RU2117011C1 - Олигодезоксирибонуклеотиды и способ их получения - Google Patents
Олигодезоксирибонуклеотиды и способ их получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2117011C1 RU2117011C1 SU5060802A RU2117011C1 RU 2117011 C1 RU2117011 C1 RU 2117011C1 SU 5060802 A SU5060802 A SU 5060802A RU 2117011 C1 RU2117011 C1 RU 2117011C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dimethoxytrityl
- oligodeoxyribonucleotides
- oligonucleotide
- viii
- ethyl
- Prior art date
Links
- WHLGIGOELCNIQE-UHFFFAOYSA-N CC1C(C)(C)OC(C)(COP(C)(O)=O)C1C Chemical compound CC1C(C)(C)OC(C)(COP(C)(O)=O)C1C WHLGIGOELCNIQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYRBIGVMDRWVES-UHFFFAOYSA-N CC1C(C)(C)OC(C)(CP(C)(O)=O)C1C Chemical compound CC1C(C)(C)OC(C)(CP(C)(O)=O)C1C SYRBIGVMDRWVES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Использование: в качестве активных зондов в структурно-функциональных исследованиях белков и нуклеиновых кислот, в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот или в молекулярно-биологических исследованиях биополимеров. Сущность изобретения: продукт - олигодезоксирибонуклеотиды ф-лы Y'-X'ORO-X-Y, где R - остаток олигодезоксирибонуклеотида, имеющего от 8 до 30 звеньев, X', X - ф-ла 1, 2 или H, n - 2-12, Y', Y - ф-ла 3, 4, причем X и X' не могут одновременно H, и если X(X') - H, то Y(Y') - отсутствует. Реагент 1: 5'-О-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'- О-бета-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфит. Реагент 2: диметокситритильное производное О-бета-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфит алифатических гликолей HO(CH2)nOH. Реагент: 3: 1,2-дидезокси-D-рибофураноза. Условия: постадийные конденсации в присутствии активирующих соединений - 1-этил-3(3'-диметиламмонийпропил)карбодиимида или 1-оксибензотриазола. Структура ф-л 1, 2, 3 и 4
n=2-12
2 с.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.
n=2-12
2 с.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к получению олигодезоксирибонуклеотидов общей формулы:
RO-X-Y (I)
Y-X-OR (II)
Y-X-ORO-X-Y (III)
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
n = 2-12
которые могут использоваться для ковалентного присоединения к природным и синтетическим биополимерам с целью создания новых аналогов субстратов для изучения механизмов действия ферментов нуклеинового обмена в энзимологии; в антисенсовой биотехнологии для ингибирования экспрессии генетического материала в качестве потенциальных противовирусных и противоопухолевых препаратов в структурно-функциональных исследованиях белков и нуклеиновых кислот; в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот; а также в других различных молекулярно-биологических исследованиях биополимеров.
RO-X-Y (I)
Y-X-OR (II)
Y-X-ORO-X-Y (III)
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
n = 2-12
которые могут использоваться для ковалентного присоединения к природным и синтетическим биополимерам с целью создания новых аналогов субстратов для изучения механизмов действия ферментов нуклеинового обмена в энзимологии; в антисенсовой биотехнологии для ингибирования экспрессии генетического материала в качестве потенциальных противовирусных и противоопухолевых препаратов в структурно-функциональных исследованиях белков и нуклеиновых кислот; в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот; а также в других различных молекулярно-биологических исследованиях биополимеров.
Аналогами предложенных соединений, обладающими сходными структурой и свойством ковалентно присоединяться к биополимерам, являются олигонуклеотиды типа (IV):
где
R' - остаток олигодезоксирибонуклеотида.
где
R' - остаток олигодезоксирибонуклеотида.
Указанные соединения (IV) могут ковалентно присоединяться с помощью активной алкилирующей группировки к различным нуклеофилам в реакционной смеси, в том числе к нуклеофильным центрам ДНК, РНК и белков [1].
Недостатком этого типа соединений является их высокая реакционная способность. Это приводит к тому, что алкилированию могут подвергаться нуклеофильные центры буферов (ацетат, фосфат), самих реагентов (IV), а также к снижению селективности реакции ковалентного присоединения (IV) к биополимерам [2]. Активная группа в соединении (IV) представлена аналогом азотистого иприта, являющимся достаточно дорогостоящим и труднодоступным препаратом. Кроме того, отсутствие спейсерной группы ограничивает сферу применения (IV).
Способ получения соединения (IV) заключается в обработке N-метилимидазолидов олигодезоксирибонуклеотидов (IV) хлоргидратом 4-[N-(2-хлорэтил)-N-метиламиино]бензиламина [3]. Реакция протекает по следующей схеме:
Сами олигодезоксирибонуклеотиды
получают постадийной конденсацией мономерных компонентов олигонуклеотидного синтеза, осуществляемой по стандартной методике на модифицированном силикагеле. Для получения соединения (VI) олигодезоксирибонуклеотид (V) переводят в триэтиламмониевую (для дитетрануклеотидов) или цетилтриэтиламмониевую (для более длинных олигодезоксирибонуклеотидов с длиной нуклеозидных звеньев более 4) соли, поскольку реакцию проводят в безводных органических растворителях. Выход целевого соединения (IV) составляет 75-80%.
Сами олигодезоксирибонуклеотиды
получают постадийной конденсацией мономерных компонентов олигонуклеотидного синтеза, осуществляемой по стандартной методике на модифицированном силикагеле. Для получения соединения (VI) олигодезоксирибонуклеотид (V) переводят в триэтиламмониевую (для дитетрануклеотидов) или цетилтриэтиламмониевую (для более длинных олигодезоксирибонуклеотидов с длиной нуклеозидных звеньев более 4) соли, поскольку реакцию проводят в безводных органических растворителях. Выход целевого соединения (IV) составляет 75-80%.
Недостатком описанного способа получения является то, что особенность конструкции модифицированного силикагеля, на котором проводятся постадийные конденсации мономерных компонентов олигонуклеотидного синтеза, не позволяет вводить активную группировку на 3'-концевую фосфатную группу олигодезоксирибонуклеотида, а также одновременно на 3'- и 5'-концевые фосфатные группы. Другим недостатком является наличие дополнительной стадии перевода олигодезоксирибонуклеотидов в триэтил- или цетилтриэтиламмониевые соли с целью получения их N-метилимидазолидов (V), поскольку эту реакцию проводят в безводной органической среде. Кроме того, ковалентное присоединение активной группировки осуществляется после синтеза олигодезоксирибонуклеотида с выходом 75-80%.
Задача изобретения - получение олигодезоксирибонуклеотидов общей формулы
RO-X-Y (I)
Y-X-OR (II)
Y-X-ORO-X-Y (III)
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
n = 2-12
в качестве активных зондов, отличающихся от аналога большей легкостью получения, более высокой гидролитической устойчивостью и наличием спейсерной группы, что делает эти зонды более доступными и удобными для практического использования и расширяет сферу их применения, и разработка способа их получения.
RO-X-Y (I)
Y-X-OR (II)
Y-X-ORO-X-Y (III)
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
n = 2-12
в качестве активных зондов, отличающихся от аналога большей легкостью получения, более высокой гидролитической устойчивостью и наличием спейсерной группы, что делает эти зонды более доступными и удобными для практического использования и расширяет сферу их применения, и разработка способа их получения.
Соединения (I-III) получаются путем введения через спейсерное звено на 5'- либо (и) 3'-конец олигонуклеотида активированной фосфатной группы. Образующиеся активные олигонуклеотидные зонды превосходят по гидролитической устойчивости аналог (IV), что обеспечивает стабильность соединений при работе с ними. Наличие спейсерной группы увеличивает эффективность ковалентного присоединения активных зондов к биополимерам и позволяет осуществить их селективное взаимодействие с комплементарными участками нуклеиновых кислот, которое протекает с образованием ковалентной связи.
Способ получения соединений (I-III) заключается в постадийной конденсации 5'-0-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов, являющихся стандартными мономерными компонентами амидофосфитного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов. Мономерные компоненты вводили в последовательности, заданной структурой олигодезоксирибонуклеотида. Синтез проводили в автоматическом режиме в автомате-синтезаторе по стандартной методике [4] , используя в качестве полимерного носителя специально сконструированный модифицированный полимер, содержащий способные к β -элиминированию в щелочной среде β -этилсульфоновые группы.
Спейсерное звено, содержащее концевую фосфатную группу, вводили либо (и) вначале постадийной конденсации, либо (и) в конце ее, также по стандартной методике, используя его в виде стандартного мономерного амидофосфитного компонента, полученного по следующей схеме:
Выходы на каждой стадии последовательных конденсаций составляли 96-99%.
Выходы на каждой стадии последовательных конденсаций составляли 96-99%.
После окончания конденсаций в процессе удаления защитных групп с синтезированных олигонуклеотидов происходит реакция β-элиминирования, приводящая к получению соединений (VIII), содержащих концевую фосфатную группу, присоединенную к олигонуклеотиду через спейсерное звено, например:
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
Активацию этой фосфатной группы, то есть собственно получение соединений (I-III), проводили путем обработки соединений (VIII) 1- этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимидом, либо N-оксибензотриазолом в присутствии карбодиимида. Реакция протекает в водных буферных растворах (pH 5,0 - 6,0) с количественным выходом.
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;
Активацию этой фосфатной группы, то есть собственно получение соединений (I-III), проводили путем обработки соединений (VIII) 1- этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимидом, либо N-оксибензотриазолом в присутствии карбодиимида. Реакция протекает в водных буферных растворах (pH 5,0 - 6,0) с количественным выходом.
Предложенный способ отличается от известного тем, что в качестве модифицированного силикагеля используют специально сконструированный полимер, содержащий способные к β-элиминированию в щелочной среде β-этилсульфоновые группы, а в качестве мономерных компонентов олигонуклеотидного синтеза берут наряду с 5'-0-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфитами также и диметокситритильные производные 0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов алифатических гликолей или 1,2-дидезокси-D-рибофуранозы, причем последние добавляют либо(и) вначале постадийной конденсации, либо(и) в конце ее, в качестве активирующих зон соединений используют 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид или N-оксибензотриазол, которые присоединяют с количественными выходами в водной среде.
Использование специально сконструированного полимера, содержащего β-этилсульфоновые группы, позволяет вводить спейсерную группу, а, следовательно, и присоединять активирующие зонд соединения как на 3'-, так и одновременно на 3'-, 5'-концы олигодезоксирибонуклеотидов, что имеет важное значение дальнейшего использования активных олигодезоксирибонуклеотидных зондов в различных областях биоорганической химии и молекулярной биологии.
Использование в постадийной конденсации наряду с 5'-0-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитами также и диметокситритильных производных 0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов алифатических гликолей и 1,2-дидезокси-D-рибофуранозы дает возможность в процессе автоматического синтеза олигодезоксирибонуклеотидов вводить спейсерные полиметиленовые группы с различным числом метиленовых звеньев, а поскольку именно к спейсерному звену присоединяется активная группировка, то это придает дополнительную конформационную подвижность этой группировке и тем самым значительно расширяет спектр действия активных зондов (I-III). Использование в качестве активирующих зонд соединений 1-этил-3'(3'-диметиламинопропил)карбодиимида или N-оксибензотриазола позволяет получить активные зонды, отличающиеся от прототипа большей стабильностью и устойчивостью к нуклеофильным центрам буферных растворов и практически не взаимодействующие с нуклеофильными центрами самих реагентов. Кроме того, присоединение этих активирующих зонд соединений проводят в водной среде, что исключает трудоемкую стадию перевода олигодезоксирибонуклеотидов в безводную органическую среду. И, наконец, 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид и N-оксибензотриазол присоединяются к олигодезоксирибонуклеотиду с количественным выходом (в случае прототипа выход составляет 75-80%).
Пример 1.
Синтез
18 мг модифицированного силикагеля, содержащего β-этилсульфоновые группы, обрабатывали 0,2 мл 0,1 М раствора 1-диметокситритил-3-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфита пропиленгликоля и 0,2 мл 0,5М раствора тетразола в ацетонитриле. Далее реакцию проводили в стандартном режиме [5] на автомате-синтезаторе "Виктория-4М". Затем осуществляли постадийные конденсации 5'-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов, используя их в порядке, обусловленном первичной структурой соединения (VII). Выход на каждой стадии конденсации составил 98%. После удаления защитных групп 5'-0-диметокситритильное производное синтезированного олигодезоксирибонуклеотида
выделяли обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) (хроматограф Altex, США; носитель Диасорб C16Б 7 мкм; размер колонки 4•250 мм, в градиенте концентрации (0-40%) ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония (pH 6,5) за 60 мин при температуре 45oC). Удаление диметокситритильной группы проводили 80%-ным водным раствором уксусной кислоты (30 мин). Чистоту полученного соединения
подтверждали обращенно-фазовой и ион-парной ВЭЖХ. Хроматографические характеристики соединения (VIII) представлены в таблице. Чистота соединения (VIII) составила 97%. Его первичную структуру подтверждали секвенированием по методу Максама-Гилберта (анализ нуклеотидной последовательности октануклеотида (VII), электрофорез в 20% ПААГ в 7 М мочевине (фиг. 1). Наличие концевой фосфатной группы подтверждали путем ферментативного гидролиза (VIII) фосфомоноэстеразой. На фиг. 2 - хроматографический профиль элюции продуктов реакции гидролиза модифицированного октануклеотида (VIII) фосфомоноэстеразой (б); профиль элюции смеси продуктов реакции гидролиза (VIII) фосфомоноэстеразой с исходным соединением (VIII) (a). Анализ проводился методом ион-парной ВЭЖХ. Наличие спейсерного триметиленового звена подтверждали сравнением хроматографической подвижности продуктов исчерпывающего гидролиза соединения (VIII) смесью фосфомоноэстеразы ФМЭ (a) и фосфодиэстеразы змеиного яда (ФДЭ) с подвижностью специально синтезированного для этой цели модифицированного нуклеотида - оксипропилового эфира цитидин-3'-фосфата (dCp O(CH2)3OH); гидролизат октаннуклеотида (VIII) + dC*(б); dC*-гидроксипропиловый эфир дезоксирибоцитизин-3'-фосфата. Анализ проводился методом обращено-фазовой ВЭЖХ (фиг. 3). Активированный олигонуклеотидный зонд (VII) получали обработкой олигонуклеотида (VIII) IM раствором N-оксибензотриазола в 40% диметилформамиде (pH 5,0) в присутствии 0,5М 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимида в течение 2,5 ч. при 10oC. Соединение (VII) выделяли из реакционной смеси высаживанием перхлоратом лития в ацетоне. Выход его был практически количественным. На фиг. 4 - хроматографический профиль элюции реакционной смеси, образующейся при получении активного олигонуклеотидного зонда (VII) (a); профиль элюции исходного олигонуклеотидного зонда (VIII) (б). Анализ проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
18 мг модифицированного силикагеля, содержащего β-этилсульфоновые группы, обрабатывали 0,2 мл 0,1 М раствора 1-диметокситритил-3-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфита пропиленгликоля и 0,2 мл 0,5М раствора тетразола в ацетонитриле. Далее реакцию проводили в стандартном режиме [5] на автомате-синтезаторе "Виктория-4М". Затем осуществляли постадийные конденсации 5'-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов, используя их в порядке, обусловленном первичной структурой соединения (VII). Выход на каждой стадии конденсации составил 98%. После удаления защитных групп 5'-0-диметокситритильное производное синтезированного олигодезоксирибонуклеотида
выделяли обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) (хроматограф Altex, США; носитель Диасорб C16Б 7 мкм; размер колонки 4•250 мм, в градиенте концентрации (0-40%) ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония (pH 6,5) за 60 мин при температуре 45oC). Удаление диметокситритильной группы проводили 80%-ным водным раствором уксусной кислоты (30 мин). Чистоту полученного соединения
подтверждали обращенно-фазовой и ион-парной ВЭЖХ. Хроматографические характеристики соединения (VIII) представлены в таблице. Чистота соединения (VIII) составила 97%. Его первичную структуру подтверждали секвенированием по методу Максама-Гилберта (анализ нуклеотидной последовательности октануклеотида (VII), электрофорез в 20% ПААГ в 7 М мочевине (фиг. 1). Наличие концевой фосфатной группы подтверждали путем ферментативного гидролиза (VIII) фосфомоноэстеразой. На фиг. 2 - хроматографический профиль элюции продуктов реакции гидролиза модифицированного октануклеотида (VIII) фосфомоноэстеразой (б); профиль элюции смеси продуктов реакции гидролиза (VIII) фосфомоноэстеразой с исходным соединением (VIII) (a). Анализ проводился методом ион-парной ВЭЖХ. Наличие спейсерного триметиленового звена подтверждали сравнением хроматографической подвижности продуктов исчерпывающего гидролиза соединения (VIII) смесью фосфомоноэстеразы ФМЭ (a) и фосфодиэстеразы змеиного яда (ФДЭ) с подвижностью специально синтезированного для этой цели модифицированного нуклеотида - оксипропилового эфира цитидин-3'-фосфата (dCp O(CH2)3OH); гидролизат октаннуклеотида (VIII) + dC*(б); dC*-гидроксипропиловый эфир дезоксирибоцитизин-3'-фосфата. Анализ проводился методом обращено-фазовой ВЭЖХ (фиг. 3). Активированный олигонуклеотидный зонд (VII) получали обработкой олигонуклеотида (VIII) IM раствором N-оксибензотриазола в 40% диметилформамиде (pH 5,0) в присутствии 0,5М 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимида в течение 2,5 ч. при 10oC. Соединение (VII) выделяли из реакционной смеси высаживанием перхлоратом лития в ацетоне. Выход его был практически количественным. На фиг. 4 - хроматографический профиль элюции реакционной смеси, образующейся при получении активного олигонуклеотидного зонда (VII) (a); профиль элюции исходного олигонуклеотидного зонда (VIII) (б). Анализ проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Аналогично были получены, выделены и охарактеризованы олигонуклеотиды (IX-XIII, XVIII-XX), хроматографические и некоторые другие характеристики которых представлены в таблице, а также их активные N-оксибензотриазоловые эфиры.
Активный олигонуклеотидный зонд (VII') получали обработкой олигонуклеотида (VIII) 0,2М 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимидом. Реакцию проводили в 0,05М морфолиноэтансульфонатном буфере (pH 6,0), содержащем 0,02М MgCl2 в течение 3 ч. при 10oC. Аналогично получали активные производные с карбодиимидом соединений (IX-XIII, XVIII-XX).
Пример 2.
Синтез
На 10 мг полимера проводили синтез указанного олигонуклеотида по стандартной методике, используя в постадийных конденсациях мономерные компоненты амидофосфитного синтеза в порядке, обусловленном первичной структурой соединений (XXI и XXI'). На последней стадии конденсации для введения спейсерного триметиленового звена полимер с олигонуклеотидом обрабатывали по стандартной методике 0,2 мл 0,1М раствором 1-диметокситритил-3-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфита пропиленгликоля и 0,2 мл 0,5М раствором тетразола в ацетонитриле. Далее введение фосфатной группы проводили аналогично с 2-[2-(4-метокситротилокси)этилсульфонил] этил-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфитом. После удаления защитных групп по стандартной методике олигонуклеотид (XIV) выделяли обращенно-фазовой ВЭЖХ (хроматограф Altex, США; носитель Диасорб C16, 7 мкм; размер колонки 4•250 мм, в градиенте концентрации (0-40%) ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония (pH 6,5) за 60 мин при температуре 45oC).
На 10 мг полимера проводили синтез указанного олигонуклеотида по стандартной методике, используя в постадийных конденсациях мономерные компоненты амидофосфитного синтеза в порядке, обусловленном первичной структурой соединений (XXI и XXI'). На последней стадии конденсации для введения спейсерного триметиленового звена полимер с олигонуклеотидом обрабатывали по стандартной методике 0,2 мл 0,1М раствором 1-диметокситритил-3-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфита пропиленгликоля и 0,2 мл 0,5М раствором тетразола в ацетонитриле. Далее введение фосфатной группы проводили аналогично с 2-[2-(4-метокситротилокси)этилсульфонил] этил-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфитом. После удаления защитных групп по стандартной методике олигонуклеотид (XIV) выделяли обращенно-фазовой ВЭЖХ (хроматограф Altex, США; носитель Диасорб C16, 7 мкм; размер колонки 4•250 мм, в градиенте концентрации (0-40%) ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония (pH 6,5) за 60 мин при температуре 45oC).
Активные олигонуклеотидные зонды (XXI) и (XXI') получали путем обработки этого соединения N-оксибензотриазолом и 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимидом, как описано в примере 1.
Пример 3.
Синтез
18 мг модифицированного силикагеля, содержащего β-этилсульфоновые группы, обрабатывали 0,2 мл 0,1 M раствора 1-диметокситритил-3-N,N-дизопропиламидофосфита пропиленгликоля в ацетонитриле. Реакцию поводили в стандартном режиме [5] на автомате-синтезаторе "Виктория 4M". Затем осуществляли постадийные конденсации 5'-0-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-N, N- диизопропиламидофосфитов, используя их в порядке, обусловленном первичной структурой соединений (XXII и XXII'). На последней стадии конденсации проводили повторную обработку 0,2 мл 0,1 M раствора 1-диметокситритил-3-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфита пропиленгликоля в ацетонитриле. Выход на каждой стадии конденсации составил 97%.
18 мг модифицированного силикагеля, содержащего β-этилсульфоновые группы, обрабатывали 0,2 мл 0,1 M раствора 1-диметокситритил-3-N,N-дизопропиламидофосфита пропиленгликоля в ацетонитриле. Реакцию поводили в стандартном режиме [5] на автомате-синтезаторе "Виктория 4M". Затем осуществляли постадийные конденсации 5'-0-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-N, N- диизопропиламидофосфитов, используя их в порядке, обусловленном первичной структурой соединений (XXII и XXII'). На последней стадии конденсации проводили повторную обработку 0,2 мл 0,1 M раствора 1-диметокситритил-3-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфита пропиленгликоля в ацетонитриле. Выход на каждой стадии конденсации составил 97%.
Чистота олигонуклеотида
после удаления защитных групп и последующего выделения методом ВЭЖХ составила 95%. Его структуру подтверждали аналогично тому, как описано в примере 1. В таблице представлены хроматографические и некоторые другие свойства соединения (XV). Аналогично были получены, выделены и охарактеризованы олигонуклеотиды (XVI) и (XVII), характеристики которых также представлены в таблице.
после удаления защитных групп и последующего выделения методом ВЭЖХ составила 95%. Его структуру подтверждали аналогично тому, как описано в примере 1. В таблице представлены хроматографические и некоторые другие свойства соединения (XV). Аналогично были получены, выделены и охарактеризованы олигонуклеотиды (XVI) и (XVII), характеристики которых также представлены в таблице.
Активные олигонуклеотидные зонды (XXII) и (XXII') были получены с количественным выходом путем обработки соединения (XV) N-оксибензотриазолом и 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)-карбодиимидом соответственно, как описано в примере 1.
Испытания активных олигонуклеотидных зондов.
Проведенные исследования по изучению гидролитической устойчивости синтезированных активных олигонуклеотидных зондов показали, что эти соединения устойчивы в водных буферных растворах (pH 6,0-8,5), не содержащих сильных нуклеофилов, по крайней мере в течение 48 ч. Они не вступают во взаимодействие с нуклеофильными группами самих реагентов и компонентов буферных растворов. В то же время в присутствии таких нуклеофилов как первичные, вторичные и третичные амины, фосфат-анион, эти соединения фосфорилируют последние с образованием соответствующих фосфоамидов и пирофосфатов. В качестве нуклеофилов могут выступать функциональные группы аминокислот, пептидов и белков (как N- и C-концы, так и нуклеофильные группы боковых радикалов), нуклеиновых кислот в том случае, когда реагирующие группировки стерически сближены. В результате реакции активный олигонуклеотидный зонд ковалентно присоединяется к биополимерам. Это свойство активных зондов может быть использовано в энзимологии для изучения механизма действия ферментов нуклеинового обмена; в антисенсовой биотехнологии для ингибирования экспрессии генетического материала в качестве потенциальных противовирусных и противоопухолевых препаратов; в структурных исследованиях белков и нуклеиновых кислот; в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, а также в других молекулярно-биологических исследованиях биополимеров.
Свойства активных олигонуклеотидных зондов иллюстрируются следующими примерами.
Пример 4. К 1 о.е. соединения (VII) добавили 50 мкл 1 M водного раствора лизина (pH 9,6). Реакцию проводили при 8oC в течение 6 ч.
Реакционную смесь анализировали ион-парной ВЭЖХ после предварительной гель-фильтрации на биогеле P-2 (200-400 меш). Выход лизинового производного олигонуклеотидного зонда составил 85% (фиг. 5). Природу образующейся фосфоамидной ковалентной связи между зондом и лизином подтверждали путем избирательного гидролиза фосфоамидной связи (15% CH3COOH, 50oC, 40 мин) с последующим сравнением хроматографической подвижности гидролизата с подвижностью исходного олигонуклеотида (VIII). На фиг. 5 - хроматографический профиль элюции реакционной смеси, образующейся при получении лизинового производства олигонуклеотидного зонда (VIII)(а); профиль элюции исходного олигонуклеотидного зонда (VIII)(б); Анализ проводили методом ион-парной ВЭЖХ.
Пример 5. 1 о.е. олигонуклеотидного зонда (VIII) растворили в 50 мкл 0,7 M раствора N-α-бензоил-L-аргиниламида в 35%-ном водном диметилформамиде (pH 6,0), добавили 7 мг 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)-карбодиимида. Реакцию проводили при 8oC в течение 10 ч. Реакционную смесь анализировали так же, как в примере 4. Выход производного аргинина с олигонуклеотидным зондом составил 36% (фиг. 6). Природу образующейся ковалентной связи подтверждали, как в примере 4.
На фиг. 6 - хроматографический профиль элюции реакционной смеси, образующейся при взаимодействии N-α-бензоил-L-аргиниламида с зондом (VIII)(а); профиль элюции исходного зонда (VIII)(б); анализ методом ион-парной ВЭЖХ.
Пример 6. К 1 о.е. соединения (VIII) добавили 50 мкл 1 M раствора лейцилглицина в 40%-ном водном диметилформамиде (pH 7,0). Реакцию проводили при 8oC в течение 10 ч. Реакционную смесь анализировали так же, как в примере 4. Выход производного олигонуклеотидного зонда с лейцилглицином составил 98% (фиг. 7). Природу образующейся ковалентной связи подтверждали, как в примере 4.
На фиг. 7 - хроматографический профиль элюции реакционной смеси, образующейся при получении дипептидного производного зонда (VIII)(а); профиль элюции исходного зонда (VIII)(б); анализ - методом ион-парной ВЭЖХ.
Пример 7. 0,249 о.е. олигонуклеотидного зонда (VII) смешивали с эквимолярным количеством комплементарного олигонуклеотида 5'd(GTAAAACGACGGCCAGT)3', смесь растворяли в 90 мкл 0,2 M водного раствора N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этаносульфоната (pH 8,2), содержащего 0,1 M MgCl2. Реакцию проводили при 10oC в течение 48 ч, реакционную смесь осаждали из раствора 2% перхлоратом лития в ацетоне и анализировали электрофорезом в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7 M мочевину при постоянном напряжении 1000 B. Выход ковалентно-связанного комплекса зонд-олигонуклеотид составил 40%.
На фиг.8 - электрофореграмма реакционных смесей, образующихся в результате ковалентного присоединения октануклеотида TGGCCGTCp-X к гептадекануклеотиду GTAAAACGACGGCCAGT.
1 - 32pGTAAAACGACGGCCAGT,
2 - реакционная смесь, образующаяся при активации фосфатной группы октануклеотида с помощью 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимида
3 - реакционная смесь, образующаяся при активации фосфатной группы октануклеотида с помощью N-оксибензотриазола
Реакцию проводили в течение 2 сут.
2 - реакционная смесь, образующаяся при активации фосфатной группы октануклеотида с помощью 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимида
3 - реакционная смесь, образующаяся при активации фосфатной группы октануклеотида с помощью N-оксибензотриазола
Реакцию проводили в течение 2 сут.
Таким образом, предлагаемое изобретение не известно из уровня техники, явным образом не следует из него и может быть без изменения использовано в отраслях народного хозяйства.
Claims (2)
2. Способ получения олигодезоксирибонуклеотидов по п.1, отличающийся тем, что на модифицированном силикагеле, содержащем β-этилсульфоновые группы, проводят постадийные конденсации 5'-O-диметокситритил-2'-дезоксинуклеодиз-3'-O-β-цианэтил-N,N-диизопропиламинофосфитов и диметокситритильных производных O-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфитов алифатических гликолей общей формулы
HO(CH2)nOHOH,
где n = 1 - 12,
и 1,2-дизезокси-D-рибофуранозы, причем последние добавляют и/или в начале постадийной конденсации и/или в конце ее, а в качестве активирующих зонд соединений, используют 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид или 1-оксибензотриазол.
HO(CH2)nOHOH,
где n = 1 - 12,
и 1,2-дизезокси-D-рибофуранозы, причем последние добавляют и/или в начале постадийной конденсации и/или в конце ее, а в качестве активирующих зонд соединений, используют 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид или 1-оксибензотриазол.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5060802 RU2117011C1 (ru) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | Олигодезоксирибонуклеотиды и способ их получения |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5060802 RU2117011C1 (ru) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | Олигодезоксирибонуклеотиды и способ их получения |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2117011C1 true RU2117011C1 (ru) | 1998-08-10 |
Family
ID=21612576
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5060802 RU2117011C1 (ru) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | Олигодезоксирибонуклеотиды и способ их получения |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2117011C1 (ru) |
-
1992
- 1992-07-10 RU SU5060802 patent/RU2117011C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Иванова Е.М., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г., Попова В.С., Райт А.С., Стефанович Л.Е. Молекулярная биология, 1984, т.18, вып. 3, с. 631 - 619. 2. Кнорре Д.Г., Зарытова В.Ф., Бадашкеева А.Г., Федорова О.С. Реакционноспособные производные олигонуклеотидов как геннанаправленные биологически активные вещества. - М.: Итоги науки и техники, сер. Биотехнология, 1991, т. 37, с. 1-182. 3. Годовикова Т.С., Зарытова В.Ф., Халимская Л.М. - Биоорганическая химия, 1986, т. 12, N 4, с. 475 - 481. 4. Волков Е.М., Романова Е.А., Круг А., Орецкая Т.С., Потапов В.К., Шабарова З.А. Биоорганическая химия, 1988, т. 14, N 8, с. 1034 - 1039. 5. Грязнов С.М., Потапов В.К., Метелев В.Г., Елов А.А., Пурмаль А.А., Шабарова З.А. Биоорганическая химия, 1986, т. 12, N 7, с. 988 - 991. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4876335A (en) | Poly-labelled oligonucleotide derivative | |
EP0135587B1 (en) | Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis | |
US7538192B2 (en) | Process for preparing albumin protein conjugated oligonucleotide probes | |
JP4499141B2 (ja) | 修飾核酸合成用アミダイド及び修飾核酸合成方法 | |
JPH06102670B2 (ja) | 2―置換―3―保護―1,3,2―オキサザホスファシクロアルカン類の合成方法 | |
JPS61293553A (ja) | 新規な担体、担体の製造、新規な中間体生成物、担体のオリゴヌクレオチド合成への使用並びに担体に結合した新規なヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド | |
JP5195757B2 (ja) | 核酸合成用ダイマーアミダイド及び核酸合成方法 | |
JP2002536381A5 (ru) | ||
US20160311845A1 (en) | Nucleotide derivative or salt thereof, nucleotide-derived 5'-phosphate ester or salt thereof, nucleotide-derived 3'-phosphoramidite compound or salt thereof, and polynucleotide | |
CN116143854A (zh) | 一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 | |
EP2739732B1 (en) | Functionalization and purification of molecules by reversible group exchange | |
RU2117011C1 (ru) | Олигодезоксирибонуклеотиды и способ их получения | |
Markham et al. | Rapid chemical synthesis and circular dichroism properties of some 2′-5′-linked oligoriboadenylates | |
US9353142B2 (en) | Protecting group for indole group, nucleic acid-synthesizing amidite and nucleic acid-synthesizing method | |
CN116478226A (zh) | 一种锁核苷帽类似物和应用 | |
US7098326B2 (en) | Methods for the integrated synthesis and purification of oligonucleotides | |
US5688940A (en) | Linker for immobilization, modification and subsequent release of oligomers with a terminal hydroxyl group | |
Hausch et al. | Multifunctional dinucleotide analogs for the generation of complex RNA conjugates | |
US7329515B2 (en) | Solid support for the synthesis of 3′-amino oligonucleotides | |
RU2124522C1 (ru) | Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, способ их получения | |
Chung et al. | Template-directed organic synthesis. A model for the peptidyl transfer reaction of protein biosynthesis | |
US6153742A (en) | General process for the preparation of cyclic oligonucleotides | |
Eriyagama | Non-chromatographic Oligonucleotide Purification and Automated Polyethyleneglycol Synthesis | |
Abramova et al. | Synthesis and properties of nucleic acid methylene carboxamide mimics derived from morpholine nucleosides | |
JP5795819B2 (ja) | インドール基用保護基、並びに核酸自動合成用アミダイド及び核酸合成方法 |