KR100393336B1 - 아미노산핵산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법에 사용하기 위해 종래의 올리고뉴클레오티드 보다 우수한 피험체 화합물을 제조하는 하나 이상의 성질을 갖는 다양하고 신규한 올리고뉴클레오티드 유사체를 제공한다. 본 발명의 화합물은 자연발생핵산의 푸라노스고리가 아미노산 또는 변형된 아미노알코올잔기로 치환되는 올리고뉴클레오티드 유사체이다. 본 발명의 신규한 화합물의 몇몇 구체예는 유전자 발현의 안티센스 제어에 특히 유용하다. 본 발명의 화합물은 핵산 혼성화 프로브 또는 프라이머로 사용될 수도 있다. 본 발명의 다른 양태는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체의 단량체적 전구체를 제공하는 것이다. 이들 단량체적 전구체는 피험체 폴리뉴클레오티드 유사체를 합성하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태는 질병 상태의 치료나 예방을 위해 디자인되는 피험체 폴리뉴클레오티드 유사체의 조제물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 질병, 특히 바이러스 감염 및 세포성장장해의 치료나 예방을 위한 방법을 제공하는 것이다. 피험체 질병치료방법은 안티센스 저해제로 사용하기 위한 피험체 폴리뉴클레오티드 유사체의 유효량을 투여하는 단계로 이루어진다.

Description

아미노산 핵산
유전자 발현을 저해하기 위해서 수소결합에 의해 상보적 핵산(즉 센스 가닥)에 특이적으로 서열결합하는 올리고뉴클레오티드는 통상 안티센스 올리고뉴클레오티드로 언급된다. 이들 합성 올리고뉴클레오티드는 표적(mRNA)에 결합되고 이로써 전령 RNA의 번역을 저해한다. 이 안티센스 원리는 (Uhlmann, E. et al.,Chem. Reviews, 1990, 90,543-584; 및 Stein, C. A. et al.,Cancer Res., 1998, 48,2659-2688) 유전자 발현을 조절하는데 사실상 사용된다. 이 안티센스 원리는 유전자 발현을 저해할 뿐만 아니라 활성화시키기 위해 실험실에서 사용되었다. Zam-ecnik 및 Stephenson이 치료목적을 위해 합성올리고뉴클레오티드의 사용을 1978년에 최초로 제안하였다(Stephenson, M. L.; 및 Zamecnik, P. C.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75,280 및 285). 안티센스 폴리뉴클레오티드의 특이적 저해는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 바이러스 핵산의 복소환식 염기들 사이의 특이적인 왓슨-크릭 염기쌍에 기초한다. 올리고뉴클레오티드와 상보적 핵산의 결합방법을 혼성화라고 부른다. 질병의 진행에 필요한 단백질을 암호화하는 mRNA에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고머가 특히 관심이 있다. mRNA에 특이적으로 혼성화시킴으로써 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 합성이 저해될 수 있다.
비변형된 올리고뉴클레오티드, 즉, DNA구조를 갖는 올리고뉴클레오티드의 제조는 지난 십년간 많은 연구그룹에서 관심있는 핵심이었다. 포스파이트트리에스테르 방법으로서 Letsinger(Letsinger, R.L.; 및 Lunsford, W. B.,J. Amer. Chem. Soc., 1976, 98,3655)에 의해 처음으로 도입된, Caruthers(McBride, L,J.; 및 Caruthers, M. H.,Tetrahedron Letts., 1983. 24,245)에 따른 포스포르아미디트를 통한 합성이 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 현재 가장 효과적인 방법이다. 정상, 즉 비변형된 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드로 사용되면 뉴클레아제에 불안정하고 막침투가 불충분한 문제가 생겼다. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 번역을 저해시킬수 있기 위해서 비변경된 세포 내부에 도달해야 한다. 안티센스 저해에 사용될 올리고뉴클레오티드에 유용한 성질은: (i) 세포외- 및 세포내 효소에 대한 올리고뉴클레오티드의 안정성; (ii) 세포막을 통하여 침투할 수 있는 능력; 및 (iii) 표적 DNA 또는 RNA를 혼성화시킬 수 있는 능력을 포함한다 (Agarwal, K. L. et al.,Nucleic Acids Res., 1979, 6,3009; Agawal, S. et al.,Proc Natl Acad ScI. USA 1998, 85,7079). 따라서 안티센스로 사용 또는 프라이머나 혼성화 프로브로 사용하는데 우수한 성질을 갖는 폴리뉴클레오티드 유사체를 제공하는 것에 관심이 있다.
변형된 폴리뉴클레오티드가 과거에 합성되었고 이들 폴리뉴클레오티드 변형은 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트, 다양한 아미데이트 및 핵산종의 당부분을 포함한다. 이들 골격치환은 어느정도로 증강된 안정성을 주지만 결합에서 키랄인을 결과하는 결점을 가져 2n부분입체이성체(여기서 n은 올리고머에서 변형된 디에스테르 결합수)의 형성을 초래한다. 이들 다수의 부분입체이성체의 존재는 표적서열에 혼성화되는 변형된 올리고뉴클레오티드의 능력을 약화시킨다. 또한 이들 치환중 몇몇은 음전하를 제공하는 능력을 보유하고 전하를 띤 기의 존재는 세포막을 침투하는 화합물의 능력을 저하시킨다. 결합의 정밀성에 의존하여 이들 변형결합과 연합된 많은 다른 결점이 있다.
당변형을 함유하는 어떤 올리고뉴클레오티드 유사체가 합성되었다. (데옥시)리보스 핵산의 이전에 사용된 당변형은 a -DNA, 단일(homo) DNA, 모르폴리노와 티오 뉴클레오시드 및 펩티드핵산(PNA)을 포함하여 개선된 구조, 특히 개선된 세포 흡수성을 갖는 구조로 파악된 것을 제공하였다. 그런 유사체에 도달하기 위한 일반 합성도는 5가 또는 3가중 한 산화상태에서 인원자와 중합체의 담체 또는 서열특정화된 3'-뉴클레오티드 중 하나에 결합된 뉴클레오티드나 뉴클레오시드의 1차 히드록실기를 포함하였다. 특이적 결합방법은 포스파이트트리에스테르(포스포르아미디트), 인 디에스테르 및 포스폰산수소 방법으로 언급되었다. 시판용 단량체 및 중합체의 담체-결합된 단량체는 보호된 인원자와 같이 보호된 염기(G,A,C,T,U 및 다른 복소환)를 갖는 그런 방법에 유용하여 결합과정중에 저장을 허용하고 비특이적 반응을 방지한다.
변형당, 비이온성 골격 또는 비환식 폴리아미드(PNA)를 함유하고 유전자 조절에 유용한 하나 이상의 다음 성질들을 어느 정도로 갖는 핵산종이: 이중의 안정성(혼성화 효율), 증가된 표적특이성, 뉴클레아제에 대한 안정성, 개선된 세포흡수성, 및 핵산의 중요한 중지 사건(예를들면 RN아제 H활성, 촉매적 절단, 혼성화 중지 등등)에의 조력을 증강시킨다. 카보네이트디에스테르를 사용하는 것도 제안되었다. 그러나, 이들 화합물은 매우 불안정하며 카보네이트 디에스테르결합은 포스포디에스테르 중의 인에 의해 나타낸 정사면체 배치를 유지하지 못한다. 유사하게, 키랄이 아닌 카르바메이트 결합은 삼각형 대칭을 부여하고 이 결합을 갖는 폴리dT가 폴리dA와 강하게 혼성화되지 않는 것을 나타내었다 (Coull, J. M. et al.,Tetrahedron Lertts., 1987, 28, 745; Stirchak, E. P. et al.,J. Org. Chem., 1987, 52, 4202).
보다 최근에, 비환식 당 유사체의 기록이 문헌에 나타났다(Augustyns, K. A. et al.,Nucleic Acids Res., 1991, 19,2587-2593). 올리고뉴클레오티드로 이들 비환식 뉴클레오시드의 통합은 올리고머내에 세워진 링커수에 의존하여 Tm에서의 저하를 야기하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 효소학적으로 안정하고 상보적 서열과 염기쌍을 형성한다는 것이 발견된다. 폴리뉴클레오티드와 공지된 폴리뉴클레오티드 유사체가 결점이 있으므로, 올리고머를 사용하는 다른 기술 및 안티센스 저해에 사용하기 위한 새로운 폴리뉴클레오티드 유사체를 제공하는 것에 관심이 있다.
당과 골격성분 둘다를 변형시키려는 시도는 치료 및 다른 방법으로 사용하는데 어떤 결점을 갖는다. 따라서, 효과적인 치료, 진단 및 조사도구가 유용해지기전에 이들 품질의 매우 향상된 개선이 필요해진다. 따라서, 약학적 화합물로서 올리고뉴클레오티드의 개선된 올리고머 유사체에 대한 필요성을 오랫동안 느껴왔다.
본 발명은 신규한 올리고뉴클레오티드 및 그것의 구조적 전구체를 제공하는데, 이것은 뉴클레아제 분해에 대해 개선된 내성을 갖고 생리적 상태하에서 안정성을 증가시키며 세포침투를 증강시킬수 있게 중성 또는 양성전하를 띨수 있다. 더욱이, 본 발명의 신규한 올리고뉴클레오티드는 핵산 혼성화 표적과 관련하여 혼성화 성질을 개선시켰다.
본 발명의 올리고머는 일반적으로 서열 특이적 방법으로 표적 핵산에 복소환식 염기를 결합시키는데 적당한 일련의 강요된 (constrained) 링커 또는 단량체로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 올리고머로 통합될 때 본문에서 기술된 강요된 링커는 단일 수소결합보다 훨씬 큰 힘을 가질수 있어 이로써 결합에 적당한 구조의 형성을 촉진한다.
본 발명의 핵단량체(nucleomonomer)는 일반적으로, 자연발생 뉴클레오티드에서 발견되는 푸라노스고리를 아미노산이나 변형된 아미노알코올잔기로 대치하는 부분이나 잔기를 특징으로 한다. 본 발명의 단량체와 올리고머의 예들은 식 1 내지 식 41에 나타낸다. 본문에 기술된 이들 단량체의 올리고뉴클레오티드로의 통합은 개선된 성질을 갖는 화합물 합성을 허용하며, 이들 개선된 성질은 (i) 포스포디에스테르 결합과 연합된 전하 제거로부터 결과되는 증가된 친유성 (Dalge, J. M. et al.,Nucleic Acids Res., 1991, 19, 1805) 및 (ii) 뉴클레아제 같은 효소에 의한 분해에 대한 내성을 포함한다. 이들 단량체를 함유하는 올리고머는 표적서열과 혼성화하는데 상당히 안정하고 하나 이상의 적용에서 비변형된 뉴클레오시드 잔기보다 우수할 수 있다.
본 발명은 푸라노스고리가 부족한 폴리뉴클레오티드 유사체에 관한 분야이다.
도 1 내지 도 25는 본 발명 단량체와 올리고뉴클레오티드 합성에 사용할 수 있는 화학반응순서를 나타낸다. 보다 구체적으로,
도 1은 티민과 세린올 사이의 -CH2-CO-결합을 갖는 L-세린올 결합 티민단량체 포스포르아미디트 합성을 나타낸다.
도 2는 티민과 세린올 사이의 -CH2-CH2-결합을 갖는 L-세린올 결합 티민단량체 포스포르아미디트 합성을 나타낸다.
도 3 및 도 4는 티민과 세린올 사이의 -CH2-CO-결합을 갖는 치환된 L-세린올 결합 티민단량체 포스포르아미디트 합성을 나타낸다.
도 5는 티민과 세린올 사이의 -CH2-CO-결합을 갖는 뉴클레오티드간 결합중앙에 히드록실아민을 갖는 5원자길이 뉴클레오티드간 결합을 갖는 T-T 이량체의 합성을 나타낸다.
도 6은 티민이 -CH2-CO-결합을 통하여 N-에틸히드록실아민에 연결되는 티민단량체 포스포르아미디트의 합성을 나타낸다.
도 7은 L-세린의 NH2기가 2-히드록시아세틸기에 연결되고 히드록시작용이 DMT기로 차단되는 L-세린올결합 티민단량체 포스포르아미디트의 합성을 나타낸다. 이 건축 블록은 2'-5'연결에 사용된다. 또한 이 도는 L-세린의 NH2기가 2'-히드록시에틸작용에 연결되는 티민 단량체의 합성도 나타낸다.
도 8은 2'-5'결합으로 히드록사메이트 골격을 갖는 T-T이량체 합성을 나타낸다. 이 이량체에서 한 건축 블록은 L-아스파르트산 및 티민에서 제조되고 다른 것은 L-세린 및 티민에서 제조된다. 이 이량체는 골격에서 2개의 추가 아미드 결합을 갖는다.
도 9는 2'-5'결합으로 히드록사메이트 골격을 갖는 T-T이량체 합성을 나타낸다. 이 이량체에서 한 건축 블록은 L-아스파르트산 및 티민에서 제조되고 다른 것은 L-세린 및 티민에서 제조된다. 이 이량체는 골격사이에서 아미드 결합이 부족하다.
도 10은 β-알라닌이 티민과 세린올에 결합되는 L-세린올-b-알라닌 결합 티민단량체 포스포르아미디트의 합성을 나타낸다.
도 11은 티민과 세린올에 결합되는 알킬아민을 갖는 L-세린올-알킬아민 결합 티민 단량체 포스포르아미디트의 합성을 나타낸다.
도 12는 4'-5'결합으로 히드록사메이트 골격을 갖는 T-T이량체 합성을 나타낸다. 이 경우에, 이량체는 티민과 아스파르트산 사이에 아세틸 링커를 갖는 2개의 L-아스파르트산 유니트와 2개의 티민유니트에서 제조된다.
도 13는 4'-5'결합으로 히드록사메이트 골격을 갖는 T-T이량체 합성을 나타낸다. 이 경우에, 이량체는 티민과 아스파르트산 사이에 에틸 링커를 갖는 2개의 L-아스파르트산 유니트와 2개의 티민유니트에서 제조된다.
도 14는 N-히드록시아미노산 결합된 티민 건축 블록의 합성을 나타낸다.
도 15는 티민과 아스파르트산 사이에 N-히드록실아민 링커를 갖는 L-아스파르트산 결합된 티민 건축 블록의 합성을 나타낸다.
도 16은 4'-5'결합으로 히드록사메이트 골격을 갖는 T-T이량체 합성을 나타낸다. 이 경우에, 카르복실산기는 N-히드록실아민 링커를 통하여 티민 건축 블록에 결합된다.
도 17은 티미딘아세트산 치환된 N-히드록시아미노산 건축 블록 150과 그 유사체 149 합성을 나타낸다. 이들 단량체 건축 블록은 히드록사메이트 골격을 갖는 핵산을 생산하는데 유용하다.
도 18은 아미노산 건축 블록 157 및 158을 함유하는 티미딘아세트산 치환된 히드록실아민의 합성을 나타낸다. 이들 단량체는 히드록실아민 작용기로 아미드 골격을 갖는 핵산을 디자인하는데 유용하다.
도 19는 티민과 세린올 사이에 히드록실아민 부분을 갖는 L-레신올 결합된 티미딘 건축 블록 166의 합성을 나타낸다. 이 건축 블록은 4'-5' 결합의 핵산을 생산하는데 유용하다.
도 20은 글루탐산-글리신 결합된 티미딘 단량체 174의 합성을 나타낸다. 이 단량체 건축 블록은 아미드 골격과 2'-5' 결합을 갖는 핵산을 생산하는데 유용하다.
도 21은 티민과 글리신을 사이에 히드록실아민부분을 갖는 글리신올-글리신 결합된 티미딘 건축 블록 181 및 182의 합성을 나타낸다. 이들 건축 블록은 2'-5' 결합의 핵산을 제조하는데 유용하다.
도 22 내지 도 24는 리보스 아미노산 결합된 티미딘 건축 블록 191, 199 및207의 합성을 나타낸다. 이들 건축 블록은 리보스-아미드 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 유용하다.
도 22는 리보스-아미드 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드 211의 고체상 합성을 나타낸다.
도 26은 1-0-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-[아미노(티민일아세틸)]-L-프로판-3-0-(N,N-디이소프로필)-β-시아노에틸포스포르아미디트의 합성을 나타낸다.
도 27은 1-0-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-[아미노(티민일아세틸)]-D-프로판-3-0-(N,N-디이소프로필)-β-시아노에틸포스포르아미디트의 합성을 나타낸다.
도 28은 2-[(β-(4,4'-디메톡시트리틸)-O-아세틸)아미노)-3-티민일-L-프로판-1-O-(N,N-디이소프로필)-β-시아노에틸포스포르아미디트의 합성을 나타낸다.
도 29는 N-(티민일아세틸)-N-[(2-이소부티릴)옥시]에틸]-0-벤질히드록실아민의 합성을 나타낸다.
도 30은 (2R,4S)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-[N3-벤조일(티민-1-일)]메틸-4-프탈리미도-피롤리딘의 합성을 나타낸다.
발명의 개요
본 발명은, 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법에 사용하기 위하여 피험체화합물을 종래의 올리고뉴클레오티드 보다 우수하게 하는 하나 이상의 성질을 갖는 다양한 신규의 올리고뉴클레오티드 유사체를 제공한다. 본 발명의 화합물은 자연 발생하는 핵산의 푸라노스고리가 아미노산이나 변형된 아미노알코올 잔기로 치환되는 올리고뉴클레오티드 유사체이다. 본 발명의 신규한 화합물의 몇몇 구체예가 유전자 발현의 안티센스 제어에 특히 유용하다. 또한 본 발명의 화합물은 핵산 혼성화 프로브 또는 프라이머로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체의 단량체 전구체를 제공하는 것이다. 이들 단량체의 전구체는 피험체 폴리뉴클레오티드 유사체를 합성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 질병 상태의 치료나 예방을 위해 디자인되는 피험체 폴리뉴클레오티드 유사체의 조제물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 양태는 질병, 특히 바이러스감염 및 세포성장장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 피험체의 질병치료방법은 안티센스 저해제로 사용하기 위한 피험체 폴리뉴클레오티드 유사체의 유효량을 투여하는 단계로 이루어진다.
특종구체예의 상세한 설명
A. 정의 및 약기:
본 발명을 기술하는데 있어 다음의 용어들을 사용할 것이고 하기에 가리키는 바와 같이 정의될 것으로 의도된다.
본문에서 사용된 "안티센스"처리란 상보적인 표적 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 DNA 또는 RNA 올리고머 또는 그 유사체의 투여 또는 원래 자리에서의 발생(in situ generation)으로 언급된다. 결합은 종래의 상보적 염기쌍에 의하거나, 또는 결합이 다른 메카니즘, 예를들면 이중나선구조의 대홈(major groove)에서 특이적인 상호작용으로 DNA 이중구조에 결합하는 경우일 수 있다. 일반적으로 "안티센스"는 이 분야에서 이 설명하에서 일반적으로 사용된 일련의 기술로 언급되고 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 특이적 결합에 의존하는 어떤 치료라도 포함한다. 안티센스 유전자 조절방법은 분자생물학 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되며 안티센스 유전자 조절설명은 예를들면 U.S. 특허 5,107,065, U.S. 특허 5,166,195, U.S. 특허 5,087,617, 및 Crooke, Annual Review Pharmacology Toxicology 199232; 329-376에서 찾아볼 수 있다.
"올리고머" 또는 "올리고뉴클레오티드"란 교환가능하게 사용되고 RNA 및 DNA 같은 자연발생화합물 뿐만아니라 본 발명 화합물을 포함하는 그 합성 유사체도 포함한다. 다르게 지적되지 않으면 "올리고머"와 "올리고뉴클레오티드"란 DNA/RNA 및 그 합성유사체 둘다로 언급된다. "올리고머"란 포스포디에스테르 결합 또는 어떤 다른 치환 결합에 의해 서로 공유결합된 2개 이상의 핵단량체로 이루어지는 화합물로 언급된다. 다르게 지적되지 않으면, 길이 제한은 "올리고머"란 용어로 읽히지않는다. 따라서, 올리고머는 2개 만큼이나 적은 공유결합된 핵단량체(이량체)를 가지거나 또는 유의하게 길어질 수 있다. 올리고머는 결합할 수 있어 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 서열과 염기쌍 형성할 수 있다. 올리고머(예를들면 이량체-육량체)는 또한 본문에서 기술될 때 더 긴 올리고머를 위한 신톤(synthon)으로서도 유용하다. 올리고머는 비염기성 부위와 슈도뉴클레오시드를 함유할 수 있다.
올리고머는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 폴리데옥시리보-뉴클레오티드(2'-데옥시-D-리보스 또는 그것의 변형된 형태 함유), 즉, DNA, 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스 또는 그것의 변형된 형태 함유), 즉, RNA, 및 푸린이나 피리미딘 염기 또는 변형된 푸린이나 피리미딘 염기의 N-글리코시드 또는 C-글리코시드, 또는 변형된 푸린이나 피리미딘 염기인 어떤 다른 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본문에서 사용된 올리고머는 인접한 핵단량체가 히드록사메이트 결합을 통하여 결합되는 화합물을 포함하도록 의도된다. 푸라노스 고리 및/또는 포스포디 에스테르 결합같은 올리고머에서 통상 발견된 원소는 어느 적당한 작용성 동일 원소로 치환될 수 있다. "올리고머"란 염기용 샤시(chassis)나 지지체로 쓰이는 어떤 구조를 포함하도록 의도되는데 여기서 샤시는 서열-의존방법으로 표적핵산에 결합을 촉진시킨다. 현재 공지된 올리고머는 4가지 군으로 한정될 수 있는데, (i) 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유사체 (포스포로티아오에이트, 메틸포스포네이트 등)결합 (ii) 비인등량식 (리보아세탈, 포름아세탈, 카르바메이트 등)을 함유하는 치환결합 (iii) 리보스나 데옥시리보스 대신에 모르폴리노잔기, 탄소환잔기 또는 아라비노스 같은 다른 푸라노스 당 또는 핵소스 및 (iv) 아미드 결합으로 결합된 핵단량체 또는 어느 적당한 치환결합으로라도 결합된 핵단량체를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본문에 사용된 "핵단량체"란 (2)두번째 부분에 (1)공유결합된 염기로 이루어지는 부분으로 언급된다. 핵단량체는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 아미노알코올에 연결된 염기를 포함한다. 핵단량체가 결합되어 서열특이적 방법으로 핵산의 상보적 염기서열이나 표적에 결합되는 올리고머를 형성할 수 있다.
본문에서 사용된 "두번째 부분"이란 핵단량체에 결합된 화합물로 언급되고 아미노산/아미노알코올 부분, 통상 세린올, 아스파르트산, 글루탐산, 글리신, 및 아미노산 부분의 변형을 함유하는 종들을 포함하는데 예를들면, 여기에서 하나 이상의 수소가 다른 작용기로 치환되거나(식 24-41참조) 또는 한 카르복실산이 알코올, 아민, 티올, 히드록실아민 등으로 작용하는 것이다.
본문에서 사용된 "뉴클레오시드"란 하기할 푸린, 피리미딘, 또는 그 유사체형을 운반하는 이하에 더 기술될 그 아미노산 및 아미노알코올 유도체로 언급되지만, 포스포디에스테르 유사체 또는 변형된 뉴클레오시드간 결합같은 결합부분이 부족하다. "5" 뉴클레오시드란 5'탄소결합지점을 링커로 제공하는 뉴클레오시드를 의미한다. 링커의 "5'"말단이 5'뉴클레오시드로 결합된다. 링커의 "3'" 말단은 다음 뉴클레오시드상의 3'위치로 결합된다. 변형된 뉴클레오시드가 3' 및/또는 5' 탄소를 정확히 포함하지 않게 제공되면 DNA 및 RNA에 유사하게 사용된 가닥 극성을 기술하기 위한 이 "3'" 및 "5'"전문용어는 본 기술분야에서 숙련된 자에 의해 이해될 것이다.
본문에서 사용된 "뉴클레오시드"란 아미노알코올/아미노산 유사체에 공유결합된 염기로 언급되며 염기와 아미노산/아미노알코올 사이의 링커를 함유한다. 뉴클레오시드란 통상 리보뉴클레오시드, 데옥시리보뉴클레오시드, 또는 염기의 N-글리코시드나 C-글리코시드인 어떤 다른 뉴클레오시드를 포함한다.
본문에서 사용된 "뉴클레오티드"란 포스페이트기 또는 포스페이트 유사체(티오포스페이트, 아미데이트 같은 포스페이트기에서와 동일한 산화상태에서 인을 갖는 기)를 갖는 뉴클레오시드로 언급된다.
본문에서 사용된 "염기"란 광범위한 뉴클레오시드 염기로 언급되며, 푸린과 피리미딘 복소환 및 복소환 유사체 및 그 호변이성체를 포함한다. 푸린은 아데닌, 구아닌, 및 크산틴을 포함하며 푸린 유사체의 예로는 8-옥소-N6-메틸아데닌 및 7-데아자크산틴을 포함한다. 피리미딘은 우라실과 시토신 및 5-메틸시토신, 5-(1-프로핀일우라실), 5-(1-프로핀일시토신), 5-메틸우라실과 4,4-에탄오시토신 같은 그 유사체를 포함한다. 적당한 분자구조, 예를 들어 포스포디에스테르 골격에 결합되면 염기는 이중가닥 DNA 또는 유사구조의 다른 이중가닥 핵산에서 발생하는 염기쌍 관계에 가담할 수 있다. 염기는 또한 삼중 나선구조의 핵산에서 염기쌍 관계에 가담할 수도 있다.
본문에서 사용된 "당변형"이란 2'-데옥시리보스 이외의 어떤 아미노산이나 아미노알코올 부분으로 언급된다.
본문에서 사용된 "아미노산/알코올"이란 "R" 및 "S"이성체 둘다의 어떤 자연적 아미노산으로 언급된다.
본문에서 사용된 "뉴클레오시드 결합"이란 단량체내에 존재하는 결합으로 언급된다.
본문에서 사용된 "결합"이란 아미노산/아미노알코올과 그 유사체와, 염기를 연결시키는데 사용되는 부분으로 언급된다.
본문에서 사용된 "뉴클레오티드간 결합"이란 인접한 핵단량체를 공유 결합시키는 포스포디에스테르 부분 (-O-P (O)(O)-O-) 또는 어떤 다른 작용성 대응물로 언급된다.
본문에서 사용된 "치환 결합"이란 인접한 핵단량체를 공유결합시키는 자연기의 어느 유사체 또는 어떤 적당한 부분으로 언급된다. 치환 결합은 포스포디에스테르 유사체, 예를들면 포스포로티오에이트와 메틸포스포네이트, 및 인을 함유하지 않은 결합, 예를들면 아미드, 히드록사메이트, 히드록실아민을 포함한다. 치환결합은 본 발명의 인을 함유하지 않은 결합(2',5'결합, 3',5'결합 및 4',5'결합)을 포함한다.
본문에서 사용된 "가교부분"이란 표적핵산과 공유결합을 형성하는 올리고머중의 기 또는 부분으로 언급된다. 가교부분은 자발적 (예, N4,N4-에탄오시토신) 또는 광활성 (예, 프소랄렌)등을 통한 것중 하나로 표적핵산에 올리고머를 공유결합시키는 공유결합종을 포함한다.
본문에서 사용된 "차단기"란 보호기, 합성용 결합기, OPO3-2, 또는 고형지지체, 라벨, 항체, 단클론성 항체나 그 단편등 같은 다른 종래의 콘쥬게이트중의 하나로서 올리고머나 핵단량체에 공유결합되는 H 이외의 치환기로 언급된다. 본문에서 사용된 바와 같이 "차단기"는 전문용어에 따라 보호기로만 해석되도록 의도되지 않는데, 예를들면 H-포스포네이트 또는 포스포르아미디트 같은 결합기를 포함하는 것도 의미한다.
본문에서 사용된 "보호기"란 그것이 부착되는 O-원자, S원자 또는 N원자가 반응이나 결합에 관여하지 않도록 보호할 수 있는 어떤 기로 언급된다. 핵단량체 안의 염기부분상의 N-원자를 위한 보호기와 그 도입은 본 기술분야에서 종래적으로 공지된다. 적당한 보호기의 한정되지 않은 예로는 : 디이소부틸포름아미딘, 벤조일, 실릴등을 포함한다. O원자와 S원자를 위해 적당한 보호기는, 예를들면 DMT, MMT, FMOC 또는 에스테르이다. 본문에서 사용된 "보호기"는 그것이 부착되는 O원자, S원자 또는 N원자가 반응이나 결합에 관여하는 것을 방지할 수 있는 어떤기를 포함한다. 핵단량체중의 O, -S-, 및 N-원자를 위한 보호기가 기술되고 그 도입을 위한 방법이 본 기술분야에서 종래적으로 공지된다. 또한 보호기는 카르복실산, 티올등에서 반응과 결합을 방지할 수 있는 어떤 기도 포함한다.
본문에서 사용된 "결합기"란 포스폰산수소 같은 핵단량체와 포스포르아미디트 사이의 결합이나 치환결합을 발생시키는데 적당한 어떤기로 언급된다.
본문에서 사용된 "콘쥬게이트" 또는 "콘쥬게이트 부분"이란 올리고머 자체내 또는 말단에서 올리고머에 부착된 어떤 기로 언급된다. 콘쥬게이트는 실리카겔, 제어된 다공성 유리 및 폴리스티렌 같은 고형지지체; 형광, 화학발광, 방사활성원자나 분자, 효소부분 및 리포터기 같은 라벨; 폴리양이온, 혈청단백질과 글리코단백질 및 중합체 등 같은 올리고머 운반제를 포함한다. 다른 콘쥬게이트 부분은 0-콜레스테롤, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 아미노산, 삽입기, 폴리뉴클레오티드 제거부분, 가교작용기, 지질, 히드록사메이트, 알킬화제 등을 포함한다.
본문에서 사용된 "신톤(Synthon)"이란 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체내에서 구조적 단위로 언급된다.
본문에서 사용된 "트랜스펙션"이란 세포로 올리고머의 증강된 운반에 적당한 어떤 방법으로 언급된다.
본문에서 사용된 "피험체"란 식물이나 포유동물, 특히 사람을 포함하여 동물로 언급된다.
올리고머 "유도체"와 그 단량체 성분은 종래적으로 본 기술분야에서 인정된 것들을 포함한다. 예를들면, 올리고뉴클레오티드는 삽입기, DNA 이중나선의 소홈(minor groove)과 특별히 상호작용하는 물질 및, 라벨 (방사활성, 형광, 효소 등) 같은 다른 임의로 선택된 콘쥬게이트 같은 다양한 부분에 공유결합될 수 있다. 이들 추가부분은 결합 자체의 일부로서 변형된 골격 결합을 통하여 유도화될 수 있다(그러나 그럴필요가 없다). 예를들면, 아크리딘 같은 삽입기가 예를들면, RNA 또는 DNA의 말단 5'위치, RNA의 2'위치에서 어떤 유용한 -OH 또는 SH, 또는 예를들면 시토신의 5메틸 대신에 5위치에서 -CH2CH2CH2OH나 -CH2CH2CH2SH를 함유하는 유도형태인 피리미딘의 5위치로 처리된 OH 또는 SH로 결합된 R-CH2-를 통하여 결합될 수 있다. 광범위한 치환기가 결합될 수 있으며 종래의 결합으로 결합된 것들을 포함한다, 따라서 식(1)중의 올리고머에서 나타낸 OH부분은 포스포네이트기로 치환될 수 있고 표준 보호기로 보호되거나 또는 다른 뉴클레오티드에 추가의 결합 제조를 활성화시키고, 또는 콘쥬게이트된 치환기에 결합될 수 있다. 5'말단 OH는 종래적으로 인산화된다; 3'말단에서 2'-OH 또는 OH 치환기도 인산화될 수 있다. 히드록실도 표준보호기로 유도체화될 수 있다.
본문에서 사용된 "포스포디에스테르 유사체"란 종래의 포스포디에스테르 결합의 유사체 뿐만 아니라 교체 결합기로 언급된다. 이들 교체결합기는 O-P(O)가 P(O)S, P(O)NR2, P(O)R, P(O)OR'로 치환되고, 여기서 R은 H 또는 알킬(1-7C)이고, R'는 알킬(1-7C)인 구체예를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 동일한 올리고 내의 포스포디에스테르 유사체가 모두 동일할 필요는 없으며, 단지 필요조건은 이들 결합중 적어도 하나가 본문에서 기술된 변형 뉴클레오티드간 결합인 것이다.
푸린과 피리미딘의 "유사체"형태는 본 기술분야에서 일반적으로 공지된 것들이며, 이들중 대부분이 화학치료제로 사용된다. 완전한 목록은 아니지만 예로는 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데닌, 아지리딘일시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 아노신, N6-이소펜텐일아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실구아노신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜텐일아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 구에오신, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀴에오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노푸린을 포함한다. 특히 바람직한 유사체는 5-메틸시토신(본문에서 "Cme"로 약기함)이다.
본문에서 사용된 "등량식(Isosteric)"이란 뉴클레오시드간 결합의 공간 및 배향성과 이들 성질이 원래의 포스포디에스테르 결합의 것과 유사하다는 사실로 언급되며 등량식 결합을 함유하는 변형된 올리고뉴클레오티드가 원래의 올리고뉴클레오티드와 모사 및/또는 혼성화로 교체, 치환될 것이다.
본문에서 사용된 "리보스-아미드"란 2개의 뉴클레오염기들 사이에 존재하는 뉴클레오티드간 결합으로 언급된다. 리보스-아미드 뉴클레오티드간 결합은 리보스/(2'-데옥시) 및 아미노산 작용기의 조합을 갖는다.
다양한 약기가 작용성기와 화합물로 언급되는 본 명세서에 사용된다. 이들 약기는 유기화학의 분야에서 숙련된 자에 의해 쉽게 이해되는데, 예를들면 "Ph"는 페닐로 언급되고, "Me"는 메틸로 언급되고 "(1-7C)"는 1 내지 7개의 탄소원자를 함유하는 주어진 사슬을 나타낸다.
발명의 설명
본 발명은 변형된 뉴클레오티드 결합으로도 언급되는 염기와 골격 (표 1에 나타낸 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 다른 것들)사이의 변형된 아미노산/아미노알코올 결합을 함유하는 신규한 올리고뉴클레오티드 유사체를 제공한다. 변형 또는 그 작용성 대응물이 염기와 골격 사이에 있는 당부분을 아미노산 유도체로 치환시키는데, 예를 식 24에 나타낸다. 또한 본 발명은 신규한 핵단량체와 핵단량체 함유 올리고머로 그것을 통합시키는 방법도 제공한다.
본 발명은 식 1-23의 구조를 갖는 다양한 핵화합물을 제공한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명의 올리고머는 DNA 나 RNA의 구조유사체를 제공하기 위해 결합된 하나 이상의 피험체 단량체 화합물로 이루어지는 중합체이다. 본 발명의 올리고머는 2개 이상의 핵단량체로 이루어지고 실제로 어떤 수의 핵단량체로이든 이루어질수 있지만 200개 이하의 핵단량체의 올리고머는 일반적으로 합성하기가 용이하다. 식 1-23의 화합물들은 식 24-41에서 볼 수 있는 바와 같이 4'-5'결합, 3'-5'결합, 및2'-5'결합을 통하여 서로 결합될 수 있다
Figure pct00003
본 발명의 화합물내의 뉴클레오티드 결합은 아미노산 세린 및 글리신이나 그 유도체로부터 제조된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 안정하고 내인성 뉴클레아제에 대해 내성이고 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있다. 본 발명의 예시적인 화합물을 식 24 내지 41에 나타내고 비변형된 DNA 또는 RNA에서 발견된 포스포디에스테르 결합에 비하여 구조적으로 보다 한정된다. 부분적으로 이 구조적 한정은 상보적인 폴리뉴클레오티드 표적서열에 대한 피험체 화합물의 증강된 결합성질을 기여할 수 있고; 그러나 본 발명의 사용은 증강된 결합성질을 위해 이 이론에 의존하지 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 변형된 올리고뉴클레오티드나 그 유도체로 지향되는데 본래의 올리고뉴클레오티드, 예를들면 DNA나 RNA의 푸라노스 부분이 아미노산/아미노알코올 부분으로 치환되고 아미노산 위치에서 치환으로 이루어지는 다른 변형은 식 25 내지 식 41에 나타낸다. 인접한 핵단량체들 사이의 뉴클레오티드간 결합은 인접한 핵단량체의 4'와 5' 위치 사이의 결합이다. 환언하면, 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 결합, 또는 그 작용성 대응물은, 식 24-33의 화합물로 예시된대로 한 핵단량체의 5'-위치에서 기원하며 인접한 단량체의 4'-위치에 연결된다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
상기식에서 각 "R"은 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2,0NH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "Base"는 독립적으로 뉴클레오시드 염기이다.
상기식에서 각 "R1"는 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "R2"는 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "R3"은 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "R4"은 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH33, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "A"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH,NOH, NCH3, NR5및 Se인데, 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이다.
상기식에서 각 "B"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3, NR5및 Se인데, 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이다.
상기식에서 각 "X"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, O, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3, NR5및 Se인데, 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이다.
상기식에서 각 "X"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3및 NR5인데, 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이다.
상기식에서 각 "Z"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3및 NR5인데, 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이다.
R5는 H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH3, ONH2, 에틸, 프로필, 저급알킬(1-7C), Me, 헤테로알킬(1-7C), 아릴(6-7C), -(CH2)xF이며; 여기서 "x"는 1-7C이고 "F"는 독립적으로 H, OH, SH, OCH3, CN, SCH3, ONH2, ONH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "V"는 독립적으로 포스포디에스테르유사체, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 보론포스포네이트, 셀레노포스포네이트, 포스포르아미데이트, 아세트아미데이트, 옥시포름아미도, 옥시아세트아미도,디이소프로필실릴, 카르바메이트, 황화디메틸렌, 술폭시화디메틸렌, 디메틸렌술폰이고/이거나 2 내지 4개의 원자길이 뉴클레오시드간 결합이 탄소, 질소, 산소, 황 및 셀레늄에서 선택된다. 올리고머의 길이는 이량체 내지 200량체, 이상으로 다양할 수 있다. "V"를 위한 구조를 포함하는 바람직한 변형 뉴클레오티드간 결합은 표 1에 나타낸다.
추가로, 다음식의 화합물은 하나 이상의 콘쥬게이트 부분에 콘쥬게이트될 수 있다. 적당하게, 콘쥬게이트 부분은 O-콜레스테롤, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 삽입기, 절단부분(예, 임다졸), 가교작용기(예, 프소랄렌), 지질, 펩티드, 알킬화제, 히드록사매, 및 형광라벨을 포함한다. 콘쥬게이트 부분은 독립적으로 하나 이상의 R, R1, R2, R3, R4및 R5와 대체될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 식 34-36에 나타낸 올리고머 구조와 그 유도체를 제공하는 것이다.
Figure pct00007
식 34-36의 화합물에서, 인접한 핵단량체들 사이의 결합은 3'에서 5'로의 결합니다.
상기식에서 각 "R"은 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "Base"는 독립적으로 뉴클레오시드 염기이다.
상기식에서 각 "R1"는 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH,COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "R2"는 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "R3"은 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "R4"은 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "A"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3, NR5및 Se인데, 여기서 "x"는 1-7이다.
상기식에서 각 "B"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3, NR5및 Se인데, 여기서 "x"는 1-7이다.
상기식에서 각 "X"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, O, S, S(O), S(O)(O), NH,NOH, NCH3및 NR5인데, 여기서 "x"는 1-7이다.
상기식에서 각 "Y"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, O, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3및 NR5인데, 여기서 "x"는 1-7이다.
상기식에서 각 "Z"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3및 NR5인데, 여기서 "x"는 1-7이다.
R5는 H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH3, ONH2, 에틸, 프로필, 저급알킬(1-7C), Me, 헤테로알킬(1-7C), 아릴(6-7C), -(CH2)xF이며; 여기서 "x"는 1-7C이고 "F"는 독립적으로 H, OH, SH, OCH3, CN, SCH3, ONH2, ONH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "V"는 독립적으로 포스포디에스테르유사체, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 보론포스포네이트, 셀레노포스포네이트, 포스포르아미데이트 이고/이거나 2 내지 4개의 원자길이 뉴클레오시드간 결합이 탄소, 질소, 산소, 황 및 셀레늄에서 선택된다. 올리고머의 길이는 이량체 내지 200량체, 이상으로 다양할 수 있다. "V"를 위한 구조를 포함하는 바람직한 변형 뉴클레오티드간 결합은 표 1에 나타낸다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 식 37 내지 41, 또는 그 변이체를 갖는 올리고머, 2',5'결합인 신규한 뉴클레오티드간 결합으로 이루어지는 올리고머를제공한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 안정하고 내인성 뉴클레아제에 개선된 내성을 갖고 표적 올리고뉴클레오티드 서열로 혼성화될 수 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
상기식에서 각 "R"은 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서"'x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "Base"는 독립적으로 뉴클레오시드 염기이다.
상기식에서 각 "R1"는 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2,ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "R2"는 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "R3"은 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "R4"은 독립적으로 H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F이며; 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이고 "F"는 NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "A"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3, NR5및 Se인데, 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이다.
상기식에서 각 "B"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3, NR5및 Se인데, 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이다.
상기식에서 각 "X"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, O, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3및 NR5인데, 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이다.
상기식에서 각 "Z"는 독립적으로 (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH3및 NR5인데, 여기서 "x"는 1-7개의 탄소이다.
R5는 H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH3, ONH2, 에틸, 프로필, 저급알킬(1-7C), Me, 헤테로알킬(1-7C), 아릴(6-7C), -(CH2)xF이며; 여기서 "x"는 1-7C이고 "F"는 독립적으로 H, OH, SH, OCH3, CN, SCH3, ONH2, ONH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다.
상기식에서 각 "V"는 독립적으로 포스포디에스테르유사체, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 보론포스포네이트, 셀레노포스포네이트, 포스포르아미데이트이고/이거나 2 내지 4개의 원자길이 뉴클레오시드간 결합이 탄소, 질소, 산소, 황 및 셀레늄에서 선택된다. 올리고머의 길이는 이량체 내지 200량체로 다양할 수 있다. "V"를 위한 구조를 포함하는 바람직한 변형 뉴클레오티드간 결합은 표 1에 나타낸다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 다음식 (식 42)과 그 단량체 성분(식85-90)의 올리고머로 지향된다.
Figure pct00010
상기식에서,
X는 n=1-3인 (CH2)n, n=0-2인 CO(CH2)n, n=1-2인 (CH2)nSO2로 이루어지는 군에서 선택되고,
Y는 CH2, CO, COOH, CS, 및 SO2로 이루어지는 군에서 선택되고,
Y'는 CH2, CO, COOH, CS, 및 SO2로 이루어지는 군에서 선택되고,
Z는 O, S, NH, 및 CH2로 이루어지는 군에서 선택되고,
R은 CH2OH, CH2NH2, CH2NHCHO, CONH2, 및 COOH로 이루어지는 군에서 선택되고,
B는 뉴클레오시드 염기이다.
Figure pct00011
상기식에서,
X는 n=1-3인 (CH2)n, n=0-2인 CO(CH2)n, n=1-2인 (CH2)nSO2로 이루어지는 군에서 선택되고,
Y는 CH2, CO, COOH, CS, 및 SO2로 이루어지는 군에서 선택되고,
Y'는 CH2, CO, COOH, CS, 및 SO2로 이루어지는 군에서 선택되고,
Z는 O, S, NH, 및 CH2로 이루어지는 군에서 선택되고,
R은 CH2OH, CH2NH2, CH2NHCHO, CONH2, 및 COOH로 이루어지는 군에서 선택되고,
B는 뉴클레오시드 염기이다.
다른 구체예에서, 본발명은 뉴클레오티드 서열을 불활성화시키는데 효과적인 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 결합할 수 있는 상기 변형된 올리고뉴클레오티드의 양을 그러한 치료가 필요한 피험자에게 투여하는 것으로 이루어지는 뉴클레오티드 서열의 존재로 매개된 질병치료 방법을 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에서, 식 24-41의 "V"내에 포함된 포스포디에스테르기의 적어도 하나는 본문에서 기술된 변형 뉴클레오시드간 결합으로 치환된다. 바람직하게, 비변형된 올리고뉴클레오티드 중의 다수의 포스포디에스테르 결합은 변형된 뉴클레오시드간 결합, 또는 원한다면 다양한 변형된 뉴클레오티드간 결합으로 치환될 수 있는데, 변형된 뉴클레오시드간 결합은 이 구조에서 반복적으로 사용될 수 있거나, 또는 원한다면 다양한 변형된 뉴클레오티드간 결합이 각각의 올리고뉴클레오티드에 사용될 수 있다. 피험체 올리고뉴클레오티드의 바람직한 구체예에서 이들 치환 결합이 비키랄이어서 원하는 표적으로 혼성화시키는 올리고뉴클레오티드의 능력을 증강시킨다; 그러나, 본 발명의 유용한 화합물은 키랄형태가 사용된 구체예들을 포함한다.
"V"를 위한 구조를 포함하는 바람직한 변형된 뉴클레오티드간 결합은 다음 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
R5는 H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH3, ONH2, 에틸, 프로필, 저급알킬(1-7C), Me, 헤테로알킬(1-7C), 아릴(6-7C), -(CH2)xF이며; 여기서 "x"는 1-7C이고, "F"는 독립적으로 H, OH, SH, OCH3, CN, SCH3, ONH2, ONH(CH3), SNH2, S(O)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph이다. 추가로, 하나 이상의 콘쥬게이트 부분은 결합으로 연결되어 올리고머 콘쥬게이트를 생산할 수 있다. 적당한 콘쥬게이트 부분은 O-콜레스테롤, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 삽입기, 절단부분(예, 임다졸), 가교작용기(예, 프소랄렌), 지질, 펩티드, 알킬화제, 히드록사메이트, 및 형광라벨을 포함한다.
구체적으로 바람직한 4'-5' 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 카르복스아미드, 티오카르복스아미드, 히드록사메이트, 술폰아미드, 히드록실아민 및 카르바메이트를 포함한다. 동일한 변형이 2'-5'와 3'-5'결합에도 같이 바람직하다.
본 발명의 올리고머는 균질한 결합형태의 올리고머로 제한되지 않으며 2',5'결합을 포함하는 교체 또는 임의로 분포된 치환결합이 포함된다. 본 발명의 올리고머는 한번에 한 핵단량체 잔기를 합성시킬 수 있기 때문에 각 개개의 결합 및/또는 치환결합, 및 각 개개의 "염기" 치환의 종류가 독립적으로 선택되어 원하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 생산할 수 있다.
본 발명의 올리고머는 어떤 원하는 수의 치환결합이든 함유할 수 있다. 치환결합은 다른 비발명 치환결합을 포함하는 "V"로 선택된 구체예의 덕분으로 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 올리고머는 서열상으로 제조되기 때문에 어떤 패턴의 결합이나 치환결합 형태, 염기 및 당변형이라도 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치환결합은 규칙적 패턴으로 교체된다. 예를들면, 한 치환결합은 2개의 포스포디에스테르 결합에 이어서 한 발명 치환결합등으로 이루어진다. 추가의 구체예는, 예를들면, 치환결합같은 교체 결합에 이어서 포스포디에스테르 유사체(예, 티오에이트 등), 다음에 본 발명의 치환결합에 이어서 포스포디에스테르 유사체 등을 포함하는데, 즉 본 발명의 올리고머는 두가지 형태의 치환 결합중 하나씩 교체되는 것으로 이루어질 수 있다. 하나 이상의 형태의 결합으로 이루어지는 본 발명의 올리고머는 올리고머의 서브유니트들 사이에 존재하는 상이한 결합형태들 사이에서 번갈아 형성된 많은 규칙적 패턴중 어떤 것을 가질 수 있다.
당변형은 본 발명의 올리고머에서 하나 이상의 핵단량체 잔기에 제조될 수 있다; 그러나, 아미노산 잔기들 사이에서 4'-5', 3'-5' 및 2'-5' 뉴클레오티드 결합은 당변형이 통합된다면 바람직하다. 이런 경우에, 추가의 약기가 올리고뉴클레오티드 유사체의 염기 서열을 나타내는데 사용될 수 있다. 예를들면, 표준 DNA(또는 RNA)에서 서열은 일반적으로 예를들면 ATG CGC TGA 같은 염기 단독의 서열로 나타낸다. 일반적으로, 이것이 RNA 또는 DNA서열을 나타내는지 미리 간단히 언급된다. 대응하는 표시 시스템이 본문에서 사용되어 주어진 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드 유사체를 나타낸다.
추가 핵단량체 변형:
또한 본 발명의 올리고머는 본 발명의 치환 결합 이외에 다양한 변형으로도 이루어질 수 있다. 추가의 변형은 다음과 같은 올리고머를 포함하는데, (i) 하나 이상의 핵단량체 잔기가 2',3',4', 및 5'위치에서 변형되고, (ii) 하나 이상의 공유 가교 부분이 통합되고, (iii) 다른 비발명 치환결합이 포함되고, (iv) 8-옥소-N6-메틸아데닌 같은 다른 염기 유사체가 포함되며 (v) 각각 표적핵산서열로 결합 친화성을 증강시키거나 올리고머와 세포의 연합을 증강시키는 삽입제 또는 폴리리신 같은 콘쥬게이트가 포함된다.
단일 가닥 및 듀플렉스 표적을 위한 본 발명의 올리고머의 서열특이적 폴리 뉴클레오티드 결합성질이 올리고머에 대한 다른 변형과 양립할 수 있다. 이들 다른 변형은 또한 뉴클레아제 절단 (예를들면, 포스포디에스테르 결합을 갖는 본 발명의 올리고머의 영역에서)에 대한 안정성 같은 유용한 성질을 부여할 수 있거나, 또는 세포막을 침투하는 능력등을 증강시킬 수도 있다.
본 발명의 올리고머는 황화물이나 술폰 결합같은 하나이상의 치환결합(Benner, S.A. 국제공개번호 WO 89/12060), 술파메이트 결합(국제공개번호 WO 91/15500), 모르폴리노-결합된 올리고머에서 카르바메이트 또는 다른 치환결합(Stirchak, E. P. et alNuleic Acids Res. 1989,17, 6129-6141; Summerton, J., et al 국제공개번호 WO 216 860) 및 관련 결합으로 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명 올리고머의 예시적인 구체예는 (1) 인접단량체에 결합되는 적어도 한 치환결합 및 아미노산, (2) 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 티오노메틸포스포네이트로 이루어지는 군에서 선택된 하나이상의 비발명 치환결합 및/또는 (3) 하나이상의 포스포디에스테르 결합 및/또는 (4) 상보적인 표적서열에 대한 결합 친화성을 증강시키는 푸린 또는 피리미딘 유사체를 갖는 올리고머를 포함한다. 다른 예시적인 올리고머는 (1) 3' 및/또는 5'말단에서 본 발명 치환결합과 올리고머내의 다른 곳에서 포스포로티오에이트 결합을 갖는 올리고머; (2) 본 발명 치환결합과 표준 푸린이나 피리미딘 염기(예, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실)를 갖는 올리고머; (3) 본 발명 치환결합과 올리고머의 결합 친화성이나 침투등을 증강시키는 하나이상의 염기(예, 5-메틸시토신, 5'(1-프로핀일)우라실, 5-(1-프로핀일)시토신)를 갖는 올리고머를 포함한다. 또한, 히드록사메이트를 통하여 결합된 핵단량체 잔기를 함유하는 올리고머도 포함된다.
올리고머의 합성:
본 발명의 올리고머는 본 발명의 핵단량체 단독 또는 종래의 핵단량체와의조합을 사용하여 형성되고, 표준 고체상(또는 용액상)올리고머 합성기술을 사용하여 형성될 수 있으며 현재 시중구입가능하다. 일반적으로 본 발명의 올리고머는: 핵단량체 또는 올리고머에 결합 가능한 결합기 및 염기 및 보호기를 갖는 핵단량체 또는 올리고머 신톤을 합성시키는 단계, 수용체 핵단량체 또는 수용체 올리고머에 핵단량체 또는 올리고머신톤을 결합시키는 단계; 보호기를 제거하는 단계; 및 원하는 올리고머가 합성될 때까지 필요한 만큼 사이클을 반복하는 단계로 이루어지는 방법으로 합성될 수 있다.
본 발명의 올리고머는 40,50,100,200 또는 500개의 핵단량체보다 많은 것을 포함하는 어떤 길이일 수 있다. 일반적으로 바람직한 올리고머는 2-30개의 핵단량체를 함유한다. 약 8내지 20개의 핵단량체와 동일하거나 보다 많은 길이는 적당한 염기서열을 가졌다면 치료나 진단 용도에 유용할 수 있다. 2,3,4 또는 5개의 핵단량체를 함유하는 짧은 올리고머는 본 발명에 특히 포함되며 신톤으로 사용될 수 있다.
올리고머가 폴리머라제 또는 역전사효소를 위한 프라이머로 쓰일 수 있는 3' 말단에서의 약 1 또는 2개의 잔기를 함유하거나 그렇지 않으면 폴리머라제 활성을 간섭하지 않는다면, 임의적인 서열을 갖고, 약 6,7 또는 8개의 핵단량체를 갖는 올리고머가 임의적 서열 프라이머를 사용하는 클로닝이나 증폭 프로토콜에 사용되는 프라이머로 사용될 수 있다.
본문에서 처음으로 기술된 결합이외에 본 발명의 올리고머는 종래의 포스포디에스테르 결합으로 이루어지거나 본 발명의 치환결합이외에 포스포르아미디트 결합같은 다른 치환결합을 함유할 수 있다. 이들 치환결합은 식 -O-P(O)(S)-O-("포스포로티오에이트"), -O-P(O)(NR2 11)-X2, -O-P(O)(Rll)-O-, -O-P(S)(R11)-O-("티오노알킬포스포네이트"), -P(O)(OR9)-X2, -O-C(O)-X2, 또는 -O-C(O)(NR2 11)-X2-의 부분, 여기서 R11은 H(또는 염)이거나 알킬(메틸과 에틸포함 1-12C)이고 R9는 알킬(1=9C)이고 결합은 핵단량체의 탄소에 결합된 -O-또는 -S-를 통하여 인접한 핵단량체에 결합되고 X2는 O 또는 S인 구체예를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 포스포로티오에이트와 포스포디에스테르결합은 공지된다. 본 발명의 올리고머에 사용되는 구체적으로 바람직한 치환결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 티오노메틸포스포네이트 치환결합을 포함한다. 포스포로티오에이트와 메틸 포스포네이트 치환결합은 동일해야 되는 올리고머에 가해진 안정성을 부여하고, 본 발명의 구체적으로 바람직한 올리고머가 하나이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 치환결합을 함유한다.
본 발명의 올리고머와 그 절편은 이 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되는 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 본문에 기술되고 이 분야에서 공지된 합성방법은 적당하게 보호된 핵단량체를 사용하는 본 발명의 치환결합뿐만 아니라 이 분야에서 공지된 다른 결합이나 치환결합을 함유하는 올리고머를 합성하는데 사용될 수 있다. 결합을 함유하는 인을 갖는 올리고머의 합성방법은, 예를들면 Froeh-ler, B., et al.,Nucleic Acids Res., 1986, 14, 5399-5467;Nucleic Acids Res.,1988, 16, 4831-4839;Nucleosides & Nucleotides, 1987, 6, 287-291; Froehler, B.,tetrahedron Letts., 1986, 27, 5575-5578; Caruthers, M. H. inOligodeoxy-nucleotides Antisense Inhibitions of Gene Expression, 1989,J.S. Cohen, editor, CRC Press, Boca Raton, p7-24; Reese, C.B. et al,Tetrahedron Letts, 1985, 26, 2245-2248에서 발견된다. 메틸 포스폰아미디트 화학을 통하여 올리고머에 결합된 메틸 포스포네이트의 합성도 기술되었다.(Agrawal, S. et al.,Tetrah-edron Letts., 1987,28, 3539-3542; Klem, R.E., et al, 국제공개번호 No. WO 92/07864).
또한 본 발명의 결합을 함유하는 올리고머는 용액상 화학에 의해 이량체 또는 삼량체 제조 다음에 고체상이나 용액상 화학중 하나에 의해 올리고머로 통합되는 유도체에 신톤의 전환으로 편리하게 합성된다. 전형적인 신톤은 표준방법(참조: Gait, M.J. ed.,Oligonucleotide Synthesis; A Practical Approach 1984,IRL Press, Oxford)에 의해 제조되는 5'DMT 또는 MMT 차단된 3'포스포네이트 또는 포스포르아미디트 유도체이다.
본 발명의 범위에 포함되는 신톤은 고체 또는 용액상 합성으로 제조된 이량체, 삼량체, 사량체, 육량체 및 보다 긴 올리고머를 포함한다. 신톤은 상기한 어떤 염기 또는 상기한 OH, DMTO, MMTO, O-알릴, 포스페이트, 포스포네이트 또는 아미디트 같은 2', 3', 4' 및 5'기들을 포함한다.
리보스-아미드 올리고뉴클레오티드는 표준 고체상 펩티드 합성(Fmoc 화학)조건(도26참조)을 사용함으로써 합성되었다.
본 발명 화합물의 합성을 위한 차단기
1. 결합기
적당한 결합기는 예를들면 H-포스포네이트, 메틸포스포노미디트 또는 포스포르아미디트를 포함한다. 사용가능한 포스포르아미디트는 β-시아노에틸포스포르아미디트를(바람직하게) 포함한다. 메틸포스폰아미디트, 알킬포스폰아미디트(에틸포스폰아미디트 및 프로필포스폰아미디트포함)도 사용될 수 있다. 포스포르아미디트 예는 도 1내지 21에 나타낸다.
본문에서 "아미디트 화학"으로 언급된 포스포르아미디트 트리에스테르 화학으로 올리고머 합성을 위한 2', 3', 4'또는 5'위치에서 적당한 "결합기"는 N,N-디이소프로필아미노-β-시아노에톡시포스핀, N,N-디이소프로필아미노-메톡시포스핀, N,N-디에틸아미노-시아노에톡시포스핀, 및(N-모르폴리노)-메톡시포스핀을 포함한다(Moore, M. F. et al,J Org Chem., 1985, 50, 2019-2025; Uznanski, A.W., et al,Tetrahedron Letts., 1987, 28, 3401-3404; Bjergarde, K., et al,Nucl Acids Res., 1991, 19, 5843-5850; Dahl, O.Sulfur Reports, 1991, 11, 167-192). N,N-디이소프로필아미노-메틸-포스핀 또는 N,N-디에틸아미노-메틸-포스핀같은 관련 결합기도 메틸 포스포네이트 제조에 사용될 수 있다. 메틸 포스포네이트 올리고머는 N,N-디이소프로필아미노-메틸포스포르아미디트같은 결합기를 사용하여 편리하게 합성될 수 있다. 본 발명의 핵단량체 아미디트 합성은 종래의 방법 (예를들면, Gryaznov, S. M., et al,Nucl Acids Res., 1992, 20, 1879-1882; Vinayak, R., et al,Nucl Acids Res., 1992, 20, 1265-1269; Sinha, N.D., et al,NuclAcids Res., 1984, 12, 4539-4557; 및 본문에서 인용된 다른 참고문헌들)에 의해 완성될 수 있다.
2. 보호기
이 분야에서 공지된 디이소부틸포름아미딘, 벤조일, 이소부티릴, FMOC, 디알킬포름아미딘, 디알킬아세트아미딘 또는 다른 기같은 보호기는 시토신, 아데닌 또는 구아닌 복소환의 외향고리 질소를 보호하는데 사용될 수 있다. 대안으로, 시티딘은 기술된 방법(Gryaznov, S. M. et al,J Amer Chem Soc., 1991, 113, 5876-5877; Gryaznov, S. M. et al,Nucl Acids Res., 1992, 20, 1879-1882; Kung, P. -P. et al,Tetrahedron Letts., 1992, 33, 5869-5872)을 사용하여 외향고리 질소에서 보호기없이 올리고머로 직접 통합될 수 있다.
적당한 보호기는 5'말단에서 DMT(디메톡시트리틸), Bz(벤조일), Bu(이소부티릴), 페녹시아세틸, MMT(모노메톡시트리틸) 또는 FMOC 및/또는 3'말단에서 포스폰산수소, 메틸포스포르아미디트, 메틸포스폰아미디트, β-시아노에틸 포스포르아미디트, TBS(t-부틸디메틸실릴) 또는 TBDPS(t-부틸디페닐실릴)이다.
바람직한 보호기는 5'말단이나 위치에서 Bz(벤조일), DMT(디메톡시트리틸), MMT(모노메톡시트리틸) 또는 FMOC 및/또는 3'-말단에서 TBS, 포스폰산수소, 메틸포스포르아미디트, 메틸포스폰아미디트, β-시아노에틸 포스포르아미디트이다. 그러나, 차단기의 위치가 필요한 대로 전환될 수 있도록 의도된다(예, 5'위치에서 포스포르아미디트 및 3'위치에서 DMT), 일반적으로, 본 발명의 핵단량체와 올리고머는 이 분야에서 공지된 방법에 의해 적절한 식으로 나타낸 "차단기"로 유도될 수 있다.
콘쥬게이트:
본 발명의 목적은 본 발명의 올리고머의 "콘쥬게이트"를 제공한다. 종래 올리고머의 "콘쥬게이트"는 이 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된다. 예를 들면, 본 발명의 올리고머는 DNA이중나선의 소홈과 특히 상호작용하는 화합물과 삽입기 같은 다양한 부분에 공유결합될 수 있다. 피험체 올리고머에 콘쥬게이션을 위한 다른 부분은 절단가능한 링커등을 사용하여 세포연합을 촉진하는 부분이나 라벨(예, 방사활성, 형광, 효소)을 포함한다. 적당한 방사라벨은32P,35S,3H,131I 및14C를 포함하고; 적당한 형광라벨은 형광성 물질, 레소루핀, 로다민, BODIPY(분자프로브) 및 텍사스레드를 포함하며; 적당한 효소는 알칼리성 포스파타제 및 양고추냉이 퍼옥시다제를 포함한다. 공유결합된 부분으로 사용될 수 있는 다른 화합물은 비오틴, 항체나 항체단편, 아시알로글리코프로테인, 트랜스페린을 포함하고 HIVTat 단백질이 본 발명의 올리고머에 편리하게 결합될 수도 있다.
이들 추가의 부분은 어떤 편리한 부분으로 유도될 수 있다. 예를들면, 아크리딘이나 프소랄렌같은 삽입기는 어떤 유용한 -OH 또는 -SH, 예를들면 올리고머의 말단 5'-위치, RNA의 2'-위치 또는 피리미딘의 5-위치로 통합된 OH, NH2, COOH나 SH를 통하여 본 발명의 올리고머에 결합될 수 있다. 피리미딘의 5-위치에서 -CH2CH2CH2또는 -CH2CH2CH2SH를 함유하는 유도형태가 용이하다. 폴리리신이나 리신을포함하는 콘쥬게이트는 상기한 대로 합성될 수 있고 표적핵산 서열로 올리고머의 결합 친화성을 더 증강시킬 수 있다(Lemaitre, M. et al.,Proc Natl Acad Sci. USA, 1987, 84, 648-652; Lemaitre., M. et al.,Nuleosdes 및 Nucleo-tides, 1987, 6, 311-315).
다양한 치환기가 결합이나 치환결합으로 결합된 것들을 포함하여 결합될 수 있다. 올리고머중 -OH부분은 포스페이트기로 치환될 수 있고, 표준 보호기 또는 다른 핵단량체에 부가결합을 제조하기 위한 결합기로 보호될 수 있거나, 또는 콘쥬게이트된 치환기에 결합될 수도 있다. 5'-말단 OH는 인산화될 수 있다.; 3'-말단에서 2'-OH나 OH치환기도 인산화될 수 있다. 히드록실도 표준보호기로 유도될 수 있다.
본 발명의 올리고머는 절단가능한 링커를 사용하여 세포 연합을 촉진하는 부분으로 공유유도될 수 있다. 또한 적당한 콘쥬게이트는 올리고머합성을 위해서 및 핵산서열의 검출을 촉진하기 위해서 고체 지지체를 포함한다. 고체 지지체는 실리카겔, 제어된 다공성 유리, 폴리스티렌 및 자기유리비드를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
당면형:
유도체는 당에서 치환에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 올리고머중 바람직한 유도체는 뉴클레아제 분해에 대해 안정성 및 침투능을 증강시키지만 단일 사슬이나 이중 표적에 대한 올리고머의 친화성을 감소시키지 않는 2'-0-알릴 또는 3'-알릴기이다. 보다 구체적으로, 리보스-아미드 골격 올리고뉴클레오티드에서, 상이한 작용기가 대응하는 올리고뉴클레오티드의 약물학 성질을 개선시키기 위해 리보스 부분의 1', 2', 3', 4' 및 5' 위치에서 도입되었다.
치환결합:
본 발명의 올리고머는 본문에 기술된 2'-5', 3'-5' 및 4'-5' 결합이외에 하나이상의 "치환결합"을 함유할 수도 있고, 이것은 일반적으로 이 분야에서 이해된다. 이들 "치환결합"은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 티오노메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 모르폴리노술프아미드, 보란오포스페이트(-O-P(OCH3)(BH3)-O-), 실록산(-O-Si(X4)(X4)-O-; X4는 1-6C 알킬이나 페닐임) 및 포스포르아미데이트(메톡시에틸아민(-O-P(OCH2CH2OCH3)(0)-0-)등)을 포함하고, 다음 참고문헌을 포함하는 일반적으로 유용한 문헌에 기술된 대로 합성된다(Sood, A., et alJ. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 9000-9001; WO 91/082l3; WO 90/l5065; WO 91/15500; Stirchak, E. P. et alNucleic Acid Res., 1989, 17, 6129-6141; U.S. 특허 5,034,506; U.S. 특허 5,142,047; Hewitt, J. M. et al,Nucleosides & Nucleotides, 1992, 11, 1661-1666; Summerton, J. et al 국제공보 No. 216 860). 본문에 기술된 올리고머에 사용될 수 있는 치환결합은 술폰아미드(-O-SO2-NH-), 황화물(-CH2-S-CH2), 술포네이트(-O-SO2-CH2-), 카르바메이트(O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-), 디메틸히드라진오(CH2-NCH3-), 술파메이트(-O-S(O)(O)-N-; -N-S-(O)(O)-N-), 3'-아민(-NH-CH2-), N-메틸히드록실아민(-CH2-NCH3-O-) 및 2',5' 결합 (2',5'카르바메이트(2'-N(H)-C(O)-O-5'), 5', 2'카르바메이트 (2'-O-C(O)-N(H)-5'), 5', 2'메틸카르바메이트(2'-O-C(O)-N(CH3)-5') 및 5', 2'티오포름아세탈(2'-O-CH2-S-5')을 포함한다. 적당한 추가치환결합은 Buchardt, 0. et al, (국제공개번호 WO 92/20702), 및 Cook, P.D. et al, (국제공개번호 WO 92/ 20822), De Mesmaeker, A. et al., (국제공개번호 WO 92/20823) 및 PCT/US92/04294 에 의해 기술된 아미드결합을 포함한다.
구체적으로 나타낸 것을 제외하고, 포름아세탈 결합, -O-CH2-O-같은 치환결합은 왼쪽부위에서 핵단량체의 4', 3', 2' 탄소나 오른쪽 부위에서 핵단량체의 5' 탄소중 하나에 결합된다. 4', 3', 2' 또는 5'탄소의 지정은 리보스, 데옥시리보스나 아라비노스 이외의 구조가 인접한 핵단량체에 결합될 때 따라서 변형될 수 있다. 그런 구조는 크실로스, 헥소스, 모르폴리노고리, 탄소환고리(예, 시클로펜탄)등을 포함한다.
신톤이나 올리고머에서 카르바메이트, 카보네이트, 황화물, 술폭시드, 술폰, N-메틸히드록실아민 및 디메틸히드라진오 결합의 사용이 기술되었다 (Vaseur, J-J. et al,J Amer Chem Soc., 1992, 114, 4006-4007; WO 89/12060; Musicki, B. et al,J Org Chem., 1990, 55,4231-4233; Reynolds, R.C. et al.,J. Org. Chem., 1992, 57,2983-2985; Mcrtes, M.P., et al,J Med. Chem., 1969, 12,154-157; Mungall, W.S., et al.J. Org. Chem., 1997, 42,703-706; Stirchak, E.P., et al,J. Org. Chem., 1987, 52,4202-4206; Wang, H., et al,Tetrahedron Letts., 1991, 32,7385-7388; 국제출원번호 PCT US91/03680). 치환결합(들)은 상보적인 표적핵산 서열과의 결합을 더 촉진시키고/또는 뉴클레아제에 대한 올리고머의 안정성을 증가시키는 많은 목적을 위해 올리고머에 이용될 수 있다.
염기:
본 발명 화합물에서 뉴클레오시드 염기로 사용하는데 적당한 염기는 자연발생 푸린 및 피리미딘 염기뿐만 아니라 이들 복소환 염기의 유사체와 그 호변이성체도 포함한다. 그런 유사체는 알킬화된 푸린이나 피리미딘, 아실화된 푸린이나 피리미딘, 또는 다른 복소환을 포함한다. "유사 푸린" 및 "유사 피리미딘" 또는 푸린이나 피리미딘 유사체가 이 분야에서 일반적으로 공지된 것들이며 어떤 것은 화학치료제로 사용된다. 완전하진 않지만 예시적인 목록은 N4N4-에탄오시토신, 7-데아자크산토신, 7-데아자구아노신, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 이노신, N6-이소펜텐일아데닌, 1-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-(1-프로핀일)-4-티오우라실, 5-(1-프로핀일)-2-티오우라실, 5-(1-프로핀일)-2-티오시토신, 2-티오시토신 및 2,6-디아미노푸린을 포함한다. 이들 염기 유사체 이외에 Cook, D.P., et al, 국제공개번호 WO 92/02258 (본문에 참고로 포함됨)에 기술된 6-아자시토신, 6-아자티미딘 및 5-트리플루오로메틸우라실을 포함하는 피리미딘 유사체가 본 발명 올리고머로 편리하게 통합될 수 있다.
올리고머로 4-티오우리딘 및 2-티오티미딘의 통합이 기술되었다 (Nikiforov, T.T. et al,Tetrahedron Letts., 1992, 33, 2379-2382; Clivio, P., et alTetra-hedron Letts., 1992,33:65-68; Nikiforov, T.T., et al,Tetrahedron Letts., 199132: 2505-2508; Xu, Y. -Z., et alTetrahedron Letts., 199132: 2817-2820; Clivio, P., et alTetrahedron Letts., 199233: 69-72; Connolly, B.A., et al.,Nucl. Acids Res., 198917; 4957-4974). 바람직한 염기는 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실, 시토신, 5-메틸시토신, 5-(1-프로핀일)우라실, 시토신, 5-메틸시토신, 5-(1-프로핀일)우라실, 5-(1-프로핀일) 시토신, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자-7-메틸구아닌, 7-데아자-7-메틸아데닌 및 7-데아자크산토신을 포함한다.
공유결합부분:
본 발명의 몇몇 올리고머에 포함된 것은 올리고머와 이중구조사이에 적어도 한 공유결합에 효과적일수 있는 부분이다. 다수의 공유결합은 다수의 가교부분을 제공함으로써 형성될 수도 있다. 바람직하게 공유결합은 표적 가닥에서 염기 잔기에 있지만 당류나 포스포디에스테르를 포함하는 표적의 다른 위치로 제조될 수도 있다. 가교에 영향을 주는 부분의 반응성은 이중구조에서 표적의 성질을 결정한다. 바람직한 가교부분은 아실화와 알킬화제, 특히 서열특이성 부여부분과 관련하여 위치된 것들을 포함하여 가닥에서 표적위치와의 반응을 허용한다.
복소환이 푸린이나 피리미딘이 아니어도 되는 것이 명백하다; 반응작용이 결합되는 슈도염기는 모두 복소환이 아니어도 된다. 반응기를 결합시키는 어떤 방법도 위치가 정확하다면 만족스럽다.
올리고머의 극성:
대부분의 일반형태에서, 기호 3'----5'는 결합이 왼쪽으로 핵단량체의 아미노산잔기중 5'-히드록실과 오른쪽(즉, 균일한 극성부위)으로 핵단량체의 아미노산 잔기중 3'(또는 2'-5' 결합을 갖는 올리고머에 대해서는 2', 또는 4'-5' 결합을 갖는 올리고머에 대해서는 4')-히드록실 사이에 일관되게 형성되는 올리고머를 나타내어 추가 콘쥬게이션이 없는 대부분 오른쪽 핵단량체 아미노산 잔기중 5'-히드록실을 얻는다. 유사하게, 5'----3'는 결합이 왼쪽 핵단량체의 아미노산 잔기중 3'-히드록실과 오른쪽 핵단량체의 아미노산 잔기중 5'-히드록실 사이에 형성되는 반대 배향의 일련의 올리고머를 나타내고, 따라서, 추가 콘쥬게이션이 없는 대부분 오른쪽 핵단량체 아미노산 잔기중 3'-히드록실을 얻는다. 동일한 경우가 올리고머의 5'----4' 연속에도 적용된다.
약학적으로 허용가능한 염:
본 발명은 동물이나 사람에게 투여하기 위한 약학적으로 허용가능한 염을 포함하여 본문에 기술된 모든 화합물의 다양한 염을 제공한다. 약학적으로 허용가능한 염과 그런 염형성물질은 이 분야에서 공지된다. 약학적으로 허용가능한 염은 바람직하게 본 발명 올리고머의 금속이나 암모늄이고 알칼리 또는 알칼리토금속염, 예를들면 나트륨, 칼륨, 마그네슘이나 칼습염; 또는 모노-, 디- 또는 트리-저급(알킬, 시클로알킬 또는 히드록시알킬)-아미드, 저급알킬렌디아민이나 저급(히드록시알킬이나 아릴알킬)-알킬암모늄 염기 같은 암모니아나 유기아민에서 유도된 유리하게 쉽게 결정화하는 암모늄염, 메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 디시클로헥실아민, 트리에탄올아민, 에틸렌디아민, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄 또는 수산화 벤질트리메틸암모늄을 포함한다. 본 발명의 올리고머는 산부가염, 바람직하게 강무기산, 예를들면 친수성 같은 치료적으로 허용가능한 무기나 유기산, 예를들면 염산이나 브롬산; 황산, 인산; 지방족 또는 방향족 카르복실산이나 술폰산, 예를들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 락트산, 말산, 타르타르산, 글루콘산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 푸마르산, 히드록시말레산, 피루브산, 페닐아세트산, 벤조산, 4-아미노벤조산, 안트라닐산, 4-히드록시벤조산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 술파닐산이나 시클로헥실술팜산 등을 형성한다.
이용성과 투여:
본 발명의 올리고머가 단일 가닥 또는 이중가닥의 표적 핵산 결합활성을 나타낼 수 있어 자연발생 폴리뉴클레오티드 및 그 구조적 유사체와 안정한 연합의 이중구조, 삼중구조 또는 다른 형태를 형성하기 때문에 본 발명의 올리고머는 종래의 올리고머를 사용하는 대부분의 방법에 사용될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 올리고머는, 예를들면 폴리뉴클레오티드 혼성화 프로브, 폴리머라제 연쇄반응과 유사한 고리증폭반응을 위한 프라이머, 서열화 프라이머 등으로 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고머는 질병의 치료와 진단에도 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고머의 치료적 용도는 안티센스 올리고머의 사용으로 병리적 상태의 유지나 확립중 하나와연합되는 유전자 발현의 특이적 저해(또는 이들 유전자에 의해 암호화된 RNA 서열 번역저해)를 포함한다. 본 발명 올리고머는 많은 유전자 표적의 안티센스 저해를 매개하는데 사용될 수 있다. 올리고머를 사용하는 안티센스를 통해 표적화될 수 있는 이들 유전자에 의해 암호화된 유전자 또는 RNA 예는 효소, 호르몬, 혈청단백질, 막전달 단백질, 점착성 분자(LFA-1, GPIIb/IIIa, ELAM-1, VACM-1, ICAM-1, E-셀렉션 등), 시토킨 리셉터 포함 리셉터 분자, 시토킨(IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6)등, 종양원, 성장인자 및 인터로이킨을 암호화하는 것들을 포함한다. 표적 유전자 또는 RNA는 염증상태, 심장혈관질병, 면역반응, 암, 바이러스감염, 박테리아감염, 효모감염, 기생체 감염등과 연합된 어떤 병리적 상태와 연합될 수 있다.
본 발명의 올리고머는 생체내에서 및 생체외에서 둘다 치료 용도에 사용하는데 적당하다. 생체외에서 사용하기 위한 적용은 백혈병(만성 골수성 백혈병, 급성 임파성 백혈병) 또는 바이러스감염 같은 상태에서 골수 또는 말초혈액 같은 세포의 치료를 포함한다. 암치료를 위한 표적으로 사용될 수 있는 유전자로 암호화된 표적 유전자 또는 RNA는 ras, k-ras, bcl-2, c-myb, bcr, c-myc, c-abl같은 종양원이나 mdm2, 온코스타틴 M, IL-6(카포시의 육종), HER-2 같은 과잉발현된 서열 및 bcr-abl 같은 전좌를 포함한다. CMV, HSV-1, HSV-2 같은 헤르페스바이러스, HTLV-1, HIV-1, HIV-2같은 레트로바이러스, 또는 HBV, HPV, VZV, 인플루엔자바이러스, 아데노바이러스, 플라비바이러스, 리노바이러스 등 같은 다른 DNA 또는 RNA바이러스의 폴리머라제 또는 역전사 효소 유전자 같은 이들 유전자에 의해 암호화된 바이러스유전자 서열 또는 RNA도 표적으로 적당하다. 특이적 올리고머의 용도는 다른 치료적 처리와 관련하여 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고머를 위한 다른 치료 용도는 (1) 염증을 매개하는 역할을 하는 IL-1리셉터, IL-1, ICAM-1 또는 E-셀렉션 같은 유전자의 발현을 조절함으로써 염증반응 조절 및 (2)(a) 비근육 미오신, myc, fox, PCNA, PDGF 또는 FGF 같은 성장이나 분열촉진 물질인자 또는 그 리셉터 또는 (b) c-myb 같은 세포증식인자의 발현을 조절함으로써 혈관형성후에 동맥폐색(재협착증)같은 상태에서 세포증식의 조절을 포함한다. TGFx, IL-6, gINF, 단백질키나제 C, 티로신키나제(p210, p190) 같은 신호 유발인자나 다른 적당한 증식인자는 건선이나 다른 상태의 치료를 위해 표적화될 수 있다. 게다가, EGF리셉터, TGFa 또는 MHC 대립형질은 자동면역 질병으로 표적화될 수 있다.
세포로 본 발명의 올리고머의 운반은 인산칼슘, DMSO, 글리세롤이나 덱스트란 트랜스펙션, 일렉트로포레이션을 포함하는 어떤 적당한 방법에 의하거나 또는 기술된 방법에 의한 리포솜이나 양이온성 음이온성 및/또는 중성지질조성물의 사용으로 증강될 수 있다 (국제공개번호는 WO 90/14074, WO 91/16024, WO 91/17424, U.S. 특허 4,897,355). 올리고머는 DOTMA(리포솜을 형성하거나 또는 할 수 없음) 같은 양이온성 지질을 갖는 착체에 의해 세포로 도입될 수 있는데 착체는 세포와 접촉된다. 적당한 양이온성 지질을 N-(2,3-디(9-(Z)-옥타데센일옥실))-프로프-1-일-N,N,N-트리메틸암모늄(DOTMA)과 그 염, 1-0-올레일-2-0-올레일-3-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸암모늄과 그 염 및 2,2-비스(올레일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판과 그 염을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다.
본 발명 올리고머의 증강된 운반은 (i) 센다이(Sendai) 바이러스 (Bartzatt, R.,Biotechnol Appl Biochem., 1989, 11,133-135) 또는 아데노바이러스 (Wagner, E. et al,Proc Natl Acad Sci. USA, 1992, 89,6099-6013); (ii) 폴리리신, 프로타민 또는 Na, N12-비스(에틸)스페르민 같은 화합물을 사용하는 폴리아민 또는 폴리 양이온 콘쥬게이트 (Wagner, E. et al,Proc Natl Acad Sci. USA, 1991, 88,4255-4259; Zenke, M. et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87,3655-3659; Chank, B.K. et al,Biochem Biophys Res Commun., 1988, 157,264-270; U.S. 특허 5,138,045; (iii) 리포스페르민 같은 화합물을 사용하는 리포폴리아민 착체(Behr, J. -P. et al,Proc Natl Acad Sci. USA, 1989, 86,6982-6986; Loeffler, J.P. et al, J.Neurochem., 1990, 54,1812-1815); (iV) 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀, 포스파티드산 또는 포스파티딜에탄올아민 같은 음이온성 인지질 포함 화합물을 사용하는 음이온성, 중성 또는 pH 감성 지질 (Lee, K.-D. et al,Biochem Bioph-ys ACTA, 1992, 1103,185-197; Cheddar, G. et al,Arch Biochem Biophvs, 1992, 294,188-192; Yoshimura, T., et al,Biochem Int., 1990, 20,697-706); (v) 트랜스페린이나 비오틴 같은 화합물과의 콘쥬게이트 또는 (vi) 피험체에 올리고머의 약물속도성을 증강시키는 단백질 (알부민 또는 항체 포함), 글리코단백질 또는 중합체 (폴리에틸렌글리콜)와의 콘쥬게이트의 사용으로 매개될 수 있다. 본문에서 사용된 바와 같이, 트랜스팩션은 세포로 올리고머의 운반에 적당한 어떤 방법으로 언급된다. 트랜스팩션 프로토콜에 사용될 수 있는 바이러스 같은 어떤 제제 또는 지질같은 어떤 시약이 "침투증강제"로 본문에서 집합적으로 언급된다. 세포로 올리고머의 운반은 (i) 단백질(들) 또는 단백질 단편을 암호화하는 발현성 DNA 단편 또는 (ii) 단백질(들) 또는 단백질 단편을 암호화하는 번역가능한 RNA 같은 다른 핵산으로 공트랜스팩션을 할 수 있다.
본 발명의 올리고머는 세포로 올리고머의 운반을 증강시키는 어떤 적당한 조제물로 통합될 수 있다. 또한 적당한 약학적 조제물은 화합물이 국소투여에 의해 세포나 조직으로 운반되는 적용에도 통상 사용되는 것들을 포함한다. 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 아존, 논옥소닐-9, 올레산, DMSO, 폴리아민이나 리포폴리아민 같은 화합물은 올리고머를 함유하는 국소 제제에 사용될 수 있다.
본 발명의 올리고머는 유전자 발현의 저해가 소망되는 조사 또는 생산목적을 위한 시약으로 편리하게 사용될 수 있다. 어떤 메카니즘에 의해 표적 유전자의 발현을 효과적으로 특이적으로 저해하는 유용한 시약이 현재 거의 없다. 자주 표적 유전자 발현을 저해하는 것이 이전에 기록된 올리고머는 비특이적 효과를 갖거나; 또는 매우 낮은 레벨(비저해된 레벨의 약 40% 미만)로 표적 유전자 발현을 감소시키지 않는다.
따라서, 본문에 기술된 올리고머는 피험체 또는 세포에서 선택된 단백질 또는 단백질들의 발현을 저해하는 방법으로 사용될 수 있는 시약으로 이루어지는데 단백질은 DNA서열에 의해 암호화되고 단백질은 RNA 서열에서 해독되며, 다음 단계들로 이루어진다: 세포로 본 발명의 올리고머를 도입하는 단계, 및 DNA 나 RNA를갖는 삼중 또는 DNA 나 RNA를 갖는 이중구조를 형성하기 위해 올리고머를 허용하여 이로써 단백질이나 단백질들의 발현을 저해하는 단계, 본 발명의 방법과 화합물은 박테리아, 균류기생체, 효모 및 포유류 세포 같은 진핵세포 및 원핵세포 둘다에서 유전자 발현을 조절하는데 적당하다.
RN아제 H "콤피턴트(competent)" 또는 RN아제 H "인콤피턴트(incompetent)"올리고머는 본 발명의 치환결합을 사용하여 쉽게 디자인될 수 있다. RN아제 H 콤피턴트 올리고머는 결합된 RN아제 H 콤피턴트 핵단량체로 이루어진 하나 이상의 RN아제 H 콤피턴트 영역으로 이루어질수 있다. 2'-치환(2'-O-알릴등) 또는 어떤 비전하결합 (메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트)같은 변형을 갖는 올리고머는 RN아제 H에 의해 인지되고 /또는 작용되는 기질로서 통상 부적당하다. RN아제 H 수용능력은 RNA-올리고머 이중구조에서 표적 RNA를 분해함으로써 안티센스 올리고머작용을 촉진시킬수 있다(Dagle, J.M. et al.,Nucl Acids., 1990, 18,4751-4757; Walder, J.A. et al., 국제공개번호 WO 89/05358). 효소는 RNA-DNA 이중구조에서 RNA를 절단한다.
RN아제 H 수용능력을 보유하기 위해, 올리고머는 영역내에 위치된 3개 이상의 콤피턴트 인접한 핵단량체의 RN아제 H 콤피턴트 영역을 요구한다 (Quartin, R.S., et al,Nucl Acids Res., 1989, 17,7253-7262). 뉴클레아제 분해에 대한 올리고머 내성의 디자인은 말단결합, 당 및/또는 염기변형을 가져 뉴클레아제 내성에 영향을 끼칠 것이다. 따라서, 올리고머는 5'- 및/또는 3'-말단 둘다 또는 그중 하나에서 변형된 핵단량체 잔기를 갖고, 한편 내부 RN아제 H 콤피턴트 영역을 갖도록디자인될 수 있다. RN아제 H 수용능력을 보유하는 올리고머예는 일반적으로 균일한 극성을 갖고 뉴클레아제 분해에 대해 올리고머를 안정화시키는 5'-말단 및 3'-말단에서 약 2 내지 약 12개의 핵단량체 및 RN아제 H 인콤피턴트 3'와 5'-말단 사이의 RN아제 H 콤퍼턴트 영역으로 작용하는 약 3 내지 약 26개의 핵단량체로 이루어졌다. 그런 올리고머에 대한 변이는 (1) 1 또는 2개의 RN아제 H 콤피턴트 결합이나 치환결합으로 이루어지는 보다 짧은 RN아제 H 콤피턴트 영역, (2) 15까지, 20이상의 치환결합이나 핵단량체로 이루어지는 보다 긴 RN아제 H 인콤피턴트 영역, (3) 30까지, 40이상의 결합으로 이루어지는 보다 긴 RN아제 H 콤피턴트 영역, (4) 3' 말단이나 5' 말단에서 단일 RN아제 H 인콤피턴트 영역만을 갖는 올리고머를 포함하였다.
많지 않은 약 8개의 핵단량체를 함유하는 올리고머는 표적 핵산서열을 갖는 이중 또는 삼중구조의 형성에 의한 표적단백질(들) 발현의 저해에 영향을 끼치는데 사용될 수 있다. 그러나, 이중 또는 삼중구조 형성을 통해 표적 단백질 발현을 저해하는데 사용된 선형올리고머는 바람직하게 약 10 내지 약 20개의 핵단량체 잔기를 가질 것이다.
본 발명의 치환 결합을 함유하는 올리고머는 기술된 대로 편리하게 환상화 될 수 있다 (국제공개번호 WO 92/19732; Kool, E.T.J Am Chem Soc., 1991, 113,6265, 6265-6266; Prakash, G. et al.,J Am Chem Soc., 1992, 114,3523-2527). 올리고머는 단일가닥이나 이중가닥의 핵산 표적으로 결합되는데 적당하다. 환상을 리고머는 다양한 크기일 수 있다. 약 22-50개의 핵단량체의 크기 범위에서 올리고머는 편리하게 제조될 수 있다. 환상올리고머는 기술된 바와 같이 올리고머의 결합영역을 분리하는 고리영역에서 약 3 내지 약 6개의 핵단량체 잔기를 가질 수 있다(Prakash, G, ibid). 올리고머는 5'- 및 3'-말단 당 및/또는 염기로 결합을 통해 리가제나 화학적 방법에 의해 말단 포스페이트를 통해 효소학적으로 환상화될 수 있다.
올리고머는 전사(Maher, L.T., et al,Science, 1989, 245,725-730) 또는 번역을 조절하는 책임이 있는 핵산 결합 단백질의 상호작용을 저해함으로써 표적 유전자 발현을 조절하는데 유용할 수 있다. 따라서 올리고머는 핵산 결합 단백질(리보솜, RNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제, 번역개시인자, 전사를 증가 또는 감소 시키는 것중 하나인 전사인자, 단백질-호르몬 전사인자 등 포함)과 경쟁하는 서열 특이적 제제로서 적당하다. 적당히 디자인된 올리고머는 정확한 부위로 또는 근처에 결합같은 메카니즘을 통하여 표적단백질 합성을 증가시키는데 사용될 수 있는데 전사인자는 선택된 리프레서 단백질 자체의 발현을 저해함으로써 발현을 억제하는데 사용한다.
결합 친화성을 증강시키는 추가 변형으로 이루어지는 본 발명 올리고머는 슈도마디 또는 슈도-반-마디 같은 2차 또는 3차 구조를 함유하도록 디자인 될 수 있다(Ecker, D.J. et al.,Science, 1992, 257,958-961). 그런 구조는 대응하는 비 변형된 올리고머보다 안정한 2차 또는 3차 구조를 가질 수 있다. 구조의 증강된 안정성은 주어진 구조를 형성하는 2개 이상의 올리고머들 사이의 상보적인 영역이나 단일 올리고머에서 자기 상보적인 영역사이에 증가된 결합 친화성에 의존하였다.구조는 HIV Tat 단백질(TAR에 결합하는 단백질)에 의해 결합을 간섭하기 위해 HIV TAR 구조 같은 모사구조에 사용될 수 있다. 유사한 접근이 줄기, 고리, 헤어핀, 마디등 같은 고급핵산구조를 인지하는 다른 전사 또는 번역인자로 이용될 수 있다. 대안으로, 본 발명 올리고머는 핵산구조에 단백질의 결합을 (1) 간섭하거나 (2) 증강시키는 방법으로 상기 구조에 (1) 파괴되거나 또는 (2) 결합되는데 사용될 수 있다.
안티센스 또는 삼중 나선구조 치료에의 사용이외에, 본 발명의 올리고머는 이중구조의 핵산에서 한가닥의 직접 치환으로 작용하는 치료 또는 진단 제제로도 적용될 수 있다. 염색체 DNA 또는 이중구조 바이러스 DNA, RNA 또는 혼성 DNA/RNA 같은 본래의 이중구조중의 가닥의 치환은 이중구조에서 DNA나 RNA 가닥을 효과적으로 치환하기에 충분하지 않은 그 상보적인 서열에 대해 고 결합친화성을 갖는 올리고머에서 가능하다. D-고리화에 의해 작용하는 올리고머의 치료효능은 핵산표적과 연합된 보통 생물학적 작용의 조절을 결과하는 상보적인 서열에 고친화성 결합으로부터 결과되었다. 표적핵산의 형태는 (i) 엑손, 인트론, 엑손/인트론 접합, 프로모터/증강제영역 및 5' 또는 3' 비번역된 영역을 포함하는 유전자 서열, (ii) 작용을 위해 2차 구조를 이용하는 핵산영역(예, HIV TAR 줄기-고리요소 또는 tRNAs), (iii) 미측부, 중앙부 또는 복제기원(바이러스, 박테리아 등)같은 구조적 또는 다른 작용을 하는 핵산 및 (iv) 어떤 다른 이중구조영역을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 올리고머가 별개의 작용영역으로 합성될 수 있는데 올리고머중 한 영역이 D-고리화에 의해 표적에 결합되는 한편 인접영역은 삼중 나선구조 형성 또는 단백질 압타머(aptamer)로 결합됨으로써 표적분자에 결합되는 것이 명백하다. 대안으로 D-고리화 올리고머는 올리고머가 결합되는 가닥을 치환함으로써 이중구조중의 각 가닥에 결합될 수 있다(즉 한가닥에 결합되는 올리고머의 한영역 및 상보적 가닥에 결합되는 다른 영역을 가짐). 결합모드를 지시하는 제어요소(즉 삼중 나선 구조 또는 DO 고리)는 올리고머로 세워진 고유한 친화성 및 올리고머의 서열이다. 염기인식은 삼중구조 결합을 제어한 후그스틴(Hoogsteen)에서와 상이한 왓슨-크릭 이중구조 결합을 규정한다. 이 때문에, 올리고머 염기서열은 올리고머를 이용하는 결합규칙의 형태를 지시하는데 사용될 수 있다, D-고리구조는 효소-매개된 방법으로 천연에서 형성되거나(Harris, L.D. et al., et al.,J Biol Chem., 1987. 262,9285-9292) 또는 DNA 복제가 발생하는 영역과 연합된다(Jacobs, H.T. et al.,Nucl Acids Res, 1989, 17,8949-8966). 올리고머의 결합에서 생기는 D-고리는 하나 또는 두단계 방법으로부터 결과될 수 있다. 표적가닥의 직접치환은 단일 결합 경우에 D-고리를 발생시킬 것이다. 그러나, D-고리화는 가닥치환을 촉진하는 삼중 나선구조를 형성함으로써 발생하여 D-고리를 얻을 수 있다.
본 발명의 치환결합을 함유하는 리보자임은 변경된 특징을 갖는 종을 디자인 하기 위해 디자인될 수 있다. 단일 가닥 RNA 또는 DNA를 절단하는 리보자임이 기술되었다(Robertson, D.L., et al.,Nature, 1990, 344,367-468). 리보자임을 위한 치료적용이 요구되었다(Sarver, N. et al.,Sience, 1990, 247,1222-1225; 국제공개번호 WO 91/04319). 리보자임 작용을 위해 필요한 2차 또는 3차 구조는, 적당한 올리고머 서열의 디자인에 의해 영향받을 수 있다. 예를들면, 본 발명의 치환결합을 함유하는 영역을 안정하게 표적화하는 뉴클레아제를 갖는 리보자임이 염기쌍 특이성을 유지하는 한편 표적서열에 대해 고친화성을 가질 수 있다. 본 발명 치환결합의 고친화성 및/또는 뉴클레아제 안정성 때문에 리보자임에서 보다 짧은 인식영역(제조유리)은 보다 유리한 기질 반전(리보자임 작용에 유리)을 얻을 수 있게 디자인될 수 있다.
치료 용도에서, 본 발명의 올리고머는 적당한 표적 유전자의 발현을 저해함으로써 다양한 상태의 치료에 적당한 방법으로 사용될 수 있다. 치료를 위해 올리고머는, 전신, 국소 또는 국부 투여를 포함하는 다양한 투여 방식으로 조제될 수 있다. 일반적으로 기술과 조제는Remington's Pharmaceutical Sciences,Merck Publishing Co., Easton, PA, 최종판에서 찾아볼 수 있다. 올리고머 유효성분은 일반적으로, 투여 및 투여량 형태의 방식 성질에 의존하여 충전제, 증량제, 결합제, 습식제, 팽화제, 표면활성제 또는 윤활제를 포함할 수 있는 희석제 또는 부형제 같은 담체와 조합된다. 전형적인 투여량 형태는 정제, 분말, 현탁액, 유화액 및 용액을 포함하는 액체제제, 과립, 캡슐 및 좌약 뿐만 아니라 리포솜 제제를 포함하는 주사용 액체제제도 포함한다.
전신투여를 위해 주사가 근육내, 정맥내, 복강내 및 피하를 포함하여 바람직하다. 주사를 위해, 본 발명의 올리고머는 액체용액, 바람직하게는 생리적으로 적합한 행크(Hank)용액이나 링거(Ringer)용액 같은 완충액에서 조제된다. 게다가, 올리고머는 고체형태로 조제될 수 있고 사용하기 전에 바로 재용해시키거나 현탁시킬수 있다. 동결 건조된 형태도 포함된다. 전신투여에 사용될 수 있는 투여량은 1일당 한번 또는 두 번 투여된 약 0.01mg/kg 내지 50mg/kg 범위이다. 그러나, 상이한 사용 스케쥴은 (i) 그 표적 DNA 또는 RNA의 활성을 저해하는 개개의 올리머의 잠재성, (ii) 주어진 표적 유전자와 연합된 병리적 질병상태의 엄격한 또는 정도, 또는 (iii) 주어진 올리고머의 약물속도학 행동에 의존하여 사용될 수 있다.
전신투여는 경근육 또는 경피방식으로 할 수 있거나, 또는 화합물은 경구투여될 수 있다. 경근육 또는 경피투여를 위해, 침투될 장벽에 적당하게 관통하는 것이 조제물로 사용된다. 일반적으로 그런 관통하는 것은 이 분야에서 공지되고 예를들면 경근육투여를 위해 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 게다가, 정화제가 침투를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 경근육 투여는 경비 분무, 예를들면 좌약의 사용으로 할 수 있다. 경구투여를 위해, 올리고머는 캡슐, 정제, 및 강장제 같은 종래의 경구투여형태로 조제될 수 있다.
국소투여를 위해, 본 발명의 올리고머는 이 분야에서 일반적으로 공지된 바와같이 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 조제된다. 바이러스 감염같이 시각적으로 나타내기 위한 본 발명 올리고머의 제조물은 이 분야에서 공지된 표준 조성물에 기초하였다.
치료용도 이외에, 본 발명의 올리고머는 특이적으로 결합하는 표적핵산서열의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 진단시약으로 사용될 수 있다. 본 발명 올리고머의 증강된 결합 친화성은 프라이머 및 프로브로 사용하기에 유리하다. 진단시험은 종래방법으로 검출되는 이중 또는 삼중 나선구조중 하나의 조제물을 통하여 혼성화로 시행될 수 있다. 예를들면, 올리고머는 방사활성, 형광, 염색체라벨과 검출된 고체 지지체에 결합된 라벨의 존재를 사용하여 라벨화할 수 있다. 대안으로, 이중 또는 삼중 나선구조의 존재는 이들 형태를 특이적으로 인식하는 항체에 의해 검출될 수 있다. 프로브로서 올리고머를 사용하는 분석시행방법이 일반적으로 공지된다.
삼중 나선구조 조제에 의한 진단시약으로서 본 발명 치환 결합의 올리고머 사용은 삼중 나선구조가 온화한 조건하에서 형성되기 때문에 유리하고 따라서 분석은 너무 가혹한 조건으로 피험체 시험표본이 없이 실행될 수 있다. RNA가 편재하는 뉴클레아제에 매우 감성적이기 때문에 박테리아, 균류 또는 프로토조아 서열의 확인을 위해 RNA의 검출에 기초한 진단 분석은 실험실에서 성장한 샘플 또는 유기체로부터 RNA의 분리를 종종 요구하는데, 이는 노력과 시간이 소비되다.
올리고머 프로브는 올리고머를 특히 안정한 뉴클레아제로 주는 치환결합 및/또는 변형된 당 같은 추가의 변형을 통합할 수 있어, 통상 뉴클레아제 활성을 함유하는 세포 또는 조직 추출물의 존재에서 시행된 분석에 유용하였다. 말단 변형을 함유하는 올리고머는 특이성 손실이 없는 상보적 서열에 결합하는 그 용량을 종종 보유한다(Uhlmann et al.,Chemical Reviews, 1990, 90,543-584). 상기한 바와 같이, 본 발명 프로브는 특이적 결합을 허용하는 결합을 함유하여 그런 결합을 허용하는 결합을 통합시킴으로써 DNA 가닥을 교체시킬수 있다(Froehler, B.C. et al.,Biochemistry, 1992, 311603-1609); Horne et al.,J Am Chem Soc., 1990, 112,2435-2437).
공유가교제를 함유하는 프로브로 본 발명의 염기 유사체의 통합은 감성을 증가시키고 진단 또는 검출분석에서 자연방사선을 저하시키는 잠재성을 갖는다. 게다가, 가교제의 사용은 (1) 프로브 구별을 증가시키기 위한 가교의 사용, (2) 자연 방사선을 저하시키는 변성세척단계의 포함 및 (3) 혼성화의 용융온도에서 또는 근처에서 혼성화 및 가교를 실행하여 표적의 2차구조를 감소시키고 프로브특이성을 증가시키는 신규한 분석변형을 허용할 것이다. 혼성화조건의 변형은 이전에 기술되었다(Gamper et al.,Nucleic Acids Res, 1986, 14,9943).
본 발명의 올리고머는 검출된 올리고머나 핵산중 하나가 기술된 바와 같이 고체지지체에 공유결합하는 방법을 사용하는 진단분석으로 사용하는데 적당하다(U.S. 특허번호 4,775,619). 또한 올리고머는 기술된 방법에 따라 표적 서열을 증폭시키기 위해 폴리머라제 연쇄반응기술에 의존하는 진단 분석으로 사용하는데 적당하다(유럽특허공개번호 0 393 744). 프라이머로 사용될 수 있는 3'말단을 함유하는 본 발명의 올리고머는 Taq 또는 VentTM(New England Biolabs)폴리머라제 같은 폴리머라제 연쇄반응에 사용된 폴리머라제와 상용적이다. 본 발명의 올리고머는 PCR 프로토콜에서 프라이머로 사용될 수 있다.
본 발명의 올리고머는 서열을 분리하는 프라이머 또는 임의의 서열을 갖는 프라이머로 유용하다. 임의의 서열 프라이머는 일반적으로 길이가 약 6, 7 또는 8개의 핵단량체일 수 있다. 그런 프라이머는 다양한 핵산 증폭프로토콜(PCR, 리가제 연쇄반응 등) 또는 클로닝 프로토콜에 사용될 수 있다. 본 발명의 치환 결합은 프라이머로 작용하기 위해 올리고머의 능력을 일반적으로 방해하지 않는다. 3'말단잔기 이외의 부위에서 2'-변형, 올리고머 RN아제 H 인콤피턴트 또는 다른 안정한 뉴클레아제로 되는 다른 변형을 갖는 본 발명의 올리고머는 뉴클레아제를 함유하는 세포추출물 또는 다른 용액에서 RNA 또는 DNA 서열을 위한 프로브나 프라이머로 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 올리고머는 표적핵산을 함유하는 샘플과 올리고머를 혼합한 다음에 표적핵산과 올리고머를 혼성화시켜 샘플중의 핵산을 증폭시키고 PCR, LCR 또는 다른 적당한 방법으로 표적 핵산을 증폭시키기 위한 프로토콜에 사용될 수 있다.
EDTA, DTPA 또는 1,2-디아미노시클로헥산 아세트산의 유사체 같은 킬레이트제로 유도된 올리고머는 기술된 바와 같은 시험관내에서 다양한 진단분석에 사용될 수 있다(U.S. 특허번호 4,772,548, 4,707,440 및 4,707,352). 대안으로, 본 발명의 올리고머는 5-(3-요오도아세트아미도프로프-1-일) 2'-데옥시우리딘 또는 5-(3-(4-브로모부티르아미도)프로프-1-일)-2'-데옥시우리딘 같은 가교제로 유도될 수 있고 기술된 다양한 분석방법이나 키트에 사용될 수도 있다(국제공개번호 WO 90/14353).
전술한 용도 이외에, 유전자 발현을 저해하는 올리고머의 능력은 적당한 방법에 의해 피험체 세포 또는 재조합 시스템에서 발현 레벨을 측정함으로써 시험관 내에서 시스템에서 증명될 수 있다(Graessmann, M. et al,Nucleic Acids Res., 1991, 19.53-59).
상기한 본 발명에서, 다음의 실시예들은 본 발명을 보다 잘 설명하기 위해 제공된다. 실시예들은 본 발명을 예시하고 본 발명을 한정하도록 해석되지 않게 제공된다.
핵단량체 신톤 올리고머의 합성 개관:
본 발명의 올리고머는 올리고뉴클레오티드 유도체 합성의 이 분야에서 공지된 반응을 사용하여 합성되었다. 예를들면 Flandor, J. 및 Yam, S.Y.,Tetrahed-ron Letts., 1990, 31, 597-600; Mattson, R.J. et al.,J Org Chem., 1990, 55,2552-2554; Chung, C.K. et al.,J Org Chem., 1989, 54,2767-2769 참조.
표 1에 구체적으로 나열된 다양한 치환결합에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 치환결합은 그 구조내에 하나 이상의 질소, 황, 및/또는 산소원자를 함유하여 다양해질 수 있다. 치환결합내의 이들 원자위치는 "5'"말단, "2'" 또는 "3'"에 대한 중간 및 "4'"말단으로 다양해질 수 있다. 본 단원에서, 일련의 대표적인 합성반응 도면이 치환결합내에 질소와 산소원자의 조합과 다양한 위치에 대한 경로를 제공하여 개시된다.
변형될 도 1-25에 나타낸 합성은 올리고뉴클레오티드 화학분야에서 실시하는 것들로 공지된다. 예를들면, 염기보호를 항상 합성도면에 표시하진 않지만, 그런 것이 바람직하며 이 분야에서 공지된 시약과 기술을 사용하여 완성할 수 있다. 예를들면 Protective Groups in Organic Synthssis (Theodora W. Greene, John Wiley 및 Sons, 1981)참조. 유사하게도, 보호기의 사용이 어떤 경우에는 나타나지만 예시된 본 발명의 올리고머를 합성하기 위해 반응물을 차단하는 것이 항상 필요한 것은 아니다.
(실시예 1)
도 1에 나타낸 처음 다섯 단계는 이소부틸 보호된 세린올아미노산알코올 제조에 관한 것이다. 도 1의 제6단계 및 후속단계들은 세린올 치환된 티민 포스포르아미디트 건축블록의 합성을 지향한다.
도 1의 단계 1에서, 세린 아미노산의 아미노기는 1과 디-tert-부틸디카보네이트를 반응시켜 보호함으로써 화합물 2를 얻는다. 다른 등가의 보호기를 사용할 수도 있다. 다음 단계에서, 화합물 2의 β-히드록실기는 디히드로피란으로 차단되어 완전히 보호된 아미노산 3을 얻는다. 다음에 아미노산 3은 황화 이붕소-디메틸착체와 반응하여 알코올 4를 제공하고, 염화 이소부틸에 노출시켜 5를 얻었다. 이 환원반응은 이소부틸클로로포르메이트 및 수소화붕소나트륨을 사용하여 실행할 수 있다(참조: K.Ramasamy, R.K. Olsen 및 T. Emery, Synthesis, 1982, 42). 5와 트리플루오로아세트산을 30분동안 반응시킨 다음에 NaHCO3로 세척하여 6을 얻었다.
티민아세트산 7을 문헌에 기술된 대로 제조하였다(참조: L. Kosynkina, W. Wang 및 T.C. Liang,Tetrahadron Letts, 1994, 35,5173). 혼합된 무수물 조건하에서 6과 7을 결합시켜 8을 제공하였다. DMTCl엘로 8을 디메톡시트리틸화하여 화합물 9를 얻고 염기로 가수분해하여 10을 얻었다. 표준조건하에서 10을 포피시틸화하여 세린올 결합된 티민 건축 블록 11을 제공하였다. 다음에 이 신톤을 종래의 화학을 사용하는 성장 올리고머로 가하였다. 포스포르아미디트 또는 포스포네이트 화학 같은 어떤 DNA 합성화학이 상기한 유사한 방법으로 단량체 또는 이량체를 결합시키는데 사용될 수 있다.
(실시예 2)
반응도 2에서, 티민아세트알데히드 13은 티민을 브로모아세트알데히드 디메틸아세탈로 처리시킨 다음에 12를 수성 TFA로 가수분해하여 제조하였다. 다음에 알데히드 13 및 아민 6을 결합시키고 대응하는 중간체를 도 1에 사용된 단계와 유사한 방법으로 포스포르아미디트 건축블록 17로 변환시켰다.
(실시예 3)
반응도 3에서, 개시물질은 β-치환된 아미노산 18이다. 치환된 아미노산은 도 1 및 도 2에 사용된 단계의 방법을 시행함으로써 포스포르아미디트 건축블록 27로 변환시켰다.
(실시예 4)
도 4에서, 개시 아미노 알코올 21은 CrO3/피리딘혼합물로 산화시켜 알데히드 28을 얻었다. 알데히드를 염기의 존재에서 할로겐화 알킬과 반응시켜 혼합물 29를 얻었다. 아미노알코올 29는 도 1 및 도 2에서 사용된 단계와 유사한 방법으로 건축블록 35로 변형시켰다.
(실시예 5)
도 5에서, 처음의 네단계는 본질적으로 도 1에서 사용된 동일한 단계이며 여기서 아스파르트산이 세린 대신에 사용된다. 아스파르트산 메틸에스테르 36으로 완전히 보호된 알코올 40을 얻고, 아세트산으로 선택적인 탈보호를 하여 41을 제공하였다. 41을 CrO3/피리딘으로 산화시켜 대응하는 알데히드 42를 얻었다. 알데히드 42를 수소화 트리아세트옥시붕소나트륨의 존재에서 o-벤질히드록실아민으로 환원아미노화 반응시켜 43을 얻었다(참조: T.Kolasa 및 M.J. Miller,J. Org. Chem., 1990, 55,1711). 다음에 알코올 39를 상기한 바와 동일한 반응 조건을 본질적으로 사용하지만, 39의 히드록실작용을 위해 알릴보호기로 알데히드 46으로 전환시킨다. 수소화트리아세트옥시붕소나트륨의 존재에서 알데히드 46과 히드록실아민 43을 반응시킨 다음에 아미노보호기를 탈보호시켜 비스아민 48을 얻었다. 비스아민 48을 도 1에서 사용된 단계를 실행함으로써 이량체 53으로 전환시켰다.
(실시예 6)
도 6에서, 미츠노부(Mitsunobu) 반응조건(참조: O. Mitsunobu Synthesis, 1981, 1)하에서 알코올 54와 O-벤질히드록실아민 55를 결합시켜 화합물 56을 제공한다. 중간체 56을 수소첨가반응시킨 다음에 아세틸화시켜 57을 얻었다. 57을 TFA에 노출시켜 "TBDMSi" 보호기를 차단하지 않고 58을 얻었다. 58을 7과 결합시킨 다음에 디메톡시트리틸화로 60을 제공하였다. 최종 건축블록 62를 염기 가수분해 다음에 포스피틸화에 의해 60으로부터 완성시켰다.
(실시예 7)
도 7에서, 세린올 4를 할로겐화물 59로 전환시키고 티민으로 알킬화하여 63을 제공하였다. 63에서 보호기를 제거하고 DMT-보호된 히드록시아세트산과 결합시키고 포스피틸화하여 66을 얻었다.
(실시예 8)
도 8에서, 알코올 64를 N-히드록실아미노프로파노산 69와 결합시켜 70을 얻었다. 할로겐화물 73으로 티민을 알킬화하여 74를 얻고 탈보호하고 76과 결합시킨 다음에 가수분해로 78을 얻었다. 78을 70으로 응축시킨 다음에 포스피틸화로 히드록사메이트 이량체 80을 얻었다.
(실시예 9)
도 9에서, N-히드록실아미노 프로파노알데히드 81을 알코올 64와 결합시키는데 사용한다. 이량체 88을 도 8에서 사용된 단계를 실행함으로써 83 및 86으로부터 제조된다.
(실시예 10)
도 10에서, α-브로모콘 -β-아미노프로파노산 메틸에스테르 89를 티민으로 알킬화하여(참조: T.Kolasa 및 M.J. Miller,J. Org. Chem., 1990, 55,4246) 90을 제조하였다. 중간체 90을 수산화나트륨으로 가수분해시켜 산 91을 얻고 이것을 6과 결합시켜 92를 제공한다. 화합물 92를 다음에 도 1에 기술된 단계를 사용하는 포스포르아미디트 건축블록 95로 전환시킨다.
(실시예 11)
도 11에서, 티민을 할로겐화알킬아민 96으로 알킬화하여(참조: 할로겐화아미노알킬 제조를 위해 R.K. Olsen, K. Ramasamy 및 T. Emery,J. Org. Chem., 1984, 49,3527 및 Islam et al.,J. Med. Chem., 1994, 37,293-304) 97를 얻었다. 화합물 97을 TFA에 노출시킨 다음에 알킬화하여 100을 얻었다. 건축블록 103을 디메톡시트리틸화, 가수분해, 다음에 포스피틸화에 의해 100으로부터 얻는다.
(실시예 12)
도 12는 아스파르트산에서 교대로 제조된 알데히드 107 및 N-히드록실아민 43으로부터 히드록사메이트 골격 이량체 111을 얻는 대안적인 경로이다.
(실시예 13)
도 13에서, 이량체 115는 도 2에 기술된 반응의 동일한 단계를 실행함으로써중간체 108 및 13으로부터 제조된다.
(실시예 14)
도 14에서 N-히드록실티민이 제조되고(참조: Kim, C.U., et al.,Tetrahed-ron Letts., 1992, 33,25-28) N-히드록시프탈리미드와 결합하여 117을 제공하고 에탄올중의 히드라진에 노출시켜 118을 얻었다. 118을 에폭시화 DMT-보호된 글리세롤로 처리하여 120을 제공한다. 다음에 중간체 120을 표준방법을 사용하여 포스포르아미디트 121로 변형시킨다. 두 번째 합성에서, 화합물 118을 환원 아미노화 조건하에서 아미노산알데히드 122와 결합시켜 123을 제공한다. 2차 아미노 작용기를 FMOCCl로 보호한 다음에 가수분해하여 125를 얻었다.
(실시예 15)
도 15에서 1,2-디히드록시프로파노산 126을 N-히드록실아민티민 118과 결합시켜 127을 얻고, 다음에 표준조건하에서 포스포르아미디트 신톤 129로 변형시킨다. 화합물 118을 아디프산과 결합시키고 핵산 건축블록 133으로 변형시킨다.
(실시예 16)
도 16에서, 먼저 건축블록 136을 도 1에 기술된 유사한 방법으로 118 및 134로부터 합성시킨다. 139와 118을 결합시켜 140을 제공하였다. 137을 118로 처리하여 138을 제공하고 140으로 응축시켜 이량체 141을 얻는다.
(실시예 17)
도 17에서, 알데히드 142와 글리신벤질에스테르를 결합시켜 143을 얻는다. 143을 7로 처리하여 145를 제공하고 아세트산에 노출시켜 148을 얻는다. 148을Boc-NH-O-아세틸히드록실아민으로 미츠노부 알킬화시켜 147을 얻고 수소첨가반응시켜 건축블록 150을 얻었다. 유사하게 상기한 바와 동일한 반응을 실행시키고 143과 13을 결합시켜 신톤 149를 얻었다.
(실시예 18)
도 18에서, 알데히드 142 및 Boc-NH-O-벤질히드로일아민의 환원아미노화로 151을 얻었다. 151의 수소첨가반응 후에 152를 글리콜산 153으로 알릴화하여(B.C. Borer 및 D.C. Balogh,Tetrahedron Letts., 1991, 32,1039) 154를 얻었다. 154를 TFA로 처리하여 Boc 보호기를 제거하고 결합시켜 155를 얻었다. 155의 히드록실보호기를 선택적으로 아세트산으로 제거하여 156을 얻었다. 화합물 156을 표준 반응조건을 사용하여 건축블록 157로 변형시킨다. 유사하게 건축블록 158을 157의 제조에 사용된 단계를 실행시키고 154와 13을 결합시켜 제조한다.
(실시예 19)
도 19에서, 티민-N-히드록실아민 160을 알코올 162로 알킬화하여 163을 얻는다. 화합물 163을 도 1에서 사용된 단계를 실행함으로써 포스포르아미디트 건축블록 166으로 변형시켰다.
(실시예 20)
도 20에서, 먼저 중간체 169를 표준반응조건을 사용하여 글루탐산으로부터 합성시킨다. 티민을 169로 알킬화하여 170을 얻고 TFA로 처리하여 171을 제조하였다. 중간체 171을 Boc-글리신과 결합시켜 173을 제조하고 가수분해시켜 단량체 신톤 174를 얻었다. 유사하게 172를 118과 Boc-아미노아세트알데히드를 결합시키고벤질에스테르를 가수분해하여 제조하였다.
(실시예 21)
도 21에서, 중간체 177을 표준반응조건을 사용하여 Boc-NH-O-벤질히드록실아민과 175로부터 제조한다. 177의 수소첨가 반응후에 N-히드록시티민 116과 결합시켜 178을 제조하였다. THP보호기의 제거후에 디메톡시트리틸화 및 포스피틸화로 건축블록 신톤 181을 얻었다. 유사하게 182를 THP-히드록시아세트산 대신에 THP-히드록시아세트알데히드를 사용하고 상기 모든 반응을 실행시킴으로써 제조하였다.
(실시예 22)
도 22에서, 건축블록 191은 도 22의 아랫부분에 나타낸 반응 조건들을 실행하고 공지된 개시물질 183을 사용하여 제조하였다.
(실시예 23)
도 23에서, 건축블록 199의 합성은 도 23의 아랫부분에 나타낸 반응조건들을 실행하고 개시물질 183을 사용하여 완성되었다.
(실시예 24)
도 24에서, 개시물질 200은 도 24의 아랫부분에 나타낸 반응조건들을 실행하고 건축 블록 207로 변형시킨다.
(실시예 25)
본 실시예에서 사용하고 발생된 화합물을 도 1에 나타낸다.
세린 (1): 티민(37.8g, 300mmol)을 200㎖의 물중의 수산화칼륨(64.5g, 1150mmol)의 용액에 용해시켰다. 이 용액을 40℃ 수욕에서 가온시키고 100㎖의 물중의 브로모아세트산(62.5g, 450mmol)의 용액을 1시간에 걸쳐 가하였다. 반응물을 이 온도에서 1시간 더 교반시켰다. 실온으로 냉각시키고 PH를 농 HCI로 5.5로 조정하였다. 다음에 용액을 2시간동안 냉장고에서 냉각시켰다. 형성된 어떤 침전(미반응 티민)을 여과로 제거시켰다. 용액을 농 HCl로 pH2로 조정하고 2시간동안 냉동기에 놓았다. 백색침전을 여과로 수집하고 6시간동안 40℃에서 진공오븐에서 건조시켰다. 수율은 44g(88%)이었다.
N-Boc-L-세린 메틸에스테르(2): L-세린메틸에스테르(15.6g, 100mmol)를 실온에서 THF/DMF (각각 100㎖) 혼합물에 현탁시켰다. 이 교반혼합물에 트리에틸아민(11.13g, 110mmol) 다음에 디-tert-부틸디카보네이트 (24.0g, 110mmol)를 가하고, 교반을 30분동안 실온에서 계속하였다. 물(20㎖)을 가하고 용액을 8시간동안 실온에서 교반시켰다. 용액을 증발건조시켰다. 잔사를 아세트산에틸(250㎖)에 현탁시키고 황화수소칼륨(0.25N용액, 100㎖)으로 처리하였다. 생성물을 아세트산에틸 용액으로 바로 추출하였다. 유기추출물을 물(100㎖), 염수(100㎖)로 세척하고 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 유기용매를 증발시켜 오일같은 잔사 26g(90%)을 제공하였다.
N-Boc-L-세린(OTHP)메틸에스테르 (3): 화합물2(15g, 68.49mmol)를 건조 CH2Cl2(100㎖)에 용해시키고 실온에서 3,4-디히드로-2H-피란(8.4g, 100mmol) 및 p-톨루엔술폰산(100mg)의 촉매량으로 처리시켰다. 반응 혼합물을 12시간동안 실온에서 교반시키고 증발건조시켰다. 잔사를 아세트산에틸(200㎖)에 용해시키고, 5%NaHCO3용액(100㎖), 물(50㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. 유기추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사는 다음 단계에 사용하기 충분할 정도로 순수하였고 그 자체로 사용되었다. 수율 15g(72%).
N-Boc-L-세린올 (OTHP) (4): 세린(OTHP)메틸에스테르(10g, 33mmol)를 건조 THF(100㎖)에 용해시키고 아르곤 분위기하에서 얼음욕에서 0℃로 냉각시켰다. 이 냉각 교반된 용액에 0℃ 온도에서 1시간동안 황화붕소-메틸착체(THF중의 2M 용액, 100㎖, 200mmol)를 가하였다. 붕소의 첨가후에, 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 6시간동안 40℃에서 가열시켰다. 반응혼합물을 0℃로 냉각시키고 물과 아세트산으로 pH 6-7로 중화시키고 에테르(3× 100㎖)로 추출하였다. 에테르 추출물을 물(2×100㎖) 및 염수(100㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켜 오일로서 미정제 생성물을 얻었다. 오일을 용리제로서 헥산→ 아세톤을 사용하는 실리카겔의 섬광컬럼으로 정제하여 8g(88%)의 순수한 생성물을 얻었다.
N-Boc-L-세린(OTHP)Olb (5): 0℃에서 건조 CH2Cl2(100㎖)중의 화합물4(8g, 29.09mmol)의 교반용액에 TEA(3.54g, 35mmol) 다음에 염화이소부티릴(3.71g, 35mmol)을 30분동안 가하였다. 반응 혼합물을 4시간동안 실온에서 교반시키고 증발 건조시켰다. 잔사를 EtOAC(200㎖)에 용해시키고 5% NaHCO3용액(50㎖), 물(50㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. 유기추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켜 오일로서 미정제 생성물을 얻었다. 오일을 용리제로서 핵산 → 아세톤을 사용하는 실리카겔의 섬광컬럼으로 정제하여 7.9g(79%)의 순수한 생성물을 얻었다.
L-세린올(OIb) (6): 화합물 5 (10g, 28.98mmol)를 CH2Cl2(100㎖)에 용해시키고 실온에서 1시간동안 TFA(50㎖)로 교반시키고 증발건조시켰다. 잔사를 메탄올(50㎖)에 용해시키고 다시 증발시켰다. 잔사를 CH2Cl2(200㎖)에 용해시키고 포화 NaHCO3용액(2×100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. 유기추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켜 4.5(96%)의 생성물을 오일로서 얻었다.
N-(티민일아세틸)-L-세린올(OIb) (8): 티민아세트산 7(7.3g, 40mmol) 및 N-메틸모르폴린 (4.4㎖, 40mmol)을 100㎖의 DMF에 용해시켰다. 용액을 아르곤분위기 하에서 -20℃로 냉각시켰다. 이 냉각 교반된 용액에 이소부틸 클로로포르메이트(5.2㎖, 40mmol)를 한번에 가하였다. 15분후에 30㎖의 DMF중의 용액 6(6.44g, 40mmol)(동일온도로 냉각시킴)을 가하였다. 반응 혼합물을 30분동안 -20℃에서 교반시키고 실온으로 가온시키고 1시간동안 교반을 계속하였다. 반응혼합물을 증발 건조시키고 잔사를 CH2Cl2(200㎖)에 용해시켰다. 유기용액을 5% NaHCO3용액 (100㎖), 물(100㎖) 및 염수(5㎖)로 세척하였다. 유기추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켜 거품으로서 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리제로서 CH2Cl2→ 아세톤을 사용하는 실리카겔의 섬광컬럼으로 정제시켜 12g(92%)의 순수한 생성물을 얻었다.
4,4'-디메톡시트리틸-N-(티민일아세틸)-L-세린올(OIb)(9): 화합물8(10g,30.58mmol)을 건조피리딘(3×50㎖)으로 공증발시키고 건조피리딘(100㎖)에 용해시켰다. 이 용액에 아르곤 분위기하에서 실온에서 TEA(3.54g, 35mmol) 다음에 DMTCl(11.83g, 35mmol)을 가하였다. 반응혼합물을 12시간동안 교반시키고 메탄올(20㎖)로 켄칭시키고 30분동안 교반시켰다. 용액을 증발건조시켜 CH2Cl2(200㎖)에 용해시켰다. 유기추출물을 5% NaHCO3용액(100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다, CH2Cl2층을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켜 거품으로서 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리제로서 CH2Cl2→ 아세톤을 사용하는 실리카겔의 섬광컬럼으로 정제시켜 17g(88%)의 순수한 생성물을 얻었다.
1-0(4,4'-디메톡시트리틸)-2[아미노(티민일아세틸)]-L-프로판-1,3-디올(10): 화합물9(10g, 15.89mmol)를 메탄올(20㎖)에 용해시켰다. 이 용액에 1N NaOH 용액(20㎖, 20mmol)을 0℃에서 가하였다. 반응혼합물을 1시간동안 교반시키고 아세트산으로 pH7로 켄칭시켰다. 용액을 EtOAc(2× 200㎖)로 추출하였다. 유기추출물을 5% NaHCO3용액(100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. EtOAc 층을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켜 거품으로서 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리제로서 CH2Cl2→ 아세톤을 사용하는 실리카겔의 섬광컬럼으로 정제시켜 8.2g(92%)의 순수한 생성물을 얻었다.
1'-O-(4-4'디메톡시트리틸)-2-[아미노(티민일아세틸)-L-프로판-3'-O-(N,N-디이소프로필)-β-시아소에틸포스포르아미디트 (11): 화힙물10(8.00g, 14.31mmol)을 건조피리딘(3×50㎖)으로 공증발시키고 진공하에서 밤새 고체 NaOH상에서 건조시켰다. 건조시킨 물질을 건조 CH2Cl2(100㎖)에 용해시키고 아르곤분위기하에서 0℃로 냉각시켰다. 이 냉각용액에 N,N-디이소프로필에틸아민(5.23g, 25mmol)다음에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포르아미디트(4.72g, 20.00mmol)를 아르곤분위기하에서 가하였다. 반응혼합물을 1시간동안 0℃에서, 1시간동안 실온에서 교반시켰다. 반응혼합물을 CH2Cl2(100㎖)로 희석시켰다. CH2Cl2용액을 5% NaHCO3용액(100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. CH2Cl2층을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켜 거품으로서 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리제로서 CH2Cl2→ 0.1% TEA 함유 아세톤을 사용하는 실리카겔의 섬광컬럼으로 정제하여 10g(x%)의 순수한 생성물을 얻었다. 거품을 CH2Cl2(15㎖)에 용해시키고 1시간동안 아르곤하에서 건조헥산(2000㎖)의 교반용액으로 적가하였다. CH2Cl2용액 첨가후에 형성된 침전을 1시간동안 더 교반시키고, 여과시키고, 건조헥산(200㎖)으로 세척하고 밤새 고체 NaOH상에서 건조시켰다. 수율: 9.5g(87%)
(실시예 26)
(도 26 참조)
N-(tert-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-L-세린 (2): O-벤질-L-세린1(10g, 51. 28mmol)을 실온에서 THF/H2O(8:2, 100㎖) 혼합물에 현탁시켰다. 이 교반용액에 트리에틸아민(6.06g, 60mmol) 다음에 디-tert-부틸디카보네이트 (13.08g,60mmol)를 가하고 교반을 밤새 실온에서 계속하였다. 균질한 용액을 증발건조시키고 잔사를 아세트산에틸(300㎖)에 용해시켰다. 유기추출물을 0.5N용액의 황산수소칼륨(100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. 아세트산에틸 추출물을 무수황산나트륨 상에서 건조시키고 증발건조시켜 14g(93%)의 오일같은 잔사를 얻었다.
N-(tret-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-L-세린올 (3): N-(tert-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-L-세린2(6.0g 20.34mmol)를 건조 THF에 용해시키고 아르곤분위기하에서 -20℃로 냉각시켰다. 이 냉각교반된 용액에 TEA(2.32g, 23mmol) 및 이소부틸클로로포르메이트(3.13g, 23mmol)를 가하였다. 교반을 아르곤 분위기하에서 -20℃에서 30분동안 계속하였다. 반응 혼합물을 아르곤 분위기하에서 바로 여과시키고 침전을 건조 THF(50㎖)로 세척하였다. 조합한 여과액을 10분동안 THF/물(80:20, 200㎖)중의 NaBH4(7.4g, 200mmol)의 냉각(0℃)용액으로 서서히 가하였다. 첨가후에 반응 혼합물을 0℃에서 2시간동안 교반시키고 pH를 아세트산으로 7로 조정하였다. 용액을 증발건조시키고 아세트산 에틸/물 (300:150㎖)사이에 분배시키고 아세트산 에틸에서 추출하였다. 유기추출물을 염수(100㎖)로 세척하고, 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 미정제 생성물을 용리제로서 CH2Cl2--> EtOAc를 사용하는 실리카겔 상에서 섬광 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 생성물을 함께 푸울화하고 증발건조시켜 4.7(82%)의 순수한 생성물을 오일로서 얻었다.
Figure pct00017
N-(tert-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-L-세린올-Ib (4): 건조피리딘(50㎖)중의 N-(tert-부틸옥시카르보닐)-0-벤질-L-세린올3(4.3g, 14.3mmol)의 건조시킨 용액에 실온에서 TEA(2.02g, 20mmol)를 가하였다. 이 교반된 용액에 이소부티르무수물(3.l6g,20mmol)을 가하고 교반을 아르곤 분위기하에 밤새 계속하였다. 반응혼합물을 증발건조시키고 EtOAc(100㎖)와 NaHCO3(5%용액, 100㎖)사이에 분배시키고 EtOAc로 추출하였다. 유기추출물을 물(100㎖), 염수(5㎖)로 세척하고 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 건조시킨 용액을 증발건조시켜 미정제 잔사를 얻었다. 잔사를 용리제로서 헥산 --> EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광 크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 푸울화하고 증발시켜 오일같은 생성물 4.5g(84%)을 얻었다.
Figure pct00018
Figure pct00019
N-(티민일아세틸)-O-벤질-L-세린올-O-Ib (6): N-(tert-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-L-세린올-O-Ib4(4.3g, 12.25mmol)를 트리플루오로아세트산 (20㎖)과 CH2Cl2(2㎖)중에서 30분동안 실온에서 교반시켰다. 반응혼합물을 증발건조시키고, 건조 CH3OH(10㎖)에 용해시키고 다시 증발건조시켰다. 잔사를 고체 KOH상에서 12시간동안 진공하에서 건조시켰다. 건조시킨 잔사를 특성을 규명하지 않고 다음 반응에 그대로 사용하였다.
티민 아세트산5(2.76g, 15mmol)를 건조 DMF(75㎖)에 용해시키고 아르곤하에서 -20℃로 냉각시켰다. 이 냉각교반된 용액에 N-메틸모르폴린 (1.72g, 17mmol) 다음에 이소부틸클로로포르메이트(2.31g, 17mmol)를 가하였다. 15분 교반후에 건조 DMF(50㎖)중의 상기 TFA염의 용액을 N-메틸모르폴린(1.72g, 17mmol)으로 중화시키고 티민아세트산의 냉각 교반된 용액으로 한번에 가하였다. 반응혼합물을 1시간 동안 -20℃에서 교반시키고 실온으로 가온시키고 교반을 밤새 계속하였다. 용액을 증발건조시키고 잔사를 CH2Cl2(250㎖) 및 물(100㎖)에 용해시키고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기추출물을 5% NaHCO3용액(100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. CH2Cl2추출물을 건조시키고 증발건조시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리제로서 CH2Cl2--> 아세톤을 사용하는 실리카겔 상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 필요한 분획을 수집하고 증발시켜 4.8g (94%)의 생성물을 얻었다. 순수한 생성물을 CH2Cl2/ 헥산으로부터 결정화하였다. 융점 : 122 - 124 ℃.1HNMR
Figure pct00020
Figure pct00021
N-(티민일아세틸)-L-세린올-O-Ib (7): N-(티민일아세틸)-O-벤질-L-세린올-O-Ib6(2.08g, 5mmol)을 에탄올(50㎖)에 용해시켰다. 이 용액에 Pd(OH)2(0.6g) 및 시클로헥센(5㎖)을 실온에서 가하였다. 반응 혼합물을 12시간동안 70℃에서 가열하였다. 촉매를 여과시키고 메탄올(20㎖)로 세척하였다. 여과액을 증발건조시켜 백색 고체를 얻었다. 백색고체를 최소량의 MeOH에 용해시키고 실온으로 냉각시켰다. 생성물을 미세분말로 결정화하였다. 융점: 196-198℃, 수율: 1.48g(91%).
Figure pct00022
4,4'-디메톡시트리틸-N-(티민아세틸)-L-세린올-O-Ib (8): N-(티민일아세틸)-L-세린올-0-Ib7(1.48g,4.5mmol)을 아르곤하에서 건조피리딘 (50㎖)에 용해시켰다. 이 교반시킨 용액에 TEA (0.51g, 5mmol)와 N,N-디메틸아미노피리딘 (0.10g)을 가하였다. 10분후에, 염화 4,4'-디메톡시트리틸 (1.69g, 5mmol)을 가하고, 교반을 밤새 아르곤하에서 실온에서 계속하였다. 반응혼합물을 MeOH(10㎖)로 켄칭시키고, 10분동안 교반하고 증발건조시켰다. 잔사를 EtOAc(200㎖)에 용해시키고, 5% NaHCO3용액 (100㎖), 물 (100㎖) 및 염수 (50㎖)로 세척하였다. 유기추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 미정제 생성물을 용리제로서 CH2Cl2--> EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광컬럼크로마토그래피로 정제시켰다. 순수한 분획을푸울화하고 증발시켜 2.5 g (88 %) 의 거품을 얻었다.1HNMR (CDCl3) : δ 1.04
Figure pct00023
1-0-(4,4'-디메톡시트리닐)-2[아미노(티민일아세틸)]-L-프로판-1,3-디올(9): 4,4'-디메톡시트리틸-N-(티민일아세틸)-L-세린올-O-Ib8(3.4g, 5.4mmol)을 MeOH(30㎖)에 용해시키고 얼음욕에서 0℃로 냉각시켰다. 이 냉각교반된 용액에 2N NaOH(10㎖, 20mmol)를 가하고 교반을 0℃에서 30분동안 계속하였다. 용액의 pH를 아세트산으로 7로 조정하고 증발건조시켰다. 잔사를 물(50㎖)과 CH2Cl2(150㎖)사이에 분배시키고 CH2Cl2로 추출하였다. 수층을 CH2Cl2(50 ㎖)로 다시 추출하였다. 조합한 유기추출물을 염수 (50 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2--> 아세톤을 사용하는 실리카겔상에서 섬광컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 수율 : 3.0g (99 %).1HNMR (CDCl3) : 1.72 (s, 3H, CH3), 3.0 (m,
Figure pct00024
1-O(4,4'-디메톡시트리틸)-2[아미노(티민일아세틸)]-L-프로판-3-0-(N,N-디이소프로필)-β-시아노에틸포스포르아미디트 (10): 1-0-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-[아미노(티민일아세틸)]-L-프로판-1,3-디올9(3.1g, 5.55mmol)를 밤새 진공하에서 고체 NaOH상에서 건조시키고 건조 CH2Cl2(100㎖)에 용해시켰다. 용액을 아르곤 분위기하에서 0℃로 냉각시켰다. 이 냉각 교반된 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민(1.29g, 10mmol) 다음에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포르아미디트(1.96g, 8.3mmol)를 가하였다. 반응혼합물을 1시간동안 0℃에서, 2시간동안 실온에서 교반시켰다. 반응물을 CH2Cl2(100㎖)로 희석시키고 유기층을 5% NaHCO3용액(100㎖), 물(10㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. CH2Cl2추출물을 건조시키고 증발건조시켜 오일같은 잔사를 얻었다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2--> 0.1% TEA 함유 EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 함께 푸울화하고 증발시켜 거품을 얻었다. 거품을 밤새 진공하에서 고체 NaOH상에서 건조시켰다. 건조된 거품을 건조 CH2Cl2(20㎖)에 용해시키고 아르곤하에서 1시간동안 건조헥산 (2000㎖)의 교반용액으로 적가하였다. 첨가후에, 형성된 침전을 1시간동안 더 교반시키고, 여과하고 건조핵산(100㎖)으로 세척하고 고체를 4시간동안 진공하에서 고체 NaOH상에서 건조시켰다. 수율: 3.5g (83%).
(실시예 27)
(도 27 참조)
N-(tert-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-D-세린 (12): O-벤질-D-세린11(5g, 25.64mmol)을 실온에서 THF/H2O (8:2, 70㎖)에 현탁시켰다. 이 교반된 혼합물에 트리에틸아민 (4.04g, 40mmol)다음에 디-tert-부틸디카보네이트 (6.54g, 30mmol)를 가하고 교반을 밤새 실온에서 계속하였다. 균질한 용액을 증발건조시키고 잔사를 아세트산에틸(150㎖)에 용해시켰다. 유기추출물을 황산수소칼륨(100㎖)의 0.5N용액, 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. 아세트산에틸추출물을 무수황산나트륨상에 건조시키고 증발건조시켜 7.56g (100%)의 오일같은 잔사를 얻었다.
N-(tert-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-D-세린올 (13): N-(tert-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-D-세린10(7.56g, 25.63mmol)을 건조 THF에 용해시키고 아르곤 분위기하에서 -20℃로 냉각시켰다. 이 냉각 교반된 용액에 TEA (3.03g, 30mmol)와 이소부틸클로로포르메이트(4.08g, 30mmol)를 가하였다. 교반을 아르곤 분위기하에서 -20℃에서 30분동안 계속하였다. 반응혼합물을 아르곤 분위기하에서 바로 여과시키고 침전을 건조 THF(50㎖)로 세척하였다. 조합한 여과액을 10분동안 THF/물(80:20, 200㎖)중의 NaBH4(7.4g, 200mmol)의 냉각(0℃)용액으로 서서히 가하였다. 첨가후예, 반응혼합물을 0℃에서 2시간동안 교반시키고 pH를 아세트산으로 7로 조정하였다. 용액을 증발건조시키고 아세트산에틸/물 (300:150㎖)사이에 분배시키고 아세트산에틸로 추출하였다. 유기추출물을 염수(100㎖)로 세척하고, 무수황산나트륨상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 미정제 생성물을 용리제로서 CH2Cl2--> EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광컬럼크로마토그래피로 정제시켰다. 순수한 생성물을 함께 푸울화하고 증발건조시켜 6.68g(92%)의 순수한 생성물을 오일로서 얻었다.
Figure pct00025
N-(tert-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-D-세린올-O-Ib (14): 건조 피리딘(50㎖)중의 N-(tert-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-D-세린올13(6.6g, 23.5mmol)의 건조시킨 용액에서 실온에서 TEA (3.03g, 30mmol)를 가하였다. 이 교반용액에 이소부티르무수물 (4.74g, 30mmol)을 가하고 교반을 아르곤 분위기하에서 밤새 계속하였다. 반응 혼합물을 증발건조시키고 EtOAc (200㎖)와 NaHCO3(5% 용액, 100㎖)사이에 분배시키고 EtOAc로 추출하였다. 유기추출물을 물 (100㎖), 염수 (50㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 건조시킨 용액을 증발건조시켜 미정제 잔사를 얻었다. 잔사를 용리제로서 핵산 --> EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제시켰다. 순수한 분획을 함께 푸울화하고 증발시켜 오일같은 생성물
Figure pct00026
N-(티민일아세틸)-O-벤질-D-세린올-O-Ib (15): N-(tert-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-D-세린올-O-Ib14(5.0g, 14.25mmol)를 30분동안 트리플루오로아세트산(20㎖) 및 CH2Cl2(20㎖)중에서 실온에서 교반시켰다. 반응혼합물을 증발건조시키고,건조 CH3OH (10㎖)에 용해시키고 다시 증발건조시켰다. 잔사를 CH2Cl2(150㎖)에 용해시키고 pH를 5% NaHCO3용액으로 7로 조정하고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 물(5㎖)과 염수(5㎖)로 세척하였다. CH2Cl2추출물을 건조시키고 증발건조시켰다. 이렇게 얻은 잔사를 12시간동안 진공하에서 고체 KOH상에서 건조시켰다. 건조잔사를 특성을 규명하지 않고 다음 반응에 그대로 사용하였다.
티민아세트산5(2.57, 14mmol)를 건조 DMF (50㎖)에 용해시키고 아르곤하에서 -20℃로 냉각시켰다. 이 냉각교반된 용액에 N-메틸모르폴린(1.52g, 15mmol) 다음에 이소부틸클로로포르메이트(2.04g, 15mmol)를 가하였다. 15분 교반후에, 건조 DMF (50㎖)중의 상기 아민의 용액을 티민아세트산의 냉각 교반된 용액에 한번에 가하였다. 반응혼합물을 1시간동안 -20℃에서 교반시키고, 실온으로 가온시키고 교반을 밤새 계속하였다. 용액을 증발건조시키고 잔사를 CH2Cl2(250㎖) 및 물(100㎖)에 용해시키고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기추출물을 5% NaHCO3용액 (100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. CH2Cl2추출물을 건조시키고 증발건조시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 용리제로서 CH2Cl2--> 아세톤을 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제시켰다. 필요한 분획을 수집하고 증발시켜2.8g (54 %) 의 순수한 생성물을 얻었다.1HNMR (CDCl3) : δ 1.04 (d, 6H,
Figure pct00027
표제 화합물도 "L"이성체 제조를 위해 기술된 방법을 사용함으로써 제조하였다. 사용된 시약들: 티민아세트산(2.2g, 12mmol); 이소부틸클로로포르메이트(1.77g, 13mmol); N-메틸모르폴린(1.52g, 15mmol); TFA 염 (3.65g, 10mmol); N-메틸모르폴린(1.5g, 15mmol) 및 건조 DMF (100㎖) 수율: 3.5g (84%).
N-(티민일아세틸)-D-세린올-O-Ib (16): N-(티민일아세틸)-O-벤질-D-세린올-O-Ib15(3.5g, 8.39mmol)를 에탄올(50㎖)에 용해시켰다. 이 용액에 Pd(OH)2(1.00g) 및 시클로헥센(10㎖)을 실온에서 가하였다. 반응혼합물을 12시간동안 70℃에서 가열하였다. 촉매를 여과시키고 메탄올 (20 ㎖)로 세척하였다. 여과액을 증발건조시켜 백색고체를 얻었다. 수율 : 2.7 g (98 %).1HNMR (Me2SO - d6) : δ 1.04 (d,
Figure pct00028
Figure pct00029
4,4'-디메톡시트리틸-N-(티민일아세틸)-D-세린올-0-Ib (17): N-(티민일아세틸)-D-세린올-O-Ib16(2.7g, 8.26mmol)을 아르곤하에서 건조피리딘(50㎖)에 용해시켰다. 이 교반용액에 TEA (1.0lg, 10mmol) 다음에 염화 4,4'-디메톡시트리틸(3.38g, 10mmol)을 가하고 교반을 밤새 아르곤하에서 실온에서 계속하였다. 반응 혼합물을 MeOH(10㎖)로 켄칭시키고, 10분동안 교반시키고 증발건조시켰다. 잔사를 EtOAc (250㎖)에 용해시키고, 5% NaHCO3용액 (100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. 유기추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 미정제 생성물을 용리제로서 CH2Cl2--> EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 푸울화하고 증발시켜 5.0g (96%)의 거품을 얻었다.
Figure pct00030
1-O-(4,4'-디메톡시트리닐)-2-[아미노(티민일아세틸)]-D-프로판-1,3-디올(18): 4,4'-디메톡시트리틸-N-(티민일아세틸)-D-세린올-O-Ib17(5.0, 7.95mmol)을 MeOH(30㎖)에 용해시키고 얼음욕에서 0℃로 냉각시켰다. 이 냉각교반된 용액에 2N NaOH (10㎖, 20mmol)를 가하고 교반을 0℃에서 30분동안 계속하였다, 용액의 pH를아세트산으로 7로 조정하고 증발건조시켰다. 잔사를 물(50㎖)과 CH2Cl2(250㎖)사이에서 분배시키고 CH2Cl2로 추출하였다. 수층을 CH2Cl2(50 ㎖)로 다시 추출하였다. 조합한 유기추출물을 염수 (50 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2--> 아세톤을 사용하는 실리카겔 상에서 섬광 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 수율 : 4.0 g (90 %).1HNMR (CDCl3) : 1.72 (s, 3H, CH3),
Figure pct00031
1-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-[아미노(티민일아세틸)]-D-프로판-3-O(N,N-디이소프로필)-β-시아노에틸포스포르아미디트 (19): 1-0-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-[아미노(티민일아세틸)]-D-프로판-1,3-디올18(2.79g, 5.0mmol)을 밤새 진공하에서 고체 NaOH상에서 건조시키고 건조 CH2Cl2(100㎖)에 용해시켰다. 용액을 아르곤 분위기하에서 0℃로 냉각시켰다. 이 냉각 교반된 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.29g, 10mmol) 다음에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포르아미디트 (1.96g, 8.3mmol)를 가하였다. 반응혼합물을 1시간동안 0℃에서 2시간동안 실온에서 교반시켰다. 반응물을 CH2Cl2(100㎖)로 희석시키고 유기층을 5% NaHCO3용액(100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. CH2Cl2추출물을 건조시키고 증발건조시켜 오일같은 잔사를 얻었다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2--> 0.1% TEA함유 EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 함께 푸울화하고 증발시켜 거품을 얻었다. 거품을 밤새 진공하에서 고체 NaOH상에서 건조시켰다. 건조시킨 거품을 건조 CH2Cl2(20㎖)에 용해시키고 1시간동안 아르곤하에서 건조헥산(2000㎖)의 교반용액으로 적가하였다. 첨가후에 형성된 침전을 1시간 더 교반시키고, 여과하고, 건조헥산(100㎖)으로 세척하고 고체를 4시간 동안 진공하에서 고체 NaOH상에서 건조시켰다. 수율: 3.3g (87%).
(실시예 28)
(도 28)
1-O-벤질-2[tert-부틸옥시카르보닐)아미노]-3-[3-N 3 -벤조일(티민일)-L-프로판올 (21):아르곤하에서 건조 THF(200㎖)중의 N3-벤조일티민20(5.75g,25mmol)의 교반용액에 실온에서 트리페닐포스핀(10.48g,40mmol) 및 Na-tert-부틸옥시카르보닐-β-벤조일옥시-L-세린올3(5.3g, 18.86mmol)을 가하였다. 15분후에, 디에틸아조디카르복실레이트 (6.96g, 40mmol)을 30분동안 서서히 가하였다. 반응혼합물을 알루미늄 호일로 커버하고 24시간동안 아르곤하에서 실온에서 교반시켰다. 용매를 증발건조시키고 잔사를 EtOAc (300㎖)에 용해시켰다. 유기추출물을 5% NaHCO3용액 (100 ㎖), 물 (100 ㎖) 및 염수 (100 ㎖)로 세척하고 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 건조 EtOAc 추출물을 증발건조시켜 오렌지오일을 얻었다. 미정제 생성물을 용리제로서 헥산 --> EtOAc를 사용하는 실리카 상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 필요한 생성물을 갖는 분획을 푸울화하고 증발시켜 담핑크 오일을 얻었다. 수율 :
Figure pct00032
2-[(tert-부틸옥시카르보닐)아미노]-3-[N 3 -벤조일(티민일)-L-프로판-1-올(22): 1-O-벤질-2-[(tert-부틸옥시카르보닐)아미노]-3-[N3-벤조일(티민일)-L-프로판올21(4.93g, 10mmol)을 MeOH (100㎖)에 용해시키고 Pd/C (10%, 1g)로 처리시켰다. 반응혼합물을 12시간동안 수소의 50psi에서 수소첨가반응시켰다. 촉매를 여과하고 MeOH (50㎖)로 세척하고 여과액을 증발건조시켰다. 잔사를 아세톤 / 헥산으로부터 결정화하여 3.70 g (92 %)의 순수한 생성물을 얻었다. 융점 : 156 - 159 ℃.1HNMR
Figure pct00033
1-O-이소부티릴-2-[(tert-부틸옥시카르보닐)아미노]-3-[N 3 -벤조일(티민일)-L-프로판올 (23): 2-[(tert-부틸옥시카르보닐)아미노]-3-[N3-벤조일(티민일)-L-프로판-1-올22(1.60g, 3.97mmol)을 건조 피리딘(30㎖)에 용해시키고 아르곤하에서 실온에서 교반시켰다. 이 교반용액에 TEA (0.51g, 5mmol) 및 이소부티르 무수물(0.79g, 5mmol)을 가하였다. 반응혼합물을 12시간동안 실온에서 교반시키고 증발 건조시켰다. 잔사를 EtOAc (150㎖)에 용해시키고 5% NaHCO3용액 (100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. 유기 추출물을 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2-->EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 함께 수집하고 증발시켜 1.6g(85%)의 거품을 얻었다. 순수한 생성물을 아세톤/핵산으로부터 결정화하였다. 융점: 165-167℃.
Figure pct00034
Figure pct00035
1-O-이소부티릴-2-[(β-히드록시아세틸)아미노]-3-[N 3 -벤조일(티민일)-L-프로판올 (24): 1-O-이소부티릴-2-[(tert-부틸옥시카르보닐)아미노]-3-[N3-벤조일(티민일)-L-프로판올23(1.6g, 3.38mmol)을 30분동안 실온에서 TFA(5㎖) 및 CH2Cl2(10㎖)의 혼합물에서 교반시키고 증발건조시켰다. 잔사를 건조 MeOH(10㎖)에 용해시키고 다시 증발시켰다. 이렇게 얻은 잔사를 진공하에서 밤새 고체 NaOH상에서 건조시켰다. 건조물질을 다음반응에 사용하였다.
건조 DMF (50㎖)중의 글리콜산 (0.53g, 7mmol)의 교반용액에 1-히드록시벤조트리아졸 (0.67g, 5mmol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염(EDC)(1.91g, 10mmol)을 가하였다. 15분동안 교반한후에, DMF(20㎖)중의 상기 TFA 염 및 TEA(1.01g, 10mmol)를 실온에서 가하였다. 반응혼합물을 12시간 교반하고 증발건조시켰다. 잔사를 CH2Cl2(150㎖) 및 물(100㎖) 사이에서 분배시키고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기추출물을 염수(50㎖)로 세척하고, 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2--> 아세톤을 사용하는 실리카겔 상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 필요한 생성물을 갖는 분획을 수집하고 증발시켜 1.35g (92 %)의 거품을 얻었다.1HNMR (CDCl3) : 1.16 (d, 6H, IbCH3), 1.94 (s, 3H,
Figure pct00036
1-O-이소부티릴-2-[(β-4,4'-디메톡시트리틸)-O-아세틸]-3-(N 3 -벤조일(티민일)-L-프로판올(25): 1-O-이소부티릴-2-[(β-히드록시아세틸)아미노]-3-[N3-벤조일(티민일)-L-프로판올24(1.2g, 2.78mmol)을 건조피리딘(50㎖)에 용해시키고 아르곤 분위기하에서 실온에서 교반시켰다. 이 교반용액에 TEA (0.35g, 3.5mmol) 및 염화 4,4'-디메톡시트리틸(1.18g, 3.5mmol)을 가하였다. 반응혼합물을 12시간동안 실온에서 교반시키고 MeOH(10㎖)로 켄칭시키고 증발건조시켰다. 잔사를 EtOAc(150㎖)에 용해시키고, 5% NaHCO3용액 (100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. 유기추출물을 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2--> EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 푸울화하고 증발시켜 1.7g (83%)의 순수한 생성물을 얻었다.
Figure pct00037
2-[β-(4,4'-디메톡시트리틸)-0-아세틸)아미노)-3-티민일-L-프로판올 (26): 1-O-이소부티릴-2-[(β-(4,4'-디메톡시트리틸)-0-아세틸)아미노]-3-[N3-벤조일(티민일)-L-프로판올25(1.55g, 2.05mmol)을 MeOH(20㎖)에 용해시키고 얼음욕에서 0℃로 냉각시켰다. 이 냉각 교반된 용액에 2N NaOH (5㎖, 10mmol)를 가하고 교반을 0℃에서 30분동안 계속하였다. 용액의 pH를 아세트산으로 7로 조정하고 증발건조시켰다. 잔사를 물(50㎖)과 CH2Cl2(150㎖)사이에서 분배시키고 CH2Cl2로 추출하였다. 수층을 CH2Cl2(50㎖)로 다시 추출하였다. 조합된 유기추출물을 염수 (5㎖)로 세척하고 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2--> 아세톤을 사용하는 실리카겔상에서 섬광 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 수율 : 1.0g (99%).
Figure pct00038
2-[(β-(4,4'-디메톡시트리틸)-O-아세틸)아미노]-3-티민일-L-프로판-1-O-(N, N-디이소프로필)-β-시아노에틸-포스포르아미디트 (27): 2-[(β-(4,4'-디메톡시트리틸)-O-아세틸)아미노]-3-티민일-L-프로판올26(1.00g, 2.09mmol)을 밤새 진공하에서 고체 NaOH상에서 건조시키고 건조 CH2Cl2(50㎖)에 용해시켰다. 용액을 아르곤 분위기하에서 0℃로 냉각시켰다. 이 냉각 교반된 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.54g, 4.2mmol) 다음에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포르아미디트 (0.73g, 3.1mmol)을 가하였다. 반응혼합물을 1시간동안 0℃에서, 2시간동안 실온에서 교반시켰다. 반응물을 CH2Cl2(100㎖)로 희석시키고 유기층을 5% NaHCO3용액(100㎖), 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 세척하였다. CH2Cl2추출물을 건조시키고 증발건조시켜 오일같은 잔사를 얻었다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2--> 0.1% TEA를 함유하는 EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 함께 푸울화하고 증발시켜 거품을 얻었다. 거품을 밤새 진공하에서 고체 NaOH상에서 건조시켰다. 건조된 거품을 건조 CH2Cl2(10㎖)에 용해시키고 30분동안 아르곤하에서 건조헥산(800㎖)의 교반용액으로 적가하였다. 첨가후에, 형성된 침전을 30분 더 교반시키고 여과하고, 건조핵산(100㎖)으로 세척하고 고체를 4시간동안 진공하에서 고체 NaOH상에서 건조시켰다. 수율: 1.3g (82%).
(실시예 29)
(도 29)
N α -tert-부틸옥시카르보닐-O-벤질히드록실아민 (28): O-벤질히드록실아민 염산염 (15.9g, 100mmol)을 THF(150㎖) 및 물(50㎖)혼합물에 현탁시켰다. 이 교반된 혼합물에 TEA(15.15g, 150mmol) 다음에 디-tert-부틸디카보네이트(23.98g, 110mmol)를 가하였다. 반응혼합물을 12시간 동안 실온에서 교반시키고 증발건조시켰다. 잔사를 EtOAc (250㎖)와 물(200㎖)사이에서 분배시키고 EtOAc로 추출하였다. EtOAc 추출물을 황산수소칼륨(100㎖) 및 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고 증발 건조시켜 15g(91%)의 맑은 오일을 얻었다.
1-클로로-2-(테트라히드로피란일)옥시-에탄 (29): 1-클로로에탄올(8.06, 100mmol)을 건조 CH2Cl2(100㎖)에 용해시키고 아르곤하에서 얼음욕에서 0℃로 냉각시켰다. 이 교반용액에 디히드로피란(12.6g, 150mmol) 다음에 피리디늄-p-톨루엔-4-술포네이트(1.25g, 5mmol)를 가하고 밤새 교반을 계속하였다. 반응혼합물을 증발건조시키고 EtOAc(200㎖)에 용해시켰다. EtOAc 추출물을 5% NaHCO3용액(100㎖), 물(100㎖) 및 염수(100㎖)로 세척하였다. 유기추출물을 건조시키고 증발건조시켰다. 미정제 물질을 용리제로서 헥산 --> CH2Cl2를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제시켰다. 순수한 분획을 함께 수집하고 증발시켜 11g(67%)의 순수한 생성물을 얻었다.
N-tert-부틸옥시카르보닐-N-[(테트라히드로피란일)에틸-O-벤질히드록실아민 (30): 건조 DMF(50㎖)중의 Nα-tert-부틸옥시카르보닐-O-벤질히드록실아민28(5.79g, 25.96mmol)의 교반용액에 0℃에서 아르곤 분위기하에서 15분동안 서서히 NaH(60%, 1.2g, 30mmol)를 가하였다. 반응물을 30분동안 0℃에서, 1시간동안 실온에서 교반시켰다. 1-클로로-2-(테트라히드로피란일)옥시-에탄29(4.95g, 30mmol)을 가하고 반응혼합물을 12시간동안 80℃에서 가열시켰다. 반응물을 냉각시키고 증발건조시켰다. 잔사를 물 (50㎖)에 현탁시키고 용액의 pH를 7로 조정하고 EtOAc(150㎖)로 추출하였다. EtOAc 추출물을 물과 염수로 세척하고, 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사를 용리제로서 헥산-->CH2Cl2를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 필요한 분획을 수집하고 증발시켜 6.0g(66%)의 오일같
Figure pct00039
N-tert-부틸옥시카르보닐-N-[(2-히드록시)에틸]-O-벤질히드록실아민(31): THF:물: AcOH(1:1:1:,100㎖)중의 N-tert-부틸옥시카르보닐-N-[(테트라히드로피란일)옥시]에틸-O-벤질히드록실아민30(3.51g,10mmol)의 교반용액을 3시간동안 70℃에서 가열하였다. 반응물을 0℃로 냉각시키고 pH를 고체 NaHCO3로 7로 조정하였다. 반응혼합물을 EtOAc(2×75㎖)로 추출하였다. 조합한 유기추출물을 물(100㎖)과 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2-->EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획
Figure pct00040
N-tert-부틸옥시카르보닐-N-[[(2-이소부티릴)옥시]에틸]-O-벤질히드록실아민 (32): 건조피리딘 (50 ㎖)중의 N-tert-부틸옥시카르보닐-N-[(2-히드록시)에틸]-O-벤질히드록실아민31(4.2g, 16.6 mmol)의 교반용액에 TEA (2.02g, 20 mmol) 다음에 이소부티르무수물 (3.16g, 20 mmol)을 아르곤 분위기하에서 실온에서 가하였다. 반응 혼합물을 12시간 동안 실온에서 교반시키고 증발건조시켰다. 잔사를 EtOAc (200 ㎖)에 용해시키고 5% NaHCO3용액 (100 ㎖), 물과 염수 (50 ㎖)로 세척하였다. 유기추출물을 건조시키고 증발 건조시켰다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2를 사용하는 실리카겔에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 수집하고 증발시켜
Figure pct00041
N-(티민일아세틸)-N-[[2-이소부티릴)옥시]에틸]-O-벤질히드록실아민 (33): N-tert-부틸옥시카르보닐-N-[[(2-이소부티릴)옥시]에틸-O-벤질히드록실아민32(5.0g, 14.84mmol)을 CH2Cl2(10㎖)에 용해시키고 30분동안 TFA(12㎖)에서 교반시켰다, 반응혼합물을 증발건조시키고 건조메탄올(10㎖)에 용해시켰다. 다시 증발건조시키고 밤새 고체 NaOH상에서 진공하에서 건조시켰다. 건조물질을 특성규명을 하지 않고 다음 반응에 그대로 사용하였다.
티민아세트산5(3.13g, 17mmol)을 건조 DMF(75㎖)에 용해시키고 아르곤하에서 -20℃로 냉각시켰다. 이 냉각교반된 용액에 N-메틸모르폴린 (2.02g, 20mmol) 다음에 이소부틸클로로포르메이트 (2.72g, 20mmol)을 가하였다. 15분 교반한 후에, 건조 DMF (50㎖)중의 상기 TFA염의 용액을 N-메틸모르폴린 (2.02g, 20mmol)로 중화시키고 티민 아세트산의 냉각 교반된 용액으로 바로 한번에 가하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 -20℃에서 교반시키고 실온으로 가온시키고 밤새 교반을 계속하였다. 용액을 증발건조시키고 잔사를 CH2Cl2(250㎖) 및 물 (100㎖)에 용해시키고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기추출물을 5% NaHCO3용액 (100㎖), 물 (100㎖) 및 염수 (50㎖)로 세척하고 CH2Cl2추출물을 건조시키고 증발건조시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제생성물을 용리제로서 CH2Cl2--> 아세톤을 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 필요한 분획을 수집하고 증발시켜 4.0g (70%)의 순수한 생성물을 얻었다. 순수한 생성물을 CH2Cl2/ 헥산으로부터 결정화시켰다. 융점 : 185-
Figure pct00042
(실시예 30)
(도 30)
(2R,4R)-2-카르보닐메톡시-4-히드록시피롤리딘 (35): 자기교반바아 및 환류응축기가 장착된 250㎖ 둥근바닥플라스크에 건조메탄올(40㎖)을 놓고 아르곤 분위기하에서 얼음욕으로 냉각시켰다. 이 교반용액에 염화아세틸(4.32g,55mmol) 다음에 cis-4-히드록시-D-피롤린34(5.00g, 38.17mmol)을 가하였다. 결과용액을 7-8시간동안 가열환류시키고 실온으로 냉각시켰다. 용액을 에테르로 희석시키고 결과 백색고체를 흡입으로 수집하고, 에테르로 고체 NaOH상에서 진공하에서 건조시켰다.
Figure pct00043
(2R,4R)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-카르보메톡시-4-히드록시피롤리딘(36): THF/물(8:2, 150㎖)중의 (2R,4R)-2-카르보메톡시-4-히드록시피롤리딘35(6.9g, 38.12mmol)의 교반용액에서 TEA (10.1g, 100mmol) 다음에 디-tert-부틸디카보네이트 (10.9g, 50mmol)를 실온에서 가하였다. 반응물을 6시간동안 실온에서 교반시키고 증발건조시켰다. 잔사를 EtOAc (200㎖)에 용해시키고 0.5N 황화수소칼륨 (50㎖), 물 (100㎖) 및 염수 (50㎖)로 세척하였다. 유기추출물을 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켜 7.8g (84 %)의 오일같은 생성물을 얻었다. 오일같은 생성물을
Figure pct00044
(2R,4R)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-히드록시메틸-4-히드록시피롤리딘(37): (2R,4R)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-카르보메톡시-4-히드록시피롤리딘36(7.0g, 28.6mmol)을 건조 THF(100㎖)에 용해시키고 아르곤 분위기하에서 얼음염욕에서 냉각시켰다. 이 냉각용액에 수소화붕소리튬(1.88g, 85.8mmol)을 15분동안 소량으로 가하였다. 수소화붕소리튬의 첨가후에 반응혼합물을 아르곤하에서 0℃에서 1시간동안, 이어서 15시간동안 실온에서 교반시켰다. 용액을 냉각시키고 물(50㎖)로 희석시키고 pH를 AcOH로 6으로 조정하였다. 반응물을 증발건조시키고 EtOAc(200㎖)에 용해시키고, 물(100㎖)과 염수(100㎖)로 세척하였다. EtOAc 추출물을 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2--> EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 수집하고 증발 건조시켜 5.00g(81%)의 맑은 오일을 얻었다. 오일을 방치시켜 무색고체를 얻었다.
Figure pct00045
(2R,4R)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-(4,4'-디메톡시트리틸)옥시메틸-4-히드록시피롤리딘 (38): (2R,4R)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-히드록시메틸-4-히드록시피롤리딘37(4.4g, 20.28mmol)을 건조피리딘(50㎖)에 용해시키고 아르곤 분위기하에서 교반시켰다. 이 교반된 용액에 TEA (2.53g, 25mmol) 다음에 염화 4,4'-디메톡시트리틸(7.45g, 22mmol)을 가하였다. 반응혼합물을 12시간동안 실온에서 교반시키고 MeOH(10㎖)로 켄칭시켰다. 용액을 증발건조시키고 EtOAc(200㎖)에 용해시켰다. EtOAc층을 5% NaHCO3용액(100㎖), 물(100㎖) 및 염수로 세척하였다. 유기추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 잔사를 용리제로서 헥산 --> EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광 크로마토그래피로 정제하였다. 필요한 분획을 함께 푸울화하고 증발시켜 8.09g(100%)의 오렌지 거품을 얻었다.
Figure pct00046
(2R,4R)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-(4.4'-디메톡시트리틸)옥시메틸-4-[(p-톨루엔술포닐)옥시]피롤리딘 (39): (2R,4R)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-(4,4'-디메톡시트리틸)옥시메틸-4-히드록시피롤리딘38(8.09g, 20.27 mmol)을 건조 피리딘/CH2Cl2(2:1, 200㎖)에 용해시키고 아르곤 분위기하에서 얼음욕에서 냉각시켰다. 이 냉각용액에 TEA(3.03g, 30mmol) 다음에 염화 p-톨루엔술포닐 (5.7g, 30mmol)을 가하였다. 반응혼합물을 3시간동안 0℃, 8시간동안 30℃미만에서 교반시켰다. 반응혼합물을 증발건조시키고, EtOAc(200㎖)와 5% NaHCO3용액 (100㎖)사이에서 분배시키고, EtOAc로 추출하였다. EtOAc추출물을 물(100㎖)과 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고 증발건조시켰다. 미정제 생성물을 용리제로서 헥산-->EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광 크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 함께
Figure pct00047
(2R,4S)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-(4,4'-디메톡시트리틸)옥시메틸-4-아지도-피롤리딘(40): (2R,4R)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-(4,4'-디메톡시트리틸)옥시메틸-4-[(p-톨루엔술포닐)옥시]피롤리딘39(5.1g, 7.58mmol)를 디메틸포름아미드 (50㎖)에 용해시키고 물 (5㎖)로 희석시켰다. 이 교반용액에 아지드화나트륨 (0.65g, 10mmol)을 가하고 8시간 동안 80℃에서 가열하였다. 냉각시키고 증발건조시켰다. 잔사를 CH2Cl2(200㎖)와 물 (100㎖)사이에 분배시키고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기추출물을 염수 (50㎖)로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 미정제 생성물을 용리제로서 헥산 --> EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 함께 푸울화하고 증발시켜 3.8g(92%)
Figure pct00048
(2R,4S)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-히드록시메틸-4-아미노-피롤리딘 (41): 메탄올(75㎖) 중의 (2R,4S)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-(4,4'-디메톡시트리틸) 옥시메틸-4-아지도-피롤리딘40(2.72g,5mmol)을 실온 및 5atm 압력에서 목탄(0.3g)상의 10% 팔라듐의 존재에서 수소첨가시켰다. 12 시간 후에 촉매를 여과하고 메탄올 (20㎖)로 세척하고 진공하에서 용매를 제거하였다. 수율 1.0g (93%).1HNMR
Figure pct00049
(2R,4S)-1-(tert-부틸옥시카보닐)-2-히드록시메틸-4-프탈리미도-피롤리딘(42): (2R,4S)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-히드록시메틸-4-아미노-피롤리딘41(1.00g, 4.63mmol)을 건조메탄올 (20㎖)에 용해시키고 실온에서 N-에톡시카르보닐프탈리미드 (1.0g, 5mmol)로 처리하였다. 반응혼합물을 6시간 동안 교반시키고 증발 건조시켰다. 잔사를 용리제로서 CH2Cl2--> EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 분획을 수집하고 증발시켜 1.5g (94%)의
Figure pct00050
(2R,4S)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-[N 3 -벤조일(티민-1-일)]메틸-4-프탈이미도-피롤리딘 (43): 아르곤하에서 건조 THF (70㎖) 중의 N3-벤조일티민20(1.15g, 5mmol)의 교반용액에 트리페닐포스핀 (2.62g, 10mmol) 및 (2R,4S)-1-(tert-부틸옥시카르보닐)-2-히드록시메틸-4-프탈리미도-피롤리딘 (1.4g, 4.05mmol)을 실온에서 가하였다. 15분후에, 디에틸아조디카르복실레이트 (1.74g, 10mmol)를 10분 동안 서서히 가하였다. 반응혼합물을 알루미늄 호일로 커버하고 24시간 동안 아르곤하에서 실온에서 교반시켰다. 용매를 증발건조시키고 잔사를 EtOAc(150㎖)에 용해시켰다. 유기추출물을 5% NaHCO3용액(100㎖), 물(100㎖) 및 염수(100㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 건조시킨 EtOAc추출물을 증발건조시켜 오렌지 오일을 얻었다. 미정제 생성물을 용리제로서 헥산-->EtOAc를 사용하는 실리카겔상에서 섬광크로마토그래피로 정제시켰다. 필요한 생성물을 갖는 분획을 푸울화하
Figure pct00051
(실시예 31)
올리고뉴클레오티드의 합성: 변형된 아미노산핵산 골격을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 표준 포스포르아미디트 화학을 사용하는 자동화된 DNA 합성기 (어플라이드 바이오시스템스 모델 394)에서 합성시켰다. β-시아노에틸 포스포르아미디트, 합성시약 및 CPG 폴리스티렌 컬럼을 어플라이드 바이오시스템스 (Foster City, CA)에서 구입하였다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 대해서, 표준산화병을 테트라에틸티우람 디술피드/아세토니트릴로 대신하고 표준 ABI 포스포로티오에이트 프로그램을 포스페이트 결합의 단계식 황화반응에 사용하였다. 제어된 다공성 유리컬럼으로부터 절단된 후에 보호기는 올리고뉴클레오티드 농수산화 암모늄으로 8시간동안 55℃에서 처리시킴으로써 제거된다. 올리고뉴클레오티드(DMT-on)를 0.1M 아세트산트리에틸암모늄(완축액A) 및 아세토니트릴(완축액B)중의 5% 아세토니트릴 선형구배를 갖는 역상 세미프레프(Semiprep) C6컬럼(ABI)을 사용하는 HPLC로 정제시켰다. DMT보호기를 80% 아세트산으로 처리하여 절단하고 생성물은 침전된 에탄올이었다. 생성물의 순도는 분석 C18컬럼 (Beckman)을 사용하는 HPLC로 체크하였다. 아미노산 핵산 단량체를 3'-말단, 5'-말단 및 100%의 결합효율을 갖는 DNA서열의 중앙에 통합시켰다. 16개의 아미노산 변형된 티민을 함유하는 단일 중합체도 어떤 문제없이 제조되었다.
(실시예 32)
혼성화 분석: 본 발명의 아미노산 변형된 올리고뉴클레오티드의 그 상보적인 RNA 및 DNA 서열로 혼성화하기 위한 능력을 열용융분석으로 측정한다. RNA 보체는 Genset corporation (La Jolla, CA)에 의해 합성되고 변성시키는 우레아 PAGE에 의하여 정제된다. 본래의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 특이적 위치에서 작용기를 함유하는 것들을 화학량론적 농도에서 RNA나 DNA 보체중 하나에 가하여 혼성 이중구조를 형성한다. 이중구조의 랜덤코일 전이시 온도에 의존하는 흡광도(260nm)의 흡광증가는 Varian Cary 1E UV-가시영역 분광광도계를 사용하여 모니터된다. 측정을 10mM Na-포스페이트, pH 7.4, 0.1mM EDTA, 및 NaCl의 완충액에서 실시하여 0.1M 또는 1.0M 중 하나의 이온강도를 얻었다. 데이터는 1/Tm 대 ln[Ct]의 그래프표시로 분석되는데, 여기서 [Ct]는 전체 올리고뉴클레오티드 농도다. 이 분석으로부터 열역학 척도가 측정된다. 형성된 이중구조 또는 헤테로 이중구조의 안정성에 대해 얻은 정보에 기초하여 변형된 피리미딘의 올리고뉴클레오티드로의 배치는 나선구조의 안정성에 대한 효과를 평가한다. 하이브리드의 안정성을 격렬하게 변경시키는 변형은 자유에너지(△G)에서 감소나 증강을 나타내고 안티센스올리고뉴클레오티드에서 유용성에 대한 결정이 이루어진다.
혼성화 연구는 3'-말단 뿐만아니라 5'-말단에서 아미노산핵산골격을 함유하는 올리고뉴클레오티드로 시행하였다. 예비연구는 변형된 올리고뉴클레오티드가 비변형된 올리고뉴클레오티드와 유사한 상보적인 RNA와 DNA서열을 갖는 이중구조를 형성한다는 것을 나타내었다.
(실시예 33)
뉴클레아제 내성: 본래의, 포스포로티오에이트 및 본 발명의 변형된 올리고 뉴클레오티드는 태아송아지 혈청이나 성인 혈청의 다양한 농도를 함유하는 배지에서 올리고뉴클레오티드의 배양으로 혈청 뉴클레아제에 대한 내성을 평가한다. 표지된 올리고뉴클레오티드를 여러시간동안 배양시키고, 프로테아제 K로 처리한 다음에 20% 폴리아크릴아미드-우레아 변성겔에서 겔전기이동과 후속 방사선 사진술 또는 인-화상으로 분석한다. 방사선 사진은 레이저 농도계로 측정한다. 올리고뉴클레오티드의 공지된 길이와 변형의 위치에 기초하여 뉴클레아제 분해에 대한 특별한 변형 효과를 측정하는 것이 가능하다. 세포질 뉴클레아제에 대해 HL60 세포주를 사용한다. 후-미토콘드리아 상청액을 분별원심분리로 제조하고 표지된 올리고뉴클레오티드를 여러시간동안 이 상청액에서 배양시킨다. 배양후에 올리고뉴클레오티드는 혈청 핵분해에 대해 상기한 분해를 평가한다. 방사선자동사진법 결과는 비변형된, 즉, 포스포로티오에이트 및 변형된 올리고뉴클레오티드를 비교하여 측정한다.
아미노산 변형된 올리고뉴클레오티드에 대한 예비 연구는 Snake Venom 포스포디에스테라제에 내성이 있다는 것을 나타내었다.
참고로 포함
인용된 모든 특허, 특허출원, 및 공보는 참고로 본문에 포함된다.
대응물
전술한 명세서는 이 분야의 숙련된 자가 본 발명을 실행할 수 있기에 충분하다고 생각된다. 실제로, 상기한 것의 다양한 변형은 분자생물학, 유기화학분야, 또는 다음에 오는 청구항의 범위내에 들도록 의도되는 관련 분야에서 숙련된 사람들에게 자명한 실험을 수행하는데 이바지한다.

Claims (9)

  1. I-V군중 어느 군의 화합물 1의 화합물,
    Figure pct00052
    I군에서:
    X는 CHR2OH이고 (이때 R2는 H, 하급 알킬아민 또는 하급 알킬 이미다졸);
    Y는 Base-(CH2)n-이고 (이때 Base는 할로겐화되지 않은 변하는 뉴클레오시드 염기이고, n은 1 내지 7);
    A는 카르보닐이고;
    Z는 H 또는 OR3이고 (이때 R3는 H, 하급 알킬, 하급 알킬아민 또는 하급 알킬 이미다졸);
    W는 CHR4OH이고 (이때 R4는 H 또는 하급 알킬아민 또는 하급 알킬 이미다졸);
    N는 N(질소)이고;
    L은 아무것도 아니고;
    II군에서:
    X는 Base-(CH2)n-이고 (이때 Base는 할로겐화되지 않은 변하는 뉴클레오시드염기이고, n은 1 내지 7);
    Y는 CHR2OH이고 (이때 R2는 H, 하급 알킬아민 또는 하급 알킬 이미다졸);
    A는 카르보닐 또는 CH2이고;
    Z는 H 또는 OR3이고 (이때 R3는 H, 하급 알킬, 하급 알킬아민 또는 하급 알킬이미다졸);
    W는 CHR4OH이고 (이때 R4는 H 또는 하급 알킬아민 또는 하급 알킬 이미다졸);
    N는 N(질소)이고;
    L은 아무것도 아니고;
    III군에서:
    X는 CHR2OH이고 (이때 R2는 H, 하급 알킬아민 또는 하급 알킬 이미다졸);
    Y는 Base-(CH2)n-이고 (이때 Base는 할로겐화되지 않은 변하는 뉴클레오시드염기이고, n은 1 내지 7);
    A는 CH2이고;
    Z는 OH 또는 OR3이고 (이때 R3는 H, 하급 알킬, 하급 알킬아민 또는 하급 알킬 이미다졸);
    W는 CHR4OH이고 (이때 R4는 H 또는 하급 알킬아민 또는 하급 알킬 이미다졸);
    N는 N(질소)이고;
    L은 아무것도 아니고;
    IV군에서:
    X는 Base-(CH2)n-이고 (이때 Base는 할로겐화되지 않은 변하는 뉴클레오시드 염기이고, n은 1 내지 7);
    Y는 COOH 또는 CHR2OH이고 (이때 R2는 H, 하급 알킬아민 또는 하급 알킬 이미다졸);
    A는 카르보닐 또는 CH2이고;
    Z는 CH2이고;
    W는 CH2이고;
    N는 N(질소)이고;
    L은 CHNHR5이고 (이때 R5는 H, OH 또는 OR3이고, R3는 H, 하급 알킬, 하급 알킬아민 또는 하급 알킬 이미다졸);
    V군에서:
    X는 CH2OH, CH2NH2, CONH2또는 COOH이고;
    Y는 아무것도 아니고;
    Z는 CH2또는 CHO-L1-B이고;
    W는 O, S 또는 CH2이고;
    N는 CH이고;
    L과 A는 독립적으로 COOH, CHCOOH, CHCH2COOH, NH2, CHNH2, L1-NH-L2-B 또는 CH-L1-NH-L2-B (이때 B는 H 또는 뉴클레오시드 염기이고, L1과 L2는 독립적으로 (CH2)n(이때 n=1-3) 또는 (CH2)nCO (이때 n=0-2))이다.
  2. 제 1 항에 따른 화합물이 중합된 올리고뉴클레오티드로서, 뉴클레오티드간 결합이 I군에서는 W와 X간에, II군에서는 W와 Y간에, III군에서는 W와 Z간에, IV군에서는 L과 Y간에, V군에서는 L과 A간에 발생하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제 2 항에 있어서, 뉴클레오티드간 결합이 포스포디에스테르로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제 2 항에 있어서, 뉴클레오티드간 결합이 포스포로티오에이트로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제 2 항에 있어서, 뉴클레오티드간 결합이 포스포르아미데이트로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제 2 항에 있어서, 뉴클레오티드간 결합이 히드록사메이트로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제 2 항에 있어서, 다수의 단량체로 구별될 수 있고 이때 적어도 하나의 단량체가 2'-데옥시리보스 뉴클레오시드로 이루어지는 것을 특징으로 하고, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 및 히드록사메이트로 구성된 군으로부터의 적어도 두개의 다른 뉴클레오티드간 결합으로 이루어지는 것을 추가적으로 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  8. 제 7 항에 있어서, 2'-데옥시리보스 뉴클레오시드 펜타푸라노실 고리를 가지고 이때 고리 산소가 CH2또는 NR6(이때 R6은 아세틸, 하급 알킬, 카르보닐, 카르보닐 하급 알킬아민, 또는 카르보닐 하급 알킬 이미다졸)으로 대치되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  9. 제 2 항에 있어서, 적어도 하나의 단량체가 제 1 항의 집단 V를 충족시키고,최대 50개의 단량체가 2'-데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드 및 2'-메틸리보뉴클레오시드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
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