
し、該レポーターの存在を検出する信号を生じるよう適
用されている。
【００３２】
【発明の実施の形態】本発明の診断用系は、多数のヌク
レオチド結合ポリマー分子を備えた固体担体からなる固
体担体試薬を含んでいる。本発明のポリマー組成物は、
選択された結合親和性で、塩基の標的配列を含むポリヌ
クレオチドと結合するように設計されている。この組成
物は、非単独重合性で実質的に立体規則的な分子または
種（以下の形式である）からなっている：
【００３３】
【化１３】
【００３４】ここで、 B−Riは、バックボーン部分Ｂお
よび認識部分Riを含む一連の塩基特異的なサブユニット
である。この認識部分Riは、標的配列中の対応する内部
配列塩基と、ワトソン／クリック塩基対により特異的に
結合するように選択されている。このサブユニットは、
これらバックボーン部分を介して、主としてアキラルで
あり実質的に非荷電の結合と連結されている。このポリ
マー種を構成する際の使用に適当なサブユニットの設計
および選択は、以下の第１節に記述されるだろう。アキ
ラルな連鎖を介したサブユニットのカップリング方法
は、第２節に記述されている。サブユニット保護基とと
もに、サブユニット合成の際に包含される戦略は、第２
節で論じられる。
【００３５】このポリマー種は、連続して起こるサブユ
ニットカップリングにより合成され、選択された長さお
よび配列のポリマー分子が形成される。第４節に記述の
ように、この標的配列およびポリマー配列の長さは、所
望の結合特異性を達成するべく選択される。このポリマ
ーの標的に対する結合親和性は、第４節に論じるいくつ
かの戦略により選択的に変えられ得る。この戦略には認
識部分の選択が含まれる。この認識部分は、対応する標
的塩基とともに、３つ（より大きな結合親和性のため
に）または２つ（より小さな結合親和性のために）のい
ずれかの塩基と対になった水素結合を形成し得る。この
得られた組成物は、ポリマー種またはポリマー分子を含
む。これらのすべては、実質的に同じサブユニット配列
および実質的に同じ内部サブユニット連鎖のタイプを有
している。機能的な言い方では、このポリマー種のすべ
ては、この標的ポリヌクレオチドに対し、実質的に同じ
結合親和性を有している。いったん所望のサブユニット
配列が選択されると、このポリマーを組立てる方法は第
５節に示される。
【００３６】このポリマー組成物は、第６−７節に記述
の新規な固相診断システムに有用である。このシステム
は、各結合された分析分子に対し増幅されたレポーター
シグナルを与えるべく、分析ポリヌクレオチド分子の担
体結合ポリマー分子への結合および続いて起こる多数の
ポリカチオン性レポーター分子のこのポリヌクレオチド
への静電気的な付加に基づいている。
【００３７】Ｉ．サブユニット構造 Ａ．認識部分 本発明のポリマー種を形成する際の使用に適当なサブユ
ニット B−Riの設計には、多数の構造上の規準および／
または立体化学的な規準が包含される。この規準は、バ
ックボーン部分および認識部分だけでなく、この２つの
間の連鎖によっても達成されるに違いない。この認識部
分の設計上の必要条件がまず考慮されるだろう。
【００３８】各サブユニットの認識部分は、確かな立体
配置で保持された２つまたは３つの水素結合基を供給す
るに違いない。この立体配置は、標的遺伝子配列の特異
化された内部配列塩基上の２つまたは３つのワトソン／
クリック水素結合部位に対する水素結合に適合する。認
識部分とそれに対応する標的塩基との間の望ましくない
ミスペアリングを避けるために、使用条件下において、
1)この認識部分の互変異性状態を相対的に安定化すべき
であり、そして2)この認識部分は、水素結合基が相対的
に固定した配置となる構造を有するべきである。このよ
うな固定化は、最適には、極性の水素結合基を有する環
構造により提供される。この極性の水素結合基は、環の
一部を形成するかあるいは環に直接付加されるかいずれ
かである。
【００３９】このより好ましい認識部分の構造は、プリ
ン、プリン類似物、ピリミジン、およびピリミジン類似
物の構造を含んでいる。この構造は、２つまたは３つの
いずれかの水素結合を介して、選択されたポリヌクレオ
チド塩基とワトソン／クリック塩基対を形成するように
設計されている。ポリマーの合成で用いられるサブユニ
ットの基は、少なくとも２つの認識部分を含んでおり、
この認識部分は、異なるポリヌクレオチド塩基に対し塩
基特異的である。好ましくは、天然の DNAヌクレオチド
または RNAヌクレオチド中の４つの塩基のそれぞれに対
し、１つまたはそれ以上の認識部分がある。また、以下
でわかるように、認識部分の１つの基Ri（これは２つの
水素結合を介してヌクレオチド塩基と塩基対になり得
る）と、２番目の基Rj（これは３つの水素結合を介して
同じ塩基と結合し得る）とを供給するのが望ましい。第
１図に、典型的なプリン型の認識部分およびピリミジン
型の認識部分を示す。このプリン構造１および２は、チ
ミン塩基またはウラシル塩基と結合するべく設計されて
おり、構造３−６はグアニン塩基と、構造７−９はシト
シン塩基と、そして構造10−12はアデニン塩基と結合す
るべく設計されている。構造１、４、５、６、８および
10−12は、２つの水素結合を介して、対応する内部配列
塩基と結合するように適合されたRiタイプの部分であ
る。残りの構造は、Rjタイプの部分であり、これは塩基
対上に３つの水素結合を形成する。以下でわかるよう
に、プリンヌクレオシドおよびピリミジンヌクレオシド
は、ポリマー合成での使用に適当な種々の他のサブユニ
ットを合成する際に有用である。これらのサブユニット
は、必要ならアミン保護基で修飾される。これらは、市
販の原料から得られるかまたは公知方法（例えば、実施
例１に記述されているかまたはそれに関連した方法）に
従って調製され得る。
【００４０】多くのプリン類似物構造またはピリミジン
類似物構造が第２図に示されている。これらの構造内で
は、認識部分が環状炭素を介してバックボーンと連結さ
れている。これらの構造は、第１図に示される類似物構
造の塩基対特異性や水素結合特性と似かよった塩基対特
異性や水素結合特性を有する。炭素で連結された認識部
分を含むポリマーの結合特性は、認識部分が窒素で結合
されるポリマー（第１図のような）の結合特性と著しく
変わらないけれども、この炭素で結合した部分を含むサ
ブユニットは、一般に、実施されたプリンおよびピリミ
ジンを含むサブユニットよりも合成が困難である。しか
しながら、あるサブユニットの合成、例えば、実施例10
に記述のアキラルな非環状のバックボーンサブユニット
の合成では、炭素で結合した認識部分が有用な出発物質
を提供している。
【００４１】Ｂ．バックボーン部分 各サブユニットのバックボーン部分は、一般式N1----Ｅ
またはN1----N2を有する。ここで、N1およびN2は求核性
基であり、Ｅは求電子性基である。以下で論じるよう
に、得られるサブユニット間連鎖に必要な安定性および
サブユニット結合の容易性に基づくと、より好ましい求
核性基はアミノ基、水酸基およびヒドラジノ基である。
そして、より好ましい求電子性基および／または求電子
性結合試薬は、炭酸、チオ炭酸、カルボン酸およびスル
ホン酸の誘導体である。
【００４２】バックボーン部分は、環状構造または非環
状構造のいずれかを有し得る。可能なバックボーン部分
の構造の全数は極めて多いものの、それにもかかわら
ず、多くの要因のために、かなり限られた数の構造しか
実際に実施するに値しない。都合のよいバックボーン部
分を選択する最初の手順を次に示した。
【００４３】第一の条件としては、これら環状のバック
ボーン部分だけは、デオキシリボースまたはリボースか
らなるかまたはそこから容易に誘導され得ると考えられ
た。この制約は実際的な制約であり、これは、多数のキ
ラル中心をもつ環構造を新生合成することが困難である
うえにそれに対応してより多くの経費がかかることを反
映している。一般に、ポリマーに適当と思われる可能性
のあるバックボーン部分およびサブユニット間連鎖は、
以下の要因の１つまたはそれ以上に基づいて選択され
た：公知の反応に基づく合成の実行可能性；入手可能な
出発物質からの合成の予期された容易性：構造の簡単
さ；および最終的なバックボーンの予期された安定性。
【００４４】都合のよいバックボーン部分およびサブユ
ニット間連鎖の最初の選抜は、以下のように行われた。
Ｂ型のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびＡ型のオ
リゴヌクレオチドのＸ線回折により決定されたパラメー
ターに従って、二重の DNAおよび RNAの空間−充填 CPK
分子モデルが構成された。これら構成された各二重構造
において、２つの糖−リン酸塩バックボーンのうちの１
つは除去された。次いで、可能であれば、この塩基形状
における最初の糖−リン酸塩バックボーンが除かれた部
位に、各可能性のあるバックボーンが付加された。得ら
れた各ポリヌクレオチド／ポリマー二重構造は、次い
で、そのワトソン／クリック塩基対の同一平面性、可能
性のあるポリマーバックボーン中のねじれ歪みおよび角
度歪み、この核酸鎖上で付与される歪みの程度、および
鎖間および鎖内の非結合性相互作用について調べられ
た。各アミド基を含むバックボーンについて、そのアミ
ド部分が平面的なコンホーメーションを容易に採用し得
るかどうかに、特に注目が払われた。
【００４５】これら初期の研究から、次のことが立証さ
れた。必要なユニットバックボーン長（すなわち、N1--
--Ｅ内のN1----Ｅ間隔または活性化されたN1----N2−Ｅ
サブユニット内のN1----Ｅ間隔）は、デオキシリボース
またはリボース（環状バックボーン構造）を構成する
か、またはそこから誘導されるバックボーン部分に対
し、５−７原子であり、６原子長さが最適である。
【００４６】上記モデル研究で受け入れ可能と判断され
たサブユニット構造は、次いで、合成の実行可能性およ
び集められたポリマーバックボーンの安定性に関して評
価された。（この合成の実行可能性は、文献で報告され
た主要な合成反応またはモデル化合物に関して実施され
る反応に基づくか、および／またはこのサブユニットの
実際の合成を媒介としている。）（この集められたポリ
マーバックボーンの安定性では、一般に、適当に連結さ
れたモデル化合物またはサブユニットダイマーを用いて
予備の安定性研究が実行された。）これらのタイプの研
究は、候補となるバックボーン構造の数をさらに制限す
るべく用いられた。この制限された候補のプールから、
より好ましい構造として、第３図に示す環状バックボー
ン構造Ａ−Ｇが最終的に選択された。
【００４７】この図では、N1----N2タイプの環状バック
ボーン部分を含むサブユニットＡ−Ｄは、2'−デオキシ
リボヌクレオシド（構造Ａ）：5'位置および3'位置がア
ミノ基で置換された2'−デオキシリボヌクレオシド（そ
れぞれ、構造ＢおよびＣ）；およびリボヌクレオシドの
モルホリノ誘導体（構造Ｄ）を包含している。N1----Ｅ
タイプのバックボーン部分を含むサブユニットは、これ
らの5'位置が１つまたは２つの炭素酸で置換された2'−
デオキシリボヌクレオシド（それぞれ、構造Ｅおよび
Ｆ）；および、これらの5'位置がカルボン酸で置換され
たリボヌクレオシドのN-アミノモルホリノ誘導体（構造
Ｇ）またはスルホン酸で置換されたリボヌクレオシドの
N-アミノモルホリノ誘導体（構造Ｈ）を包含している。
【００４８】非環状（分岐していない鎖）のバックボー
ン部分に適用される同じ分子モデルの方法では、一本鎖
ポリヌクレオチドに対する塩基対水素結合内のポリマー
コンホーメーションに関して、４−６原子の範囲のユニ
ットバックボーン長が受け入れられ、５原子のバックボ
ーン長が最適であることが示された。これは、６原子の
ユニットバックボーン長が最適である環状バックボーン
と対照的である。さらに、このモデル化研究では、以下
のことが示された。この環状の認識部分は、この相補的
な塩基の同一平面性を厳密に阻害することなく、しかも
この認識部分とバックボーンとの間の望ましくない相互
作用を導入することなしでは、線状のバックボーン部分
に直接付加し得ない。この認識部分が１原子のスペーサ
ーでこのバックボーン部分と連結されると、結合歪みが
最小となった。２原子スペーサーは許容されるが、３原
子スペーサーは許容され得ない。しかし、この認識部分
と線状のバックボーンとの間の自由度が増すと、２原子
スペーサーでは標的塩基と誤って対になり得る。
【００４９】第４図に示される非環状バックボーン部分
の構造Ｉ−Ｎは、すべてバックボーン部分と認識部分と
の間に１原子のメチレンスペーサーを含んでいる。この
構造では、相補的なポリヌクレオチドに好ましい塩基対
に対する良好なモデルが得られると予測された。２つの
炭素スペーサーを含む類似構造は受け入れ可能なことが
示されたが、結合コンホーメーションは好ましくなかっ
た。図に示される構造および類似の２つの炭素スペーサ
ー構造は、一般に合成が容易なために、より好ましい非
環状バックボーン部分である。しかしながら、多くの他
のバックボーン部分もまた、一般に合成が容易でないか
および／または合成には安価ではないものの、まったく
実行可能でありかつ適当であることに触れておくべきで
ある。
【００５０】Ｃ．バックボーン／認識部分の結合 上記に示されるように、このポリマーサブユニット内の
バックボーンと認識部分とを接続する連鎖またはスペー
サーは、ある設計規準に適合するに違いない。この規準
は、ポリヌクレオチド塩基と結合する塩基対に対し、こ
の認識部分を位置決めするのに効果的である。第３図に
示される環状バックボーン部分の場合では、この認識部
分が、リボース構造またはリボース類似構造の1'炭素に
直接付加するときやモルホリノ構造の類似の1'位置に直
接付加するとき、このポリマー内の結合コンホーメーシ
ョンが最も好ましいことがモデル化研究により示され
る。すなわち、この部分は、正規の結合位置において、
ヌクレオシドのリボース基またはデオキシリボース基に
対するプリン塩基またはピリミジン塩基の正しい立体異
性化立体配置で付加している。非環状の構造に関し、こ
の認識部分を好ましい結合位置に置くためには、１つお
よび２つの炭素原子スペーサーが必要である。１原子ス
ペーサーは、上記に論じられるごとくより好ましい。
【００５１】ポリヌクレオチド標的に対しこのポリマー
分子が一定の結合親和性を得るのに要する立体規則性ポ
リマーの立体配置を達成するためには、このバックボー
ン／認識部分の結合が、すべて一定のキラリティーを有
するかまたはアキラルかいずれかであることも必要であ
る。もし、各結合がこのすべてのポリマー分子のあるサ
ブユニット位置において、同じ立体異性化立体配置また
はキラリティーを有するなら、ここでの定義のために、
この結合は一定のキラリティーを有すると考えられる。
すなわち、異なる配列位置でのサブユニットは、異なる
内部の立体異性化立体配置（特定の配列位置でのアキラ
リティーを含む）を有し得るけれども、このポリマー分
子間で与えられた配列位置における結合は、すべて同じ
立体異性化立体配置を有する。ふつうに定義されたキラ
リティーは、すべてのサブユニットに同じ立体異性化立
体配置を用いることにより、極めて容易に達成される。
【００５２】この環状のバックボーン部分に対し、第３
図に示される天然のＤ型立体異性化立体配置を有するヌ
クレオシド類似物では、最も好ましい結合が起こる。こ
のタイプのサブユニットもまた、以下に論じられるごと
く、天然のＤ型ヌクレオシド出発物質を用いて、容易に
合成される。第４図に関して、構造ＩおよびＬだけが、
このバックボーンと認識部分との間にキラルな連鎖を有
することがわかる。これらのサブユニットは、記述のよ
うに、ホモキラルな出発物質を用いることにより、ホモ
キラルな形状で容易に合成される。第４図に示される他
の非環状構造のすべてに対し、バックボーンの窒素原子
にこの１原子鎖が付加され、それゆえアキラルとなる。
もちろん、このメチレンスペーサーもまたそれ自体アキ
ラルである。
【００５３】II．保護基の戦略 このサブユニットの活性化および／またはカップリング
に用いられる化合物がかなり高い反応性を有するため
に、この認識部分の環外にあって環に結合した窒素を保
護することが、一般に望ましく、またしばしば必要であ
る。これら保護基の選択は、まず第１に、これらサブユ
ニットから組立てられるポリマー内で用いるサブユニッ
ト間結合のタイプにより決定される。２番目には、保護
されるべき窒素の相対的な反応性により決定される。
【００５４】塩基保護されたヌクレオシドは、また、以
下で述べられるような多くのサブユニット合成反応にお
いて、有用な出発試薬である。実施例１の極くありふれ
た多数のリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオ
チドを塩基保護する方法は、実施例２に例示されてい
る。この実施例に詳述されている方法は、一般に、アミ
ン保護基をもったヌクレオシドの形成に適用できる。
【００５５】用いられるサブユニット間連鎖が求核剤、
特に水酸化アンモニウムに相対的に安定であると、核酸
化学に用いられる一般の塩基保護基が適している。この
ような求核感度のないサブユニット間連鎖には、カルバ
ミン酸塩連鎖、アミド連鎖およびスルホンアミド連鎖が
含まれる。この認識部分に対し、対応する求核感度のあ
る保護基には、ＣのN4に対するベンゾイル基、ＡのN6に
対するベンゾイル基またはｐ−ニトロベンゾイル基、Ｇ
のN2に対するアセチル基またはイソブチリル基、および
2,6−ジアミノプリン残基に対するN2、N6−ビスイソブ
チリル基がある。ポリマー集合体の完成後において、水
酸化アンモニウムで処理することにより、これらの基の
除去が達成される。
【００５６】対照的に、用いられるサブユニット間連鎖
が水酸化アンモニウムのような求核剤に感度があると、
適当な保護基は、強力な非求核性塩基により、β脱離機
構を経て除去され得る保護基である。このような求核感
度のあるサブユニット間連鎖には、炭酸塩連鎖、エステ
ル連鎖、およびより狭い範囲では、トリカルバミン酸塩
連鎖が含まれる。この認識部分に対し、β脱離を経て除
去可能な適当な保護基には、ＣのN4およびＡのN6の両方
に対する２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニ
ル基または２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボ
ニル基、およびＧのN2および 2,6−ジアミノプリン残基
のN2およびN6に対する９−フルオレニルメトキシカルボ
ニル基が包含される。ポリマー集合体の完成後における
これらの基の除去は、厳しい無水条件下での強力な非求
核塩基 1,8−ジアザビシクロ[5,4,Ｏ]ウンデク−７−エ
ン(DBU）の処理により達成される。
【００５７】このバックボーン部分（一般には上記構造
のN1）の一時的な求核保護に関して、一般的なポリマー
集合戦略では、温和な酸により容易に取り除かれる選択
されたバックボーン保護基が用いられる。保護基の選択
に関する１つの主要な規準は、これらの基が充分に安定
ではあるが、除去に要する条件が成長ポリマーを損なう
ほど安定ではないことにある。環状のバックボーン部分
から集められたポリマーの場合のおもな問題点は、保護
されたプリン残基をこれらバックボーン部分のＣ１に連
結させるグリコシド結合の著しい酸感度にある。このバ
ックボーン保護基の選択に関する第２の基準は、この保
護基が容易に導入されるところにある。上記に基づい
て、以下のバックボーン保護基がより好ましい：１級水
酸基に対するジ（ｐ−メトキシ）トリチル基；１級アミ
ン基に対するｐ−メトキシトリチル基；および２級アミ
ン基（モルホリノタイプのバックボーン部分中における
ような）に対するフェニルイソプロポキシカルボニル
基。これら保護基は、ジクロルメタン中で0.2Mのジクロ
ル酢酸の処理により、容易に除去され得る。
【００５８】III．サブユニット合成 Ａ．環状バックボーン部分 デオキシリボヌクレオシドサブユニット構造（第３図の
構造Ａ）を有するサブユニットは、市販の原料から得ら
れるかまたは実施例１に記述のように、文献の方法によ
り調製され得る。このサブユニットは、以下のリボシド
およびデオキシリボシドを含んでおり、第１図で得られ
る認識部分の構造数に従って同定される：アデノシンお
よびデオキシアデノシン（構造１）； 2,6−ジアミノプ
リンリボシドおよびデオキシリボシド（構造２）；シト
ジンおよびデオキシシトジン（構造３）；４−メトキシ
−２−ピリミジノンデオキシリボシド（構造４）；２−
ヒドロキシ−５−メチルピリミジンデオキシリボシド
（構造５）；２−ヒドロキシピリミジンリボシド（構造
６）；グアノシンおよびデオキシグアノシン（構造7)；
イノシンおよびデオキシイノシン（構造８）；チオグア
ノシンおよびデオキシチオグアノシン（構造９）；ウラ
ジンおよびデオキシウリジン（構造10）；チミジンおよ
び５−メチルウリジン（構造11）；および５−ハロウリ
ジンおよび５−ハロデオキシウリジン（構造12）。
【００５９】この5'−アミノ−2',5' −ジデオキシリボ
ヌクレオシド（第３図の構造Ｂ）は、実施例３に詳述の
方法に従って調製される。簡単に言えば、この選択され
たデオキシリボヌクレオシド（必要に応じて塩基で保護
された）は、トリフェニルホスフィン、四臭化炭素およ
びリチウムアジドとの反応に供され、対応する5'−アジ
ドヌクレオシドが形成される。これは、次いで、炭素触
媒上のパラジウム存在下にて水素化により還元される。
このヌクレオシドは実施例１のように得られ、そして実
施例２のように塩基保護され得る。この反応物ヌクレオ
シドの立体化学は５−アミノヌクレオシド類似物を形成
する際に保存される。
【００６０】他の還元方法は、実施例3.2 に記述のよう
に、5'−アジド−５−ブロモウリジンのアジド基を還元
する際に用いられる。ここで、触媒なしの水素化は、環
の臭素原子の分離を妨げるために必要である。この5'−
アミングアノシン化合物を形成する際に、実施例3.2 に
詳述のように、まずこの5'水酸基のトシル化、次いでア
ジドでの置換により、このアジドは5'位に配置される。
【００６１】この3'−アミノ−2',3'−ジデオキシリボ
ヌクレオシド（第３図の構造Ｃ）は、実施例４に詳述の
方法に従って調製される。簡単に言えば、5'位の水酸基
にて保護されるチミジンは、3'位の水酸基にてトシル化
され、次いで、２オキシ塩基置換基により分子内置換さ
れる。得られた環はアジドによる処理によりすぐに開環
され、正確な立体異性形状のアジド類似物が生じる。こ
の類似物は、このアジド化合物と、選択されたプリン塩
基またはピリミジン塩基との反応により、選択された塩
基類似物に転化され得る。この後者は、必要に応じて、
以下に記述のように、続いて起こるサブユニットカップ
リング反応に対し塩基保護されてもよい。このチミジン
または他のアジド類似物は、次いで還元され、所望の3'
−アミンヌクレオシドが生成する。このチミジン出発物
質の立体化学は、合成において保存される。
【００６２】第３図の構造Ｄに示されるこのモルホリノ
タイプのサブユニット誘導体の合成は、種々の異なる認
識部分に対し、実施例５で詳述されている。簡単に言え
ば、選択されたヌクレオシド（必要に応じて塩基保護さ
れた）は、重ホウ酸アンモニウムのようなアンモニウム
塩に溶解され、次いで、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応
に供されて、過渡的な2',3'−ジアルデヒドが形成され
る。これは、次いで、アンモニウムイオン上で閉環さ
れ、2'位および4'位に水酸基を有するモルホリノ環が形
成される。この化合物は、次いで、この環の水酸基を除
去するべく、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムで処理され
る。この環の窒素は、好ましくは、続いて起こるサブユ
ニットカップリングに対し、２−フェニルイソプロピル
カルバミン酸塩として保護される。このヌクレオシド出
発物質の立体化学は保持される。
【００６３】5'位に酢酸基を有するデオキシリボースサ
ブユニット構造（第３図の構造Ｆ）は、実施例６に記述
の一般的な合成スキームに従って調製され得る。このス
キームは、構造Ｆで示される5'位が酢酸の化合物の合成
を詳述している。ここで、3'位が水酸基で保護されてい
る選択されたデオキシリボヌクレオシドは、5'位にアル
デヒドが転化され、続いて、不飽和な酢酸誘導体を与え
るべく、２位に炭素のあるウィッティヒ試薬で処理され
る。この側鎖オレフィンの還元により、5'位が酢酸であ
る所望の化合物が得られる。この反応は、出発ヌクレオ
シド物質の立体化学を保存している。
【００６４】この類似の5'位がギ酸塩の化合物（第３図
の構造Ｅ）は、上記5'ヌクレオシドアルデヒドを１個の
炭素のウィッティヒ試薬で処理し、得られたエノールを
加水分解して対応するホルムアルデヒド誘導体（これは
所望の酸に酸化される）を形成することにより、形成さ
れる。この反応は、出発ヌクレオシド物質の立体化学を
保存する。
【００６５】Ｂ．サブユニット合成−非環状バックボー
ン 第４図の構造Ｉで示される５原子の鎖状アミノ酸サブユ
ニットは、実施例７−９で概説されている一般的な方法
に従って調製される。簡単に言えば、 (S)−５−カルボ
キシピロリドンが、公知方法により、立体化学的に純粋
な対応する (S)−５−トシルメチル−２−ピロリドンに
転化された。次いで、これは、選択されたプリンまたは
ピリミジンとの反応とに供され、対応する(S) −５−メ
チルプリン（またはメチルピリミジン）ピロリドンが形
成される。この置換反応は最初の立体特異性を保持し、
その結果、形成されるサブユニットは、この認識部分の
結合部位において、このバックボーン炭素に対し、同一
異性である。
【００６６】サブユニット合成に用いられるプリンは、
１位および３位の環窒素の反応性を減ずるべく、すなわ
ち、環窒素にピロリドンがカップリングすることを最小
にするべく、好ましくは６位に電子吸引性基を含んでい
る。このピロリドンが誘導されたプリンまたはピリミジ
ンは、次いで、以下に記述の開環ステップ前に、アミン
誘導体に転化され、必要に応じて塩基保護されてもよ
い。実施例7.1 および7.2 はシトシンピロリドンおよび
その塩基保護された誘導体の形成方法を詳述している。
実施例7.3 −7.5 で形成されるアデノシンピロリドン
は、出発物質として６−クロロプリンを用いている。こ
の対応するピロリドンは、記述のように、アジド形成を
経て、アデノシン誘導体に転化される。このアデノシン
は、実施例7.6 のように開環前に塩基保護される。実施
例7.7 −7.9 に記述のように、２−アミノ−６−クロロ
プリンから出発して、塩基保護されたグアニンピロリド
ンを生ずるべく、類似の方法が用いられる。 2,6−ジア
ミノプリンピロリドン、イノシンピロリドンおよび２−
ヒドロキシピリミジンピロリドンの合成にもまた、実施
例７に詳述のように、類似の方法が用いられる。
【００６７】このピロリドンは、次いで、ｔ−BOC で保
護されたアミンを用いてピロリドン環を開裂し、アミノ
酸を形成する一連の反応を経て処理される。実施例8.1
−8.4 は、多数の選択された認識部分を有するこのよう
なｔ−BOC アミノ酸の合成を記述している。最終ステッ
プ（実施例５）では、このｔ−BOC 保護基は、第４図の
構造Ｉで示される対応するアミノ酸を形成するべく、除
去されてもよい。このアミノ酸は、以下の反応に従っ
て、サブユニットカップリングに対し直接用いられ得
る。他方、このｔ−BOC で保護された化合物は、サブユ
ニットカップリング反応で使用するために、その酸基に
おいて活性化され得る。
【００６８】第４図の構造Ｊで示されるサブユニット形
成方法は、それぞれシトジン類似物サブユニットおよび
ウリジン類似物サブユニットを形成するために、実施例
１０．１と１０．２に概説される。簡単に言うと、ピリ
ミジンタイプのサブユニットを形成する際には、ピリミ
ジンまたはニコチン酸塩のような６員環の複素環が、バ
ックボーンへの付加がうまくできる炭素環部位で、反応
性のあるメチレンを含むように修飾される。実施例10.1
に詳説されるように、このシトシン類似物は、５−アミ
ノ−５−ブロモピリミジンを反応させて対応する５−位
のカルボキシアルデヒドを形成することにより形成され
る。実施例12にあるように、このウリジン類似物は、６
−ヒドロキシニコチン酸エステルを対応するベンジリッ
クアルコールに転化することにより、形成される。この
化合物は、二酸化マンガン存在下の反応により、アルデ
ヒドに転化される。
【００６９】このアルデヒド化合物は、次いで、４−ア
ミノ酪酸のような所望のアミノ酸との反応に供される。
安定なアミンサブユニット形成のために還元される不安
定なイミンを生成するアミン基で反応がなされる。この
２級アミンは、実施例10.1に記述のように、ｔ−BOC 基
により、酸基の活性化を含むサブユニットカップリング
に対して保護され得る。バックボーン窒素においてメチ
レンスペーサーを通じて、バックボーンに塩基が付加さ
れ、このサブユニットがキラル中心を持たず、それゆえ
立体規則的でないようにされる。
【００７０】第４図のＫに示されるサブユニット構造を
形成するために、上記化合物のＣ−炭素バックボーン類
似物が、３−アミノプロピオン酸を用いて調製され、こ
の化合物はさらに、酸化窒素で処理され、対応するＮ−
ニトロソ化合物が形成される。この化合物は、鉄塩存在
下でH2IPd により、順に還元されて、ヒドラジノ酸サブ
ユニットが得られる。
【００７１】IV．バックボーンカップリング反応 本発明のポリマー分子の形成に用いられるカップリング
反応は、ひとつの選択されたサブユニットまたはサブユ
ニット配列を、もうひとつの選択されたサブユニットま
たはサブユニット配列に結合させる段階的反応である。
この議論をするため、このカップリング反応は、一般
に、選択された認識部分R1を有する単一のサブユニット
B-R1が、同一または相異なる選択された認識部分R2を有
するもう１つの単一のサブユニットB-R2とカップリング
して以下の形状の２量体を形成することに関して記述さ
れるだろう。
【００７２】
【化１４】
【００７３】ここでR1およびR2は示された特異的配列を
有する。
【００７４】Ａ：サブユニットのカップリング；N ----
N バックボーン立体配置 N1----N2バックボーン立体配置を有するサブユニットの
カップリングの一般的な方法は、第5A図および第5B図に
例示される。上記第Ｉ節から想起されるように、N1およ
びN2は、水酸基やアミン基のような求核性のバックボー
ン基である。この基は、求電子基Ｅによって活性化され
得、活性化されたN1−Ｅバックボーン基またはN2−Ｅバ
ックボーン基が形成される。これらの基は、次いで、第
２のN1----N2タイプのバックボーン部分と反応してN1--
--N2−Ｅ−N1----N2バックボーン結合された２量体を形
成する。このタイプのサブユニットバックボーンは、上
記に特に記述されており、第３図の構造Ａ−Ｄの環状バ
ックボーンである。構造ＡおよびＢでは、この活性化さ
れたN2求核基が3'水酸基であり、構造Ｃでは5'水酸基、
そして、構造Ｄでは構造Ｃの5'位の水酸基に相当する6'
位の水酸基である。第5A図に例示されるより好ましいカ
ップリング方法では、選択された認識部分R1を有するサ
ブユニットは、求電子基Ｅによって活性化される。この
認識部分の星印は、必要な塩基保護を示す。この図から
わかるように、この選択されたサブユニットは、N1求核
基で保護されており、N2求核基だけが活性化される、お
よびこの活性化されたサブユニットは、それ自体で重合
し得ないことを保証している。第３図の構造Ａ、Ｃおよ
びＤでは、このバックボーン保護基が5'水酸基であり、
この保護基は、好ましくはジメトキシトリチル(DMTO)の
ような酸不安定基である。
【００７５】第5A図に示される活性化試薬は以下の一般
式を有する：
【００７６】
【化１５】
【００７７】ここでＸは、酸素または硫黄、そしてＣ
は、求核基（例えば、水酸基の酸素かアミンの窒素）と
反応しＹと置換して活性化されたサブユニットを形成し
得る活性な求電子基である。
【００７８】活性化剤（例えば、ビス−p−ニトロフェ
ニルカーボネート）は、カルボニルで活性化されたサブ
ユニット（Ｘ＝Ｏ）を与え、カーボネートやカルバメー
トサブユニット連鎖を形成する際に使用される。同様
に、チオカルボニル−ジ−(1,2,4−トリアゾール）（Ｘ
＝Ｓ）のような活性化剤は、チオカルバメート連鎖を形
成する際に使用される。
【００７９】カルボニルで活性化されたサブユニットを
含むサブユニット活性化反応は、第４図のＡで示される
5'位が保護された2'−デオキシヌクレオシドに対し、実
施例11に詳述されている；実施例12では、第４図のＢで
示される5'位が保護されたアミノヌクレオシド；実施例
13では、第４図のＤに示されるＮが保護されたモルホリ
ノタイプのサブユニットについて詳述されている。これ
らの構造中の水酸基の活性化に用いられる一般的な反応
条件は、一般に適用可能である；チオカルボニル活性化
サブユニットを含むサブユニット活性化反応は、Ｂに示
される5'−アミノヌクレオシドに関し実施例14で、そし
て第３図のＤに示されるモルホリノタイプのサブユニッ
トは実施例15に示した。
【００８０】この活性化反応に続いて、シリカゲルクロ
マトグラフィーのような通常の方法により、活性化複合
体が精製される。次いで、これは２番目のサブユニット
との反応に供される。このサブユニットの選択された認
識部分R2は、完成したポリマー中の次の配列中の認識部
分を形成する。このカップリング反応は、好ましくは、
活性基がバックボーンのN2アミン基とは反応し得るが、
N1水酸基とは反応し得ないような、温和な条件下で実行
される。それゆえ、この方法は、第４図の構造Ｂ−Ｄに
示されるタイプのサブユニットのカップリングには適し
ているが、構造Ａのサブユニットには適さない。このカ
ップリング方法の有利な点は、第２のサブユニット−こ
れは、アミンN1の求核基および水酸基N2の求核基を含む
−が、最初に活性化されたサブユニットと、このN1アミ
ンを介してのみカップリングし、それゆえN2バックボー
ン基を保護する必要がないことにある。従って、得られ
る２量体サブユニットは、図に示されるように、N2−Ｅ
−N1結合を通じてカップリングされる。
【００８１】この第２のサブユニットの遊離のN2求核基
を活性化し、活性化剤からこの活性化された種を分離
し、そして活性化された化合物を、バックボーンが保護
されていない次の配列中のサブユニットとカップリング
させるという上記のステップをくり返すことにより、こ
のオリゴマーが伸長され得る。この方法は、固相ブロッ
クの集合に適した溶液法（下記で記述されている）によ
って、短いオリゴマーブロックを形成するのに特に使用
される。
【００８２】固相の連続的なサブユニット添加によって
ポリマーを形成するために、第5B図に概説される第２の
カップリング法が、より好ましい。この第２の方法は、
存在するサブユニットまたはポリマー鎖に、活性化され
た過剰のサブユニットを付加することにより、ポリマー
の成長が起こる点で、最初の方法とは異なっている。む
しろ最初の方法では、活性化されていないサブユニット
を活性化された鎖に付加することにより、ポリマーの成
長が生じる。第5B図には、認識部分がR1（第5B図の２列
め）のサブユニットにより、存在するサブユニットまた
はサブユニット鎖が示される。このサブユニットは、遊
離のN1バックボーン求核基およびN2求核基を有する。こ
のN2求核基は、固体担体との比較的酸に安定な結合によ
り、または固体担体と結合するサブユニット鎖に連結さ
れることにより、保護されている。このようにN2が保護
された環状バックボーンサブユニットを形成する方法
は、一般的に実施例12〜15に述べられている。この最初
のサブユニット（成長するポリマー中で最も最近付加さ
れたサブユニット）は、ポリマー中の次の配列内のサブ
ユニットになる活性化されたサブユニットとの反応にす
ぐに供される。この活性化されたサブユニットは、N2バ
ックボーン部位で活性化され、そして比較的酸に不安定
な保護基によってN1部位が保護されている。このサブユ
ニットは、第６図に関連して上記で述べた方法により調
製される。
【００８３】第5B図でわかるように、このカップリング
反応により、N2−活性化した第２のサブユニットが、N1
−保護された第１のサブユニットに付加され、N2−Ｅ−
N1結合を介して両者がカップリングされ、そして遊離の
バックボーン求核部位の両方が保護された化合物が形成
される。この化合物は、例えば酸と反応させることによ
りすぐに処理され、最後に付加されたサブユニット上の
酸に不安定なN1保護基が脱保護される。この手順は、所
望の配列ポリマーを構築するべく繰り返される。
【００８４】上記のことから、このN2−活性化されたサ
ブユニット（これは、最後の配列中のサブユニットを形
成する）は、そのN1バックボーン部位で保護され、それ
によりN2部位での選択的な活性化を可能にするとともに
活性化された化合物の自己重合を防止するに違いない。
また、このN1−脱保護されたサブユニットは、活性化サ
ブユニットとカップリングし得る。このサブユニット
は、N2−活性化されたサブユニットとそのN1部分との選
択的な反応を可能にするべく、N2部位が保護されるだろ
う。それゆえ、この反応するサブユニットは、１つのバ
ックボーン部位がともに保護されているので、この方法
は、ヌクレオシド（第４図の構造Ａ）のカップリングだ
けでなく、アミンと水酸基バックボーン求核基の両方を
含んだ環状バックボーンを有するサブユニット（例え
ば、この図の構造Ｂ−Ｄ）のカップリングにも適してい
る。構造Ａのサブユニットを、カーボネート結合を介し
てカップリングするのに用いられる反応方法は、実施例
12に詳述される。簡単に言うと、5'位が保護されたバッ
クボーン部分を含むサブユニットが、3'位の水酸基にて
活性化され、3'位の水酸基を保護した他のサブユニット
（または成長鎖）との反応に供される。このカップリン
グ反応は、Ｎ−メチルイミダゾールまたはＮ,Ｎ−ジメ
チルアミノピリジンのような、カーボネート結合を形成
するのに必要な触媒の存在下で実行される。構造Ｂ〜Ｄ
の環状バックボーンを含むサブユニットのカップリング
には、サブユニット間のカーバメート結合またはチオカ
ーバメート結合が形成される場合において、最初の方法
に関して上に記述のようなより温和な、触媒のないカッ
プリング条件が適している。
【００８５】この第２のカップリング方法の、固相サブ
ユニット添加によるポリマーの形成に対する有利な点
は、実質的に過剰のモル数の活性化されたサブユニット
が、各ポリマーの添加段階において、成長している担体
結合ポリマーに加えられ、その結果、非常に高い割合で
担体結合ポリマーにカップリングしているサブユニット
が得られる点にある。このことは、大部分の担体結合ポ
リマーが、所望のサブユニットの完全な配列を含むこと
を保証している。第１の方法と比較すると、この成長し
ているポリマーが、最後に添加されたサブユニットで活
性化される場合には、サブユニット添加の効率は、活性
化段階の効率によって制限される。
【００８６】第６図は、第４図でＡ−ＡからＤ−Ｄまで
示される環状バックボーンサブユニットのカップリング
により形成される２量体構造を示す。この図の構造Ａ中
のヌクレオシドサブユニットは、カーボネート（Ｙ＝
Ｏ）により結合される。残った３つの構造Ｂ−Ｄでは、
このサブユニットは、カーバメート（Ｙ＝Ｏ）結合また
はチオカーバメート（Ｙ＝Ｓ）結合により連結される。
この図からわかるように、すべてのサブユニット連鎖
は、荷電しておらずしかもアキラルである。すなわちキ
ラル中心を含んでいない。添付に際し、この連鎖は、水
系媒質中で安定である。このことは、中性の水系溶液中
において、長期間にわたって加水分解に耐性があるとい
うポリマーの性能から判断される。
【００８７】本発明の他の重要な特徴によれば、この構
造は、ポリマーを形成するべく結合されるとき、相補的
なポリヌクレオチドとともに正しいワトソン／クリック
塩基対を示す。
【００８８】最後に、もう１つの本発明の重要な特徴に
よれば、このサブユニットから形成されるポリマーは、
立体規則性である。これは、天然のヌクレオシドまたは
ヌクレオシド誘導体または天然の立体異性化立体配置を
有する合成ヌクレオシドをサブユニットとして用いるこ
と、およびアキラルなサブユニット間連鎖によりこのサ
ブユニットを連結すること、により達成される。カップ
リング方法の例は、実施例11〜15に詳述される。
【００８９】Ｂ．サブユニットカップリング；N ----Ｅ
バックボーン立体配置 N1----Ｅバックボーン立体配置を有するサブユニットの
一般的なカップリング方法は、第7A図、第7B図および第
7C図に例示される。上記第Ｉ節から想起されるように、
N1は水酸基またはアミン基のような求核性バックボーン
基であり、Ｅは、カルボキシル基またはスルホニル基の
ような求電子基である。このN1は、活性化されると、第
２のN1----Ｅタイプのバックボーンと反応して、N1----
Ｅ−N1----Ｅバックボーン結合２量体を形成し得る。こ
のタイプのサブユニットバックボーン、特に上記に述べ
られるバックボーンは、第３図の環状バックボーン構造
Ｅ〜Ｈ、および第４図の非環状バックボーン構造Ｉ〜Ｎ
である。この環状構造ＥおよびＦにおいて、このN1求核
基は、3'位の水酸基であり、構造ＧおよびＨでは、モル
ホリノ環上の3'位の窒素に付加されたアミンである。す
べての環状構造において、このＥ基は、リボース環の5'
位かまたはモルホリノ環の6'位に付加したカルボキシル
基または対応するスルホニル基である。第４図に示され
るすべての構造では、このN1基およびＥ基は、それぞれ
バックボーンアミンまたはヒドラジンおよびバックボー
ン部分末端のカルボキシル基またはスルホン酸基であ
る。
【００９０】この第１のカップリング方法は、第7A図に
例示されており、第5A図に関連して上記に述べた方法と
類似している。ここでは、第１のN1−保護されたサブユ
ニットが活性化され、次いで、バックボーン−非保護サ
ブユニットと直接カップリングされる。このサブユニッ
トは、成長しているポリマー中の次の配列内のサブユニ
ットを形成する。このサブユニットN1のP1保護基は、好
ましくは、固体担体に結合した開裂可能なリンカーか、
ｔ−ブトキシカルボニル基のような酸に不安定な保護基
である。環状バックボーン構造のN1−保護の方法は、環
状構造Ａ〜Ｄに対し上記に述べた手順に類似している。
同様の方法が、非環状バックボーン構造中のアミンの窒
素の保護に効果的である。他方、もしこのポリマーが固
相の担体上で構成され得るなら、下記に述べるように、
このバックボーンのN1部位は、成長ポリマーへのサブユ
ニットの添加に伴うN1部の固体担体への結合により保護
され得る。この成長ポリマーは、最後に添加されるサブ
ユニットの活性化された求電子基Ｅにより生じる。
【００９１】この活性化反応は、活性化された部分また
は鎖の末端部分が、N1----Ｅ−Ｘを形成するように設計
される。ここで、Ｘは第６図に関連して上記に記述され
ている。この活性化されたサブユニットは、バックボー
ン求核基に対して、以前に述べた方法で活性化されたサ
ブユニットと、ほとんど同様の反応性を有する。すなわ
ち、この活性化は、N1----N2タイプのバックボーンとほ
とんど同様の活性化カップリング基を生成するべく設計
されている。しかし、その場合、この反応性のカルボニ
ル基またはスルホニル基が、第６図に示される方法のよ
うに、活性化試薬のカルボニル基またはスルホニル基よ
りむしろバックボーン自身により供給される。この活性
化は、バックボーンの求電子基がカルボニル基の場合、
p−ニトロフェノールの存在下で、N1----Ｅタイプのサ
ブユニットをカルボジイミドと反応させることにより、
容易に達成され得る。または、このバックボーンがスル
ホニルの場合には、イミダーゾール、1,2,4-トリアゾー
ルまたはテトラゾールの存在下でこのサブユニットをカ
ルボジイミドと反応させることにより達成され得る。カ
ルボニル求電子基を含むサブユニット活性化反応は、実
施例16および17に詳述される。このＮ−アミノ−モルフ
ィリノ基および線状鎖バックボーンのカルボニル基を活
性化するのに用いられる一般的な反応条件は、一般に、
第３図および第４図に示される他のN1----Ｅタイプのバ
ックボーン構造にも適用できる。
【００９２】この活性化反応につづいて、この活性化複
合体は、シリカクロマトグラフィーのような通常の方法
により精製される。または担体結合され活性化された鎖
の場合には、単に洗浄される。次いで、選択された認識
部分R2が完全なポリマー中の配列内の次の認識部分を形
成するような第２のサブユニットとの反応に供される。
このカップリング反応によって、図に示されるような２
量体が得られる。この２量体のサブユニットは、それゆ
え、E-N1結合を介してカップリングされている。上記の
ように、両方のサブユニットは、活性化反応およびカッ
プリング反応の間に、適切に塩基保護されなければなら
ない。
【００９３】このポリマーは、上記の段階をくり返して
伸長し得る。この段階は、第２のサブユニット中の遊離
のＥ求電子基を活性化すること、この活性化剤から活性
化された種を分離すること、およびこの活性化された化
合物と、次の配列中のサブユニット（これは、バックボ
ーンが保護されていない）とをカップリングさせること
である。
【００９４】この第２のカップリング方法は、第7B図に
例示される。この方法は、第5B図に関連して上記に記述
の方法と、直接的に類似している。ここでは、Ｅ−保護
されたバックボーンを有する最初のサブユニットが、活
性化されたＥ基および保護されたN1求核基を有する第２
のサブユニットとの反応に供され、Ｅ−N1結合により連
結されかつ両方の遊離したバックボーン末端基が保護さ
れた２量体が形成される。このポリマーが、固相合成に
よって形成される場合には、このP2保護“基”は、固体
担体と酸安定性の連鎖を形成する。このN1−保護された
サブユニットは、上記のように調製されそして活性化さ
れる。カップリングの条件は、一般に、上記の環状サブ
ユニットカップリング反応で用いられる条件に従う。
【００９５】第7C図に示される第３のカップリング方法
では、このN1−保護されかつＥ−非保護のサブユニット
（またはポリマーユニット）が、指示されるごとく、カ
ルボジイミドのような適当なＥ−活性化試薬の存在下
で、ともに反応に供される。
【００９６】第８図は、環状および非環状のバックボー
ンサブユニット（これらは、それぞれ第３図および第４
図のＥ−Ｋ、およびＥ−ＥからＫ−Ｋで示される）をカ
ップリングすることにより生成する２量体構造を示す。
第３図の構造Ｆ−Ｆのヌクレオシドサブユニットは、エ
ステル結合で連結されている。環状バックボーン構造の
ままで、このサブユニットＧ−Ｇは、ヒドラジド結合あ
るいはスルホニルヒドラジド結合を介して連結されてい
る。Ｉ−Ｉ、Ｊ−ＪおよびＫ−Ｋに示される非環状バッ
クボーンサブユニットの全ては、アミド結合（Ｅ＝カル
ボニル）またはスルホンアミド結合（Ｅ＝スルホニル）
を介して連結されている。上記に述べられた環状バック
ボーンサブユニット構造におけるように、すべてのサブ
ユニット連鎖は、エステル結合、ヒドラジド結合および
アミド結合の溶液中での公知の安定性から推定されるよ
うに、水系媒質中にてかなり安定である。
【００９７】本発明の他の重要な特徴によれば、この構
造は、ポリマーを形成するべく連結されるとき、相補的
ポリヌクレオチドと、ワトソン／クリック塩基対を示
す。
【００９８】最後に、上に述べたN1----N2バックボーン
サブユニットとともに示されているすべてのN1----Ｅバ
ックボーン構造は立体規則性である。これは、認識部分
のバックボーン部分への付加のホモモラル（第３図のＥ
〜Ｈおよび第４図のＩとＬ）な性質またはアキラル（第
４図のＪ、Ｋ、ＭおよびＮ）な性質、およびｂアキラル
なサブユニット連鎖による。
【００９９】Ｃ．サブユニットのカップリング；交互に
荷電され荷電されていないアキラルな連鎖 いくらかの応用において、ひとつかあるいはそれ以上の
荷電されたアキラルなサブユニット連鎖をポリマー分子
中に導入することが望ましい。以下でさらに記述される
ように、このバックボーンの電荷は、多くの溶液への適
用に際しポリマーの溶解度を促進し、あるいはポリマー
の標的結合定数を調整するために用いられ得る。荷電さ
れたアキラルなバックボーン連鎖、例えば、２番目かあ
るいは３番目のサブユニット間に規則的に配置したポリ
マーは、以下に述べるような新規な診察システムに適し
ている。現在議論している目的のために、アキラルな非
荷電連鎖によって内部に連結される２つかそれ以上のサ
ブユニットから構成されるポリマーユニットは、荷電さ
れたアキラルな連鎖により連結されうる。これらの非荷
電ユニットは、上記のＡ節およびＢ節に記述の方法の１
つにより形成される。
【０１００】連結されうる２量体サブユニットは次のよ
うに選択される。ひとつの２量体の遊離したN2基が、も
うひとつの２量体の遊離のN1基と、適当に荷電されたア
キラルな連鎖を介して、カップリングされ得る。この望
ましい連鎖は、ひとつのサブユニットの遊離N2基と、も
うひとつのサブユニットの遊離のN1基がともに水酸基で
あることを必要とするホスホジエステル結合である。第
３図を見ればわかるように、この条件では、構造Ａおよ
び構造Ｂのいずれかのサブユニットから形成される２量
体（その両方は遊離のN2水酸基を有する）が、構造Ａ、
Ｃ、またはＤのサブユニットから形成された２量体（こ
れらは、全て遊離のN1水酸基を有する）と結合するなら
ば適当である。
【０１０１】典型的なカップリング方法では、N1位を保
護した２量体Ａは、第９図に示されるように、ホスホエ
ステル結合を介してN2水酸基と連結された反応性ホスホ
エステルカップリング種に誘導される一連の反応の間保
たれる。より好ましいカップリング方法は、米国特許出
願“ポリヌクレオチド測定試薬と方法”連続番号712,39
6(1985年３月15日出願）に詳述されている。この方法
は、４量体の形成に関して、非荷電の立体特異的なメチ
ルホスホネート結合および荷電されたアキラルなホスホ
ジエステル結合を交互に有する。簡単に言うと、この例
示された方法は、まずメチルホスホネート結合により連
結されたヌクレオチド２量体を形成し、この２量体の立
体異性型を単離し、そして立体異性型２量体のひとつを
活性化して、N1−保護された反応性のN2−(p−クロロフ
ェニル−２−シアノエチル)−ホスフェートを形成する
ことを包含する。この活性化された２量体は、次いで、
第２の２量体との反応に供され、非荷電で立体異性型の
連鎖および荷電されたアキラルなサブユニット間連鎖に
より交互に連結される４量体を形成する。
【０１０２】このホスホジエステル連結方法は、アキラ
ルではあるが非荷電の結合反応を含むポリマーカップリ
ングに関し、Ａ節およびＢ節に概説される一般的な方法
に従って、溶液タイプのポリマー合成方法か担体タイプ
のポリマー合成方法のいずれかを組み合わせていてもよ
い。示されるように、このホスホジエステル結合は、非
荷電のアキラルな結合によりそれ自体カップリングされ
る２量体ユニットあるいは多量体ユニットのカップリン
グに使用され得る。あるいは、この結合は、非荷電でキ
ラルだが立体異性的な結合（メチルホスホネートが連結
された２量体の分離された立体異性形状）により連結さ
れる２量体ユニットのカップリングに対し形成され得
る。
【０１０３】下記に述べられる診断への応用のために、
一般に、水系媒質中で充分なポリマー溶解度を得るのに
要するのと同程度にほとんど荷電されていない連鎖を導
入することがより好ましい。この溶解性の促進は、一般
に、約20サブユニットのポリマーあたり１〜３の荷電さ
れたバックボーン連鎖、好ましくは、４サブユニットあ
たり約１つを越えない荷電された連鎖で達成される。こ
こで定義されるように、アキラルなバックボーン連鎖
は、もしそれが２量体ユニットあたり約１つの荷電バッ
クボーン連鎖より少ないバックボーン連鎖を含み、好ま
しくは、４量体ユニットあたり１つか２、３のバックボ
ーン連鎖を含むならば、実質的に非荷電であると考えら
れる。
【０１０４】Ｖ．ポリマー標的化の考察 本発明に用いられるポリヌクレオチド結合ポリマーを調
製する際に適用される設計上の考察は、標的分析物の性
質およびこの分析物が検定され得る反応条件に支配され
る。
【０１０５】最初の考察としては、選択された非単独重
合性の標的塩基配列（これに対し、ポリマーが指示され
ている）がある。この標的配列は、好ましくは、検定さ
れる分析物に対して特有である。すなわち、この配列
は、既知の多数の配列塩基を含む検定混合物中にて、あ
る限定されたわずかの確率（例えば１％またはそれ以
下）でのみ生じるべく算出される。既知の n−塩基標的
配列の出現確率は、およそ1/4nである。すなわち、既知
の n−塩基標的配列は、4n個の塩基を含むポリマー中に
おいて、約１回出現すると推測されるだろう。それゆ
え、既知の n−塩基配列が、N個の特有の配列塩基全体
を含むポリヌクレオチドで生じる確率 Pは、およそ P＝
N/4nである。例示のために、 9−塩基標的配列が20キロ
ベースのヌクレオチド内に見出される確率 Pは、約20×
103／２×105 すなわち0.08であり、16−塩基標的配列
が存在する確率は約20×103／4.3×109 すなわち 0.000
0047である。これらの計算から、９〜16個の一定の塩基
標的配列に対し特異的な９〜16個の認識部分を有するポ
リマーは、ウイルス性ゲノムだけを含む検定混合物（こ
の最大の複合体は、約 400K の特有の配列塩基に対応し
ている）中の標的配列に対し、高い特異性を有するべき
ことが見出されている。
【０１０６】類似のタイプの計算では、12〜16個のサブ
ユニットポリマーが、ウイルス性およびバクテリア性の
ゲノム物質（最大のゲノムサイズは約5000キロベース）
だけを含む検定混合物中にて、ウイルス性またはバクテ
リア性の標的配列に対し充分な特異性を提供し得ること
が示されている。また、16〜22個のサブユニットポリマ
ーは、動物性のゲノミック DNA物質（ゲノムサイズは、
特有の配列 DNAの約50億塩基対である）を含むポリヌク
レオチド混合物中にて、標的配列に対し充分な特異性を
提供し得ることも示されている。
【０１０７】このポリマー／分析物の結合親和性、およ
び特にこのポリマーが標的配列とうまく結合する温度
（融解温度すなわちTm）は、ポリマーの長さ、認識部分
とそれに対応する分析物の標的配列の配列内塩基との間
に形成されうる水素結合の数、バックボーンの荷電密
度、によって選択的に変化させ得る。モデルホモポリマ
ー二本鎖における多くの研究から、オリゴヌクレオチド
二本鎖の融解温度は、10〜20bpの範囲で、この相補的な
塩基が水素結合を２つ形成し得る場合には、添加される
塩基対あたり、およそ３℃、この塩基が水素結合を３つ
形成し得る場合には、約６℃上昇する事が知られてい
る。それゆえ、最初にこのポリマーとの高い結合特異性
を保証するべく選択された標的配列の長さは、選択され
た検定条件での相補的な塩基ポリマーとの所望の融解温
度を得るために伸長されてもよい。また、上記に例示の
ように、このポリマーを構成する際に用いられる認識部
分が標準的な核酸塩基であるなら、この標的配列は、比
較的高いポリマー／分析物の融解温度を達成するため
に、グアニン塩基にシトシン塩基を加えた割合を高くよ
うに選択されてもよい。または、この標的配列は、比較
的低い融解温度を達成するために、アデニン塩基にチミ
ン塩基を加えた割合を高くするよう選択されてもよい。
【０１０８】このポリマーのバックボーンの荷電密度
は、このポリヌクレオチド分析物の荷電密度より実質的
に低くなければならない。それは、すでに言及されてい
るように、レポーターのポリマーへの結合がおこらない
条件下で、ポリカチオン性レポーター分子を分析物に優
先的に結合させるためである。この必要条件は、ポリマ
ーバックボーンの隣接する負電荷の間隔が、分析物の隣
接するホスホジエステル結合の負電荷の間隔の少なくと
も２倍あれば満たされる。このバックボーンの荷電密度
もまた、ポリマー／分析物の融解温度に重要な影響を与
える。特に、塩濃度が低い条件では、分析物とポリマー
バックボーンとの電荷間の反発も、２つがアニールでき
る温度を低下させるように作用し得る。それゆえ、一般
に、電荷のより少ないバックボーンを有するポリマー
は、1)分析物／ポリマーの融解温度がより高くなるこ
と、および2)この融解温度の塩濃度への依存がより低く
なること、を示すと期待されるだろう。これらの考察に
基づくと、第６図および第８図に関連して上記に記述さ
れる数種のポリマーのような非荷電でアキラルなポリマ
ーは、交互に荷電されたアキラルなホスホジエステル結
合およびアキラルまたはキラルのいずれかである非荷電
の連鎖、から形成されるポリマーのような部分的に荷電
されかつ立体特異的に限定されたポリマーより広範囲の
塩濃度で、診断方法におけるポリマー／分析物のアニー
リング反応の実行を可能にさせるだろう。
【０１０９】VI．ポリマー集合方法 Ａ．幾何学的集合方法 第ＩＶ節で考察される要因によれば、所望のポリマー長
および認識部分の配列を選択した後、上記に詳述の一般
的なサブユニットカップリング手順を用いて、このポリ
マーが集められる。ポリマーを集める一つの方法には、
はじめに適当な一組の２量体を調製し、選択された２量
体を連結させて４量体を形成し、それらを連結して８量
体を形成するなど、が含まれる。この方法は溶液中で実
行され、第5A図および第7A図に関連して上記に記述され
る方法に実質的に従う。すべてのカップリングが必ずし
も同じサイズのオリゴマーの間で行われる必要がない事
に注目すべきである。例えば、しばしば、最後のカップ
リングでは、20量体を得るには、16量体と４量体とを連
結させること、あるいは24量体を得るには16量体と８量
体とを連結させることが望ましい。
【０１１０】この集合方法で特に有利な点は、それぞれ
のカップリング生成物が、その前駆体のおよそ２倍の質
量をもつので、それぞれのカップリング生成物の精製が
簡単な事である。下記の実施例18では、８サブユニット
のカルバミン酸塩が連結されたポリマーのこの方法によ
り形成される集合体について詳細に述べる。
【０１１１】Ｂ．固体担体上での段階的集合 ポリマー合成のための一つの好ましい方法として、固体
担体上での段階的な集合がある。ここでは、ポリマー中
の最初のサブユニットが、そのN2バックボーン基を介し
て固体担体に付加される。典型的には、開裂可能であり
好ましくは酸に安定な長鎖のリンカーによって誘導され
たガラスビーズのような固体担体が、この担体材料とし
て用いられる。実施例19で記述のごとく、この固体担体
は、ヌクレオシドの5'水酸基のようなN2求核基の付加の
ために調製される。このガラスビーズは、好ましくは酸
に不安定なN1保護基、および活性化されたN2基または E
バックボーン基を有するサブユニットと、第IV節に詳述
のように反応に供される。種々のタイプのサブユニット
のガラスビーズ担体へのカップリングは、一般に、実施
例20〜22に記述されている。
【０１１２】この二番目のサブユニット（または、溶液
中で集合されうるポリマーユニット）の担体へのカップ
リングの後、すべての未反応のリンカー求核基は、p−
ニトロフェニル酢酸塩のような適当なキャッピング試薬
の付加により、キャップされる。その後、担体は洗浄さ
れ濾過される。このN1末端サブユニット上の保護基は、
典型的には酸処理により除去される。中和の後、この担
体は、次いで、遊離のN2バックボーン部分で活性化され
る次の配列中のサブユニット（またはポリマーユニッ
ト）の過剰量との反応に供される。活性化された過剰の
サブユニットにより、鎖を伸長されている多数の担体結
合サブユニットの数が最大になる。すなわち、この固体
担体の集合方法の一つの特徴は、各サブユニット付加段
階において、高いカップリング効率が必要なところにあ
る。付加され活性化されたサブユニットの濃度は、この
効率を最大にするように選択される。鎖の伸長は、各サ
ブユニットの付加の後、不足配列のキャッピングととも
に、所望の長さおよび配列のポリマーが得られるまで続
けられる。この一般的な方法は、14サブユニットの炭酸
塩が連結されたポリマーの調製に対し実施例20に、19サ
ブユニットのカルバミン酸塩が連結されたポリマーの合
成に対し実施例21に、そして19サブユニットのアミドが
連結されたポリマーの集合に対して実施例22に示されて
いる。
【０１１３】この最後の配列中のサブユニットの付加の
後、このポリマーは、末端のN1基にカップリングされて
いる適当な荷電または非荷電の基とともにキャップされ
てもよい。もしこのバックボーンの集合が非荷電のアキ
ラルな連鎖ばかりで行われるなら、このキャッピング試
薬は、好ましくはポリマーに末端の電荷を与える荷電さ
れた一群である。ポリマーのキャッピングの後、このポ
リマーは、たとえば水酸化アンモニウムのような求核剤
を用いた処理により切り離される。そして、このポリマ
ーは、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーにより精
製される。この集められ精製されたポリマーは、以下に
考察される方法により、固体担体に付加される。
【０１１４】上記に論じされたポリマー設計の原則は、
あらかじめ集められた２量体ユニットからの溶液中の合
成に関し実施例18に、種々の非荷電のアキラルな連鎖の
調製に関し実施例20〜23に、そして、交互に荷電したタ
イプのポリマーの調製に関し実施例24に例示されてい
る。
【０１１５】VII．診断試薬 Ａ．固体担体試薬 本発明の試薬は、上記物質から、固体担体への多数の結
合ポリマーのカップリングにより形成される。他方、こ
のポリマーは、カルバミン酸塩で連結されたポリマーに
関し上記に記述のように、段階的形式またはブロック形
式で、担体上にて合成されてもよい。このポリマーは、
担体に直接カップルされても良い。（または担体上に直
接形成されてもよい。）例えば、このポリマーは、ポリ
マー上のOH末端基を介して、活性化したアガロース、セ
ルロースまたはその類似物のような固体担体上のOH反応
性基にカップリングされてもよい。しかしながら、直接
のカップリングは、しばしば、この担体に近いサブユニ
ットを担体に近すぎる所におくため、この分析物とこの
近接したサブユニット認識部分との間の相補的な塩基の
結合ができない。従って、このポリマー分子は、好まし
くは、スペーサーアームを介して、この固体担体にそれ
ぞれ連結される。このスペーサーアームは、このポリマ
ーと分析物の標的配列との間の結合が実質的に妨げられ
ないように、この担体の表面領域からこのポリマーに距
離をおくべく適合される。
【０１１６】このスペーサーアームは、好ましくは、少
なくとも６原子の全体鎖長を有する分枝していない鎖で
ある。そして、このスペーサーアームは、１つの末端に
は担体との結合のために、また他の末端にはポリマーと
の結合のために、適当な反応性末端基を有する。種々の
タイプのスペーサーアーム、特に、種々の長さと親水性
の炭素を含む鎖は、スペーサーアームのカップリング反
応に使われる反応性基のように公知である。下記の実施
例25は、アミノヘキシルスペーサーアームの合成、その
メチルホスホネート／ホスホジエステル混合物ポリマー
の5'末端への結合、および固体担体へのカップリングを
記述している。下記の実施例26は、カルバミン酸塩で連
結されたポリマーを有する診断試薬を形成する際の使用
に対し、多数の表面結合された直鎖スペーサーアームを
有するポリマー担体の調製について詳述する。実施例26
の方法は、第10図に例示される。この図に示される担体
は、アミノメチル化したポリスチレンであり、これは無
水コハク酸と最初に反応に供されてカルボキシル化され
た誘導体を形成する。この担体のジ（スクシンイミド）
カーボネートによる活性化および 6−アミノヘキサノー
ルとの反応により、示したような13原子の末端ヒドロキ
シルスペーサーアームが生じる。
【０１１７】より好ましい固体担体には、アガロース、
セルロース、ニトロセルロース、ラテックス、ポリスチ
レンおよび他の市販の細長い担体物質または粒子状ビー
ズの担体物質（これは、表面に反応性の基または活性化
され得る基を有する）が含まれる。これらの基は、特に
ポリマーと結合するスペーサーアームを介して、ポリマ
ー分子と効果的にカップリング可能である。この担体の
表面にカップリングされるポリマーの濃度は、下記に記
述のように、この診断方法において、適当なサンプル容
量の検定材料が担体と混合されるとき、分析物分子に対
しポリマー分子を10〜1000倍モル過剰になるように選択
するのが好ましい。実施例25からのアミノヘキシルスペ
ーサーアームを介して、標的と結合したポリマーをアガ
ロースビーズとカップリングする方法は、同じ実施例中
に記述されている。
【０１１８】Ｂ．レポーター 本発明の診断システムでのレポーターは、２つの部分か
ら構成される：これは、1)このレポーターが、診断試薬
上にある。より荷電の少ない結合ポリマーに結合しない
という条件下で、完全に荷電したポリヌクレオチドに静
電気的に結合するべく設計されたポリカチオン性部分ま
たはテイル、および2)レポーターの存在が検出され得る
シグナルを生じるべく適合されたこのテイルに結合され
ている１つまたはそれ以上のレポーター基である。ポリ
カチオン性とは、この用語がここで用いられるとき、２
つまたはそれ以上の適当な間隔を持った複数のカチオン
性基を有するテイルを包含する。
【０１１９】このカチオン性テイルは、好ましくは、少
なくとも２つの正に荷電された基を供給するように構成
される。これらの基は、ポリヌクレオチド分析物の糖−
リン酸塩バックボーン上の隣接した負電荷に結合するよ
うに間隔をあけて配置されている。同時に、このカチオ
ン性テイル上の隣接する電荷の間隔は、このレポーター
の電荷の半分以上の電荷を含む試薬ポリマーバックボー
ンとの静電気的な結合がエネルギー的に好ましくないよ
うな間隔である。例えば、非荷電のリン酸塩連鎖と荷電
されたリン酸連鎖とを交互に有する上記に記述のポリマ
ーでは、このポリマーバックボーン中の隣接する負電荷
間の距離は、ポリヌクレオチドバックボーン中の距離の
およそ２倍である。それゆえ、このカチオン性テイルの
荷電された基の実質的に全てと、このポリマーバックボ
ーンの交互に間隔をあけている負電荷との間で結合すれ
ば、このポリマーバックボーンのエネルギー的に好まし
くないゆがみを必要とするだろう。このポリマーバック
ボーンが荷電された／非荷電の立体配置を交互に有する
場合、このカチオン性テイルの隣接する正電荷の間隔
は、このポリヌクレオチドバックボーンとこのレポータ
ーテイルとの間の強い静電気的な結合を供給する最小の
間隔にまで狭められるべきだと評価され得る。もちろ
ん、この試薬ポリマーが２つのサブユニット連鎖あたり
１つ以下の負電荷密度を有するか、またはこの試薬ポリ
マーが非荷電のバックボーンを有する場合、このレポー
ター内の電荷の間隔に関する必要条件はほとんど重要で
なくなる。このポリマーバックボーンが、荷電された／
非荷電の立体配置を交互に有する。例えば、荷電された
ホスホジエステル連鎖と非荷電のメチルホスホネート連
鎖とが交互になった立体配置を有するとき、このカチオ
ン性レポーターは、完全に荷電したポリヌクレオチドと
ポリマーとの間には、そのポリマーのカチオン性部分が
この非荷電の連鎖（例えばメチルホスホネート連鎖の二
重結合した酸素）と水素結合ができない場合、最も効果
的に識別されうることも注目される。この理由のため
に、このようなレポーター中のカチオン性基に４級アン
モニウムイオンを用いることが、一般的に有利である。
【０１２０】このレポーターテイル内のカチオン性部分
の数は、レポーターが試薬ポリマーバックボーンに結合
しない結合条件下において、レポーターがポリヌクレオ
チド分析物に結合するのに要する全静電気引力に従っ
て、２個から８個またはそれ以上まで変化してもよい。
酵素のような比較的大きなレポーター基を有するレポー
ターに関しては、このレポーターテイルを分析物バック
ボーンに付加させるのに、多くの静電気的結合が必要と
されるかも知れない。間隔をあけた多数のカチオン性部
分を有するレポーターテイルは、特に、次の試薬ととも
に用いるのに適している。この試薬は、そのポリマーバ
ックボーンが荷電されずそれゆえこのテイルと静電気的
な結合を形成し得ない。本発明での使用に適するカチオ
ン性テイルの構成方法は、第11〜13図に概説されてい
る。まず最初に第11図に関しては、 N−メチルアミノ酸
がジ−t−ブチルジカーボネート (BOC)で Nを保護さ
れ、カルボニルジイミダゾールで活性化される。次い
で、これはアミド連鎖を介してジメチルアミドにカップ
ルされる。保護をはずした後、このアミドは、 Nを保護
されカルボニルジイミダゾールで活性化された上記から
のアミノ酸との反応に供され、第11図の中央に示される
ジアミド化合物が形成される。この保護基をはずす反応
および Nを保護されジイミダゾールで活性化されたアミ
ノ酸との反応は、所望の長さのポリアミドが形成される
までくり返される。この合成反応の詳細は、実施例28〜
30中に説明される。
【０１２１】レポーター基は、典型的には、このポリカ
チオン中の第一アミン基に極めて容易に付加される。第
11図の化合物の二級アミン末端に一級アミンを付加させ
るには、ある適当な方法に従って、アミノ酸、例えば 4
−アミノ酪酸が、第12図に例示のように BOCで保護さ
れ、ジイミダゾールで活性化され、そして保護をはずし
たポリアミンとの反応に供される。その結果得られる B
OCで保護された化合物は、次いで、この BOC基を除くた
めトリフルオロ酢酸で処理された後、ボラン−テトラヒ
ドロフランとの反応によって還元される。これらの方法
は、実施例31〜32に記述されている。
【０１２２】第13図は、上記で合成されるようなポリア
ミンのポリ４級アンモニウム塩への転化に対する反応ス
キームを示す。この方法には、末端のアミンの保護とそ
れに続くヨウ化メチルとの反応によるポリ４級アンモニ
ウム塩の形成、およびトリフルオロ酢酸による脱保護が
含まれる。以下の実施例33にはこの方法の詳細を示す。
【０１２３】このレポーター中の１つまたはそれ以上の
レポーター基は、このレポーターがポリヌクレオチドバ
ックボーンに結合されるとき、またはこのレポーターが
分析物から溶出された後のいずれかにおいて、1)容易に
カチオン性テイルに付加され、そして2)容易に検出され
るシグナルを発生し得るべきである。発色団（ニトロア
ニリンまたは他の強く吸着する色素）、および螢光団
（ダンシルベースまたはローダミンベースの螢光分子）
を含む小さなレポーター基は、適しており、光度計によ
りまたは色素の場合は視覚検査によって容易に検出でき
るという有利な点を有する。放射性同位体のレポーター
基は診断の感度に有利性を供給するかもしれない。しか
し、レポーターの検出はより複雑で高価になるだろう。
ニトロキシドスピンラベルのような安定な常磁性分子も
また使用されうる。このレポーターのポリヌクレオチド
への結合は、固定化された常磁性種の電子スピン共鳴
(esr)の吸着線特性の広がりによって検出される。
【０１２４】適当なレポーター基のもう一つのクラスに
は、リガンド分子、および好ましくは小さな抗原分子が
含まれる。この抗原分子は、抗リガンド分子に高い親和
性で特異的に結合し得る。模範的なリガンド／抗リガン
ド対には、抗原／抗体、レクチン／炭水化物、およびビ
オチン／アビジンが含まれる。この抗リガンド分子は、
シグナルを生成する結合共役物の一部であり、この共役
物はまた、発色団、螢光団、または酵素のようなシグナ
ル生成基を含む。このシグナル生成基により、リガンド
／抗リガンドの結合が起こるとき、リガンド基の存在を
検出され得る。このレポーターは、特に、上記で言及さ
れるように、レポーターテイルが２つ以上のカチオン性
基を有する場合には、酵素レポーター部分を有していて
も良い。酵素の代表的なクラスには、ルシフェラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼお
よびカタラーゼに代表される酸化還元酵素、種々のホス
ファターゼに代表される加水分解酵素、β−ガラクトシ
ダーゼ、ペプチダーゼおよびリアーゼのようなグリコシ
ル加水分解酵素がある。
【０１２５】１つまたは複数のレポーター基は、典型的
には、公知のカップリング方法に従って、ポリカチオン
性テイルのアミン、好ましくは一級アミンにカップリン
グされる。第15図に例示されるより好ましい方法では、
ポリアミンは、 4−フルオロ−３−ニトロフェニルアジ
ドのような適当な二官能性カップリング試薬との反応に
供され、次いで、酵素のようなレポーター基とカップル
される。アミン、カルボキシル基、OH基およびサルヒド
ラル基のような反応性のレポーター基にアミン類をカッ
プリングさせるための種々の二官能性試薬がよく知られ
ている。アルカリホスファターゼレポーター基とテトラ
カチオン性レポーターを形成するための詳細な方法は、
実施例38に示される。第15図に例示のもう一つのより好
ましい方法では、ビス− 3,3'−アミノプロピルメチル
アミンと、アミンと反応性のダンシル基とを反応させる
ことにより、レポーターが調製される。この図中の反応
スキームは、このテイルにレポーターをカップリングす
る前または後に、どのようにしてこのレポーターテイル
のアミノ部分が完全にアルキル化され得るかも示してい
る。この方法の詳細は実施例34に示される。
【０１２６】VIII．診断方法 この節では、ポリヌクレオチド分析物の検出に関して上
記に記述される診断システムの使用を記述する。この分
析物は、メッセンジャー− RNA（mRNA）、リボゾーマル
RNA（rRNA）、または一本鎖 RNAまたは DNAウイルス性
ゲノムのような一本鎖の形で通常存在する分析物か；ま
たは二本鎖ウイルス性 RNA、 RNA／DNAウイルス性複製
中間体、およびウイルス、細菌、真核細胞から誘導され
るような二重 DNAのような二本鎖または重複した形で生
理的条件下にて存在する分析物である。試薬ポリマーが
標的化される分析物ポリヌクレオチド中の標的配列を選
択する際に用いられる考察および原理は、第Ｉ節で考察
される。
【０１２７】この診断を行う際、分析物とされるサンプ
ルが、典型的には、通常の臨床のサンプルを採取する技
術により、集められる。この分析物がウイルスまたは細
菌由来のポリヌクレオチドの場合は、より長い非分析細
胞物質を除くのが、最初のサンプルの処理としてしばし
ば有用である。例えば、ウイルスの病原の存在を検定す
る際に、細菌物質を除くために 0.2ミクロンの穴のサイ
ズの膜でサンプルを濾過することがしばしば有用であ
る。細菌の病原の存在を検定する場合、サンプル中に存
在するであろう真核細胞をも除去するため、1.0ミクロ
ンの穴のサイズの膜でサンプルを濾過することがしばし
ば有用である。典型的なサンプル調製法は、ウイルス病
原の診断に関して実施例36および37に記述されている。
【０１２８】この試薬ポリマーに結合するのに適した形
でこのサンプル分析物材料を調製するために、このサン
プルは、生物の核酸が遊離するよう処理されるべきであ
る。細胞膜を欠いた生物には、界面活性剤および／また
はカオトロピック性塩が一般に適当である。細胞膜を有
する生物には、アルカリ（分析物が DNAのとき）または
適当な酵素（例えば、多くの細菌に対するリゾチーム）
が使用可能である。必要に応じて、この遊離の核酸は、
カオトロピック性塩（トリクロロ酢酸ナトリウム）を加
え、続いてエタノールで選択的に核酸を沈澱させること
により、タンパクおよび他の混入物から簡便に分離され
得る。
【０１２９】ウイルス、または細胞成分から核酸を遊離
および単離する一つの有効な方法は、Anal Biochem (19
83) 133 : 79で、本発明者により記述されている。実施
例36に詳述の方法には、サンプルを４M トリクロロ酢
酸、100mM EDTA で懸濁してタンパク性物質を変性およ
び可溶化すること、次いで、等容量の冷エタノールを加
えることにより、遊離の核酸物質を塩溶液中に沈澱させ
ること、が包含される。ポリウリジル酸のような担体ポ
リヌクレオチドが、核酸の沈澱を容易にするために加え
られてもよい。短時間の冷却の後、この沈澱された核酸
は遠心分離により、ペレット化される。そして、この核
酸は、塩を除去するべく、洗浄される。
【０１３０】この核酸の分画は、選択された塩濃度であ
り二価カチオン性のキレート剤を含むアニーリング緩衝
液に再懸濁される。約 100mMまたはそれ以下の一価塩
（例えば NaCl）および約10mMのキレート剤（例えば ED
TA）を含むアニーリング緩衝液が、一般に、二本鎖 DNA
の形で正常に存在するポリヌクレオチドの結合に適して
いる。 100mMより著しく低い塩濃度は、正確に達成する
のが困難である。より高い塩濃度、特に約0.5 M 以上の
塩濃度では、相補的ポリヌクレオチド鎖間で二本鎖を形
成させる傾向にあり、この分析物ポリヌクレオチドとの
結合に対し試薬ポリマーと相補鎖との間で競合が生じ
る。相補的ポリヌクレオチド間での二本鎖の形成は、ま
たキレート剤により阻害される。このキレート剤は、ア
ニーリング混合液中のMg2+イオンおよびCa2+イオンを引
き離すように作用する。この分析物がRNAの場合、解離
された DNAと RNA分析物との間の試薬ポリマーへの結合
に対する競合を避けるため、サンプルをDNアーゼで処理
することが有利であり得る。
【０１３１】このアニーリング反応は、反応中に形成さ
れる分析物／ポリマー二重構造の融解温度より約５〜15
℃低い温度で行われるのが好ましい。このアニーリング
温度は、分析物標的配列とこのポリマーとの間の正確な
塩基−配列対合に好ましい。上記に示されるごとく、こ
の分析物ポリヌクレオチドが二本鎖構造としてその相補
鎖とともに正常に存在する場合には、その反応温度は、
分析物と試薬ポリマーの所望の対合に競合する分析物と
その相補ポリヌクレオチドとの望ましくない対合を避け
るため、本来のポリヌクレオチド二本鎖の融解温度より
高い反応温度が好ましい。約 100mMの一価カチオン濃度
のアニーリング緩衝液濃度においては、24〜60℃の範囲
のアニーリング温度が一般に適している。以前に注目し
たように、この正確に最適なアニーリング温度は、結合
するポリマーの長さ、その認識部分のA + T のC + G に
対する比、および部分的に荷電されたポリマーではこの
塩濃度の関数である。
【０１３２】上記に論じたように、このポリマーの構造
的特徴に依存して、この分析物／ポリマー二重構造の融
解温度は、100mMの一価塩のようなアニーリング緩衝液
中では、例えば37℃のような好ましい反応温度より実質
的に高くなり得る。このような場合では、ホルムアミド
のような変性剤を加えることにより、ポリマー／分析物
二重構造の融解温度を所望の温度まで低くすることが便
利であり得る。所望の融解温度を達成するのに必要なホ
ルムアミドの量を決定するため、分析物標的配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドであろう標的配列とポリマー
との融解曲線が、常法に従って、多くの異なる変性剤濃
度において決定される。ホルムアミドを添加する場合に
は、典型的には、約５〜50％の範囲の変性剤容量で行わ
れる。この決定から、所望の反応温度より約５〜15℃高
い融解温度を達成するために、アニーリング緩衝液中に
必要なホルムアミドの量が決定される。
【０１３３】この反応緩衝液中の分析物サンプルは、好
ましくは、この試薬の結合ポリマーが、検定混合液中の
分析物分子のモル濃度の10〜1000倍過剰に存在する条件
下にて、診断試薬に加えられる。このポリマー／ポリヌ
クレオチドのアニーリング反応は、選択された反応温度
で、ポリマー／分析物のアニーリングが実質的に充分に
行われる期間、典型的には10分間と３時間との間で行わ
れる。この固体担体試薬は、結合していない物質を除く
ため、一回またはそれ以上洗浄される。
【０１３４】次いで、試薬に結合した分析物の完全に荷
電したバックボーンにレポーター分子を結合させるため
のあらかじめ選択された条件下で、レポーターがこの洗
浄された試薬に加えられる。このレポーターのポリヌク
レオチドバックボーンへの選択された結合を可能にする
このレポーターの空間的／荷電の特徴は、上記で論じら
れている。この試薬ポリマーがある負の荷電のバックボ
ーンを有する場合、一つの重要な要因は、結合媒質の塩
濃度である。非常に低い塩濃度では、静電気的な相互作
用はより強い。それは、試薬ポリマーの広く間隔をあけ
たアニオン性基へのレポーターの望ましくない結合を生
じえる。反対に、非常に高い塩濃度では、静電気的な荷
電の遮蔽が、分析物バックボーンの狭い間隔で存在する
アニオン性基とのこのレポーターの所望の結合を妨害し
得る。この結合媒質の最適塩濃度は、完全に荷電された
分析物バックボーンへのこのレポーターの十分に静電気
的な結合を可能にする最大または最大に近い一価塩の濃
度である。この最適塩濃度は、平衡透析法によって決定
され得る。この平衡透析法においては、拡散可能なレポ
ーターの拡散不可能なポリヌクレオチドへの結合が、こ
の懸濁した媒質の塩濃度の関数として測定される。この
分析物へのレポーターの結合のための最適イオン強度の
条件は、また、低い塩濃度条件での固定化されたポリヌ
クレオチドへのレポーターの結合、および塩勾配による
レポーターの溶出によって容易に決定され得る。
【０１３５】この診断システムにおける結合成分は、本
発明の診断方法で機能するように、以下の第16図に示さ
れる。ここでＳは、鋸歯状の線で示されるスペーサーア
ームを介して、多くの結合ポリマーをその表面に結合さ
せた固体担体である。この“ｍ”と“ｐ”のサブユニッ
ト連鎖は、それぞれ、非荷電で、立体異性的に規定され
たメチルホスホネート連鎖および荷電されたホスホ酸ジ
エステル連鎖を示している。このレポーターは二価のカ
チオン性テイルおよびＲレポーター基を有する。例示の
目的のため、各ポリマーは、実施例21で記述されるよう
に、Herpes simplexウイルス、タイプＩおよびタイプ二
中の選択した16塩基標的配列に相補的な認識部分の配列
を有する。これらのポリマーのうちの一つの、Herpes s
implex分析物ポリヌクレオチド中の標的配列への塩基−
相補的な結合が示されている。
【０１３６】この図に示されるレポーターは、実施例34
からの二価のカチオン性レポーターである。各レポータ
ーは、隣接するホスホジエステル結合との静電引力を介
して、静電引力によってポリヌクレオチド中の一対の隣
接したホスホジエステル結合と結合するべく適合され
る。このレポーター分子はそれらの予期される結合コン
フィギュレーションで示される。ここでは、実質的にい
ずれのホスホジエステル連鎖も、レポーターのカチオン
と対合し、このレポーター分子はヘッドとヘッド、テイ
ルとテイルで並んでいる。結合しているレポーター分子
の最大密度を推測すると、Ｎ塩基分析物は、約 N/2レポ
ーター分子まで結合し得ると評価できる。さらに一般的
には、分析物のサイズおよびレポーターあたりのレポー
ター部分とカチオン性基との両方の相対的な数に依存し
て、この検定方法により、数十万またはそれ以上のレポ
ーター分子の試薬結合分析物各分子への結合が容易に生
じる。それゆえ、分析物の検出が、一般に、分析物分子
あたり１つか数個のプローブに基づく場合、それぞれの
プローブが、典型的には約 100のレポーター部分を含む
ので、既存のタイプのポリヌクレオチドに基づく診断よ
り２〜４桁検出の感度が高い。
【０１３７】このレポーター溶液との反応（典型的には
室温で１〜２分）の後、この試薬は、結合していないレ
ポーターを除くために洗浄される。次いで、結合したレ
ポーターに対し直接評価されうる。この試薬と結合した
レポーターの量の決定に際し、特に螢光レポーター基ま
たは発色レポーター基の場合には、このレポーターを高
塩濃度の溶液を用いてこの試薬から溶出し、次いで溶離
液をレポーターについて評価するのが望ましいかもしれ
ない。酵素のような、他のタイプのレポーター基では、
この試薬に結合したレポーターまたは、試薬から溶出さ
れたレポーターにより容易に評価され得る。上記に言及
されるような種々の異なるレポーター基の検出方法はよ
く知られている。実施例36および37は、それぞれ螢光レ
ポーターおよび酵素レポーターの検出に基づく診断方法
を例示している。
【０１３８】前述のことから、本発明によりいかに種々
の目的および特徴が達成されるか理解され得る。この診
断試薬は、試薬ポリマーの設計により、特有の塩基対配
列を有するどのようなリボポリヌクレオチドまたはデオ
キシリボポリヌクレオチドの検出に対しても、容易に適
合され得る。さらに、この試薬ポリマーは、適した温度
で、高い配列特異性をもった一定の標的配列と結合する
ように適合させ得る。二本鎖ポリヌクレオチドの検出の
ため、この反応は、低い塩濃度条件および／または変性
条件（これは、試薬に結合する分析物に対する相補的な
ポリヌクレオチド鎖との競合を妨げる）下で実行されう
る。それゆえ、この診断システムは、従来技術の固体担
体、シングルプローブポリヌクレオチド診断システムの
有利な点を提供する。この有利な点は、相補鎖との競合
は削除されるが、この診断システムでは固体担体への一
本鎖テスト核酸の付加に際し、かなり困難なステップが
回避されることである。同時に、このシステムは、以前
に記述した二重のプローブポリヌクレオチド診断システ
ムに関連した問題を回避する。この問題は、分析物の検
出は、偽一次の速度論に基づいており、１つの配列特異
的な結合ポリマーのみが必要である点にある。
【０１３９】本発明のもう一つの重要な特徴によれば、
この分析物へのレポーターの結合は、既存のタイプのポ
リヌクレオチド診断とのような、配列特異的な結合よ
り、むしろ配列には無関係の静電気的相互作用に基づい
ている。従って、このレポーター自体は比較的安価に調
製され得、分析物とすぐにそして広範囲の条件下で反応
し得る。そして、最も重要なことには、このレポーター
は、この分析物中のポリヌクレオチドサブユニットあた
り、多数のレポーター部分までの範囲の密度で、この分
析物に結合し得る。従って、この診断システムの感度
は、既存のテストより、２〜４桁またはそれ以上のオー
ダーのちがいで高くなり得る。既存のテストは、分析物
分子あたり限られた数のレポーター部分を含む、一つま
たは少数のプローブの検出に依存しているからである。
【０１４０】以下の実施例は、本発明の特定の実施態様
に従って構成される検定システムの調製および使用につ
いて例示する。しかしこれらの実施例により、決して本
発明の範囲は限定されない。
【０１４１】
【実施例】
（実施例１）リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌク
レオシドの調製 次のヌクレオシドは、Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO から得られる：デオキシウリジン、デオキシグアノ
シン、チミジン、デオキシアデノシン、デオキシシチジ
ン、 5−ブロモデオキシウリジン、デオキシイノシン、
2,6−ジアミノ−９−(2−デオキシ−β−D−エリスロ
−ペントフラノシル)9H−プリン(2,6−ジアミノプリン
デオキシリボシド）、ウリジン、グアノシン、 5−メチ
ルウリジン、アデノシン、シチジン、 5−ブロモウリジ
ン、イノシン。
【０１４２】2,6−ジアミノ−9−(β−D−リボフラノシ
ル)−9H−プリン(2,6−ジアミノプリンリボシド）は、P
faltz and Bauer, Inc., Division of Aceto Chemical
Co.,Inc., Waterbury, CTから得られる。
【０１４３】次のヌクレオシドは、次に示す文献の方法
で調製される：1−(2−デオキシ−β−D−エリスロ−ペ
ントフラノシル−２−ピリミジノン(2−ヒドロキシピリ
ミジンデオキシリボシド）は、John Wiley and Sons, I
nc.の Nucleic Acid Chemisty ; L. B. Townsend and
R. S. Tipson, eds (1976)に記 載された P. Kohler,
E. Volz, U. Sequinおよび C. Tammの方法により調製さ
れる。
【０１４４】1−(2−デオキシ−β−D−エリスロ−ペン
トフラノシル)−4−メトキシ−2−ピリミジノンは、次
の方法で調製される：1−(3',5'−ジ−Ｏ−ベンゾイル
−２−デオキシ−β−D−エリスロ−ペントフラノシル
−4−メチルチオ−2−ピリミジノン〔Collection of Cz
echoslov Chem Comm (1977) 42 : 2246 の D. Cechおよ
び A. Holyの方法により調製〕を、 0.2M ナトリウムメ
トキシド溶液 200mLで処理する。処理後の溶液を一夜室
温に放置する。この溶液を次に、ダウエックス50×８
（Dowex 50×８ ; H+ 型）で中和し、濾過する。残渣を
水 100mLに溶解し、エーテル2.50mLで抽出し、水相をエ
バポレートする。その残渣はアモルファス状の物質であ
り、直接次の反応に用いられる。
【０１４５】2−アミノ−9−(2−デオキシ−β−D−エ
リスロ−ペントフラノシル)−1,9−ジヒドロ−6H−プリ
ン−6−チオン(デオキシチオグアノシン）は、J Med Ch
em (1963) 6 : 684 の R. H. Iwamoto, E. M. Acton,お
よび L. Goodman の方法により調製される。
【０１４６】1−(β−D−リボフラノシル)−2−ピリミ
ジノン(2−ヒドロキシピリミジンリボシド）は、J Org
Chem (1974) 39 : 3668 の U. Niedballa および H. Vo
rbruggenの方法により調製される。
【０１４７】1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシ
ル)−4−メトキシ−2−ピリミジノン(2−ヒドロキシピ
リミジンデオキシリボシド）は、Collection of Czecho
slov Chem Comm (1973) 38 : 1381 の R. Wightmanおよ
び D. Holyの方法により調製される。
【０１４８】2−アミノ−9−(β−D−リボフラノシル)
−1,6−ジヒドロ−6H−プリン−6−チオン（チオグアノ
シン）は、J Amer Chem Soc (1958) 80 : 1669 の J.
J. Fox, I. Wempen,A. Hamptonおよび I. L. Doerrの方
法で調製される。
【０１４９】（実施例２）塩基保護されたヌクレオチド
の調製 ジメトキシトリチルクロリド、 N−ベンゾイルアデノシ
ン、 N−ベンゾイル−2'−デオキシアデノシン、 N−ベ
ンゾイルシチジン、 N−ベンゾイル−2'−デオキシシチ
ジンおよび N−イソブチリル−2'−デオキシグアノシン
は、Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri から得ら
れる。 9−フルオレニルメトキシカルボニルクロリド
（FMOCクロリド）、トリメチルクロロシラン、無水イソ
酪酸、 4−ニトロベンゾイルクロリド、および有機溶媒
のすべて（反応およびクロマトグラフィー用）は、Aldr
ich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsinから得られ
る。シリカゲルは、EM Science, Cherry Hill, New Jer
sey から得られる。
【０１５０】2.1 グアノシン N−2 9−フルオレニルメトキシカルボニル誘導体は、
次に示すヌクレオシドのアミノ基の保護の一般的な手法
により調製される：グアノシン（１mmol）をピリジン
（５mL）に懸濁させ、トリメチルクロロシラン（５mmo
l）で処理する。この溶液を15分間攪拌した後、9−フル
オレニルメトキシカルボニルクロリド（５mmol）を加
え、この溶液を室温に３時間保持する。反応液を氷浴中
で冷却し、水（１mL）を加える。５分間攪拌後、濃アン
モニア（１mL）を加え、反応液を15分間攪拌する。この
溶液をほぼ乾固状態近くにまでエバポレートし、残渣を
クロロホルム（10mL）に溶解させる。この溶液を重炭酸
ナトリウム溶液（５mL、10％）で洗浄し、硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、エバポレートする。残渣をトルエンととも
に数回エバポレートし、生成物をメチレンクロライド中
メタノール勾配（０〜50％）を用いてシリカゲルのクロ
マトグラフィーにかける。
【０１５１】N−イソブチリルグアノシンは、J Amer Ch
em Soc (1969) 91 : 3356 の Letsingerおよび Miller
の方法により調製される。
【０１５２】N−アセチルグアノシンは、J Chem Soc Pe
rkin Trans (1972)1 : 2937の C.B. Reeseおよび R. S.
Saffhill の方法で得られる。
【０１５３】2.2 デオキシグアノシン N−2 9−フルオレニルメトキシカルボニル誘導体は、A
ctaChem Scand (1983) B 37 : 263の J. Heikkla およ
び J. Chat-topadhyayaの方法で調製される。
【０１５４】N−2 アセチル誘導体は、 Research Plus
Inc., Bayonne, N. J. から得られる。
【０１５５】2.3 デオキシアデノシン N−6 2−(4−ニトロフェニル）エトキシカルボニル誘
導体は、TetrahedronLett (1983) 24 : 3583 の F. Him
mels-bachおよび W. Pfleidererの方法により調製され
る。
【０１５６】N−6 4−ニトロベンゾイル−2'−デオキ
シアデノシンは、FMOCクロリドの代わりに 4−ニトロベ
ンゾイルクロリドを用いたこと以外は上記FMOC−グアノ
シンの調製法により調製される。
【０１５７】N−6 2−(フェニルスルホニル）エトキシ
カルボニル誘導体は、アシル化剤として 2−(フェニル
スルホニル)−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron
Lett (1981) 22 : 3667 の N. Balgobin, S. Josephso
nおよび B. Chattopadhyayaの方法により得られる〕を
用い、溶媒として N−メチルイミダゾールまたはピリジ
ンを用いたこと以外は、FMOCグアノシンの調製法により
調製される。
【０１５８】2.4 アデノシン N−6 2−(4−ニトロフェニル)−エトキシカルボニル誘
導体は、TetrahedronLett (1983) 24 : 3583 の F. Him
mels-bachおよび W. Pfleidererの方法により調製され
る。
【０１５９】N−6 4−ニトロベンゾイルアデノシン
は、FMOCクロリドの代わりに 4−ニトロベンゾイルクロ
リドを用いたこと以外はFMOC−グアノシンの調製法によ
り調製される。
【０１６０】N−6 2−(フェニルスルホニル)エトキシ
カルボニル誘導体は、アシル化剤として 2−(フェニル
スルホニル)−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron
Lett(1981) 22 : 3667 の N. Balgobin, S. Josephson
および B. Chattopadhyayaの方法により得られる〕を用
い、溶媒として N−メチルイミダゾールまたはピリジン
を用いたこと以外は、FMOCグアノシンの調製法により調
製される。
【０１６１】2.5 デオキシシチジン N−4 2−(4−ニトロフェニル)−エトキシカルボニル誘
導体は、TetrahedronLett (1983) 24 : 3583 の F. Him
melsbachおよび W. Pfleidererの方法により調製され
る。
【０１６２】N−6 2−(フェニルスルホニル)エトキシ
カルボニル誘導体は、アシル化剤として 2−(フェニル
スルホニル)−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron
Lett(1981) 22 : 3667 の N. Balgobin, S. Josephson
および B. Chattopadhyayaの方法により得られる〕を用
い、溶媒として N−メチルイミダゾールまたはピリジン
を用いたこと以外は、FMOCグアノシンの調製法により調
製される。
【０１６３】2.6 シチジン N−4 2−(4−ニトロフェニル)−エトキシカルボニル誘
導体は、TetrahedronLett (1983) 24 : 3583 の F. Him
melsbachおよび W. Pfleidererの方法により調製され
る。
【０１６４】N−6 2−(フェニルスルホニル)エトキシ
カルボニル誘導体は、アシル化剤として 2−(フェニル
スルホニル)−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron
Lett(1981) 22 : 3667 の N. Balgobin, S. Josephson
および B. Chattopadhyayaの方法により得られる〕を用
い、溶媒として N−メチルイミダゾールまたはピリジン
を用いたこと以外は、FMOCグアノシンの調製法により調
製される。
【０１６５】2.7 2,6−ジアミノプリンリボシド 2,6−ジアミノプリンリボシドの N−2, N−6 ビス(9−
フルオレニルメトキシカルボニル）誘導体は、一般的な
手法で調製される。
【０１６６】N−2, N−6−ビス(イソブチリル）誘導体
は、通常の手法により調製される。 2.8 2,6−ジアミノプリン−2'−デオキシリボシド 2,6−ジアミノプリン−2'−デオキシリボシドのビス N
−2, N−6−(9−フルオレニルメトキシカルボニル）誘
導体は、通常の手法により調製される。
【０１６７】2.9 チオグアノシン チオグアノシンの N−2 9−フルオレニルメトキシカル
ボニル誘導体は通常の手法により調製される。
【０１６８】2.10 2'−デオキシチオグアノシン 2'−デオキシチオグアノシンの N−2 9−フルオレニル
メトキシカルボニル誘導体は、通常の手法により調製さ
れる。 （実施例３）5'−アミノ−2',5−ジデオキシリボヌクレ
オシド サブユニットの調製 四臭化炭素、ナトリウムアジド、p−トルエンスルホニ
ルクロリド（トシルクロリド）、トリフェニルホスフィ
ンおよび10％パラジウム−炭は、Aldrich ChemCo.で購
入される。リチウムアジドは、Kodak Laboratory and S
pecialty Chemicalsで得られる。
【０１６９】3.1 一般的手法 この実施例で用いられるヌクレオシドは、チミジン、N6
−ベンゾイル−2'−デオキシアデノシン、N4−ベンゾイ
ル−2'−デオキシシトジン、および2'−デオキシイノシ
ン、 2−ヒドロキシ−ピリミジン−2'−デオキシリボシ
ドおよび 2,6−ジアミノプリン−2'−デオキシリボシド
のN2−N6−ビスイソブチリル誘導体（実施例１参照）で
ある。所望の乾燥したヌクレオシド（１mmol）を計量
し、トリフェニルホスフィン（1.01mmol）およびリチウ
ムアジド（５mmol）を入れた反応容器に添加する。固形
物を DMFに懸濁させた後、四臭化炭素（ 1.0mmol）を容
器に加える。この溶液を室温で24時間攪拌する。反応を
メタノールで止めた後、この溶液をエバポレートして乾
固させる。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにか
け、メタノール／クロロホルム混合液で溶出すると、所
望の5'−アジド−2',5'−デオキシヌクレオシドが得ら
れる。
【０１７０】この5'−アジドヌクレオシド（１mmol）を
エタノールに溶解させる。触媒量の10％パラジウム−炭
の存在下、水素圧35psi で10時間にわたり水素化を行
う。この溶液を濾過し、減圧下でエバポレートすると粗
固形物が得られる。この固形分は適当な溶媒を加えてこ
ねることにより精製される。
【０１７１】3.2 5'−アジドウリジン誘導体 5−ブロモ−2'−デオキシウリジンの 5'−アジド誘導体
は、上記方法により調製される。5'−アジド−t−ブロ
モ−2'−デオキシウリジン（１mmol）は、トリフェニル
ホスフィン（ 1.5mmol）とピリジン中室温で２時間にわ
たり処理される。この反応容器に濃アンモニア（１mL）
を加える。14時間後、溶媒を真空下で除去する。残渣を
THFに溶解させ、この溶液をヘキサンに加える。沈澱物
を集め、この固形成分を適当な溶剤でこねると、5'−ア
ミノ−5−ブロモ−2'−デオキシウリジンが得られる。
【０１７２】3.5 5'−アジドグアノシン 5'−アミノ−2',5'−ジデオキシグアノシンの他の調製
法は、保護された2'−デオキシグアノシン（N−2−アセ
チルか N−2−FMOC誘導体で保護されている）（１mmo
l）をピリジン中トシルクロリド（ 1.3mmol）で０℃に
て一夜処理することである。この溶液をエバポレートし
て乾固し、残渣をクロロホルムに溶解させる。得られた
溶液を重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウ
ムで乾燥する。この溶液をエバポレートし、残渣をシリ
カゲルクロマトグラフィーにかけメタノール／クロロホ
ルム混合液で溶離する。得られたトシレート（１mmol）
は、DMF中ナトリウムアジド（６mmol）で80〜 100℃に
て数時間処理する。溶媒をロータリーエバポレーターで
除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけク
ロロホルム／メタノール混合溶媒で溶離する。このアジ
ドは、上記手法を用いて目的とするアミンに還元され
る。
【０１７３】2'−デオキシシチジン、2'−デオキシアデ
ノシン、2'−デオキシグアノシン、および 2,6−ジアミ
ノプリンデオキシリボシドの塩基窒素の保護基として
は、2'−デオキシシチジンおよび2'−デオキシアデノシ
ンに対しては 2−(フェニルスルホニル）エトキシカル
ボニル基が、そして2'−デオキシグアノシンおよび 2,6
−ジアミノプリンデオキシリボシドを保護するためには
9'−フルオレニルメトキシカルボニル（FMOC）基が、実
施例２に示されるように、使用される。
【０１７４】（実施例４）3'−アミノ−2',3'−ジデオ
キシリボヌクレオシド サブユニットの調製 チミジンを5'−O−アセチル−3'−アジド−2',3'−ジデ
オキシチミジンに変換し、これを J Org Chem (1978)
43 :3044の M. Imazawa および F. Ecksteinの方法によ
り3'−アジド−2'、3'−ジデオキシアデノシンおよび3'
−アジド−2',3'−ジデオキシグアノシンに変換する。
3'−アジドアデノシンの塩基部分は、ベンゾイル誘導体
または 2−(フェニルスルホニル)エトキシカルボニル誘
導体（実施例１に示す）として保護される。3'−アジド
グアノシンの N−2 は、アセチル誘導体またはFMOC誘導
体（実施例１参照）として保護される。これらの3'−ア
ジド基の3'−アミノ−2'−3'−ジデオキシリボヌクレオ
シドへの還元は実施例３に示されるようになされる。
【０１７５】（実施例５）リボヌクレオシドから誘導さ
れるモルホリン型サブユニットの調製 重ホウ酸アンモニウム、 m−過ヨウ素酸ナトリウム、ナ
トリウムシアノボロハイドライド、ウリジン、N4−ベン
ゾイルシチジン、およびN6−ベイゾイルアデノシンは、
Sigma Chemical Co. で得られる。N2−イソブチリルグ
アノシンは、Letsinger および Miller （J Amer Chem
Soc (1969) 91 : 3356 ）の一般的手法により調製され
る。 2−フェニル−2−プロパノールおよびビス（p−ニ
トロフェニル）カーボネートは、Aldrich Chemical Co.
で得られる。
【０１７６】ウリジンのモルフォリン誘導体は、ウリジ
ン１mmolと重ホウ酸アンモニウム、(NH4)2B2O7 ２mmol
とを水５mlに溶解させて調製される。氷浴下で攪拌し直
射日光を避けながら、m−過ヨウ素酸ナトリウム 1.2mmo
lを水５mlに溶解させた溶液を添加する。90分後に 1,2
−プロパンジオール 0.2mlを加え、室温で10分間攪拌を
続ける。その後、換気の充分なフードの中で充分に攪拌
しながらナトリウムシアノボロハイドライド0.25ｇを水
３mlに溶解した溶液を添加し、混合物を室温で４時間攪
拌する。次に、反応混合物を温水浴中真空下で濃縮して
オイル状とし、これを最小量のメタノールで再分散して
シリカゲルクロマトグラフィーカラム上に積層し、メタ
ノール／１％トリエチルアミンで溶離する。モルフォリ
ン型生成物はシャープなバンドでカラムから溶離され
る。この生成物は、もとのリボヌクレオシドおよびその
酸化生成物に比較してはるかにゆっくりと移動する。こ
のモルフォリン型生成物は、もとのリボヌクレオシドと
ほとんど同一のUVスペクトルを有する。しかし、マスス
ペクトルは、17ダルトンだけ低い（高速原子衝撃活性化
によるマススペクトル分析により決定）。
【０１７７】次に、生成物を 2−フェニルイソプロピル
フェニルカーボネートと反応させることによりモルフォ
リンの窒素を保護する。所望の活性カーボネートを調製
し、これを、Int J Peptide Protein Res (1974) 6 :
111 の Sandberg and Ragmarssonの方法に基本的に従
い、モルフォリン型サブユニットと反応させる。最終的
に、必要に応じて（サブユニットアセンブリーをポリマ
ーへ組み込む方法に依存する）、もとの5'に対応する位
置の水酸基は、次の方法により活性化され得る。その方
法とは、 N−保護化サブユニットを最小容量の乾燥ジメ
チルホルムアミドに溶解させ、ビス（ p−ニトロフェニ
ル）カーボネート２等量とトリエチルアミン、 N−メチ
ルイミダゾール、または N,N−ジメチルアミノピリジン
0.2等量とを加えることである。室温で３時間保持した
後、反応混合物を温浴中で真空下濃縮する。この濃厚な
シロップを少容量のジクロロメタンに再懸濁し、シリカ
ゲルカラム上に積層し、N,N−ジメチルアニリンを 0.2
容量％の割合で含有するジクロロメタン／エーテル（容
量比１：１）混合物で溶離する。この溶媒系において、
活性化生成物は、 p−ニトロフェノールおよびビス（ p
−ニトロフェニル）カーボネートよりも実質的にゆっく
りと移動するが、未反応の出発物質よりもはるかに速く
移動する。活性化された生成物は、アンモニアを噴霧す
ることによりシリカゲル TLCプレート上で簡単に目視観
察することができる。アンモニアの噴霧により、黄色の
ニトロフェノレートイオンが１〜２分間で現れる。
【０１７８】他のリボヌクレオシド（必要に応じて実施
例２のように塩基が保護されている）は、基本的には同
様の手法で、対応するモルフォリン型誘導体に変換され
る。ただし、最初の過ヨウ素酸塩による酸化の段階の前
の、保護されたリボヌクレオシドの溶解性に応じて、メ
タノールを適当量添加する必要がある。
【０１７９】モルフォリン型サブユニットがチオカーバ
メート結合を介して結合されるとき、通常の出発リボヌ
クレオシドに対する好適な塩基保護基は次のとおりであ
る：シチジンおよびアデノシンにはフェニルスルホニル
エトキシカルボニル基、およびグアノシンには 9−フル
オレニルメトキシカルボニル基。 （実施例６）5'−酢酸−2',5'−ジデオキシリボヌクレ
オシド サブユニットの調製 トリエチルアミン、ピリジン／三酸化イオウ錯体、 p−
ニトロフェノール、ジシクロヘキシルカルボジイミド、
および40％ジメチルアミン水溶液は Aldrichで得られ
る。
【０１８０】実施例12.1で調製される3'−O−tert−ブ
チルジメチルシリル−N−2−(フェニルスルホニル)エト
キシカルボニルアデノシン（１mmol）をメチレンクロリ
ドおよびジメチルスルホキシド（1/1 、v/v ；10mL）に
０℃で溶解させる。これに、トリエチルアミン（３mmo
l）およびピリジン／三酸化イオウ錯体（３mmol）を加
える。この混合液をこの温度で１時間攪拌し、水洗す
る。硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下でエバポレートす
る。残渣を乾燥ピリジン（10mL）に溶解させ、ベンジル
オキシカルボニルメチレントリフェニルホスホラン（
1.5mmol）と37℃で24時間処理する。この混合物を、次
に、減圧下でエバポレートして乾固し、残渣をメチレン
クロリドに溶解させ、希HCl でそして水で洗浄する。次
に、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で
留去する。残渣をクロロホルム中メタノール勾配（０〜
20％）を用いてシリカクロマトグラフィーにかける。
【０１８１】前段で得られる不飽和エステル（１mmol）
をシクロヘキサジエン（５mL）および10％パラジウム−
炭（100mg ）を含む酢酸エチル／エタノール（40mL、1/
1 、v/v）に溶解させ、この懸濁液を窒素気流下５〜24
時間にわたり激しく攪拌する。この混合物を濾過し、溶
媒を減圧で留去する。残渣をクロロホルム中メタノール
勾配（５〜50％）を用いてシリカゲルクロマトグラフィ
ーにかける。
【０１８２】前段で得られる酸の 0.2〜 0.5M 酢酸エチ
ル（またはメチレンクロライド）溶液に p−ニトロフェ
ノールを約20％過剰に加える。この溶液に０℃でジシク
ロヘキシルカルボジイミドを計算量加える。 0.5時間後
に、この溶液を室温に戻し、１時間保持した。分離した
ジシクロヘキシル尿素を濾過し、溶媒で洗浄する。濾液
と洗液とを合わせたものを減圧下でエバポレートし乾固
する。このエステルはそのままカップリング反応に使用
され得、また、クロロホルム中イソプロパノール勾配
（０〜50％）を用いて、シリカの短いカラムで精製する
こともできる。
【０１８３】適切に保護された他の2'−デオキシヌクレ
オシドについても類似の一連の反応を行うことができ
る。
【０１８４】この活性エステル（１mmol）を、40％ジメ
チルアミン水溶液（２mmol）とメタノール中で処理する
と、 N−保護化3'−O−tert−ブチルジメチルシリル−
2',5'−ジデオキシアデノシン−5'−酢酸の N,N−ジメ
チルアミドが生成する。溶媒を減圧下でエバポレートし
て除去し、残渣を２M HF／１M tert−ブチルアンモニウ
ムフルオライド（TBAF）試薬を用いて脱シリル化する。
このTBAF試薬は、Tetrahedron Lett (1982) 23 :2257に
B. L. Gaffneyおよび R. A. Jonesにより記載されてい
る。ピリジン中の２M HF／１M tert−ブチルアンモニウ
ムフルオライド（TBAF１mmol）に、前段で得られる脱保
護化ヌクレオシドを加える。24時間攪拌後、反応液をメ
チレンおよび重炭酸ナトリウム水溶液に分離する。有機
層を水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートし
乾固する。残渣をメチレンクロライド中メタノール勾配
（５〜25％）を用い、シリカクロマトグラフィーで精製
する。
【０１８５】（実施例７）プリンおよびピリミジンピロ
リドンの調製 カリウム t−ブトキシド、アニソイルクロリド、 6−ク
ロロプリン、10％パラジウム−炭、フタロイルクロリ
ド、 2−アミノ−6−クロロプリン、20％テトラエチル
アンモニウムヒドロキシド水溶液、25％トリメチルアミ
ン水溶液、 2−ピリミジノン、 N−ブロモコハク酸イミ
ド、トリフルオロ酢酸、 4−ニトロフェノール、および
N,N−ジスクシイミジルカーボネートは Aldrichで得ら
れる。リチウムアジドは EastmanKodak, Rochester, Ne
w York, で得られる。Ｃ18逆相シリカゲルは、Whatman,
Hillsboro, Oregon, で得られる。
【０１８６】7.1. (S)−５−[(4−アミノ−2−オキソ
ピリミジニル)−メチル]−ピロリドンの調製（以下、シ
トシンピロリドンとして述べる） シトシン（ 2.2mmol）を、カリウムtert−ブトキシド
（２mmol）を含むジメチルスルホキシド（２mL）に溶解
させる。この溶液を (S)−5−(トシルオキシメチル)−2
−ピロリドン（１mmol）を含むフラスコに加える。この
(S)−5−(トシルオキシメチル)−2−ピロリドンは、E,
Hardeggerおよび H. Ott.の方法（Helv Chim Acta (19
55) 38 : 312）により調製される。溶解後、この混合物
を25℃で６時間攪拌する。この混合物を酢酸（２mmol）
で中和し、減圧下でエバポレートする。残渣をジメチル
ホルムアミド（５mL）中に取り、減圧下でエバポレート
する。この工程を３度繰り返す。
【０１８７】7.2. N−4 アニソイルシトシンピロリド
ンの調製 前段で得られる混合物をピリジンまたは N−メチルイミ
ダゾール（10mL）に溶解させ、室温にてアニソイルクロ
リド（2.8mmol）と処理する。２時間攪拌後、混合物を
氷（0.5ｇ）で反応を止める。５分後、29％アンモニア
１mLを加える。15分間室温に保持した後、その溶液を酢
酸エチル（15mL）に溶解させ、塩水（15mL）を用いて２
度洗浄する。洗液を合併し、酢酸エチル（２×30mL）で
洗浄する。有機層を合併し、硫酸ナトリウムで乾燥し、
減圧下でエバポレートする。残渣はトルエンとともに数
度エバポレートし、得られた残渣を、メチレンクロリド
中メタノール勾配（０〜20％）でシリカゲルクロマトグ
ラフィーにかける。
【０１８８】7.3. 6−クロロプリンピロリドンの調製 この化合物は、シトシンのアルキル化の方法により調製
される。シトシンのアルキル化の条件と異なるのは、ア
ルキル化は 6−クロロプリンに対して行い、混合物を35
〜95℃に数時間加熱することである。その混合物を室温
に冷却し、酢酸（２mmol）で中和し、減圧下でエバポレ
ートする。これを、20％メタノール／クロロホルムおよ
び10％重炭酸ナトリウム混合物とともに振盪する。水層
をクロロホルムで洗浄し、合併した有機層を硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、減圧下でエバポレートする。残渣を、ク
ロロホルム中メタノール勾配（０〜25％）を用いてシリ
カゲルクロマトグラフィーにかける。
【０１８９】7.4. 6−アジドプリンピロリドンの調製 6−クロロプリンピロリドン（１mmol）を、リチウムア
ジド（２mmol）を含むジメチルスルホキシド（２mL）中
で30〜 100℃にて数時間処理する。処理後、この混合物
を減圧下でエバポレートし、クロロホルムに溶解させ
る。10％重炭酸ナトリウムで洗浄し、有機層を硫酸ナト
リウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。残渣を、クロロホ
ルム中メタノール勾配（０〜25％）を用いてシリカクロ
マトグラフィーにかける。
【０１９０】7.5. アデノシンピロリドンの調製 前記実施例で得られるアジドを水素化する。この水素化
は、該アジド（１mmol）のパラジウム−炭（100mg、Pd
10重量％）を含むエタノール（10mL）溶液に30ポンドの
水素圧をかけて24時間振盪することにより行われる。こ
の溶液をセライトを用いて濾過し、濾液をエバポレート
する。残渣を直接次のステップに用いる。
【０１９１】7.6. N−6 フタロイルアデノシンピロリ
ドンの調製 アデノシンピロリドン（１mmol）をフタロイルクロリド
（1.4mmol）でアシル化することにより N−6 位にフタ
ロイル基を導入する。この反応は、反応液中にアンモニ
アを加えないこと以外は、上記シチジンのアニソイル化
と同様の方法を用いて行われる。
【０１９２】7.7. 2−アミノ−6−クロロプリンピロリ
ドンの調製 ピロリドントシレートを、6−クロロプリン誘導体の調
製に示された方法で 2−アミノ−6−クロロプリンを用
いてアルキル化する。
【０１９３】7.8. グアニンピロリドンの調製 前段で得られるクロロプリンピロリドン（１mmol）をジ
グリム（10mL）および25％トリメチルアミン水溶液（２
mL）中に溶解させる。その溶液を室温で５時間攪拌し、
水（10mL）を加え、その混合物を減圧下で10mLにまで濃
縮する。酢酸（２mL）を加え、その混合液を減圧下でエ
バポレートし、オイル状物を得た。酢酸四エチルアンモ
ニウムを含む残渣は、直接、次のステップに使用され
る。
【０１９４】7.9. N−2 アセチルグアニンピロリドン
の調製 前段で得られるグアニンピロリドン（１mmol）を無水酢
酸（５mL）と、還流下で２時間反応させる。その溶媒を
エバポレートし、その残渣をジメチルホルムアミドと共
にエバポレートする。その残渣を、０℃にてアンモニア
で飽和させたエタノール（５mL）に溶解させ、溶液をこ
の温度で２時間攪拌する。その溶媒を減圧下でエバポレ
ートし、残渣をクロロホルム中メタノール勾配（５〜50
％）を用い、短いカラムのシリカクロマトグラフィーに
より精製する。
【０１９５】7.10. 2−アミノ−6−アジドプリンピロ
リドンの調製 この化合物は、実施例7.4.の手法を用い、 2−アミノ−
6−クロロプリンピロリドンから調製される。実施例7.
4.の方法と異なるのは、反応がより長い時間を必要と
し、かつより高い温度で行われることである。
【０１９６】7.11. 2,6−ジアミノプリンピロリドンの
調製 この化合物は、 2−アミノ−6−アジド誘導体の還元に
より、アデノシンピロリドンと同様に調製される。
【０１９７】7.12. N−2 アセチル N−6 フタロイル
2,6−ジアミノプリンピロリドンの調製 メタノール性アンモニア処理を８時間にわたって行うこ
とを除き、上記 N−2アセチルグアニンピロリドンの調
製と同様の方法により、アセチル基が導入される。溶媒
をエバポレートし、残渣をアデノシン誘導体の場合と同
様にフタロイル化する。
【０１９８】7.13. イノシンピロリドンの調製 6−クロロプリンピロリドン（１mmol）は、グアニンピ
ロリドン誘導体の調製に用いられる方法によりイノシン
誘導体に変換された。その化合物は、クロロホルム中メ
タノール勾配（５〜25％）を用いて、シリカクロマトグ
ラフィーによって精製される。
【０１９９】7.14. 2−ヒドロキシピリミジンピロリド
ンの調製 この化合物は、 6−クロロプリン誘導体の調製に用いら
れる手法により、 2−ピリミジノンのアルキル化により
得られる。
【０２００】(実施例８)プリンおよびピリミジン T-BOC
アミノ酸の調製 シトシンピロリドンの下記一般的手法は、すべての適切
に保護されたピロリドン誘導体に適用することができ
る。t-BOC酸として言及されるその生成物は、ピロリド
ン環が開裂して酸および t-BOCアミンとなることにより
形成される。
【０２０１】8.1. シトシン t-BOC酸の調製 N−4−アニソイルシトシンピロリドン（１mmol）を、ジ
−tert−ブチルジカーボネート（２mmol）、トリエチル
アミン（１mmol）およびジメチルアミノピリジン（１mm
ol）を含むメチレンクロライドに溶解させる（ 0.5M 溶
液）。その溶液を、室温で10時間攪拌する。揮発性物質
を除去し、残渣をクロロホルム中メタノール勾配（０〜
20％）を用いて、シリカで精製する。その残渣をテトラ
ヒドロフランに溶解させ（0.2 M 溶液）、次に、水酸化
リチウムを加える（３mmol、１M 溶液として）。室温で
５時間保持した後、その溶液を10％酢酸（３mmol）を添
加することにより中和し、溶媒を減圧下で除去する。そ
の残渣を9N アンニモアに溶解させ、室温で１〜10時間
攪拌した。その溶媒を減圧下で除去し、残渣を水および
メタノール（またはトリフルオロエタノール）の混合液
を用いて、Ｃ18逆相シリカゲルのクロマトグラフィーに
より精製する。
【０２０２】8.2. ウラシル t-BOC酸の調製 これは、次の操作によりシトシン t-BOC酸から調製す
る：シトシン t-BOC酸（１mmol）を酢酸水溶液に溶解さ
せ、亜硫酸ナトリウム（１mmol）と４℃で処理する。そ
の混合物を１時間攪拌し、減圧下エバポレート・乾固す
る。その生成物を、水およびメタノール（またはトリフ
ルオロエタノール）混合液を用い、Ｃ18逆相シリカゲル
のクロマトグラフィーにより精製する。
【０２０３】8.3. 5−ブロモウラシル t-BOC酸の調製 この化合物は次の手法により、ウラシル t-BOC酸から得
る：ウラシル t-BOC酸（１mmol）を DMF（３ml）に溶解
させ、 N−ブロモコハク酸イミド（ 1.2mmol）で処理す
る。その溶液を、16時間室温で放置する。溶媒を減圧下
で除去した後、その生成物を、水およびメタノール（ま
たはトリフルオロエタノール）混合液を用い、Ｃ18逆相
シリカゲルのクロマトグラフィーにより精製する。
【０２０４】8.4. N−保護化 t-BOC酸の調製 認識部分の環外のアミノ基をアシル化するためのこの一
般的な手法もまた、アデノシン誘導体の保護に適用され
る。
【０２０５】前段で得られるシトシン t-BOC酸（１mmo
l）を N−メチルイミダゾールあるいはピリジン（５m
L）に溶解させて、クロロトリメチルシラン（５mmol）
で処理する。室温で15分間保持した後、その溶液を 2−
(4−ニトロフェニル)エチルクロロフォーメート ３mmol
[F. Himmelsbachおよび W. Pfleiderer（Tetrahedron
Lett (1983) 24 : 3583)の方法により得られる]で処理
する。その反応液を室温で８時間保持し、次に氷浴で冷
却し、そして水（１mL）を加えた。５分後、濃アンモニ
ア１mLを加えて、混合物を室温で15分間攪拌する。その
反応液を次に、エバポレート・乾固し、その残渣を水に
溶解させる。その溶液を 2M 塩酸で酸性にして、クロロ
ホルムで抽出する。合併した有機抽出物を硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、減圧下でエバポレートする。その残渣をク
ロロホルム中メタノール勾配（５〜50％）を用いてシリ
カクロマトグラフィーにより精製する。
【０２０６】グアニンおよび 2,6−ジアミノプリン誘導
体の保護のために、上の操作を改変し、反応をピリジン
中で行い、アシル化試薬を9-フルオレニルメチルクロロ
フォーメイトとした。
【０２０７】（実施例９）プリンおよびピリミジンアミ
ノ酸の調製 次の手法は、すべての誘導体に適用される。それは t-B
OC基を取り除き、バックボーンの第一アミノ基をフリー
にする。
【０２０８】t-BOC酸（１mmol）を20％のトリフルオロ
酢酸を含むメチレンクロライド５mLに溶解させ、室温で
30分間攪拌した。トルエン（３mL）を加え、溶媒を減圧
下でエバポレートすると、アミノ酸トリフルオロ酢酸塩
が得られる。これを直接、カップリング反応に用いる。
【０２０９】（実施例10）アキラルな非環状ポリヌクレ
オチド類似物の組立てのためのサブユニットの調製 10.1 シチジン類似物の調製 水素化ホウ素リチウム、ジ−tert−ブチルジカーボネー
トおよびビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムＩ
Ｉクロライドは、Aldrich Chemical Co., Milwaukee, W
I.から得た。 2−アミノ−5−ブロモピリミジンは、T.
Nishikawa〔Chem. Pharm. Bull. 9 : 38 (1961) 〕の
方法により調製される。
【０２１０】2−アミノ−5−ブロモピリミジンは、ベン
ゾイルクロライドを用いる実施例２の一般的手法によ
り、環外のアミノ基がベンゾイル化される。生成物のベ
ンズアミド（25mmol）を、トリエチルアミン（10mL）、
ベンゼン（10mL）およびビス（トリフェニルホスフィ
ン）パラジウムＩＩクロライド（ 0.375mmol）を含む45
mLの耐圧容器に加える。その容器にアルゴンを吹き込
み、密閉し、そして、一酸化炭素で 600psi に加圧し、
次に、水素で1200psi にまで加圧する。攪拌しながらそ
の反応容器を油浴中 145℃に加熱する。気体の吸収がす
べて終わった後、その反応物を冷却し、気体をゆっくり
と排気する。無水エーテルの添加後、その反応混合物を
濾過し真空下でエバポレートする。次に、その生成物
を、メチレンクロライド中イソプロパノール勾配（０〜
20％）を用いて、シリカゲルクロマトグラフィーで単離
した。
【０２１１】前段で得られる 2−ベンズアミドピリミジ
ン−5−カルボキシアルデヒド（１mmol）をエタノール
（５mL）に溶解させ、 4−アミノ酪酸（１mmol）および
トリエチルアミン（１mmol）で処理する。１時間攪拌
後、その混合物を10％パラジウム−炭（ 100mg）を用い
て30psi で水素化する。水素の吸収が終わった後、その
反応液を濾過し、溶媒を減圧下で除去する。その残渣を
０℃にてアンモニアで飽和したメタノールに溶解させ、
室温で10時間攪拌する。溶媒をエバポレートした後、そ
の残渣を酢酸アンモニウム（ 0.2M ）でpH７に緩衝化し
たメタノール−水混合液を用い、Ｃ18シリカゲルのクロ
マトグラフィーにより精製する。
【０２１２】前段で得られるアミノ酸（１mmol）をジ−
tert−ブチルジカーボネート（１mmol）を含むエタノー
ル（３mL）に溶解させる。トリエチルアミン（ 1.5mmo
l）を室温でゆっくりと加える。二酸化炭素の発生が終
わった後、その溶媒を真空下で除去し、そして残渣を直
接次の反応に用いる。
【０２１３】前段で得られる t-BOCアミノ酸の環外のア
ミノ基を、 2−(フェニルスルホニル)エトキシカルボニ
ルクロライドを用いる実施例２の一般的手法により、ア
シル化する。その生成物は、クロロホルム中メタノール
勾配（０〜50％）を用い、シリカゲルクロマトグラフィ
ーによって精製され得る。
【０２１４】前段で得られる 2−(フェニルスルホニル)
−エトキシカルボニル−保護化 BOCアミノ酸を、実施例
11.3および11.4中の手法により、 p−ニトロフェニルま
たはN−ヒドロキシサクシイミドイル活性エステルへ変
換した。
【０２１５】10.2. ウリジン類似物の調製 6−ヒドロキシニコチン酸エチルを、H. Gault, J. Gilb
ert, および D. Briaucourt〔C. R. Acad. Sci., Pari
s, Ser. C,266 : 131 (1968)〕の方法により調製する。
水素化ホウ素リチウムは Aldrichから得られる。二酸化
マンガンは、Vereshcha-gin ら〔Zhurnal Arganichesko
i Khimil, 8 : 1129 (1972) 〕の方法により調製する。
Dowex樹脂は、 Bio-Rad Laboratories,Richmond, CAか
ら得られる。
【０２１６】6−ヒドロキシニコチン酸エチル（49mmo
l）のテトラヒドロフラン（10mL）溶液を、窒素雰囲気
下、室温で水素化ホウ素リチウム（ 100mmol）のテトラ
ヒドロフラン（THF ）（75mL）懸濁液へ滴下する。この
粘性の混合物を25℃で16時間攪拌する。次に、20％酢酸
60mlを、冷却したその懸濁液に加える。 THFを減圧下で
エバポレートし、残留した水性溶液を、リチウムイオン
を取り除くために、イオン交換カラム（Dowex-50W-X8）
にかける。カラムを注意深く 250mLの水で洗浄し、次に
エバポレートする。メタノールと共に繰り返しエバポレ
ートすることによって、得られた残渣からホウ酸が除去
される。生成物を減圧下で蒸留することにより精製す
る。
【０２１７】前段で調製されたベンジリックアルコール
（66mmol）をエーテル（ 250mL）に溶解させ、二酸化マ
ンガン（54ｇ）のエーテル（ 100ml）スラリーで、ゆっ
くりと処理（発熱を伴う）する。室温で12時間保持した
後、その混合物を濾過し、減圧下で溶媒を除去し、その
残渣を真空で蒸留すると、 6−ヒドロキシニコチンアル
デヒドを得る。
【０２１８】前段で得られるアルデヒドを、実施例11.1
のシチジン類似物の調製と同様に、4−アミノ酪酸と反
応させる。
【０２１９】前段で得られるアミノ酸を、実施例10.1の
シチジン類似物の調製と同様に、対応する BOC−誘導体
へ変換した。
【０２２０】前段で得られる BOC−アミノ酸は、実施例
11.3および11.4中の手法により、 p−ニトロフェニルま
たは、 N−ヒドロキシサクシイミドイル活性エステルへ
変換する。
【０２２１】（実施例11）5'−保護化、3'−活性化2'−
デオキシヌクレオシドの調製 11.1. 2'−デオキシヌクレオシド5'−O−ジメトキシト
リチル誘導体 2'−デオキシヌクレオシド5'−O−ジメトキシトリチル
誘導体の調製には、次の手法が一般的である。
【０２２２】N−2 9−フルオレニルメトキシカルボニ
ル−2'−デオキシグアノシン（１mmol）を無水ピリジン
（２mL）に溶解させ、０℃に保つ。ジメトキシトリチル
クロリド（ 1.2mmol）を0.15mmolずつ８時間にわたり添
加する。さらに２時間後、メタノール（ 0.5mL）を加
え、溶液を減圧下で濃縮する。残渣を重炭酸ナトリウム
（２mL、 0.5％）および塩化メチレン（５mL）の混合液
で処理する。
【０２２３】水層を塩化メチレン（２×５mL）で抽出
し、合併した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポ
レートする。残渣をトルエンとともに数回エバポレート
し、生成物を塩化メチレン中メタノール勾配（０〜10
％）を用い、シリカゲルクロマトグラフィーで精製す
る。
【０２２４】11.2. 5'−ジメトキシトリチル−2'−デ
オキシヌクレオシド 3'−０−(4−ニトロフェニル）カ
ーボネート 5'−０−ジメトキシトリチル−2−デオキシシチジン3'
−０−(4−ニトロフェニル）カーボネートの調製法は、
4−ニトロフェニルカーボネートの一般的調製法である
以下の操作法の中に記載されている。ビス(4−ニトロフ
ェニル）カーボネートおよび N,N−ジメチルアミノピリ
ジンは Sigmaより得られる。
【０２２５】5'−０−ジメトキシトリチル−N−2−(4−
ニトロフェニル)−エトキシカルボニル−2'−デオキシ
シチジン（１mmol）を、無水ジメチルホルムアミド（５
mL）に室温で溶解させ、ビス（4−ニトロフェニル）カ
ーボネート（２mmol）で処理し、次に、減圧下でエバポ
レートする。残渣をジメチルホルムアミド（５mL）に溶
解させ、 N,N−ジメチルアミノピリジン（ 0.1mmol）を
加える。黄色の溶液をエバポレートし、１時間反応させ
る。反応混合物をクロロホルム（10mL）に溶かし、塩酸
水溶液（５mL、0.1M ）で洗浄する。有機層を水酸化ナ
トリウム水溶液（５mL、0.1M ）、水（２mL）で２度洗
浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートする。残
渣をシリカゲルカラムにかけ、クロロホルム中イソプロ
パノール勾配（０〜10％）で溶離させる。生成物を含む
分画を集め、エバポレートし、クロロホルム（10mL）に
溶かし、痕跡量の 4−ニトロフェノールを除くために水
酸化ナトリウム水溶液での洗浄を繰り返す。この有機層
を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥しエバポレートす
る。生成物は、TLCによれば均一であり、二量化カーボ
ネートの調製に直接用いられる。
【０２２６】FMOC基を含むヌクレオシドのカーボネート
の調製には、N,N−ジメチルアミノピリジンよりもむし
ろ、 N−メチルイミダゾームを触媒として使用するのが
時として優れている。
【０２２７】11.3. N−保護化 t-BOC p−ニトロフェニ
ルエステル サブユニット結合用の活性化エステルは、以下の２つの
操作法により調製される。これは、すべての t-BOC酸誘
導体において一般的なものである。
【０２２８】実施例8.4.で得られる t-BOC酸の 0.2〜
0.5M 酢酸エチル（または塩化メチレン）溶液に p−ニ
トロフェノールを約20％過剰量だけ加える。０℃におい
て、ジシクロヘキシルカルボジイミドを計算量だけその
溶液に加える。 0.5時間後、混合物を室温にもどし、１
時間保持する。分離したジシクロヘキシル尿素を濾過
し、溶媒で洗う。濾液と洗浄液とを合併し、減圧下でエ
バポレートし乾固する。このエステルはカップリング反
応に直接使用され得る。または、シリカの短いカラムで
クロロホルム中イソプロパノール勾配（０〜50％）で精
製され得る。
【０２２９】11.4. N−保護化− t-BOC N−ヒドロキシ
スクシイミドイルエステル 実施例8.4.で得られる t-BOC酸（１mmol）のアセトニト
リル（５mL）溶液に、ピリジン（１mmol）およびN,N'−
ジスクシイミジルカーボネート（１mmol）を加える。こ
の溶液を室温で３時間攪拌する。溶媒を減圧下で除き、
残渣をクロロホルムに溶解する。有機相を 0.1M HCl お
よび水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレー
トして乾固する。このエステルは、直接使用し得るだけ
充分に純粋なものである。
【０２３０】(実施例12）カーボネート分子間サブユニ
ット結合の形成 シチジニル−(3'−5')−シチジンカーボネートの調製法
は、次の操作法の中で記載されている。これは、カーボ
ネート分子間サブユニットの形成およびオリゴカーボネ
ートの脱保護において一般的な操作法である。塩基を保
護している基は、2−(4−ニトロフェニル）エトキシカ
ルボニル、2−(フェニルスルホニル）エトキシカルボニ
ル、またはFMOCでなければならないことに注意された
い。tert−ブチルジメチルシリルクロライトは Aldrich
から得られる。
【０２３１】12.1 2'−デオキシヌクレオシド 3'−O−
tert−ブチルジメチルシリル誘導体の調製 3'−O−tert−ブチルジメチルシリル−N−2−(4−ニト
ロフェニル）エトキシカルボニル−2'−デオキシシチジ
ンの調製法を以下に示す。これは、2'−デオキシヌクレ
オシド−3'−O−tert−ブチルジメチルシリル誘導体の
調製のための一般的操作法である。
【０２３２】乾燥ジメチルホルムアミドまたはテトラヒ
ドロフラン10mLに5'−Ｏ−ジメトキシトリチル−N−4−
(4−ニトロフェニル)−エトキシカルボニル−2'−デオ
キシシチジン（１mmol）とイミダゾール（ 3.5mmol）と
を溶かした溶液に、攪拌しながらtert−ブチルジメチル
シリルクロライド（３mmol）の乾燥 DMF（10mL）溶液を
滴下する。反応液を１時間攪拌した後、氷で反応を止
め、塩化メチレンで抽出する。水で洗浄し、硫酸ナトリ
ウムで乾燥する。有機層を減圧下でエバポレート乾固
し、シリカゲルクロマトグラフィーで塩化メチレンを溶
離剤として精製する。
【０２３３】前段で得られる5'−O−ジメトキシトリチ
ル誘導体（１mmol）の塩化メチレン（５mmol）溶液に、
臭化亜鉛のメタノール（15％v/v)含有塩化メチレン（10
mL、１M ）溶液を加える。反応混合物を30分間攪拌し、
氷で反応を止め、塩化メチレンで抽出する。有機層を水
で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下でエバポレ
ート乾固する。生成物を、塩化メチレン中メタノール勾
配（０〜10％）を用いシリカゲルクロマトグラフィーで
精製する。
【０２３４】5'−O−ジメトキシトリチル−N−2−(4−
ニトロフェニル）エトキシカルボニル−2'−デオキシシ
チジン−3'−O−(4−ニトロフェニル）カーボネート（
1.5mmol）および3'−O−tert−ブチルジメチルシリル−
N−4−(4−ニトロフェニル）エトキシカルボニル−2'−
デオキシシチジン（１mmol）をジメチルホルムアミド
（５mL）に溶かし、減圧下で溶媒を除去する。これを２
度繰り返す。残渣を再びジメチルホルムアミド（５mL）
に溶かし、N, N'−ジメチルアミノピリジン（ 0.5mmo
l）またはＮ−メチルイミダゾール（１mmol）で処理す
る。溶媒を減圧下でエバポレートすることにより除去
し、反応物を室温にて終夜放置する。残渣をクロロホル
ム（20mL）に溶かし、HCl 水溶液（２mL、0.1M）、水
（２mL）、NaOHナトリウム水溶液（２×２mL、0.2M）、
水（２mL）で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥
し、エバポレートする。この残渣を、クロロホルム中イ
ソプロパノール勾配（０〜30％）を用いてシリカゲルで
精製する。単離した生成物は、TLC （および 400MHz の
NMRにおいて均一である。
【０２３５】残渣を、B. L. Gaffney および R. A. Jon
es〔Tetrahedron Lett (1982) 23 :2257 〕の記述に従
い、2M HF/1M tert−ブチルアンモニウムフルオライド
（TBAF）試薬を用いて脱シリル化する。この 2M HF/1M
tert−ブチルアンモニウムフルオライドを含むピリジン
（TBAF 1mmol）に、前段で得られる脱保護化ヌクレオシ
ドを加える。24時間攪拌後、反応液を塩化メチレンと重
炭酸ナトリウム水溶液との間で分配する。その有機層を
水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートし乾固
する。残渣を塩化メチレン中メタノール勾配（５〜25
％）を用い、シリカクロマトグラフィーで精製する。
【０２３６】3'−ヒドロキシジヌクレオシドカーボネー
トを、実施例11の方法により3'−(4−ニトロフェニル）
−カーボネートに変換する。これらの誘導体は、ヌクレ
オシドまたはオリゴヌクレオシドカーボネートの 5'−
水酸基と反応し、より高級のオリゴヌクレオシドカーボ
ネートが調製され得る。
【０２３７】（実施例13）カーバメート分子間サブユニ
ット結合の形成 ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート、ｐ−アニソ
イルジフェニルメチルクロライド、N, N−ジメチルアニ
リン（DMA)、およびトリエチルアミンは、Aldrich Chem
ical Co.で得られる。
【０２３８】上記実施例３で調製される目的とする 5'
−アミノ−2', 5'−ジデオキシリボヌクレオシド（必要
に応じて塩基の保護のためにアセチル基またはベンゾイ
ル基を使用する）を、ピリジン中でｐ−アニソイルジフ
ェニルメチルクロライド（1.2mmol)と処理する。12時間
後、溶媒をエバポレートし、残渣を再びクロロホルムに
溶解させる。この溶液を NaHCO3 水溶液と水とで各々１
回洗浄し、Na2SO4で乾燥する。溶媒をエバポレートし、
残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけてクロロホ
ルム／メタノール／１％トリエチルアミン混合液で溶出
させる。
【０２３９】5'−トリチル化アミノヌクレオシド（１mm
ol）を DMFから２度エバポレートする。次に、溶媒とし
て DMFを使用し、トリエチルアミン（またはN, N−ジメ
チルアミノピリジン、または N−メチルイミダゾール）
の触媒量の存在下でビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボ
ネート（２mmol）と処理する。３時間後、溶媒をエバポ
レートし、残渣をクロロホルムに溶解させる。この溶液
を 0.01N水酸化ナトリウム水溶液で２度洗浄し、水で１
度洗浄し、次いで Na2SO4 で乾燥する。この溶媒をロー
タリーエバポレーターで除去する。残渣をシリカゲルク
ロマトグラフィーにかけ、まず、クロロホルム／ 0.1％
DMA混合液で溶出させ、次いで、クロロホルム／メタノ
ール／ 0.1％ DMA溶媒系で溶離させる。適当な分画を集
め、エバポレート・乾固させる。残渣を最小量の THFに
溶かし、この溶液を過剰量のヘキサンに加える。沈澱し
た活性化ヌクレオシドを濾過して集め、真空下で乾燥す
る。
【０２４０】目的とする5'−アミノヌクレオシド（ 1.1
mmol）は、上記実施例３のように、DMF で２度エバポレ
ートする。活性化ヌクレオシド（１mmol）を反応器に加
え、固形物を DMFに溶解させる。溶液を小容量に濃縮
し、一晩放置する。溶媒を真空下で完全に除去し、残渣
をクロロホルムに溶解させる。この溶液を0.01N 水酸化
ナトリウム水溶液で２度洗浄し、水で１度洗浄し、次
に、固体の硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒をロータリ
ーエバポレーターで除去し、残渣をシリカゲルのクロマ
トグラフィーにかけ、適当なメタノール／クロロホルム
／１％トリエチルアミン溶媒系で溶出する。二量体のヌ
クレオシドを含む分画を合併し、エバポレート・乾固す
る。残渣を最小量のTHF に溶解し、この溶液をヘキサン
に加える。沈澱物を集め、真空下で乾燥させる。
【０２４１】（実施例14）チオカーバメートサブユニッ
ト間結合の形成 N, N−ジメチルアミノピリジン（DMAP）は、Aldrich Ch
emical Co. で購入する。
【０２４２】実施例３で調製した5'−アミノヌクレオシ
ドのサブユニット間結合のチオカルバメートの生成は、
上記の実施例13に記載したのと同様の方法で行なわれ
る。操作法において異なる点は次のとおりである。用い
られた5'−アミノヌクレオシドは塩基保護部分として、
2−(フェニルスルホニル）エトキシカルボニル（デオキ
シシチジンおよびデオキシアデノシン用）または 9−FM
OC（グアノシンおよび2,6−ジアミノ−2'−ジオキシリ
ボミド用）基を有する。これらの分子の調製法は上記
（実施例３）に記載されている。5'−トリチルアミノヌ
クレオシド（１mmol）の活性化は、DMF中、トリエチル
アミン（２mmol）およびDMAP（触媒量）の存在下でｐ−
ニトロフェニルクロロチオフォーメート（Monatsber De
ut Akad WissBerlin (1964) 6 : 897の G Hilgetag お
よび r. Phillippson の方法により調製）によりなされ
る。カップリングステップでは、この活性化モノマー
（１mmol）と所望の 5'−アミノヌクレオシド（ 1.1mmo
l）とを用いる。触媒としてはDMAPまたは N−メチルイ
ミダゾールを、そして、溶媒としては DMFを使用する。
このステップでの水性の処理物において、0.01N 水酸化
ナトリウム水溶液による洗浄は省き水で洗浄を行う。
【０２４３】（実施例15）モルフォリン型サブユニット
間のカーバメートおよびチオカーバメート分子間サブユ
ニット結合の形成 Ｎ−メチルイミダゾールは Aldrich Chemical Co. から
購入する。
【０２４４】実施例５で調製した目的とする乾燥N'−保
護化、5'−フリーアルコールモルフォリン型のヌクレオ
シド（必要に応じて塩基保護のためにアセチル基または
ベンゾイル基を使用）を、無水条件下で DMF中のビス−
（ｐ−ニトロフェニル）カーボネートおよびトリエチル
アミン（または DMAP またはＮ−メチルイミダゾール）
（触媒量）で処理する。この溶液を３時間攪拌し、次に
エバポレートし乾固する。残渣をクロロホルムに溶か
し、その溶液を0.01N 水酸化ナトリウム水溶液で２度、
水で１度洗浄し、次に Na2SO4 で乾燥する。溶媒をロー
タリーエバポレーターで除去し、残渣をシリカゲルクロ
マトグラフィーにかけ、適当なクロロホルム／イソプロ
パノール／0.1 ％ DMA混合液で溶出する。目的とする活
性化ヌクレオシドを含む分画をあわせて、エバポレート
し、得られた固形物を最小量の THFに溶解させる。この
THF溶液を過剰量のヘキサンに加え、得られた沈澱物を
採取して乾燥する。
【０２４５】DMF で２度エバポレートした後、目的とす
る5'−フリーヒドロキシ、N'−フリーモルフォリン型ヌ
クレオシド（この実施例の中で挙げたのと同一の塩基保
護基を使用）（1.1mmol)を、5'−(p−ニトロフェノキシ
カルボニル）モルフォリンサブユニット（１mmol）の D
MF溶液で処理する。反応溶液の容量を真空下で減じ、小
容量とする。必要であれば、Ｎ−メチルイミダゾールま
たはトルエチルアミンを触媒量反応容器中へ加える。得
られた溶液を室温で終夜放置する。残留した溶媒をエバ
ポレートし、残渣をクロロホルムに溶かす。クロロホル
ム溶液を 0.01N水酸化ナトリウム水溶液で２度、水で１
度洗浄し、そして Na2SO4 で乾燥する。この溶媒をロー
タリーエバポレーターで除去し、残渣でシリカゲルクロ
マトグラフィーにかけ、クロロホルム／メタノールの混
合溶媒で溶出させる。目的とするダイマーを含む分画を
あわせ、エバポレート乾固する。残渣を最小量の THFに
溶かし、この溶液を過剰量のヘキサンに加える。沈澱物
を集め、真空下で乾燥する。
【０２４６】チオカーバメート部分により結合したモル
フォリンサブユニットは、上記この実施例に関連して、
次のように操作を変更して調製する。塩基の保護基は、
１−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル基（デ
オキシシチジンおよびデオキシアデノシン用）、または
9−FMOC基（デオキシグアノシンおよび2, 6−ジアミノ
−2'−デオキシリボシド用）である。これらの分子の調
製は、上記（実施例５）に記載されている。Ｎ−保護化
モルフォリンヌクレオシド（１mmol）は、DMF中で、ト
リエチルアミン（２mmol）とDMAPまたはＮ−メチルイミ
ダゾール（触媒量）との存在下、ｐ−ニトロフェニルク
ロロチオフォーメート（ 1.2mmol）で活性化される。カ
ップリングステップには、この活性モノマー（１mmol）
および所望のN'−フリーモルフォリンヌクレオシド（
1.1mmol）を用いる。触媒としてDMAPまたはＮ−メチル
イミダゾールを、そして、溶媒としてDMF を用い、溶液
を35〜40℃に加温して行う。これらのステップの水性の
処理物においては、0.01N NaOH水溶液による洗浄を省
き、水で洗浄する方法を採用する。
【０２４７】（実施例16）エステルサブユニット結合の
調製 N, N−ジメチルアミノピリジンおよびＮ−メチルイミダ
ゾールは Aldrichから得られる。
【０２４８】２つのサブユニットの結合は、5'−N, N−
アセトアミド−3'−ヒドロキシ誘導体と3'−シリル化−
5'−活性化エステルとの反応により行う。これらは実施
例６と同様に調製される。その試薬（各１mmol）をジメ
チルホルムアミドと数回にわたり共にエバポレートし、
次に、ジメチルホルムアミド（５mL）に溶かし、N, N−
ジメチルアミノピリジン（ 0.2mmol）またはＮ−メチル
イミダゾール（１mmol）で処理する。溶媒を減圧下で除
き、反応物を室温で２時間放置する。残渣をクロロホル
ムに溶かし、希 HCl、水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、そして、溶媒を減圧下でエバポレートす
る。残渣をクロロホルム中メタノール勾配を用いてシリ
カゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０２４９】その鎖は実施例６のように脱シリル化し、
そして、前段に示すように得られた3'−フリーヒドロキ
シ化合物を活性化エステルで処理することにより伸長さ
せてもよい。
【０２５０】（実施例17）t-BOC アミド結合ダイマーの
形成 完全に保護された t-BOC N−ヒドロキシスクシイミドイ
ルエステルまたはｐ−ニトロフェニルエステル（１mmo
l）を、実施例11.3および11.4に従って調製し、乾燥ジ
メチルホルムアミドで数回、共にエバポレートし乾燥さ
せる。実施例９で調製した保護化アミノ酸トリフルオロ
酢酸塩（１mmol）を同様に処理する。この２つの成分
を、別々に乾燥ジメチルホルムアミド（２mL）に溶解さ
せ、混合し、そして、ジイソプロピルエチルアミン（
1.0mmol）で処理する。この溶液を室温で１時間攪拌
し、次に溶媒を減圧下でエバポレートすることにより除
去する。この残渣をクロロホルムに溶解させ、希塩酸で
洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で
エバポレート・乾固する。この残渣をクロロホルム中メ
タノール勾配（15〜50％）を用いてシリカゲルクロマト
グラフィーにより精製する。t-BOC ダイマー酸を水−メ
タノール（トリフルオロエタノール）混合液を用いてC1
8逆相クロマトグラフィーにより精製することもでき
る。
【０２５１】17.1 t-BOC ダイマー活性化エステルの調
製 前段で得られた酸を、実施例11.3および11.4の一般的手
法を用いてＮ−ヒドロキシスクシイミドイルエステルま
たはｐ−ニトロフェニルエステルに変換する。 17.2 t-BOC ダイマーアミノ酸トリフルオロ酢酸塩の調
製 実施例９の一般的操作法により t-BOCダイマー酸をトリ
フルオロ酢酸塩で処理する。
【０２５２】17.3 t-BOC テトラマー酸の調製 t-BOC ダイマー活性化エステルおよびダイマー酸トリフ
ルオロ酢酸塩を一般的操作法により結合させ、t-BOC テ
トラマー酸を得る。精製については、C18 逆相シリカゲ
ルクロマトグラフィーで、水およびメタノール（または
トリフルオロエタノール）混合液をトリエチルアンモニ
ウムアセテートによりpHを 7.0に調整したものを用いて
溶出させる方法が、最も効果的である。このようにし
て、活性化エステルとフリーのアミン成分とを結合させ
ることによりどのような長さの鎖も調製され得る。
【０２５３】（実施例18）８−サブユニットカーボネー
ト結合ポリマーの幾何的組み立て DEAEセルロースは Sigma Chemical Co. から購入する。
調製 TLCプレートは EM Science の製品であり、VWR Sc
ientificから購入する。HPLC装置、カラムおよび供給装
置は、Beckman Instruments, Inc. で得られる。
【０２５４】実施例12に記載した方法で調製した所望の
カーバメート結合ダイマー(0.2mmol）を、メタノール／
THF ／氷酢酸（１：１：１）の混合液４mLで室温にて12
時間で処理する。溶媒を真空下で除き、残渣を最小量の
THF に溶解させる。このTHF溶液を大容量のヘキサンに
加え、得られた沈澱物を採取し乾燥する。この酢酸塩を
THF ／エタノール（４／１）混合物に溶解させ、DEAEセ
ルロース（塩基0.8mmol)をこの容器に加える。20分間攪
拌後、不均一な混合物を濾過し、濾液をエバポレート・
乾固する。残渣を最小量のTHF ／エタノール（４：１）
に溶かし、この溶液をヘキサンに加える。固形物を採取
し乾燥する。沈澱操作をもう一度繰りかえす。
【０２５５】所望のＮ−5'−トリチルダイマー(0.1mmo
l）（実施例12で調製される）をDMFで２度エバポレート
し、次いで、DMF を溶媒とし、トリエチルアミン（また
はDMAPまたはＮ−メチルイミダゾール）（触媒量）の存
在下で、ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボーネート(2
mmol）で処理する。３時間後、溶媒をエバポレートし、
残渣をクロロホルムに溶解させる。この溶液を0.01Ｎ水
酸化ナトリウム水溶液で２度、水で１度洗浄し、次に、
Na2SO4で乾燥する。溶媒をロータリーエバポレーターで
除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、
クロロホルム／イソプロパノールまたはメタノール／0・
1 ％ DMA混合液で溶出させる。適当な分画を合併し、エ
バポレート・乾固する。この残渣を最小量のTHF に溶解
させ、そしてこの溶液を過剰量のヘキサンに加える。沈
澱した活性化ダイマーを濾過して集め、真空下で乾燥さ
せる。
【０２５６】上記調製した5'−アミノダイマーヌクレオ
シド（0.11mmol）をDMF で２度エバポレートする。この
活性化ダイマー(0.1mmol）を反応容器に加え、固形物を
DMFに溶解させる。溶液を小容量に濃縮し、終夜放置す
る。溶媒を真空下で完全に除去し、得られた残渣をクロ
ロホルムに溶解させる。この溶液を0.01Ｎ水酸化ナトリ
ウム水溶液で２度、水で１度洗浄し、次に硫酸ナトリウ
ムで乾燥する。溶媒をロータリーエバポレーターで除去
し、残渣を調製TLC プレートにかけて適当なメタノール
／クロロホルム／１％トリエチルアミン溶媒系で溶出さ
せる。テトラマーヌクレオシドを含むバンドを溶離さ
せ、溶媒をエバポレートする。残渣を最小量のTHF に溶
かし、この溶液をヘキサンに加える。沈澱を集め真空下
で乾燥させる。
【０２５７】この実施例の中で挙げた操作法を用い、次
のような転換を行う。所望のＮ−5'−トリチルエトラマ
ーヌクレオシド(0.06 mmol) を、 THF／メタノール／氷
酢酸（１／１／１）で処理し精製して5'−アミノテトラ
マーヌクレオシド（0.05mmol）を得る。他のＮ−5'−ト
リチルテトラマーヌクレオシド(0.05 mmol）をビス（ｐ
−ニトロフェニル）カーボーネートで活性化し、次いで
精製する。この２つのテトラマーを結合させ、処理し、
さらに調製 TLCプレートまたはHPLCクロマトグラフィー
により精製する。クロマトグラフィーで得られる物質を
固形物として単離し、最小量の THFにとかし、ヘキサン
により沈澱させる。そのオクタマー（８量体）ヌクレオ
シドを集め、乾燥させる。
【０２５８】オクタマーを以下で使用するために、次の
ように形成する。
【０２５９】Ｎ−5'−トリチルオクタマーヌクレオシド
を THF／メタノール／氷酢酸（１／１／１）で処理し、
上に挙げた条件で精製する。5'−アミノオクタマーヌク
レオシド（0.01mmol）をピリジン中無水コハク酸（0.02
mmol）で室温にて２時間処理する。溶媒をロータリーエ
バポレーターで除去し、残渣をエタノールで数回エバポ
レートする。残渣を THF／エタノール（３／１）に溶か
し、ヘキサン／ベンゼン混合液（２／１）に加える。固
形物を集め乾燥させる。Ｎ−5'−スクシニル化オクタマ
ーヌクレオシド（0.01mmol）をピリジン／濃アンモニア
（１／１）（１mL）で処理する。終夜放置後、溶媒をロ
ータリーエバポレーターで除去し、残渣をエタノールで
数回エバポレートする。粗固形物を逆相(RP-18) HPLCを
用い精製する。溶出物をエバポレートし、残渣をDMSOに
加え、ヘキサン／ベンゼン（１／１）溶液で沈澱させ
る。固形物を採取し、乾燥させる。
【０２６０】（実施例19）ポリマーの段階的および段階
的／ブロック組み立てに適切な担体に結合した開裂可能
なリンカーの調製：担体の活性化およびリンカーの結合 長鎖アルキルアミン誘導体化制御細孔グラス（Cat.No.2
4875)は、Pierce Chemical Co. から得られる。 2,2−
スルホニルジエタノールおよびジシクロヘキシルカルボ
ジイミドはAldrich Chemical Co.から得られる。
【０２６１】グラス担体のアミノ基（担体１ｇあたり約
40mmol）を、実質的にMatteucci およびCaruthers(J Am
er Chem Soc(1981） 103；3185）の方法により、無水コ
ハク酸と反応させ、フリーのカルボン酸末端を得る。
2,2−スルホニルジエタノール（60重量％水溶液）1/10m
ol を次のようにして乾燥させる。まず、３倍容のジメ
チルホルムアミド(DMF）と混合し、温水浴中で真空下濃
縮して濃いシロップとする。次に同容量のDMF を加えて
濃縮し、濃いシロップとし、さらにこの操作をもう１度
繰り返す。次に、乾燥DMF を加え、最終的に2Mのスルホ
ニルジエタノールを得る。スルホニルジエタノール１ml
およびジシクロヘキシルカルボジイミド 0.2ｇの混合液
を、カルボン酸残基をもつ乾燥制御多孔グラス担体１ｇ
に加え、スラリーを前後左右に動揺させて（攪拌しな
い）室温で終夜混合する。その後、グラス担体をメタノ
ールで充分に洗浄し乾燥する。
【０２６２】（実施例20）エイズ(AIDS)ウイルス染色体
における保存された配列に対する14−サブユニットカー
ボーネート結合ポリマーの調製：固体担体上での段階的
な組立て：第１サブユニットの付加および鎖の伸長 Ｎ−メチルイミダゾール、4−(N,N−ジメチルアミノ）
ピリジン(DMAP)、および 1,8−ジアザビシクロ〔5,4,0
〕ウンデク−７−エン（DBU)は、Aldrich Chemical C
o.で得られる。メチルｐ−ニトロフェニルカーボーネー
トは、メチルクロロフォーメートとｐ−ニトロフェノー
ルとから調製される。
【０２６３】実施例4.2 で調製される2'−デオキシシチ
ジン サブユニット（N4はｐ−ニトロフェネトキシカル
ボニル部分を、5'酸素はジ（ｐ−メトキシ）トリチル部
分(DMT）を、そして3'酸素はｐ−ニトロフェノキシカル
ボニル部分を有する）(0.1mmol）を、最小容量の乾燥テ
トラヒドロフラン(THF）またはジメチルホルムアミドに
溶解させ、実施例19で調製される充分に乾燥した制御多
孔グラス担体（開裂可能なリンカーを有する）0.5 ｇに
加える。触媒（１mmol Ｎ−メチルイミダゾールまたは
0.1mmol DMAPのいずれか）を加え、このスラリーを前後
左右に動揺させて（攪拌しない）２時間にわたり混合す
る。次にこのスラリーを濾過し、固形物を THFで洗浄す
る。
【０２６４】1Mのメチルｐ−ニトロフェニルカーボーネ
ートと0.5MのDMAPとを含む THF２mlを加えて20分間室温
で混合することにより、未反応の水酸基をキャップす
る。その後、グラス担体を THFで洗浄し、濾過する。
【０２６５】ジクロロメタンで担体を洗浄して5'末端の
ジメトキシトリチルを除き、次に、0.2Mジクロロ酢酸ジ
クロロメタン溶液５mlで室温にて５分間処理する。次に
グラス担体をジクロロメタンで洗い濾過する。
【０２６６】次に、実施例１で調製され実施例２で活性
化したサブユニットを同様にして、次の順序で加える：
G,A,T,A,A,C,A,T,T,T,T,T,C,(GはFMOC部分で保護され、
AおよびC はｐ−ニトロフェネトキシカルボニル部分で
保護されている）。
【０２６７】（実施例21）エイズウイルス染色体におけ
る保存された配列に対する19−サブユニットカーバメー
ト結合ポリマーの調製。固体担体上におけるオリゴマー
ブロックの段階的組み立て：第１サブユニットの付加お
よび鎖の伸長 実施例３で調製した5'−アミノ−2', 5'−ジデオキシシ
チジン サブユニット（ 0.2mmol）（ここでN4はベンゾ
イル部分を有し、5'−アミンは、ｐ−メトキシトリチル
部分を有し、3'酸素は、ｐ−ニトロフェノキシカルボニ
ル部分を有する）を最小量の乾燥 THFに溶かし、実施例
19で調製した開裂可能なリンカーを有する乾燥制御細孔
グラス担体0.5 ｇに加える。触媒（１mmolのＮ−メチル
イミダゾールまたは 0.1mmolのDMAP）を加え、このスラ
リーを前後左右に２時間揺動させて混合する。次にスラ
リーを濾過し、固形物を THFで充分に洗浄する。
【０２６８】モノ−ｐ−メトキシトリチルをジクロロメ
タンで洗浄して除き、続いて、 0.2M ジクロロ酢酸のジ
クロロメタン溶液５mlで室温にて１分間処理する。次
に、担体をジクロロメタンで洗浄し、濾過する。１％容
量のジイソプロピルエチルアミンを含む THF３mlで簡単
に洗浄し、5'−アミノ末端をフリーのアミンに変換す
る。これを THFで洗浄し、濾過する。
【０２６９】5'−Ａ−Ｇ−3'配列をもつ3'−ｐ−ニトロ
フェノキシカルボニル−活性化ダイマー（実施例13で調
製される）0.1mmol （グアニンN2は、アセチル部分で保
護され、アデニンN6はベンゾイルまたはｐ−ニトロベン
ゾイル部分で保護されている）を最小量の乾燥 THFに溶
かし、ガラス担体に加え、混合を２時間にわたり行う
（この反応および次のカップリングステップには触媒を
加えない）。次に、スラリーを THFで洗浄し濾過する。
【０２７０】ｐ−ニトロフェニル酢酸２M を含む THFを
２ml加えて20分間室温で混合することにより未反応のア
ミン部分をキャップする。その後、ガラス担体を THFで
洗い、濾過する。
【０２７１】5'−末端のモノ−メトキシトリチルを、前
述のようにジクロロ酢酸により除去する。
【０２７２】実施例17で調製される活性化２量体サブユ
ニット（ここでシトシンの環外の窒素はベンゾイル部分
で保護されており、Ａの環外の窒素はベンゾイルまた
は、ｐ−ニトロベンゾイル部分で保護されている）を同
様にして、次の順序で加える：A-T, C-A, T-A, T-T, T-
T, A-C, A-C, C-A (5'から3'）。
【０２７３】強い非求核塩基（例えば、ＡおよびＣには
ｐ−ニトロフェネトキシカルボニルまたはフェニルスル
ホニルエトキシカルボニルそしてＧにはFMOC）により除
去され得る環外の塩基性窒素保護基を有するサブユニッ
トも、上記操作法によりポリマーを組み立てるために使
用され得る。しかし、これらのどちらか一方の保護基を
有するポリマーは、通常、水酸化アンモニウムで処理す
るよりも DBUで処理することによって脱保護される。
【０２７４】（実施例22）エイズウイルス染色体におけ
る保存された配列に対する19−サブユニットアミド結合
ポリマーの調製。固体担体上におけるオリゴマーブロッ
クの段階的組み立て：第１サブユニットの付加および鎖
の伸長 実施例11.3と同様に調製されるシトシン含有非環状バッ
クボーンサブユニット（ここで、シトシンのＮ４は２
（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル部分を有
し、バックボーンのアミンはｔ−ブトキシカルボニル部
分を有し、そして、カルボキシルは、ｐ−ニトロフェニ
ルエステルの形態である）を最小容量の乾燥THFに溶解
させる。これを、実施例19で調製され、開裂可能なリン
カーを有する乾燥制御細孔グラス担体 0.5ｇに加える。
触媒（１mmolのＮ−メチルイミダゾールまたは 0.1mmol
の DMAP ）を加え、担体を２時間にわたり混合し、濾過
し、固形物を THFで充分に洗浄する。
【０２７５】担体をジクロロメタンで洗浄し、続いて、
20％のトリフルオロ酢酸を含む塩化メチレン５mlで室温
にて30分間処理することにより t-BOCを除去する。担体
をジクロロメタンで洗浄し、濾過する。担体に結合して
いるアミノ末端を、１容量％ジイソプロピルエチルアミ
ンを含む THF３mlで簡単に洗浄しフリーのアミンに変換
し、さらに THFで洗浄する。
【０２７６】実施例17で調製される（アミノ末端）−Ｇ
−Ａ（カルボキシ末端）の配列を有する活性化２量体サ
ブユニット（ここでグアニンのＮ２はFMOC部分を有し、
アデニンのＮ６はｐ−ニトロフェネトキシカルボニル部
分を有し、バックーボンのアミノ末端は t-BOC部分を有
し、そして、カルボキシ末端は、ｐ−ニトロフェニルエ
ステルの形態である） 0.1mmolを最小容量の乾燥 THFに
溶かしてグラス担体に加え、混合を２時間にわたり行う
（この反応および続くカップリングステップでは触媒を
加えない）。その担体を THFで洗浄する。
【０２７７】２M ｐ−ニトロフェニルアセテートを含む
THF２mlを加え、室温で20分間混合することにより未反
応のアミン部分のいずれをもキャップする。その後、グ
ラス担体を THFで洗浄する。
【０２７８】上記のように、末端 t-BOC部分を TFAで除
去し、そして担体を中和する。
【０２７９】続いて、実施例17で調製される２量体サブ
ユニットを次の順序で加える：（Ｃ末端）T-A, A-C, A-
T, T-T, T-T, C-A, C-A, A-C（Ｎ末端）。
【０２８０】環外窒素の保護基〔その保護基は、適切な
求核試薬（例えば、Ｃに対してはベンゾイル、Ａに対し
てはベンゾイルまたはニトロベンゾイル、そしてＧに対
してはアセチルまたはイソブチルにより除去されうる〕
を有するサブユニットも、上の操作法によりポリマーを
組み立てるために使用され得る。しかし、これらのいず
れかの保護基を有するポリマーは、通常、DBU で処理す
るよりもむしろ水酸化アンモニウムで処理することによ
り脱保護される。
【０２８１】（実施例23）ヌクレオシド 3'−O−(p−ク
ロロフェニル−2−シアノエチル)−リン酸の調製 23.1 3'の保護基の付いたヌクレオシドの調製 チミジン、Ｎ−ベンゾイルデオキシアデノシン、Ｎ−ベ
ンゾイルデオキシシチジン、Ｎ−イソブチリルデオキシ
グアノシンおよびそれらの5'−O−（ジ−ｐ−メトキシ
トリチル）5'−ODMT−ヌクレオシド）派生物はファルマ
シア Ｐ−Ｌバイオケミカル（Piscataway, NJ）より入
手する。β−ベンゾイルプロピオン酸とジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（DCCD）は販売会社より入手する。
【０２８２】選択された5'−O−ジメトキシトリチルヌ
クレオシド（１mmol）を、６mlのピリジン中でβ−ベン
ゾイルプロピオン酸（３mmol）およびDCCD（４mmol）と
反応させる。反応混合液を25℃で３時間攪拌し、その後
1.5mlの水を加え、その混合液を25℃で５時間攪拌す
る。反応混合液を濾過し、濾液の蒸発後、エタノールを
用いた数回の共蒸発により残留物からピリジンを除去す
る。精製した残留物を酢酸エチル中に取り、酢酸エチル
を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーを行う。濃
縮した酢酸エチル溶出物をヘキサンで処理し、生成した
3'−O−β−ベンゾイルプロピオニル−ヌクレオシド
（3'−O−βＢ−ヌクレオシド）を沈澱させる。
【０２８３】23.2 ヌクレオシドの活性化 ホスホロジクロル酸ｐ−クロロフェニルはアルドリッチ
（Milwaukee, WI)より入手する。ベンゼンスルホン酸、
テトラヒドロフラン、トリエチルアミン、および３−ヒ
ドロキシプロパンニトリルは販売会社より入手する。
【０２８４】テトラヒドロフラン10ml中３mmolのトリア
ゾールと３mmolのトリエチルアミンおよび 1.5mmolのホ
スホロジクロル酸ｐ−クロロフェニルとの連続反応によ
り、ｐ−クロロフェニルホスホロジトリアゾリドの溶液
を調製する。25℃で10分反応後、乾燥ピリジン２ml中の
選択された5'−ODMTヌクレオシド１mmolをその反応混合
液に加える。長くて２時間、25℃で放置後、混合液を３
mlの無水ピリジン中のベンゼンスルホン酸（４mmol）と
トリエチルアミン（４mmol）の溶液で処理し、続いて３
−ヒドロキシプロパンニトリル（２mmol）を加える。反
応混合液を真空下で４mlに濃縮し、長くて２時間まで25
℃で放置し、次に長くて24時間まで４℃で放置する。０
℃、20mlの５％重炭酸ナトリウム水溶液中へ混合液を注
ぎ、クロロホルムで完全に抽出し、硫酸ナトリウムで抽
出物を乾燥させ、そして溶媒を減圧下で除去することに
より、反応を終結させる。5'−ODMTヌクレオシド3'−O
−（ｐ−クロロフェニル−(2−シアノエチル））−リン
酸生成物を、エーテル、酢酸エチル、およびテトラヒド
ロフランの連続溶出を用いたシリカゲルでのクロマトグ
ラフィーにより得る。
【０２８５】（実施例24）荷重された結合と荷重されて
いない結合とを交互に有するテトラマー調製 ホスホノジクロル酸メチルはアルドリッチから入手す
る。ベンゼンスルホニルテトラゾリドは Stawinski et
al, Nucleic Acids Research (1977) 4 : 353 に従って
調製する。
【０２８６】24.1 二量体の合成 無水テトラヒドロフラン20ml中の1, 2, 4,−トリアゾー
ル（３mmol）とトリエチルアミン（３mmol）を、ホスホ
ノジクロル酸メチル（ 1.2mmol）の存在下で25℃、２〜
10時間反応させることにより、メチルホスホノジトリア
ゾリド溶液を調製する。濾過に続いて、選択された5'−
ODMTヌクレオシド（１mmol）の10ml乾燥ピリジン溶液を
濾液に加え、混合液を８mlまで濃縮し、長くて２時間ま
で25℃で放置する。その溶液に、ベンゼンスルホニルテ
トラゾリド（ 1.2mmol）と選択した3'−ＯβＢヌクレオ
シドを加える。25℃で 2.5時間保温後、−78℃の50％重
炭酸ナトリウムを20ml加えることにより反応を止め、ク
ロロホルムで完全に抽出する。溶媒を硫酸ナトリウムで
乾燥し蒸発させる。その反応はまた、実施例ＩＩからの
3'−Ｏ−PO−（OpCP)(OCE)−保護のヌクレオシドリン酸
から開始して、実質的には前述同様に行ってよい。
【０２８７】24.2 立体異性ホスホン酸メチル二量体の
分離 酢酸エチル：テトラヒドロフラン混合液（０〜 100％テ
トラヒドロフラン）またはクロロホルム／メタノール混
合液（０〜20％メタノール）を用いて、シリカゲル60を
充填したガラスカラムで大気圧で行うシリカゲル・カラ
ムクロマトグラフィーにより、前節で生成した立体異性
二量体を分離する。より速く移動する立体異性体の画分
を合わせ、ヘキサンを加えることによりテトラヒドロフ
ラン溶液から沈澱させる。より遅く移動する立体異性体
はそれ以後用いられない。
【０２８８】24.3 ホスホジエステル／ホスホン酸メチ
ル−連結四量体 それぞれ、選択された２塩基結合、および3'ＯβＤと5'
ODMTの保護基をもつ、第１と第２の立体特異的ホスホン
酸メチル二量体は、おのおの実施例24.1と24.2のように
して調製する。メシチレンスルホニルテトラゾリドは S
tawinski, et al, Nuc Acids Res (1977) 4 : 353に従
って調製する。
【０２８９】純粋な5'ヒドロキシ化合物を得るために第
１の二量体の5'ODMT保護基を除く。第２の二量体のシア
ノエチル基を、１mmolの二量体をピリジン溶液（ 8.5m
l）、水（ 2.9ml）およびトリエチルアミン（ 2.9ml）
と25℃で１時間処理することにより除き、溶媒を蒸発さ
せることにより3'ヒドロキシヌクレオチドを得る。
【０２９０】5'−OH二量体（１mmol）と3'−ヒドロキシ
ヌクレオチド二量体（１mmol）を８mlのピリジン中に溶
解し、メシチレンスルホニルテトラゾリド（３〜６mmo
l）を加えて25℃で 3.5時間処理することにより、二量
体縮合反応を行う。反応混合液を４mlの冷50％ピリジン
水溶液と加え合わせ、80mlの重炭酸ナトリウム水溶液中
に注ぐ。反応生成物をクロロホルムで完全に抽出し、硫
酸ナトリウムでの乾燥および有機溶媒の蒸発の後、メタ
ノール／クロロホルム混合液を用いたシリカゲルで精製
する。溶出させた生成物はヘキサンを用いて沈澱させ
る。3'−O−PO−(OpCP)(OCE)保護基を有する四量体は、
3'−O−PO−(OpCP)(OCE)基を有する二量体から始めて実
質的には同様な方法により調製してもよい。
【０２９１】（実施例25）リンカーアームによるポリマ
ーの固体担体への付着 25.1 二機能性ヘキサンリンカーアームの調製 Dowex 50X ピリジニウム樹脂はバイオ−ラッド（Richmo
nd, CA）から入手し、そして6−アミノヘキサノール、
ジメチルホルムアミドおよび３−ヒドロキシプロパンニ
トリルは販売業者から入手する。6−(2−メチルスルホ
ニル)−エチルｐ−ニトロフェニルカルボネートは Eber
le, et al, Helvetica Chimica Acta (1975) 58 : 210
6 に従って調製する。
【０２９２】二機能性のヘキサンリンカーアーム 6−
(2−メチルスルホニル−エトキシカルボニルアミノ)−
ヘキサノールは、１mlのジメチルホルムアミド中で6−
アミノヘキサノール（１mmol）を2−(メチルスルホニ
ル）エチルｐ−ニトロフェニルカルボネート（１mmol）
と25℃で長くて４時間まで反応させることにより調製す
る。反応混合液を水中に注ぎ、ベンゼンで完全に抽出
し、そのベンゼンを水で洗浄し、その有機溶媒を次に硫
酸ナトリウムで乾燥させ、そして蒸発させてカルバメー
トアルコールを得る。これはメタノール／クロロホルム
溶媒混合液を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによ
り精製する。
【０２９３】25.2 5'−O−(6−アミノヘキシル）のリ
ンカーアームを持つオリゴヌクレオチド類似物の調製。
【０２９４】重炭酸トリエチルアンモニウムとフッ化テ
トラブチルアンモニウムは販売業者から入手する。完全
に保護されているオリゴヌクレオチド類似物は、実施例
ＶＩで記述されているホスホン酸メチル二量体の縮合ス
キームにより調製する。２％のベンゼンスルホン酸を含
む10mlのクロロホルム：メタノール（７：３、v/v)中
に、オリゴヌクレオチド（１mmol）を溶解させ、約40
分、０℃で放置する。反応混合液を５％重炭酸ナトリウ
ム溶液で洗浄し、次に水で洗浄する。クロロホルム層を
硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下で蒸発
させる。その物質をクロロホルムに溶解し、残留物をク
ロロホルム／メタノール混合液を用いてシリカゲルでク
ロマトグラフィーを行って、5'−ヒドロキシオリゴヌク
レオチド化合物を得る。
【０２９５】6−(2−メチルスルホニル)−エトキシ−カ
ルボニルアミノ)−ヘキシルメチルホスホニルトリアゾ
リド（５mmol）のピリジン（10ml）溶液は、実施例25.1
からのカルバメートアルコールを、実施例24.1に述べら
れているようにして調製したメチルホスホノジトリアゾ
リドで処理することにより調製する。この溶液に、前節
の5'ヒドロキシ化合物（１mmol）とベンゼンスルホニル
テトラゾリド（４mmol）を加える。反応を継続し、実施
例24.1のように仕上げる。
【０２９６】残留物をクロロホルム／メタノール溶媒混
合液を用いてシリカゲルでのクロマトグラフィーにかけ
る。保護されたオリゴヌクレオチド（１mmol）を、14ml
の20％酢酸／ピリジン中で、４mlのヒドラジン水和物で
25℃にて16〜24時間処理する。
【０２９７】蒸発後、残留物を30mlのテトラヒドロフラ
ン／ピリジン／水（８：１：１、v/v/v ）中で、0.017M
のフッ化テトラブチルアンモニウムを含む溶液で25℃に
て24時間処理する。この溶液を次に、60mlのピリジン中
50％濃縮水酸化アンモニウムで４℃にて10時間処理す
る。その結果生成するオリゴマーを、0.1M酢酸アンモニ
ウムバッファー、pH 5.8中の水・アセトニトリル混合液
をクロマトグラフィー溶媒として用いた逆相HPLCカラム
で調製する。
【０２９８】25.3 5'−O−(アミノヘキシル)−オリゴ
ヌクレオチド類似物の同体担体への付着 アフィ−ゲル
10はバイオ−ラッド（Richmond, CA) から入手する。10
mlの充填ゲルを、イソプロピルアルコール（３ベッド容
量）、そして次に氷冷脱イオン水（３ベッド容量）で洗
浄する。5'−O−(6−アミノヘキシル）−オリゴヌクレ
オチド（ 150mmol）は、実施例26で述べられているよう
にして調製する。0.1M重炭酸ナトリウムバッファー、pH
8.0、５ml中のオリゴヌクレオチド（150M）を、25℃で
１〜４時間、洗浄したゲルを加えてスラリー化する。そ
の混合液を次に、１mlの１M エタノールアミン：塩酸バ
ッファー（pH 8.0）で処理して、ゲル上のあらゆる未反
応の活性エステルをおおう。そのゲルを、すべてのバッ
ファーが除かれるまで水で洗浄し、0.02％のアジ化ナト
リウムの存在下で４℃で保存する。
【０２９９】（実施例26）試薬担体の調製 アミノメチル化したポリスチレンは、B.A.Mukhitdinov
a, E.E.Eighozin, と G.A.Makhmudova, Izv Akad Nauk
Kaz SSR., Ser Khim (1980) 48により記述されているよ
うに調製する。重炭酸ジスクシンイミドと6−アミノヘ
キサノールはアルドリッチより入手する。
【０３００】アミノメチル化したポリスチレン（１ｇ、
3.0meq/g)を水／アセトニトリル（10ml、３：１ v/v）
中に懸濁し、無水コハク酸（20mmol）を加えて４℃で処
理する。溶液のpHは20％NaOHを加えることにより 6.0に
保つ。溶液のpHを一定にして、反応を24時間続ける。ビ
ーズを濾過し、２N HCl 、水で（洗浄液のpHが中性にな
るまで）洗浄し、ジオキサンで繰り返し洗浄することに
より脱水する。
【０３０１】前節からの（固定した酸性基をもつ）担体
を、アセトニトリル（10ml）中で重炭酸ジスクシンイミ
ド（20mmol）と25℃で24時間反応させる。その担体を濾
過により単離し、固定したスクシンイミドエステルをも
つ担体をアセトニトリルで完全に洗浄する。
【０３０２】前出からの担体をジメチルホルムアミド
（10ml）に懸濁し、6−アミノヘキサノール（20mmol）
を加えて25℃で24時間反応させる。その担体を濾過によ
り単離し、固定したアルコール鎖をもつ担体をジメチル
ホルムアミドで完全に洗浄する 。（実施例27）アミノヌクレオシドの担体へのカップリ
ングの手順 Ｎ−メチルイミダゾール、塩化テトラブチルアンモニウ
ム、フッ化テトラブチルアンモニウム、およびイミダゾ
ールはアルドリッチから入手する。ビス（ｐ−ニトロフ
ェニル）カルボネートはシグマ（St. Louis, MO)から入
手する。
【０３０３】支持化アルコール（10mmol）を、ジメチル
ホルムアミド（30ml）中でカルボニルジイミダゾール
（50mmol）のようなカップリング試薬を加えて25℃にて
３時間反応させる。活性化させた担体を濾過により単離
し、ジメチルホルムアミドで完全に洗浄する。その担体
を30mlのジメチルホルムアミド中に再懸濁し、実施例21
のように調製した選択されたポリカルバメートポリマー
（50mmol）を加えて処理する。３時間後、支持化アルコ
ールを濾過し、ジメチルホルムアミドで完全に洗浄す
る。
【０３０４】選択したプローブは、ARV-2 の ORF-2遺伝
子の8441から8456までの残基を含有する標的配列に特異
的であり、AIDSの病因学的因子（Sanchez-Pescador et
al,Science (1985) 227：484 ）は次の5'−アミノヌク
レオチド（早い導入順）でゲルにカップリングさせるこ
とにより合成する：C, T, G, C, T,C, C, C, A, C, C,
C, C, A, T, C, ここで C, G,およびA はそれぞれ、Ｎ
−(β−(トリメチルシリル）エトキシカルボニル）保護
の5'−アミノ−2', 5'−ジデオキシシチジン、グアノシ
ンおよびアデノシンを表し、またT は5'−アミノ−2',
5'−ジデオキシチミジンを表す。
【０３０５】支持化ポリカルバメート（10mmol）をアセ
トニトリル（30mmol）中に懸濁し、塩化テトラブチルア
ンモニウム（１meq 保護基あたり３mmol）とフッ化カリ
ウム二水和物（１meq 保護基あたり４mmol）を加えて処
理し、50℃で12時間加熱する。この時間の終わりに水
（30ml）を加え、支持化プローブを水で完全に洗浄す
る。保護基を同様な条件で、テトラヒドロフラン中フッ
化テトラブチルアンモニウム（１meq 保護基あたり３mm
ol）で除いてもよい。
【０３０６】（実施例28）BOC 誘導体 4−(N−tert−
ブトキシカルボニル−N−メチルアミノ）−ブチル酸と
してのアミノ基の保護 4−(メチルアミノ)−ブチル酸はアルドリッチから入手
する。ジ−tert−ブチルジカルボネートはピアス（Rock
ford, IL）より入手する。
【０３０７】4−(メチルアミノ)−ブチル酸（10mmol）
をジオキサン／水（30ml、2/1)に溶解し、１N NaOH（10
ml）を加える。この溶液を０℃に冷やし、ジ−tert−ブ
チルカルボネート（11mmol）を攪拌しながら加える。25
℃で30分後、減圧下でジオキサンを除去し、硫酸水素カ
リウムを加えることにより、溶液のpHをpH−2.5 に合わ
せる。水相を酢酸エチルで完全に抽出し、有機層を加え
合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥する。減圧下での溶媒の
除去により遊離酸が得られ、これはクロロホルム／ヘキ
サンからの再結晶化、またはクロロホルム／メタノール
混合液を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーによ
り精製する。
【０３０８】（実施例29）末端ジメチルアミノ基の導
入、イミダゾールへの変換による酸の活性化の一般的手
順、およびアミンとのカップリングの一般的手順 N, N' −カルボニルジイミダゾールはアルドリッチから
入手する。
【０３０９】BOC で保護されたアミノ酸（またはオリゴ
ペプチド酸、１mmol）の溶液を、カルボニルジイミダゾ
ール（１mmol）を加え、−20℃で６時間処理する。この
時期に、実施例30のように調製したジメチルアミン（過
剰）またはオリゴペプチド酸（１mmol）の DMF溶液（１
ml）を−20℃で加え、反応物を次に25℃で12時間攪拌す
る。溶媒を減圧により除去し、残留物をメタノール／ク
ロロホルムを用いたシリカゲルでのクロマトグラフィー
にかけて、N, N−ジメチル 4−(N−tert−ブトキシカル
ボニル−N−メチルアミノ)−ブチルアミドを得る。
【０３１０】（実施例30）N, N−ジメチル 4−(メチル
アミノ)−ブチルアミドのBOC 保護基の除去の一般的手
順 トリフルオロ酢酸はアルドリッチから入手する。（BOC
保護されたオリゴペプチド、１mmolの）N, N−ジメチル
4−(N−tert−ブトキシカルボニル−N−メチルアミノ)
−ブチルアミド（実施例ＸＶ）をトリフルオロ酢酸（５
ml）に溶解し、25℃で１時間攪拌する。溶媒を除去し、
残留物を１N NaOH／飽和 NaCl(1/10）およびクロロホル
ムに分割する。水相をクロロホルムで完全に抽出し、加
え合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で
蒸発させ、遊離アミンを得た。これは、以後のカップリ
ング反応に直接用いることができ、また１％トリエチル
アミンを含むメタノール／クロロホルム混合液を用いて
シリカゲルで精製できる。 カップリングの手順および
BOC非保護配列を用いて、いろいろな長さのポリアミド
を調製してもよい。例えば、4−(N−tert−ブトキシカ
ルボニル−N−メチルアミノ)−ブチリルイミダゾリドと
N, N−ジメチル 4−(メチルアミノ)−ブチルアミドとの
反応により二量体のモノアミドが生成する。BOC 基の除
去、そして他のイミダゾリド等価物とのカップリングに
より三量体のジアミドが生成し、この過程は目的の長さ
が得られるまで繰り返される。
【０３１１】代わりに、4−(N−tert−ブトキシカルボ
ニル−N−メチルアミノ)−ブチリルイミダゾリドを4−
(メチルアミノ)−ブチル酸と反応させ、そしてその結果
生成する二量体の酸をN, N−カルボニルジイミダゾール
で活性化し、遊離アミノオリゴアミドとカップリングさ
せる。
【０３１２】（実施例31）アミド結合のアミンへの還元
のための一般的手順 AG-50およびDowex-50W はバイオ−ラッド(Richmond,C
A）から入手する還元されるべきオリゴマーポリアミド
を、 BOC基を除去するために、一般的手順のようにトリ
フルオロ酢酸で処理する。単離および精製後、テトラヒ
ドロフラン(1ml）中遊離アミン(1mmol）を25℃でテトラ
ヒドロフラン(3ml）中ボラン（アミド残基当り2mmol)溶
液に滴定的に加える。無色の溶液を１時間還流し、０℃
まで冷却し、そして６N HCl(1 ml）で滴定処理する。気
体の放出を全て終えた後、溶液を減圧下で蒸発させて、
テトラヒドロフランを除き、残存する水溶液を AG-50イ
オン交換樹脂にかけ、そして水（10ml）でカラムを洗い
酢酸ナトリウム(0.1-2.0M)と食塩(0.1-2.0M)から成るpH
５のバッファーでポリアミンを溶出させることにより精
製する所望の生成物を含む画分を集めて蒸発させた後、
残留物を１N HCl(４ml）に溶解し、そしてDowex-50W イ
オン交換カラムにかける。水、そして2M HClで洗った
後、生成物は、６N HCl で溶出させ、また減圧下で溶媒
を除去することにより、塩酸塩として回収する。
【０３１３】ポリアミンの一級アミノ基は BOC−誘導体
として保護され、実施例33のようにメチルヨウ化物を用
いてアンモニウム塩に交換される。
【０３１４】（実施例32）ポリアミンへの末端一級アミ
ノ基組込みの一般的手順 ４−アミノブチル酸を BOC−誘導体に交換する。これを
実施例28のようにカルボニルジイミダゾールと反応さ
せ、そして実施例29からの二量体アミドで処理する。実
施例31のような BOC−基の切断と還元によりポリアミン
が生じる。
【０３１５】ポリアミンの一級アミノ基は一般的手順の
ように BOC−誘導体として保護され、実施例33のように
メチルヨウ化物を用いてアンモニウム塩に交換される。
【０３１６】（実施例33）ポリアミンのポリ（第４アン
モニウム）塩（3−アミノプロピル−）−ジメチル(3−
(5'−ジメチルアミノ−1−ナフタレン−スルホニルアミ
ノ)−プロピル)−アンモニウムクロライドへの変換の一
般的手順 メチルヨウ化物とエチルジイソプロピルアミンはアルド
リッチから入手する。ジオキサン／水（３ml、2/1)中の
ビス−(3−アミノプロピル）メチルアミン(1mmol）の溶
液に、１Ｎ NaOH(1ml）を加える。０℃で攪拌しなが
ら、ジ−tert−ブチルジカーボネート(1.1mmol）を加
え、その混合液を25℃で30分攪拌する。塩基性溶液を徹
底的にクロロホルムで抽出し、一緒にした有機相を硫酸
ナトリウムで乾燥させ、蒸発させる。生成物は、無水ジ
メチルホルムアミド（５ml）からの蒸発により乾燥させ
る。残留物を DMFに溶解させ、そして溶液を、25℃で１
時間、メチルヨウ化物（12mmol）で処理する。溶媒を蒸
発させ、そして残留物をトリフルオロ酢酸（５ml）に溶
解させる。１時間後、溶媒を蒸発させ、そして残留物は
ピリジン（５ml）に溶解させる。この溶液にエチルジイ
ソプロピルアミン（１級、２級、および３級アミン官能
基１mmol当り２mmol）を加え、そしてこの溶液を０℃に
て５−ジメチルアミノ−１−ナフタレン−スルホニル
クロライド(0.9mmol）（実施例20のようにして得られた
もの）で処理し、次いでこの混合液を４℃で一晩放置す
ることにより、ダンシル基を導入する。反応生成物を前
節のように、イオン交換クロマトグラフィーにより精製
し、そして塩酸塩として単離する。
【０３１７】代わりに、ダニシル化リポーターを直接ジ
メチルホルムアミド中のメチルヨウ化物で処理し、上記
のようにイオン交換クロマトグラフィーにより精製して
もよい。
【０３１８】（実施例34）フロオロフォア導入の一般的
手順 5−ジメチルアミノ−1−ナフタレン−スルホニルクロラ
イドはアルドリッチより入手する。
【０３１９】０℃で、ピリジン（５ml）中の出発ポリア
ミン（１mmol）の溶液に5−ジメチルアミノ−1−ナフタ
レン−スルホニルクロライド(0.85mmol)を加え、混合液
を４℃で一晩攪拌する。次いでピリジンを25℃、減圧下
で除去し、残留物を１NHCl（５ml）に溶解させ、そして
AG-50Wイオン交換カラムにかける。水（10ml）で洗った
後、生成物を酢酸ナトリウム（0.1-2.0M）と食塩（0.1-
2.0M）から成るpH５のバッファーで溶出させる。生成物
を含む分画を集めて濃縮した後、残留物を水（10ml）に
溶解させ、Dowex-50W(バイオ−ラッド）イオン交換カラ
ムにかけ、水（10ml）と 0.5N HCl(５ml）で洗い、そし
て最終的に生成物を６N HCl で溶出させる。生成物の塩
酸塩を、減圧下での溶媒の除去により得る。
【０３２０】（実施例35）ヘルペスシンプレックス、タ
イプＩおよびＩＩの検出用診断試薬の調製 ヘルペスシンプレックスウイルス、タイプＩおよびＩＩ
の2gＤ遺伝子の位置462 から477 までの16−塩基配列5'
−GCGGGGCTGCGTTCGG−3'は選択された標的配列を含む(L
asky & Downbenko, DNA(1984)３：23）。交互のメチル
ホスフェートホスホジエステル結合から成る相補的試薬
ポリマーは、実質的には実施例23および実施例24の方法
に従い構築する。
【０３２１】ポリマーを5'−O−(6−アミノヘキシル)−
オリゴヌクレオチド類似物に交換し、そして従来のカッ
プリング方法により、Affi−Gel 10固体担体物質にアミ
ノヘキシル スペーサー アームを介してカップリング
させる。
【０３２２】ポリマー／分析物デュプレックスの融解温
度は、5'−GCGGGGCTGCGTTCGG−3'の標的配列を持つ合成
オリゴヌクレオチドを用いて決定する。この標的配列
は、これは購入するかもしくは従来法で構築するのだ
が、アニーリングバッファー（10mM EDTA, 100mMリン酸
ナトリウム、pH7.2)中で実質的に等モル量のポリマーと
混合する（ポリマーが固体担体に付着する前に）。この
溶液を90℃に加熱し、そしてゆっくり室温まで冷やして
アニーリングを行わせる。温度をその後ゆっくり上昇さ
せ、そして吸光度を温度の関数として記録する。融解温
度（Tm）は、全吸光度変化の半分となった点の温度とす
る。
【０３２３】（実施例36）ヘルペスシンプレックスタイ
プＩおよびＩＩの検出 感染領域の皮膚の傷口として取った分析用試料を 0.1ml
のEDTA−界面活性溶液（10mM EDTA 、１％w/v ドデシル
硫酸ナトリウム、pH 7.0）に懸濁し、微量組織破砕器
（Kontes＃K-885470）で簡単にホモジナイズし、そして
そのホモジネートをマイクロフィルター(VWR Scientifi
c ＃28151-807)により遠心濾過する。4.5Mトリクロロ酢
酸ナトリウム 0.5mlを加え、２、３秒以内に 0.6mlエタ
ノールを加える。この調合液を氷浴中に30分間置き、そ
れから10,000ｇで５分間遠心分離する。上澄液を慎重に
デカンテーションして捨て、そして管を80％水性エタノ
ールにより緩やかに洗浄する。ペレットになった物質
（しばしば見えない）を0.05mlのアニーリングバッファ
ー（10mM EDTA, 100mMリン酸ナトリウム、pH7.2)に再懸
濁し、実施例21からの適量の診断試薬に加える（試薬ポ
リマー／分析物のモル比は 100を上まわると見積もられ
る）。アニーリングは、ポリマー／標的のデュプレック
スのTm（実施例35に記載のようにしてあらかじめ決定し
てある）より８℃低い温度で30分間行われ、次いで診断
試薬を２ml容量のアニーリングバッファーで３回洗う。
この洗浄は便宜上、マイクロフィルターにより遠心的に
行われる。洗浄後、診断試薬を、１mgのフルオレセント
−ジ４級アンモニウム リポーター（この合成は実施例
34に記載）を含むリポーター溶液 0.2mlに懸濁する。リ
ポーター溶液は、上述のようにあらかじめ決定してある
適当な濃度のNaClだけを含む。診断試薬は次に、リポー
ターを含まない結合溶液で２ml容量で３回洗う。最後
に、リポーターを２M NaCl 0.1mlで診断試薬から溶出さ
せ、溶出液を分光光度計により螢光を査定する。分析物
を含まない対照試料からの螢光を引いて、初期試料中に
存在する分析物に比例した量的測定を得る。
【０３２４】（実施例37）エイズウイルス検出用診断試
薬の調製 エイズ関連レトロウイルス(ARV-2）の ORF-2遺伝子の位
置8441-8456 の16塩基配列5'−GATGGGGTGGGAGCAG−3'は
選択された標的配列を含有する(Sanchez-Pescador, et
al, Science (1985) 227：484)。カルバメートに結合し
たサブユニットを持つ相補的ポリマーは、実質的には実
施例21に詳細に示した方法により構築される。簡単に言
えば、2'−デオキシリボヌクレオシドdA、dCおよびdG
を、実施例10のように保護する。これらの保護されたヌ
クレオシドとチミジンを、次いで、5'−アミノ誘導体に
変換する。次に重合体の担体を、実施例25または実施例
26にあるように調製し、そしてサブユニットをこれら実
施例に記載の方法によりこの担体に実質的に結合して、
担体----CTGCTCCCACCCCATC−3'の配列を持つ、担体と結
合した保護されたポリマーを得る。最終段階において塩
基の保護基は除去され、所望のカルバメート結合診断試
薬が得られる。
【０３２５】ポリマー／分析物の融解温度は以下のよう
に決定される。 RNA転写物を、標的配列に相補的な配列
を含む一本鎖ポリヌクレオチドから調製する。この標的
含有RNAをアニーリングバッファー（10mM EDTA, 100mM
リン酸ナトリウム、pH7.0)に懸濁し、そして上記の診断
試薬に加える。混合液を90℃まで温め、そしてゆっくり
室温まで冷却して、アニーリングを行わせる。その後、
診断試薬を小さい水ジャケットクロマトグラフィーカラ
ムに置き、これを通してアニーリングバッファーがゆっ
くりとポンプ注入される。遊離 RNAの流出をモンヌーリ
ングしている間、温度をゆっくりと上昇させる。遊離温
度(Tr)は RNAがカラムから溶出される温度である。この
Tr値は、実施例21に記載の濃色シフト法により決定され
る対応Tm値と１℃から数℃違うことがしばしばある。
【０３２６】（実施例38）荷電されていない診断試薬を
用いたシステムで使用される酵素的リポーターの調製 一つの末端に一級アミンを持つポリ陽イオン性テイル
は、実施例14−18に記載のように調製され、その構造は
以下の通りである： この生成物１mmolを、過剰の4−フルオロ−3−と、暗所
で室温にて24時間反応させる。
【０３２７】低光条件下で、溶媒を減圧下で除去し、そ
して固体をヘキサンで粉砕して未反応のフェニルアジド
を除く。次に固体を0.1M NaCl 10mlに懸濁し、そしてカ
コジル酸を加えてpH7.2 に低下させる。次に、５mgのア
ルカリ性ホスファターゼ(SigmaChem Co., ＃P5778)を前
述のテイル溶液１mlに加え、そして高流量の366nm 光を
１時間照射させる。得られたリポーターを多容量のバッ
ファー(0.1M NaCl, 0.05M コカジル酸ナトリウム、pH7.
0)に対して18時間透析して、酵素と結合しない陽イオン
性テイルを除く。ウシ血清アルブミン（１％w/v)とアジ
化ナトリウム（0.02％w/v)を加えて、このテトラ陽イオ
ン性リポーターの酵素部分を安定化させる。このリポー
ター溶液の保存は暗所、４℃で行う。
【０３２８】（実施例39）エイズウイルスの検出 エイズウイルスを含むと思われる血液５mlを遠心分離
し、そして無細胞血清２mlを、0.1mgポリアデニル酸(Si
gma Chem Co.,＃P9403 ）を含む4.5Mトリクロロ酢酸ナ
トリウム８mlに加える。２、３秒後、10mlのエタノール
を加え、そしてこの調合液を30分間氷浴中で冷やし、次
いで10,000ｇで５分間遠心分離する。上澄液を慎重にデ
カンテーションして捨てる。ペレットになった核酸（し
ばしば見えない）を80％水性エタノールで洗浄し、よく
排水し、そして 0.1mlのアニーリングバッファー（10mM
EDTA, 100mMリン酸ナトリウム、pH7.2)に再懸濁する。
これを、実施例37からの適当量の診断試薬に加える。
（ポリマー／標的のモル比は 100を上まわると見積もら
れる）。アニーリングは、ポリマー／標的のデュプレッ
クスのTr（実施例37のようにあらかじめ決定してある）
より７℃低い温度で１時間行われ、次いで診断試薬を２
ml容量のアニーリングバッファーで３回洗浄する。この
洗浄は便宜上、マイクロフィルターにより遠心的に行わ
れる。
【０３２９】洗浄後、診断試薬を実施例38の調製された
酵素的−テトラ陽イオン性リポーター溶液の 0.2mlに懸
濁する。30秒後、診断試薬を、リポーターを含まない結
合溶液２ml容量で３回洗浄する。その後、診断試薬を展
開液（15mM ｐ−ニトロフェニルホスフェート、0.5mM
MgCl, 1.0Mジエタノールアミン、pH9.8)に懸濁し、37℃
で３時間保温する。リポーターにより生ずるｐ−ニトロ
フェノールを分光光度計で定量する。分析物を欠く対照
試料の対応吸光度を引いて初期試料に存在する分析物に
比例する量的測定を供する。
【０３３０】本発明を特別な実施態様に関して述べた
が、本発明からはずれることなく種々の変化や改変がな
されうることは正しく評価されよう。例えば、診断試薬
は、多種の担体結合ポリマーを含んでよく、ここで各種
は、異なる分析物からのポリヌクレオチド鎖中の異なる
選択された標的配列に結合するように設計されている。
あるいは、診断試薬は２種の担体結合ポリマーを含んで
よく、ここで各種は、デュプレックス分析物の異なる相
補鎖に結合するように設計されている。これらの多量の
試薬は、１つの診断テストにおいて１つ以上の分析物の
検出能を提供し、また単一のデュプレックス分析物の検
出感度を倍増させる可能性をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のポリマー分子を形成する際に
用いられるより好ましいプリン構造およびピリミジン構
造を示す。
【図２】図２は、このポリマー分子を形成する際に用い
られるより好ましいプリン類似物認識部分およびピリミ
ジン類似物認識部分を示す。
【図３】図３は、このポリマー分子を形成する際に用い
られるより好ましい環状バックボーン部分を示す。
【図４】図４は、このポリマー分子を形成する際に用い
られるより好ましい非環状バックボーン部分を示す。
【図５】図５は、5Aおよび5Bによって、N1----N2タイプ
のサブユニットバックボーンをカップリングするための
２つのより好ましいサブユニット組立てスキームを例示
している。
【図６】第６図は、図５の5Aおよび5Bに例示の方法に従
って形成されたＤ−Ｄを介したサブユニットダイマーＡ
−Ａのバックボーン構造を示し、かつ7Aおよび7Bに例示
の方法に従って形成された２つの環状バックボーン構造
を示す。
【図７】図７は、7A〜7Cによって、N1----Ｅタイプのサ
ブユニットバックボーンをカップリングするための３つ
のより好ましいサブユニット組立てスキームを例示して
いる。
【図８】図８は、図７の7A〜7Cに例示の方法に従って形
成されたサブユニットダイマーのより好ましい非環状バ
ックボーン構造を示す。
【図９】図９は、ホスホトリエステル連鎖のかわりに、
メチルホスホネートバックボーン連鎖を有するテトラヌ
クレオチド類似物の合成を示す。
【図１０】図10は、固体担体へのスペーサーアーム分子
の付加反応を例示している。
【図１１】図11は、 N−メチルアミノ酸からポリアミン
を合成する一般的な方法を示す。
【図１２】図12は、末端１級アミノ基を有するポリアミ
ンの合成方法を示す。
【図１３】図13は、末端１級アミノ基を有する４級アン
モニウムカチオンテイルの調製を示す。
【図１４】図14は、本発明の一実施態様に従って、複数
の荷電を有する酵素レポーターの調製のための反応を例
示する。
【図１５】第15図は、本発明の一実施態様に従って、２
価の螢光レポーターの調製のための反応を例示する。
【図１６】第16図は、診断システムおよび本発明方法に
包含される種々の成分を例示する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 19/16 19/173 21/00 21/04 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/566

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 選択された標的塩基配列を含む一本鎖の
    ポリヌクレオチド分析物を確定するための診断用系であ
    って、該系は、診断用試薬およびレポーター分子を有
    し、 該診断用試薬は、固体担体と該担体に付着した多数のポ
    リマーとからなり、 (1) 該ポリマー分子は、選択された結合条件下で標的塩
    基配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに結合し；非単独
    重合体で分枝してなく；実質的に立体規則性であり；次
    の構造を有し： 【化１】 ここで、(a)Ｒ1〜Ｒnは、該標的配列の対応内部配列塩
    基に、ワトソン／クリック対により結合するのに効果的
    なプリン、プリン類似、ピリミジンおよびピリミジン類
    似の複素環物から選択された認識部分であり、(b)ｎ
    は、該ポリマー分子と該標的配列との間で形成されるワ
    トソン／クリック水素結合の総数であり少なくとも約１
    ５であり、(c)Ｂは、主として実質的に非荷電でかつア
    キラルな連鎖により連結され得るバックボーン部分であ
    り、(d)ユニットバックボーン長は５から７原子の範囲
    であり、そして該バックボーン部分が次の基から選択さ
    れる環状構造を有し： 【化２】 (e) 該バックボーン部分は該認識部分と該標的配列の対
    応する内部配列塩基との間を水素結合させ得る位置に該
    認識部分を支持し；そして該選択された条件下で該分析
    物のバックボーン電荷密度よりも実質的に小さいバック
    ボーン電荷密度を有する、そして (2) 該レポーター分子は、オリゴカチオン性テイルおよ
    び一つもしくはそれ以上のレポーター基から成り、該テ
    イルは、該テイルが該ポリマーのわずかしか密に荷電し
    ていないか、もしくは非荷電のバックボーンに結合しな
    いあらかじめ選択された条件下で該ポリヌクレオチド分
    析物の荷電したバックボーンに静電的に結合するように
    適用され、該レポーター基は該テイルに付着し、該レポ
    ーターの存在を検出する信号を生じるよう適用されてい
    る、 診断用系。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の診断用系であって、前
    記レポーター中のテイルがポリヌクレオチド分析物のバ
    ックボーン中の隣接リン酸基間の空間にほぼ相当する間
    隔で正電荷の基を含む、診断用系。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の診断用系であって、前
    記テイルが次の式を有するオリゴカチオン性部分を含
    む、診断用系： ---N+(R1)(R2)-(CH2) n-m--N+(R3)(R4)(R5) ここで、 nは２〜５、 m＞０、そして、おのおののR1〜
    R5は水素もしくはアルキル基である。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の診断用系であって、前
    記レポーター中のレポーター基が一つもしくはそれ以上
    の螢光、発色団、酵素、もしくは放射性同位体基を含
    む、診断用系。
  5. 【請求項５】 選択された標的塩基配列を含むポリヌク
    レオチド分析物の確定方法であって、該方法は、以下の
    工程： (1) 固体担体および該担体に付着した多数のポリマー分
    子からなる診断用試薬を準備する工程、ここで、該ポリ
    マー分子は、選択された結合条件下で標的塩基配列を含
    む一本鎖ポリヌクレオチドに結合し；非単独重合体で分
    枝してなく；実質的に立体規則性であり；次の構造を有
    し： 【化３】 ここで、(a)Ｒ1〜Ｒnは、該標的配列の対応内部配列塩
    基に、ワトソン／クリック対により結合するのに効果的
    なプリン、プリン類似、ピリミジンおよびピリミジン類
    似の複素環物から選択された認識部分であり、(b)ｎ
    は、該ポリマー分子と該標的配列との間で形成されるワ
    トソン／クリック水素結合の総数であり少なくとも約１
    ５であり、(c)Ｂは、主として実質的に非荷電でかつア
    キラルな連鎖により連結され得るバックボーン部分であ
    り、(d)ユニットバックボーン長は５から７原子の範囲
    であり、そして該バックボーン部分が次の基から選択さ
    れる環状構造を有し： 【化４】 (e) 該バックボーン部分は該認識部分と該標的配列の対
    応する内部配列塩基との間を水素結合させ得る位置に該
    認識部分を支持し；そして該選択された条件下で該分析
    物のバックボーン電荷密度よりも実質的に小さいバック
    ボーン電荷密度を有する、工程、 (2) 該選択された条件下で該診断用試薬と分析物含有試
    料とを混合して、該分析物を試薬ポリマーに配列特異的
    に結合させる工程、 (3) レポーターを準備する工程、ここで、該レポーター
    はオリゴカチオン性テイルおよび一つもしくはそれ以上
    のレポーター基から成り；該テイルは、該テイルが該ポ
    リマーのわずかしか密に荷電していないか、もしくは非
    荷電のバックボーンに結合しないあらかじめ選択された
    条件下で該ポリヌクレオチド分析物の荷電したバックボ
    ーンに結合するように適用され；該レポーター基は該テ
    イルに付着し；そして該レポーターの存在を検出する信
    号を生じるよう適用されている、工程、 (4) 該レポーターを該選択された条件下で該試薬に加え
    る工程、 (5) 該レポーターを加える前もしくは後もしくは前およ
    び後に該試薬を未結合物質から分離する工程、および (6) 分析物に結合したレポーターのレポート信号を確定
    する工程、 を包含する、方法。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の方法であって、前記混
    合が、二価のカチオンキレート剤の存在下でかつ該二重
    鎖分析物の融点以上の温度で、約 0.2M の一価のカチオ
    ンよりも小さい選択されたイオン強度にてなされる、方
    法。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載の方法であって、該方法
    が、さらに所定温度でレポーター試料結合ポリヌクレオ
    チドへの適当な結合が起きる最も高い塩濃度であるよう
    なあらかじめ選択された条件を確立することを含む、方
    法。
  8. 【請求項８】 選択された標的塩基配列を含む一本鎖の
    ポリヌクレオチド分析物を確定するための診断用系であ
    って、該診断用系は、診断用試薬およびレポーター分子
    を有し、 該診断用試薬は、固体担体と該担体に付着した多数のポ
    リマーとからなり、 (1) 該ポリマー分子は、選択された結合条件下で標的塩
    基配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに結合し；非単独
    重合体で分枝してなく；実質的に立体規則性であり；次
    の構造を有し： 【化５】 ここで、(a)Ｒ1〜Ｒnは、該標的配列の対応内部配列塩
    基に、ワトソン／クリック対により結合するのに効果的
    なプリン、プリン類似、ピリミジンおよびピリミジン類
    似の複素環物から選択された認識部分であり、(b)ｎ
    は、該ポリマー分子と該標的配列との間で形成されるワ
    トソン／クリック水素結合の総数であり少なくとも約１
    ５であり、(c)Ｂは、主として実質的に非荷電でかつア
    キラルな連鎖により連結され得るバックボーン部分であ
    り、(d)ユニットバックボーン長は５から７原子の範囲
    であり、そして該バックボーン部分が次の環状構造を有
    し： 【化６】 (e) 該バックボーン部分は該認識部分と該標的配列の対
    応する内部配列塩基との間を水素結合させ得る位置に該
    認識部分を支持し；そして該選択された条件下で該分析
    物のバックボーン電荷密度よりも実質的に小さいバック
    ボーン電荷密度を有する、そして (2) 該レポーター分子は、オリゴカチオン性テイルおよ
    び一つもしくはそれ以上のレポーター基から成り、該テ
    イルは、該テイルが該ポリマーのわずかしか密に荷電し
    ていないか、もしくは非荷電のバックボーンに結合しな
    いあらかじめ選択された条件下で該ポリヌクレオチド分
    析物の荷電したバックボーンに静電的に結合するように
    適用され、該レポーター基は該テイルに付着し、該レポ
    ーターの存在を検出する信号を生じるよう適用されてい
    る、 診断用系。
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