DE3515529A1 - Verfahren zur festphasensynthese von oligonucleotiden definierter sequenz - Google Patents

Description

• Patentbesthreibuna
• In Mikrobiologie, Biochemie und verwandten Gebieten besteht ein großer Bedarf an Polydesoxyribonucleotiden definierter Sequenz, d.h. definierter Abfolge der Mononucleotidbausteine. Die Kettenlänge solcher Biopolymere kann bis zu fünfzig, aber auch wesentlich mehr, bis z.B. über tausend Nucleotide betragen.
• Bisher wurden Oligonucleotide mit mehr als hundert Nucleotidbausteinen entweder enzymatisch aus kurzen, chemisch synthetisierten Fragmenten dargestellt oder durch enzymatische Spalt- und Ve rknüp fungs reaktionen aus natürlichen Desoxyribonucleinsäuren erhalten.
• Diese Verfahren sind jedoch arbeits- und zeitaufwendig.
• Sie führen oft nicht zu den gewünschten Sequenzen.
• Auch auf chemisch-synthetischem Wege sind Oligonucleotide, bestehend aus etwa hundert Nucleotiden und etwas darüber, hergestellt worden.
• Besonders nach dem sogenannten Amiditverfahren lassen sich Oligonucleotide solcher Kettenlänge darstellen.
• Dieses Verfahren wird- bei Festphasensynthesen von Oligodesoxyribonucleotiden vorwiegend verwendet. Hierbei wird ein terminales Nucleosid der zu synthetisierenden Sequenz über eine Abstandhaltergruppe kovalent mit einer Festphase verbunden. Durch sukzessives Ankondensieren jeweils eines Nucleotids oder Dinucleotids wird die gewünschte Sequenz schrittweise aufgebaut. Nach der letzten Kondensation erhält man ein über die Abstandhaltergruppe kovalent mit der festphase verbundenes Oligonucleotid.
• Diese gerhältnisse stellen sich wie folgt dar.
• A= Festphase; B= Abstandhaltergruppe; C= Oligonucleotid mit allen Hydroxy-, Phosphat- und Basen-Schutzgruppen.
• Als Festphase (A) wurden beispielsweise mit Aminogruppen funktionalisierte Polysilikate, Polysaccharide, sulphonierte und aminierte Polysterole sowie andere analog derivatisierte Kunststoffe verwendet.
• Als Abstandhaltergruppe (B), d.h. als funktionelle Gruppe, die die sterischen Wechselwirkungen der Festphase mit den auf ihr synthetisiertn Oligonucleotiden veringern soll, wurden bisher beispielsweise Oligopeptide, Oligoamide und Sulphone verwendet.
• Die bisher verwendeten Abstandhaltergruppen haben meist den Nachteil, daß sie sich nur unter Bedingungen abspalten lassen, unter denen andere Schutzgruppen ebenfalls abgespalten werden.
• Dieser Schverhalt kann wie folgt dargestellt werden:

  A }ciro lyse

  Hydralyse

  l

  yseprodukte der Festphase (A)

  +

  Hydrolyseprodukte der Abstandhaltergruppe (B)

  +

  Hydrolyseprodukte des Oligodesoxyribonucleotids (C)

  mit partiell abgespaltenen Schutzgruppen

  Falls eine Abspaltung unter Erhalt der Schutzgruppen möglich ist, werden aufgrund der bisher verwendeten Abstandhaltergruppen an den abgespaltenen Oligonucleotiden terminale Phosphodiester belassen:

  A

  t

  Hydrolyseprodukte der Festphase (A)

  +

  Hydrolyseprodukte der Abstandhaltergruppe (B)

  +

  Oligonucleotid (C) mit allen Schutzgruppen,

  jedoch mit terminaler Phosphodiestergruppe

  Terminal phosphorylierte Oligonucleotide solcher Art lassen sich mit Hilfe des bekannten Triesterverfahrens zu größeren Molekülen koppeln. Bei diesem Verfahren müssen jedoch gerade bei langkettigen Kopplungskomponenten lange Reaktionszeiten und niedrige Ausbeuten in Kauf genommen werden.
• Ziel der Erfindung war die Vermeidung der geschilderten Nachteile, was erfindungsgemäß durch Verwendung der 4-Carboxyphenoxyacetylgruppe als Abstandhaltergruppe ( Siehe Abb. zwischen den gestrichelten Linien (B')) erreicht wird. Unter Einsatz der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Abstandhaltergruppe (B') lassen sich Oligonucleotide unter Beibehaltung aller Schutzgruppen von der Festphase abspalten, wobei Oligonucleotide mit einer terminalen Hydroxylgruppe entstehen. Diese Verbindungen können vorteilhafterweise als Bausteine für die Festphasensynthese nach dem bevorzugt verwendeten Amiditverfahren eingesetzt werden.
• Diese Verhältnisse können wie folgt dargestellt werden.

  A

  L - I,Hydrolyse

  Hydrolyseprodukte des Abstandhalters

  |Oligonucleotid (C) mit terminaler Hydroxylgruppe

  Oligonucleotide größerer bzw. großer Kettenlänge lassen sich jetzt durch sukzessives Ankondensieren von geschützten Oligonucleotiden mit terminaler Hydroxylgruppe bzw.
• den daraus hergestellten Phosphoramiditen auf einer Festphase nach an sich bekannter Weise darstellen:

  c

  Ankondensieren der mit

  Schutzgruppen versehenen

  Oligonucleotide

  Nach Anspruch 2) vorliegender Erfindung können auch Derivate der 4-Carboxyphenoxyacetylgruppe verwendet werden, wobei an deren aromatischen und (oder) aliphatischen Rest Modifikationen durch Einführung von Substituenten z.B. Halogenen, Nitro-, Alkyl- und Alkoxygruppen vorgenommen werden können. Auch die Substitution der Sauerstoffatome der 4-Carboxyph-enoxyacetylgruppe (Siehe Abb. zwischen gestrichelten Linien) durch Schwefel- und (oder) Selenatome ist mitinbegriffen.
• Die Darstellung der 4-Carboxyphenoxyacetatgnppe zwischen einem terminalen Nucleosid einer zu synthetisierenden Desoxyribonucleotidsequenz und der Festphase (A) ist in der Abb. aufgezeigt. Die 4-Carboxyphenoxyacetylgruppe (Siehe Abb. zwischen gestrichelten Linien) wird durch Reaktion-- eines 3'0-bromacetylierten, 580- und basengeschützten Nucleosids (II) mit einer 4-hydroxybenzoylierten Festphase (III) zwischen beiden Reaktionspartnern gebildet.
• An das entstehende Mononucleosidderivat (I) können nach bekannten Verfahren Nucleotide ankondensiert werden.
• Die Darstellung der 3'0-bromacetylierten, 5'0- und basen-geschützten Desoxyribonucleoside (II) erfolgt durch Umsetzung der 5~0- und basen-gescützten Nucleoside (IV) mit Bromacetylhalogeniden (Va) oder Bromacetanhydrid (Vb).
• Die geschilderten Verhältnisse sind auf der Abb. wiedergegeben.
• Die 4-hydroxybenzoylierte Festphase (Siehe Abb.)(III) entsteht bei der Etherspaltung der Anisoylierten Festphase (VI).
• Die Anisoylierte Festphase (Siehe Abb.) (VI) ist durch Umsetzung der aminierten Trägersubstanzen (A) mit Anisoylhalogeniden (VIIa) oder Anisoylanhydrid (VISb) nach bekannten Verfahren zugänglich.
• RL heterozyklische Base; R"= 5'-O-Schutzgruppe

Claims (2)

1. FestDhasenssntheseilvon Oliqonucleotiden definierter Sequenz PatentansPrüche 1) Festphasensynthese von Oligonucleotiden definierter Sequenz unter Verwendung einer Abstandhaltergruppe, dadurch gekennzeichnet, daß als Abstandhaltergruppe die 4-Carboxyphenoxyacetylgruppe verwendet wird.
2. 2) Verfahren nach Anspruch 1), dadurch gekennzeichnet, daß Derivate der 4-Carboxyphenoxyacetylgruppe Verwendung finden.