RU2124522C1 - Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, способ их получения - Google Patents
Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, способ их получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2124522C1 RU2124522C1 SU5060823A RU2124522C1 RU 2124522 C1 RU2124522 C1 RU 2124522C1 SU 5060823 A SU5060823 A SU 5060823A RU 2124522 C1 RU2124522 C1 RU 2124522C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- oligonucleotide
- complexes
- covalently bound
- reaction
- Prior art date
Links
- SNEQERIKROHWTM-UHFFFAOYSA-N CC(C(C)OC1(C)CP(C)(O)=O)C1OP1(C)(CC1)O Chemical compound CC(C(C)OC1(C)CP(C)(O)=O)C1OP1(C)(CC1)O SNEQERIKROHWTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 0 CC(C(C)OC1(C)CP(C*)(O)=O)C1OP(C*)(CC=C)=O Chemical compound CC(C(C)OC1(C)CP(C*)(O)=O)C1OP(C*)(CC=C)=O 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биоорганической химии. Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота общей формулы I и II, где R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов, R', R", R"' -остатки нуклеиновой кислоты, n = 3-12, могут использоваться для изучения механизмов действия ферментов нуклеинового обмена в энзимологии. Соединения формулы I и II получают выдержкой эквимолекулярной смеси нуклеиновой кислоты и активного олигонуклеотидного зонда в водном буферном растворе в условиях устойчивости комплементарного комплекса при рН 6,0-9,0. Использование в качестве активных олигонуклеотидных зондов олигодезоксирибонуклеотидов (III-V) позволяет исключить дополнительную стадию введения реакционноспособной группы и повысить селективность образования комплексов I и II. 3 c. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к получению ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, содержащих ковалентную связь в определенном месте нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты (НК), общей формулы:
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов
R', R'', R''' - остатки нуклеиновой кислоты;
которые могут использоваться в качестве новых аналогов субстратов для изучения механизмов действия ферментов нуклеинового обмена в энзимологии; в структурно-функциональных исследованиях белков и нуклеиновых кислот; в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот; а также в других различных молекулярно-биологических исследованиях биополимеров.
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов
R', R'', R''' - остатки нуклеиновой кислоты;
которые могут использоваться в качестве новых аналогов субстратов для изучения механизмов действия ферментов нуклеинового обмена в энзимологии; в структурно-функциональных исследованиях белков и нуклеиновых кислот; в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот; а также в других различных молекулярно-биологических исследованиях биополимеров.
Аналогами сходной структуры являются ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота типа (III):
где
R - остаток олигодезоксирибонуклеотида;
R', R'' - остатки нуклеиновой кислоты;
B - остатки гетероциклических оснований G, C, A.
где
R - остаток олигодезоксирибонуклеотида;
R', R'' - остатки нуклеиновой кислоты;
B - остатки гетероциклических оснований G, C, A.
Указанные соединения (III) образуются при взаимодействии алкилирующих производных олигонуклеотидов (IV) с комплементарными участками НК по следующей схеме [I]:
Недостатком ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК типа (III) является то, что при образовании этих соединений происходит алкилирование гетероциклических оснований, входящих в состав НК, что приводит к повышению лабильности N-гликозидных связей. В результате этого процесса возможно выщепление алкилированных гетероциклических оснований из полинуклеотидной цепи с последующим ее разрушением [2], что ограничивает сферу применения указанных соединений.
Недостатком ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК типа (III) является то, что при образовании этих соединений происходит алкилирование гетероциклических оснований, входящих в состав НК, что приводит к повышению лабильности N-гликозидных связей. В результате этого процесса возможно выщепление алкилированных гетероциклических оснований из полинуклеотидной цепи с последующим ее разрушением [2], что ограничивает сферу применения указанных соединений.
Для получения соединений типа (III) проводят реакцию между НК и комплементарным ее участку алкилирующим производным олигонуклеотида в 10 мМ трис HCl (pH 7,6), содержащем 0,1 М NaCl и 1 мМ EDTA, при 10 - 25oC в течение 0,5 - 3 суток. Выходы целевого продукта достигают 70 - 90%. При этом алкилированию подвергаются остатки гетероциклических оснований, отстоящих на 1 - 3 нуклеотида от конца комплементарного дуплекса.
Недостатком описанного способа получения является то, что используемые в реакции алкилирующие производные олигонуклеотидов (IV) обладают высокой реакционной способностью, приводящей к снижению ее селективности [3]. Кроме того, алкилированию подвергаются как остатки гуанина, так и остатки цитидина и аденина полинуклеотидной цепи, что приводит к образованию смеси продуктов ковалентного присоединения алкилирующих производных олигонуклеотидов к НК [4] . Это может затруднять интерпретацию результатов, полученных при использовании такого рода соединений для решения различных молекулярно-биологических задач. Еще одним недостатком является то, что синтез алкилирующих производных олигонуклеотидов представляет собой достаточно трудоемкий многостадийный процесс, требующий использования дорогостоящих и труднодоступных реагентов [5].
Задача изобретения - получение ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК общей формулы
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов
R', R'', R''' - остатки нуклеиновой кислоты;
отличающихся от аналога (III) легкостью получения, более высокой селективностью образования ковалентной связи и возможностью ее избирательного расщепления с образованием исходных соединений, что делает эти соединения более доступными и удобными для практического использования и расширяет сферу их применения, и разработка способа их получения.
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов
R', R'', R''' - остатки нуклеиновой кислоты;
отличающихся от аналога (III) легкостью получения, более высокой селективностью образования ковалентной связи и возможностью ее избирательного расщепления с образованием исходных соединений, что делает эти соединения более доступными и удобными для практического использования и расширяет сферу их применения, и разработка способа их получения.
Поставленная задача достигается тем, что эквимолярную смесь нуклеиновой кислоты и активного олигонуклеотидного зонда выдерживают в водном буферном растворе в условиях устойчивости комплементарного комплекса при pH 6,0 - 9,0 с последующим выделением образующихся продуктов. Вместо алкилирующих производных олигонуклеотидов используются специально сконструированные олигонуклеотидные зонды, несущие активированную фосфатную группу, связанную с 3'-, 5'- или одновременно с 3', 5'-концами олигонуклеотида через гибкое спейсерное звено (V - VII).
RO-X-Y (V)
Y-X-OR (VI)
Y-X-ORO-X-Y- (VII)
где
R и X те же, что и для соединений (I) и (II)
Соединения (V - VII) получают в процессе автоматического синтеза олигонуклеотидов на полимере, содержащем β-этилсульфоновые группы, путем постадийных конденсаций стандартных мономерных компонентов амидофосфитного синтеза олигонуклеотидов, используя наряду с ними диметокситритильные производные O-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов алифатических гликолей и 1,2-дидезокси-D-рибофуранозы, причем эти производные добавляют либо (и) вначале постадийной конденсации, либо (и) в конце ее, а в качестве активирующих зонд соединений используют 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид или N-оксибензотриазол.
Y-X-OR (VI)
Y-X-ORO-X-Y- (VII)
где
R и X те же, что и для соединений (I) и (II)
Соединения (V - VII) получают в процессе автоматического синтеза олигонуклеотидов на полимере, содержащем β-этилсульфоновые группы, путем постадийных конденсаций стандартных мономерных компонентов амидофосфитного синтеза олигонуклеотидов, используя наряду с ними диметокситритильные производные O-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов алифатических гликолей и 1,2-дидезокси-D-рибофуранозы, причем эти производные добавляют либо (и) вначале постадийной конденсации, либо (и) в конце ее, а в качестве активирующих зонд соединений используют 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид или N-оксибензотриазол.
В отличие от аналога (III), образование ковалентной связи происходит селективно при взаимодействии активированной фосфатной группы зонда с пространственно сближенной межнуклеотидной фосфатной группой НК в месте, непосредственно примыкающем к двуспиральному участку олигонуклеотидный зонд - НК, а введение в качестве ковалентной связи замещенной пирофосфатной дает возможность направленного контролируемого расщепления указанных комплексов по этой связи с образованием исходных соединений и тем самым использовать предлагаемые соединения для зондирования активных центров ферментов нуклеинового обмена и их аффинной модификации.
Соединения (I) и (II) получаются при взаимодействии активированной концевой фосфатной группы олигонуклеотидных зондов с пространственно сближенной межнуклеотидной фосфатной группой комплементарного участка НК по схеме:
или
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
R', R'', R''' -остатки нуклеиновой кислоты;
X - спейсерная группы;
Y - активирующая фосфат группа.
или
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
R', R'', R''' -остатки нуклеиновой кислоты;
X - спейсерная группы;
Y - активирующая фосфат группа.
Реакция протекает при выдерживании смеси НК и комплементарного ее участку активного олигонуклеотидного зонда, растворенных в эквимолярных соотношениях в водных буферных растворах при pH 6,0 - 9,0. При этом образуется замещенная пирофосфатная межнуклеотидная связь. Выход целевого продукта достигает 75%.
Отличие предлагаемого способа получения ковалентно-связанных комплексов (I) и (II) от способа получения аналога (III) состоит в использовании более простых по конструкции и способу получения компонентов реакции - активных олигонуклеотидных зондов, а также тем, что данную реакцию проводят в более широком интервале pH (6,0 - 9,0).
Использование этих зондов позволяет получать ковалентно-связанные комплексы с новым типом ковалентной связи. При этом исключается дополнительная стадия введения реакционноспособной группы, представляющей собой аналог азотистого иприта, который является достаточно дорогостоящим и труднодоступным препаратом. Это делает предлагаемые ковалентно-связанные комплексы более доступными и расширяет сферу их применения. Особенность конструкции олигонуклеотидных зондов дает возможность получать ковалентно-связанные комплексы с двумя ковалентными связями - одновременно по 3'- и 5'-концам олигонуклеотидных зондов и повысить селективность их образования, что также расширяет сферу применения этих соединений. Образование замещенной пирофосфатной связи в процессе получения ковалентно-связанных комплексов дает возможность их контролируемого избирательного расщепления под действием нуклеофильных агентов, в том числе и нуклеофильных групп ряда аминокислот, входящих в активные центры белков нуклеинового обмена, и тем самым открывает перспективы аффинной модификации и более детального изучения последних.
Предлагаемый способ получения ковалентно-связанных комплексов позволяет существенно расширить интервал значений pH, в котором возможно протекание данной реакции, вплоть до 9,0. Важно отметить, использование таких значений pH невозможно для аналога, поскольку в этом случае наблюдается гидролиз гликозидной связи с последующим разрушением углеводофосфатного остова нуклеиновых кислот [2].
Совокупность указанных отличительных признаков позволяет упростить процесс, сократить длительность приготовления ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК, снизить их стоимость за счет использования недорогостоящих компонентов.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Синтез
0,04 о.е. смеси эквимолярных количеств олигонуклеотидного зонда (X) (см. таблицу) и гептадекануклеотида
d(GTAAAACGACGGCCAGT) (IX)
(суммарная нуклеотидная концентрация 10-3 М) обрабатывали 0,2 М раствором КДИ в морфолиноэтансульфонатном буфере (pH 6,0), содержащем ионы двухвалентного металла, при 10oC в течение 2 суток. Контроль за ходом реакции осуществляли методом гель-электрофореза в 20% полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 7 М мочевину. Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей, образующихся при получении ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК приведена на фиг. 1. Выделение продуктов реакции из реакционной смеси проводили элюцией с ПААГ. Выход целевого продукта составил 75% (см. таблицу).
Синтез
0,04 о.е. смеси эквимолярных количеств олигонуклеотидного зонда (X) (см. таблицу) и гептадекануклеотида
d(GTAAAACGACGGCCAGT) (IX)
(суммарная нуклеотидная концентрация 10-3 М) обрабатывали 0,2 М раствором КДИ в морфолиноэтансульфонатном буфере (pH 6,0), содержащем ионы двухвалентного металла, при 10oC в течение 2 суток. Контроль за ходом реакции осуществляли методом гель-электрофореза в 20% полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 7 М мочевину. Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей, образующихся при получении ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК приведена на фиг. 1. Выделение продуктов реакции из реакционной смеси проводили элюцией с ПААГ. Выход целевого продукта составил 75% (см. таблицу).
Образование ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотидных зондов (XI - XV) с гептадекануклеотидом (IX) под действием КДИ проводили аналогично. Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей приведена на фиг. 1. Выходы целевых продуктов приведены в таблице. Снижение температуры до 0oC не оказало существенного влияния на выходы образующихся продуктов.
Пример 2
0,1 о. е. олигонуклеотидного зонда (X) растворяли в 10 мкл 50% водного раствора диметилформамида (ДМФА). К раствору добавляли 2 М раствор N-оксибензотриазола в 50% ДМФА и 7 мг КДИ. Реакцию проводили в течение 2,5 ч при 8oC. Синтезированный с количественным выходом N-оксибензотриазоловый эфир выделяли высаживанием 2% раствором перхлората лития в ацетоне и затем к нему добавляли эквимольное количество гептадекануклеотида (IX), растворенного в N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этаносульфонатном буфере (pH 8,75), содержащем ионы двухвалентного металла. Смесь инкубировали при 10oC в течение 2 суток. Контроль за ходом реакции и выделение продуктов осуществляли как в примере 1. Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей, образующихся при получении ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК приведена на фиг. 2. Выход целевого продукта составил 50% (см. таблицу).
0,1 о. е. олигонуклеотидного зонда (X) растворяли в 10 мкл 50% водного раствора диметилформамида (ДМФА). К раствору добавляли 2 М раствор N-оксибензотриазола в 50% ДМФА и 7 мг КДИ. Реакцию проводили в течение 2,5 ч при 8oC. Синтезированный с количественным выходом N-оксибензотриазоловый эфир выделяли высаживанием 2% раствором перхлората лития в ацетоне и затем к нему добавляли эквимольное количество гептадекануклеотида (IX), растворенного в N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этаносульфонатном буфере (pH 8,75), содержащем ионы двухвалентного металла. Смесь инкубировали при 10oC в течение 2 суток. Контроль за ходом реакции и выделение продуктов осуществляли как в примере 1. Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей, образующихся при получении ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК приведена на фиг. 2. Выход целевого продукта составил 50% (см. таблицу).
Образование ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотидных зондов (XI - XV) с гептадекануклеотидом (IX) методом N-оксибензотриазоловых эфиров проводилось аналогично. Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей приведена на фиг. 2. Выходы целевых продуктов приведены в таблице.
Пример 3
Синтез соединения (XVII) под действием КДИ и методом N-оксибензотриазоловых эфиров проводили как описано в примерах 1 и 2 соответственно, используя в реакциях олигонуклеотидный зонд (XIII) (см. таблицу) и комплементарный ему 20-звенный олигонуклеотид d(ATGCGTTGTTCCATACAACC) (XVIII). Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей приведена на фиг. 3. Выход целевого продукта достигал 40%.
Синтез соединения (XVII) под действием КДИ и методом N-оксибензотриазоловых эфиров проводили как описано в примерах 1 и 2 соответственно, используя в реакциях олигонуклеотидный зонд (XIII) (см. таблицу) и комплементарный ему 20-звенный олигонуклеотид d(ATGCGTTGTTCCATACAACC) (XVIII). Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей приведена на фиг. 3. Выход целевого продукта достигал 40%.
Пример 4
Синтез
где X=
Синтез соединения (XIX) под действием КДИ и методом N-оксибензотриазоловых эфиров проводили как описано в примерах 1 и 2 соответственно, используя в реакциях олигонуклеотидный зонд (XV) (см. таблицу) и гептадекануклеотид (IX). Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей приведена на фиг. 2. Выход целевого продукта достигал 65%.
Синтез
где X=
Синтез соединения (XIX) под действием КДИ и методом N-оксибензотриазоловых эфиров проводили как описано в примерах 1 и 2 соответственно, используя в реакциях олигонуклеотидный зонд (XV) (см. таблицу) и гептадекануклеотид (IX). Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей приведена на фиг. 2. Выход целевого продукта достигал 65%.
В таблице приведены выходы продуктов реакций образования ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК, полученных при взаимодействии олигонуклеотидных зондов (X - XVI) с комплементарными участками НК.
Испытания ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК
Проведенные исследования по изучению гидролитической устойчивости и свойств синтезированных ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК показали, что эти соединения устойчивы в водных буферных растворах (pH 6,0 - 8,5, 20oC), не содержащих сильных нуклеофилов, по крайней мере в течение 48 часов, а при -20oC могут храниться в течение нескольких месяцев. В то же время в присутствии таких нуклеофилов, как первичные, вторичные и третичные амины происходит расщепление замещенной пирофосфатной связи с образованием исходных соединений по схеме:
При обработке этих соединений 15% водным раствором уксусной кислоты или 0,1 н водным раствором NaOH также наблюдается образование исходных соединений.
Проведенные исследования по изучению гидролитической устойчивости и свойств синтезированных ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК показали, что эти соединения устойчивы в водных буферных растворах (pH 6,0 - 8,5, 20oC), не содержащих сильных нуклеофилов, по крайней мере в течение 48 часов, а при -20oC могут храниться в течение нескольких месяцев. В то же время в присутствии таких нуклеофилов, как первичные, вторичные и третичные амины происходит расщепление замещенной пирофосфатной связи с образованием исходных соединений по схеме:
При обработке этих соединений 15% водным раствором уксусной кислоты или 0,1 н водным раствором NaOH также наблюдается образование исходных соединений.
Свойства полученных ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК иллюстрируются следующими примерами.
Пример 5
0,01 о. е. соединения (VIII) обрабатывали 15% водным раствором CH3COOH при 50oC в речение 2 ч. На фиг. 4. приведен радиоавтограф гель-электрофореза продуктов этой реакции. Гидролиз изучаемого соединения проходил на 10%.
0,01 о. е. соединения (VIII) обрабатывали 15% водным раствором CH3COOH при 50oC в речение 2 ч. На фиг. 4. приведен радиоавтограф гель-электрофореза продуктов этой реакции. Гидролиз изучаемого соединения проходил на 10%.
Пример 6
0,1 о. е. соединения (VIII) выдерживали в 0,1 н NaOH при 20oC в течение 12 ч. Радиоавтограмма гель-электрофореза продуктов этой реакции приведена на фиг. 4. В результате реакции наблюдается количественный гидролиз (VIII) с образованием исходных соединений.
0,1 о. е. соединения (VIII) выдерживали в 0,1 н NaOH при 20oC в течение 12 ч. Радиоавтограмма гель-электрофореза продуктов этой реакции приведена на фиг. 4. В результате реакции наблюдается количественный гидролиз (VIII) с образованием исходных соединений.
Пример 7
0,01 о. е. соединения (VIII) выдерживали в 0,5 М водном растворе этилендиамина (ЭДА) (pH 8,0) при 37oC в течение 1 сут. На фиг. 4 приведен радиоавтограф гель-электрофореза продуктов реакции аминолиза этого соединения. Как видно из этой фиг., при обработке соединения (VIII) ЭДА происходит количественное расщепление модифицированной связи и наблюдается образование ЭДА-производного гептадекануклеотида (IX).
0,01 о. е. соединения (VIII) выдерживали в 0,5 М водном растворе этилендиамина (ЭДА) (pH 8,0) при 37oC в течение 1 сут. На фиг. 4 приведен радиоавтограф гель-электрофореза продуктов реакции аминолиза этого соединения. Как видно из этой фиг., при обработке соединения (VIII) ЭДА происходит количественное расщепление модифицированной связи и наблюдается образование ЭДА-производного гептадекануклеотида (IX).
Пример 8
Аналогичным образом, как описано в примерах 5 и 7, был проведен кислотный гидролиз и аминолиз ковалентно-связанного комплекса олигонуклеотид-НК следующей структуры:
Радиоавтограмма гель-электрофореза продуктов этих реакций
Пример 9
Синтез
0,04 о.е. смеси эквимольных количеств олигонуклеотидного зонда d(AGTGTGGTTAATGATCTACAGTT)pdRp и олигонуклеотидного зонда pdRpd(CACCAATTACTAGATGTCAATAATTT)p32, где
(суммарная нуклеотидная концентрация 10-3 М) обрабатывали 0,2 М раствором КДИ в морфолиноэтансульфонатном буфере (pH 6,0), содержащем ионы двухвалентного металла, при 10oC в течение 2 суток. Контроль за ходом реакции осуществляли методом гель-электрофореза в 20% полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 7 М мочевину. Выделение продуктов реакции из реакционной смеси проводили элюцией с ПААГ.
Аналогичным образом, как описано в примерах 5 и 7, был проведен кислотный гидролиз и аминолиз ковалентно-связанного комплекса олигонуклеотид-НК следующей структуры:
Радиоавтограмма гель-электрофореза продуктов этих реакций
Пример 9
Синтез
0,04 о.е. смеси эквимольных количеств олигонуклеотидного зонда d(AGTGTGGTTAATGATCTACAGTT)pdRp и олигонуклеотидного зонда pdRpd(CACCAATTACTAGATGTCAATAATTT)p32, где
(суммарная нуклеотидная концентрация 10-3 М) обрабатывали 0,2 М раствором КДИ в морфолиноэтансульфонатном буфере (pH 6,0), содержащем ионы двухвалентного металла, при 10oC в течение 2 суток. Контроль за ходом реакции осуществляли методом гель-электрофореза в 20% полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 7 М мочевину. Выделение продуктов реакции из реакционной смеси проводили элюцией с ПААГ.
Пример 10
0,01 о.е. соединения (XXI) обрабатывали 15% водным раствором CH3COOH при 50oC в течение 2 ч. В ходе реакции проходил гидролиз изучаемого соединения с образованием исходных соединений.
0,01 о.е. соединения (XXI) обрабатывали 15% водным раствором CH3COOH при 50oC в течение 2 ч. В ходе реакции проходил гидролиз изучаемого соединения с образованием исходных соединений.
Пример 11
0,1 о.е. соединения (XXI) выдерживали в 0,1 н NaOH при 20oC в течение 12 ч. В результате реакции наблюдается количественный гидролиз (XXI) с образованием исходных соединений.
0,1 о.е. соединения (XXI) выдерживали в 0,1 н NaOH при 20oC в течение 12 ч. В результате реакции наблюдается количественный гидролиз (XXI) с образованием исходных соединений.
Пример 12
0,01 о. е. соединения (XXI) выдерживали в 0,5 М водном растворе этилендиамина (ЭДА) (pH 8,0) при 37oC в течение 1 сут. В результате реакции происходит количественное расщепление модифицированной связи и наблюдается образование ЭДА-производного исходного олигонуклеотида.
0,01 о. е. соединения (XXI) выдерживали в 0,5 М водном растворе этилендиамина (ЭДА) (pH 8,0) при 37oC в течение 1 сут. В результате реакции происходит количественное расщепление модифицированной связи и наблюдается образование ЭДА-производного исходного олигонуклеотида.
Возможность избирательного расщепления полученных ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК является важным преимуществом этих соединений и открывает новые перспективы их использования в молекулярной биологии и генной инженерии. Таким образом, предложенное техническое решение неизвестно из уровня техники, явным образом не следует из него и может быть без изменения использовано в отраслях народного хозяйства.
Источники информации
1. Власов В.В., Кнорре Д.Г., Кутявин И.В., Мамаев С.В., Подуст Л.М., Федорова О.С. Биоорган. химия. 1987, т. 13, N 9, с. 1221 - 1229.
1. Власов В.В., Кнорре Д.Г., Кутявин И.В., Мамаев С.В., Подуст Л.М., Федорова О.С. Биоорган. химия. 1987, т. 13, N 9, с. 1221 - 1229.
2. Шабарова З. А. , Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. М., 1978, с. 360 - 361.
3. Кнорре Д. Г., Зарытова В.Ф., Бадашкеева А.Г., Федорова О.С. Реакционноспособные производные олигонуклеотидов как геннаправленные биологически активные вещества. М.: "Итоги науки и техники". Сер. Биотехнология. 1991. т. 37, с. 1 - 182.
4. Vlasov V.V., Zarytova V.F., Kutiavin I.V, Mamaev S.V., Podyminogin M. A. Nucl. Acids Res., 1986, v. 14, N 10, p. 4065 - 4076.
5. Годовикова Т. С. , Зарытова В.Ф., Халимская Л.М. Биоорганич. химия, 1986, т. 12, N 4, с. 475 - 481.
Claims (3)
1. Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота общей формулы
где R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
R', R'' - остатки нуклеиновой кислоты;
n = 3 - 12.
где R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
R', R'' - остатки нуклеиновой кислоты;
n = 3 - 12.
2. Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота общей формулы
где R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
R', R'', R''' - остатки нуклеиновой кислоты;
n = 3 - 12.
где R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
R', R'', R''' - остатки нуклеиновой кислоты;
n = 3 - 12.
3. Способ получения ковалентно-связанных комплексов общих формул I и II, отличающийся тем, что эквимолярную смесь нуклеиновой кислоты и активного олигонуклеотидного зонда общих формул III, IV и V
RO - X - Y (III)
Y - X - OR (IV)
Y - X - OPO - X - Y - (V)
где R, X имеют вышеуказанные значения, а
выдерживают в водном буферном растворе, содержащем ионы двухвалентного металла, при рН 6,0 - 9,0 и температуре 0 - 10oC с последующим выделением целевых продуктов.
RO - X - Y (III)
Y - X - OR (IV)
Y - X - OPO - X - Y - (V)
где R, X имеют вышеуказанные значения, а
выдерживают в водном буферном растворе, содержащем ионы двухвалентного металла, при рН 6,0 - 9,0 и температуре 0 - 10oC с последующим выделением целевых продуктов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5060823 RU2124522C1 (ru) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, способ их получения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5060823 RU2124522C1 (ru) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, способ их получения |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2124522C1 true RU2124522C1 (ru) | 1999-01-10 |
Family
ID=21612584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5060823 RU2124522C1 (ru) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, способ их получения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2124522C1 (ru) |
-
1992
- 1992-07-10 RU SU5060823 patent/RU2124522C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. S.A. Kuznetsova, M.G. Jvanovskay, L.A. Shabarova, Bioorgan khimija, 16, 219 (1990) 2. L.A. Shabarova, M.G. Jvanovskay, M.G. Isaguliants, FEBS, Lett., 154, 288 (1983). * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5541313A (en) | Single-stranded labelled oligonucleotides of preselected sequence | |
| US5015733A (en) | Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups | |
| US5118802A (en) | DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside | |
| US5118800A (en) | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide | |
| US4876335A (en) | Poly-labelled oligonucleotide derivative | |
| EP0379559B1 (en) | Method and reagents for detecting nucleic acid sequences | |
| JP2528107B2 (ja) | ポリヌクレオチド測定試薬と方法 | |
| EP0135587B1 (en) | Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis | |
| US4849513A (en) | Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups | |
| EP0786468B1 (en) | Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides | |
| JP3544945B2 (ja) | 個体支持体上のポリヌクレオチドの連結アセンブリおよび検出 | |
| EP1247815A2 (en) | Modified oligonucleotides and uses thereof | |
| Hanna et al. | Synthesis and characterization of a new photocrosslinking CTP analog and its use in photoaffinity labeling E. coli and T7 RNA polymerases | |
| KR20140064735A (ko) | 표적 핵산 검출을 위한 방법 및 조성물 | |
| CA2297776A1 (en) | Base analogues | |
| JP2002527523A (ja) | 機能付与したピリミジン誘導体 | |
| RU2124522C1 (ru) | Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, способ их получения | |
| JPH0631310B2 (ja) | 核酸又は核酸フラグメントを固相で酵素的に又は化学的及び酵素的に反応させるための担体及び核酸の固相合成法 | |
| EP0462224B1 (en) | Sequencing nucleic acids using chemiluminescent detection | |
| US6716971B1 (en) | Pteridine nucleotide analogs | |
| US7700289B2 (en) | Method for labeling RNA | |
| EP0244860B1 (en) | Polynucleotide probes and a method for their preparation | |
| RU2117011C1 (ru) | Олигодезоксирибонуклеотиды и способ их получения | |
| EP1112281B1 (en) | Pteridine nucleotide analogs | |
| RU2000300C1 (ru) | Олигонуклеотид в качестве расщепл емого зонда и способ его получени |