JP5399919B2 - オリゴヌクレオチドを合成及び精製するための化合物及び方法 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
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- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
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- C07F9/24—Esteramides
- C07F9/2404—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
- C07F9/2408—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of hydroxyalkyl compounds
Description
PR1R2R3
(I)
(式中、R1は、C1−C8アルコキシ−、C1−C8アルケニルオキシ−及びC1−C8アルキニルオキシ−からなる群から選択され、所望により、CNで置換されていて;
R2は、ハロゲン又はNR4 2であり;
R3は、式−L−Aを有し;
各R4は、C1−C6アルキルであるか、又は結合して4〜7員複素環を形成し、所望により、C1−C6アルキル−、C1−C6ハロアルキル−、C1−C6アルコキシ−、アリールC1−C6アルコキシ−、オキソ−及びC1−C6アルコキシカルボニルからなる群から選択された1〜3個の置換基で置換されていて;
Lは、C1−C10アルキレンオキシ−であり、所望により、C1−C6アルキル−、C1−C6ハロアルキル−、C1−C6アルコキシ−、アリールC1−C6アルコキシ−、オキソ−及びC1−C6アルコキシカルボニル−からなる群から選択された1〜3個の置換基で置換されていて;そして
Aは、C1−C30ペルフルオロアルキルである)
のキャッピング化合物により達成される。
(a)それぞれがX−n個のヌクレオチド又はヌクレオシド単位(nは1〜X−1の整数である)を含む複数のオリゴヌクレオチドを、修飾されたヌクレオチドと接触させる工程;及び
(b)(a)の未反応物を式(I)のキャッピング試薬と接触させる工程
を含む方法を提供する。
(a)複数のオリゴマーであって、各々がX−n個の単一ユニット(nは1〜X−1の整数である)を含むオリゴマーをモノマーと接触させる工程;
(b)(a)の未反応物を式(I)のキャッピング試薬と接触させる工程;及び
(c)フルオラス親和性クロマトグラフィーによって、(b)の生成物の残りからキャッピングされていないオリゴマーを分離する工程
を含む方法を提供する。
Nu〜PO2R3NR4
(式中、Nuは、ヌクレオシドであり;
R3は、式−LAを有し;
各R4は、C1−C6アルキルであるか、又は結合して4〜7員複素環を形成し、所望により、C1−C6アルキル−、C1−C6ハロアルキル−、C1−C6アルコキシ−、アリールC1−C6アルコキシ−、オキソ−及びC1−C6アルコキシカルボニルからなる群から選択された1〜3個の置換基で置換されていて;
Lは、C1−C10アルキレンオキシ−であり、所望により、C1−C6アルキル−、C1−C6ハロアルキル−、C1−C6アルコキシ−、アリールC1−C6アルコキシ−、オキソ−及びC1−C6アルコキシカルボニル−からなる群から選択された1〜3個の置換基で置換されていて;
Aは、C1−C30ペルフルオロアルキルであり;そして
〜は、ヌクレオシドのヒドロキシル酸素に対する結合点を示す)
を含む少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド部分を含むオリゴヌクレオチドも提供する。
本発明を詳細に説明する前に、この発明は特定の組成物又は方法に限定されず、当然ながら変化できると解する。本明細書で使われる専門用語は、特定の実施形態の説明を明確にすることのみを目的とし、限定する目的ではないと解する。さらに、他に定義しない限り、本明細書で使われる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本発明を説明し、特許を請求するに際して、次の専門用語及び文法的変化が、下記の説明にしたがって使われるであろう。
次に記述された明細書及び図面について検討すると、本発明は、リン系フルオラスオリゴヌクレオチドキャッピング試薬、並びにオリゴヌクレオチド化学合成反応の、例えば失敗及び欠陥配列などの不要な副生成物であるフルオラスキャピングされたオリゴヌクレオチドに対してより大きな親和性を有する分離媒体を用いて、キャッピングされていない対象オリゴヌクレオチドを精製するための方法論を提供する。
本発明は、主としてキャッピング試薬又はキャッピングされたモノマーを利用してポリマー、例えばオリゴヌクレオチドの伸張をキャッピングする及び防ぐための方法に関する。オリゴヌクレオチドについては、本方法は、(a)複数のオリゴヌクレオチドを、修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシドと接触させる工程;及び(b)(a)の未反応物を、ペルフルオロアルキル親和性部分を含むキャッピング試薬と接触させる工程を含む。
配列的伸張は、次の:
1.部分的に合成された支持体結合オリゴヌクレオチド鎖から保護基を外して、反応性ヒドロキシル基を生む工程;
2.亜リン酸エステル結合によってヌクレオチドを支持体結合オリゴヌクレオチド鎖にカップリングする工程;
3.亜リン酸エステル結合を酸化して、リン酸エステル結合を得る工程;及び
4.伸張されていない任意の支持体結合オリゴヌクレオチドの未反応ヒドロキシル基をキャッピングする工程
を含む。
(a)それぞれがX−n個のヌクレオチド又はヌクレオシド単位(nは1〜X−1の整数である)を含む複数のオリゴヌクレオチドを、修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシドと接触させる工程;及び
(b)(a)の未反応物をペルフルオロアルキル親和性部分を含むキャッピング試薬と接触させる工程
を含む、方法を提供する。別の種類の実施形態では、固体支持体が、ガラス、シリカ、アルミナ、ゼオライト、合成ポリマー又はコポリマー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の種類の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、保護されたヌクレオチドである。別の種類の実施形態では、オリゴヌクレオチドは3’から5’に向かって調製される。別の種類の実施形態では、オリゴヌクレオチドは5’から3’に向かって調製される。別の種類の実施形態では、キャッピング試薬は、本明細書で説明した実施形態の1つである。
さらに、本発明は、キャッピング試薬及びキャッピング試薬の製造方法も提供する。キャッピング剤は、オリゴマーが約4〜100個以上のモノマーからなるように、フルオラス親和性クロマトグラフィーによって保持されることができるフルオラス親和性部分を含む。様々な種類の実施形態では、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100又は100個を超えるモノマーが、より短い失敗配列から精製され得る。そのような親和性部分の例としては、限定されるものではないが、ペルフルオロアルキル基が挙げられる。したがって、本発明の一実施形態では、キャッピング剤は、フルオラス親和性支持体に結合できるフルオラス部分によって誘導体化されている。フルオラス系親和性精製が行なわれるときには、次にフルオラスキャッピング剤が失敗配列にカップリングされ、失敗配列がフルオラス親和性支持体上に選択的に保持されるようにする。
PR1R2R3
(I)
(式中、R1は、C1−C8アルキルオキシ−、C1−C8アルケニルオキシ−及びC1−C8アルキニルオキシ−からなる群から選択され、所望により、CNで置換されていて;
R2は、ハロゲン又はNR4 2であり;
R3は、式−L−Aを有し;
各R4は、C1−C6アルキルであるか、又は結合して4〜7員複素環を形成し、所望により、C1−C6アルキル−、C1−C6ハロアルキル−、C1−C6アルコキシ−、アリールC1−C6アルコキシ−、オキソ−及びC1−C6アルコキシカルボニルからなる群から選択された1〜3個の置換基で置換されていて;
Lは、C1−C10アルキレンオキシ−であり、所望により、C1−C6アルキル−、C1−C6ハロアルキル−、C1−C6アルコキシ−、アリールC1−C6アルコキシ−、オキソ−及びC1−C6アルコキシカルボニル−からなる群から選択された1〜3個の置換基で置換されていて;そして
Aは、C1−C30ペルフルオロアルキルである)
によって表される。
フルオラス親和性については、ペルフルオロアルキル又はフルオラス基を含む分子は、それらの過フッ素化媒体への親和性を利用して精製される。フルオラス親和性相互作用は強力であり、他の種類の親和性相互作用(例えば親油性)とは区別できる。したがって、一実施形態では、フルオラスキャッピング基で失敗配列をキャッピングして、次にフルオラス分離技術を利用して適切な配列のオリゴマーからキャッピングされた分子を分離することにより、適切な配列のオリゴマーは失敗配列から精製され得る。フルオラス分離技術の例としては、限定されるものではないが、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)などのフルオラス親和性クロマトグラフィー、フルオラス逆相シリカ−ゲル(FRPSG)(例えば液相抽出を参照)ろ過における固相抽出(「SPE」又は「カートリッジ精製(cartridge purification)」)などが挙げられる。
(i)キャッピングされたオリゴマーがフルオラス親和性媒体によって吸着されるように、工程(b)の生成物を前記フルオラス親和性媒体に通過させる工程;及び
(ii)フルオラス親和性媒体から所望の対象配列のキャッピングされていないオリゴマーを洗浄する工程
を含む。
本発明は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び他の組成物、例えば試薬液及び反応混合物も提供し、それらは、本明細書で説明した通り、少なくとも1つのキャッピング試薬又は部分を含む。幾つかの実施形態では、本発明は、式:
Nu〜PO3R3
(式中、Nuは、ヌクレオシドであり;
R3は、式−LAを有し;
Lは、C1−C10アルキレンオキシであり、所望により、C1−C6アルキル−、C1−C6ハロアルキル−、C1−C6アルコキシ−、アリールC1−C6アルコキシ−、オキソ−及びC1−C6アルコキシカルボニル−からなる群から選択された1〜3個の置換基で置換されていて;
Aは、C1−C30ペルフルオロアルキルであり;そして
〜は、オリゴヌクレオチドのヒドロキシル酸素の結合点を示す)
を含む修飾されたヌクレオシド部分を提供する。幾つかの実施形態では、ヌクレオシドは従来の保護基を含んでよい。そのような代替試薬のより具体的な例が、−−すなわち、少なくとも1つの永続的に含有させられたフルオラス基を含むヌクレオシド試薬が−−、本明細書で提供される。他の実施形態では、本発明は、本明細書で説明した方法により製造されたオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、例えばオリゴヌクレオチドの合成及び精製のためのキットも提供する。本キットは、本明細書で説明した通り、成分として少なくとも1つのキャッピング試薬を含む。幾つかの実施形態では、本キットは、(a)少なくとも1つの伸張可能なモノマー、例えばヌクレオチド又は修飾されたヌクレオチド又はホスホラミダイト;(b)少なくとも1つの固体支持体;(c)オリゴヌクレオチドを伸張するのに用いる少なくとも1つの触媒;(d)少なくとも1つのバッファー;(e)キットの成分を用いる、オリゴヌクレオチド(例えば核酸)を伸張するための少なくとも1組の指示体;並びに(f)キットの成分を詰めるための少なくとも1つの容器の、1つ以上をさらに含む。
全てのTLC分析が、イーエム・サイエンス(EM Science)社製#5715−7、シリカゲル60F254、0.25mm厚TLCプレートを用いて行なわれた。全てのGCクロマトグラムは、FID検出器及びアジレント(Agilent)社製#19091Z−413、HP−1、30m×0.32mm、25ミクロンカラムを備えたHP5890シリーズIIガスクロマトグラフを用いて得られた。全てのNMRスペクトルは、ブルカー(Bruker)社製270MHzNMRを用いて得られた。
キャッピング試薬1の調製:2−シアノエチル−N’N’−ジイソプロピル3−ペルフルオロヘキシル−プロピルオキシ−ホスホラミダイト
キャッピング試薬2の調製:2−シアノエチル−N’N’−ジイソプロピル−3−ペルフルオロオクチル−プロピルオキシホスホラミダイト
i.フルオラスキャッピング試薬(PFC8C3ホスホラミダイト)を用いる自動化循環固相オリゴヌクレオチド合成法
ポリ−T(T−15)配列が、トリチル−オフサイクル及び改良型キャッピングプロトコルを用いてABI394機器上で合成された。この実験は、各ヌクレオチド付加工程のカップリング効率が減少するように設計された。これは、ホスホラミダイト濃度を標準的な0.1Mから0.02Mに減少させることにより行なわれた。減少した効率が十分な濃度の短縮配列の製造を確保するので、この実施例に、失敗配列から所望のオリゴヌクレオチドを速く精製するという本発明の実用性を明確に説明させる。標準的な塩基ホスホラミダイトを、30秒カップリング時間の標準的なlumol合成サイクルを用いて加えた。PFC8C3ホスホラミダイトを0.1Mの濃度でアセトニトリルに溶解し、DNA合成機上の底位5に置いた。標準的なキャッピングサイクルを、200秒カップリング時間のPFC8C3ホスホラミダイト+活性化因子カップリングサイクルに置き換えた。オリゴヌクレオチドを標準的な脱保護条件(30%水酸化アンモニウム、55℃で終夜)にして、カートリッジ精製に必要とされるまで−20℃で保管した。一定分量をNAP−10カラムで1XTEに脱塩し、ダイオネクス(Dionex)社製ヌクレオパック(Nucleopak)−100カラム中の塩化ナトリウムの20mM水酸化ナトリウム溶液の勾配を用いてイオン交換HPLCにより分析した。
固体支持体をカラムから除去し、閉管中の1mlの濃水酸化アンモニウムに室温で4時間接触させた。次に、支持体をろ過により除去し、部分的に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドを含む溶液を55℃にして5時間保った。アンモニアを除去してもよいが、本発明の利点は残留物をアンモニアの除去なしで後述の通り直接精製できることである。
フルオラスカートリッジ精製による未保護オリゴヌクレオチドからのキャッピングされた失敗配列の除去
オリゴヌクレオチド精製に関するフルオラス方法の実用性が、固相抽出(「SPE」又は「カートリッジ精製」)を用いて説明された。粗脱保護オリゴヌクレオチド(4a及び5b)を、ベリー・アンド・アソシエーツ(Berry and Associates)社(ミシガン州、デクスター)から購入した等体積のローディングバッファー(10%塩化ナトリウム及び5%ジメチルホルムアミドの水溶液)で希釈した。フルオラス親和性カートリッジ(フルオロパック(fluoro−PAK)II)もベリー・アンド・アソシエーツ社(ミシガン州、デクスター)から購入し、2mLのアセトニトリル、次に2mLの0.1Mトリエチルアンモニウム−酢酸(TEAA)、さらに次に2mLのローディングバッファーを通すことにより、予備調整した。製造業者の提言を受けて2秒/液滴の流速をこれらの工程では維持した。簡単にオリゴヌクレオチド及びローディングバッファー混合物を5秒/液滴の流速で予備調整したカラムに通過させることにより、粗オリゴヌクレオチドの精製を行ない、それによって、カラムを通過した所望の全長オリゴヌクレオチド及び汚染物となっているフルオラスキャッピングされた失敗配列を定量的に保持した。追加的な速いNAP−10脱塩工程は、オリゴヌクレオチドからアンモニア及び塩を除去するのに十分であった。失敗配列をフルオラスカートリッジから溶出させ、アニオン交換HPLCによって分析した。
Claims (10)
- R1が−OCH3である、請求項1に記載の化合物。
- R1が−O−CH2CH=CH2である、請求項1に記載の化合物。
- R1が−OCH2CH2CNである、請求項1に記載の化合物。
- R2が、−N(Me)2、−N(Et)2、−N(Pr)2、−N(i−Pr)2、1−ピロリジニル、1−ピペリジニル、4−モルホリニル及び1−イミダゾリルからなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
- R3が、式−O−(CH2)m(CF2)pCF3を有し;mが、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、pが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30である、請求項1に記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドの伸張を阻害する方法であって、触媒の有無に関わらずオリゴヌクレオチドを化合物と接触させる工程を含み、前記化合物が、式(I):
PR1R2R3
(I)
(式中、R1は、CNで置換されていてもよい、C1−C8アルキルオキシ、C2−C8アルケニルオキシ及びC2−C8アルキニルオキシからなる群から選択され;
R2は、ハロゲン又は−NR4 2であり;
R3は、式−L−Aを有し;
各R4は、C1−C6アルキルであるか、又は結合して4〜7員複素環を形成し;
Lは、−C1−C10アルキレンオキシ−であり;そして
Aは、C1−C30ペルフルオロアルキルであり;
そして、アルキル基は、直鎖、分岐鎖、又は環状の飽和炭化水素部分を意味する)
を有する、方法。 - X個のヌクレオチド(Xは3以上の整数である)を含む修飾されたオリゴヌクレオチドの製造方法であって;
(a)それぞれがX−n個のヌクレオチド単位(nは1〜X−1の整数である)を含む複数のオリゴヌクレオチドを、修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシドと接触させる工程;及び
(b)(a)の未反応物を、式(I):
PR1R2R3 (I)
(式中、R1は、CNで置換されていてもよい、C1−C8アルキルオキシ、C2−C8アルケニルオキシ及びC2−C8アルキニルオキシからなる群から選択され;
R2は、ハロゲン又はNR4 2であり;
R3は、式−L−Aを有し;
各R4は、C1−C6アルキルであるか、又は結合して4〜7員複素環を形成し;
Lは、−C1−C10アルキレンオキシ−であり;そして
Aは、C1−C30ペルフルオロアルキルであり;
そして、アルキル基は、直鎖、分岐鎖、又は環状の飽和炭化水素部分を意味する)
を有する化合物を含むキャッピング試薬と接触させる工程
を含む、方法。 - 核酸伸長阻害及び/又は核酸分離精製用組成物であって、式(I):
PR 1 R 2 R 3 (I)
(式中、R 1 は、CNで置換されていてもよい、C 1 −C 8 アルキルオキシ、C 2 −C 8 アルケニルオキシ及びC 2 −C 8 アルキニルオキシからなる群から選択され;
R 2 は、ハロゲン又は−NR 4 2 であり;
R 3 は、式−L−Aを有し;
各R 4 は、C 1 −C 6 アルキルであるか、又は結合して4〜7員複素環を形成し;
Lは、−C 1 −C 10 アルキレンオキシ−であり;そして
Aは、C 2 −C 30 ペルフルオロアルキルであり;
そして、アルキル基は、直鎖、分岐鎖、又は環状の飽和炭化水素部分を意味する)
を有する少なくとも1つの化合物を含む組成物。 - 核酸を製造するためのキットであって、式(I):
PR 1 R 2 R 3 (I)
(式中、R 1 は、CNで置換されていてもよい、C 1 −C 8 アルキルオキシ、C 2 −C 8 アルケニルオキシ及びC 2 −C 8 アルキニルオキシからなる群から選択され;
R 2 は、ハロゲン又は−NR 4 2 であり;
R 3 は、式−L−Aを有し;
各R 4 は、C 1 −C 6 アルキルであるか、又は結合して4〜7員複素環を形成し;
Lは、−C 1 −C 10 アルキレンオキシ−であり;そして
Aは、C 2 −C 30 ペルフルオロアルキルであり;
そして、アルキル基は、直鎖、分岐鎖、又は環状の飽和炭化水素部分を意味する)
を有する少なくとも1つの化合物、並びに(a)少なくとも1つの伸張可能なモノマー;(b)少なくとも1つの固体支持体;(c)オリゴヌクレオチドを伸張するのに用いる少なくとも1つの触媒;(d)少なくとも1つのバッファー;(e)キットの成分を用いる、オリゴヌクレオチドを伸張するための少なくとも1組の指示体;及び(f)キットの成分を詰めるための少なくとも1つの容器の少なくとも1つを含む、核酸の製造キット。
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