RU2460721C1 - Способ получения амидофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки для модификации олигонуклеотидов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биоорганической химии. Способ получения аминофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки для модификации олигонуклеотидов включает диметокситритилирование соответствующего спирта, разветвление каркаса вставки путем взаимодействия амина с активированной карбоновой кислотой и фосфитилирование предшественника целевого соединения в стандартных условиях. Причем на первой стадии синтезируют 4-(2-гидроксиэтил)морфолин-2,3-дион (соединение I) путем добавления раствора диэтаноламина к раствору диэфира щавелевой кислоты при молярном соотношении диэфир щавелевой кислоты-диэтаноламин, равном 1:1,15, при перемешивании при комнатной температуре в течение 15-24 часов. Далее полученное соединение I диметокситритилируют с помощью диметокситритилхлорида при эквимолярном соотношении реагирующих веществ. Затем полученным соединением II проводят реакцию ацилирования алифатического первичного или вторичного амина, несущего необходимую функциональную группу либо группы, при концентрации реагирующих веществ 0,1-0,4 М при температуре 25-60°С в течение 8-24 часов с последующим фосфитилированием полученного соединения 2-цианоэтил-N,N,N′,N′-тетраизопропилдиамидофосфитом стандартным методом с получением целевого амидофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к способу получения амидофосфитного мономера ахиральной (оптически неактивной) ненуклеотидной вставки для модификации (функционализации) олигонуклеотидов в рамках автоматического синтеза.

Модифицированные олигонуклеотиды в настоящее время имеют широкий спектр использования в качестве молекулярных инструментов ДНК-диагностики и направленного воздействия на генетические системы живых организмов и вирусов. Возможность введения ненуклеотидных модификаций в любое положение олигонуклеотидной цепи в значительной степени расширяет возможности придания олигонуклеотидной конструкции заданной(ых) функции(й), то есть ее дополнительной функционализации. Использование амидофосфитных мономеров, обеспечивающих возможность встройки функционального остатка во внутреннюю и концевые части олигонуклеотида, является универсальным.

В структуре амидофосфитного мономера ненуклеотидных модификаций должны присутствовать центры ветвления каркаса, определяющие одновременное присутствие реакционных групп для встраивания данного мономера в синтезируемую цепь (две группы) и дополнительной модификации (одна группа или более). Использование каркаса на основе замещенных предельных углеводородов влечет наличие в структуре вставки хиральных центров. Имеются доказательства, что различия пространственной ориентации дополнительной группы в составе олигонуклеотидного производного обуславливают разные комплексообразующие свойства соответствующих производных-энантиомеров (Kashida H., Liang X., Asanuma H. // Curr. Org. Chem. 2009. V.13. No.11. P.1065-1084). Использование рацематов вставок возможно, но часто оказывается функционально неоправданно. Амидофосфитные мономеры, получаемые на основе оптически чистых изомеров соединений-предшественников каркаса дороги в получении и производстве, ввиду ограниченности сырья.

Известен способ получения ахиральных ненуклеотидных вставок (Utagawa E., Ohkubo A., Sekine M., Seio K. // J. Org. Chem. 2007. V.72. P.8259-8266), заключающийся в последовательном присоединении первичных аминов, несущих в своем составе различные функциональные группы, к каркасу вставки - остатку тримесовой кислоты. Синтез стартуют с диметилового эфира тримесовой кислоты и далее, последовательно гидролизуя одну из сложноэфирных связей, проводят реакцию по освободившейся карбоксильной группе с амином, несущим определенную функциональную группу, в присутствии конденсирующего агента, например, N.N′-карбонилдиимидазола.

Недостатком известного способа является то, что выбранный каркас, являющийся жесткой и объемной структурой на основе 1,3,5-замещенного бензола, накладывает множественные ограничения, такие как: возможность введения лишь трех функциональных групп, необходимость использования протяженных линкерных элементов между первичной амино- и функциональной группами в рамках одной ветви каркаса. При использовании коротких линкерных элементов структура теряет гибкость, функциональные группы преимущественно ориентированы под углом 120° друг относительно друга, что не всегда приемлемо. Структура таких ахиральных вставок значительно нарушает организацию нативного углеводно-фосфатного остова ДНК.

Известен способ получения ахиральных ненуклеотидных вставок (Zimmerman J., Cebulla М., Mönninghoff S., Von Kiedrowski G. // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. V.48. P.3626-3630), заключающийся в последовательном введении функциональных групп в состав предварительно синтезированного триола - каркаса вставки.

Недостатком известного способа, помимо выбора каркаса, описанного выше, является то, что в качестве функциональных групп могут выступать лишь производные гидроксильных групп. Кроме того, на первой и второй стадии синтеза неизбежны побочные продукты в виде ди- и три-O-замещенных триолов, ввиду эквивалентности модифицируемых положений и, как следствие, невысокие выходы.

Известен способ получения ненуклеотидных вставок (Christensen U.В., Pedersen Е.Р. // Nucleic Acids Res. 2002. V.30. P.4918-4925), заключающийся в использовании глицерина в качестве каркаса вставки. На первой стадии, используя одну из первичных гидроксильных групп, вводят необходимую функциональную группу, после чего оставшуюся первичную гидроксильную группу используют для селективного введения диметокситритильной группы. Далее следует стадия фосфитилирования, давая искомый амидофосфитный мономер.

Недостатком известного способа является то, что наличие вторичной гидроксильной группы в каркасе вставки хоть и позволяет селективно проводить диметокситритилирование на предпоследней стадии синтеза, однако неизбежно ведет к хиральности структуры мономера.

Наиболее ближайшим к заявленному способу-прототипом является способ получения ненуклеотидных вставок (Okamoto A., Ichiba Т., Saito I. Pyrene-labeled oligodeoxynucleotide probe for detecting base insertion by excimer fluorescence emission // J. Am. Chem. Soc. 2004. V.126. P.8364-8365), заключающийся в следующем. На первой стадии по одной из гидроксильных групп диэтаноламина вводят защитную группу в реакции с диметокситритилхлоридом (DMTrCl). На второй стадии оставшуюся гидроксильную группу полученного соединения блокируют временной защитной группой в реакции с третбутилдиметилхлорсиланом (TBDMSCl). На третьей стадии осуществляют разветвление каркаса вставки по вторичному амину диэтаноламина в реакции полученного соединения с различными аминокислотами (L-лизин, L-орнитин и L-диаминобутановая кислота), содержащими защищенные аминогруппы, в присутствии конденсирующего агента (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфоний гексафторфосфат (РуВОР). На четвертой стадии проводят деблокирование аминогрупп в составе полученного соединения. На пятой стадии вводят в состав соединения необходимые одинаковые функциональные группы в реакции с 1-пиренкарбоновой кислотой в присутствии конденсирующего агента (РуВОР). На шестой стадии осуществляют удаление временной защитной группы TBDMS действием тетрабутиламмоний фторида. На седьмой стадии проводят фосфитилирование в стандартных условиях. Выход конечных целевых продуктов после очистки составляет 5-19%.

Недостатками способа являются:

1) многостадийность синтеза (семь стадий);

2) низкие выходы целевых соединений, составляющие - 5-19%. На первой стадии синтеза неизбежен побочный дизамещенный продукт ввиду эквивалентности положений модифицируемых гидроксильных групп и, как следствие, невысокие выходы реакции;

3) полученные соединения содержат хиральные центры ввиду применения в синтезе оптически активных веществ;

4) необходимость применения конденсирующего агента для проведения активации карбоксильной группы;

5) известный способ обеспечивает получение лишь монофункционализированной либо содержащей несколько одинаковых функциональных групп в составе ненуклеотидной вставки.

Технической задачей изобретения является упрощение способа, повышение выхода целевых продуктов, а также расширение функциональных возможностей способа за счет обеспечения возможности получения не только монофункционализированной ненуклеотидной вставки, но и одновременное введение двух и более различных функциональных групп в каркас ненуклеотидной вставки.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом получения амидофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки для модификации олигонуклеотидов, заключающимся в следующем.

На фиг.1 представлена общая схема синтеза амидофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки, где R - это -СН₃ либо -СН₂СН₃, R1-NH-R2 - это первичный (R1=H, R2≠H) либо вторичный (R1, R2≠H) алифатический амин.

Синтез амидофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки осуществляют в четыре стадии.

На первой стадии синтезируют 4-(2-гидроксиэтил)морфолин-2,3-дион (соединение I) добавлением раствора диэтаноламина в изопропаноле к раствору диэфира щавелевой кислоты в изопропаноле при перемешивании в течение 15-24 часов при мольном соотношении диэфир щавелевой кислоты - диэтаноламин, равном 1:1,15. Выпадший осадок отфильтровывают, промывают холодным этанолом и высушивают до постоянного веса в вакууме.

На второй стадии проводят диметокситритилирование полученного соединения (I) диметокситритилхлоридом. Реакцию проводят при эквивалентном соотношении реагирующих веществ, взятых в концентрации 0,3 М в пиридине, при комнатной температуре в течение 3 часов. В результате получают 4-(2-(4,4′-диметокситритилокси)этил)морфолин-2,3-дион (соединение II). После экстракции реакционной смеси хлористым метиленом (CH₂Cl₂) соединение II используют в дальнейших этапах синтеза без дополнительной очистки.

На третьей стадии в присутствии или в отсутствие нуклеофильного катализатора (0-4 эквивалента) 4-диметиламинопиридина (DMAP) проводят реакцию ацилирования соединением (II) (1-2 эквивалента) алифатического первичного или вторичного амина, несущего необходимую функциональную группу либо группы. Реакцию проводят при концентрации реагирующих веществ 0,1-0,4 М при температуре 25-60°C в течение 8-24 ч.

На четвертой стадии осуществляют фосфитилирование полученного на предыдущей стадии соединения (III, V или VII) 2-цианоэтил-N,N,N′,N′-тетраизопропилдиамидофосфитом стандартным методом (Barone A.D., Tang J.-Y., Caruthers M.H. // Nucleic Acids Res. 1984. V.12. P.4051-4061) с получением целевого амидофосфитного мономера. Выходы целевых соединений - амидофосфитов ахиральных ненуклеотидных вставок (IV, VI, VIII) - составляет 24-63% в зависимости от используемого амина.

Полученные амидофосфитные мономеры пригодны для автоматического синтеза олигонуклеотидных производных (модифицированных олигонуклеотидов) при использовании ДНК-синтезаторов.

Определяющими отличительными признаками заявляемого способа от прототипа, являются следующие.

1. На первой стадии синтезируют 4-(2-гидроксиэтил)морфолин-2,3-дион (соединение I) добавлением раствора диэтаноламина в изопропаноле к раствору диэфира щавелевой кислоты в изопропаноле при перемешивании в течение 15-24 часов при мольном соотношении диэфир щавелевой кислоты - диэтаноламин, равном 1:1,15, что позволяет повысить выход целевых продуктов и упростить схему синтеза за счет одновременного введения в состав соединения временной защитной группы по одному из гидроксилов диэтаноламина и введения активированной карбоксильной группы в виде сложного эфира без применения дополнительных реакционноспособных соединений - конденсирующих агентов.

2. Полученное соединение I, несущее одну OH-группу, диметокситритилируют с помощью DMTrCl при эквимолярном соотношении реагирующих веществ, что позволяет упростить способ за счет исключения низкоэффективного получения моно-O-замещенного производного исходя из диолов, снизить расход реагентов для блокирования гидроксильных групп и повысить выход необходимого диметокситритилированного производного.

3. Полученное соединение II подвергают взаимодействию с алифатическим первичным или вторичным амином, несущим необходимую функциональную группу (либо несколько), при концентрации реагирующих веществ 0,1-0,4 M при температуре 25-60°C в течение 8-24 часов, что позволяет расширить функциональные возможности способа за счет возможности введения разнообразных функциональных групп (одной либо нескольких) в состав ненуклеотидной вставки при применении соответствующих алифатических аминов, в качестве которых могут выступать как вновь создаваемые, так и любые коммерчески доступные амины. Кроме того, в каркасе ненуклеотидной вставки, созданной заявляемым способом, отсутствуют хиральные центры, что обеспечивает отсутствие нежелательной хиральности у соответствующего звена, вводимого с помощь создаваемых амидофосфитов в углеводно-фосфатный остов олигонуклеотидного продукта.

Способ иллюстрируется следующими примерами получения амидофосфитов ахиральных ненуклеотидных вставок и олигонуклеотидных производных, содержащих синтезированные ненуклеотидные вставки.

Пример 1

Получение амидофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки с использованием первичного амина, содержащего третбутилдиметилсилильную группу.

В круглодонную колбу вместимостью 250 мл загружают 24,9 г диэтаноламина и добавляют 10 мл изопропанола, раствор упаривают на ротационном испарителе при пониженном давлении при температуре 40°C досуха, повторяют эту операцию дважды. Остаток в колбе растворяют в 20 мл изопропанола (концентрация 12 M). Далее полученный раствор прикапывают к раствору 32 мл (29,9 г) диэтилилоксалата в 48 мл изопропанола (концентрация 4 M) при перемешивании при комнатной температуре в течение 3 часов. Реагенты берут в молярном соотношении диэтилоксалат - диэтаноламин 1:1,15. Перемешивание продолжают 12 часов. Выпадший осадок отфильтровывают, промывают холодным этанолом и высушивают до постоянного веса в вакууме. Выход соединения I составляет 28,16 г, 0,18 моль, 86%.

В круглодонную колбу вместимостью 100 мл загружают 1,55 г соединения I и добавляют 10 мл пиридина, раствор упаривают на ротационном испарителе при пониженном давлении при температуре 40°C досуха, повторяют эту операцию дважды. Остаток в колбе растворяют в 30 мл пиридина и добавляют 3 г DMTrCl. Реагенты берут в эквимолярном соотношении в концентрации 0,3 M. Реакционную смесь перемешивают 3 часа при комнатной температуре, затем упаривают досуха. Остаток в колбе растворяют в 250 мл CH₂Cl₂ и экстрагируют раствором 0,3 M дигидрофосфата калия (KH₂PO₄) (3×150 мл). Органическую фазу сушат безводным сульфатом натрия (Na₂SO₄), раствор упаривают и высушивают до постоянного веса в вакууме. Далее работают с полученным соединением II без дополнительной очистки. Выход реакции по соединению II близок к количественному: 90% и выше.

В круглодонную колбу вместимостью 100 мл загружают 0,25 г соединения II и добавляют 10 мл пиридина, раствор упаривают на ротационном испарителе при пониженном давлении при температуре 40°C досуха, повторяют эту операцию дважды. Остаток в колбе растворяют в 10 мл пиридина и добавляют 0,12 г 6-(третбутилдиметилсилилокси)гексил-1-амина. Реагенты берут в эквимолярном соотношении в концентрации 0,1 M. Реакционную смесь перемешивают в течение 24-х часов при температуре 25°C, затем упаривают досуха. Остаток в колбе растворяют в 100 мл CH₂Cl₂ и экстрагируют насыщенным раствором NaCl, содержащим 5% гидрокарбоната натрия (NaHCO₃) (3×150 мл). Органическую фазу сушат безводным Na₂SO₄, раствор упаривают и высушивают до постоянного веса в вакууме. После высушивания осадок растворяют в 5 мл толуола, раствор наносят на колонку 40×80 мм с сорбентом Kieselgel 60 (Merck, Германия). Элюцию осуществляют 1% раствором триэтиламина в CH₂Cl₂. Фракции, содержащие целевой продукт, упаривают в вакууме с помощью ротационного испарителя при температуре 40°C. Остаток высушивают до постоянного веса в вакууме. Выход соединения III составляет 0,19 г, 0,27 ммоль, 53%.

В круглодонную колбу вместимостью 25 мл загружают 0,26 г соединения III и добавляют 5 мл ацетонитрила, раствор упаривают на ротационном испарителе при пониженном давлении при температуре 40°C досуха, повторяют эту операцию дважды. Остаток в колбе растворяют в 2 мл ацетонитрила (концентрация 0,2 M). Отдельно готовят раствор 0,06 г тетразола (2,5 эквивалента), 0,18 мл диэтилизопропиламина (5 эквивалентов), 0,29 мл 2-цианоэтил-N,N,N′,N′-тетраизопропил-диамидофосфита (2,5 эквивалента) в 2 мл ацетонитрила и выдерживают 30 мин. К полученному раствору по каплям добавляют раствор соединения III в течение 2 мин и выдерживают час при комнатной температуре. Затем реакционную смесь упаривают на ³/₄ объема, остаток в колбе растворяют в 100 мл CH₂Cl₂ и экстрагируют раствором 0,3 M KH₂PO₄ (3×150 мл). Органическую фазу сушат безводным Na₂SO₄, раствор упаривают и высушивают до постоянного веса в вакууме. Выход соединения IV 0,28 г, 0,31 ммоль (83%).

Суммарный выход соединения IV по 4 стадиям составляет 34%.

Пример 2

Получение соединения IV осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что на первой стадии (получение соединения I) вместо диэтилоксалата используют диметилоксалат, а перемешивание осуществляют 24 часа. Из 2 г диметилоксалата получают 1,8 г соединения I, выход 70%.

Суммарный выход соединения IV по 4 стадиям составляет 28%.

Пример 3

Получение амидофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки, с использованием вторичного амина, содержащего третбутилдиметилсилильную и 6-хлор-2-метоксиакридин-9-ильную группы.

Синтез соединения V из N¹-(2-(третбутилдиметилсилокси)этил)-N²-(6-хлор-2-метоксиакридин-9-ил)этилендиамина и соединения II осуществляют аналогично протоколу синтеза соединения III, за исключением следующих отличий: реакцию проводят при концентрации соединения V 0,2 M в присутствии 2-х эквивалентов соединения II и 4-х эквивалентов нуклеофильного катализатора DMAP, реакционную смесь выдерживают 12 часов при температуре 45°C. Из 0,54 г N1-(2-(третбутилдиметилсилокси)этил)-N2-(6-хлоро-2-метоксиакридин-9-ил)этилендиамина получают 1 г соединения V, выход 93%.

Синтез соединения VI из соединения V проводят аналогично протоколу синтеза соединения IV. Из 0,33 г соединения V получают 0,36 г соединениния VI, выход 88%.

Суммарный выход соединения VI по 4 стадиям составляет 63%.

Пример 4

Получение амидофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки, с использованием первичного амина, содержащего левулинатную группу.

Синтез соединения VII из 6-аминогексиллевулината и соединения II осуществляют аналогично протоколу синтеза соединения III, за исключением следующих отличий: реакцию проводят при концентрации соединения VII 0,4 М в присутствии 1,3 эквивалентов соединения II и 3-х эквивалентов DMAP, реакционную смесь выдерживают 8 ч при температуре 60°C. Из 0,19 г 6-аминогексил-4-оксопентоата получают 0,29 г соединения VII (40%).

Синтез соединения VIII из соединения VII осуществляют аналогично протоколу синтеза соединения IV. Из 0,199 г соединения VII получают 0,197 г соединения VIII, выход 77%.

Суммарный выход соединения VIII по 4 стадиям составляет 24%.

На фиг.2 представлена схема синтеза ахиральных ненуклеотидных вставок.

Пример 5. Получение модифицированных олигонуклеотидов, содержащих синтезируемые ахиральные ненуклеотидные вставки.

Используя стандартные протоколы твердофазного амидофосфитного синтеза на автоматическом ДНК-синтезаторе был синтезирован ряд олигонуклеотидов, содержащих ненуклеотидные вставки в различных положениях.

Для характеризации структуры модифицированных олигонуклеотидов был проведен масс-спектрометрический и электрофоретический анализ полученных образцов.

В таблице 1 представлены результаты MALDI TOF масс-спектрометрического анализа некоторых образцов: линейных и разветвленных олигонуклеотидов, где:

Y - ненуклеотидное звено, введенное с помощью соединения IV;

X - ненуклеотидное звено, введенное с помощью соединения VI;

* - отсутствие силильной защиты на дополнительном гидроксиле вставки.

Схематическое изображение структуры некоторых последовательностей модифицированных олигонуклеотидов приведено в таблице 2.

Из таблиц 1 и 2 видно, что массы полученных продуктов соответствуют массам целевых последовательностей. Каркасы созданных ненуклеотидных вставок X, Y (Z имеет каркас аналогичный Y) устойчивы в условиях протоколов автоматического синтеза олигонуклеотидов, и созданные ахиральные ненуклеотидные вставки IV, VI и VIII могут быть использованы для создания модифицированных олигонуклеотидов в рамках автоматического синтеза фрагментов нуклеиновых кислот. Приведенные данные доказывают, что при использовании созданных амидофосфитов возможно получение разветвленных олигонуклеотидов.

Электрофоретическая подвижность некоторых образцов в денатурирующем 20% ПААГ представлена в таблице 3, где:

µ - электрофоретическая подвижность образца относительно подвижности красителя бром-фенолового синего;

Z - ненуклеотидное звено, введенное с помощью соединения VIII;

A - олигонуклеотид: 5′-GAGACCAGAGTGATC-3′;

A′ - олигонуклеотид: 5′-GATCACTCTGGTCTC-3′;

B - олигонуклеотид: 5′-GATTATTTGGAAAAG-3′;

B′ - олигонуклеотид: 5′-CTTTTCCAAATAATC-3′.

Буфер: 8 M мочевина, 89 мМ трис-борат, рН 8,3, 2 мМ Na₂EDTA, акриламид:N,N′-метиленбисакриламид = 30:1.

Из таблицы 3 видно, что в рамках стандартных протоколов анализа нуклеиновых кислот удается регистрировать изменения структуры олигонуклеотидных производных, несущих ненуклеотидные вставки, относительно их немодифицированных предшественников. Электрофоретическая подвижность отражает наличие в олигонуклеотидах модифицированного звена и разветвление углеводно-фосфатного каркаса.

Физико-химические свойства синтезированных олигонуклеотидов представлены в таблице 4, а также на фиг.3 и 4.

В таблице 4 приведены температуры плавления ДНК/ДНК-комплексов нативных олигонуклеотидов и их производных, где:

deg - диэтиленгликоливая вставка, введенная с помощью соответствующего амидофосфита в состав олигонуклеотида;

¹ температуры плавления приведены для суммарной концентрации олигонуклеотидов 2·10^-4 моль/л;

² величина температуры плавления комплекса рассчитана по методу, описанному в работе (Ломзов А.А., Пышная И.А., Иванова Е.М., Пышный Д.В. // Докл. Акад. Наук. 2006. Т.409. №. 2. С.266-270);

³ температуры плавления приведены для суммарной концентрации олигонуклеотидов 10^-5 моль/л.

Диэтиленгликолиевая вставка является линкерным элементом, не содержащим функциональных групп и удлиняющим углеводно-фосфатный остов олигонуклеотида на такое же число ковалентных связей, как и в случае звеньев X, Y либо Z.

Электрофореграммы нативных и модифицированных ДНК-дуплексов с участием разветвленных олигонуклеотидов представлены на фиг.3.

Взаимодействующие олигонуклеотиды для формирования дуплексных структур взяты в стехиометрическом соотношении, буфер: 1 М NaCl, 0,01 M фосфат натрия (рН 7,3), 0,1 мМ Na₂EDTA.

Анализ реакционных смесей формирования дуплексных структур проводили с помощью гель-электрофореза в нативном 10% ПААГ (акриламид:N,N′-метиленбисакриламид = 30:1) в буфере 100 мМ трис-борат, при температуре 5°C.

Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.3:

1) нативный дуплекс B′A′+AB;

2) некомплементарная пара олигонуклеотидов A′degB′+B′A′;

3) дуплекс из разветвленного и комплементарного олигонуклеотида (BG)₂ZA+A′degB′;

4) дуплекс из разветвленного и комплементарного олигонуклеотида (A′)₂ZB′+BdegA;

5) дуплекс двух разветвленных олигонуклеотидов (BG)₂ZA+(A′)₂ZB′;

6) дуплекс из олигонуклеотидов, содержащих диэтиленгликолиевую вставку BdegA+A′degB′.

Приведенные таблица 4 и фиг.3 указывают, что синтезированные олигонуклеотиды соответствуют основным требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным конструкциям: способность к сиквенс-специфичному распознаванию нуклеиновых кислот, формирование стабильных межмолекулярных комплексов, что доказывают функциональную целостность получаемых олигонуклеотидов с созданными ненуклеотидными вставками.

На фиг.4 (А, Б) представлены графики флуоресценции, где сплошные линии соответствуют спектру испускания образцов при облучении на длине волны 400 нм, а пунктирные линии соответствуют спектру возбуждения образцов при облучении на длине волны 550 нм.

Модифицированные олигонуклеотиды взяты в концентрации 10^-6  моль/л. T (термостат) = 15°C, ширина щели монохроматора (возбуждение и испускание) = 5 нм.

Из представленных на фиг.4 (А, Б) графиков видно, что, варьируя положение модифицированного звена в олигонуклеотиде, можно добиваться как разгорания флюоресценции (фиг.4А, олигонуклеотид XT₆, разгорание на 20%), так и ее тушения (фиг.4Б, олигонуклеотид T₂XT₄, падение на 16%) при комплексообразовании с комплементарным олигонуклеотидом.

Использование предлагаемого способа обеспечит получение следующих технико-экономических преимуществ.

1. Малостадийность синтеза (четыре стадии).

2. Высокие выходы целевых соединений, составляющие 24-63%. Протокол синтеза искомых амидофосфитов ахиральных ненуклеотидных вставок обеспечивает получение набора блоков предшественников целевого продукта. Данная стратегия предполагает параллельный синтез двух промежуточных функционально различных блоков (соединения II - универсальный блок, алифатический амин - функционализированный блок), синтез которых осуществляется независимо. Объединение блоков в единую структуру производят на этапе, предшествующем финальному этапу фосфитилирования, дающему конечный продукт. Соединение II, универсальный блок, является общим реагентом для синтеза всех вставок данным способом, что позволяет получать наборы различных мономеров ненуклеотидных вставок, структуры которых определяются выбором функционализированного блока, несущего алифатическую амино-компоненту. В качестве функционализированных блоков могут выступать как вновь создаваемые, так и любые коммерчески доступные алифатические амины.

3. В каркасе ненуклеотидной вставки отсутствуют хиральные центры, что определяет отсутствие нежелательной хиральности у соответствующего звена, вводимого с помощь создаваемых амидофосфитов в углеводно-фосфатный остов олигонуклеотидного продукта.

4. Наличие в соединении II активированной сложноэфирной группы в составе циклического 2,3-морфолинодионового фрагмента, образованного остатками диэтаноламина и оксалата, позволяет избежать использования при конденсации блоков дополнительных реакционноспособных соединений - конденсирующих агентов и, с другой стороны, исключает необходимость использования временной защитной группы по одной из гидроксильных групп остатка диэтаноламина, которая функционализируется последней на этапе фосфитилирования, давая искомый амидофосфит ненуклеотидной вставки. Это определяет селективность дифференциальной функционализации гидроксильных групп диэтаноламинового фрагмента и позволяет существенно снизить расход реагентов для блокирования гидроксильных групп (например, диметокситритилхлорида) и повысить выход данного универсального блока, при получении которого исключается этап получения моно-O-замещенного диола с остатком защитной гриппы, входящей в структуру конечного амидофосфита ненуклеотидной вставки.

5. Предложенный способ обеспечивает получение амидофосфитов ненуклеотидных вставок как монофункционализированных, так и содержащих несколько дополнительных функциональных групп.

Таблица 1
Способ получения ахиральных ненуклеотидных вставок для модификации олигонуклеотидов
последовательность	Mr ([M-H]-) расчетное значение	Mr ([M-H]-) полученное значение
YT6	2214.8	2214.1
T2YT4	2214.8	2214.1
T2Y*T4	2100.5	2100.6
T2(T)YT4	2404.7	2405.8
(T2)2YT4	2708.9	2709.0
XT6	2443.4	2443.5
T2XT4	2443.4	2443.5
T2X*T4	2330.2	2331.0
T2(T)XT4	2634.4	2635.3
(T2)2XT4	2938.6	2937.1
T5XT	2443.4	2443.5
T5(T)XT	2634.4	2635.9
T5(T2)XT	2938.6	2938.2
T5(T3)XT	3242.8	3244.2
T5(T4)XT	3547	3549.1
(T5)2XT	3848.2	3852.1
T3XT3	2443.4	2443.8
T3X*T3	2330.2	2331.1
T3(T)XT3	2634.4	2639.5
T3(T2)XT3	2938.6	2942.2
(T3)2XT3	3242.8	3246.3
X*2T6	2896.1	2896.9

Таблица 2
последовательность	Схематическая структурная формула
T2Y*T4
T2(T)YT4
(T2)2YT4
T3X*T3
T3(T)XT3
(T3)2XT3
X*2T6

Таблица 3.
последовательность	Электрофоретическая подвижность, µ
T3Y*T3	0.89
T3(T)YT3	0.88
T3(T2)YT3	0.86
(T3)2YT3	0.84
T6YT3	0.82
T6Y*T3	0.83
T6(T)YT3	0.8
T6(T2)YT3	0.78
T6(T3)YT3	0.75
T6(T4)YT3	0.72
T6(T5)YT3	0.7
(T6)2YT3	0.67
XT6	0.7
T2XT4	0.73
T5XT	0.73
T3XT3	0.73
X*2T6	0.66
T6	0.9
(BG)2ZA	0.33
(A′)2ZB′	0.32

Таблица 4.
Система	Tпл, °C
XT6+CA6C	35.51
T2XT4+CA6C	12.51
T5XT+CA6C	181
T3XT3+CA6C	51
X*X*T6+CA6C	331
T6+CA6C	6.81
T3degT3+CA6C	-9.51,2
(A′)2ZB′+(BG)2ZA	673
(A′)2ZB′+ВА	723
A′degB′+ВА	713
B′A′+AB	76.53

Claims (4)

1. Способ получения аминофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки для модификации олигонуклеотидов, включающий диметокситритилирование соответствующего спирта, разветвление каркаса вставки путем взаимодействия амина с активированной карбоновой кислотой и фосфитилирование предшественника целевого соединения в стандартных условиях, отличающийся тем, что на первой стадии синтезируют 4-(2-гидроксиэтил)морфолин-2,3-дион (соединение I) путем добавления раствора диэтаноламина к раствору диэфира щавелевой кислоты при молярном соотношении диэфир щавелевой кислоты : диэтаноламин, равном 1:1,15, при перемешивании при комнатной температуре в течение 15-24 ч, далее полученное соединение I диметокситритилируют с помощью диметокситритилхлорида при эквимолярном соотношении реагирующих веществ, затем полученным соединением II проводят реакцию ацилирования алифатического первичного или вторичного амина, несущего необходимую функциональную группу, либо группы, при концентрации реагирующих веществ 0,1-0,4 М при температуре 25-60°С в течение 8-24 ч с последующим фосфитилированием полученного соединения 2-цианоэтил-N,N,N′,N′-тетраизопропилдиамидофосфитом стандартным методом с получением целевого амидофосфитного мономера ахиральной ненуклеотидной вставки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве диэфира щавелевой кислоты используют диэтилоксалат или диметилоксалат.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию ацилирования проводят в присутствии нуклеофильного катализатора 4-диметиламинопиридина, взятого в количестве 1-4 эквивалентов.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для проведения реакции ацилирования соединение II используют в количестве 1-2 эквивалентов.

Images