CN111032669B - 用于亲和纯化寡核苷酸的原酸酯组合物 - Google Patents

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Abstract

用于纯化寡核苷酸例如RNA和DNA的化合物和方法。靶寡核苷酸与包含亲和标签的原酸酯接头反应以形成原酸酯寡核苷酸‑原酸酯接头缀合物，其经历纯化技术以使靶寡核苷酸与杂质例如截短的寡核苷酸分离。然后可以将原酸酯接头在温和条件下除去，以生成高纯度的靶寡核苷酸。

Description

用于亲和纯化寡核苷酸的原酸酯组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年8月18日提交的美国临时申请No.62/547,687的权益，将其全部内容通过引用并入。
技术领域
本申请涉及用于纯化生物聚合物例如RNA和DNA的化合物和方法。
背景技术
固相合成是宝贵的工具，其可用于制备定制寡核苷酸序列(例如，定制RNA和DNA)、定制肽、定制寡糖和各种代谢物。寡核苷酸的化学合成通常以连续的方式进行，在该方式中，生长链的一端连接至固体表面，然后使用重复的合成循环，将反应性核苷酸单体依次缩合。这些核苷酸单体包含反应性磷基团，例如亚磷酰胺、H-磷酸酯或本领域中众所周知的其它反应性磷或修饰基团，并且结构单元衍生自保护的2’-脱氧核苷(dA、dC、dG和T)，保护的核糖核苷(A、C、G和U)或保护的化学修饰的核苷。典型的所需寡核苷酸产物包含在相邻核苷酸的5’-羟基和3’-羟基之间的核苷酸间键。然而，也可期望在相邻核苷酸上的任何羟基之间形成非天然核苷酸间键。为了完成合成，合成循环的第一步通常是保护的单体与连接至表面的核苷的反应或保护的单体与表面上的羟基的反应。表面上的羟基可以是可裂解的通用接头或不可裂解的表面连接物的一部分。在反应性磷基团与表面上的羟基进行初始偶联后，随后的步骤通常包括未反应的羟基的封端，然后是反应性磷中间体的氧化。在使用某些修饰的磷基团的某些条件下，可能需要在封端前进行氧化，特别是在氧化剂产生修饰的磷基团例如硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或氨基磷酸酯的情况下。最终的步骤通常是将偶联至下一个保护的核苷酸单体的羟基去封闭。该最后步骤中除去的保护基通常为二甲氧基三苯甲基(DMT)。然而，许多其它保护基在本领域中是众所周知的，例如，9-苯基呫吨基(Pixyl)、二苯甲基氧基-双(三甲基甲硅烷基氧基)甲硅烷基(BZH)。链装配完成后，将所需产物从固相中释放出，脱保护，并且用于进一步的生物学应用。
寡核苷酸产物应不含较短的截短序列以及具有与所需产物不同序列的序列，因为在体外或体内实验中使用时，副产物的存在可能会产生不良影响。可期望的寡核苷酸合成将以定量产率提供选择的寡核苷酸，使得完成的合成组合物仅包含靶寡核苷酸产物。然而，化学方法通常提供小于定量的产率，通常为95％至99％的产率。粗制反应混合物经常包含所需寡核苷酸和截短序列或失败序列的混合物，并且需要纯化以得到纯净的寡核苷酸靶产物。
从粗制合成产物中纯化所需寡核苷酸产物的最常用方法是高效液相色谱(HPLC)。然而，从较短的寡核苷酸序列中分离出靶全长寡核苷酸通常需要费力并且费时的色谱条件。对于较长的寡核苷酸例如具有100个或更多个核苷酸的寡核苷酸，每次运行的HPLC洗脱梯度可需要2个至3个小时，并且该过程需要精确采集和级分分析以得到可接受水平的纯度。此外，这种色谱方法通常需要具有非常小的粒径和丰富的理论塔板数的固定相。
在标准的寡核苷酸合成方法中，失败序列用乙酰基或其它酸可稳定的反应性官能团封端，全长寡核苷酸包括二甲氧基三苯甲基、9-苯基呫吨基(Pixyl)、二苯甲基氧基-双(三甲基甲硅烷基氧基)甲硅烷基(BZH)或在5’-羟基位置的其它众所周知的基团。研究人员提出，在合成循环完成时，全长的寡核苷酸产物可以通过寡核苷酸分子的5’-羟基上的化学基团与失败序列区分开。由于二甲氧基三苯甲基之类的基团比乙酰基的疏水性要显著得多，因此该差异在理论上可用于使用色谱方法例如反相HPLC从封端的失败产物中分离出全长寡核苷酸产物(J.Chrom.326,293-299；1985)。然而，使用DMT进行HPLC纯化有几个缺点。尽管由于有利的平衡条件，容易地除去DMT基团同时核苷酸处于固相支持体上，但从固相支持体中除去寡核苷酸后，DMT基团明显地更难以除去，需要强酸条件和长的反应时间。不幸的是，除去溶液中的DMT基团所需的条件可使纯化的寡核苷酸降解，最终导致纯度显著下降。对于DNA，这种条件在嘌呤碱基上尤为苛刻，导致糖苷键的断裂。对于RNA，暴露于酸中的问题甚至更大，因为这样的暴露可以直接断裂核苷酸间键并且催化核苷酸间键的异构化，产生5’-3’和5’-2’连接的RNA产物的混合物。
因此，需要用于温和并且有效地纯化寡核苷酸以产生高纯度的寡核苷酸的方法和化合物。本申请提供使用亲和标签纯化寡核苷酸的方法和化合物，该亲和标签在温和条件下可裂解，并且对寡核苷酸产物的纯度或完整性几乎没有影响。这些化合物也可以与新合成的生物聚合物和含有可获得的羟基的生物活性代谢物反应。亲和标签可用于纯化生物聚合物或代谢物。
发明内容
根据以下详细描述并且结合所附权利要求，本发明的方法和化合物的这些和其它特征和优点将是明显的。
一方面，本申请提供纯化靶寡核苷酸的方法。该方法包括以下步骤：
1.在固相支持体上合成靶寡核苷酸并且得到包含靶寡核苷酸和截短的寡核苷酸的混合物；
2.将靶寡核苷酸与原酸酯接头反应，由此形成寡核苷酸-原酸酯接头缀合物，其中原酸酯接头在缀合时包含亲和标签，或在缀合反应后在第二反应中，所述亲和标签与寡核苷酸-原酸酯接头缀合物反应；
3.从固相支持体中裂解寡核苷酸-原酸酯接头缀合物和截短的寡核苷酸；
4.将寡核苷酸-原酸酯接头缀合物和截短的寡核苷酸加载至色谱柱或亲和捕获支持体上并且将寡核苷酸-原酸酯接头缀合物通过亲和标签结合至亲和捕获支持体；
5.将截短的寡核苷酸从柱或亲和捕获支持体洗掉；和
6.将原酸酯接头从靶寡核苷酸裂解并且将靶寡核苷酸从色谱柱或亲和捕获支持体洗脱，由此释放纯化的靶寡核苷酸。
在方法中，亲和标签可以是原酸酯接头中的一个或多个基团或亲和标签通过接头连接至原酸酯接头。
在这些方法的任一种中，在寡核苷酸-原酸酯接头缀合物从固相支持体裂解前或在寡核苷酸-原酸酯接头缀合物从固相支持体裂解后，进行第二反应。
在这些方法的任一种中，原酸酯接头可以在靶寡核苷酸的5’-羟基处连接，或原酸酯接头在靶寡核苷酸的3’-羟基处连接。
在本申请提供的任何方法中，亲和标签可以包含以下中的一个或多个：氟标签、疏水标签、生物素标签、谷胱甘肽标签、麦芽糖标签、芳基硼酸标签、聚组氨酸肽标签、聚巯基标签、环糊精标签、金刚烷标签、多胺标签、马来酰亚胺标签、炔烃标签、叠氮基标签、酰肼标签、氨基标签、二醇标签、硫醇标签，或其任何组合。
本申请的方法可以用包含寡核糖核苷酸(RNA)的靶寡核苷酸进行。该RNA可以包含2’-羟基保护基，其选自硫羰氨基甲酸酯(TC)保护基、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)保护基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)保护基、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)保护基、新戊酰氧基甲基(PivOM)保护基和2-氰基乙氧基甲基(CEM)保护基。RNA可以进一步包含磷保护基、核碱基保护基，或其组合。在RNA中，可以在寡核苷酸与原酸酯接头反应之前将磷保护基脱保护。在RNA中，在靶寡核苷酸与原酸酯接头反应后，核碱基保护基和任选地磷保护基可以脱保护。在这些方法中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物从固相支持体的裂解和核碱基保护基的脱保护和任选地磷保护基的脱保护可以在单一反应中进行。RNA可以包含至少70个核苷酸。
在本申请提供的任何纯化方法中，原酸酯接头可以是式(Ia)化合物：
其中R、R’、R”和R”’各自独立地为C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、卤代C1-C24烷基、卤代C2-C24烯基、卤代C2-C24炔基、碳环基、杂烷基、芳基、杂芳基、杂环或任何取代的等同物，条件是R可以为氢。
在式(Ia)化合物中，R可以是H或C1-C3烷基且R’、R”、R’”各自独立地可以是芳基或取代的芳基。在式(Ia)化合物中，R可以是其中R为H或CH3且R’、R”、R’”可以是苯基或取代的苯基。在式(Ia)化合物中，R、R’、R”和R”’中的至少之一可以是疏水标签、部分疏水标签、氟标签或部分氟标签。
在本申请提供的任何纯化方法中，原酸酯接头可以是式(Ib)化合物：
其中AfTg为亲和标签，R、R’、R”各自独立地是AfTg-L或C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、卤代C1-C24烷基、卤代C2-C24烯基、卤代C2-C24炔基、碳环基、杂烷基、芳基、杂芳基、杂环、任何取代的等同物或其组合，但条件是碳的总数不超过24；和
其中L为共价键或直链、支链、单环或多环、饱和、部分不饱和或不饱和的C1-C12烃链，其任选地取代有F、Cl、Br、I或C1-C3烷基和任选地散杂有独立地选自O、S、N的杂原子，或散杂有独立地选自如下的基团：S-S、NRa、NRa-CO、-CO-NRa-、NRa-CO-NRb、CO，其中Ra、Rb各自独立地为H或C1-C6烷基。
在本申请提供的任何纯化方法中，原酸酯接头可以是式(I)化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基或任何取代的等同物或其组合，条件是碳的总数不超过24；R8和R9为H；X是H、甲基或吸电子基；n是0、1或2，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签。在一些实施方案中，在式(I)化合物中，R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一是氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基、氟代碳环基、氟代杂烷基、氟代杂烯基、氟代杂炔基或氟代杂环基。
在本申请提供的纯化方法中，亲和标签可以是cLogP值是至少3的氟标签或疏水标签。在根据本申请的纯化方法中，亲和标签可以是氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基或氟代碳环基。
在一些实施方案中，纯化方法用以下原酸酯接头进行：
在其它方面，本申请提供寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其包含寡核苷酸，所述寡核苷酸在其5’末端或3’末端包含式(IV)的部分。
其中连接至弯曲线的氧为寡核苷酸的5’末端或3’末端的氧；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少之一是C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基、任何取代的等同物或其组合，剩余的R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6-C12芳烷基、碳环基、杂环基、任何取代的等同物或其组合；n是0、1或2，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签；条件是所述部分不为
具有式(IV)的部分的寡核苷酸原酸酯接头缀合物包括化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少之一是氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基或氟代芳基、氟代杂烷基、氟代杂烯基、氟代杂炔基或氟代杂环基。在其它实施方案中，具有式(IV)的部分的寡核苷酸原酸酯接头缀合物包括化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少之一是氟标签，剩余的包括R7在内的R基团是H。在其它实施方案中，式(IV)的寡核苷酸原酸酯接头缀合物包括化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少两个是氟标签。
具有式(IV)的部分的寡核苷酸原酸酯接头缀合物包括化合物，其中n＝0，亲和标签是cLogP值是至少3的氟标签或疏水标签。
在一些实施方案中，具有式(IV)的部分的寡核苷酸原酸酯接头缀合物中的寡核苷酸包含寡核糖核酸(RNA)。
在寡核苷酸原酸酯接头缀合物的一些实施方案中，式(IV)的部分选自：
其中R11和R12各自独立地是H、C1-C23烷基、C1-C23杂烷基、取代的C1-C23烷基、C2-C23烯基、C2-C23杂烯基、取代的C2-C23烯基、C2-C23炔基、C2-C23杂炔基、取代的C2-C23炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基，条件是R11和R12中的至少之一包含亲和标签；R7是H、甲基、乙基、正丙基、苯基或苄基；Z各自独立地是CRaRb、O、S或NRa，其中Ra和Rb各自独立地是H、C1-C6烷基，或Ra和R11或Ra和R12一起形成含N的杂环；n为0、1或2。
在具有式(IV)的部分的寡核苷酸原酸酯接头缀合物的一些实施方案中，所述部分为：
其中X1是H、F、叠氮基、保护的巯基、保护的聚巯基、聚组氨酸、保护的氨基、保护的酰肼基、保护的羟基胺基团、马来酰亚胺、环辛炔、共轭二烯、C2烯基、取代的C2烯基、C2炔基或取代的C2炔基；R18和R19各自独立地是H、F、C1-3杂烷基或取代的C1-3烷基；n为1或2；m为0至12的整数。
在具有式(IV)的部分的寡核苷酸原酸酯接头缀合物的一些实施方案中，所述部分选自：
本申请的其它方面涉及式(Id)的原酸酯接头
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少之一是C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基、任何取代的等同物或其任何组合，条件是碳的总数不超过24，剩余的R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代或杂取代的等同物、C3-C12碳环基或杂环基和取代的等同物，条件是R1至R7基团中的两个R基团不与如下所示的环状原酸酯形成稠环：
X是F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基；n是0或1，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签。
式(Id)的原酸酯接头可以具有以下结构：
其中R11是H、C1-C23烷基、C1-C23杂烷基、取代的C1-C23烷基、C2-C23烯基、C2-C23杂烯基、取代的C2-C23烯基、C2-C23炔基、C2-C23杂炔基、取代的C2-C23炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基；R7是H或CH3。Z为CRaRb、O、S、NRa、NRaCO、CONRa，其中Ra和Rb各自独立地是H、C1-C6烷基，或Ra和R11一起形成含N的杂环；X是F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基；n为0或1，R11包含亲和标签。
式(Id)的原酸酯接头可以具有结构：
其中R11和R12各自独立地是H、C1-C23烷基、C1-C23杂烷基、取代的C1-C23烷基、C2-C23烯基、C2-C23杂烯基、取代的C2-C23烯基、C2-C23炔基、C2-C23杂炔基、取代的C2-C23炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基，条件是R11和R12中的至少之一包含亲和标签；R7是H或CH3。Z各自独立地是CRaRb、O、S、NRaCO、CONRa或NRa，其中Ra和Rb各自独立地是H、C1-C6烷基，或Ra和R11或Ra和R12一起形成含N的杂环；X为F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基；n为0或1。
式(Id)的原酸酯接头中的任一个可以具有亲和标签，其中亲和标签是cLogP值是至少3的氟标签或疏水标签。
式(Id)的原酸酯接头中的一些包括化合物，其中n是0，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少两个各自独立地是C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基或任何取代的等同物，R1、R2、R3、R4、R5和R6中所有剩余的R基团是H，条件是不为H的两个R基团不与所述环状原酸酯一起连接以形成稠环。式(Id)的原酸酯接头中的一些包括化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6中之一是氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基或氟代芳基。
本申请的其它方面包括氟原酸酯接头，其具有结构：
其中Z是CH2、O、S、NRa或NRaCO，其中Ra是H或C1-C6烷基；R7是H、甲基、乙基、正丙基、苯基或苄基；X是H、F、Cl、Br或单、双、三卤代甲基或氰基；m是0至12的整数；n是1或2。
本申请的其它方面包括原酸酯接头，其具有选自如下的结构：
本申请的其它方面包括式(IIIa)的原酸酯接头：
其中X1是H、F、叠氮基、保护的巯基、保护的聚巯基、聚组氨酸、保护的氨基、保护的酰肼基、保护的羟基胺基团、环辛炔、共轭二烯、C2烯基、取代的C2烯基、C2炔基或取代的C2炔基；R18和R19各自独立地是H、F、C1-3杂烷基或取代的C1-3烷基；X2是H、CH3、F、Cl、Br或单、双、三卤代甲基或氰基；n是1或2；m是0至12的整数。
式(IIIa)的原酸酯接头可以是以下化合物：
根据以下详细描述并且结合所附权利要求，本发明的方法和化合物的这些和其它特征和优点将是明显的。
附图说明
图1显示寡核苷酸在固相支持体上的典型化学合成。
图2显示粗制寡核苷酸混合物的二极管阵列检测器(DAD)光谱，该混合物包括全长序列和多个失败序列，其中全长序列是最大峰。
图3显示寡核苷酸的典型化学合成方法，其中截短或失败序列的5’-羟基由乙酰基保护基封端，同时全长寡核苷酸在其5’-末端带有二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基，使得在全长寡核苷酸的5’-位上特异性除去DMT基团和区域特异性添加原酸酯接头。
图4显示RNA的核苷酸间键的酸裂解和核苷酸间键的异构化，产生5’-3’和5’-2’连接的RNA产物的混合物。
图5显示寡核苷酸通过无环原酸酯接头的保护，其中亲和标签位于连接至原酸酯的中心碳的R基团上或位于原酸酯的所有R基团上，产生带有两个亲和标签的原酸酯缀合的寡核苷酸。
图6显示寡核苷酸通过环状原酸酯的保护和原酸酯保护基的酸促进的裂解。
图7显示使用包含氟亲和标签的原酸酯接头对寡核苷酸进行纯化的工作流程。工作流程显示四步骤工艺，其中将寡核苷酸首先缀合至氟取代的原酸酯接头，然后将寡核苷酸原酸酯接头缀合物的寡核苷酸部分进行脱保护并且从固相支持体中裂解，然后将寡核苷酸原酸酯接头缀合物使用氟亲和标签通过HPLC或固相萃取进行纯化。最后步骤中，将氟代原酸酯接头从寡核苷酸中裂解，产生所需纯化产物寡核苷酸。
图8显示使用原酸酯保护基和色谱分离进行纯化寡核苷酸的纯化策略。
定义的术语
应该理解的是，本申请使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并非旨在进行限制。除了如在本教导的技术领域中通常理解和接受的定义的术语的技术和科学的含义之外，定义的术语还为如下所述。
术语“取代的”是关于烷基、杂烷基、烯基、杂烯基、炔基、杂炔基、芳基、杂芳基、杂环基等的，并且术语“取代的等同物”，例如“取代的烷基”、“取代的杂烷基”、“取代的烯基”、“取代的杂烯基”、“取代的炔基”、“取代的杂炔基”、“取代的芳基”、“取代的杂芳基”和“取代的杂环基”分别是指烷基、杂烷基、烯基、杂烯基、炔基、杂炔基、芳基、杂芳基、杂环基，其中一个或多个氢原子各自独立地由非氢取代基替代。典型的取代基包括但不限于，-X、-R、-O-、═O、-OR、-SR、-S-、-NR2、-N+R3、═NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N═C═O、-NCS、-NO、-NO2、═N2、-N3、-NHC(═O)R、-NHS(═O)2R、-C(═O)R、-C(═O)NRR-S(═O)2O-、-S(═O)2OH、-S(═O)2R、-OS(═O)2OR、-S(═O)2NR、-S(═O)R、-OP(═O)(OR)2、-P(═O)(OR)2、-P(═O)(O-)2、-P(═O)(OH)2、-P(O)(OR)(O-)、-C(═O)R、-C(═O)OR、-C(═O)X、-C(S)R、-C(O)OR、-C(O)O-、-C(S)OR、-C(O)SR、-C(S)SR、-C(O)NRR、-C(S)NRR、-C(═NR)NRR，其中每个X独立地是卤素：F、Cl、Br或I；并且每个R独立地是H、烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或保护基。亚烷基、亚烯基和亚炔基基团也可以类似地进行取代。当对于取代基团指定碳原子数时，碳原子数是指基团，而不是取代基(除非另有说明)。例如，取代的C1-4烷基是指C1-4烷基，其可以由具有大于例如4个碳原子的基团取代的。
如本申请所用的术语“亲和对(affinity pair)”是指通过强的和/或特定的生物或化学亲和力相互作用而彼此缔合的一对分子或物质，所述生物或化学亲和力相互作用例如在抗原和抗体之间、酶与底物之间或受体与配体之间或疏水化合物与疏水性树脂之间等。与不溶性支持体共价连接或固定在凝胶中的这些物质中的任一种可以用作吸附剂，使得相互作用的物质从相对不纯的样品中分离出。使用这种亲和对的缔合相互作用连同使用不溶性支持体或凝胶进行分离、隔离或纯化物质的技术称为亲和捕获。该技术通常意味着通过与亲和对的与不溶性支持体相连的另一成员的缔合相互作用，将所需的亲和性标签的生物分子保留在不溶性支持体或凝胶上，并且洗脱未标签在液相中的杂质或不需要的副产物。亲和捕获可通过过滤不溶性物质并且从滤液中分离，然后从不溶性支持体上洗脱或裂解所需的纯化生物分子来进行。亲和对的非限制性实例包括生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、谷胱甘肽/GST、麦芽糖/MBP(麦芽糖结合蛋白)、二醇/芳基硼酸、镍或钴/组氨酸或硫醇、葫芦脲/金刚烷、环糊精/金刚烷、氟烷基/氟烷基和三苯甲基/C18树脂。
如本申请所用的术语“亲和标签”可以指亲和对的一个成员或具有固有性质(例如疏水性、亲水性、极性、电荷、亲氟性(fluorophilicity)等)的部分，利用该固有性质使得分离或隔离与亲和标签连接的靶分子(例如，寡核苷酸)。亲和对包括亲和标签以及对亲和标签具有特异性结合能力的识别部分。亲和标签可以存在于靶分子中(例如，作为取代基)或通过接头(例如，原酸酯接头)连接到靶分子上。亲和标签也可以共价捕获在固相支持体上。亲和标签的非限制性实例包括氟亲和标签、疏水标签、生物素标签、环糊精标签、金刚烷标签、麦芽糖或多胺标签、带电标签等。亲和标签也可以是任选被保护的化学官能团，其与分子上的特定化学官能团选择性反应，以赋予固有性质(例如疏水性、亲水性、极性、电荷、亲氟性等)，从而隔离或分离新连接的靶分子，或使其与连接在固相或亲和捕获介质上的特定化学官能团选择性反应。功能性化学标签的非限制性实例包括马来酰亚胺标签、炔烃标签、叠氮基标签、酰肼标签、氨基标签、羰基标签和硫醇标签。
如本申请所用的术语“识别部分”是指亲和对的第二个成员，其特异性地与亲和标签相互作用。
如本申请所用的术语“疏水标签”是指疏水取代基或富含碳的疏水取代基的组合。取代基的疏水性可通过其分配系数(logP)的值来确定、测量或计算。物质的分配系数(logP)定义其在两种不相混溶的溶剂中的溶解度之比，通常是辛醇:水。当该值是计算值而不是测量值时，其称为cLogP。疏水标签的cLogP是至少3，或两个、三个或四个“部分疏水标签”的组合的cLogP的总值是至少3。疏水标签的非限制性实例包括C6-C24烷基、C4-C24烯基、C4-C24炔基、碳环和芳基、三苯甲基、脂质、类固醇、金刚烷。氟取代基或氟代基团可用于增加疏水标签的疏水性。疏水标签包含至少六个碳原子。包含疏水标签的原酸酯接头包括具有一个、两个、三个或四个疏水标签的原酸酯接头，所述疏水标签各自位于其四个自由基R基团之一上。疏水原酸酯接头也包括具有“部分疏水标签”(即各自的碳原子数少于六个)但组合在一起时包含至少六个碳原子的原酸酯接头。
如本申请所用的术语“氟标签”是指全氟或氟取代基或全氟或氟取代基的组合，例如氟代C1-C24烷基、氟代C2-C24烯基、氟代C2-C24炔基、氟代碳环基和氟代芳基。氟标签包含至少七个氟原子和三个碳原子。包含氟标签的原酸酯接头包括具有一个、两个、三个或四个氟标签的原酸酯接头，所述氟标签各自位于其四个自由基R基团之一上。氟原酸酯接头也包括具有“部分氟标签”的原酸酯接头，所述部分氟标签即具有少于七个氟原子和少于三个碳，但当其组合在一起时包含至少七个氟原子和至少三个碳，并且当全部组合在一起时不超过52个氟原子。“氟标签”可充当“疏水标签”并且可使用疏水介质而不是氟介质进行分离。
术语“色谱法”是指分离一种或多种化合物的方法，该方法涉及使用固定相和移动通过或穿过固定相的流动相或洗脱剂。色谱法的非限制性实例包括氟亲和纯化、高效液相色谱和气相色谱。
术语“氟亲和纯化”是指基于亲和性的方法，用于纯化具有氟亲和标签的靶分子，该方法利用氟化材料(例如，氟化或全氟吸附剂或氟化或全氟树脂)作为分离介质。该方法基于氟标签与氟化物质(例如氟化吸附剂)之间的强亲和力。
术语“烷基”是指直链或支链烷基，优选具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个碳。这种烷基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。在一些实施方案中，烷基基团可以是环烷基。
如上定义，烷基基团可以是未取代的或取代的。术语“卤代烷基”是指由一个或多个卤素原子取代的烷基。非限制性实例包括三氟甲基、三氟乙基、五氟乙基、2,2,2-三氯乙基、氯甲基等。如上定义，卤代烷基基团可以是未取代的或取代的。术语“氟代烷基”是指由一个或多个氟原子取代的烷基基团。
术语“烯基”是指直链或支链烃，优选具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个碳，并且具有一个或多个碳-碳双键。烯基基团的非限制性实例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、异丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基和2-丁烯基。烯基基团可以是未取代的或由如上定义的一个或多个的适宜取代基取代的。术语“卤代烯基”是指由一个或多个卤素原子取代的烯基基团。术语“氟代烯基”是指由一个或多个氟原子取代的烯基基团。
术语“炔基”是指直链或支链烃，优选具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个碳，并且具有一个或多个碳-碳三键。炔基基团包括但不限于乙炔基、丙炔基和丁炔基。炔基基团可以是未取代的或由如上定义的一个或多个的适宜取代基取代的。术语“卤代炔基”是指由一个或多个卤素原子取代的炔基基团。术语“氟代炔基”是指由一个或多个氟原子取代的炔基基团。
“碳环”或“碳环基”是指饱和环(即环烷基)、部分不饱和环(例如环烯基、环二烯基等)或芳族环，其作为单环具有3至7个碳原子、作为双环具有7至12个碳原子和作为多环具有至多约20个碳原子。单环碳环具有3至6个环原子，仍更典型地具有5至6个环原子。双环碳环具有7至12个环原子，其例如排列为双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]体系，或9或10个环原子，其排列为双环[5,6]或[6,6]体系，或螺稠环。单环碳环的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基和苯基。双环碳环的非限制性实例包括萘基。
“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”分别是指烷基基团、烯基基团和炔基基团，其中一个或多个碳原子由杂原子例如O、N或S替代。烷基基团、烯基基团或炔基基团中的任何碳原子都可独立地由杂原子(O、N或S)替代，表示这些基团中的第一个碳原子、末端碳原子或内部碳原子都可进行这样的替代。例如，如果与母体分子连接的烷基基团的碳原子由杂原子(例如，O、N或S)替代，则杂烷基基团分别是烷氧基基团(例如，-OCH3等)、烷氨基基团(例如，-NHCH3、-N(CH3)2等)或烷硫基基团(例如，-SCH3)。如果未与母体分子连接的烷基基团的非末端碳原子由杂原子(例如，O、N或S)替代，则所得杂烷基基团分别是烷基醚(例如，-CH2CH2-O-CH3等)、烷基胺(例如，-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2等)或硫代烷基醚(例如，-CH2-S-CH3)。如果烷基基团的末端碳原子由杂原子(例如，O、N或S)替代，则所得杂烷基基团分别是羟基烷基基团(例如，-CH2CH2-OH)、氨基烷基基团(例如，-CH2NH2)或巯烷基基团(例如，-CH2CH2-SH)。杂烷基基团、杂烯基基团或杂炔基基团可以具有1至24个碳原子。C1-C6杂烷基基团是指具有1至6个碳原子的杂烷基基团。“取代的杂烷基”、“取代的杂烯基”或“取代的杂炔基”是指如本申请定义的杂烷基、杂烯基或杂炔基，其中一个或多个氢原子已经由“取代的”定义中定义的非氢取代基替代。
术语“芳基”是指如本领域中通常所理解的未取代的或取代的芳族碳环取代基，其作为单环具有3至7个碳原子、作为双环具有7至12个碳原子、作为多环至多约20个碳原子，例如苯基、萘基、蒽基、茚满基等。应当理解，根据休克尔(Hückel)规则，术语芳基适用于为平面的并且包含4n+2个电子的取代基。芳基基团可以是未取代的或由如上定义的一个或多个的适宜取代基取代的。术语“卤代芳基”是指由一个或多个卤素原子或含卤素的取代基取代的芳基。术语“氟代芳基”是指由一个或多个氟原子或含氟取代基取代的芳基。
“芳基烷基”是指其中与碳原子(通常为末端碳原子)键合的氢原子之一由芳基替代的无环烷基。典型的芳基烷基基团包括但不限于苄基、2-苯基乙-1-基、萘甲基、2-萘基乙-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙-1-基等。芳基烷基基团可以包含6至24个碳原子，例如，烷基碳原子和芳基碳原子加起来至多6至24个碳原子。芳基基团可以是未取代的或由如上定义的一个或多个的适宜取代基取代的。
术语“羰基”是指包含与氧双键键合的碳的取代基。这种取代基的实例包括醛、酮、羧酸、酯、酰胺、碳酸酯和氨基甲酸酯。羰基基团可以是未取代的或由如上定义的一个或多个的适宜取代基取代的。
术语“氨基”是指任何含氮部分。氨基基团的非限制性实例是NH2-(伯)、RHN-(仲)和R2N(叔)，其中R是烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基或杂芳基。RHN-和R2N基团可以是未取代的或取代的，如上定义。
术语“杂芳基”是指单环或双环5或6元环体系，其中杂芳基基团是不饱和的并且满足休克尔规则。杂芳基基团的非限制性实例包括呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、异噁唑基、噁唑基、异噻唑基、噻唑基、1,3,4-噁二唑-2-基、1,2,4-噁二唑-2-基、5-甲基-1,3,4-噁二唑、3-甲基-1,2,4-噁二唑、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑啉基、喹唑啉基等。杂芳基基团可以是未取代的或取代的，如上定义。
术语“杂环”或“杂环基”是指包含1至4个选自O、N和S的杂原子的单环、双环或三环部分。杂环基基团任选地包含一个或多个双键。杂环基基团包括但不限于氮杂环丁烷基、四氢呋喃基、咪唑烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、噻唑烷基、吡唑烷基、硫代吗啉基、四氢噻嗪基、四氢噻二嗪基、吗啉基、氧杂环丁烷基、四氢二嗪基、噁嗪基、噁噻嗪基、吲哚基、异吲哚基、奎宁环基、色满基、异色满基和苯并噁嗪基。单环饱和或部分饱和的环体系的非限制性实例是四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、咪唑烷基-1-基、咪唑烷基-2-基、咪唑烷基-4-基、吡咯烷-1-基、吡咯烷基-2-基、吡咯烷-3-基、哌啶-1-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌嗪-1-基、哌嗪-2-基、哌嗪-3-基、1,3-噁唑烷-3-基、异噻唑烷、1,3-噻唑烷-3-基、1,2-吡唑啉-2-基、1,3-吡唑啉-1-基、硫代吗啉基、1,2-四氢噻嗪-2-基、1,3-四氢噻嗪-3-基、四氢噻二嗪基、吗啉基、1,2-四氢二嗪-2-基、1,3-四氢二嗪-1-基、1,4-噁嗪-2-基和1,2,5-氧杂噻嗪-4-基。杂环基团可以是未取代的或由如上定义的一个或多个的适宜取代基取代的。
“卤素”或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。
“核苷酸”是指核酸(无论是DNA还是RNA或其类似物)的子单元，其包括磷酸基、糖基团和杂环碱基以及这种子单元的类似物。其它基团(例如，保护基)可以连接到核苷酸的任何一个或多个组分上。“核苷”或“核苷部分”是指包含糖基团和杂环碱基的核酸子单元以及这种子单元的类似物。
术语“核苷”和“核苷酸”意在包括如下的那些部分，其不仅包含已知的嘌呤和嘧啶碱基，例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)，而且包含其它已修饰的杂环碱基。嘧啶、嘌呤、杂环碱基和修饰的杂环碱基在本申请中称为“核碱基”。这种修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶，酰化的嘌呤或嘧啶，烷基化的杂环基或其它杂环基。这种修饰例如包括二氨基嘌呤及其衍生物，肌苷及其衍生物，烷基化的嘌呤或嘧啶，酰化的嘌呤或嘧啶，硫醇化的嘌呤或嘧啶等，或加入保护基，例如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、9-芴基甲氧基羰基、苯氧基乙酰基，二甲基甲脒、二丁基甲脒、N,N-二苯基氨基甲酸酯等。另外，术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅包含常规核糖和脱氧核糖的糖而且包含其它糖的那些部分。修饰的核苷或核苷酸也包括对糖部分的修饰，例如其中一个或多个羟基由卤素原子或脂族基团替代，或由醚、胺等官能化。修饰的核苷或核苷酸也包括对核苷酸间键或主链部分的修饰。“类似物”是指具有文献中认可的作为模拟物、衍生物的结构特征、具有类似结构的分子或其它类似术语，包括例如，包含非天然(通常不存在于自然界中)的核苷酸，非天然核苷酸模拟物例如2’-修饰的核苷，肽核酸，寡聚核苷磷酸酯，和具有增加的取代基例如保护基或连接基团的任何聚核苷酸。
“寡核苷酸”是指包含多个通过核苷酸间键连接的核苷部分子单元的化合物。因此，该术语也是指包含多个核苷酸部分子单元或残基的化合物。寡核苷酸可包含核糖核苷或脱氧核糖核苷或其混合物。寡核苷酸可以包括天然和/或非天然的核苷、核苷类似物和修饰的核苷。
如本申请所用的术语“接头”是指烃基链(例如，(C1-C12)亚烷基、(C2-C12)亚烯基、(C2-C12)亚炔基)，任选地取代有取代基，或散杂有其它原子，如-(CHR’)a-Wb-(CHR’)c-Vd-(CHR’)e-所示，其中W和V独立地是-O-、-S-或-NR’-；R’是H或(C1-C6)烷基；并且a、b、c、d和e独立地是0至10、优选0至6或优选0至3的整数，并且a、b、c、d和e优选地是2到6之间的整数。烃基链可以散杂有-O-R”、-O-CO-R”、-NR’-R”、-NR’-CO-R”、-CO-NR’-R”、-CO-R”或其组合，其中R’和R”独立地是H或(C1-C6)烃基。
术语“原酸酯接头”是指能够连接至生物聚合物例如寡核苷酸的原酸酯化合物。在一些实施方案中，原酸酯接头包含亲和标签。
术语“寡核苷酸-原酸酯接头缀合物”是指寡核苷酸氧与原酸酯接头反应生成的产物。
术语“氟原酸酯”是指包含至少一个氟标签的原酸酯。
“硫羰氨基甲酸酯保护基”是指包括硫羰羰基的保护基，所述硫羰羰基具有键合至硫羰基碳原子的氮和氧：-O-C(S)N-。
术语“吸电子基”是指从反应中心吸引电子的化学基团。吸电子基(EWG)的非限制性实例是卤素(例如，氟和氯)、卤代烷基(例如，CH2Cl、CF3等)、腈(-RCN)、羰基(-COR)、磺酰基(-SO3R)、铵(N+R3)和硝基基团(-NO2)。
术语“截短序列”或“截短的寡核苷酸”是指长度比靶全长寡核苷酸短的序列。
如说明书和所附权利要求中使用的，除了它们的通常含义之外，术语“基本的”或“基本上”是指在对于本领域普通技术人员来说可接受的范围或程度内。例如，“基本上取消”是指本领域技术人员认为取消是可接受的。
如说明书和所附权利要求中使用的，除了其通常含义之外，术语“大约”和“约”是指在对于本领域普通技术人员来说可接受的范围内。术语“约”通常是指所示数字的±15％。例如，“约10”可表示8.5至11.5的范围。例如，“大约相同”是指本领域普通技术人员认为项目经比较是相同的。
在本申请中，数字范围包括定义范围的数字。应当认识到，出于说明的目的，化学结构和化学式可以延伸或扩展。
每当指出结构中的原子数范围时(例如，C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基等)，特别预想的是，取代基可以通过如下描述：子范围内的任何碳原子或落入所示范围内的任何单个碳原子数。举例来说，对于基团例如烷基基团使用记载范围为1-24个碳原子(例如，C1-C24)、1-6个碳原子(例如，C1-C6)、1-4个碳原子(例如，C1-C4)、1-3个碳原子(例如，C1-C3)或2-24个碳原子(例如，C2-C24)的描述，涵盖和具体描述具有适当时1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24个碳原子以及其任何子范围(例如，适当时1-2个碳原子、1-3个碳原子、1-4个碳原子、1-5个碳原子、1-6个碳原子、1-7个碳原子、1-8个碳原子、1-9个碳原子、1-10个碳原子、1-11个碳原子、1-12个碳原子、1-13个碳原子、1-14个碳原子、1-15个碳原子、1-24个碳原子、2-3个碳原子、2-4个碳原子、2-5个碳原子、2-6个碳原子、2-7个碳原子、2-8个碳原子、2-9个碳原子、2-10个碳原子、2-11个碳原子、2-12个碳原子、2-13个碳原子、2-14个碳原子、2-15个碳原子、2-16个碳原子、3-4个碳原子、3-5个碳原子、3-6个碳原子、3-7个碳原子、3-8个碳原子、3-9个碳原子、3-10个碳原子、3-11个碳原子、3-12个碳原子、3-13个碳原子、3-14个碳原子、3-15个碳原子、3-16个碳原子、3-17个碳原子、3-18个碳原子、3-19个碳原子、3-20个碳原子、3-21个碳原子、3-22个碳原子、3-23个碳原子和/或3-24个碳原子)的任一个的烷基基团。
除非另有定义，否则本申请所用的所有技术和科学术语都具有与本申请所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。
具体实施方式
在描述各种实施方案前，应当理解，本申请的教导不限于描述的特定实施方案，并且因此当然可以变化。还应当理解，本申请中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意欲进行限制，因为本申请教导的范围将仅由所附权利要求限制。
如本申请公开的，提供许多数值范围。应该理解的是，除非上下文另外明确指出，否则各个中间值，直至下限的十分之一，也明确地公开该范围的上限和下限之间的值。在规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其它规定值或中间值之间的各个较小范围都涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围外，并且其中任一个端值或两个端值都包含在较小范围内或任一个端值都不包含在较小范围内的各个范围也涵盖于本发明内，进行任何明确排除的端值在规定范围内。当规定范围包括端值的任一个或两者时，排除所包括的端值中任一个或两者的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本申请所用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本申请描述的那些方法和物质类似或等同的任何方法和物质也可以用于本申请教导的实践或测试中，但现在描述一些示例性方法和物质。
本申请提及的所有专利和专利出版物都明确地通过引用并入。
如说明书和所附权利要求中使用的，术语“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指代物这两者，除非上下文另有明确规定。因此，例如，“一部分”包括一个部分和多个部分。
提供可用于纯化寡核苷酸例如RNA、DNA或嵌合体的方法和化合物。本发明的方法涉及寡核苷酸与原酸酯接头的缀合，并且使用例如色谱分离或亲和捕获法纯化所得的寡核苷酸-原酸酯接头缀合物。本发明的方法和化合物对于从截短或失败序列中分离出全长寡核苷酸是特别有用的。本发明的方法提供类似大小的高分辨率的寡核苷酸，使得从不需要的副产品中快速分离出寡核苷酸。本发明方法的另一优点是寡核苷酸-原酸酯接头缀合物是碱稳定的，使得在碱性条件下对寡核苷酸-原酸酯接头缀合物进行合成操作而没有原酸酯从寡核苷酸裂解的风险。在分离介质(凝胶或树脂)上对寡核苷酸-原酸酯接头缀合物进行亲和纯化后，可在弱酸性条件下裂解寡核苷酸-原酸酯接头缀合物，从而高收率地释放纯化的寡核苷酸。本发明的方法对于纯化通过各种合成方法制备的寡核苷酸都是有效的，所述寡核苷酸包括以固相寡核苷酸合成方法制备的寡核苷酸。
待纯化的寡核苷酸可以从天然来源获得或使用合成方法制备。可以使用本领域已知的任何方法来制备合成的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸通过固相寡核苷酸合成制备。在这种实施方案中，合成在固相支持体上进行。固相支持体通常固定在柱中的两列过滤器之间，所述柱能够使试剂和溶剂自由通过。
在一些实施方案中，合成在平面上进行。在一些实施方案中，合成在非平面上进行。在这种实施方案中，合成在基本上固体、基本上光滑的表面上进行。如本申请所用的对于表面的术语“基本上固体”是指发生寡核苷酸合成的支持体表面上的一个或多个位置可抵抗寡核苷酸合成的相关试剂和化学物质扩散、吸收或渗透到其表面以外并且进入支持体体内(与允许这种扩散和渗透使得在支持体体内发生寡聚合成的商业聚合物寡聚合成器支持体相反)。如本申请所用的对于表面的术语“基本上光滑”是指在支持体表面上发生寡核苷酸合成的一个或多个位置至多是表面上不规则的，使得不规则度(如果有的话)不具有会严重影响试剂可均匀地施用至表面、在表面混合或从表面除去的迅速性的程度(与其中含有孔和不规则结构从而减缓试剂的施用和除去速度的商用“可控多孔玻璃”低聚物合成器支持体相反)。基本上固体、基本上光滑的表面不必是平坦的，例如将包括平坦表面、管、圆柱体、凹陷或孔的阵列、这些元素的组合以及代表具有上述属性的表面部分的其它设计。例如，基本上固体、基本上光滑的表面是可以由喷墨打印头处理的表面(或表面的一部分)。
在一些实施方案中，寡核苷酸连接至固相支持体例如可控多孔玻璃或聚合支持体例如聚苯乙烯(PS)支持体。适宜的固相支持体在某些情况下是聚合的，可以具有多种形式和组成并且来源于天然存在物质，经过人工合成修饰的天然存在物质或合成物质。适宜的支持体物质的实例包括但不限于多糖，例如琼脂糖(例如，作为从Pharmacia商购可得的那种)和葡聚糖(例如，以商品名/>和/>也从Pharmacia商购可得的那些)，聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，二氧化硅，聚四氟乙烯，玻璃等。
在一些实施方案中，寡核苷酸使用亚磷酰胺方法制备。在一些实施方案中，寡核苷酸合成方法包括具有5’-DMT保护基的与支持体结合的核苷。
在一些实施方案中，寡核苷酸合成方法包括具有3’-DMT保护基的与支持体结合的核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸合成方法包括具有5’-甲硅烷基保护基的与支持体结合的核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸合成方法包括具有氧化可除去的保护基的与支持体结合的核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸合成包括去三苯甲基化、支持体结合的核苷与核苷亚磷酰胺单体的偶联、封端未反应的5’-羟基以及亚磷酰胺氧化的步骤。在一些实施方案中，寡核苷酸合成是自动的。在一些实施方案中，在进行本发明的方法前，使寡核苷酸去三苯甲基化。
在一种实施方案中，本发明提供纯化寡核苷酸的方法。该方法包括在固相支持体上合成寡核苷酸；使寡核苷酸与原酸酯接头反应以形成寡核苷酸-原酸酯接头缀合物，其中原酸酯接头包含亲和标签；将寡核苷酸-原酸酯接头缀合物从用于合成的固相支持体裂解；将寡核苷酸-原酸酯接头缀合物利用色谱或亲和捕获法分离；并且将原酸酯接头从寡核苷酸原酸酯接头缀合物裂解，由此释放纯化的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的方法包括使寡核苷酸与包含亲和标签的原酸酯接头和烷氧基离去基团反应。反应产生寡核苷酸-原酸酯接头缀合物，所述缀合物包含连接至原酸酯接头的寡核苷酸，其中所述原酸酯接头连接至亲和标签。亲和标签期望地具有结构和/或官能团性质，其可以在纯化方法中加以利用，以从一种或多种杂质中分离出寡核苷酸-原酸酯接头缀合物。例如，在一些实施方案中，可以使用氟亲和色谱从一种或多种杂质中分离出寡核苷酸-原酸酯接头缀合物。
在一些实施方案中，原酸酯接头是环状原酸酯。在一些实施方案中，环状原酸酯是五元环状原酸酯。在一些实施方案中，原酸酯接头是六元环状原酸酯。在一些实施方案中，原酸酯接头是七元环状原酸酯。
在一些实施方案中，所述原酸酯接头是氟原酸酯。在一些实施方案中，原酸酯接头包含至少一个氟原子、至少两个氟原子、至少三个氟原子、至少四个氟原子、至少五个氟原子、至少六个氟原子、至少七个氟原子、至少八个氟原子、至少九个氟原子、至少十个氟原子、至少十一个氟原子、至少十二个氟原子、至少十三个氟原子、至少十四个氟原子、至少十五个氟原子、至少十七个氟原子、至少十九个氟原子、至少二十一个氟原子、至少二十三个氟原子或至少二十五个氟原子或至多但不超过五十二个氟原子。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式RC(OR’)(OR”)(OR”’)的化合物(Ia)，
其中R、R’、R”和R”’各自独立地是C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、烷基、烯基、炔基、碳环基、杂烷基、芳基、杂芳基、杂环基或任何取代的等同物。R可以是氢。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(Ia)化合物，其中R、R’、R”和R”’各自独立地是C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、卤代C1-C24烷基、卤代C2-C24烯基、卤代C2-C24炔基、碳环基、杂烷基、芳基、杂芳基、杂环基或任何取代的等同物，条件是R可以是氢。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(Ia)化合物，其中R是H或C1-C3烷基，R’、R”、R’”各自独立地是芳基或取代的芳基。
在一些实施方案中，R是H或CH3，R’、R”、R’”全部是苯基或取代的苯基。
在一些实施方案中，R’、R”和R’”之一是离去基团并且可以包含吸电子基“EWG”，例如三氟烷基、卤素(例如，氯)或氰乙基基团。在一些实施方案中，R、R’、R”和R”’是甲基或乙基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(Ia)化合物，其中R、R’、R”和R”’中的至少之一为疏水标签或部分疏水标签，剩余的R基团是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代或杂取代的等同物、C3-C12碳环基或杂环基和取代的等同物。
在一些实施方案中，R、R’、R”和R”’中的至少两个是疏水标签或部分疏水标签，剩余的R基团是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代或杂取代的等同物、C3-C12碳环基或杂环基和取代的等同物。
在其中原酸酯接头为式(Ia)化合物的实施方案中，其中R、R’、R”和R”’中的至少之一或至少两个是疏水标签或部分疏水标签，疏水标签是指直链、支链、单环或多环、饱和、部分不饱和或不饱和的C1-C24烃链，其任选地取代有F、Cl、Br、I或C1-C3烷基和任选地散杂有独立地选自：O、S和N的杂原子，或散杂有独立地选自如下的基团：NRa-Rb、-NRa-CO-Rb、-CO-NRa-Rb、-CO-Ra，其中Ra、Rb各自独立地是H或C1-C6烷基。单独使用或一起使用，疏水标签或部分疏水标签的总和的cLogP值是至少3。在一些实施方案中，R、R’、R”和R’”之间共享有的碳原子总个数不大于50。在一些实施方案中，R是氢。在一些实施方案中，R是甲基或乙基。
在一些实施方案中，原酸酯接头化合物(Ia)选自以下两种结构：
其中SG是0、1、2、3、4或5个取代基，在每个苯基上独立地存在或不存在，并且独立地选自卤素、NO2、甲基和甲氧基基团。优选地，至少两个取代的苯基基团是相同的。
在一种优选的实施方案中，在三个苯基上不存在SG。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(Ia)化合物，其中R、R’、R”和R”’中的至少之一是氟标签或部分氟标签，剩余的其它R基团是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代或杂取代的等同物、C3-C12碳环基或杂环基和取代的等同物。
氟标签是指直链、支链、单环或多环、饱和、部分不饱和或不饱和C1-C24烃链，其部分或全部(全氟)取代有氟原子，任选地取代有Cl、Br、I或C1-C3烷基和任选地散杂有独立地选自O、S、N的杂原子，或散杂有独立地选自如下的基团：NRa-Rb、-NRa-CO-Rb、-CO-NRa-Rb、-CO-Ra，其中Ra、Rb各自独立地为H或C1-C6烷基。在氟标签中，R、R’、R”和R’”之间共享有的碳的总个数是至少3，氟原子的总个数是至少7。
在一些实施方案中，原酸酯接头是化合物(Ia)，其中R是H或C1-C3烷基和R’、R”、R’”各自独立地为C2-C12氟烷基。
在一些实施方案中，原酸酯接头化合物(Ia)具有以下化合物的结构：
其中n是选自1至5的整数。
在一些实施方案中，原酸酯接头包含至少一种亲和标签(AfTg)。在一些实施方案中，亲和标签(AfTg)可以是上述原酸酯接头的R基团的化学结构的一部分或全部(例如，疏水或氟标签)。
在一些实施方案中，亲和标签(AfTg)不是疏水或氟标签，并且是例如生物素标签、麦芽糖标签、金刚烷标签或化学功能标签，可以通过共价键直接连接至原酸酯接头，或可以通过接头L间接连接至原酸酯接头。在这些实施方案中，原酸酯接头是式(Ib)化合物
其中R、R’、R”各自独立地是AfTg-L或直链、支链、单环或多环、饱和、部分不饱和或不饱和C1-C12烃链，其是任选地取代的并且任选地散杂有独立地选自O、S、N的杂原子，或散杂有独立地选自如下的基团：NRa-Rb、NRa-CO-Rb、-CO-NRa-Rb、-CO-Ra，其中Ra、Rb各自独立地是H或C1-C6烷基；其中L为共价键或直链、支链、单环或多环、饱和、部分不饱和或不饱和的C1-C12烃链，其任选地取代有F、Cl、Br、I或C1-C3烷基和任选地散杂有独立地选自O、S、N的杂原子，或任选地散杂有独立地选自如下的基团：NRa-Rb、-NRa-CO-Rb、-CO-NRa-Rb、-CO-Ra，其中Ra、Rb各自独立地为H或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，L是直链、支链、单环或多环、饱和、部分不饱和或不饱和C1-C12烃链，其任选地取代有F、Cl、Br、I或C1-C3烷基和任选地散杂有独立地选自O、S、N的杂原子，或散杂有独立地选自如下的基团：NRa-Rb、-NRa-CO-Rb、-CO-NRa-Rb、-CO-Ra，其中Ra、Rb各自独立地是H或C1-C6烷基，R、R’和R”各自独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代或杂取代的等同物、C3-C12碳环基或杂环基和取代的等同物。R可以是氢。在一些实施方案中，R’和R”之一是离去基团并且可以包含吸电子基EWG例如三氟烷基(例如CH2CF3)或氰乙基基团。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(Ib)化合物，其中AfTg是亲和标签，R、R’、R”各自独立地是AfTg-L或C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、卤代C1-C24烷基、卤代C2-C24烯基、卤代C2-C24炔基、碳环基、杂烷基、芳基、杂芳基、杂环、任何取代的等同物或其组合，但条件是碳的总数不超过24；其中L为共价键或直链、支链、单环或多环、饱和、部分不饱和或不饱和的C1-C12烃链，其任选地取代有F、Cl、Br、I或C1-C3烷基和任选地散杂有独立地选自O、S、N的杂原子，或散杂有独立地选自如下的基团：S-S、NRa、NRa-CO、-CO-NRa-、NRa-CO-NRb、CO，其中Ra、Rb各自独立地为H或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(Ic)化合物，其中原酸酯接头的R’、R”和R’”基团中的两个通过碳-碳键连接在一起，并且形成如下所示的环状原酸酯：
原酸酯接头化合物(Ia)与寡核苷酸反应后，得到寡核苷酸-原酸酯接头缀合物(IVa)。
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其中R、R’和R”中的至少之一是疏水标签或氟标签，
其中R、R’和R”各自独立地是C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、碳环基、杂烷基、芳基、杂芳基、杂环基或任何取代的等同物；优选地，R’和/或R”是疏水标签或氟标签，R是H或甲基；
其中X是H、OH、F、保护的羟基、O-甲氧基或O-MOE(甲氧基乙氧基)；和
其中B是保护的或未保护的核碱基。
原酸酯接头(Ib)与寡核苷酸反应后，得到寡核苷酸-原酸酯接头缀合物(IVb)。
其中AfTg是亲和标签；
其中L为共价键或直链、支链、单环或多环、饱和、部分不饱和或不饱和的C1-C12烃链，其任选地取代有F、Cl、Br、I或C1-C3烷基和任选地散杂有独立地选自O、S、N的杂原子，或散杂有独立地选自如下的基团：NRa-Rb、-NRa-CO-Rb、-CO-NRa-Rb、-CO-Ra，其中Ra、Rb各自独立地是H或C1-C6烷基；
其中R和R’各自独立地是C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、碳环基、杂烷基、芳基、杂芳基、杂环基或任何取代的等同物；和
其中X是H、OH、F、保护的羟基、O-甲氧基或O-MOE(甲氧基乙氧基)，其中B是保护的或未保护的核碱基。
在优选的实施方案中，R是H，R’是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代或杂取代的等同物、C3-C12碳环基或杂环基和取代的等同物。
在一些实施方案中，亲和纯化用于分离或纯化寡核苷酸-原酸酯接头缀合物。
在一些实施方案中，原酸酯接头与寡核苷酸的5’-羟基反应，由此连接至寡核苷酸的5’-羟基。因此，在一些实施方案中，原酸酯接头连接在寡核苷酸的5’-羟基处。在一些实施方案中，原酸酯接头与寡核苷酸的3’-羟基反应，由此连接至寡核苷酸的3’-羟基。因此，在一些实施方案中，原酸酯接头连接在寡核苷酸的3’-羟基处。在一些实施方案中，原酸酯接头连接至存在于核苷酸碱上的羟基。
在一些实施方案中，寡核苷酸是寡核糖核苷酸(RNA)。在一些实施方案中，寡核苷酸是寡脱氧核糖核苷酸(DNA)。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少15个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少70个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少75个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少100个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少125个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少150个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是约15个核苷酸至约500个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是约40个核苷酸至约300个核苷酸的长度。
亲和标签和相同亲和对的识别部分可以可互换地连接至生物分子或生物聚合物或不溶性支持体，并且将根据缀合反应的难易程度和所用条件的相容性进行选择以使标签从生物分子脱保护和裂解。考虑到这一点，本领域技术人员可以决定亲和力对中的哪个成员将连接至生物分子并且连接至固相支持体。
在一些实施方案中，亲和标签是氟亲和标签。氟亲和标签的非限制性实例包括氟化取代基，例如氟代烷基、氟代杂烷基、氟代烯基、氟代炔基、氟代碳环基,氟代杂环基和氟代芳基取代基。在一些实施方案中，原酸酯充当氟亲和标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)直接(作为R基团)或通过接头L间接连接至氟亲和标签并且连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，氟亲和纯化用于分离或纯化寡核苷酸-原酸酯连接的氟标签缀合物。
在一些实施方案中，亲和标签为疏水标签。疏水亲和标签的非限制性实例包括包含氟化基团、三苯甲基、类固醇、脂质、长的烷基饱和或不饱和链例如十八烷基取代基和碳环基的分子。在一些实施方案中，原酸酯充当疏水亲和标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)直接(作为R基团)或通过接头L间接连接至疏水亲和标签并且也连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，疏水亲和纯化用于分离或纯化寡核苷酸-原酸酯连接的疏水标签缀合物。
在一些实施方案中，亲和标签是生物素标签。在一些实施方案中，原酸酯充当生物素标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)直接(作为R基团)或通过接头L间接连接至生物素标签并且也连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，亲和素或链霉亲和素连接至固相或包埋在凝胶中，并且用于捕获寡核苷酸-原酸酯连接的生物素缀合物。
在一些实施方案中，亲和标签是谷胱甘肽标签。在一些实施方案中，原酸酯充当谷胱甘肽标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)直接(作为R基团)或通过接头L间接连接至谷胱甘肽标签并且也连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，谷胱甘肽S-转移酶(GST)连接至固相或包埋在凝胶中，并且用于捕获寡核苷酸-原酸酯连接的谷胱甘肽缀合物。
在一些实施方案中，亲和标签是麦芽糖标签。在一些实施方案中，原酸酯充当麦芽糖标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)直接(作为R基团)或通过接头L间接连接至麦芽糖标签，并且也连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，麦芽糖结合蛋白连接至固相或包埋在凝胶中，并且用于捕获寡核苷酸-原酸酯连接的麦芽糖缀合物。
在一些实施方案中，所述亲和标签为芳基硼酸标签。在一些实施方案中，原酸酯充当芳基硼酸标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)直接(作为R基团)或通过接头L间接连接至芳基硼酸标签并且也连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，含有二醇的分子连接至固相或包埋在凝胶中并且用于捕获寡核苷酸-原酸酯连接的芳基硼酸缀合物。在一些实施方案中，亲和标签是含有二醇的化合物，芳基硼酸衍生物连接至固相支持体。
在一些实施方案中，亲和标签是聚组氨酸肽标签。聚组氨酸肽标签的非限制性实例包括咪唑基取代基，例如咪唑和组氨酸。在一些实施方案中，原酸酯充当聚组氨酸肽标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)直接(作为R基团)或通过接头L间接连接至聚组氨酸肽标签并且也连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，固定的金属亲和层析(IMAC)纯化用于分离或纯化寡核苷酸-原酸酯连接的组氨酸或咪唑基缀合物。
在一些实施方案中，亲和标签是聚巯基标签。聚巯基标签的非限制性实例包括取代基，例如半胱氨酸和二硫苏糖醇。在一些实施方案中，原酸酯充当聚巯基标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)直接(作为R基团)或通过接头L间接连接至聚巯基标签并且也连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，固定的金属亲和层析(IMAC)纯化用于分离或纯化寡核苷酸-原酸酯连接的聚巯基缀合物。
在一些实施方案中，所述亲和标签为马来酰亚胺标签。在一些实施方案中，原酸酯充当马来酰亚胺标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)直接(作为R基团)或通过接头L间接连接至马来酰亚胺标签并且也连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，含有巯基的分子连接至固相或包埋在凝胶中并且用于捕获寡核苷酸-原酸酯连接的马来酰亚胺缀合物。在一些实施方案中，亲和标签是含有巯基的化合物，马来酰亚胺衍生物连接至固相支持体。在另一种实施方案中，亲和标签是含有巯基的化合物和α-卤代羰基衍生物连接至固相支持体。
在一些实施方案中，亲和标签是金刚烷标签。在一些实施方案中，原酸酯充当金刚烷标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)直接或通过接头L连接至金刚烷并且连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，葫芦脲或环糊精连接至固相或包埋在凝胶中并且用于捕获寡核苷酸-原酸酯连接的金刚烷缀合物。在其它实施方案中，环糊精或葫芦脲化合物连接至原酸酯接头，金刚烷连接至固相或包埋在凝胶中用于亲和纯化。
在一些实施方案中，亲和标签是叠氮基标签。在一些实施方案中，原酸酯充当叠氮基标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)通过接头L连接至叠氮化物并且连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，炔烃或环辛炔连接至固相或包埋在凝胶中并且用于捕获寡核苷酸-原酸酯连接的叠氮化物缀合物。在另一种实施方案中，叠氮基部分连接至固相支持体或凝胶，炔烃或环辛炔直接或间接连接至原酸酯接头。
在一些实施方案中，亲和标签是环辛炔标签。在一些实施方案中，原酸酯充当环辛炔标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)通过接头L连接至环辛炔并且连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，氮碳基连接至固相或包埋在凝胶中并且用于捕获寡核苷酸-原酸酯连接的环辛炔缀合物。在另一种实施方案中，环辛炔部分连接至固相支持体或连接至凝胶，含有氮碳基的化合物直接或间接连接至原酸酯接头。
在一些实施方案中，亲和标签是烯基标签。在一些实施方案中，原酸酯充当烯基标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)通过接头L连接至烯基并且连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，共轭二烯连接至固相或包埋在凝胶中并且用于捕获在狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)类型的反应中([4+2]环加成)的寡核苷酸-原酸酯连接的烯基缀合物。在另一种实施方案中，含有烯基的化合物连接至固相支持体或凝胶，共轭二烯直接或间接连接至原酸酯接头。
在一些实施方案中，亲和标签是氨基标签。在一些实施方案中，原酸酯充当氨基标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)通过接头L连接至胺并且连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，活化的酯例如N-羟基琥珀酰亚胺连接至固相或包埋在凝胶中并且用于捕获寡核苷酸-原酸酯连接的氨基-缀合物。
在一些实施方案中，亲和标签是酰肼或羟基胺标签。在一些实施方案中，原酸酯充当酰肼或羟基胺标签与寡核苷酸之间的接头。换句话说，原酸酯(即原酸酯接头)通过接头L连接至酰肼或羟基胺并且连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，含有醛或酮的化合物连接至固相或包埋在凝胶中并且用于捕获寡核苷酸-原酸酯连接的酰肼或羟基胺-缀合物。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含磷保护基，由此寡核苷酸的磷部分连接至磷保护基。在一些实施方案中，磷部分是磷酸酯、亚磷酰胺或H-磷酸酯基团。在一些实施方案中，磷保护基是甲基或氰乙基基团(例如，β-氰乙基基团)。例如，可以使用硫酚或2-氨基甲酰基-2-氰基亚乙基-1,1-二硫醇钠除去甲基基团。例如，可以使用非亲核或受阻胺例如二乙胺、叔丁胺或1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯(DBU)除去氰乙基基团。在一些实施方案中，方法包括在使寡核苷酸与原酸酯接头反应前，使寡核苷酸的磷保护基脱保护。在一些实施方案中，方法包括在使寡核苷酸与原酸酯接头反应后，使核碱基保护基脱保护和任选地使磷保护基脱保护。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含核碱基保护基。寡核苷酸中的任何核碱基可包含核碱基保护基。在一些实施方案中，核碱基保护基是乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基等。例如，保护的核碱基可以是N6-苯甲酰基-A、N6-异丁酰基-A、N4-乙酰基-C、N4-异丁酰基-C或N2-异丁酰基-G。在一些实施方案中，核碱基保护基通过使寡核苷酸与多胺接触来除去。在一些实施方案中，核碱基保护基通过使寡核苷酸与二胺(例如1,2-二氨基乙烷)接触来除去。在一些实施方案中，在室温使寡核苷酸暴露于1,2-二氨基乙烷2小时导致核碱基的脱保护。在一些实施方案中，核碱基保护基是苯氧基乙酰基、叔丁基苯氧基乙酰基、二甲基甲脒、二甲基乙脒等。在一些实施方案中，在寡核苷酸与原酸酯接头反应前，除去核碱基保护基。
在一些实施方案中，在寡核苷酸与原酸酯接头反应后，除去核碱基保护基。
在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯-接头缀合物从固相支持体的裂解和核碱基保护基和任选地磷保护基的脱保护同时和/或在相同反应中进行。
在一些实施方案中，寡核苷酸是包含2’-羟基保护基的寡核糖核苷酸(RNA)。在一些实施方案中，2’-羟基保护基是硫羰氨基甲酸酯(TC)保护基。在一些实施方案中，2’-羟基保护基是双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)保护基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)保护基、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)保护基、新戊酰氧基甲基(PivOM)保护基或2-氰基乙氧基甲基(CEM)保护基。
在一些实施方案中，寡核苷酸的合成在固相(例如，CPG)上进行，所述固相包含3’-末端核苷酸，3’-末端核苷酸通过碱不稳定的接头(例如琥珀酸酯接头或通用支持体接头(例如Glen Research UnySupport)或UnyLinker)连接至固相。合成循环包括5’-OH保护基(例如，三苯甲基或DMT)的脱保护，在活化剂存在下亚磷酰胺的偶联，未反应的羟基通过碱不稳定的保护基(例如乙酰基保护基)的封端，和次磷酸三酯键(phoshitetriesterlinkage)至磷酸三酯键的氧化。
在固相支持体上合成新合成的寡核苷酸、DNA、RNA或修饰的寡核苷酸。通过在去封闭步骤中除去最终的保护基来制备所得全长产物以连接包含亲和标签的原酸酯接头。保护基可以是文献中众所周知的各种基团；最典型的是DMT、Pixyl或BZH。寡核苷酸的合成可发生在其中最终保护基从所得寡核苷酸的5’-羟基除去的3’至5’方向上，或合成可发生在其中最终保护基从所得寡核苷酸的3’-羟基除去的5’至3’方向上。此时，磷保护基可以任选地从新合成的寡核苷酸除去。包含亲和标签的原酸酯接头与全长产物的羟基反应，仅全长产物作为截短的序列的羟基在合成期间通过例如乙酸酯保护基封端，并且因此不能与原酸酯接头反应。最终的去封闭步骤中释放出羟基，该步骤可以使用弱酸作为反式原酸酯交换催化剂来进行。典型地在室温或较高温度、至多95℃在高介电常数溶剂(例如，乙腈、DMF、二噁烷、THF、碳酸亚丙酯等)进行原酸酯接头与全长寡核苷酸的缀合，并且以约0.001M至约0.1M、优选以约0.02M的浓度向反应中加入酸溶液(在无水溶剂例如乙腈中的酸)(例如，全氟庚酸或七氟丁酸、三氯乙酸、二氯乙酸、2-二氯丙酸、2,3-二氯丙酸、2,6-双(三氟甲基)苯甲酸、2-(三氟甲基)苯甲酸、4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-十三氟壬酸和4,4,5,5,6,6,6-七氟己酸)，取决于原酸酯接头的反应性，反应进行约15分钟至约12小时。
现可以用各种碱性胺(氨、氢氧化铵、甲胺、乙二胺等)处理所得原酸酯接头-寡核苷酸缀合物和未标签的截短的寡核苷酸，以任选地除去各种保护基、核碱基保护基以及如果存在的对碱基不稳定的2’-羟基保护基如TC或PivOM，并且可能裂解接头，典型的是将寡核苷酸连接到固相支持体上的琥珀酸酯接头或UnyLinker。
全长寡核苷酸-原酸酯接头缀合物和未标签的截短的序列(粗制样品)从固相支持体以缓冲液、典型地包含0.2M磷酸钠、0.6M氯化钠(pH为7.4)和10％的二甲基甲酰胺的缓冲液(加样缓冲液)进行洗脱。
释放的粗制寡核苷酸然后可利用色谱分离或固相萃取(例如，柱体)借助于亲和对进行纯化。包含连接至亲和标签的全长寡核苷酸-原酸酯接头缀合物的粗制寡核苷酸样品和未标签的截短的序列通过加样缓冲液加载到填充有包含捕获部分的树脂或珠或聚合物质的柱或柱体上。连接至全长寡核苷酸-原酸酯接头缀合物的亲和标签通过亲和力或共价地结合至包埋在树脂或珠中的捕获部分并且保留在树脂或珠上，同时将未标签的截短的序列从柱或柱体中通过洗涤缓冲液、通常是0.01M磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)洗脱出。
原酸酯接头然后可从全长寡核苷酸缀合物通过如下进行裂解：向柱或柱体中加入弱酸溶液(裂解缓冲液)例如3.0M的乙酸钠缓冲液(pH为5.5)，并且在室温使其静置30分钟至3小时。如果使用具有非碱不稳定的2’-羟基保护基的单体来合成寡核苷酸，例如ACE、CEM、TBDMS或TOM等，则那些非碱不稳定的2’-羟基保护基(例如，TBDMS、TOM或CEM)的脱保护可以在原酸酯接头从全长寡核苷酸裂解前(如果亲和捕获物质抗化学脱保护处理)或在原酸酯接头从全长寡核苷酸裂解后通过氟离子进行。或者，如果使用酸不稳定的2’-羟基保护基例如ACE，则这些基团的脱保护可在原酸酯接头从全长寡核苷酸裂解的过程中进行。裂解原酸酯接头后，使用洗涤缓冲液从柱中除去裂解缓冲液，直到洗脱液的pH恢复至约7。使用在DNase/RNase-Free水中的10％乙腈从树脂或珠中洗脱吸附的纯化的全长寡核苷酸。
在一些实施方案中，原酸酯接头缀合在合成柱上在酸的存在下进行。原酸酯-寡核苷酸缀合后，进行寡核苷酸-原酸酯缀合物从合成固相(例如，CPG)的裂解，以及对寡核苷酸脱保护各种保护基(当合成RNA时的磷保护基、核碱基保护基和2’O-羟基保护基)。
取决于用于合成寡核苷酸的化学组成(即单体组成)，在室温或较高温度用碱或碱性试剂(例如1,2-二氨基乙烷、氨、氢氧化铵等)进行保护基的脱保护。在一些实施方案中，寡核苷酸的合成是在包含3’-末端核苷酸的固相上完成的，该3’-末端核苷酸由非碱不稳定的可裂解接头(例如，光可裂解接头)连接。在该实施方案中，用非碱不稳定试剂(例如，Unicap)完成对正在生长的寡核苷酸上未反应的5’-羟基的封端，该试剂在脱保护后在截短的寡核苷酸序列留下磷酸酯基团而不是游离羟基。在这种实施方案中，用胺碱对磷和核苷酸保护基进行脱保护，得到仍然连接至固相上的脱保护寡核苷酸，但是只有5’-末端可用于与原酸酯接头缀合。原酸酯接头与仍然连接至固相但是核苷酸和磷脱保护的寡核苷酸之间的缀合后，寡核苷酸可从固相裂解并且进行亲和纯化以分离所需全长原酸酯-寡核苷酸缀合物。最后，原酸酯接头在弱酸溶液(pH＝5-6)中从纯化的全长寡核苷酸裂解并且从亲和分离介质洗脱。
2’-羟基保护基可利用任何适宜条件来除去。在一些实施方案中通过使寡核糖核苷酸与二胺例如1,2-二氨基乙烷接触，从2’-羟基除去TC或PivOM保护基。在一些实施方案中，通过使寡核糖核苷酸与氨或烷基胺接触，从寡核糖核苷酸除去PivOM保护基。在一些实施方案中，寡核糖核苷酸与二胺、氨或烷基胺接触导致同时使2’-羟基脱保护和寡核糖核苷酸从固相支持体裂解。在一些实施方案中，通过寡核糖核苷酸与酸接触来除去ACE保护基。在一些实施方案中，同时除去ACE保护基和原酸酯接头。在一些实施方案中，2’-羟基保护基是TBDMS或TOM保护基并且通过使寡核糖核苷酸与包含氟化物的组合物接触来除去。可以在分离寡聚核糖核苷酸-原酸酯接头缀合物并且在裂解原酸酯接头前、在裂解原酸酯接头的同时或在裂解原酸酯接头后，除去TBDMS或TOM保护基。
在一些实施方案中，在分离寡聚核糖核苷酸-原酸酯接头缀合物前，除去2’-羟基保护基。在一些实施方案中，在分离寡聚核糖核苷酸-原酸酯接头缀合物后，除去2’-羟基保护基。在一些实施方案中，寡核苷酸用1,2-二氨基乙烷处理，导致同时从寡核苷酸除去保护基和寡聚核糖核苷酸-原酸酯接头缀合物从固相支持体裂解。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含磷保护基或核碱基保护基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含磷保护基和核碱基保护基。在一些实施方案中，寡核苷酸是包含磷保护基、核碱基保护基和2’-羟基保护基的RNA。
在一些实施方案中，寡核苷酸用1,2-二氨基乙烷处理，由此同时从寡核苷酸除去2’-OH保护基(例如，TC或PivOM)和从合成固相支持体裂解寡聚核糖核苷酸-原酸酯接头缀合物。
在一些实施方案中，原酸酯接头(Ia)的R’、R”和R’”基团中的两个通过碳-碳键连接在一起并且形成5、6或7元环的环状原酸酯，如化合物式(I)所示。
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基、取代的C1-C24烷基、取代的C2-C24烯基、取代的C2-C24炔基或取代的芳基，并且R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少之一不是H；X是H、甲基或吸电子基；n是0、1或2，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签；优选地，R7、R8和R9是H。
当n是2时，原酸酯接头部分形成7元环的环状原酸酯，如以下结构所示，并且在另外的碳上具有两个另外的R基团R’5和R’6，其各自独立地定义为R1至R6基团的任一个：
在一些实施方案中，在式(I)原酸酯接头中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基或任何取代的等同物或其组合，条件是碳的总数不超过24；R8和R9是H；X是H、甲基或吸电子基；n是0、1或2，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签。
在一些实施方案中，在式(I)原酸酯接头中，R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一是氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基、氟代碳环基、氟代杂烷基、氟代杂烯基、氟代杂炔基或氟代杂环基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是以下式(Id)化合物：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少之一是C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基、任何取代的等同物或其任何组合，条件是碳的总数不超过24，剩余的R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代或杂取代的等同物、C3-C12碳环基或杂环基和取代的等同物，条件是R1至R7基团中的两个R基团不与如下所示的环状原酸酯形成稠环：
其中X是F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基；n是0或1，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签。
式(Id)原酸酯接头包括如下化合物，其中n是0，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少两个各自独立地是C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基或任何取代的等同物，R1、R2、R3、R4、R5和R6中所有剩余的R基团是H，条件是不为H的两个R基团不与所述环状原酸酯一起连接以形成稠环。
式(Id)原酸酯接头包括如下化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6中之一是氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基或氟代芳基。
在式(Id)原酸酯接头中，亲和标签可以是cLogP值是至少3的氟标签或疏水标签。
亲和标签(AfTg)可以是R基团(R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7)的化学结构的一部分或全部或其可以通过接头L连接至原酸酯，如下所示。
其中AfTg是亲和标签，L是共价键或是直链、支链、单环或多环、饱和、部分不饱和或不饱和C1-C12烃链，其任选地取代有F、Cl、Br、I或C1-C3烷基和任选地散杂有独立地选自O、S、N的杂原子，或散杂有独立地选自如下的基团：NRa-Rb、-NRa-CO-Rb、-CO-NRa-Rb、-CO-Ra，其中Ra、Rb各自独立地是H或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R5和R6是H。在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R5、R6、R7、R8和R9是H。优选地，n是0。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中之一是C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、取代的C1-C24烷基、取代的C2-C24烯基、取代的C2-C24炔基或取代的芳基，并且R1、R2、R3、R4、R5和R6中的所有其它是H；R7、R8和R9是H；X是H或吸电子基；n是0、1或2，R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少之一包含亲和标签。
在一些实施方案中，R1包含亲和标签。在一些实施方案中，R2包含亲和标签。在一些实施方案中，R3包含亲和标签。在一些实施方案中，R4包含亲和标签。在一些实施方案中，R5包含亲和标签。在一些实施方案中，R6包含亲和标签。在一些实施方案中，R7包含亲和标签。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少两个包含亲和标签。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少三个包含亲和标签。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少四个包含亲和标签。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少五个包含亲和标签。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5或R6各自包含亲和标签。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一是氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基、氟代杂烷基或氟代芳基。在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少之一是氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基或氟代芳基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6是包含一个或多个杂原子的C1-C24烷基。在一些实施方案中，杂原子是氧。在一些实施方案中，杂原子是氮。在一些实施方案中，杂原子是不同杂原子的组合。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R7是H。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R1、R2和R3是H，R4是C1-C24烷基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R1、R2、R3、R5、R6和R7是氢，R4是C1-C24烷基、C1-C24杂烷基或C6-C24芳基烷基和取代的等同物。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R8和R9是氢。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R8或R9中之一是甲基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R8或R9中之一是卤素。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中X是氢。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中X是卤代烷基。在一些实施方案中，卤代烷基是CF3、CF2H、CFH2,CCl3、CCl2H或CClH2。在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中X为CF3。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中X是Cl、F、SO3H、NO2、SO2 R10、CH2SO2R10、COR10、CH2COR10、NO2、CH2CN或羰基，其中R10是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、芳基、杂芳基或杂环基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中n是0。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6是取代基其中W是氟代烷基基团，m是1至12。在一些实施方案中，氟代烷基包含1至25个氟原子。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其在R1、R2、R3或R4处包含取代基其中W是卤代烷基基团，m是1至12。在一些实施方案中，取代基包含1-14个另外的氟原子。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其在R1、R2、R3、R4、R5或R6包含取代基其中m是0至6。在一些实施方案中，R5和R6是氢。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其在R1、R2、R3、R4、R5或R6处包含取代基在一些实施方案中，R5和R6是氢。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其在R1、R2、R3、R4、R5或R6处包含取代基其中m是0至6。在一些实施方案中，R5和R6是氢。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R1、R2、R3或R4、R5和R6是H，R3或R4是C1-C24氟烷基，其任选地包含一个或多个杂原子；X是CF3；n是0或1。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(I)化合物，其中R1、R2、R3或R4、R5和R6是H，R3或R4是C1-C24烷基，其任选地包含一个或多个杂原子；X是CF3；n是0或1。
在一些实施方案中，原酸酯接头是
其中R11是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、取代的C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、取代的C2-C24烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、取代的C2-C24炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基；R7是H或CH3。Z是CRaRb、O、S或NRa，其中Ra和Rb各自独立地是H或C1-C6烷基；Z’各自独立地选自O和S；X是H、CH3或吸电子基；n是0、1或2。在一些实施方案中，R11包含亲和标签。在一些实施方案中，R11是亲和标签。优选地，n是0。
在一些实施方案中，原酸酯接头是：
其中R11是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、取代的C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、取代的C2-C24烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、取代的C2-C24炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基；R7是H或CH3。Z是CRaRb、O、S或NRa，其中Ra和Rb各自独立地是H或C1-C6烷基。X是H、CH3或吸电子基；n是0、1或2。在一些实施方案中，R11包含亲和标签。优选地，n是0。
在一些实施方案中，原酸酯接头是：
其中R11是H、C1-C23烷基、C1-C23杂烷基、取代的C1-C23烷基、C2-C23烯基、C2-C23杂烯基、取代的C2-C23烯基、C2-C23炔基、C2-C23杂炔基、取代的C2-C23炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基；R7是H或CH3。Z是CRaRb、O、S、NRa、NRaCO、CONRa，其中Ra和Rb各自独立地是H、C1-C6烷基，或Ra和R11一起形成含N的杂环；X是F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基；n是0或1，R11包含亲和标签。
在一些实施方案中，原酸酯接头是：
其中R11和R12各自独立地是H、C1-C23烷基、C1-C23杂烷基、C1-C23取代的烷基、C2-C23烯基、C2-C23杂烯基、取代的C2-C23烯基、C2-C23炔基、C2-C23杂炔基、取代的C2-C23炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基，条件是R11和R12中的至少之一包含亲和标签；R7是H或CH3。Z各自独立地是CRaRb、O、S、NRaCO、CONRa或NRa，其中Ra和Rb各自独立地是H、C1-C6烷基，或Ra和R11或Ra和R12一起形成含N的杂环；X是F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基；n是0或1。
在一些实施方案中，原酸酯接头是：
其中R11是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、取代的C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、取代的C2-C24烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、取代的C2-C24炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基；X是吸电子基；n是0、1或2。在一些实施方案中，R11包含亲和标签。在一些实施方案中，R11是C1-C12烷基，其任选地取代有至少4个氟原子。在一些实施方案中，X是CF3、CF2H、CFH2、Br、Cl、F、SO3H、NO2、CN或羰基。在一些实施方案中，X是Br、Cl、F或单、双或三卤代甲基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是：
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其中R11和R12各自独立地是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、取代的C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、取代的C2-C24烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、取代的C2-C24炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基；R7为H或CH3。Z各自独立地为CRaRb、O、S或NRa，其中Ra和Rb各自独立地是H或C1-C6烷基，条件是R11和R12不一起形成环；Z’各自独立地选自O和S；X是Br，Cl，F，单、双、三卤代甲基；X1是乙烯基、乙炔基、苯基或任何取代的等同物；n是0、1或2。在一些实施方案中，X是CF3、CF2H、CFH2、Br、Cl、F、SO3H、NO2、CN或羰基。在一些实施方案中，R11和R11包含亲和标签或是亲和标签。优选地，n是0。
适宜的原酸酯接头包括具有以下结构之一的原酸酯接头：
在一些实施方案中，原酸酯接头是具有以下结构的氟原酸酯接头：
其中Z是CH2、O、S、NRa或NRaCO，其中Ra是H或C1-C6烷基；R7是H、甲基、乙基、正丙基、苯基或苄基；X是H、F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基或氰基-；m是0至12的整数；n是1或2。
在一些实施方案中，原酸酯接头是
其中R7是H、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、或杂环基；X是吸电子基；m和n各自独立地是1、2、3或4。
在另一种实施方案中，本发明提供式(II)原酸酯接头
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、取代的C1-C24烷基、取代的C2-C24烯基、取代的C2-C24炔基、取代的芳基、取代的杂芳基或取代的杂环基；Y是离去基团；n是0、1或2，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签。优选地，R7是H。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一是CF3-(CF2)q-(CR12R13)p-Z-(CR14R15)m，其中Z是O、S、SO2、NH、NHCO、CONH或CR16R17；(CR12R13)、(CR14R15)和(CR16R17)各自独立地是C1-C3亚烷基、卤代C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、卤代C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、卤代C2-C3亚炔基、CH2-CH2-O-或CH2-CH2-NH-；m是1或2；p是0、1或2；q是0至7的整数。
在一些实施方案中，离去基团Y是O-Y’并且源自式HO-Y’的醇。在一些实施方案中，Y’是C1-C8烷基。在一些实施方案中，Y’是取代的C1-C8烷基、优选卤代醇。在一些实施方案中，Y’是乙烯基、乙炔基、苯基或任何取代的等同物，其中一个或多个取代基是吸电子基EWG。在一些实施方案中，Y’是甲基、乙基或任何取代的等同物，其中取代基是卤素，氰基或硝基。在一些实施方案中，式HO-Y’的醇的pKa是约8至约15、优选约9至13。
在一些实施方案中，式HO-Y’的醇是甲醇、乙醇、2,2,2-三氟乙醇、2,2,2-三氯乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2-二氯乙醇、2-甲氧基乙醇、羟基乙醛、2-丙烯-1-醇、2-甲硅烷基乙醇、1-羟基-2-丙炔、2-氯乙醇、2-氟乙醇、3-丁烯醇、3-丁炔-1-醇、2-丁炔-1-醇、2,3-丁二烯-1-醇、1-氯-2-丙醇、1-氟-2-丙醇、2-氰基乙醇、2-(甲硫基)乙烷-1-醇、2-丁烯-1-醇、2-氯-1-丙醇、2-乙氧基乙醇、2-氯-1-丙醇、1-羟基-2-丙酮、2,2-二氟乙醇、3-氟-1-丙醇、2-甲基-3-丁炔-1-醇、2,2-二氯乙醇、4-戊烯-2-醇、3-氯-1-丙醇、4-戊炔-2-醇、2-氟-1-丙醇、2-亚甲基-1-丁醇、2-甲基-3-丁烯-1-醇、1-氯-1-丙醇、1-环丙烯-1-甲醇、2-氟-1-丙醇、2-环丙烯-1-甲醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、1,4-戊二烯-3-醇、1-戊烯-4-炔-3-醇、3,4-戊二烯-2-醇、2-甲基-2,3-丁二烯-1-醇、3-戊炔-2-醇、2-甲基-2-丁烯-1-醇、4-甲基-1-戊烯-3-醇、4-戊炔-1-醇、3,4-戊二烯-1-醇、2-戊炔-1-醇、3-甲基-2-亚甲基-1-丁醇、3-羟基-2-甲基-丙醛、3-甲基-2-丁烯-2-醇、3-羟基-丁醛、2-环丙烯-1-醇、3-羟基丁醛、1-甲氧基-2-丙醇、2-(1-甲基乙氧基)-乙醇、4-甲氧基-1-丁醇、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙醇、α-甲基-环丙烷甲醇、3-甲基-4-戊烯-2-醇、3-甲氧基-1-丙醇、2-甲基-1-戊烯-3-醇、1-乙氧基乙醇、3-戊炔-1-醇、3-戊炔-1-醇、2-戊烯-1-醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁醛、2-羟基丁醛、2-戊烯-3-醇、2,3-二甲基-3-丁烯-1-醇、3-羟基-2-甲基丙腈、3-亚甲基-2-戊醇、2-乙基-3-丁烯-1-醇、3,4-二甲基-2-戊醇、2-氯-2-丙醇、1-(甲基二氧基)-乙醇、2-乙基-3-丁炔-1-醇、苯甲醇、2-(乙硫基)-乙醇、3-乙氧基-1-丙醇、1-氯-3-氟-2-丙醇、1,3-二氟-2-丙醇、2-3-羟基-丁酮、2-甲基-1-己醇、2-(乙烯氧基)-乙醇、2,2-二甲基-3-丁烯-1-醇、4-甲基-4-戊烯-2-醇、2-丙氧基-乙醇、3-羟基丁腈、2-氟-2-丙烯-1-醇、2,4-二甲基-1-戊醇、1-甲氧基-1-丙醇、2,3-二甲基-2-丁烯-1-醇、3-氯-2-丙烯-1-醇、3-戊烯-1-醇、2,4-戊二炔-1-醇、2,2-二甲基-3-丁炔-1-醇、2-乙基-2,3-丁二烯-1-醇、3-氯-2-丙炔-1-醇、1,1-二氟-2-丙醇、1,5-己二炔-3-醇、2,3-己二烯-1-醇、2-戊烯-2-醇、1-甲氧基-1,2-乙二醇、2-亚甲基-3-丁炔-1-醇、2-(氯甲氧基)-乙醇、α-甲基-1-环丙烯-1-甲醇、2-羟基丁硫醇、1-氯-2-甲基-1-丙醇、3-(甲硫基)-1-丙醇、1-己炔-3-醇、3-氯-2-丁醇、1,5-己二烯-3-醇、5-己炔-1-醇、1-氯-2-丁醇、1-甲基-环丙烷甲醇、4-戊烯-2-炔-1-醇、5-羟基戊醛、4-甲基-3-戊烯-2-醇、1-己烯-3-醇、1-羟基-2-丁酮、3,4-己二烯-1-醇、3-氯-2-甲基-1-丙醇、2-甲氧基-1-丁醇、2-乙氧基-1-丙醇、5-己炔-3-醇、3-甲氧基-2-丁醇、2-甲基-1,4-戊二烯-3-醇、2-甲基-1-戊烯-4-炔-3-醇、4,5-己二烯-3-醇、2-(甲硫基)-1-丙醇、2,5-己二炔-1-醇、2-(羟甲基)-丁醛、3-氟-2-丁醇、2-(羟甲基)-2-丙醛、2-乙烯基-3-丁烯-1-醇、1-(乙硫基)-乙醇、2-环丁烯-1-甲醇、2-羟基-3-丁烯醛、2-(1-甲基乙基)-3-丁烯-1-醇、1-环丙烯-1-乙醇、1-氟-2-丁醇、3-氟-2-甲基-1-丙醇、1-(1-甲基乙氧基)-乙醇、3-羟基-1-丁烯-1-酮、3-己炔-2-醇、4-乙氧基-1-丁醇、4-氟-1-丁醇、5-己烯-2-醇、2-己炔-1-醇、4-氯-1-丁醇，3-己炔-1-醇、1-乙氧基-2-丙醇、4-氯-2-丁醇、4-甲基-2,3-戊二烯-1-醇、2,4-戊二烯-1-醇、3-丙氧基-1-丙醇、2-亚甲基-1-戊醇、2,4-戊二烯-1-醇、2-戊烯-4-炔-1-醇、2-甲基-4-戊烯-1-醇、1-(甲硫基)-2-丙醇、4-甲基-2-戊炔-1-醇、3-羟基-2,2-二甲基-丙腈、4-(甲硫基)-1-丁醇、2-氯-1-丁醇、4,4-二甲基-1-戊炔-3-醇、4,5-己二烯-1-醇、3-甲基-4-戊烯-1-醇、3-亚甲基-1-戊醇、2,4-己二炔-1-醇、2-(2-羟基乙氧基)-乙醛、4,5-己二烯-2-醇、3-甲基-2-亚甲基-3-丁烯-1-醇、2-甲基-3,4-戊二烯-1-醇，2-亚环丙基-乙醇、4-羟基-3-甲基-丁醛、4-3-亚甲基-戊烯-2-醇、2,3-庚二烯-1-醇、2,5-庚二炔-1-醇、3-甲基-4-戊炔-1-醇、2-甲基-4-戊炔-1-醇、1-环丁烯-1-甲醇、2-氟-1-丁醇、3,4-庚二烯-1-醇、4-氟-2-丁醇、2-(1-甲基乙基)-2,3-丁二烯-1-醇、4-甲基-3-亚甲基-2-戊醇、3-羟基-2-甲基-丁腈、1-1-甲氧基-2-甲基-丙醇、3-乙基-3,4-戊二烯-2-醇、1-甲基-2-环丙烯-1-甲醇、3-己烯-1-醇、2-氯-2-甲基-1-丙醇、4-羟基-丁腈、2-硫杂环丙烷甲醇、3-氯-1-丁醇、2-己烯-1-醇、3-甲氧基-1-丁醇、5-己烯-2-炔-1-醇、2-(乙烯基硫基)-乙醇、2-氟-2-甲基-1-丙醇、4-甲基-2-戊烯-1-醇、3-庚炔-1-醇、3-(乙硫基)-1-丙醇、2-[((1-甲基乙基))硫基]-乙醇、4-甲氧基-2-丁醇、4-己炔-2-醇、1-甲氧基-2-丁醇、3,3-二氟-1-丙醇、3-氟-1-丁醇、2-氯-1-甲氧基-乙醇、2,3,5-己三烯-1-醇、2-(羟甲基)-丁腈、2,4,6-庚三炔-1-醇、1-氟-3-甲基-2-丁醇、2-环丁烯-1-醇、2-丁氧基-乙醇、2-氯-2,2-二氟-乙醇、2-环氧乙烷甲醇、1-氯-3-丁烯-2-醇、1-丙氧基-2-丙醇、3-庚烯-1-醇、2-丙氧基-1-丙醇、2-(丙硫基)-乙醇或3-环戊烯-1-甲醇。
在一些实施方案中，原酸酯接头是化合物式(II)，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6是包含一个或多个杂原子的C1-C24烷基。在一些实施方案中，杂原子是氧。在一些实施方案中，杂原子是N。在一些实施方案中，杂原子是不同杂原子的组合。
在一些实施方案中，原酸酯接头是化合物式(II)，其中R7是H。
在一些实施方案中，原酸酯接头是化合物式(II)，其中R1、R2、R3或R4、R5、R6和R7中之一是H，R3或R4中的另一个是C1-C24烷基或C1-C24杂烷基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(II)化合物，其中R1、R2、R3和R7是氢，R4是C1-C24烷基或C1-C24杂烷基。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(II)化合物，其中n是0。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(II)化合物，其中R1、R2和R3是H，R4是C1-C24烷基或C1-C24杂烷基；n是0或1。
在一些实施方案中，本发明提供式(III)原酸酯接头
其中X1和X2各自独立地是H或吸电子基；m是1或2；n是4至12的整数。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(III)化合物，其中X1或X2是H、CH3或CF3。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(III)化合物，其中X1和X2是H、CH3或CF3。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(III)化合物，其中X1和X2是CF3。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(III)化合物，其中m是1。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(III)化合物，其中n是6至12的整数。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(III)化合物，其中n是8至12的整数。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(IIIa)化合物
其中X1是H、F、保护的氨基、保护的羧酸、C2烯基基团或取代的C2烯基、C2炔基或取代的C2炔基；R18和R19各自独立地是H、F、C1-3杂烷基或取代的C1-3烷基；X2是H、CH3或CF3；n是1或2；m为0至12的整数。
在一些实施方案中，原酸酯接头是式(IIIa)化合物，其中X1是H、F、叠氮基、保护的巯基、保护的聚巯基、聚组氨酸、保护的氨基、保护的酰肼基、保护的羟基胺基团、环辛炔、共轭二烯、C2烯基、取代的C2烯基、C2炔基或取代的C2炔基；R18和R19各自独立地是H、F、C1-3杂烷基或取代的C1-3烷基；X2是H、CH3、F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基或氰基-；n是1或2；m为0至12的整数。
在一些实施方案中，原酸酯接头是
本发明的原酸酯接头可使用任何适宜的方法制备。在一些实施方案中，原酸酯接头通过在酸存在下使1,2-二醇、1,3-二醇或1,4-二醇与醇反应形成。在一些实施方案中，酸以亚化学计量的量使用。在一些实施方案中，酸是布朗斯台德酸。在一些实施方案中，酸是路易斯酸。在某些实施方案中，酸是稀无机酸(例如，以浓度为约0.2M或更少)。在一些实施方案中，醇的沸点是约30℃至约120℃。因此，在一些实施方案中，醇的沸点是约30℃至约120℃、约30℃至约110℃、约30℃至约100℃、约30℃至约95℃、约30℃至约90℃、约30℃至约85℃、约30℃至约80℃、约30℃至约75℃、约30℃至约70℃、约30℃至约65℃、约30℃至约60℃、约30℃至约55℃、约30℃至约50℃、约35℃至约120℃、约40℃至约120℃、约45℃至约120℃、约50℃至约120℃、约55℃至约120℃、约60℃至约120℃、约40℃至约100℃、约50℃至约100℃、约40℃至约90℃或约40℃至约80℃。
在另一种实施方案中，本发明提供包含式(IV)部分的寡核苷酸(即，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物)
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、取代的C1-C24烷基、取代的C2-C24烯基、取代的C2-C24炔基、取代的芳基、取代的杂芳基或取代的杂环基；n为0、1或2，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签。优选地，R7是H。
当n是2时，原酸酯接头部分形成7元环的环状原酸酯，如以下结构所示，并且在另外的碳上具有两个另外的R基团R’5和R’6，其各自独立地定义为R1至R6基团中的任一个：
在式(IV)的部分中，连接到弯曲线的氧是寡核苷酸的5’末端或3’末端的氧。
在式(IV)的部分中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少之一可以是C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基、任何取代的等同物或其组合，剩余的R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7可以是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6-C12芳烷基、碳环基、杂环基、任何取代的等同物或其组合；n为0、1或2，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签；条件是所述部分不是
在这些寡核苷酸原酸酯接头缀合物的一些中，n＝0，亲和标签是cLogP值是至少3的氟标签或疏水标签。
这些寡核苷酸原酸酯接头缀合物包括其中寡核苷酸包含寡核糖核酸(RNA)的那些。
在寡核苷酸原酸酯接头缀合物中，R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少之一可以是氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基、氟代芳基、氟代杂烷基、氟代杂烯基、氟代杂炔基或氟代杂环基。
在寡核苷酸原酸酯接头缀合物中，R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少之一可以是氟标签，剩余的R基团(包括R7)可以是H。
在寡核苷酸原酸酯接头缀合物中，R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少两个可以是氟标签。
在寡核苷酸原酸酯接头缀合物中，式(IV)部分可以选自：
其中R11和R12各自独立地为H、C1-C23烷基、C1-C23杂烷基、取代的C1-C23烷基、C2-C23烯基、C2-C23杂烯基、取代的C2-C23烯基、C2-C23炔基、C2-C23杂炔基、取代的C2-C23炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基或取代的杂环基，条件是中的至少之一R11和R12包含亲和标签；R7为H、甲基、乙基、正丙基、苯基或苄基；Z各自独立地为CRaRb、O、S或NRa，其中Ra和Rb各自独立地是H、C1-C6烷基，或Ra和R11或Ra和R12一起形成含N的杂环；n是0、1或2。
式(IV)部分可以具有以下结构：
其中X1是H、F、叠氮基、保护的巯基、保护的聚巯基、聚组氨酸、保护的氨基、保护的酰肼基、保护的羟基胺基团、马来酰亚胺、环辛炔、共轭二烯、C2烯基、取代的C2烯基、C2炔基或取代的C2炔基；R18和R19各自独立地是H、F、C1-3杂烷基或取代的C1-3烷基；n是1或2；m是0至12的整数。
式(IV)部分可以选自：
在一些实施方案中，寡核苷酸在5’-位连接至原酸酯接头。在一些实施方案中，寡核苷酸在3’-位连接至原酸酯接头。
在一些实施方案中，寡核苷酸是核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，寡核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少75个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少100个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少125个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸是至少150个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，所述包含式(IV)部分的寡核苷酸，其中R1、R2、R3或R4是包含杂原子的C1-C24烷基。在一些实施方案中，杂原子是氧。
在一些实施方案中，n是0。
在一些实施方案中，R5是H。
在一些实施方案中，R6是H。
在一些实施方案中，R1、R2和R3是氢，R4是C6-C24芳基烷基或取代的等同物，
在一些实施方案中，R1、R2和R3是H，R4是C1-C24烷基或取代的烷基。
在一些实施方案中，R1、R2和R3是H，R4是C1-C24烷基，其任选地包含一个或多个杂原子；n是0或1。
在一些实施方案中，R1是C4-C24烷基或杂烷基并且包含至少9个氟原子。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下部分
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、取代的C1-C24烷基、取代的C2-C24烯基、取代的C2-C24炔基、取代的芳基、取代的杂芳基或取代的杂环基；X为H、F、羟基、保护的羟基、烷氧基、或烷氧基烷基；n是0、1或2；B是核苷碱，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下部分
其中R是H、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、或杂环基；X是H、F、羟基、保护的羟基、烷氧基、或烷氧基烷基；m和n各自独立地是0、1或2；B是核苷碱。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如下部分
其中R是H、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、或杂环基；X是H、F、羟基、保护的羟基、烷氧基或烷氧基烷基；B是核苷碱。
在另一种实施方案中，本申请提供合成包含式(IV)部分的寡核苷酸(即，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物)的方法
方法包含使寡核苷酸与原酸酯接头接触以形成包含式(IV)部分的寡核苷酸，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是H、C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、卤素、芳基、杂芳基、杂环基、取代的C1-C24烷基、取代的C2-C24烯基、取代的C2-C24炔基、取代的芳基、取代的杂芳基或取代的杂环基；n是0、1或2，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签。
在一些实施方案中，寡核苷酸在酸存在下与原酸酯接头反应。在一些实施方案中，反应是酸催化的交换反应。在一些实施方案中，酸是布朗斯台德酸。在一些实施方案中，酸是路易斯酸。在一些实施方案中，酸是无机酸，例如盐酸、硫酸或硝酸。在一些实施方案中，寡核苷酸在酸浓度为约0.2M或更少的无机酸存在下与原酸酯反应。在一些实施方案中，酸是有机酸，例如乙酸或其衍生物，例如二或三氯乙酸、甲酸、苯甲酸、甲苯磺酸和三氟甲磺酸。在一些实施方案中，酸是乙酸钠(pH＝5.5)、BF3·Et2O、SiO2、蒙脱石-K10、蒙脱石-KSF或Amberlyst-15。
在一些实施方案中，在通过酸催化的反应的偶联后，原酸酯接头与最终的核苷酸合成单体上通过去封闭步骤释放的羟基反应，如以下说明性实例所示。
在一些实施方案中，原酸酯接头存在于单体合成单体的封闭基团之一中，并且唯一的单体合成单体用于最终的偶联步骤中，如以下说明性实例所示。
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在某些实施方案中，在接头已连接至寡核苷酸后，亲和标签连接至原酸酯接头，如以下实例所示。由以下R基团所示的亲和标签在脱保护和从固相支持体裂解前连接至寡核苷酸，或其可在脱保护和从固相支持体裂解后连接至原酸酯接头。R基团可以是任何亲和标签。在一些实施方案中，R基团是亲和标签，其选自氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基和氟代芳基取代基。在一些实施方案中，R基团可利用如下而连接至原酸酯接头：烯烃易位反应、环加成反应(例如，狄尔斯-阿尔德反应、4+1环加成、3+2环加成、降冰片烯环加成、环氧乙烷降冰片烯(oxanorbornadiene)环加成)、点击化学(例如，四唑光点击化学、铜催化的点击化学、应变促进的点击化学)、苏楚基(Suzuki)交叉偶联、施陶丁格(Staudinger)连接、迈克尔加成、四环庚烷连接、四嗪连接或氧化偶联。可以采用本领域众所周知的其它缀合方案来将亲和标签连接至原酸酯接头部分。这些缀合的非限制性实例包括胺末端的部分与N-羟基琥珀酰胺(NHS)部分或其它活化酯的反应、硫醇末端的部分与包含α-卤代羰基的部分的反应等。
在某些实施方案中，原酸酯接头含有阻止与保护基反应的化学部分(例如，硫醇、胺、醇等)。连接原酸酯接头后，可以除去保护基，并且化学部分可以与另一种化学部分在固相上共价地并且特异性地反应。
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寡核苷酸可以利用任何适宜方法脱保护以除去原酸酯保护基。在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物使用酸进行脱保护。在一些实施方案中，酸以催化量(即，亚化学计量的量)进行。在一些实施方案中，酸是布朗斯台德酸。在一些实施方案中，酸是路易斯酸。在一些实施方案中，酸是无机酸，例如盐酸、硫酸或硝酸。在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物在酸浓度为约0.2M或更少的无机酸存在下进行脱保护。在一些实施方案中，酸是有机酸，例如乙酸、甲酸、苯甲酸、甲苯磺酸和三氟甲磺酸。在一些实施方案中，酸是BF3·Et2O、SiO2、蒙脱石K10、蒙脱石-KSF或Amberlyst-15。
在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物在弱酸性条件下进行脱保护。在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物在约3或更大的pH进行脱保护。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物在如下pH进行脱保护：约3或更大、约3.5或更大、约4或更大、约4.5或更大、约5或更大、约5.5或更大、约6或更大、约6.5或更大或约7或更大。在一些实施方案中，寡核苷酸在约3至约7的pH进行脱保护。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸在如下pH进行脱保护：约3至约7、约3.5至约7、约4至约7、约4.5至约7、约5至约7、约5.5至约7、约6至约7、约3至约6.5、约3至约6、约3至约5或约4至约6。
在一些实施方案中，在除去原酸酯后，寡核苷酸产物的纯度是至少约60％。因此，在一些实施方案中，在除去原酸酯后，寡核苷酸产物的纯度是至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、至少约99.9％、至少约99.95％或至少约99.99％。在一些实施方案中，寡核苷酸产物包含一种或多种杂质的量是约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少、约0.5％或更少、约0.1％或更少、约0.05％或更少或约0.01％或更少。
本申请的寡核苷酸可以使用任何适宜的色谱法纯化。在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物使用氟亲和色谱纯化。在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物使用柱色谱纯化。在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物使用液相色谱(例如高压液相色谱)纯化。
在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物使用氟亲和色谱法纯化。氟亲和色谱法利用亲氟性的观念，其中氟化物倾向于对其它氟化物具有亲和力。在一些实施方案中，寡核苷酸连接至包含氟标签的原酸酯。寡核苷酸-原酸酯接头缀合物穿过氟柱。氟柱通常包含与氟化有机基团结合的聚合物树脂。在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物牢固地结合在柱上，同时未标签的杂质(例如，截短或失败的序列)不与柱相互作用并且穿过柱。由于与氟柱的亲氟相互作用的强度，后续的洗涤不从柱中释放氟化的寡核苷酸。从柱中除去所有杂质后，通过从原酸酯保护基中裂解寡核苷酸而从柱中释放寡核苷酸-原酸酯接头缀合物。寡核苷酸通常在弱酸性条件下裂解，其破坏寡核苷酸与氟柱之间的相互作用。然后使用适当的溶剂从柱中洗脱寡核苷酸，得到纯化的寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物使用高效液相色谱(HPLC)纯化。在一些实施方案中，寡核苷酸连接至原酸酯接头并且引入HPLC系统中用于纯化。原酸酯寡核苷酸-原酸酯接头缀合物通常作为包含至少一种杂质的混合物引入HPLC中。在一些实施方案中，本发明的方法使得寡核苷酸产物与类似大小的杂质分离。至少一种杂质可以是任何种类。在一些实施方案中，至少一种杂质是寡核苷酸合成期间产生的截短或失败序列。在一些实施方案中，原酸酯寡核苷酸-原酸酯接头缀合物使用反相HPLC纯化。在这种实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物在反相柱(例如，C5或C18烃柱)上纯化。在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物在正相HPLC柱上纯化。在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物从HPLC系统收集并且脱保护以取得所需寡核苷酸。HPLC系统可包括注射器、泵、HPLC柱和检测器。在一些实施方案中，检测器是吸光度检测器(例如，UV/VIS或PDA)、折射率检测器、散射检测器(例如，蒸发或多角度)、质谱仪、电导率检测器、荧光检测器、化学发光检测器、旋光检测器或电化学检测器。在一些实施方案中，HPLC系统是三重四极杆LC-MS、轨道阱LC-MS、离子阱LC-MS或TOF LC-MS。在一些实施方案中，纯化方法是部分或完全自动的。
在一些实施方案中，寡核苷酸-原酸酯接头缀合物使用包含与寡核苷酸-原酸酯接头缀合物上的亲和部分结合的化合物的柱体进行纯化。
在一些实施方案中，在多重合成平台上合成寡核苷酸，在多重纯化平台上并行进行寡核苷酸的分离。
在一些实施方案中，双重合成或纯化平台使得与4、12、48、96、192或384个寡核苷酸的合成并行进行纯化。
本发明的一些化合物可以含有不对称中心，因此可以外消旋体和消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单个非对映异构体的形式存在。取决于分子上各种取代基的性质，可以存在另外的不对称中心。这种不对称中心各自将独立地产生两种光学异构体，并且意图是所有可能的光学异构体和非对映异构体的混合物以及纯的或部分纯化的化合物都包括在本发明的范围内。本发明旨在使得理解这些化合物的所有这种异构形式。
参考图1，它是在固相支持体上典型化学合成寡核苷酸的示意图。典型的所需寡核苷酸产物包含在相邻核苷酸的5'-羟基和3'-羟基之间的核苷酸间键。为了完成合成，合成循环的第一步通常是保护的单体与连接至表面的核苷的反应或保护的单体与表面上的羟基的反应。表面上的羟基可以是可裂解的通用接头的一部分，也可以是不可裂解的表面连接的一部分。在将反应性磷基团与表面上的羟基进行初始偶联后，随后的步骤通常包括将未反应的羟基封端，然后将反应性磷中间体氧化。在使用某些修饰磷基团的某些条件下，可以需要在封端前进行氧化，特别是在氧化剂产生修饰磷基团例如硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或氨基磷酸酯的情况下。最终的步骤通常是将偶联至下一个保护的核苷酸单体的羟基去封闭。该最后步骤中除去的保护基通常是二甲氧基三苯甲基(DMT)。然而，许多其它保护基在本领域是众所周知的，例如，9-苯基呫吨基(Pixyl)、二苯甲基氧基-双(三甲基甲硅烷基氧基)甲硅烷基(BZH)。链装配完成后，所需产物从固相中释放，脱保护，并且用于进一步的生物学应用。
参考图2，它显示在固相支持体上化学合成获得的粗制寡核苷酸混合物的二极管阵列检测器(DAD)光谱。混合物包含全长靶寡核苷酸和多个失败的截短的寡核苷酸，所述失败的截短的寡核苷酸是合成的副产物。如图2所示，全长靶寡核苷酸是最大峰。
参考图3，它是寡核苷酸的典型化学合成的示意图，其中截短或失败序列的5’-羟基由乙酰基保护基封端，同时全长寡核苷酸在其5’-末端带有二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基，使得在全长寡核苷酸的5’-位进行特异性除去DMT基团并且区域特异性添加原酸酯接头。
参考图4,它是RNA的核苷酸间键的酸裂解和核苷酸间键的异构化的示意图，产生5’-3’和5’-2’连接的RNA产物的混合物。
参考图5，它是使用无环原酸酯接头保护寡核苷酸的示意图。在上部平面中，亲和标签位于R基团上，R基团连接至原酸酯接头的中心碳。寡核苷酸与该原酸酯接头反应，得到具有一个亲和标签的寡核苷酸-原酸酯接头缀合物。在下部平面中，亲和标签位于原酸酯接头的所有三个R基团上。该反应取得具有两个亲和标签的原酸酯接头缀合的寡核苷酸。
参考图6，上部是使用环状原酸酯保护寡核苷酸的示意图。下部是原酸酯保护基的酸促进裂解的示意图。
参考图7，它是使用包含氟亲和标签的原酸酯接头对寡核苷酸进行纯化的工作流程示意图。工作流程显示四步骤工艺，其中在步骤a中，寡核苷酸首先缀合至氟取代的原酸酯接头。在步骤b中，寡核苷酸原酸酯接头缀合物的寡核苷酸部分进行脱保护并且从固相支持体裂解。在步骤c中，寡核苷酸原酸酯接头缀合物使用氟亲和标签通过HPLC或固相萃取进行纯化。在步骤d中，氟代原酸酯接头从寡核苷酸裂解，取得所需纯化的产物寡核苷酸。
参考图8，它显示纯化策略，其使用原酸酯保护基和通过使用亲和标签用于纯化寡核苷酸-原酸酯接头缀合物的色谱分离。
对于本领域技术人员来说，在阅读本公开后将明显的是，本申请描述和示出的各个单独实施方案具有离散的组分和特征，其在不脱离本申请教导的范围或精神的情况下，可以容易地与其它几种实施方案中的任一种分离或组合。任何记载的方法可以按照记载的事件的顺序或在逻辑上可能的任何其它顺序进行。
实施例
实施例1
合成2-甲氧基-4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)氧基)甲基)-1,3-二氧杂环戊烷。3-[(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)氧基]-1,2-丙二醇(1当量，BOC Sciences)以浓度为2M溶解于三氟甲苯(Aldrich)中。在圆底烧瓶中将原甲酸三甲酯(3当量，Aldrich)以浓度为3.5M溶解于无水环己烷(Aldrich)中。将催化量的Amberlyst15(H型，Aldrich)与涂覆特氟龙的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。在搅拌下加入3-[(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)氧基]-1,2-丙二醇的三氟甲苯溶液并且烧瓶装配有迪安-斯达克(Dean-Stark)蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。3小时后，反应完成，将烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留物通过在减压下分馏(沸点＝130-135℃，在10mmHg)纯化，得到标题化合物，分离收率为94％。
实施例2
4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)氧基)甲基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)-1,3-二氧杂环戊烷。在圆底烧瓶中将原甲酸三(2,2,2-三氟乙基)酯(50g,161mmol,SynQuest Laboratories)和3-[(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)氧基]-1,2-丙二醇(25g,57mmol,Wako Chemicals)溶解在800mL无水环己烷(Aldrich)中。以5mL的批次加入三氟甲苯(Aldrich)直到溶液澄清(30mL)。将催化量的对甲苯磺酸(Aldrich)与涂覆特氟龙的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点65℃共沸蒸馏除去三氟乙醇。3小时后，反应完成，烧瓶冷却至室温。将反应混合物在旋转蒸发仪上在减压下浓缩。残留物通过在减压下分馏(沸点＝95-100℃，在0.05mmHg)纯化，得到标题化合物，分离收率为74％。
实施例3
合成2-甲氧基-4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)-1,3-二氧杂环戊烷。5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-十三氟癸烷-1,2-二醇(25g,61mmol,1当量，ShanghaiChemhere Co.,Ltd.)以浓度为2M溶解在300mL的环己烷/三氟甲苯(Aldrich)的90/10(体积/体积)混合物中。将原甲酸三甲酯(9g,85mmol,1.4当量，Aldrich)与催化量的Amberlyst15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。4小时后，由于没有进一步蒸馏甲醇共沸物，视为反应完成，烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留物通过在减压下分馏(沸点＝120-130℃，在10mmHg)纯化，得到标题化合物，分离收率为64％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,451.1m/z)证实。
实施例4
合成4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)-1,3-二氧杂环戊烷。在圆底烧瓶中将原甲酸三(2,2,2-三氟乙基)酯(1.4当量，48mmol,15g,SynQuest Laboratories)和5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-十三氟癸烷-1,2-二醇(14g,34mmol,1当量，Shanghai Chemhere Co.,Ltd.)溶解在240mL的无水环己烷(Aldrich)中。所得溶液略微浑浊，滴加三氟甲苯(Aldrich)直至溶液澄清(5mL)。将催化量的对甲苯磺酸(Aldrich)与涂覆特氟龙的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点65℃共沸蒸馏除去三氟乙醇。1小时后，反应完成，烧瓶冷却至室温。将反应混合物在旋转蒸发仪上在减压下浓缩。残留混合物通过在减压下分馏(沸点＝85-104℃，在0.05mmHg)进行纯化，得到标题化合物，分离收率为44％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,519.1,520.1m/z)证实。
实施例5
合成2-甲氧基-4-(3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己基)-1,3-二氧杂环戊烷。5,5,6,6,7,7,8,8,8-九氟辛烷-1,2-二醇(1当量，65mmol,20g,Polyorg Inc.(Leominster,MA))溶解在300mL的环己烷Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(27.5g,260mmol,4当量，Aldrich)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留混合物通过在减压下分馏(沸点＝89-105℃，在10mmHg)进行纯化，得到标题化合物，分离收率为32％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,351.1m/z)证实。
实施例6
合成4-(3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)-1,3-二氧杂环戊烷。5,5,6,6,7,7,8,8,8-九氟辛烷-1,2-二醇(20g,65mmol,1当量，Polyorg Inc.(Leominster,MA))溶解在200mL的环己烷(Aldrich)中。将原甲酸(2,2,2-三氟乙基)酯(60g,195mmol,3.0当量，SynQuest Laboratories)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点65℃共沸蒸馏除去三氟乙醇。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留混合物通过在减压下分馏(沸点＝99-116℃，在0.1mmHg)进行纯化，得到标题化合物，分离收率为20％。产物通过1HNMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,419.1m/z)证实。
实施例7
合成4-(2,2,3,3,4,4,5,5,5-九氟戊基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)-1,3-二氧杂环戊烷。1H,1H,2H,3H,3H-全氟庚烷-1,2-二醇(25g,85mmol,1当量，SynQuest Laboratories,Inc.(Alachua,FL))溶解在250mL的环己烷(Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(18g,170mmol,2.0当量，Aldrich)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点65℃共沸蒸馏除去甲醇。4小时后，由于没有进一步蒸馏三氟乙醇共沸物，反应视为完成，烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留混合物通过在减压下分馏(沸点＝105-110℃，在10mmHg)进行纯化，得到标题化合物，分离收率为39％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,405.0m/z)证实。
实施例8
合成4,5-双(((3,3,4,4,5,5,5-七氟戊基)氧基)甲基)-2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷。(5-羟甲基-2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)-甲醇(10g,62mmol,Combi-Blocks,Inc.(San Diego,CA))溶解在200mL的无水四氢呋喃中。氢化钠(10g,Aldrich,95％)加入烧瓶中，将混合物加热至回流持续30分钟，然后使得冷却至室温。1,1,1,2,2,3,3-七氟-5-碘戊烷(42.7g,124mmol,Oakwood Chemical(Estill,SC))加入烧瓶中，将反应加热至回流持续2小时。反应冷却至室温，通过加入氯化铵中和过量的碱，在旋转蒸发仪上在减压下蒸发溶剂。将粗制混合物溶解在二氯甲烷中，用碳酸氢钠萃取，然后用水和盐水萃取。经硫酸钠干燥二氯甲烷溶液，使用乙酸乙酯和己烷通过硅胶从起始原料纯化产物。将产物级分在配衡烧瓶中蒸发，得到20.6g黄色粘性油(收率)。将油溶解在200mL甲醇中并且在冰/水浴中冷却至0℃。在搅拌下滴加浓H2SO4直至最终浓度是9％，反应搅拌2小时。使得反应温热至室温，使用pH试纸作为指示剂，加入三乙胺以中和酸。将甲醇蒸发至干，将产物通过硅胶使用乙酸乙酯和己烷纯化，得到13.6g纯化的1,4-双((3,3,4,4,5,5,5-七氟戊基)氧基)-丁-2,3-二醇。
1,4-双((3,3,4,4,5,5,5-七氟戊基)氧基)丁-2,3-二醇(26.5mmol,13.6g)溶解在150mL的环己烷(Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(5.6g,53mmol,Aldrich)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。4小时后，由于没有进一步蒸馏甲醇共沸物，视为反应完成，烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留混合物通过在减压下分馏(沸点＝185-190℃，在10mmHg)进行纯化，得到标题化合物，分离收率为61％。产物通过1HNMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,557.2m/z)证实。
实施例9
合成2-甲氧基-4,5-双(2,2,3,3,4,4,5,5,5-九氟戊基)-1,3-二氧杂环戊烷。1,1,1,2,2,3,3,4,4,9,9,10,10,11,11,12,12,12-十八氟-6,7-十二烷二醇通过如下所述的方法制备：Laurent,P.等人(Journal of Fluorine Chemistry,62(2-3),161-71；1993)。将二醇(12g,22.8mmol)溶解在120mL的环己烷(Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(4.8g,45.6mmol,2.0当量，Aldrich)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。4小时后，由于没有进一步蒸馏甲醇共沸物，视为反应完成，烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留混合物通过在减压下分馏(沸点＝162-173℃，在10mmHg)进行纯化，得到标题化合物，分离收率为52％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,569.1m/z)证实。
实施例10
合成4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-十七氟-N-((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)十一酰胺。N-(2,3-二羟丙基)-4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-十七氟十一酰胺通过3-氨基丙烷-1,2-二醇(Aldrich)与十七氟十一酸的硝基苯酯(SynQuest Laboratories,Inc.,Alachua,FL)的反应来制备。
十七氟十一酸(10.0g,20.3mmol)、对硝基苯酚(2.8g,20.3mmol),N,N′-二环己基碳二亚胺(4.2g,20.3mmol)、N,N-二甲基吡啶-4-胺(250mg)溶解在350mL的无水二噁烷中。反应在室温下搅拌过夜，然后蒸发以形成油。产物通过硅胶柱色谱用梯度的己烷:乙酸乙酯(从9:1开始)洗脱来纯化。分离产物，4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-十七氟-十一酸4-硝基苯酯，90+％的收率。
4-硝基苯基4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-十七氟十一酸酯(10g,16.3mmol)、3-氨基丙烷-1,2-二醇(1.4g,16.3mmol)、三乙胺(1.7g,16.3mmol)溶解在200mL二氯甲烷和80mL的N,N-二甲基-甲酰胺的混合物中。在室温搅拌反应3小时。反应混合物通过硅胶柱色谱使用二氯甲烷纯化，生成产物，分离收率为87％。
N-(2,3-二羟丙基)-4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-十七氟-十一酰胺(8.6g,15.2mmol)溶解在100mL的环己烷(Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(3.2g,30.4mmol,2.0当量，Aldrich)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。4小时后，由于没有进一步蒸馏甲醇共沸物，视为反应完成，烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留混合物通过硅胶柱色谱使用二氯甲烷和三乙胺纯化，得到标题化合物，分离收率为60％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,608.0m/z)证实。
实施例11
合成4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-十三氟-N-((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)壬酰胺。N-(2,3-二羟丙基)-4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-十三氟壬酰胺如实施例10所述通过3-氨基丙烷-1,2-二醇(Aldrich)与3-(全氟己基)丙酸的硝基苯酯(SynQuestLaboratories,Inc.,Alachua,FL)的反应来制备。
N-(2,3-二羟丙基)-4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-十三氟壬酰胺(10.0g,21.5mmol)溶解在120mL的环己烷(Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(4.6g,43.0mmol,2.0当量，Aldrich)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。4小时后，由于没有进一步蒸馏甲醇共沸物，视为反应完成，烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留物通过硅胶柱色谱法使用二氯甲烷和三乙胺纯化，得到标题化合物，收率为71％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,508.1m/z)证实。
实施例12
合成4,4,5,5,6,6,6-七氟-N-((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)己酰胺。N-(2,3-二羟丙基)-4,4,5,5,6,6,6-七氟己酰胺如实施例10所述通过3-氨基丙烷-1,2-二醇(Aldrich)与2H,2H,3H,3H-全氟己酸的硝基苯酯(SynQuest Laboratories,Inc.,Alachua,FL)的反应制备。
N-(2,3-二羟丙基)-4,4,5,5,6,6,6-七氟己酰胺(10.0g,31.7mmol)溶解在160mL的环己烷(Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(6.7g,63.4mmol,2.0当量，Aldrich)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。4小时后，由于没有进一步蒸馏甲醇共沸物，视为反应完成，烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留混合物通过硅胶柱色谱使用二氯甲烷和三乙胺纯化，得到标题化合物，分离收率为55％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,358.1m/z)证实。
实施例13
合成N-((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-3-(全氟苯基)丙烯酰胺。N-(2,3-二羟丙基)-3-(全氟苯基)丙酰胺如实施例10所述通过3-氨基丙烷-1,2-二醇(Aldrich)与3-(五氟苯基)丙酸的硝基苯酯(SynQuest Laboratories,Inc.,Alachua,FL)的反应制备。
N-(2,3-二羟丙基)-3-(全氟苯基)丙酰胺(10.0g,32.0mmol)溶解在160mL的环己烷(Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(6.8g,64.0mmol,2.0当量，Aldrich)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。4小时后，由于没有进一步蒸馏甲醇共沸物，视为反应完成，烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留物通过硅胶柱色谱法使用二氯甲烷和三乙胺纯化，得到标题化合物，分离收率为78％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,355.1m/z)证实。
实施例14
合成N,N'-((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4,5-二基)双(亚甲基))双(3-(全氟苯基)丙酰胺)。N,N'-(2,3-二羟基丁烷-1,4-二基)双(3-(全氟苯基)丙酰胺)通过1,4-二氨基丁-2,3-二醇(Chemspace、Riga,Latvia)与3-(五氟苯基)丙酸的硝基苯酯(SynQuestLaboratories,Inc.,Alachua,FL)的反应制备。
3-(全氟苯基)丙酸4-硝基苯酯(20g,55.4mmol)、1,4-二氨基丁-2,3-二醇(3.3g,27.7mmol)和三乙胺(5.6g,55.4mmol)溶解在250mL二氯甲烷和100mL N,N-二甲基-甲酰胺的混合物中。在室温搅拌反应3小时。反应混合物通过硅胶柱色谱在二氯甲烷中纯化，得到产物，分离收率为82％。
N,N'-(2,3-二羟基丁烷-1,4-二基)双(3-(全氟苯基)丙酰胺)(10.0g,17.7mmol)溶解在100mL的环己烷(Aldrich)中，产生浑浊的溶液，然后通过滴加三氟甲苯(Aldrich)使其澄清。将原甲酸三甲酯(3.8g,35.4mmol,2.0当量，Aldrich)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。4小时后，由于没有进一步蒸馏甲醇共沸物，视为反应完成，烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留混合物通过硅胶柱色谱使用二氯甲烷和三乙胺纯化，得到标题化合物，分离收率为41％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,607.2m/z)证实。
实施例15
合成N,N'-((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4,5-二基)双(亚甲基))-双(4,4,5,5,6,6,7,7,7-九氟-庚酰胺)。N,N'-(2,3-二羟基丁烷-1,4-二基)双(4,4,5,5,6,6,7,7,7-九氟庚酰胺)如实施例14所述利用反应条件通过1,4-二氨基丁-2,3-二醇(Chemspace、Riga,Latvia)与4,4,5,5,6,6,7,7,7-九氟庚酸的硝基苯酯(SynQuest Laboratories,Inc.,Alachua,FL)的反应制备。
N,N'-(2,3-二羟基丁烷-1,4-二基)双(4,4,5,5,6,6,7,7,7-九氟庚酰胺)(10.0g,15.0mmol)溶解在100mL的环己烷(Aldrich)中。通过滴加三氟甲苯(Aldrich)使溶液澄清。将原甲酸三甲酯(3.2g,30.0mmol,2.0当量，Aldrich)与催化量的Amberlyst 15(H型，Aldrich)和特氟龙涂覆的磁力搅拌棒一起加入烧瓶中。烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。4小时后，由于没有进一步蒸馏甲醇共沸物，视为反应完成，烧瓶冷却至室温。通过过滤除去Amberlyst树脂，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩滤液。残留混合物通过硅胶柱色谱使用二氯甲烷和三乙胺纯化，得到标题化合物，分离收率为64％。产物通过1H NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱中的分子离子(M+1,711.1m/z)证实。
实施例16
合成4-(氯甲基)-2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷。4-(氯甲基)-2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷通过如下所述方法制备，分离收率为94％：Nguyen-Ba N.等人(抗病毒化合物，美国专利No.5,789,394A，1998年8月4日)。
实施例17
合成S-((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)乙硫醇酯。S-(2,3-二羟丙基)乙硫醇酯通过如下所述的方法制备：Polster J.等人(J.Agric.Food Chem.,63,1419-1432；2015)。在容纳特氟龙涂覆的磁力搅拌棒的圆底烧瓶中，将二醇(10.21g,68mmol)以浓度为0.7M溶解在环己烷(Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(1.5当量，Aldrich)和催化量的对甲苯磺酸(5mol％,Aldrich)加入圆底烧瓶中，烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。2小时后，反应完成，烧瓶冷却至室温，然后在旋转蒸发仪上在减压下浓缩。产物通过如下纯化：硅胶柱色谱(在9:1己烷:乙酸乙酯中用1％三乙胺调节)，用梯度的己烷:乙酸乙酯(从9:1己烷:乙酸乙酯开始)洗脱。分离标题化合物，收率为72％。产物通过1H和13C NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱的阳离子分子模式([M-OMe]+,161.0m/z)证实。
实施例18
合成1,2-双((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)二硫烷。(2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲硫醇通过如下所述的方法制备：Polster J.等人(J.Agric.FoodChem.,63,1419-1432；2015)。在容纳特氟龙涂覆的磁力搅拌棒的圆底烧瓶中，将硫醇(3.00g,20mmol)以浓度为0.33M溶解在EtOAc(Aldrich)。向溶液中加入NaI(54mg,0.36mmol,Aldrich)和30％H2O2(4.0mL,36mmol,Aldrich)，在23℃将混合物搅拌0.5小时。加入100mL饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭反应。混合物用三个150mL批次的乙酸乙酯(Aldrich)萃取。将合并的有机萃取物用一个150mL批次的饱和氯化钠洗涤，经硫酸镁(Aldrich)干燥，并且在旋转蒸发仪上在减压下浓缩。粗制残留物通过硅胶柱色谱通过用梯度的己烷:乙酸乙酯(从9:1开始)洗脱来纯化。分离标题化合物，收率78％。产物通过1H和13C NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱的阳离子分子模式([M-OMe]+,267.0m/z)证实。
实施例19
合成2-甲氧基-4-((苯基二硫烷基)甲基)-1,3-二氧杂环戊烷。3-(苯基二硫烷基)丙烷-1,2-二醇通过如下所述的方法制备：Hunter R.等人(Journal of OrganicChemistry,71,8268-8271；2006)。在容纳特氟龙涂覆的磁力搅拌棒的圆底烧瓶中将二醇(102mg,0.47mmol)以浓度为0.1M溶解在环己烷(Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(1.5当量，Aldrich)和对甲苯磺酸(Aldrich)加入圆底烧瓶中，烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。3小时后，反应完成，烧瓶冷却至室温，然后在旋转蒸发仪上在减压下浓缩。产物通过硅胶柱色谱用梯度的己烷:乙酸乙酯(从己烷开始)洗脱来纯化。分离标题化合物，收率68％。产物通过1H和13C NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱的阳离子分子模式([M-OMe]+,227.0m/z)证实。
实施例20
合成1-((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-1H-吡咯。在容纳特氟龙涂覆的磁力搅拌棒的圆底烧瓶中，将3-(1H-吡咯-1-基)丙烷-1,2-二醇(5.0g,35.4mmol,AurumPharmatech)以浓度为0.2M溶解在环己烷(Aldrich)中。将原甲酸三甲酯(1.5当量，Aldrich)和催化量的对甲苯磺酸(5mol％,Aldrich)加入圆底烧瓶中，烧瓶装配有迪安-斯达克蒸馏头。将反应缓慢加热至回流，并且通过在沸点45℃共沸蒸馏除去甲醇。3小时后，反应完成，烧瓶冷却至室温，然后在旋转蒸发仪上在减压下浓缩。产物通过硅胶柱色谱用梯度的己烷:乙酸乙酯(从纯己烷开始)洗脱来纯化。分离标题化合物，收率为66％。产物通过1H和13C NMR中的特征峰并且通过ESI/TOF质谱的阳离子分子模式([M+H],183.1m/z)证实。
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实施例21
合成1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(((4-((((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)二硫烷基)甲基)-1,3-二氧杂环戊烷-2-基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。将20mg 3’-dT-CPG(Glen Research)用100μL 3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液(Glen Research)处理两次，持续1分钟，然后用5mL乙腈处理，并且用氮气流干燥。将1,2-双((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)二硫烷原酸酯(45μL)、乙腈(45μL,Aldrich)和3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液(10μL,Glen Research)加入3’-dT-CPG中。在60℃将混合物加热1小时。除去残留液体后，将CPG用8mL乙腈洗涤，然后用氮气流干燥。在23℃将3’-dT-CPG-原酸酯缀合物用浓28％氢氧化铵处理(100μL)2小时。所得滤液在Savantspeedvac上在减压下浓缩，将其溶解于500μL水中，并且通过ESI/TOF质谱([M-OMe]+,477.1m/z)分析。
实施例22
1,2-双((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)二硫烷:dT缀合物,Sulfolink捕获和释放。将30mg 3’-dT-CPG(Glen Research)用100μL 3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液(Glen Research)处理两次，持续1分钟，然后用5mL乙腈处理，并且用氮气流干燥。将1,2-双((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)二硫烷原酸酯(45μL)、乙腈(45μL,Aldrich)和3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液(10μL,Glen Reseach)加入3’-dT-CPG中。在60℃将混合物加热1小时。除去残留液体后，将CPG用8mL乙腈洗涤，然后用氮气流干燥。在23℃将dT-CPG:原酸酯缀合物用在碳酸氢铵中制备(200mM)、pH为8.0的50mM TCEP(200μL,Aldrich)溶液处理1小时。通过在23℃用浓氢氧化铵(100μL,Aldrich)处理1小时，将含有还原硫醇的缀合物脱保护并且从CPG释放。在Savant speedvac中将滤液浓缩1小时后，残留物在200μL 50mMTris.HCl，5mM EDTA，pH 8.5中溶解。在23℃将该溶液与300μL Sulfolink树脂(ThermoFisher)一起培育12小时。树脂用200μL 50mM Tris.HCl，5mM EDTA，pH 8.5洗涤，然后通过8mL乙腈洗涤。产物3’-dT通过在23℃与100μL 20％v/v甲酸水溶液一起培育60分钟而从树脂释放。所得滤液在Savant speedvac上浓缩并且通过ESI/TOF质谱(M+H,m/z243.1)分析。
实施例23
1-((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-1H-吡咯:PTAD:RNA缀合物。将10mg 20mer RNA-CPG用100μL 3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液(Glen Research)处理两次，持续1分钟，然后用5mL乙腈处理，并且用氮气流干燥。45μL 1-((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)-1H-吡咯和5μL 3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液(Glen Research)加入20merRNA CPG中，在70℃将混合物加热2小时。除去残留液体后，将CPG用8mL乙腈洗涤，然后用氮气流干燥。将干燥的CPG用100μL 0.2M 4-苯基-1,2,4-三唑-3,5-二酮(PTAD)(Aldrich)的乙腈溶液处理30秒。除去PTAD溶液，用8mL无水乙腈洗涤CPG，并且在氮气流下干燥。在23℃将20mer RNA-CPG-原酸酯-PTAD缀合物用纯乙二胺处理2小时，然后用3mL干燥乙腈漂洗CPG。将裂解的20mer RNA:原酸酯:PTAD缀合物用0.3mL 0.1M乙酸铵缓冲液(pH＝6.9)洗脱，并且通过反褶积ESI/TOF质谱(M＝6763.86m/z)分析，显示增加一个吡咯并原酸酯(pyrroloorthoester)和两个PTAD分子。
实施例24
1,3-二氧杂环戊烷和1,4-二氧杂环戊烷原酸酯接头至固相支持体上新合成的寡核苷酸的连接的一般程序。
新合成的寡核苷酸、DNA、RNA或修饰寡核苷酸在固相支持体上合成。制备所得全长产物用于通过在去封闭步骤中除去最终保护基来连接原酸酯接头。此保护基可以是文献中众所周知的各种基团；最典型的是DMT、Pixyl或BZH。寡核苷酸的合成可发生在其中最终保护基从所得寡核苷酸的5’-羟基除去的3’至5’方向上，或合成可发生在其中最终保护基从所得寡核苷酸的3’-羟基除去的5’至3’方向上。此时，磷保护基可以任选地从新合成的寡核苷酸中除去。连接至亲和标签(AT)的1,3-二氧杂环戊烷或1,4-二氧杂环戊烷原酸酯接头使用弱酸作为反式-原酸酯交换催化剂与最终去封闭步骤中释放的羟基反应。现可以用各种碱性胺处理所得的含有亲和标签的原酸酯接头-寡聚核苷酸的缀合物，以任选地除去各种保护基团例如TC或PivOM，并且可能裂解固相支持体的连接。然后，可以借助于亲和标签通过色谱分离或固相萃取来纯化释放的寡核苷酸。然后可以使用弱酸和任何另外的酸不稳定的保护基团例如ACE除去原酸酯接头，然后可以任选地用各种试剂例如氟离子、例如TOM或TBDMS进一步使纯化的寡核苷酸脱保护。
实施例25
2-甲氧基-4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)氧基)甲基)-1,3-二氧杂环戊烷与使用TC亚磷酰胺制备的21核苷酸RNA连接。
21-核苷酸、寡核糖核苷酸在包含脱氧胸苷的可控多孔玻璃(CPG；PrimeSynthesis Aston,PA)上使用ATKA 100 DNA/RNA合成器(General Electric)和12ml柱使用TC亚磷酰胺来合成，得到6.5g CPG，其包含所需粗制寡核糖核苷酸(5’-GUGUCAGUACAGAUGAGGCCT-3’,SEQ ID NO.1)。将大约1微摩尔的粗制寡核苷酸(基于CPG的载荷量，30mg)放入高通量DNA/RNA合成柱(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,CA)。100微升2-甲氧基-4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)-氧基)甲基)-1,3-二氧杂环戊烷(原酸酯)与80微升无水乙腈和20微升3％wt/wt的二氯乙酸在无水二氯甲烷中的溶液(Glen Research)混合。原酸酯溶液加入柱中并且加热至60℃持续1小时。将柱用无水乙腈(1ml)漂洗，然后将200微升纯的无水乙二胺加入柱中，使得反应2小时。将乙二胺从柱中使用乙腈(1ml)漂洗，然后将RNA从柱中使用300微升0.1M在水中的乙酸铵缓冲液(pH 7.0)除去。原酸酯接头转化的产率通过HPLC分析使用反相C-18柱和Agilent Technologies1260Infinity LC(20分钟内使用0％B至50％B的梯度；A：0.1M在水中的乙酸三乙铵，pH为7.0，B：0.1M在30/70(体积/体积)水/乙腈中的乙酸三乙铵)来确定。反应表明，55％的全长产物转化为含有原酸酯接头的产物。
实施例26
2-甲氧基-4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)氧基)甲基)-1,3-二氧杂环戊烷与使用TC亚磷酰胺制备的100核苷酸RNA连接。
100-核苷酸、寡核糖核苷酸在容纳保护的尿苷-2’-OTC的CPG(Prime SynthesisAston,PA)上使用ATKA 100 DNA/RNA合成器(General Electric)和12ml柱使用TC亚磷酰胺来合成，得到6.8g CPG，其包含所需粗制寡核糖核苷酸(5’-CUU GCC CCA CAG GGC AGU AAGUUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAAGUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U-3’,SEQ ID NO.2)。将大约1微摩尔的粗制寡核苷酸(基于CPG的载荷量，40mg)放入高通量DNA/RNA合成柱(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,CA)。100微升2-甲氧基-4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)-氧基)甲基)-1,3-二氧杂环戊烷(原酸酯)与80微升无水乙腈和20微升3％wt/wt的二氯乙酸在无水二氯甲烷中的溶液(Glen Research)混合。原酸酯溶液加入柱中并且加热至60℃持续1小时。将柱用无水乙腈(1ml)漂洗，然后将200微升纯的无水乙二胺加入柱中，使得反应2小时。将乙二胺从柱中使用乙腈(1ml)漂洗，然后将RNA从柱中使用300微升0.1M在水中的乙酸铵缓冲液(pH 7.0)除去。原酸酯接头转化的产率通过HPLC分析使用反相C-18柱和AgilentTechnologies 1260 Infinity LC(20分钟内使用0％B至50％B的梯度；A：0.1M在水中的乙酸三乙铵，pH为7.0，B：0.1M在30/70(体积/体积)水/乙腈中的乙酸三乙铵)确定。反应表明，25％的全长产物转化为含有原酸酯接头的产物。
实施例27
4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)氧基)甲基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)-1,3-二氧杂环戊烷与使用TC亚磷酰胺制备的100核苷酸RNA连接。
100-核苷酸、寡核糖核苷酸在容纳保护的尿苷-2’-OTC的CPG(Prime SynthesisAston,PA)上使用ATKA 100 DNA/RNA合成器(General Electric)和12ml柱使用TC亚磷酰胺来合成，得到6.8g CPG，其包含所需粗制寡核糖核苷酸(5’-CUU GCC CCA CAG GGC AGU AAGUUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAAAAAGUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U-3’,SEQ ID NO.2)。将大约1微摩尔的粗制寡核苷酸(基于CPG的载荷量，40mg)放入高通量DNA/RNA合成柱(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,CA)。100微升4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)氧基)甲基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)-1,3-二氧杂环戊烷(原酸酯)与80微升无水乙腈和20微升3％wt/wt的二氯乙酸在无水二氯甲烷中的溶液(Glen Research)混合。原酸酯溶液加入柱中并且加热至60℃持续1小时。将柱用无水乙腈(1ml)漂洗，然后将200微升纯的无水乙二胺加入柱中，使得反应2小时。将乙二胺从柱中使用乙腈(1ml)漂洗，然后将RNA从柱中使用300微升0.1M在水中的乙酸铵缓冲液(pH 7.0)除去。原酸酯接头转化的产率确定通过HPLC分析使用反相C-18柱和Agilent Technologies 1260Infinity LC(20分钟内使用0％B至50％B的梯度；A：0.1M在水中的乙酸三乙铵，pH为7.0，B：0.1M在30/70(体积/体积)水/乙腈中的乙酸三乙铵)。反应表明，52％的全长产物转化为含有原酸酯接头的产物。
实施例28
氟亲和标签至原酸酯接头的2-步骤连接
将30mg的3’-RNA-CPG用100μL 3％的二氯乙酸的二氯甲烷溶液(Glen Research)处理两次，持续1分钟，然后通过8mL乙腈洗涤，并且用氮气流干燥。45μL 1,2-双((2-甲氧基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)二硫烷原酸酯、45uL乙腈(Aldrich)和10μL 3％的二氯乙酸的二氯甲烷溶液(Glen Research)加入具有游离5’-羟基的3’-RNA-CPG，在60℃将混合物加热1小时。混合除去残留液体后，将CPG用8mL乙腈洗涤，然后用氮气流干燥。在23℃将RNA-CPG:原酸酯缀合物用在200mM碳酸氢铵制备的pH为8.0的200μL 50mM TCEP(Aldrich)溶液处理1小时。将CPG上含有还原硫醇的RNA缀合物然后与浓度为10mM的1H,1H,2H,2H-全氟辛基碘烷(Aldrich)在乙腈中的溶液一起培育。缀合物然后脱保护并且通过在23℃用100uL纯乙二胺处理5小时从CPG释放，然后用8mL乙腈洗涤。氟化的RNA缀合物从CPG树脂中用0.3mL 0.1M乙酸铵缓冲液(pH＝6.9)洗脱，并且通过反褶积ESI/TOF质谱分析。
实施例29
柱体纯化或固相萃取纯化具有氟亲和标签的寡核苷酸
将30mg 100mer RNA-CPG用100uL 3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液(Glen Research)处理两次，持续1min，然后通过8mL乙腈(Aldrich)洗涤，并且用氮气流干燥。将80μL 4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)氧基)甲基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)-1,3-二氧杂环戊烷、80μL乙腈和40μL 3％二氯乙酸的二氯甲烷溶液(Glen Research)加入100mer RNA CPG，在75℃将混合物加热15分钟。除去残留液体后，将CPG用8mL乙腈洗涤，然后用氮气流干燥。在40℃将CPG接着用0.5mL纯乙二胺(Aldrich)处理1小时。除去残留液体后，将CPG用8mL乙腈洗涤，然后用氮气流干燥。将氟原酸酯:RNA缀合物从CPG用1mL包含5％v/v二甲基甲酰胺(Aldrich)的10％w/v氯化钠洗脱。
“Fluoro-pak II”柱体(Berry&Associates)通过如下调节：加入1mL乙腈，然后加入1mL 0.1M，pH 7.0(Glen Research)，并且加入1mL包含5％v/v二甲基甲酰胺(Aldrich)的10％w/v氯化钠。洗脱的氟原酸酯:RNA缀合物通过注射器加入该柱体的顶部，使用注射器将空气以每滴大约2秒的速度推入树脂，直到缓冲液到达树脂顶部。将树脂用2mL批次的在100mM乙酸三乙铵(pH为7.0)中的10％乙腈(v/v)洗涤两次，然后用两个2mL批次的在100mM乙酸三乙铵(pH为7.0)中的12.5％乙腈(v/v)洗涤。将氟原酸酯:RNA缀合物从树脂用1mL在0.1M乙酸三乙铵(pH为5.5)中的80％MeOH(v/v)洗脱。将洗脱的级分在Savant speedvac上浓缩至干，将其溶解于212μL 0.1M乙酸三乙铵(pH为5.5)中，使得在23℃培育。1小时后，将38μL乙腈加入反应溶液中，并且穿过另一个调节的Fluoro-pak II柱体，然后加入1mL在100mM乙酸三乙铵(pH为7.0)中的12.5％乙腈(v/v)。将两个级分合并并且在Savantspeedvac上蒸发至干，产生0.7mg亲和纯化的100mer RNA。
该程序使用包含玻璃料和块状氟树脂的平板扩展到6、12、24、48、96、384或1536孔的微量滴定形式。真空歧管可用于抽引所有溶液通过树脂，以收集或送至废料。已经显示该过程可自动应用于实验室机器人；Agilent Bravo Workstation。
鉴于本申请，应当指出，可以与本申请的教导一致地实施方法。此外，各种部件、物质、结构和参数仅作为说明和实施例而包括在本申请中，并没有任何限制意义。鉴于本申请，可以在其它应用中实现本申请的教导，并且可以确定实现这些应用的部件、物质、结构和设备，同时仍然在所附权利要求的范围内。

Claims (42)

1.纯化靶寡核苷酸的方法，所述方法包括：
在固相支持体上合成所述靶寡核苷酸并且得到包含所述靶寡核苷酸和截短的寡核苷酸的混合物；
将所述靶寡核苷酸与原酸酯接头反应，由此形成寡核苷酸-原酸酯接头缀合物，其中所述原酸酯接头在缀合时包含亲和标签，或在缀合反应后在第二反应中，所述亲和标签与所述寡核苷酸-原酸酯接头缀合物反应；
从所述固相支持体中裂解所述寡核苷酸-原酸酯接头缀合物和所述截短的寡核苷酸；
将所述寡核苷酸-原酸酯接头缀合物和所述截短的寡核苷酸加载至色谱柱或亲和捕获支持体上并且将所述寡核苷酸-原酸酯接头缀合物通过所述亲和标签结合至所述亲和捕获支持体；
将所述截短的寡核苷酸从所述柱或所述亲和捕获支持体洗掉；和
将所述原酸酯接头从所述靶寡核苷酸裂解并且将所述靶寡核苷酸从所述色谱柱或所述亲和捕获支持体洗脱，或将所述寡核苷酸-原酸酯接头缀合物利用色谱或亲和捕获法分离并且将所述原酸酯接头从所述寡核苷酸-原酸酯接头缀合物裂解，由此释放纯化的靶寡核苷酸；
其中所述原酸酯接头为式(I)化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地为H、卤素；C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、杂环基、或碳环基，其任选被以下取代：—卤素、—R、—O-、═O、—OR、—SR、—S-、—NR2、—N+R3、═NR、—C(卤素)3、—CN、—OCN、—SCN、—N═C═O、—NCS、—NO、—NO2、═N2、—N3、—NHC(═O)R、—NHS(═O)2R、—C(═O)R、—C(═O)NRR—S(═O)2O-、—S(═O)2OH、—S(═O)2R、—OS(═O)2OR、—S(═O)2NR、—S(═O)R、—OP(═O)(OR)2、—P(═O)(OR)2、—P(═O)(O-)2、—P(═O)(OH)2、—P(O)(OR)(O-)、—C(═O)R、—C(═O)OR、—C(═O)-卤素、—C(S)R、—C(O)OR、—C(O)O-、—C(S)OR、—C(O)SR、—C(S)SR、—C(O)NRR、—C(S)NRR、—C(═NR)NRR，并且每个R独立地是H、烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或保护基；或其组合，条件是碳的总数不超过24；R8和R9为H；X为H、甲基或吸电子基；n为0、1或2，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签；且
其中所述亲和标签包含以下中的一种或多种：氟标签、疏水标签、生物素标签、谷胱甘肽标签、麦芽糖标签、芳基硼酸标签、聚组氨酸肽标签、聚巯基标签、环糊精标签、金刚烷标签、多胺标签、马来酰亚胺标签、炔烃标签、叠氮基标签、酰肼标签、氨基标签、二醇标签、硫醇标签，或其任何组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述杂环基为杂芳基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳环基为芳基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述亲和标签为所述原酸酯接头中的一个或多个基团，或所述亲和标签通过接头连接至所述原酸酯接头。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在所述寡核苷酸-原酸酯接头缀合物从所述固相支持体裂解前或在所述寡核苷酸-原酸酯接头缀合物从所述固相支持体裂解后，进行所述第二反应。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述原酸酯接头在所述靶寡核苷酸的5’-羟基处连接。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述原酸酯接头在所述靶寡核苷酸的3’-羟基处连接。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一为氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基、氟代碳环基、氟代杂烷基、氟代杂烯基、氟代杂炔基或氟代杂环基。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述靶寡核苷酸包含寡核糖核苷酸(RNA)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述RNA包含2’-羟基保护基，其选自硫羰氨基甲酸酯(TC)保护基、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)保护基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)保护基、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)保护基、新戊酰氧基甲基(PivOM)保护基和2-氰基乙氧基甲基(CEM)保护基。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述RNA进一步包含磷保护基、核碱基保护基，或其组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述寡核苷酸与所述原酸酯接头反应前，将所述磷保护基脱保护。
13.根据权利要求11所述的方法，其中在所述靶寡核苷酸与所述原酸酯接头反应后，将所述核碱基保护基和任选地所述磷保护基脱保护。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述寡核苷酸-原酸酯接头缀合物从所述固相支持体的裂解和所述核碱基保护基的脱保护和任选地所述磷保护基的脱保护在单一反应中进行。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述RNA包含至少70个核苷酸。
16.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述亲和标签为cLogP值为至少3的氟标签或疏水标签。
17.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述原酸酯接头为：
18.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述亲和标签为氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基或氟代碳环基。
19.寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其包含寡核苷酸，所述寡核苷酸在其5’末端或3’末端包含式(IV)的部分：
其中连接至弯曲线的氧为所述寡核苷酸的5’末端或3’末端的氧；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少之一为卤素；或C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、杂环基、或碳环基，其任选被以下取代：—卤素、—R、—O-、═O、—OR、—SR、—S-、—NR2、—N+R3、═NR、—C(卤素)3、—CN、—OCN、—SCN、—N═C═O、—NCS、—NO、—NO2、═N2、—N3、—NHC(═O)R、—NHS(═O)2R、—C(═O)R、—C(═O)NRR—S(═O)2O-、—S(═O)2OH、—S(═O)2R、—OS(═O)2OR、—S(═O)2NR、—S(═O)R、—OP(═O)(OR)2、—P(═O)(OR)2、—P(═O)(O-)2、—P(═O)(OH)2、—P(O)(OR)(O-)、—C(═O)R、—C(═O)OR、—C(═O)-卤素、—C(S)R、—C(O)OR、—C(O)O-、—C(S)OR、—C(O)SR、—C(S)SR、—C(O)NRR、—C(S)NRR、—C(═NR)NRR，并且每个R独立地是H、烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或保护基；或其组合，剩余的R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7为H；或C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6-C12芳烷基、碳环基、杂环基，其任选被以下取代：—卤素、—R、—O-、═O、—OR、—SR、—S-、—NR2、—N+R3、═NR、—C(卤素)3、—CN、—OCN、—SCN、—N═C═O、—NCS、—NO、—NO2、═N2、—N3、—NHC(═O)R、—NHS(═O)2R、—C(═O)R、—C(═O)NRR—S(═O)2O-、—S(═O)2OH、—S(═O)2R、—OS(═O)2OR、—S(═O)2NR、—S(═O)R、—OP(═O)(OR)2、—P(═O)(OR)2、—P(═O)(O-)2、—P(═O)(OH)2、—P(O)(OR)(O-)、—C(═O)R、—C(═O)OR、—C(═O)-卤素、—C(S)R、—C(O)OR、—C(O)O-、—C(S)OR、—C(O)SR、—C(S)SR、—C(O)NRR、—C(S)NRR、—C(═NR)NRR，并且每个R独立地是H、烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或保护基；n为0、1至3中任一项，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7中的至少之一包含亲和标签；条件是所述部分不为
20.根据权利要求19所述的寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其中所述杂环基为杂芳基。
21.根据权利要求19所述的寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其中所述碳环基为芳基。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其中n＝0，所述亲和标签为cLogP值为至少3的氟标签或疏水标签。
23.根据权利要求19至21中任一项所述的寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其中所述寡核苷酸包含寡核糖核酸(RNA)。
24.根据权利要求19至21中任一项所述的寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少之一为氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基、氟代芳基、氟代杂烷基、氟代杂烯基、氟代杂炔基或氟代杂环基。
25.根据权利要求19至21中任一项所述的寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少之一为氟标签，剩余的R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7基团为H。
26.根据权利要求19至21中任一项所述的寡核苷酸，其中R1、R2、R3、R4、R5或R6中的至少两个为氟标签。
27.根据权利要求19至21中任一项所述的寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其中所述部分选自：
其中R11和R12各自独立地为H、C1-C23烷基、C1-C23杂烷基、取代的C1-C23烷基、C2-C23烯基、C2-C23杂烯基、取代的C2-C23烯基、C2-C23炔基、C2-C23杂炔基、取代的C2-C23炔基、芳基、取代的芳基、杂环基或取代的杂环基，条件是R11和R12中的至少之一包含亲和标签；R7为H、甲基、乙基、正丙基、苯基或苄基；Z各自独立地为CRaRb、O、S或NRa，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C6烷基，或Ra和R11或Ra和R12一起形成含N的杂环；n为0、1至3中任一项。
28.根据权利要求19至21中任一项所述的寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其中所述部分为：
其中X1为H、]F、叠氮基、保护的巯基、保护的聚巯基、聚组氨酸、保护的氨基、保护的酰肼基、保护的羟基胺基团、马来酰亚胺、环辛炔、共轭二烯、C2烯基、取代的C2烯基、C2炔基或取代的C2炔基；R18和R19各自独立地为H、F、C1-3杂烷基或取代的C1-3烷基；n为1或2；m为0至12的整数。
29.根据权利要求19至21中任一项所述的寡核苷酸原酸酯接头缀合物，其中所述部分选自：
30.式(I)的原酸酯接头
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为H、卤素；C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、杂环基、或碳环基，其任选被以下取代：—卤素、—R、—O-、═O、—OR、—SR、—S-、—NR2、—N+R3、═NR、—C(卤素)3、—CN、—OCN、—SCN、—N═C═O、—NCS、—NO、—NO2、═N2、—N3、—NHC(═O)R、—NHS(═O)2R、—C(═O)R、—C(═O)NRR—S(═O)2O-、—S(═O)2OH、—S(═O)2R、—OS(═O)2OR、—S(═O)2NR、—S(═O)R、—OP(═O)(OR)2、—P(═O)(OR)2、—P(═O)(O-)2、—P(═O)(OH)2、—P(O)(OR)(O-)、—C(═O)R、—C(═O)OR、—C(═O)-卤素、—C(S)R、—C(O)OR、—C(O)O-、—C(S)OR、—C(O)SR、—C(S)SR、—C(O)NRR、—C(S)NRR、—C(═NR)NRR，并且每个R独立地是H、烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或保护基；或其组合，条件是碳的总数不超过24；R7、R8和R9为H；X为H、甲基或吸电子基；n为0、1或2，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6中的至少之一包含亲和标签；且
其中所述亲和标签包含以下中的一种或多种：氟标签、疏水标签、生物素标签、谷胱甘肽标签、麦芽糖标签、芳基硼酸标签、聚组氨酸肽标签、聚巯基标签、环糊精标签、金刚烷标签、多胺标签、马来酰亚胺标签、炔烃标签、叠氮基标签、酰肼标签、氨基标签、二醇标签、硫醇标签，或其任何组合，其中所述氟标签选自氟代烷基、氟代烯基、氟代炔基或氟代芳基，并且所述疏水标签选自C6-C24烷基、C4-C24烯基和C4-C24炔基。
31.根据权利要求30所述的原酸酯接头，其中n为0，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少两个各自独立地为卤素；C1-C24烷基、C1-C24杂烷基、C2-C24烯基、C2-C24杂烯基、C2-C24炔基、C2-C24杂炔基、杂环基、或碳环基，其任选被以下取代：—卤素、—R、—O-、═O、—OR、—SR、—S-、—NR2、—N+R3、═NR、—C(卤素)3、—CN、—OCN、—SCN、—N═C═O、—NCS、—NO、—NO2、═N2、—N3、—NHC(═O)R、—NHS(═O)2R、—C(═O)R、—C(═O)NRR—S(═O)2O-、—S(═O)2OH、—S(═O)2R、—OS(═O)2OR、—S(═O)2NR、—S(═O)R、—OP(═O)(OR)2、—P(═O)(OR)2、—P(═O)(O-)2、—P(═O)(OH)2、—P(O)(OR)(O-)、—C(═O)R、—C(═O)OR、—C(═O)-卤素、—C(S)R、—C(O)OR、—C(O)O-、—C(S)OR、—C(O)SR、—C(S)SR、—C(O)NRR、—C(S)NRR、—C(═NR)NRR，并且每个R独立地是H、烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或保护基；R1、R2、R3、R4、R5和R6中所有剩余的基团为H，条件是不为H的两个R基团不与所述环状原酸酯一起连接以形成稠环。
32.根据权利要求30或31所述的原酸酯接头，其中所述杂环基为杂芳基。
33.根据权利要求30或31所述的原酸酯接头，其中所述碳环基为芳基。
34.根据权利要求30或31所述的原酸酯接头，其中所述亲和标签为cLogP值为至少3的氟标签或疏水标签。
35.根据权利要求30或31所述的原酸酯接头，其具有结构：
其中R11为H、C1-C23烷基、C1-C23杂烷基、取代的C1-C23烷基、C2-C23烯基、C2-C23杂烯基、取代的C2-C23烯基、C2-C23炔基、C2-C23杂炔基、取代的C2-C23炔基、芳基、取代的芳基、杂环基或取代的杂环基；R7为H或CH3；Z为CRaRb、O、S、NRa、NRaCO、CONRa，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C6烷基，或Ra和R11一起形成含N的杂环；X为F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基；n为0或1，R11包含亲和标签。
36.根据权利要求30或31所述的原酸酯接头，其具有结构：
其中R11和R12各自独立地为H、C1-C23烷基、C1-C23杂烷基、取代的C1-C23烷基、C2-C23烯基、C2-C23杂烯基、取代的C2-C23烯基、C2-C23炔基、C2-C23杂炔基、取代的C2-C23炔基、芳基、取代的芳基、杂环基或取代的杂环基，条件是R11和R12中的至少之一包含亲和标签；R7为H或CH3；Z各自独立地为CRaRb、O、S、NRaCO、CONRa或NRa，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C6烷基，或Ra和R11或Ra和R12一起形成含N的杂环；X为F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基；n为0或1。
37.根据权利要求35所述的原酸酯，其中，n为0，Z为O。
38.根据权利要求36所述的原酸酯，其中，n为0，Z为O。
39.氟原酸酯接头，其具有结构：
其中Z为CH2、O、S、NRa或NRaCO，其中Ra为H或C1-C6烷基；R7为H、甲基、乙基、正丙基、苯基或苄基；X为H、F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基或氰基-；m为0至12的整数；n为1或2。
40.原酸酯接头，其具有选自如下的结构：
41.式(IIIa)的原酸酯接头：
其中X1为H、F、叠氮基、保护的巯基、保护的聚巯基、聚组氨酸、保护的氨基、保护的酰肼基、保护的羟基胺基团、环辛炔、共轭二烯、C2烯基、取代的C2烯基、C2炔基或取代的C2炔基；R18和R19各自独立地为H、F、C1-3杂烷基或取代的C1-3烷基；X2为H、CH3、F、Cl、Br或单、双或三卤代甲基或氰基-；n为1或2；m为0至12的整数。
42.根据权利要求41所述的原酸酯接头，其中所述原酸酯接头为：
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