CN101547928A - 合成和纯化寡核苷酸的化合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了延长核酸和纯化靶向核酸的方法。该方法包括使用封端试剂，以实现链终止，并通过氟的亲合性方法来提供纯化操作。
Description
发明领域
本发明涉及核酸化学和分子生物学。更具体地说，除了化学封端试剂和包含这种试剂的组合物、试剂盒和系统之外，本发明还提供了合成和纯化核酸的方法。本发明可以用于各种工业、医学和司法鉴定目的。
发明背景
本发明涉及合成和纯化寡核苷酸的新化合物和方法，更具体地说，涉及合成、化学封端和纯化核苷酸的化合物和方法。在生命世界中，核苷酸作为遗传信息的载体和传递者是至关重要的。由于F.Miescher发现了它们，它们引起了广泛的科学兴趣，这导致人们开始阐明它们的功能、结构和作用机理。核苷酸序列的变化常常是由于对疾病和对治疗时的药理学应答的敏感性的差别所造成的。举例来说，核苷酸分子的单个碱基的变化(通常称为单个核苷酸多态性(SNPs))，可以影响个体患指定疾病的危险性。通过比较这些变化，研究人员获得了对SNPs的医学应用性的理解，由此提高我们有效确诊、预知和治疗疾病的能力。此外，纯化的合成核苷酸用于扩增聚合酶链式反应(PCR)及其它扩增方法；作为引物；检测和/或排序、基因治疗、克隆、位点特异性突变研究等等的杂交探针。这些技术结果的质量直接与所使用的寡核苷酸纯度相关。
因此，为了阐明这些分子的功能和便于这些分子的操作，核苷酸分子的纯度是关键的。对于短寡核苷酸的制备，自动的固相合成是最普通方法。这些合成方法通常基于亚磷酰胺或核苷的氢膦酸酯衍生物的逐步反应、以预先确定的顺序形成这些单体结构单元的连续连接基(参见例如，T.Brown & D.J.S.Brown，Oligonucleotides and Analogues--APractical Approach，(1991)(Eckstein，F.，publ.IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford，N.Y.，Tokyo)；Sambrook等人，1989，MolecularCloning--A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，Beaucage，S.L.；Bergstrom，D.E.；Glick，G.D.；Jones，R.A.，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.：New York，Chapters 1-4，2000-2004；和一系列，酶学方法(Academic Press，Inc.)。然而，得到的寡核苷酸是非均匀排序混合物，其使得纯化变复杂，并且限制了制备寡核苷酸的规模和得到的产率。随着链长度的增加，进一步加大了纯化难题。典型地，得到的未反应的5′-羟基在化学上用乙酸酐封端，从而防止进一步的、具有错误“失效”序列的链延长。可以平行进行的另一种方法是所谓的基于三苯甲基的纯化(TOP)，其利用三苯甲基保护基的亲油性。所需要的、携带亲脂性的三苯甲基的序列保留在亲脂性的载体物质上，而将没有三苯甲基的失效序列除去。三苯甲基在酸性条件下裂解之后，可以从亲脂性载体上洗脱所需要序列的产物。
可以使用各种方法纯化寡核苷酸，例如上述的反相层析、阴离子交换(AX)色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、乙醇沉淀或这些技术的联用。然而，由于在寡核苷酸合成中酰基和三苯甲基对于所使用的条件相对不稳定(例如典型的寡核苷酸脱保护条件包括在氨水中、在55-60℃培养16小时)，导致不良的纯化或低产率，所以这些方法具有缺点。由于疏水作用不是特别强烈，因此分离效率随着链长增加而快速降低。造成这些方法受到限制，因而，这些方法限于制备小于100个核苷酸的核苷酸，同时所需要的序列的产率低。
氟的亲合性策略已经用于肽的纯化(参见Filippov等人，TetrahedronLett.2002，43：7809-7812；de Visser等人，Tetrahedron Lett 2003 44：9013-9016；Montanari等人.J.Am.Chem.Soc.2004，126：9528；Brittain等人，Nature Biotechnol.2005 23：463-468；Markowicz等人，Synthesis2004 80-86；Mizuno等人，Chem.Lett 2005 34：426-427)，寡聚糖的纯化(参见Palmacci等人，Angew.Chem.Int.Ed 2001，40：4433；Manzoni，Chem.Commun.2003，2930-2931和Goto等人，Synlett 2004，2221-2223)。氟的亲合性策略也已经用于寡核苷酸的纯化(参见Pearson等人，J.Org.Chem.2005 70：7114-7122；Beller，Helv.Chim.Acta 2005，88：171-179；Berry等人，WO 2006/081035，U.S.Pat.出版物No.2006/0178507)，尽管这些报道仅仅公开了使用氟三苯甲基。如上所述，乙酸酯和三苯甲基封端基团常常不能在寡核苷酸合成中典型使用的脱保护条件下幸存。此外，Berry等人使用氟-DMTr来标记全长物质。它们的氟-纯化物质是全长产物加上预期缺失的寡核苷酸的分布(即n-1、n-2，等等)，这是由于末级亚磷酰胺将氟封端的核苷酸与所需要的链加上缺失材料的预存在分布偶合连接，其不能通过HPLC分辨，但可以通过毛细管电泳分析来检测。
通过提供基于亚磷的氟亲合封端来封端失效序列(其是可以独立于所使用核苷来使用的方法)，本发明解决了这些问题。该方法使用氟封端和氟亲和色谱的联用，结果得到高产率和纯度的不含失效序列(甚至具有长的(>15mer)寡聚物)的非封端寡核苷酸。
本发明概述
上述目的是通过封端通式(I)的化合物获得的：
PR1R2R3
(I)
其中R1选自C1-C8烷氧基-、C1-C8链烯氧基-和C1-C8炔基氧基-，其任选被CN取代；
R2是卤素或NR4 2；
R3具有式-L-A；
每个R4是C1-C6烷基或结合形成4至7元杂环，其任选被1至3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-，C1-C6卤代烷基-，C1-C6烷氧基-，芳基C1-C6烷氧基-，氧代-和C1-C6烷氧羰基；
L是C1-C10亚烷基氧基-，其任选被1-3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-，C1-C6卤代烷基-，C1-C6烷氧基-，芳基C1-C6烷氧基-，氧代-和C1-C6烷氧羰基-；和
A是C1-C30全氟烷基。
在另一个方面，本发明提供了抑制寡核苷酸延长的方法，包括使寡核苷酸与式(I)的封端试剂接触。
在一个实施方案中，本发明提供了制备包含X个核苷酸的修饰的寡核苷酸的方法，其中X是至少为3的整数；该方法包括：
(a)使每个包含X-n个核苷酸或核苷单元的许多寡核苷酸与修饰的核苷酸接触，其中n是1至X-1的整数；和
(b)使(a)的未反应产物与式(I)的封端试剂接触。
在另一个实施方案中，本发明提供了制备包含X个单体单元的寡核苷酸的方法，其中X是至少为3的整数；该方法包括：
(a)使每个包含X-n个单体单元的许多寡聚物与单体接触，其中n是1至X-1的整数；
(b)使(a)的未反应产物与式(I)的封端试剂接触；和
(c)利用氟亲和色谱法，从(b)的剩余产物中分离非封端寡聚物。
在又一个实施方案中，本发明还提供了利用本发明方法制备的、包含全氟化烷基团的修饰的寡核苷酸。
按照另一个实施方案，本发明还提供了一种寡核苷酸，其包含至少一种包括下式的修饰核苷部分：
Nu～PO2R3NR4
其中Nu是核苷；
R3具有式-LA；
每个R4是C1-C6烷基或结合形成4至7元杂环，其任选被1至3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-，C1-C6卤代烷基-，C1-C6烷氧基-，芳基C1-C6烷氧基-，氧代-和C1-C6烷氧羰基；
L是C1-C10亚烷基氧基-，其任选被1-3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-，C1-C6卤代烷基-，C1-C6烷氧基-，芳基C1-C6烷氧基-，氧代-和C1-C6烷氧羰基-；
A是C1-C30全氟烷基；和
～表示与核苷的羟基氧的连结点。
在又一个实施方案中，本发明还提供了包含寡核苷酸和本发明的封端试剂的组合物、试剂盒和系统。
参考下列说明和附图，可以理解本发明的前述及其它特征。
附图的简要说明
图1显示了固体相寡核苷酸合成循环。
图2显示了寡核苷酸从固体载体上裂解。
图3显示了氟亚磷酰胺(氨基亚磷酸酯)(phosphoramidite)封端试剂的合成。
图4举例说明了氟-亲和纯化法。
图5显示了粗品氟-封端的T-15的HPLC分析，显示了失效和正确序列的存在。
图6显示了通过FLUORO-PAKTM氟柱体过滤的产物的HPLC分析。
图7显示了通过氟柱体过滤(用40％乙腈/0.1M TEAA洗涤柱)后从柱中释放的杂质的HPLC分析。
图8显示了NAP-10脱盐步骤之后的过滤物的HPLC分析。
本发明的详细说明
I.定义
在详细地描述本发明之前，应该理解，本发明不局限于具体组合物或方法，其当然可以变化。还应该理解，本文使用的术语仅仅是为了理解具体实施方案的说明，并不是用来加以限制。进一步的，除非另外定义，本文使用的所有技术和科学名词具有与本发明所涉及的本领域普通技术人员通常所理解的含义的相同含义。在描述和主张本发明的过程中，可以按照下面列出的定义来使用下列术语和语法变体。
术语“一个”或“一种”是指一个或多个；例如，聚合物是指一或多种聚合物。因此，术语“一个”或“一种”在本文中可互换使用。
本文使用的术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“拥有”或其任何其它变体，是用来覆盖非排它性的内容。例如，包括一系列要素的工艺、方法、物品或装置不一定仅仅限于那些要素，但可以包括其它非明确列出的、或这种工艺、方法、物品或装置所固有的其它要素。进一步的，除非与此相反地明确陈述，“或者”是指包括在内的或者，并且不是排它性的或者。例如，下列之一满足条件A或B：A是真实的(或者存在的)且B是假的(或不存在的)，A是假的(或者不存在的)且B是真实的(或者存在的)，和A和B都是真实的(或者存在的)。
“烷基”是指直链、支链或者环状饱和烃部分，并且包括所有的位置异构体，例如甲基，乙基，丙基，1-甲基乙基，丁基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，1，1-二甲基乙基，戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2，2-二甲丙基，1-乙基丙基，己基，1，1-二甲基丙基，1，2-二甲丙基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基，正己基，环己基，正庚基，正辛基，2-乙基己基，正壬基，正癸基等等。烷基典型地包含大约1-20个碳原子，且更典型地包含大约2-15个碳原子。烷基可以是取代或未取代的烷基。
本文使用的术语“取代”意在包括有机化合物的所有允许的取代基。在广泛的方面，允许的取代基包括有机化合物的非环形和环状的、支链和直链的、碳环和杂环的、芳香和非芳香性的取代基。说明性的取代基包括例如下述的那些。取代基可以是多种基团，并且包括例如，R’，-卤素，-OR’，-NR’R”，-SR’，-SiR’R”R”’，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO2R’，-CONR’R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR’-C(O)NR”R”’，-NR”C(O)2R’，-NH-C(NH2)＝NH，-NR’C(NH2)＝NH，-NH-C(NH2)＝NR’，-S(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)2NR’R”，-NR’S(O)2R”，-CN和-NO2，数目从零至(2m′+1)，其中m′是这种原子团中的碳原子的总数。R’、R”和R”’各自独立地指的是氢、未取代的C1-8烷基、未取代的杂烷基、未取代的或取代的芳基、未取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基或C1-8硫烷氧基或未取代的芳基-C1-4烷基。当R’和R”与相同氮原子相连接时，它们可以与氮原子结合，形成3-、4-、5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。以本身或作为另一个基团的一部分的形式使用的术语“酰基”，是指原子团的最靠近连接点的碳上的两个取代基被取代基＝O取代的烷基(例如-C(O)CH3、-C(O)CH2CH2OR’等等)。对于合适的有机化合物，允许的取代基可以是一个或多个，并且可以是相同或不同的。对本发明来说，杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或本文描述的有机化合物的任何允许的取代基，只要其满足杂原子的原子价即可。本发明不想被有机化合物的可容许的取代基以任何方式来限制。
本文使用的术语“烷氧基(alkoxyl)”或“烷氧基(alkoxy)”是指具有连接在其中的氧自由基的如上所述的烷基。代表性的烷氧基原子团包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，叔丁氧基等等。“醚”是通过氧共价连接的两个烃。因此，使烷基是烷氧基或构成烷氧基的烷基的取代基，例如可以由下列之一代表：-O-烷基，-O-烯基，-O-炔基等等。
“亚烯基氧基”是指包含氧原子的亚烯基，并且包括例如烯丙氧基等等。
“亚炔基氧基”是指包含氧原子的亚炔基，并且包括例如炔丙基氧基等等。
术语“芳烷氧基”是指直接与烷氧基连接的芳基。为了简便起见，作为上述组合术语的一部分的芳基也包括杂芳基。
“醇基”是指包含至少一个羟基的有机基团。
“卤素基团”是指包括卤素原子的基团，例如F、Cl、Br或I。
本文定义的“卤代烷基”是指一个或多个氢原子被卤素取代的上面定义的烷基，包括全卤代烷基，例如三氟甲基。
“杂寡聚物”是指包含两个或多个不同的单体残基的寡聚物。
本文使用的短语“保护基”是指暂时性的取代基，其保护潜在地反应性官能团免于不希望有的化学变化。这种保护基的例子包括羧酸的酯、醇的甲硅烷基醚、和醛和酮的缩醛和缩酮。已经评述了保护基化学性质的领域(Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups in OrganicSynthesis，2.sup.nd ed.；Wiley：New York，1991)。下列缩写指的是注明的保护基。“Tr”是指化合物Ph3C，亦称三苯基甲基，亦称三苯甲基。“MMTr”是指化合物(4-CH3OPh)C(Ph)2，亦称单甲氧基三苯甲基。“DMTr”是指化合物(4-CH3OPh)2CPh，亦称二甲氧基三苯甲基。“TBDMS”是指化合物叔丁基二甲基甲硅烷基。“TES”是指化合物三乙基甲硅烷基。“TIPS”是指化合物三异丙基甲硅烷基。“Boc”是指化合物(CH3)3CO2C，亦称叔丁氧羰基。“Cbz”是指化合物PhCH2O2C，亦称苄氧羰基。“Piv”是指化合物(CH3)3CO，亦称新戊酰。
术语“许多”是指一种以上；例如，许多聚合物是指两种或多种聚合物。
本文使用的术语“寡聚物”和“聚合物”通常指的是将一个或多个小分子(称为单体)的重复单元连接在一起所制备的分子。通常，寡聚物比聚合物包含更少的单体单元，不过在寡聚物和聚合物之间的准确界线不是很清晰，对于本发明的目的，这两个术语可以互换使用，从而包括两个术语的全部范围。寡聚物可以具有不同数目的重复单元。寡聚物可以与标记物或标志物连接。
核酸的“序列”是指核酸中的核苷酸的顺序和特性。序列典型地以5′至3′方向读出。
术语“单体”是指能够聚合的化合物。术语“单体单元”是指在聚合物中重复的单元。
术语“核酸”是指核苷酸(例如核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，二脱氧核苷酸，等等)和包含这种核苷酸的聚合物(以直链或支链方式共价连接在一起)((例如“寡核苷酸”)，其包括脱氧核糖核酸(DNAs)、核醣核酸(RNAs)、DNA-RNA杂化物、寡核苷酸、多核苷酸、基因、cDNAs、核酸适配子、反义核酸、干扰RNAs(RNAis)、分子信标、核酸探针、肽核苷酸(PNAs)、PNA-DNA共轭物、PNA-RNA共轭物等等)。寡核苷酸典型地是单股或双股的，并且通常含有磷酸二酯键，不过在某些情况下(如本文所列出的)，包括核酸类似物，其可以具有替换的骨架，包括例如但不限于磷酰胺(Beaucage等人(1993)Tetrahedron 49(10)：1925)，和其中的参考文献；Letsinger(1970)J.Org.Chem.35：3800；Sprinzl等人(1977)Eur.J.Biochem.81：579；Letsinger等人(1986)Nucl.Acids Res.14：3487；Sawai等人(1984)Chem.Lett.805；Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；和Pauwels等人(1986)Chemica Scripta 26：1419)，phosphorothioate(Mag等人(1991)Nucleic Acids Res.19：1437；和U.S.Pat.No.5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：2321)，O-甲基磷酰氨基(phophoroamidite)连接基(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，Oxford UniversityPress(1992))，和肽核酸骨架和连接基(参见，Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114：1895；Meier等人(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31：1008；Nielsen(1993)Nature 365：566；Carlsson等人(1996)Nature 380：207)。其它类似核酸包括下列：带有正电荷骨架的那些(Denpcy等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6097)；带有非离子骨架的那些(U.S.Pat.Nos.5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863；Angew(1991)Chem.Intl.Ed.English 30：423；Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；Letsinger等人(1994)Nucleoside & Nucleotide13：1597；2和3章，ASC Symposium Series 580，＂CarbohydrateModifications in Antisense Research＂，Ed.Y.S.Sanghvi和P.Dan Cook；Mesmaeker等人(1994)Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4：395；Jeffs等人(1994)J.Biomolecular NMR 34：17；Tetrahedron Lett.37：743(1996))和带有非核糖骨架的那些，包括描述在下列中的那些：U.S.Pat.Nos.5,235,033和5,034,506，和6和7章，ASC Symposium Series 580，Carbohydrate Modifications in Antisense Research，Ed.Y.S.Sanghvi and P.Dan Cook。含有一或多种碳环形糖的核苷酸也包括在核苷酸的定义之内(参见Jenkins等人(1995)Chem.Soc.Rev.pp.169-176)。一些核酸类似物也描述在例如下列中：Rawls，C & E News1997年6月2日，第35页。可以进行核糖-磷酸酯骨架的这些修饰，从而便于加入额外部分，例如标记物，或改变这种分子在生理环境中的稳定性和半衰期。除了典型地在核酸中发现的天然存在的杂环碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外，核酸类似物也包括那些具有非天然存在的杂环碱基的类似物。尤其是，许多非天然存在的碱基进一步在例如下列中进行了描述：Seela等人(1991)Helv.Chim.Acta 74：1790，Grein等人(1994)Bioorg.Med.Chem.Lett.4：971-976，和Seela等人(1999)Helv.Chim.Acta82：1640。为了进一步举例说明，任选包含在核苷酸中充当熔点(Tm)调节剂所使用的某些碱基。例如，一些碱基包括7-去氮嘌呤(例如，7-去氮鸟嘌呤、7-去氮腺嘌呤等等)，吡唑并[3，4-d]嘧啶，丙炔基-dN(例如丙炔基-dU，丙炔基-dC等等)，等等。参见例如，Seela等人U.S.Pat.No.5,990,303。其它代表性的杂环碱基包括例如次黄嘌呤，次黄嘌呤核苷，黄嘌呤；2-氨基-嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基-嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷和黄嘌呤的7-去氮杂-8-氮杂衍生物；6-氮杂胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘代胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘代尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶，等等。
“核苷”是指包含碱基或碱性基(例如包含至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基和/或类似的基团)的核酸组份，碱基或碱性基与糖部分(例如核糖等等)、糖部分的衍生物或糖部分的功能等效物(例如类似物，例如碳环)共价连接。例如，当核苷包含糖部分时，碱基典型地与糖部分的1′位置连接。如上所述，碱基可以是天然存在的(例如嘌呤碱基，例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，嘧啶碱基，例如胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U))，或是非天然存在的(例如7-去氮杂嘌呤碱基，吡唑并[3，4-d]嘧啶碱基，丙炔基-dN碱基，等等)。示范性的核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、二脱氧核糖核苷、碳环核苷，等等。
“核苷酸”是指核苷的酯，例如核苷的磷酸酯。例如，核苷酸可以包括1、2、3或更多个磷酸基，其与核苷的糖部分的5′位置共价连接。
“寡核苷酸”是指包含至少两个核苷酸的核酸，典型地包含3个以上核苷酸，且更典型地多于10个核苷酸。寡核苷酸的确切规模通常取决于各种因素，包括寡核苷酸的最终的功能或用途。本文使用的术语“寡核苷酸”是指核苷酸或其化学修饰物的单股链，例如在其糖部分中具有2′O-4′C-亚甲桥的核苷酸，其是构成锁核酸(LNA)的核苷酸。修饰物包括但不局限于：给单一核苷酸或其相应的碱基或给整个寡核苷酸提供其它化学基团的那些，该化学基团可以引入额外电荷、可极化性、氢键合、静电相互作用和官能团。这种修饰包括但不局限于：修饰的碱基，例如2′-位置糖修饰，5-位置嘧啶修饰，8-位置嘌呤修饰，在胞嘧啶环外胺的修饰，5-溴-尿嘧啶的取代；骨架修饰，甲基化，碱基(其可以是异常碱基对组合的一部分，例如异碱基异胞嘧啶核苷和异胍等等)。修饰进一步包括连接的标记物和报道分子，例如荧光染料、生物素、小沟结合物等，这些为本领域技术人员所已知。此外，修饰包括修饰的寡核苷酸骨架，实例是肽核苷酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA、甲基膦酸酯DNA及其它本领域技术人员已知的修饰，如Micklefield(2001)Current MedicinalChemistry 8：1157-1179所做的评述。在本发明中所提及的寡核苷酸可以由核苷酸与其上述修饰的任何组合所组成，并且可以具有几个例如至多20个、或许多例如20至几百或更多个核苷酸结合进它们的链中，在本发明的上下文中，核苷酸的总数表示为n。
术语“失效序列”、“污染聚合物”和“污染衍生物”可互换使用，指的是在聚合物合成期间形成的不能由所需要数目的单体和/或所需要的单体序列组成的那些聚合物。因此，这些代表在合成的聚合物中的杂质。典型地在聚合物合成过程中将失效序列进行封端，并由此将其转变为截短序列。失效序列包括本文所定义的污染衍生物，具有1至X-1的链长，其中X是至少为3的整数。
本文使用的“封端”和“封端步骤”指的是在固相聚合物合成期间聚合物例如寡核苷酸链的游离羟基或适合于链延伸的任何其它官能团与封端试剂进行反应，使得链不能参与随后的偶合步骤。对于寡核苷酸合成，封端可以在3′至5′延长的寡核苷酸的5′-官能团上或在5′至3′延长的寡核苷酸的3′-官能团上进行。在固相聚合物合成的偶合步骤和下一个脱保护步骤的中间进行封端步骤。本发明实施方案的封端试剂包括能够在合成后除去污染聚合物的官能团，如下面所定义。
本文使用的术语“封端”或“封端基团”是指在聚合物合成的封端步骤期间在失效序列上引入的、可防止聚合物延长的化学基团，所述聚合物例如是与其相连接的核酸。举例来说，本发明核苷酸的5′-位置的亚磷酰胺(phosphoramidite)封端基团包括氟基团。代表性的封端基团和封端单体也在本文中得到了进一步的描述。
“亲合”是指污染聚合物与固相的结合，固相是本文表示的“亲合载体”。本文使用的术语“亲合”是指固相，该固相是用能够与通过封端引入污染聚合物中的相应官能团形成强烈结合的部分衍生化的。就氟亲和色谱法来说，固相可以用氟部分衍生化。所述衍生是通过将所述部分与固相上的官能团进行连接来实现的。这些官能团包括但不局限于多氟烷烃等等。
本文使用的“固相”是指不溶于介质的树脂、膜或聚合物，该介质是在进行本发明聚合物的合成或纯化的具体反应或单元操作中使用的。固相可以具有无机性质，包括但不限于无机氧化物，例如硅胶、矾土、分子筛和可控孔度玻璃(CPG)，或有机性质，包括但不限于聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、其它合成聚合物、碳水化合物例如纤维素和淀粉或其它聚合碳水化合物、或其它有机聚合物和任何共聚物、复合材料、或上述无机或有机物质的组合。此外，固相可以由可以被迫使进行相变的可溶性聚合物组成，例如聚乙二醇和它们的衍生物，如下列所描述：Bayer等人(1972)Nature 237：512-513。
“延长”是指增加或另外引入(例如共价结合)一个或多个额外单体例如核苷酸的聚合物例如核酸。当额外核苷酸(或其它类似分子)结合进核酸中时，核酸是“延伸”或“延长的”。例如，可以通过核苷酸引入生物催化剂来延长核酸，生物催化剂例如在核酸的3′终端典型地添加核苷酸的聚合酶。核酸也可以通过化学反应来延长，例如DNA合成反应。
“可伸长的”是指可以增加或共价结合至少一个其它单体的聚合物例如寡或多核苷酸，例如在DNA合成反应中，或在用结合单体的生物催化剂催化的反应中。
“非可伸长的”是指阻滞进一步延长(即不再加入或共价结合核苷酸)的聚合物例如寡或多核苷酸，例如在DNA合成反应中，或在用结合单体的生物催化剂催化的反应中。
术语“封端”是指单体或寡聚物的特征，例如包含封端基团的核苷酸或寡核苷酸。对于核苷酸，其通常在核苷酸的糖部分的5′位置或3′位置。
术语“亲脂性的”或“亲油性”典型地是指：基于烃基团所在溶剂的熵的提高，烃基团的结合倾向。这种效果尤其可在这种相互作用被称为＂疏水性的＂水中表示。
术语“氟的”是指高度氟化的有机部分。该部分可以是直链或支链C1-C30全氟化烷基。本文使用了相关术语“全氟烷基/氟的亲合性操作”，指的是携带一个或多个氟基团的封端试剂的配体，另外指的是用这种试剂合成的整个寡核苷酸，因此携带一个或多个这种氟基团。术语“氟相互作用”是指氟化分子与其它氟化物质结合的倾向。氟相互作用通常比亲脂性相互作用更强，其可以提供更小的封端，用于更有效地分离较长的分子。
术语“烃”是指由碳和氢原子组成的部分。烃的例子包括但不局限于烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳基烯基、芳基炔基等等。
“部分”或“基团”是指将某物例如分子分成几部分的一部分(例如官能团、取代基团等等)。例如，核苷酸典型地包含碱基(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或类拟的碱基)、糖部分和一个或多个磷酸基。
“杂环”是指饱和、不饱和或芳香化的单环或多环，并且其包含一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。杂环可以通过任何杂原子或碳原子与本发明核苷酸的糖部分或其类似物连接。示范性的杂环包括吗啉基，吡咯烷酮基，吡咯烷基，哌啶基，乙内酰脲基，戊内酰胺基，氧杂环丙基，氧杂环丁烷基，四氢呋喃基，四氢吡喃基，四氢吡啶基，四氢嘧啶基，四氢噻吩基，四氢硫吡喃基，四氢嘧啶基，四氢噻吩基，四氢硫吡喃基，呋喃基，苯并呋喃基，噻吩基，苯并噻吩基，吡咯基，吲哚基，异氮茚基，氮杂吲哚基，吡啶基，喹啉基，异喹啉基，噁唑基，异噁唑基，苯并噁唑基，吡唑基，咪唑基，苯并咪唑基，噻唑基，苯并噻唑基，异噻唑基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，三嗪基，噌琳基，酞嗪基，喹唑啉基，等等。
“全长序列”是指包含与参比序列至少基本上相同数目核苷酸的核酸序列，或与参比序列至少部分互补的核酸序列。在本发明的某些实施方案中，例如，延长的引物核酸与模板核酸的全长序列或其它参比序列互补。
术语“连接”是指相互作用，包括但不限于共价键、离子键、化学吸附、物理吸附和其组合。
“连接基”是指将化合物或取代基团与例如固体载体、另一种化合物或基团等等共价或非共价(例如离子，等等)连接的化学部分。例如，连接基可以将标记物(例如荧光染料、放射性同位素，等等)与核苷酸等等连接。连接基典型地是双功能的化学部分，在某些实施方案中，它们包括可裂解的连接，这种连接可以通过例如加热、化学酶、化学试剂、电磁辐射等等来裂解，从例如固体载体、另一种化合物等等中释放物质或化合物。连接基的仔细选择可以使裂解在与化合物的稳定性和试验方法不矛盾的合适条件下进行。通常，除了例如将化学物种连接在一起或在这种物种之间保持最短距离或其它空间关系之外，连接基没有特定的生物活性。然而，可以选择连接基的组成部分，以影响所连接化学物种的一些性能，例如三维构象、净电荷、疏水性等等。连接基分子的其它说明提供于例如下列中：Lyttle等人，(1996)Nucleic Acids Res.24(14)：2793，Shchepino等人，(2001)Nucleosides，Nucleotides，& NucleicAcids 20：369，Doronina等人，(2001)Nucleosides，Nucleotides，& NucleicAcids 20：1007，Trawick等人，(2001)Bioconjugate Chem.12：900，Olejnik等人，(1998)Methods in Enzymology 291∶135，和Pljevaljcic等人，(2003)J.Am.Chem.Soc.125(12)：3486。
“标记物”或“标志物”是指与分子连接的(共价或非共价)或能够连接的部分，该部分提供或能够提供关于分子的信息(例如关于分子的描述、鉴别等等信息)。示范性的标记物包括荧光标记物、弱的荧光标记物、非荧光标记物、量热标记物、化学发光标记物、生物发光标记物、放射性标记物、质量改变基团、抗体、抗原、生物素、半抗原和化学酶(包括例如过氧化物酶、磷酸酶等等)。
II.简介
现在转向下列说明书和附图，本发明提供了基于亚磷的氟化寡核苷酸封端试剂、以及使用对那些氟封端的寡核苷酸(其是寡核苷酸化学合成反应的有害的副产物，例如失效和消除序列等等)具有更大亲合性的分离介质来纯化未封端的靶向寡核苷酸的方法。
III.利用单个核苷酸延长来合成寡核苷酸
本发明通常涉及使用封端试剂或封端单体来封端和/或阻滞聚合物例如寡核苷酸延长的方法。对于寡核苷酸，该方法包括：(a)使许多寡核苷酸与修饰的核苷酸或核苷接触；和(b)使(a)的未反应产物与封端试剂接触，包括全氟烷基亲合性操作。
典型地，所合成的寡核苷酸包含至少3个单体单元。
在其它实施方案中，对于步骤(a)和(b)，寡聚物与固体载体相连接。在其它实施方案中，在步骤(c)之前，寡聚物从固体载体上裂解，在步骤(c)中，通过氟亲合性方法，所需要的靶向序列的非封端寡聚物从封端截取的寡聚物中分离。适合于本发明的固体载体的例子包括但不局限于玻璃(典型地是衍生化的可控孔度玻璃(CPG))；硅胶，矾土，分子筛，合成聚合物或共聚物，例如聚苯乙烯；其组合，等等。
本发明的方法和组合物适合用于多种聚合物或寡聚物的合成和纯化。在一些实施方案中，本发明提供了合成和纯化生物多聚体的组合物和方法。在一个实施方案中，寡聚物是寡核苷酸，其用于举例说明本发明。
可以使用本领域众所周知的标准技术，在固相上合成寡核苷酸，例如下列中的亚磷酰胺(phosphoramidite)法：Beaucage等人，1981，Tetrahedron Lett.22：1859-1862；和下列中的固体载体方法：U.S.Pat.No.4,458,066；T.Brown & D.J.S.Brown，Oligonucleotides and Analogues-APractical Approach，(1991)(Eckstein，F.，publ.IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford，New York，Tokyo)；McBride和Caruthers，(1983)Tetrahedron Letters 24：245-248和Sinha等人，(1983)TetrahedronLetters 24：5843-5846，下列中的磷酸三酯法：Narang等人，(1979)Meth.Enzymol.68：90-99；下列中的磷酸二酯方法：Brown等人，(1979)Meth.Enzymol.68：109-151；下列中的亚磷酰胺法：Matteucci等人，(1981)J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191；以及本领域已知的其它方法。这种合成方法基本上基于亚磷酰胺或氢膦酸酯的逐步反应和这些单体结构单元的连续结合，形成寡聚物。举例来说，图1描绘了寡核苷酸的合成循环，按照本发明的某些实施方案，产生具有正确序列的寡核苷酸和具有错误或失效序列的封端寡核苷酸的不同比例混合物。在完好的糖环(例如戊糖环)或糖类似物环(例如碳环等等)的3′或5′位置，可以通过羟基延长核苷酸。仅仅为了举例说明起见，图1显示：合成是在3′至5′方向上通过在生长链的5′端增加核苷酸进行的。进一步的，尽管图1仅仅显示了一对单体的延长和封端，但不能通过所合成或纯化的核苷酸的数目或规模来限制本发明。在这个方向上的合成是使用核苷酸亚磷酰胺(phosphoramidite)进行的，其中亚磷酰胺(phosphoramidite)基团与3′-氧和保护或封端基团(例如带负电的封端基团、体积大的(bulky)封端基团和/或类似的基团)相连接。
在固体载体方法中，初始核苷酸与固体载体偶合。通过核苷酸的序列增加，寡核苷酸被延长，直到获得所需要的序列为止。序列的延长包括下列步骤：
1.从部分合成的、载体结合的寡核苷酸链上除去保护基，产生反应性的羟基；
2.通过亚磷酸酯连接基，使核苷酸与载体结合的寡核苷酸偶合；
3.将亚磷酸酯连接基氧化，得到磷酸酯连接基；和
4.将在任何不延长的、载体结合的寡核苷酸上的未反应的羟基封端。
开始时，核苷酸1a和1b的5′-羟基也可以用能够选择性除去的合适保护基来封端或保护。合适保护基的例子包括但不局限于三苯甲基例如4，4′-二甲氧三苯甲基(DMT)，甲硅烷基例如叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)；酰基例如叔丁氧羰基(BOC)，等等。当在这个方向合成时，在除去最后保护基之前获得的产物是带有保护基的寡核苷酸，保护基与5′端连接。
或者，通过在生长链的3′端增加核苷酸，可以在5′至3′方向进行寡核苷酸的合成。在这个方向上的合成是使用核苷酸亚磷酰胺(phosphoramidite)进行的，其中亚磷酰胺(phosphoramidite)基团与5′-氧和保护基相连接，且典型地，二甲氧三苯甲基与3′-氧相连接。当在这个方向合成时，在除去最后保护基之前获得的产物是带有保护基的寡核苷酸，保护基与3′端连接。
在5′至3′方向合成，可以提供便利的合成寡核苷酸的方法，其中封端基团与3′末端氧连接。在给寡核苷酸链增加最后的核苷酸之后省略脱保护步骤，可以导致带有保护(即封端)基团的寡核苷酸的合成，保护基团与3′末端氧连接。
在解封闭或去保护步骤中，除去5′-羟基保护基，形成带有游离5′-羟基的化合物2a和2b。除去具体保护基的条件取决于所使用的保护基。就DMT来说，可以通过加入酸来将其除去，例如在二氯甲烷中的二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(TCA)。
在偶合或核苷酸缩合步骤中，2a和2b的5′-羟基与活化的核苷酸2c结合，形成延长的特定序列的核苷酸。核苷酸的活化可以如下实现：在四唑化合物的存在下，使用核苷亚磷酰胺，然后其与第一个核苷酸的5′-羟基结合，形成亚磷酸酯连接基3a。
随后氧化，将3b的磷酸酯连接基转化为4b的磷酸酯连接基。氧化条件的例子包括稀碘水溶液(在吡啶和四氢呋喃中)。
不论所使用的方法，在每个合成循环中，要有封端步骤，在封端步骤中，将封端引入到生长的寡核苷酸链的未反应的末端官能团中，该寡核苷酸链在先前的偶合步骤2a中未能延长。将未延长的核苷酸封端3a，以使它们在随后的序列延长循环中不再反应，形成带有消除序列的寡核苷酸。
当不限制时，可以在合成寡核苷酸期间通过封端试剂来使寡核苷酸封端，封端试剂包括在THF/吡啶中的乙酸酐和N-甲基咪唑的混合物，其在每个偶合循环的最后通过柱。各种碱性化合物可用于调节反应混合物的pH值，碱性化合物包括但不限于KOH、NaOH等等，以及本领域普遍认识的许多其它的碱性化合物。核苷酸典型地是限制试剂。虽然任选使用其它温度条件，但这些合成反应通常在室温或其附近进行。尽管不限制，这些反应通常进行大约100至500秒钟。
可以在氧化步骤之前进行封端步骤。然后重复这些步骤中的每一个步骤，直到所需要序列的寡核苷酸已经合成为止。
在最后的延长步骤之后，按照本领域已知的固相寡核苷酸合成的标准技术，从固体载体上裂解寡核苷酸。例如，如图2所示，可以通过在碱中培养产物大约6至24小时来进行裂解，碱包括但不限于氨、氢氧化铵等等。粗品是所需要的寡核苷酸、失效序列、裂解的基团和反应溶液的混合物。在该步骤之内，可以除去或不除去寡核苷酸5b的末端保护基。设计本发明的封端，以使它们在寡核苷酸的合成和后处理期间是稳定的。
由此，获得全长寡核苷酸产物5b和失效/污染的截短序列4a的混合物。在从固体载体上裂解之后，在减压条件下，将反应混合物至少部分地或完全浓缩，以便除去溶剂和挥发性试剂。在某些实施方案中，可以将合适的含水缓冲液加入到残余溶液或聚合物产物混合物的固体残余物中。可以按照下面更详细描述的内容，将由此获得的部分浓缩的溶液或固体残余物纯化。
优选，在可商购的自动化DNA合成仪(例如ABI 394 DNA合成仪，得自于Applied Biosystems，Foster City，Calif)中、使用可商购的核苷亚磷酰胺(例如，得自于Glen Research，Sterling，VA)来进行合成反应。用于在5′至3′方向合成的核苷亚磷酰胺(其含有与3′氧连接的二甲氧三苯甲基)也可从Glen Research(Sterling，Va.)商购。
示范性的封端寡聚物的合成描述在实施例中。其它封端的寡聚物可以使用标准合成法、用类似方式合成。
由此，在一组实施方案中，本发明提供了制备包含X个核苷酸或核苷的修饰的寡核苷酸的方法，其中X是至少为3的整数；该方法包括：
(a)使每个包含X-n个核苷酸或核苷单元的许多寡核苷酸与修饰的核苷酸或核苷接触，其中n是1至X-1的整数；和
(b)使(a)的未反应产物与封端试剂接触，封端试剂包括全氟烷基亲合性操作。在另一组实施方案中，固体载体选自玻璃、硅胶、矾土、分子筛、合成聚合物或共聚物和其组合。在另一组实施方案中，修饰的核苷酸是带保护基的核苷酸。在另一组实施方案中，从3′至5′制备寡核苷酸。在另一组实施方案中，从5′至3′制备寡核苷酸。在另一组实施方案中，封端试剂是本文所描述实施方案中的一种。
IV.封端试剂
此外，本发明也提供了封端试剂和制备封端试剂的方法。封端包括氟亲合性操作(这种操作可以利用氟亲和色谱法来保持)，以使寡聚物由大约4和100之间或更多单体组成。在各组实施方案中，可以从较短的失效序列中纯化4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或大于100个单体。这种亲合性操作的例子包括但不局限于全氟化烷基团。由此，在本发明的一个实施方案中，封端是用能够与氟亲合性载体结合的氟部分衍生的。当进行氟基亲和纯化法时，那么氟封端与失效序列偶合，使失效序列选择性地保留在氟亲合性载体上。
亲合性操作(handle)可以连接于各种封端官能团，封端官能团包括但不局限于亚磷酰胺或氯亚磷酸酯。
相应地，在本发明的一个实施方案中，在寡核苷酸合成反应中使用基于氟基亲和纯化法。在该实施方案之内，使用基于亚磷的氟封端试剂。按照本发明的基于亚磷的氟封端试剂通常用式(I)描述：
PR1R2R3
(I)
其中R1选自C1-C8烷氧基-、C1-C8链烯氧基-和C1-C8炔基氧基-，其任选被CN取代；
R2是卤素或NR4 2；
R3具有式-L-A；
每个R4是C1-C6烷基或结合形成4至7元杂环，其任选被1至3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-，C1-C6卤代烷基-，C1-C6烷氧基-，芳基C1-C6烷氧基-，氧代-和C1-C6烷氧羰基；
L是C1-C10亚烷基氧基-，其任选被1-3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-，C1-C6卤代烷基-，C1-C6烷氧基-，芳基C1-C6烷氧基-，氧代-和C1-C6烷氧羰基-；和
A是C1-C30全氟烷基。
在某些实施方案中，R1是-OCH3。在另一组实施方案中，R1是-OCH2CH＝CH2。在另一组实施方案中，R1是-OCH2CH2CN。
在某些实施方案中，R2是卤素。在另一组实施方案中，R2选自-N(Me)2、-N(Et)2、-N(Pr)2、-N(i-Pr)2、1-吡咯烷基、1-哌啶基、4-吗啉基和1-咪唑基。在另一组实施方案中，R2是-N(i-Pr)2。
在某些实施方案中，R3具有式-O-(CH2)m(CF2)pCF3；m在大约1和大约30之间。在各组实施方案中，m是1，2，3，4，5，6，7，8，9或10，和p是0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，2l，22，23，24，25，26，27，28，29或30。在另一组实施方案中，m是3，和p是7。
按照本发明的封端化合物可以用多种方式合成。在某些情况下，可以从可商购的前体物开始。图3举例说明了本发明的基于亚磷的氟封端试剂的合成。此外，图3b显示了合成按照本发明一个实施方案的2-氰乙基-N′，N′-二异丙基3-全氟烷基-丙氧基-亚磷酰胺的步骤。全氟代醇，例如3-(全氟代辛基)丙醇和3-(全氟代己基)丙醇可从公司例如FluorousTechnologies，Inc.(Pittsburgh，Pa.)商购。卤代亚磷酰胺，例如2-氰乙基二异丙基氯亚磷酰胺，可从公司例如Sigma-Aldrich，Inc.(St Louis，Mo.)商购。
已经证明，使用按照本发明的化合物来封端核酸和提供所需要序列的核酸的纯化操作是特别有利的，尤其与传统的封端试剂例如乙酸酐相比。一个优点是在宽范围的pH值条件下的化学稳定性。本方法的另一个优点是其可以使全长寡核苷酸容易从失效序列中分离出来。由于纯化的效率，可以以高产率和纯度获得全长寡核苷酸。
与制备本发明的封端试剂相关的其它合成路径及其它方面提供于下面的实施例中。各种合成技术可以适合于本发明的合成方案，其例子通常是已知的，并且描述在例如下列中：March，Advanced OrganicChemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，4thEd.，John Wiley &Sons，Inc.(1992)，and Carey and Sundberg，Advanced Organic ChemistryPart A：Structure and Mechanism，4th Ed.，Plenum Press(2000)。用于本发明封端试剂的合成的化学起始原料及其它反应组分可以很容易地得自于各种商业供应商，包括例如：Sigma-Aldrich，Inc.(St Louis，Mo.)和Fluorous Technologies，Inc.(Pittsburgh，Pa.)。
封端试剂可以在使用之前通过各种分离技术纯化，分离技术包括但不限于液相色谱，等等。可以在纯化封端试剂中使用或可以采用的各种分离技术进一步描述在例如下列中：Skoog等人，Principles ofInstrumental Analysis，5th Ed.，Harcourt Brace College Publishers(1998)和Currell，Analytical Instrumentation：Performance Characteristics andQuality，John Wiley & Sons，Inc.(2000)。
V.寡核苷酸的氟亲和纯化法
在氟的亲合中，将含有全氟烷基或氟基团的分子纯化，利用其对于全氟化介质的亲合性。氟的亲合相互作用很强，并且不同于其它类型的亲合相互作用(例如亲油性)。由此，在一个实施方案中，通过用氟封端基团将失效序列封端，而后使用氟分离技术将封端分子与正确序列的寡聚物分离，可以从失效序列中将正确序列的寡聚物纯化出来。氟分离技术的例子包括但不局限于：氟亲和色谱法例如高效液相色谱(HPLC)，用氟的反相硅胶(FRPSG)过滤进行固相提取(“SPE”或“柱纯化”)(参见例如液相抽提)等等。
现在转向图4，本发明的寡核苷酸纯化方法通常用示意图描绘，包括下列顺序的步骤。由此，在利用下列(a)和(b)如上所述制备寡核苷酸之后：(a)使寡核苷酸与修饰的核苷酸或核苷接触；和(b)使(a)的未反应产物与包括全氟烷基亲合操作的封端试剂接触，利用下列方法纯化寡核苷酸：(c)利用氟亲合方法，从(b)的封端截取的寡聚物中分离所需要靶向序列的非封端寡聚物。在另一组实施方案中，许多寡聚物在步骤(a)和(b)中与固体载体相连接，并且在步骤(c)之前从固体载体上裂解。
更尤其是，继续参考图4，使寡核苷酸合成产物和试剂的非均匀混合物(包含氟封端的失效序列寡核苷酸4a)通过含有吸附剂或介质的滤筒或柱，吸附剂或介质在固体载体上携带氟亲合基团，导致氟封端的寡核苷酸失效序列的捕获，得到复合物5a。带有氟封端的寡核苷酸4a的非所要求物质与吸附剂相互作用，因此，用至少第一种合适溶剂洗涤吸附剂，可以洗脱所需要的非封端寡核苷酸5b，仅仅剩下复合物5a。然后可以用第二种更亲氟溶剂洗涤，可以将非所要求的氟封端的寡核苷酸5b从吸附剂上解分离。如果保留了氟封端的失效序列寡核苷酸，那么非封端的寡核苷酸5b是最后的纯化目标化合物。
由此，在另一组实施方案中，纯化包括：
(i)使步骤(b)的产物通过氟亲合性介质，以使封端的寡聚物被所述氟亲合性介质吸附；和
(ii)从氟亲合性介质中洗涤出所需要靶向序列的非封端寡聚物。
在其它实施方案中，如果在随后纯化中要求所使用的分离介质更具亲合作用，可以在本说明书公开的任何试剂中使用一个以上的氟基团。这可以通过下列方式实现：将一个以上氟基团与亚磷骨架连接，或利用可容纳一个或多个支链氟链的连接基。
分离介质包括表明与本发明寡核苷酸试剂的氟基团具有强相互作用的任何基团。由此，在一个实施方案中，分离介质可以采用常规亲脂性反相吸附剂的形式，反相吸附剂基于硅胶、聚(二乙烯基苯)或与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯的基质。在其它实施方案中，分离介质包含携带氟化基团的反相吸附剂，包括例如携带氟化有机基团的聚合物(例如聚(二乙烯基苯)或与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯)或硅胶基质。虽然在实践中可以使用携带亲氟基团的任何固体或液相，示范性的可替代吸附剂包括FLUOROFLASH(Fluorous Technologies，Inc.)、携带氟化基团的硅胶基材料和POLY-PAK(Glen Research Corporation)和OPC(AppliedBiosystems，Inc.)滤筒，它们使用聚合物的反相吸附剂。
VI.核苷酸和核苷酸组合物
本发明还提供了核苷酸、寡核苷酸及其它组合物，例如试剂溶液和反应混合物，其包含至少一种本文描述的封端试剂或部分。在一些实施方案中，本发明提供了包括下式的修饰的核苷部分：
Nu～PO3R3
其中Nu是核苷；
R3具有式-LA；
L是C1-C10亚烷基氧基-，其任选被1-3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-，C1-C6卤代烷基-，C1-C6烷氧基-，芳基C1-C6烷氧基-，氧代-和C1-C6烷氧羰基-；
A是C1-C30全氟烷基；和
～表示与寡核苷酸的羟基氧的连结点。在一些实施方案中，核苷可以包括常规保护基。本文提供了这种交替性试剂(即包含至少一种永久引入的氟基团的核苷试剂)的更具体例子。在其它实施方案中，本发明提供了通过本文所描述方法制备的寡核苷酸。
在一些实施方案中，组合物还可以包括任选连接修饰核苷或寡核苷酸的固体载体。固体载体的例子包括但不局限于玻璃、硅胶、矾土、分子筛、合成聚合物或共聚物和其组合。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文所描述封端试剂的试剂溶液。在其它实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文所描述封端部分的反应混合物。在这些实施方案之内，组合物可以进一步包含下列中的至少一种：(a)至少一种溶剂；(b)至少一种可伸长的单体，例如核苷酸或修饰核苷酸；(c)至少一种催化剂；和(d)至少一种缓冲液。在组合物中，封端试剂或部分与其它组份的比例取决于组合物的其它组份的性质和制备组合物的方法。本发明组合物的进一步的非限制性例子提供于实施例中。
VIII.试剂盒
本发明还提供了试剂盒，例如用于合成和纯化寡核苷酸的试剂盒。该试剂盒包含至少一种本文所描述的封端试剂作为组分。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含下列中的一或多种：(a)至少一种可伸长的单体，例如核苷酸或修饰的核苷酸或亚磷酰胺；(b)至少一种固体载体；(c)至少一种用于延长寡核苷酸的催化剂；(d)至少一种缓冲液；(e)至少一套用于利用试剂盒组分延长寡核苷酸例如核酸的说明书；和(f)至少一个用于包装试剂盒组分的容器。
下列实验性的实施例进一步说明本文其它地方所描述的使用氟封端的寡核苷酸试剂的前述方法。提供下列实施例仅仅作为举例说明之用，不是用来限制所主张发明的范围的。通过阅读上文和下述的实施例，在实施例之后的权利要求范围内的本发明许多实施方案对本领域普通技术人员是显而易见的。
实施例
常规分析法
所有的TLC分析是使用下列进行的：EM Science #5715-7，硅胶60F254，0.25mm厚度TLC平板。所有的GC色谱是使用下列获得的：HP5890Series II气相色谱仪，带有FID检测器和Agilent #19091Z-413，HP-1，30m x 0.32mm，25微米柱。所有的NMR谱是使用Bruker 270MHz NMR获得的。
实施例1
封端试剂1的制备：2-氰乙基-N′，N′-二异丙基3-全氟己基-丙氧基-亚磷酰胺
| 起始原料 | FW | d | 数量 | mmol. | Eq. |
| Rf6丙醇 | 378.14 | 0.945g | 2.50 | 1.00 | |
| 氯代亚磷酰胺 | 236.68 | 1.06 | 0.670mL | 3.00 | 1.20 |
| Hunig′s碱 | 101.29 | 0.73 | 1.25mL | 8.98 | 3.59 |
| CH2Cl2 | 40mL |
示范性的氟衍生化的亚磷酰胺4e的合成通常是如下和按照下面图4所列内容获得的。在100mL圆底烧瓶中，将Rf6丙醇(945mg，2.50mmol，1.0当量)(FTI目录#f017029)和Hunig′s碱(1.25mL，8.98mmol，3.60当量)溶于40mL的CH2Cl2中。然后用5分钟加入2-氰乙基二异丙基氯代亚磷酰胺(Aldrich目录#30,230-9)(670μL，3.0mmol，1.20当量)，并在室温下继续搅拌。1小时之后，利用TLC(洗脱液：20％乙酸乙酯/己烷；显色：KMnO4染色；Rf6丙醇：Rf＝0.30；产物亚磷酰胺：Rf＝0.70)观测到丙醇消失，反应完成。用CH2Cl2(60mL)稀释反应，用H2O、饱和NaHCO3溶液和饱和NH4Cl溶液(各自25mL)快速洗涤有机层。通过旋转蒸发来浓缩CH2Cl2层，使残余物通过硅胶过滤(在60mL多孔玻璃漏斗中)，使用20％乙酸乙酯/己烷(～150mL)。通过旋转蒸发来浓缩滤液，真空干燥，提供澄清的无色油。下列分子式的分子量是578.36：C18H24F13N2O2P。产率：1.20g，81％产率。纯度：>95％，GC。1H NMR(CDCl3)δ：3.57-3.87(m，6H)，2.65(t，2H)，2.10-2.38(m，2H)，1.89-2.01(m，2H)，1.17-1.21(2个重叠双峰，12H)。
实施例2
封端试剂2的制备：2-氰乙基-N′N′-二异丙基-3-全氟辛基-丙氧基亚磷酰胺
| 起始原料 | FW | d | 数量 | mmol. | Eq. |
| Rf8丙醇 | 478.14 | 1.2g | 2.51 | 1.00 | |
| 氯代亚磷酰胺 | 236.68 | 1.06 | 0.670mL | 3.00 | 1.20 |
| Hunig′s碱 | 101.29 | 0.73 | 1.25mL | 8.98 | 3.58 |
| CH2Cl2 | 40mL |
在100mL圆底烧瓶中，将Rf8丙醇(1.20g，2.51mmol，1.0当量)和Hunig′s碱(1.25mL，8.98mmol，3.58当量)溶于40mL的CH2Cl2中。然后用5分钟加入氯代亚磷酰胺(670μL，3.0mmol，1.20当量)，并在室温下继续搅拌。1小时之后，利用TLC(洗脱液：20％乙酸乙酯/己烷；显色：KMnO4染色；Rf8丙醇：Rf＝0.30；产物亚磷酰胺：Rf＝0.70)观测到丙醇消失，反应完成。用CH2Cl2(60mL)稀释反应，用H2O、饱和NaHCO3溶液和饱和NH4Cl溶液(各自25mL)快速洗涤有机层。通过旋转蒸发来浓缩CH2Cl2层，使残余物通过硅胶过滤(在60mL多孔玻璃漏斗中)，使用20％乙酸乙酯/己烷(～150mL)。通过旋转蒸发来浓缩滤液，真空干燥，提供橙色油。下列分子式的分子量是678.36：C20H24F17N2O2P。产率：1.40g，82％产率。纯度：>88％，GC。1H NMR(CDCl3)δ：3.57-3.87(m，6H)，2.65(t，2H)，2.10-2.38(m，2H)，1.89-2.01(m，2H)，1.17-1.21(2个重叠双峰，12H)。
实施例3
i.使用氟封端试剂(PFC8C3亚磷酰胺)的自动化、循环固相寡核苷酸合成方法
使用脱三苯甲基循环和改进的封端方案，在ABI 394仪器上合成多聚T(T-15)序列。以各个核苷酸增加步骤的偶合效率降低的方式来设计该实验。这可以通过将亚磷酰胺浓度从标准0.1M降低至0.02M来实现。效率降低可以确保产生足够浓度的截短序列，以使该实施例清楚地说明从失效序列中快速纯化出所需要的寡核苷酸的本发明的实用性。加入标准碱性亚磷酰胺，使用标准1umol合成循环，偶合时间30s。将PFC8C3亚磷酰胺溶于乙腈中，浓度0.1M，并放置在DNA合成仪上的位置5的瓶中。用PFC8C3亚磷酰胺+活化剂偶合循环来替代标准封端循环，偶合时间200秒。对寡核苷酸进行标准脱保护条件(30％氢氧化铵，在55℃，过夜)，在-20℃存储，直到滤筒纯化需要为止。使等分样品脱盐进入带有NAP-10柱的1X TE中，利用离子交换HPLC分析，使用氯化钠/20mM氢氧化钠的梯度，在Dionex Nucleopak-100柱上。
ii寡脱氧核糖核苷酸脱保护
从柱中除去固体载体，并在封闭管中、在室温下与1ml浓氢氧化铵接触4小时。然后过滤除去载体，并将含有部分保护的寡脱氧核糖核苷酸的溶液调到55℃，保持5小时。可以除去氨，然而，本发明的优点是残余物可以按照下述直接纯化，不用除去氨。
实施例4
通过氟滤筒纯化，从未保护的寡核苷酸中除去封端的失效序列
对于寡核苷酸纯化，使用固相提取(“SPE”或“滤筒纯化”)来说明氟方法的应用性。用相等体积的荷载缓冲液(10％氯化钠和5％二甲基甲酰胺，在水中)(从Berry and Associates，Dexter，MI购买)稀释粗品脱保护的寡核苷酸(4a和5b)。还可以从Berry and Associates，Dexter，MI.，购买氟亲合性滤筒(fluoro-pak II)，通过2mL乙腈、而后通过2mL 0.1M三乙基乙酸铵(TEAA)、而后进一步通过2mL荷载缓冲液来将其预处理。按照制造商的建议，在这些步骤中，维持每滴2秒钟的流速。粗品寡核苷酸的纯化是如下实现的：使寡核苷酸和荷载缓冲液混合物以每滴5秒钟的流速简单地通过预处理柱，由此使所需要的全长寡核苷酸通过柱，并且定量保留污染的氟封端的失效序列。额外的快速NAP-10脱盐步骤足以从寡核苷酸中除去氨和盐。从氟滤筒中洗脱失效序列，用阴离子交换HPLC分析。
这些粗品寡核苷酸混合物的HPLC分析表明，氟封端的全长寡核苷酸很好地保留在氟HPLC吸附剂上。为了说明保留幅度，图5显示了粗品氟封端的T-15的HPLC分析，显示了失效和正确序列的存在。图6显示了通过FLUORO-PAKTM氟柱体过滤的产物的HPLC分析。洗脱物显示了封端寡聚物(失效序列)的完全结合，而大部分非氟物质(正确序列)未能结合。对于长的寡核苷酸，基于DMT的纯化不能获得这种水平的选择性。图7显示了通过氟柱体过滤(用40％乙腈/0.1M TEAA洗涤柱)后从柱中释放的杂质的HPLC分析。洗脱液显示除去了失效序列。这些图表明，氟封端的物质4a牢固地保留在非氟封端的15-mers上，只有当梯度组分中的乙腈比率接近50％时才洗脱。应该注意的是，无梯度洗脱可以使保留时间产生更大的差别。图8显示了在NAP-10脱盐步骤之后含有氟纯化的15-mer寡核苷酸的滤液的HPLC分析。这些实施例表明，本方法可以使全长寡核苷酸容易从失效序列中分离出来。由于纯化的效率，可以以高产率和纯度获得全长寡核苷酸。
将该说明书中引用的所有出版物、专利、登录号和专利申请引入本文作为参考，对于所有目的，如同每个单一的出版物或专利申请是具体地和单独地注明被引入作为参考那样。
尽管为了清楚理解而通过举例说明和实施例已经相当详细地描述了前述发明，但在不背离本发明精神或本文和在附加权利要求书中所定义的范围的条件下，可以按照这种发明的教导进行某些变化和改进，这对本领域普通技术人员是显而易见的。例如，如上所述的所有技术和装置可以在不同组合中使用。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.具有式(I)的化合物：
PR1R2R3
(I)
其中R1选自C1-C8烷氧基、C2-C8链烯氧基和C2-C8炔基氧基，其任选被CN取代；
R2是卤素或-NR4 2；
R3具有式-L-A；
每个R4是C1-C6烷基或结合形成4至7元杂环，其任选被1至3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基；
L是C1-C10亚烷基氧基-，其任选被1-3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基-；和
A是C2-C30全氟烷基；
并且其中烷基是指直链、支链或环状饱和烃部分。
2.权利要求1的化合物，其中R1是-OCH3。
3.权利要求1的化合物，其中R1是-O-CH2CH＝CH2。
4.权利要求1的化合物，其中R1是-OCH2CH2CN。
5.权利要求1的化合物1，其中R2是卤素。
6.权利要求1的化合物，其中R2选自-N(Me)2、-N(Et)2、-N(Pr)2、-N(i-Pr)2、1-吡咯烷基、1-哌啶基、4-吗啉基和1-咪唑基。
7.权利要求1的化合物，其中R2是-N(i-Pr)2。
8.权利要求1的化合物，其中R3具有式-O-(CH2)m(CF2)pCF3；m是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，和p是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
9.权利要求8的化合物，其中m是3，和p是5。
10.权利要求8的化合物，其中m是3，和p是7。
11.抑制寡核苷酸延长的方法，该方法包括：在用或不用催化剂的条件下，使寡核苷酸与一种化合物接触，所述化合物具有式(I)：
PR1R2R3
(I)
其中R1选自C1-C8烷氧基、C2-C8链烯氧基和C2-C8炔基氧基，其任选被CN取代；
R2是卤素或-NR4 2；
R3具有式-L-A；
每个R4是C1-C6烷基或结合形成4至7元杂环，其任选被1至3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基；
L是C1-C10亚烷基氧基-，其任选被1-3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基-；和
A是C1-C30全氟烷基；
并且其中烷基是指直链、支链或环状饱和烃部分。
12.制备包含X个核苷酸的修饰的寡核苷酸的方法，其中X是至少为3的整数；该方法包括：
(a)使每个包含X-n个核苷酸单元的许多寡核苷酸与修饰的核苷酸或核苷接触，其中n是1至X-1的整数；和
(b)使(a)的未反应产物与封端试剂接触，封端试剂包括具有式(I)的化合物：
PR1R2R3
(I)
其中R1选自C1-C8烷氧基、C2-C8链烯氧基和C2-C8炔基氧基，其任选被CN取代；
R2是卤素或-NR4 2；
R3具有式-L-A；
每个R4是C1-C6烷基或结合形成4至7元杂环，其任选被1至3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基；
L是C1-C10亚烷基氧基-，其任选被1-3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基-；和
A是C1-C30全氟烷基；
其中烷基是指直链、支链或环状饱和烃部分。
13.一种寡核苷酸，其包含至少一种包括下式的修饰核苷部分：
Nu～PO2R3NR4 2
其中Nu是核苷；
R3具有式-LA；
每个R4是C1-C6烷基或结合形成4至7元杂环，其任选被1至3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基；
L是C1-C10亚烷基氧基-，其任选被1-3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基-；
A是C1-C30全氟烷基；和
～表示与核苷的羟基氧的连结点；
其中烷基是指直链、支链或环状饱和烃部分。
14.一种组合物，其包含至少一种权利要求1至10或权利要求13的化合物。
15.制备核酸的试剂盒，其包含至少一种权利要求1至10或权利要求13的化合物和下列中的至少一种：(a)至少一种可伸长的单体；(b)至少一种固体载体；(c)至少一种用于延长寡核苷酸的催化剂；(d)至少一种缓冲液；(e)至少一套指示用试剂盒的组分来延长寡核苷酸的说明书；和(f)至少一个用于包装试剂盒组分的容器。
Claims (17)
1.具有式(I)的化合物：
PR1R2R3
(I)
其中R1选自C1-C8烷氧基、C1-C8链烯氧基和C1-C8炔基氧基，其任选被CN取代；
R2是卤素或NR4 2；
R3具有式-L-A；
每个R4是C1-C6烷基或结合形成4至7元杂环，其任选被1至3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基；
L是C1-C10亚烷基氧基-、其任选被1-3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基-；和
A是C1-C30全氟烷基。
2.权利要求1的化合物，其中R1是-OCH3。
3.权利要求1的化合物，其中R1是-O-CH2CH＝CH2。
4.权利要求1的化合物，其中R1是-OCH2CH2CN。
5.权利要求1的化合物1，其中R2是卤素。
6.权利要求1的化合物，其中R2选自-N(Me)2、-N(Et)2、-N(Pr)2、-N(i-Pr)2、1-吡咯烷基、1-哌啶基、4-吗啉基和1-咪唑基。
7.权利要求1的化合物，其中R2是-N(i-Pr)2。
8.权利要求1的化合物，其中R3具有式-O-(CH2)m(CF2)pCF3；m是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，和p是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
9.权利要求1的化合物，其中m是3，和p是5。
10.权利要求1的化合物，其中m是3，和p是7。
11.抑制寡核苷酸延长的方法，该方法包括：在用或不用催化剂的条件下，使寡核苷酸与权利要求1的化合物接触。
12.制备包含X个核苷酸的修饰的寡核苷酸的方法，其中X是至少为3的整数；该方法包括：
(a)使每个包含X-n个核苷酸单元的许多寡核苷酸与修饰的核苷酸或核苷接触，其中n是1至X-1的整数；和
(b)使(a)的未反应产物与封端试剂接触，封端试剂包括全氟烷基亲合性操作。
13.制备包含X个核苷酸的修饰的寡核苷酸的方法，其中X是至少为3的整数；该方法包括：
(a)使每个包含X-n个核苷酸单元的许多寡核苷酸与修饰的核苷酸或核苷接触，其中n是1至X-1的整数；和
(b)使(a)的未反应产物与封端试剂接触，封端试剂包括权利要求1的化合物。
14.一种寡核苷酸，其包含至少一种包括下式的修饰核苷部分：
Nu～PO2R3NR4
其中Nu是核苷；
R3具有式-LA；
每个R4是C1-C6烷基或结合形成4至7元杂环，其任选被1至3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基；
L是C1-C10亚烷基氧基-，其任选被1-3个选自下列的取代基取代：C1-C6烷基-、C1-C6卤代烷基-、C1-C6烷氧基-、芳基C1-C6烷氧基-、氧代-和C1-C6烷氧羰基-；
A是C1-C30全氟烷基；和
～表示与核苷的羟基氧的连结点。
15.一种组合物，其包含至少一种权利要求1至10或权利要求14的化合物。
16.制备核酸的试剂盒，其包含至少一种权利要求1至10或权利要求14的化合物。
17.用于制备核酸的权利要求16的试剂盒，进一步包含下列中的至少一种：(a)至少一种可伸长的单体；(b)至少一种固体载体；(c)至少一种用于延长寡核苷酸的催化剂；(d)至少一种缓冲液；(e)至少一套指示用试剂盒的组分来延长寡核苷酸的说明书；和(f)至少一个用于包装试剂盒组分的容器。
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