CN115942939A - 用于核苷酸探针的非对映体连接试剂 - Google Patents
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Abstract
一种具有非核苷酸单体单元以及与所述非核苷酸单体单元连接的第一和第二偶联基团的多功能试剂,所述非核苷酸单体单元包含对映体中心并具有配体。所述试剂允许制备具有任何所需核苷酸和非核苷酸单体单元的序列的多功能核苷酸/非核苷酸聚合物,所述多功能核苷酸/非核苷酸聚合物中的每一个都带有所需的配体。这些聚合物可以例如用作探针,其可表现出提高的灵敏度和/或能够检测属的核苷酸,其中所述属的每个种具有由不同的非目标序列桥接的共同的目标靶核苷酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及非对映非核苷酸试剂及其混合物,它们可以方便地允许单个或多个部分(例如标记物、嵌入剂、金属颗粒、活性物质(reactive species)或复合颗粒)连接到核苷酸探针或寡核苷酸上的任何特定预选位置。
发明背景
在临床研究和诊断中,用于确定特定RNA或DNA核苷酸序列(“靶核苷酸序列”或简称为“靶序列”)的存在的已知技术是进行核酸杂交测定。在这样的测定中,选择具有与靶序列的至少一部分互补的核苷酸序列的核苷酸多聚体探针(通常是寡核苷酸)。通常,探针是标记的,即,它带有一个与其连接的原子或基团,所述原子或基团的存在可以很容易地检测到。当标记探针暴露于怀疑含有靶核苷酸序列的测试样品时,在杂交条件下,靶标将与任何所述标记探针杂交。样品中靶序列的存在可以定性或定量地确定,通常通过分离杂交和未杂交的探针,然后通过确定探针杂交体中标记物的存在或通过确定非杂交探针中标记物的量来确定杂交的标记探针的量来进行。存在多种用于标记寡核苷酸的方法。此类方法包括:放射性标记;将生物素部分连接到尿苷类似物的嘧啶环的C-5位置,然后酶促引入寡核苷酸中;末端标记,更适合作为固相寡核苷酸合成的最后一步的标记物附着;和核苷酸连接磷酸基团的衍生物,其亲核部分可以在它们引入寡核苷酸后被标记,仅举几例。上述每种方法都存在环境和健康安全(例如放射性)等缺点;敏感性问题;特异性问题;或自动化问题等。本公开内容涉及使用与自动寡核苷酸合成相容的对映体富集试剂来提高核酸杂交测定的灵敏度和特异性。
发明内容
本公开内容涉及对映体特异性非核苷酸试剂,其具有可引入核酸中的非核苷酸单体单元。非核苷酸试剂——也称为连接试剂(linking reagent)——可以置于核苷酸序列主链内的任何位置。显然,可以将连接试剂合成为具有核酸合成中常用的保护基团,并且可以使用各种核酸合成方法将其引入核酸中。连接试剂可以允许连接其他化学部分,例如(但不限于)可检测的标记物、嵌入剂、螯合剂、金属颗粒、活性物质、复合颗粒(compositeparticles)、药物、激素、蛋白质、肽、半抗原(haptens)、自由基产生剂、核溶解剂、蛋白水解剂、催化剂、受体结合物质、其他具有生物学意义的结合物质、改变核酸跨生物屏障转运的试剂和改变核苷酸多聚体溶解性的试剂。
在一个实施方案中,是一种非对映体连接试剂,其包含基于R对映体亚磷酰胺的化合物,具有下式:D—X1—R2(X3—M)n—Z。在这些实施方案中,“Z”可以是连接到R2末端的反应性含磷基团,第一个核苷酸的OH基团或通过可裂解的酯键连接到R2末端的DNA合成载体(DNA synthesis support)。“R2”可以是与X1以及Z相连的长度为2-20个原子的原子链。R2对DNA合成和脱保护条件稳定。“X1”可以是O、S、NH或-N=N-。“D”可以是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除后允许X1与第二个核苷酸的磷基团偶联。每个“X3”可以独立地是在第一端连接到R2并在第二端连接到M的接头臂(linker-arm)。X3对DNA合成和脱保护条件稳定。每个“M”可以独立地是对DNA合成和去保护条件稳定的标记物,或是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除后允许X3偶联到标记物。“n”是正整数。
在另一个实施方案中,是一种非对映体连接试剂,其包含基于S对映体亚磷酰胺的化合物,具有下式:D—X1—R2(X3—M)n—Z。在这些实施方案中,“Z”可以是连接到R2末端的反应性含磷基团,第一个核苷酸的OH基团或通过可裂解的酯键连接到R2末端的DNA合成载体。“R2”可以是与X1以及Z相连的长度为2-20个原子的原子链。R2对DNA合成和脱保护条件稳定。“X1”可以是O、S、NH或-N=N-。“D”可以是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除后允许X1与第二个核苷酸的磷基团偶联。每个“X3”可以独立地是在第一端连接到R2并在第二端连接到M的接头臂(linker-arm)。X3对DNA合成和脱保护条件稳定。每个“M”可以独立地是对DNA合成和去保护条件稳定的标记物,或是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除后允许X3被偶联到标记物。“n”是正整数。
在一个实施方案中,是一种非对映体连接试剂,其包含基于R对映体亚磷酰胺的化合物,具有下式:Z—X1—R2(X3—M)n—D。在这些实施方案中,“Z”可以是连接到R2末端的反应性含磷基团,第一个核苷酸的OH基团或通过可裂解的酯键连接到R2末端的DNA合成载体。“R2”可以是与X1以及Z相连的长度为2-20个原子的原子链。R2对DNA合成和脱保护条件稳定。“X1”可以是O、S、NH或-N=N-。“D”可以是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除后允许X1与第二个核苷酸的磷基团偶联。每个“X3”可以独立地是在第一端连接到R2并在第二端连接到M的接头臂(linker-arm)。X3对DNA合成和脱保护条件稳定。每个“M”可以独立地是对DNA合成和去保护条件稳定的标记物,或是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除后允许X3被偶联到标记物。“n”是正整数。
在一个实施方案中,是一种非对映体连接试剂,其包含基于S对映体亚磷酰胺的化合物,其具有式:Z—X1—R2(X3—M)n—D。在这些实施方案中,“Z”可以是连接到R2末端的反应性含磷基团,第一个核苷酸的OH基团或通过可裂解的酯键连接到R2末端的DNA合成载体。“R2”可以是与X1以及Z相连的长度为2-20个原子的原子链。R2对DNA合成和脱保护条件稳定。“X1”可以是O、S、NH或-N=N-。“D”可以是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除后允许X1与第二个核苷酸的磷基团偶联。每个“X3”可以独立地是在第一端连接到R2并在第二端连接到M的接头臂(linker-arm)。X3对DNA合成和脱保护条件稳定。每个“M”可以独立地是对DNA合成和去保护条件稳定的标记物,或是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除后允许X3被偶联到标记物。“n”是正整数。
通常,对于任何上述连接试剂,Z可能具有下式:
当这种情况发生时,“X2”可以是卤素或取代的氨基。“R3”可以是烷基、烷氧基或苯氧基。“X4”可以是卤素、氨基或O-。“R5”可以是烷基、烷氧基、芳氧基或H,然而,仅当X4是O-时,R5可以是H。在一个实施方案中,Z可以具有下式:
当这种情况发生时,X2可以是Cl或仲氨基,并且R3可以是氯苯氧基、甲氧基、乙氧基或β-氰基乙氧基。或者,X2可以是二异丙基氨基、二甲基或吗啉代。
通常,对于任何上述连接试剂,Z可具有下式:
当这种情况发生时,X4可以是Cl、仲氨基或O-,并且R5可以是甲氧基、乙氧基、一氯苯氧基、β-氰基乙氧基或H,然而,仅当X4是O-时,R5可以是H。
对于任何上述连接试剂,特别是当Z是反应性含磷基团时,X1可以是O。
对于任何上述连接试剂,R2可以是任选地被一个或多个杂原子取代的烃链,所述一个或多个杂原子各自独立地可以是氧、氮或硫。此外,X3可以独立地为NH、O、S、-NNH-、或长度为1-25个原子的末端为NH、O、S或-NNH-的链。当X3是原子链时,它可以是任选地被一个或多个独立地选自氧、氮或硫的杂原子取代的烃链。在一个实施方案中,R2可以是无环的。在另一个实施方案中,R2可以是无环烃链。上述烃链的长度可为2至10个碳原子。或者,烃链的长度可为2至3个碳原子。此外,n可以是1。
对于任何上述连接试剂,R2可以是无环烃链。通常,烃链具有2至10个碳原子的长度,或者具有2至3个碳原子的长度。此外,n可以是1。
对于任何上述连接试剂,特别是当Z是反应性含磷基团时,X3可以通过碳连接到R2和通过氮连接到M。此外,M可以独立地为三氟乙酰基或9-三芴基甲氧基羰基。
对于任何上述连接试剂,D可以是三苯甲基或二甲氧基三苯甲基。
对于任何上述连接试剂,M可以是对DNA合成和去保护条件稳定的标记物。
对于任何上述连接试剂,特别是当Z是反应性含磷基团时,M可以是保护基团,其可被除去以允许X3偶联到所述标记物。
在一个实施方案中,是一种非对映体连接试剂,其包含基于R对映体亚磷酰胺的化合物,其具有下式:
在这些实施方案中,“Z”可以是反应性含磷基团、第一个核苷酸的OH基团或连接至DNA合成载体的可裂解的酯(cleavable ester)。“D”可以是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除时允许所述非核苷酸连接试剂与第二个核苷酸偶联。“i”可以是0、1、2或3,j可以是0、1、2或3,条件是i+j为至少1。“L1”可以是第一接头臂。“L2”可以是H或非连接烷基链或非连接混合烷基链或第二接头臂。当L1和L2不相同时,它们所连接的碳是R对映体。或者,当L1和L2不相同时,它们所连接的碳是S对映体。通常,第一接头臂(linker-arm)和第二接头臂各自独立地具有下式:(CH2)k—NH—(CO—(CH2)qNH)r—M。“M”可以独立地是H、芴基甲氧基羰基、三氟乙酰基或对DNA合成和去保护条件稳定的标记物。“k”可以是介于0和4之间的整数,包括0和4。“q”可以是介于1和11之间的整数,包括1和11。每个“r”可以独立地为0、1或2,条件是所述第一接头臂和所述第二接头臂中的每个k+1+(2+q)r独立地为介于1和25之间的整数,包括1和25。
在另一个实施方案中,是非对映体连接试剂,其包含基于S对映体亚磷酰胺的化合物,其具有下式:
在这些实施方案中,“Z”可以是反应性含磷基团、第一个核苷酸的OH基团或连接至DNA合成载体的可裂解的酯。“D”可以是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除时允许所述非核苷酸连接试剂与第二个核苷酸偶联。“i”可以是0、1、2或3,j可以是0、1、2或3,条件是i+j为至少1。“L1”可以是第一接头臂。“L2”可以是H或非连接烷基链或非连接混合烷基链或第二接头臂。当L1和L2不相同时,它们所连接的碳是R对映体。或者,当L1和L2不相同时,它们所连接的碳是S对映体。通常,第一接头臂和第二接头臂各自独立地具有下式:(CH2)k—NH—(CO—(CH2)qNH)r—M。“M”可以独立地是H、芴基甲氧基羰基、三氟乙酰基或对DNA合成和去保护条件稳定的标记物。“k”可以是介于0和4之间的整数,包括0和4。“q”可以是介于1和11之间的整数,包括1和11。每个“r”可以独立地为0、1或2,条件是所述第一接头臂和所述第二接头臂中的每个k+1+(2+q)r独立地为介于1和25之间的整数,包括1和25。
在另一个实施方案中,是一种非对映体连接试剂,其包含基于R对映体亚磷酰胺的化合物,其具有下式:
在这些实施方案中,“Z”可以是反应性含磷基团、第一个核苷酸的OH基团或连接至DNA合成载体的可裂解的酯。“D”可以是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除时允许所述非核苷酸连接试剂与第二个核苷酸偶联。“i”可以是0、1、2或3,j可以是0、1、2或3,条件是i+j为至少1。“L1”可以是第一接头臂。“L2”可以是H或非连接烷基链或非连接混合烷基链或第二接头臂。当L1和L2不相同时,它们所连接的碳是R对映体。或者,当L1和L2不相同时,它们所连接的碳是S对映体。通常,第一接头臂和第二接头臂各自独立地具有下式:(CH2)k—NH—(CO—(CH2)qNH)r—M。“M”可以独立地是H、芴基甲氧基羰基、三氟乙酰基或对DNA合成和去保护条件稳定的标记物。“k”可以是介于0和4之间的整数,包括0和4。“q”可以是介于1和11之间的整数,包括1和11。每个“r”可以独立地为0、1或2,条件是所述第一接头臂和所述第二接头臂中的每个k+1+(2+q)r独立地为介于1和25之间的整数,包括1和25。
在另一个实施方案中,是非对映体连接试剂,其包含基于S对映体亚磷酰胺的化合物,其具有下式:
在这些实施方案中,“Z”可以是反应性含磷基团、第一个核苷酸的OH基团或连接至DNA合成载体的可裂解的酯。“D”可以是可改变或可去除的保护基团,其在改变或去除时允许所述非核苷酸连接试剂与第二个核苷酸偶联。“i”可以是0、1、2或3,j可以是0、1、2或3,条件是i+j为至少1。“L1”可以是第一接头臂。“L2”可以是H或非连接烷基链或非连接混合烷基链或第二接头臂。当L1和L2不相同时,它们所连接的碳是R对映体。或者,当L1和L2不相同时,它们所连接的碳是S对映体。通常,第一接头臂和第二接头臂各自独立地具有下式:(CH2)k—NH—(CO—(CH2)qNH)r—M。“M”可以独立地是H、芴基甲氧基羰基、三氟乙酰基或对DNA合成和去保护条件稳定的标记物。“k”可以是介于0和4之间的整数,包括0和4。“q”可以是介于1和11之间的整数,包括1和11。每个“r”可以独立地为0、1或2,条件是所述第一接头臂和所述第二接头臂中的每个k+1+(2+q)r独立地为介于1和25之间的整数,包括1和25。
通常,对于任何上述连接试剂,Z可具有以下公式:
当这种情况发生时,“X2”可以是卤素或取代的氨基。“R3”可以是烷基、烷氧基或苯氧基。“X4”可以是卤素、氨基或O-。“R5”可以是烷基、烷氧基、芳氧基或H,然而,仅当X4是O-时,R5可以是H。在一个实施方案中,Z可具有下式:
当这种情况发生时,X2可以是Cl或仲氨基,并且R3可以是氯苯氧基、甲氧基、乙氧基或β-氰基乙氧基。或者,X2可以是二异丙基氨基、二甲氨基或吗啉代(morpholino)。
通常,对于任何上述连接试剂,Z可具有下式:
当这种情况发生时,X4可以是Cl、仲氨基或O-,并且R5可以是甲氧基、乙氧基、一氯苯氧基、β-氰基乙氧基或H,然而,仅当X4是O-时,R5可以是H。
对于任何上述连接试剂,j可以是0。对于任何上述连接试剂,L2可以是H。对于任何上述连接试剂,L2可以是H且j可以是0。对于任何上述连接试剂,i可以是1。对于任何上述连接试剂,j可以是0。对于任何上述连接试剂,i可以是1且j可以是1。对于任何上述连接试剂,r可以是0。对于任何上述连接试剂,r可以是0且R5可以是H。对于任何上述连接试剂,q可以是1和6之间的整数,包括1和6。对于任何上述连接试剂,q可以是1和6之间的整数,L2可以是H且j可以是0。对于任何上述连接试剂,k可以独立地是1和3之间的整数,包括1和3。对于任何上述连接试剂,i可以为0。对于任何上述连接试剂,L2可以是H且i可以是0。对于任何上述连接试剂,j可以是1。
通常,上述任何连接试剂都可以引入寡核苷酸中。所述寡核苷酸还可包括可检测标记物。
还考虑了制备上述连接试剂的方法。通常,通过合成接头和纯化异构体来制备连接试剂。或者,通过使用异构体特异性试剂合成接头来制备连接试剂,从而无需纯化异构体。
通常,上述连接试剂可以引入寡核苷酸中。在一个实施方案中,通过以下方式引入上述连接试剂:(a)在DNA合成条件下将连接试剂的反应性磷基团偶联至第一个核苷酸(first nucleotide)或链(chain)或多个核苷酸(nucleotides),和(b)去除保护基D以允许第二个核苷酸或第二连接试剂的活化的磷基团进行偶联。
还考虑了包括任何上述连接试剂以及使用说明书的试剂盒。或者,该试剂盒可包括引入序列的具有上述连接试剂的寡核苷酸和使用说明书中。试剂盒还可包括可与连接试剂或寡核苷酸结合使用的各种缓冲液或试剂。
还考虑了可以包括任何上述连接试剂的测定方法(assay)。或者,测定方法可以包括任何上述引入了连接试剂的寡核苷酸。测定方法还可以包括可以在测定方法中使用的各种缓冲液或试剂。
下文的简要概述提供对所要求保护主题的一些方面的基本理解。此概述并不是穷举式的综述,且并不意旨表明所要求保护主题的关键/重要元素或划定所要求保护主题的范围。其目的是以简化的形式提出一些构思引出下文呈现的更详细描述。
附图说明
现在将参考附图对本发明的实施方案进行描述,其中:
图1a显示了2-(3-N-三氟乙酰氨基丙基)-1,3-丙二醇(3)的制备;
图1b显示了将二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基添加到(3)以制备1-O-DMT-2-(3-N-三氟乙酰氨基丙基)-1,3-丙二醇(4);
图1c显示了(4)的磷酸化以制备2-(3-氨基丙基)-1,3-丙二醇亚磷酰胺接头试剂(linker reagent)(5)。
图2a显示了2,2-二-(三氟乙酰氨基丙基)-1,3-丙二醇(8)的制备;
图2b显示了将DMT保护基团加成到(8)以制备(9);
图2c显示了(9)的磷酸化以制备具有两个接头臂部分的2,2-二(ε-氨基丙基)-1,3-丙二醇亚磷酰胺试剂(10)。
图3a显示了O-DMT和N-三氟乙酰保护的3-氨基-1,2-丙二醇的中间体(12)的制备;
图3b显示了(12)的磷酸化以制备3-氨基-1,2-丙二醇亚磷酰胺接头试剂(13)。
图4a显示了1,2-异丙啶-6-叠氮基-1,2-己二醇(16)的制备;
图4b描绘了(16)的还原和用Fmoc保护氨基得到(18);
图4c显示了DMT保护基团的加成得到(19);
图4d显示了(19)的磷酸化以制备6-氨基-1,2-己二醇亚磷酰胺接头试剂(20)。
图5a描绘了具有氨基烷基羧基扩展的接头臂的三种试剂(21)、(22)和(23);
图5b是接头试剂(24),它是化合物(23)的进一步扩展的类似物。
图6a显示了Fmoc-甘氨酸与3-氨基-1,2-丙二醇的偶联得到(25);
图6b显示了(25)的DMT保护和磷酸化得到接头试剂(21)。
图7a描绘了氨基烷基羧酸的Fmoc保护和用三甲基乙酰氯活化得到(27)和(28);
图7b显示了来自图7a的活化中间体,以及其与3-氨基-1,2-丙二醇的反应,得到中间体(29)和(30)。
图8a描绘了(30)的DMT保护的衍生物与氢氧化铵反应以除去Fmoc;
图8b续图8a描绘了从(31)中除去Fmoc后的(32),以及通过与(28)的三甲基乙酰酐活化的中间体偶联进一步扩展氨基化合物(32),得到扩展的类似物(33)。
图9a显示了图7a的中间体(28),以及其与三甲基乙酰氯反应形成活化中间体(35),和其随后与(S)-3-氨基-1,2-丙二醇反应形成对映体中间体(36)。
图9b显示了图9a的中间体(36),以及其与4,4'-二甲氧基三苯甲基氯反应生成对映体中间体(37)。
图9c显示了图9b的中间体(37),以及其与2-氰乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺反应得到非对映体试剂(38)。
图10显示了包含(R)-3-氨基-1,2-丙二醇的非对映体试剂(39)。
图11显示了包含(S)-3-氨基-1,2-丙二醇但具有比试剂(38)更短和更长的烷基链长度的非对映体试剂(40-44),并显示了包含(R)-3-氨基-1,2-丙二醇但具有比试剂(39)更短和更长的烷基链长度的非对映体试剂(44-47)。
图12显示了非对映体试剂N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(48)和N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(49)。
图13显示了非对映体试剂N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(50)和N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(51)。
图14显示了非对映体试剂N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(52)和N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(53)。
图15显示了非对映体试剂N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(S)-2-氨基-1,3-丙二醇(54)和N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(R)-2-氨基-1,3-丙二醇(55)。
图16显示了包含5'-至-3'(R)-3-氨基-1,2-丙二醇部分的部分核酸结构(56)和包含5'-至-3'(R)-3-氨基-1,2-丙二醇部分的部分核酸结构(57)。各个(S)异构体在手性碳中心具有相反的构型。B1和B2替换任何核苷酸碱基。波浪线表示核苷酸/非核苷酸聚合物延伸的位置。
图17显示了分别包含(S)-2'-氨基-1,2-丙二醇和(R)-2'-氨基-1,2-丙二醇中间体的非对映体试剂(58)和(59)。
图18a和图18b显示了包含(S)-4-氨基丁烷-1,3-二醇和(R)-4-氨基丁烷-1,3-二醇中间体的非对映体试剂(60)、(61)、(62)和(63)。
具体实施方式
定义
如本文所用,除非另有说明,否则任何保护基团、氨基酸和其他化合物的缩写均按照它们的常用用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature)(参见生物化学(Biochem.)11:942-944(1972))。
核苷酸多聚体:由磷酸二酯键连接的核苷酸链,或其类似物。
寡核苷酸:核苷酸多聚体,通常长度为约10至约100个核苷酸,但长度可大于100个核苷酸。它们通常被认为是由核苷酸单体合成的,但也可以通过酶促方式获得。
多核苷酸:核苷酸多聚体,通常长度为约100个核苷酸或更长。然而,核苷酸多聚体也可以更短,长度在约15至约100个核苷酸的范围内(例如,对于微小核糖核酸(microRNA)(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)或转运RNA(tRNA)。这些通常是生物来源的或通过酶促方式获得。
核苷酸多聚体探针,或探针:核苷酸多聚体,其核苷酸序列与包含在第二个核苷酸多聚体(通常是多核苷酸)中的靶核苷酸序列互补。通常选择的探针与靶序列中的相应碱基完全互补。然而,在某些情况下,探针中的一个或多个核苷酸不与靶序列中的相应碱基互补可为足够的,甚至是合乎需要的。通常,探针与至少一个标记物相连接。
非核苷酸单体单位:是指不显著地参与聚合物杂化的单体单元。所述单体单元例如不得参与与核苷酸的任何重要氢键键合,并且将排除具有作为组分的5个核苷酸碱基或其类似物之一的单体单元;
标记物:可以通过共价或非共价方式与分子连接的原子、原子团或化合物,用于直接或间接检测和/或量化所述分子。直接标记物检测可能是由于它们的放射性或稳定同位素特性、化学发光、磷光、荧光、光学、电子密度或磁性。间接标记物检测可能是由于至少第二分子与标记物的复合物,其中所述至少第二分子连接到直接检测标记物(例如,连接到抗生物素蛋白或抗体的可检测标记物,所述抗生物素蛋白或抗体——分别络合生物素或半抗原标记物——与分子相连)。
对映体:一对立体异构体中的一个(I)是其对应物(II)的镜像。它是手性的,并且通常用前缀(R)-或(S)-表示。该术语可用于具有多个手性中心的分子中的特定手性位点。
基本上纯的对映体:几乎都是一种对映体的对映体组成或对映体中心。几乎全部地,一种对映体与另一种对映体的比例在约90:10和约100:0之间。
非对映体:立体异构化合物,它们不是彼此的镜像,并且其中两个或多个立体中心在一个或多个等效立体中心上具有不同构型。
差向异构体(Epimer):仅在一个立体中心处彼此不同的非对映体。
基本上外消旋的:具有几乎相等数量的手性分子的对映体或对映体中心的组合物。几乎相等地,两种对映体的比例在约45:55和55:45之间。
吖啶酯:包含吖啶鎓部分(acridinium moiety)、酯部分和离去部分(leavingmoiety)的一系列相关分子中的任一种。示意性实例(III)示出于下文。具有数字的A和B表示各种取代位点。(如果B是氢(H),则III是吖啶酸。)这些离子分子具有抗衡离子(未示出)。
吖啶酯类化合物:包括吖啶鎓部分、不稳定部分和离去部分的一系列相关分子中的任一种。示意性实例(IV)示出于下文。具有数字的A和B表示各种取代位点。这些离子分子具有抗衡离子(未示出)。
连接试剂
已经描述了具有非核苷酸单体单元的非核苷酸试剂。一个实例是由受保护的亚磷酰胺1,2-丙二醇和1,3-丙二醇接头组成的非核苷酸试剂,其中各种长度的烷基链以受保护的胺官能团终止。与天然核酸相比,具有1,2-丙二醇接头的试剂具有受限的核苷酸间距离(internucleotidyl distance),而具有1,3-丙二醇接头的试剂在磷酸盐之间的原子数与天然核苷酸相同。当插入两个相邻核苷酸之间时,具有1,2-丙二醇接头的试剂可特别有利,而当插入进行核苷酸替代时,具有1,3-丙二醇接头的试剂可特别有利。这些试剂可以通过标准寡核苷酸合成方法引入寡核苷酸中,以在寡核苷酸的5'-末端、寡核苷酸的3'-末端、两个核苷酸之间、核苷酸和非核苷酸单体单元之间、或相同或不同结构的两个非核苷酸单体单元之间形成非核苷酸单体单元。可以将多于一种公开的非核苷酸试剂引入寡核苷酸中,以形成修饰的寡核苷酸,所述修饰的寡核苷酸具有多个彼此相邻的或由一个或多个核苷酸或非核苷酸单体单元隔开的非核苷酸单体单元。然后,所述非核苷酸单体单元的胺通过异硫氰酸酯标记试剂与荧光素共价结合,或通过合适的N-羟基琥珀酰亚胺标记试剂与生物素或吖啶酯共价结合。
其他人报道了一种类似的受保护的亚磷酰胺1,2-丙二醇接头,其具有更短的烷基胺官能团(N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-3-氨基-1,2-丙二醇),并将该非核苷酸试剂的多个非核苷酸单体单元引入到寡核苷酸的5'-末端。除了丙二醇部分的手性碳外,二异丙基亚磷酰胺磷原子是手性的,并且是磷异构体的混合物;因此,非核苷酸试剂是非对映体。这些非核苷酸单体单元上的胺被生物素标记。该试剂以及因此其引入的单体单元由丙二醇部分的立体异构体混合物组成,而不是由一种异构体或另一种异构体的基本上纯的产物组成。文献没有讨论外消旋体或单个对映体暴露于手性环境时可能产生的不同性质。例如,一种非对映体的对映体碳中心可以将接头单体单元的烷基胺部分引导向相对于核酸双链复合物的一个方向,而丙二醇部分的另一个对映体可以将该基团引导向近似正交的方向。
还公开了在固相合成期间用于衍生和标记寡核苷酸的3'-末端的相关1,2-丙二醇非核苷酸试剂。类似地公开了在固相合成期间衍生和标记寡核苷酸的3'-末端、内部位置或5'-末端的相关的1,3-丙二醇但具有更长的烷基胺的非核苷酸试剂。除了丙二醇部分的手性碳外,二异丙基亚磷酰胺磷原子是手性的,并且是磷异构体的混合物;因此,非核苷酸试剂是非对映体。这些相关试剂中的每一种及其单体单元也由丙二醇部分的立体异构体的混合物组成,而不是由一种异构体或另一种异构体的纯产物组成;文献没有讨论外消旋体或单个对映体暴露于手性环境时可能产生的不同性质。与N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-3-氨基-1,2-丙二醇试剂相同,1,2-丙二醇和1,3-丙二醇部分的两个碳对映体的胺将相对于核酸双链复合物大致正交地定向。
另一个实例是具有烷基胺官能团的受保护的亚磷酰胺丝氨醇接头(N-Fmoc-β-α-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-丝氨醇),并且在寡核苷酸的任何内部位置或5'-末端或3'-末端上引入该非核苷酸试剂或相关固体载体试剂的多个非核苷酸单体单元。除了丙二醇部分的手性碳外,二异丙基亚磷酰胺磷原子是手性的,并且是磷异构体的混合物;因此,非核苷酸、非固体载体试剂是非对映体。可以将多于一种所公开的非核苷酸试剂引入寡核苷酸中以形成修饰的寡核苷酸,所述修饰的寡核苷酸具有多个彼此相邻的或由一个或多个核苷酸隔开的非核苷酸单体单元。这些试剂以及因此其引入的单体单元由立体异构体的混合物组成,而不是由一种异构体或另一种异构体的基本上纯的产物组成,但是现有技术没有讨论外消旋体或单个对映体暴露于手性环境时可能产生的不同性质。与上述试剂相同,丝氨醇接头试剂的丙二醇部分的一种碳对映体的胺将相对于核酸双链复合物大致正交地定向。
可检测的标记物
多种可检测的标记物中的任一种——包括(但不限于)同位素、发光、磷光、荧光、光学、电子密度或磁性部分——可以连接至接头。一类敏感标记物可以由吖啶酯组成,它们是化学发光分子。与其他化学发光分子相同,在适当的条件设定下,吖啶酯可用作检测和/或定量其他分子的探针。吖啶酯由吖啶鎓部分、不稳定酯部分、离去基团部分和抗衡离子部分组成。酚和取代的酚是示例性的离去基团。吖啶鎓和离去基团的环位置可以被不同地取代。密切相关的分子——吖啶酯类化合物——包括吖啶磺酰羧酰胺、吖啶硫酯和吖啶酰胺,其与吖啶酯在其不稳定部分上具有重要区别。吖啶环或离去基团环上的取代基之一可以是允许与另一分子上的部分发生特异性反应以形成缀合物的部分;在这种情况下,吖啶化合物是吖啶酯标记物或吖啶酯类化合物标记物。
当寡核苷酸杂交至完全匹配的核酸以及杂交至在接头位点附近具有错配的核酸时,与引入这些寡核苷酸中的核苷酸间接头连接的吖啶酯显示出对修饰的敏感性不同。例如,当寡核苷酸杂交至完全匹配的核酸以及杂交至在接头位点附近具有错配的核酸时,与引入这些寡核苷酸中的核苷酸间接头连接的吖啶酯显示出对水解的敏感性不同。敏感性不同是指基于核酸杂交,吖啶酯的苯基酯部分的水解速率的差异。例如,与完全匹配的核酸杂交的寡核苷酸连接的吖啶酯的水解程度低于与含有一个或多个错配的核酸杂交的寡核苷酸连接的吖啶酯。在开始化学发光检测之前,将pH值提高到碱性范围(但低于导致核酸去杂交(dehybridization)的pH值)以及溶液温度保持一定时间两者均影响水解差异。在此时间之后,剩余的未水解的吖啶酯的量通过与氧化剂(如过氧化氢)和碱性溶液(如氢氧化钠)的化学反应确定,然后记录发光输出。这些特性使带有吖啶酯标记物的寡核苷酸成为可用于差异检测可见于某些细菌物种或变体的密切相关的序列的优异探针。
类似地,例如,当寡核苷酸杂交至完全匹配的核酸以及杂交至在接头位点附近具有错配的核酸时,与引入这些寡核苷酸的核苷酸间接头相连的吖啶酯显示出对在吖啶环的C9位置处加合物形成的敏感性不同。对加合物形成的敏感性不同是指基于核酸杂交,在吖啶酯的C9位形成加合物的差异。例如,与含有一个或多个错配的核酸杂交的寡核苷酸连接的吖啶酯相比,与完全匹配的核酸杂交的寡核苷酸连接的吖啶酯在C9位形成加合物的可能性更小。在开始化学发光检测之前,通过增加溶液中形成加合物的化学品的浓度保持一定时间来实现不同的加合物形成。形成加合物的化学品包括亚硫酸盐、巯基乙磺酸、丙硫醇和硫代磷酸盐。
异构体
当四个化学取代基结合到同一个原子中心时,它们的三维构型是四面体。如果所有的取代基都相同,例如四个氢与碳结合形成甲烷,则四面体是对称的,其中所有取代基-原子中心-取代基键形成约109.5度角。如果取代基中的至少一个与其他取代基不同,则四面体构型变得扭曲并且键形成大于和小于约109.5度的角度范围。无论对称性多么完美,与四面体构型中的原子结合的任何两个取代基都基本上彼此远离。在所有四个取代基键合到相同原子中心但彼此不同的情况下,这些取代基也基本上彼此远离。然而,在这种情况下,取代基可以与原子中心结合,使得它们在空间中的取向不同,形成立体异构体。此外,这些立体异构体互为镜像,并且它们的中心原子被指定为手性中心。这两种不同的手性异构体称为对映体,并根据用于分配取代基空间方向的Cahn-Ingold-Prelog优先规则命名为Rectus(“R”)或Sinister(“S”)。具有至少两个手性中心并且不是每个手性中心的镜像的分子是非对映体。
上述非核苷酸试剂的丙二醇部分及其单体单元含有至少一个手性原子。除了丙二醇部分的手性碳外,二异丙基亚磷酰胺磷原子是手性的,并且是磷异构体的混合物;因此,非核苷酸试剂是非对映体。如本领域技术人员所知,对映体对在非手性环境中具有相同的化学和物理性质,但在包括生物系统在内的手性环境中具有不同的性质。例如,具有单个Sp或Rp硫代磷酸酯(phosphorothioate)的寡核苷酸与碘乙酰胺的标记反应具有相同的反应性,但对两种核酸酶的水解具有相反的稳定性。
在一个实施方案中,接头亚磷酰胺由如下所示的式V描述。
在该式中,Z是反应性含磷基团,例如O-氰基乙氧基二异丙基氧膦基部分、OH或连接至DNA合成载体的可裂解的酯。反应性含磷基团能够与第一个核苷酸的OH基团偶联或被活化以偶联至第一个核苷酸的OH基团。在反应性含磷基团是O-氰基乙氧基二异丙基氧膦基部分的情况下,所述O-氰基乙氧基二异丙基氧膦基部分由RP和RS异构体(磷中心的R和S对映体)的混合物组成,如果不纯化。预计RP和RS异构体将与第一个核苷酸的OH基团以大致相等的效率反应,以在增长的寡核苷酸链中形成亚磷酸三酯中间产物,所述中间产物在氧化和消除氰乙基保护基团后变为非手性的。D是保护基团,它可以被去除以允许非核苷酸连接试剂与第二个核苷酸偶联;所述保护基团可以选自三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或其他部分。L1是具有式(CH2)k—NH—(CO—(CH2)qNH)r—M的第一接头臂。L2是氢(H)、非连接烷基链、非连接混合烷基链或具有式(CH2)k—NH—(CO—(CH2)qNH)r—M的第二接头臂。当L1和L2彼此不相同时,它们所连接的碳原子(X元素)是手性的。分子的手性中心可以具有R或S立体化学构型,并且该组合物可以由R和S异构体的不同的非外消旋比率组成。式V中CH2(亚甲基)部分的数目可以在0至3之间变化,但必须具有至少一个CH2部分(即,i+j>1)。每个M独立地是氢、芴基甲氧基羰基、三氟乙酰基或对DNA合成和脱保护条件稳定的标记物。芴基甲氧基羰基和三氟乙酰基部分是保护胺在它们被去除和预期反应之前不与化学品发生不希望的反应的基团。每个k独立地是0至4个CH2部分之间的整数,每个q独立地是1至11个CH2部分之间的整数,每个r独立地是0至2个(CO—(CH2)qNH)基团之间的整数,只要第一接头臂和第二接头臂中的每个k+1+(2+q)r独立地为1至25之间的整数。
在另一个实施方案中,接头亚磷酰胺由如下所示的式VI描述。
D-X1-R2(X3-M)n-Z
在该式中,Z是反应性含磷基团,例如O-氰基乙氧基二异丙基氧膦基部分、OH或连接至DNA合成载体的可裂解的酯。反应性含磷基团能够与第一个核苷酸的OH基团偶联或被活化以偶联至第一个核苷酸的OH基团。在反应性含磷基团是O-氰基乙氧基二异丙基氧膦基部分的情况下,所述O-氰基乙氧基二异丙基氧膦基部分由RP和RS异构体(磷中心的R和S对映体)的混合物,如果不纯化,异构体(磷中心的R和S对映体)。预计RP和RS异构体将与第一个核苷酸的OH基团以大致相等的效率反应,以在增长的寡核苷酸链中形成亚磷酸三酯中间产物,所述中间产物在氧化和消除氰乙基保护基团后变为非手性的。D是保护基团,它可以被去除以允许非核苷酸连接试剂与第二个核苷酸偶联;所述保护基团可以选自三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或其他部分。X1可以是O、S、NH或-N=N-。R2是原子链。X3是接头臂。M独立地是氢、芴基甲氧基羰基、三氟乙酰基或对DNA合成和脱保护条件稳定的标记物。芴基甲氧基羰基和三氟乙酰基部分是保护胺在它们被去除和预期反应之前不与化学品发生不希望的反应的基团。不希望受任何一种理论的束缚,据信引入核酸聚合物中的非核苷酸试剂的一种非对映体的对映体碳中心可以将接头单体单元的烷基胺部分引导向沿着核酸双链复合物的一个方向,而另一个碳对映体可以将烷基胺基团引导向近似正交的方向,包括远离复合物。或者,引入核酸聚合物中的非核苷酸试剂的一种非对映体的对映体碳中心可将接头单体单元的烷基胺部分引导朝向核酸双链复合物的小沟(minor groove),而另一个碳对映体可将烷基胺基引导朝向大沟(major groove)。进一步可替代地,引入核酸聚合物中的非核苷酸试剂的一种非对映体的对映体碳中心可将接头单体单元的烷基胺部分引导沿着核酸双链复合物的一个方向,而另一个碳对映体可以将该基团引导朝向大沟或小沟或任一个沟之外。
式V(同上)的接头亚磷酰胺——其中i+j=奇数(例如,1、3、5、7等),并且L1是第一接头臂,L2是氢或其他低优先级部分(low priority moiety)——当引入至核苷酸/非核苷酸聚合物时,无论哪个碳是X元素,都将保持不对称性。此外,不对称的性质变化,取决于i>j或j>i。例如但不旨在限制,当i+j=1时,两种不同的核苷酸/非核苷酸聚合物(其部分由结构(56)和(57)说明)在X元素处具有R构型是可能的(图16)。在一个实施方案中,允许在X元素处具有R构型的试剂(39)与通过其3'-羟基连接到固体载体的生长聚合物的5'-羟基反应;聚合物继续连接额外的连接试剂或核苷亚磷酰胺产生结构(56)。在另一个实施方案中,允许试剂(39)与通过其5'-羟基连接到固体载体的生长聚合物的3'-羟基反应;聚合物继续连接额外的连接试剂或核苷亚磷酰胺产生结构(57)。在另一个实施方案中,允许在X元素处具有R构型的试剂(59)与通过其3'-羟基连接到固体载体的生长聚合物的5'-羟基反应;聚合物继续连接额外的连接试剂或核苷亚磷酰胺产生结构(57)。在另一个实施方案中,允许试剂(59)与通过其5'-羟基连接到固体载体的生长聚合物的3'-羟基反应;聚合物继续连接与额外的连接试剂或核苷亚磷酰胺产生结构(56)。在另外的实施方案中,两种不同的核苷酸/非核苷酸聚合物是可能的,在X元素处具有S构型,由相关试剂起始。类似于接头对映体的比较(同上),引入试剂(39)或(59)以形成结构(56)和(57)——即使(56)和(57)在元素X处都是R构型——导致烷基胺基团(和标记物,如果连接)指向基本上不同的方向。对于通过将试剂(38)和(58)引入核苷酸/非核苷酸聚合物中形成的结构也是如此。
式V(同上)的接头亚磷酰胺——其中i=j且L1是第一接头臂,L2是氢或其他低优先级部分——当引入至核苷酸/非核苷酸聚合物时将保持其对称状态,也就是说,在X元素和连接到核苷酸/非核苷酸聚合物的5'-羟基或3'-羟基的磷酸盐之间将具有相同数量的CH2部分。然而,在这些情况下,将给定手性的连接试剂结合到通过其3'-羟基连接到固体载体的生长聚合物的5'-羟基上或通过其5'-羟基连接到固体载体的生长聚合物的3'-羟基上可能会或可能不会导致在X元素处具有不同手性的核苷酸/非核苷酸聚合物。由于一旦结合到核苷酸/非核苷酸聚合物中的接头部分的对称连接性,X元素处的手性构型取决于许多优先规则可能性,包括连接到碳水化合物部分的核碱基类型(例如,低优先级的核酸碱基是胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤)、碳水化合物部分的类型(例如,低优先级的碳水化合物是2-氟核糖、2-甲氧基核糖、核糖和2-脱氧核糖)和连接到核苷酸/非核苷酸聚合物的5'-羟基或3'-羟基的磷酸盐上的核苷酸(或非核苷酸接头)的数量。如果接头部分位于核苷酸/非核苷酸聚合物的末端位置,则这些规则简化为连接至核苷酸聚合物的磷酸盐具有比非核苷酸接头的末端羟基更高的优先级。如果具有两个相邻的接头部分,则这些规则简化为所连接的核苷酸聚合物的核糖具有比非核苷酸接头更高的优先级。无论X元素的绝对构型如何,所述绝对构型可以根据具体情况确定,来自核苷酸/非核苷酸聚合物的不同可能构型的烷基胺基团(和标记物,如果连接)指向基本上不同的方向。
式V(同上)的接头亚磷酰胺——其中i+j=偶数(例如,2、4、6、8等)且i≠j和L1是第一接头臂,L2是氢或其他低优先级部分(例如,甲基或烷基部分)——当引入至核苷酸/非核苷酸聚合物时,无论哪个碳是X元素,都将保持不对称性。也就是说,在X元素和连接到核苷酸/非核苷酸聚合物的5'-羟基或3'-羟基的磷酸盐之间将具有不同数量的CH2部分。至于当i+j=奇数时,不对称的性质变化,取决于i>j或j>i。例如但不旨在限制,当i=0且j=2或i=2且j=0时,在X元素处具有S构型的两种不同核苷酸/非核苷酸聚合物是可能的。在一个实施方案中,允许图18a中所示的试剂(60)——在X元素处具有S构型——与通过其3'-羟基连接到固体载体的生长聚合物的5'-羟基反应;该聚合物继续连接额外的连接试剂或核苷亚磷酰胺,以产生其中非核苷酸接头在X元素处保持S构型的结构。在另一个实施方案中,允许试剂(60)与通过其5'-羟基连接到固体载体的生长聚合物的3'-羟基反应;该聚合物继续连接额外的连接试剂或核苷亚磷酰胺,以产生其中非核苷酸接头在X元素处保持S构型的结构。在又一个实施方案中,允许图18b中所示的试剂(62)——在X元素处具有S构型——与通过其3'-羟基连接到固体载体的生长聚合物的5'-羟基反应;该聚合物继续连接额外的连接试剂或核苷亚磷酰胺,以产生其中非核苷酸接头在X元素处保持S构型的结构。在另一个实施方案中,允许试剂(62)与通过其5'-羟基连接到固体载体的生长聚合物的3'-羟基反应;该聚合物继续连接额外的连接试剂或核苷亚磷酰胺,以产生其中非核苷酸接头在X元素处保持S构型的结构。在另外的实施方案中,两种不同的核苷酸/非核苷酸聚合物是可能的,在X元素处具有R构型,由相关试剂(61、63)起始。类似于接头对映体的比较(同上),引入试剂(60)或(62)以形成核苷酸/非核苷酸接头导致烷基胺基团(和标记物,如果连接)指向基本上不同的方向。对于通过将试剂(61)和(63)引入核苷酸/非核苷酸聚合物中形成的结构,同样的比较也是如此。
未知的是,将由丙二醇手性位点的外消旋混合物或由丙二醇手性位点的单个异构体组成的非核苷酸试剂引入核酸聚合物中将对带有诸如吖啶酯等标记物的寡核苷酸探针的性能产生何种影响。据信,使用纯异构体将在基于核酸杂交的测定中提供更高的灵敏度和特异性。因此,可以使用更少的材料,同时仍保持相同或更好的测定性能。此外,使用纯异构体可以相对于错配(尤其是单碱基错配、插入、缺失、倒位和转座)改进完全匹配序列的检测。由于接头的胺部分以及从而一种碳对映体的可检测标记物将相对于双链体以比另一种对映体上的标记物更好检测的方式定向,情况可能如此。
在一个实施方案中,接头是基于式V(同上)中的X元素的R构型的纯化异构体。在另一个实施方案中,接头是基于X元素的S构型的纯化异构体。在另一个实施方案中,接头被合成为基于X元素的R构型的异构体。在另一个实施方案中,接头被合成为基于X元素的S构型的异构体。
在基于式V(同上)中X元素的单个异构体的一些用途中,异构体的组合可具有有利的性质。例如但不旨在限制,技术人员可旨在使靶核酸链上具有选择性地或特异性地感应腺嘌呤和鸟嘌呤碱基的探针或探针组。在这种情况下,当R异构体以70%存在时,基于X元素的R异构体可以有利地与靶核酸链上的腺嘌呤碱基相互作用,并且当S异构体以30%存在时,基于X元素的S异构体可以有利地与靶核酸链上的鸟嘌呤碱基相互作用。在一个实施方案中,接头是基于X元素的R和S异构体的混合物。在另一个实施方案中,混合物是90%的R异构体和10%的S异构体。在另一个实施方案中,混合物是80%的R异构体和20%的S异构体。在另一个实施方案中,混合物是70%的R异构体和30%的S异构体。在另一个实施方案中,混合物是60%的R异构体和40%的S异构体。在另一个实施方案中,混合物是40%的R异构体和60%的S异构体。在另一个实施方案中,混合物是30%的R异构体和70%的S异构体。在另一个实施方案中,混合物是20%的R异构体和80%的S异构体。在另一个实施方案中,混合物是10%的R异构体和90%的S异构体。相关地,在另一个实施方案中,混合物是其他非外消旋分数量的R和S异构体。
实施例
实施例1:2-(3-氨基丙基)-1,3-丙二醇接头试剂的合成
该合成的合成方案在图1中给出,并概述如下。
(a)2-(3-次氮基丙基)-丙二酸二乙酯的合成(1):所用步骤改编自R.Adams和R.M.Kamm在有机合成(Organic Syntheses),Coll.第1卷,1941,第250页,编辑Gilman&Blatt中的方法。
材料:丙二酸二乙酯、3-溴丙腈和乙醇钠(21%乙醇溶液)购自奥德里奇化学公司(Aldrich Chemical Company)(美国威斯康辛州密尔沃基(Milwaukee,WI,U.S.A.))。无水乙醇(200标准酒精度(proof))来自美国工业化学(U.S.Industrial Chemicals)。
步骤:乙醇钠(0.1摩尔)用无水乙醇稀释至终体积为100mL。在搅拌下滴加丙二酸二乙酯(0.1摩尔)在50mL无水乙醇中的溶液,用氯化钙干燥管以保护反应装置不受潮。在室温下继续搅拌1小时。然后,在搅拌下滴加3-溴丙腈在50mL无水乙醇中的溶液,并将混合物在室温下搅拌过夜。将所得溶液过滤以除去沉淀的溴化钠,浓缩并萃取到乙醚(50mL)中。然后将该溶液用水(50mL)萃取,用无水硫酸镁干燥,并浓缩成油状物。以氯仿为流动相的硅胶板上的薄层色谱法在用碘蒸气可视化(visualization)后产生三个斑点:比移值(Rf)0.58、0.51和0.38,随后被鉴定为分别是丙二酸二乙酯、2-(3-次氮基丙基)-丙二酸二乙酯(1)和2,2-二-(次氮基丙基)丙二酸酯。在冰箱中放置几天后,从粗制油状物中分离出晶体,将其滤出,溶解在甲苯(10mL)中,加入己烷重新沉淀,得到3.28g白色固体(12%产率);薄层色谱法(如上所述),Rf 0.38。该化合物的结构通过1H NMR(CDCl3)证实为2,2-二-(次氮基丙基)丙二酸酯(6):δ1.30(t,6H),2.26(t,4H),2.47(t,4H),4.27(q,4H)。将滤出的油状物真空蒸馏,得到标题化合物(1),(沸点(b.p.)99-103℃,0.3mmHg),产率为20%;CDCl3中的1H NMR分析:δ1.24(t,6H),2.19(q,2H),2.47(t,2H),3.46(t,1H),4.18(q,4H)。
(b)2-(3-氨基丙基)-1,3-丙二醇(2)的合成。
材料:氢化铝锂(1.0M乙醚溶液)购自奥德里奇(Aldrich)。其他材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:将2-(3-次氮基丙基)-丙二酸二乙酯(1)(3.21g,15.1mmol)在无水乙醚(50mL)中在氮气中滴加到氢化铝锂(0.1mol在100mL乙醚中)的搅拌溶液中。将所得混合物回流2小时,然后在室温下搅拌过夜。接下来,缓慢加入2.5mM氢氧化钠水溶液(100mL)以淬灭未反应的氢化物。将该混合物搅拌2小时,倾析出乙醚层并弃去(产物保留在水层中)。通过离心从水层中除去白色凝胶状固体,用水洗涤,合并含水上清液和洗涤液,并通过减压旋转蒸发浓缩成糖浆。薄层色谱法(安莱尔科技(Analtech)反相板,水流动相,用茚三酮(ninhydrin)试剂进行可视化)得到一个主要斑点,被鉴定为标题化合物(2),Rf 0.48,以及一个小斑点,其归因于缩合副产物Rf 0.29。标题化合物(2)通过阳离子交换色谱法(道威克斯(Dowex)50X8,0.5M HCl流动相)纯化,总产率为50%。1H NMR分析(D2O):δ1.36(表观四重峰,2H)),1.68(m,3H),2.97(t,2H),3.57(d,4H)。
(c)2-(3-N-三氟乙酰氨基丙基)-1,3-丙二醇(3)的合成:步骤改编自R.F.Goldfinger在酶学方法(Methods in Enzymology),第12卷,1967,第317页,H.W.Hirs编辑中的方法。
材料:S-三氟硫代乙酸乙酯来自奥德里奇(Aldrich)。其他材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:将2-(3-氨基丙基)-1,3-丙二醇(2)(3mmol)溶解在水(25mL)中。通过滴加6NHCl将溶液的pH值降至9.5。在通风橱(hood)中进行以下反应:向剧烈搅拌的溶液中滴加S-三氟硫代乙酸乙酯(2mL);通过滴加6N KOH将pH值保持在9.5和10.0之间。30分钟后,再加入一毫升S-三氟硫代乙酸乙酯,如上所述保持pH。将混合物再搅拌45分钟。接下来,使用6NKOH将pH值调节至7,并通过减压旋转蒸发将混合物浓缩至干。将残余物与丙酮(20mL)一起搅拌并过滤以除去乙酸钾沉淀。将滤液浓缩成糖浆,重新溶解在丙酮(2mL)中,然后施用到含有40g硅胶(40μm平均粒径,来自贝克化学有限公司(J.T.Baker Chemical Co.)美国堪萨斯州菲利普斯(Phillipsburg,NJ,U.S.A.))的快速色谱柱。该柱用二氯甲烷/丙酮的50:50溶液(v/v)(500mL)洗脱,得到25mL级分。通过以下步骤分析级分的产物含量:将2μL等分试样点样到硅胶板上,喷雾10%哌啶水溶液,静置15分钟,用热风枪干燥,然后用茚三酮试剂处理。省略哌啶喷雾处理阻止了与茚三酮的比色反应,证实了伯胺的三氟乙酰化。使用该步骤,在级分13和18之间发现了产物;将这些级分合并,并通过旋转蒸发浓缩,得到无色油,Rf0.4(硅胶薄层色谱法,使用与上述相同的溶剂体系和可视化方法)。
(d)1-O-DMT-2-(3-N-三氟乙酰氨基丙基-1,3-丙二醇(4)的合成。
材料:二甲氧基三苯甲基氯购自奥德里奇(Aldrich)。其他材料在前述实施例中进行了描述,见上。将二氯甲烷回流,在氢化钙上蒸馏并储存在4埃分子筛上。吡啶在氢氧化钾颗粒和对甲苯磺酸盐上蒸馏并在干燥氮气下储存。
步骤:2-(3-N-三氟乙酰氨基丙基)-1,3-丙二醇(3)(362mg,1.58mmol)在减压下用干燥的吡啶数次蒸发干燥,然后在完全真空下进一步干燥数小时。然后在干燥氮气下将残余物溶解在10mL无水吡啶中。在搅拌下加入二甲氧基三苯甲基氯(401mg,1.18mmol)在无水二氯甲烷(1.5mL)中,并将所得溶液在室温下搅拌1小时。减压除去溶剂并将残余物溶解在氯仿(50mL)中。该溶液用5%碳酸氢钠水溶液萃取3次,然后用无水硫酸镁干燥。将得到的溶液浓缩成油状物,重新溶解在2mL氯仿中,并如上文所述通过快速色谱法分级分离,不同之处在于使用氯仿/乙酸乙酯/吡啶(95:5:0.2v/v/v)作为流动相。使用相同的溶剂体系在硅胶板上通过薄层色谱法分析级分。用HCl烟雾(fume)观察到的Rf值为0.27、0.87和0.93的斑点分别被鉴定为1-(二甲氧基三苯甲基)产物(4)、二甲氧基三苯甲基和1,3-二-(二甲氧基三苯甲基)副产物。1,3-二-(二甲氧基三苯甲基)副产物可以通过与4%二氯乙酸在饱和的二氯甲烷水溶液一起振荡而水解成标题化合物(4)。通过从适当的级分中蒸发溶剂来分离产物(4),并在完全真空下干燥,得到泡沫状物(370mg,44%)。
(e)1-O-DMT-2-(3-N-三氟乙酰氨基丙基)-3-O-(甲基-N,N-二异丙基磷酰氨基)-1,3-丙二醇(5)的合成。
步骤:1-O-DMT-2-(3-三氟乙酰氨基丙基)-1,3-丙二醇(4,300mg,0.56mmol)用无水吡啶数次蒸发干燥,并溶解在10mL无水二甲基甲酰胺中。在干燥氮气下进行以下反应:在搅拌下加入N,N-二异丙基乙胺(245μL,1.3mmol),然后加入N,N-二异丙基甲基磷酰胺氯化物(140μL,0.7mmol)。将反应混合物搅拌2小时。然后,将混合物减压浓缩,并溶解在二氯甲烷(50mL)中。该溶液用5%碳酸氢钠水溶液萃取3次,用无水硫酸镁干燥,减压浓缩成油状物。起始材料(4)转化为相应的亚磷酰胺(5)通过31P NMR(CDCl3,磷酸三甲酯,外标):δ(ppm)147.9确认。纯度估计大于70%。
实施例2:2,2-二-(3-氨基丙基)-1,3-丙二醇接头试剂的合成
该实施例由用于引入至合成寡核苷酸的磷酸二酯骨架的单体组成,所述寡核苷酸具有两个用于多个标记连接的氨基丙基接头。合成原理在图2中给出。
材料:除特别说明外,材料与实施例1中所示的材料相同。
(a)2,2-二-(3-氨基丙基)-1,3-丙二醇(7)的合成:以下步骤是对实施例1(b)中所述方法的修改的简要描述。
步骤:将2,2-二-(次氮基丙基)-丙二酸二乙酯(6)(2.00g,7.51mmol)——其合成已在实施例1(a)中描述——溶解在无水乙醚(80mL)中。将所得溶液滴加到氢化铝锂(0.1摩尔)在乙醚(100mL)中的搅拌溶液中。15分钟后,将混合物加热回流2小时,然后在室温下搅拌过夜。如上文实施例1(b)中所述,进行粗产物的后处理和回收。薄层色谱法,也如实施例1(b)所述,得到一个主要斑点(Rf~0.2)。
(b)2,2-二-(3-三氟乙酰氨基丙基)-1,3-丙二醇(8)的合成。
步骤:将2,2-二-(3-氨基丙基)-1,3-丙二醇(7)(3.7mmol)溶于水(25mL)中,并用6N HCl将pH调节至约10。在剧烈搅拌下加入1mL S-三氟硫代乙酸乙酯;通过滴加6N KOH将pH值保持在9.5和10.0之间。同样地,以30分钟的间隔添加1.0mL额外的S-三氟硫代乙酸乙酯两次。通过减压旋转蒸发将混合物浓缩成油状物,然后溶解在丙酮(30mL)中。过滤除去沉淀的乙酸钾。如实施例1(c)中所述,使用二氯甲烷/丙酮(50:50v/v)流动相通过硅胶快速色谱法纯化产物(8)。使用相同的溶剂体系,用硅胶薄层色谱法纯化的材料产生单点(Rf0.7);如实施例1(c)中那样,通过用哌啶然后用茚三酮处理进行可视化。产量为510mg(1.48mmol)。
(c)1-O-DMT-2,2-二-(三氟乙酰氨基丙基)-1,3-丙二醇(9)的合成。
步骤:2,2-二-(3-三氟乙酰氨基丙基)-1,3-丙二醇(8)(510mg,1.48mmol)通过减压旋转蒸发数次蒸发无水吡啶进行干燥,然后在氮气下溶解在5mL无水吡啶中。在氮气下在搅拌下加入二甲氧基三苯甲基氯(376mg,1.11mmol)的无水二氯甲烷(1.5mL)溶液,并将混合物搅拌1小时。将混合物减压浓缩,并溶解在氯仿(50mL)中。该溶液用饱和碳酸氢钠水溶液萃取3次,用饱和氯化钠水溶液萃取一次。然后,将溶液用无水硫酸镁干燥,并通过减压旋转蒸发浓缩成油状物。接着,将油状物溶解在2mL氯仿中,并通过硅胶快速色谱分离,如上所述,使用氯仿/乙酸乙酯/吡啶(80:20:0.2v/v/v)。产物(9)通过硅胶薄层色谱法使用相同的溶剂体系用HCl烟雾可视化来进行鉴定(Rf0.3);减压浓缩并在全真空下干燥,得到淡黄色泡沫状物(517mg,52%)。
(d)1-O-DMT-2,2-二-(3-三氟乙酰氨基丙基)-3-O-(甲基-N,N-二异丙基磷酰氨基)-1,3-丙二醇(10)的合成。
步骤:1-O-DMT-2,2-二-(三氟乙酰氨基丙基)-1,3-丙二醇(9)(136mg,0.2mmol)用干燥吡啶(3mL)三次共蒸发进行干燥。将所得残余物在氩气下溶解在无水二氯甲烷(1.5mL)中,并在搅拌下加入N,N-二异丙基乙胺(175μL,1.0mmol)。接着,加入N,N-二异丙基甲基磷酰胺氯化物(80μL,0.4mmol),搅拌反应1小时。所得混合物用乙酸乙酯/三乙胺(98:2,50mL)稀释,并用饱和碳酸氢钠水溶液(25mL)萃取两次。有机层用无水硫酸镁干燥,并浓缩成油状物(240mg)。向亚磷酰胺(10)的转化通过31P NMR(CDCl3,三甲氧基磷酸酯,外标):δ(ppm)145.5。纯度估计大于60%。
实施例3:3-氨基-1,2-丙二醇基接头试剂的合成
合成图解在图3中,并在下文描述。
(a)3-(三氟乙酰氨基)-1,2-丙二醇(11)的合成。
材料:3-氨基-1,2-丙二醇和S-三氟硫代乙酸乙酯购自奥德里奇(Aldrich)。其他材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:将S-三氟硫代乙酸乙酯(5.13mL,45mmol)加入到快速搅拌的3-氨基-1,2-丙二醇(2.32mL,30mmol)和乙酸乙酯(5.0mL)的混合物中。几分钟后,混合物变得均匀。1小时后,将反应溶液与石油醚(100mL)一起振摇,得到油状物,将所述油状物通过减压旋转蒸发分离并浓缩。使用乙酸乙酯/二氯甲烷(2:1)作为流动相,通过硅胶板上的薄层色谱法分析该物质。首先用茚三酮试剂对板进行可视化,其在起始处显示出痕量的未反应的胺起始材料。接下来,通过以下步骤使板可视化:喷雾10%哌啶水溶液,15分钟后用热风枪干燥,然后用茚三酮试剂处理。在用茚三酮试剂处理的情况下,明显观察到一个主要斑点(Rf 0.28),估计占材料的95%以上。与主要斑点(11)相关的材料的纯化是通过制备级薄层色谱法实现的。
(b)3-(三氟乙酰氨基)-1-O-DMT-1,2-丙二醇(12)的合成。
材料:材料描述于实施例1(d)中,见上。
步骤:3-(三氟乙酰氨基)-1,2-丙二醇(11)(1.87g,10mmol)在减压下通过无水吡啶(10mL)三次共蒸发进行干燥。然后,将该物质溶解在无水吡啶(10mL)中。接着,在氮气下在搅拌下滴加二甲氧基三苯甲基氯(3.73g,11mmol)的无水吡啶(10mL)溶液。约1小时后,加入甲醇(0.2mL)。所得溶液用乙酸乙酯(80mL)稀释,用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)萃取两次,用水(20mL)萃取两次。有机层用无水硫酸镁干燥,并减压浓缩,得到6g粗制油状物。如上所述,使用二氯甲烷/乙酸乙酯/吡啶(10:1:0.01v/v/v)通过硅胶快速色谱法分离1.1g(Oneand one-tenth g)的粗物质。用相同的溶剂体系在硅胶板上通过薄层色谱法分析级分。用HCl烟雾使斑点可视化,显示出Rf值为0.94和0.87的两个次要组分和Rf 0.53的主要组分,它们分别被鉴定为1,2-二-(二甲氧基三苯甲基)副产物、二甲氧基三烷醇和预测的产物(12)。将如上所述通过薄层色谱法得到的Rf为0.53的级分合并,并通过减压旋转蒸发浓缩至干,得到0.72g的(12),其结构通过1H NMR证实。(12)的总产率为80%,基于来自闪蒸塔的产率。
(c)3-(三氟乙酰氨基)-1-O-DMT-2-O-(甲基-N,N-二异丙基磷酰氨基)-1,2-丙二醇(13)的合成。
材料:材料在实施例1中描述,见上。
步骤:将3-(三氟乙酰氨基)-1-O-DMT-1,2-丙二醇(12)(196mg,0.4mmol)溶解在含有二异丙基乙胺(348μL,2mmol)的无水二氯甲烷(1.5mL)中。在氩气下在搅拌下滴加N,N-二异丙基甲基磷酰胺氯化物(200μL,1mmol)。1小时后,加入含有1%三乙胺的乙酸乙酯(50mL),并且所得溶液用饱和碳酸氢钠水溶液萃取3次。有机层用无水硫酸镁干燥,并减压浓缩成油状物。通过31P NMR(CD3CN,三甲氧基磷酸,外标):δ(ppm)147.5估计该材料的纯度大于95%。粗样品直接用于将接头加成到寡核苷酸中。实施例3(A):基于6-氨基-1,2-己二醇的接头试剂的合成
合成图解在图4,并在下文描述。
(a)1,2-(异丙啶)-1,2,6-己三醇(14)的合成。
材料:1,2,6-己三醇和2,2-二甲氧基丙烷购自奥德里奇(Aldrich)。
步骤:将1,2,6-己三醇(1.00g,7.45mmol)、无水丙酮(10mL)和浓硫酸(30μL)连同磁力搅拌棒一起加入到50mL圆底烧瓶中。用氮气吹扫烧瓶,并附上橡胶隔片(rubberseptum)以排除水分。接下来,在30分钟时间内通过注射器将2,2-二甲氧基丙烷(3.00mL,24.4mmol)缓慢加入到搅拌溶液中。继续搅拌2小时。添加无水碳酸钠(150mg)以淬灭反应,然后将内容物搅拌过夜。最后,将溶液过滤,并通过减压旋转蒸发浓缩,得到淡黄色糖浆(14)(1.6g)。该物质不经纯化用于下一步。
(b)1,2-(异丙啶)-6-(对甲苯磺酰基)-1,2,6-己三醇(15)的合成
材料:对甲苯磺酰氯购自奥德里奇(Aldrich)。
步骤:将来自先前步骤的粗异丙基化材料(14)(约7.45mmol)溶解在无水丙酮(15mL)中。接着,加入对甲苯磺酰氯(2.8g,14.9mmol)和无水吡啶(5mL),将内容物在除去水分的情况下在室温下搅拌3小时。然后,通过减压旋转蒸发除去溶剂,并将残余物分配在二氯甲烷(25mL)之间,用无水硫酸镁干燥,过滤,然后通过减压旋转蒸发浓缩至干,得到2.8g结晶固体(15)。使用氯仿作为流动相,如上所述通过硅胶快速色谱法纯化粗产物。使用相同的溶剂在荧光硅胶板上通过薄层色谱分析级分。在紫外灯下观察到斑点。合并含有产物(Rf0.50)的级分,并通过减压旋转蒸发浓缩,得到油状物(15)(2.37g),总产率为97%。
(c)1,2-(异丙啶)-6-叠氮基-1,2-己二醇(16)的合成。
步骤:将来自先前步骤的甲苯磺酸酯(15)(2.37g,7.22mmol)溶解在无水二甲基甲酰胺(30mL)中。加入叠氮化钠(1.64g,25.2mmol)以及磁力搅拌棒,并连接回流冷凝器和氯化钙干燥管。然后,将混合物在60-65℃的水浴中搅拌3小时。在室温下继续搅拌过夜。然后,通过离心除去沉淀物,并将所得溶液通过减压旋转蒸发浓缩至约5mL的最终体积。将浓缩溶液在氯仿(50mL)和水(15mL)之间分配。将有机层进一步用水(15mL)洗涤,用无水硫酸镁干燥,过滤,并通过减压旋转蒸发浓缩成琥珀色油状物(16)。然后将粗产物无需进一步纯化用于下一步骤。
(d)6-氨基-1,2-己二醇(17)的合成。
材料:氢化铝锂(1.0M)的乙醚溶液购自奥德里奇(Aldrich)。
步骤:在氩气气氛下将无水乙醚(10mL)和氢化铝锂(1.0M)的乙醚溶液(15mL)加入到250mL圆底烧瓶中。然后在氩气下在搅拌下通过加料漏斗加入来自先前步骤的粗叠氮化物(16)(约7mmol)在无水乙醚(25mL)中的溶液。完成添加后,在氩气下搅拌混合物。完成添加后,将混合物在回流下搅拌90分钟。所得浆液用乙醚(25mL)稀释,并在搅拌下按所示顺序加入以下溶液:水(1mL)、5N NaOH(1mL)和水(1mL)。然后将混合物通过中型玻璃过滤器过滤。滤液在室温下蒸馏浓缩,然后高真空,得到淡黄色油状物。接下来,加入水(10.8mL)和88%甲酸(14.2mL)。将所得混合物在室温下放置过夜,然后在70-75℃下加热2小时。通过减压旋转蒸发将溶液浓缩成糖浆,然后将其溶解在水(50mL)中,并施用于含有AG50W-X8树脂的阳离子交换柱(H型,50mL床体积,美国加利福尼亚州伯乐实验室(Bio-Rad Labs,CA,U.S.A.))。用1N HCl洗脱柱。通过在硅胶TLC板上点样、喷雾茚三酮试剂并如上所述加热来使含有胺产物的级分可视化。合并含有产物的馏分,并通过减压旋转蒸发浓缩得到糖浆,通过减压旋转蒸发将其与甲醇进一步共蒸发得到浅黄色针状物(17),为盐酸盐形式。
(e)6-N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基-1,2-丙二醇(18)的合成。
材料:9-芴基甲基琥珀酰亚胺碳酸酯(Fmoc)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自巴亨公司(Bachem,Inc.)美国加利福尼亚州托伦斯(Torrance,CA,USA)。
步骤:将在前一步骤中获得产量的量的6-氨基-1,2,-己二醇盐酸盐(17)溶解在水(10mL)中,并用5N NaOH调节至最终pH为8.7。添加碳酸氢钠(588mg,7mmol)、Fmoc-NHS(2.76g,7mmol)和丙酮(10mL)。将悬浮液在室温下搅拌过夜,之后所有的Fmoc-NHS都进入溶液中。通过减压旋转蒸发浓缩反应混合物以除去丙酮。添加1N HCl(50mL)和乙酸乙酯(150mL),并将混合物转移至分液漏斗。分离有机层,并用0.1N HCl(50mL)洗涤,然后用水(2×50mL)洗涤。接着,有机层用无水硫酸镁干燥,过滤,并浓缩成油状物。使用氯仿/丙酮(50:50)作为流动相,如上所述通过硅胶快速色谱法纯化产物。使用相同的溶剂体系在荧光硅胶板上通过薄层色谱法分析级分。在紫外灯下观察斑点。合并含有产物(Rf 0.25)的级分,通过减压旋转蒸发除去溶剂,得到1.20g白色结晶固体(18)。总产率为45%,基于1,2,6-己三醇起始材料的量。
(f)1-O-DMT-6-N-(芴基甲氧基羰基)-6-氨基-1,2-己二醇的合成。
步骤:将上一步骤的产物(18)(0.5g,1.41mmol)与无水吡啶(3×3mL)共蒸发,然后在氩气下溶解在无水吡啶(8mL)中。在几分钟内通过注射器在搅拌下加入二甲氧基三苯甲基氯(0.5736g,1.69mmol)的无水二氯甲烷(2mL)溶液。在室温下继续搅拌2小时,然后加入甲醇(100μL)以淬灭反应。通过减压旋转蒸发除去溶剂,并将残余物溶解在氯仿(100mL)中。将所得溶液转移至分液漏斗中,并用饱和碳酸氢钠水溶液(3×20mL)洗涤,然后用5M氯化钠(20mL)洗涤。然后将有机层用无水硫酸镁干燥,过滤并通过减压旋转蒸发浓缩成油状物。使用二氯甲烷/乙酸乙酯/三乙胺(95:5:0.5)溶剂体系,如上所述通过硅胶快速色谱法纯化产物。使用相同的溶剂在硅胶板上通过薄层色谱法分析级分;通过将板置于HCl烟雾中使斑点可视化。合并含有产物(19)(Rf 0.35)的级分,通过减压旋转蒸发除去溶剂,得到泡沫状物(910mg,100%的理论产率)。
(g)1-O-DMT-6-N-(芴基甲氧基羰基)-2-O-(甲基-N,N-二异丙基磷酰氨基)-6-氨基-1,2-己二醇(20)的合成:
材料:材料在前面的实施例中进行了描述,见上。
步骤:在氩气气氛下将N,N-二异丙基-甲氧基氧膦基氯(102μL,0.513mmol)滴加到(19)(225mg,0.34mmol)和N,N-二异丙基乙胺(236μL,1.36mmol)的无水二氯甲烷(3mL)搅拌溶液中。90分钟后,将反应混合物稀释到含有2%三乙胺(50mL)的乙酸乙酯中,并用饱和碳酸氢钠水溶液(2×25mL)洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥,过滤,并通过减压旋转蒸发浓缩至干。将残余物溶解在甲苯(2mL)中,并在-20℃下在快速搅拌下滴加至石油醚中。然后将所得混合物在-20℃下储存16小时。然后将其升温至室温并倾析上清液。然后将沉淀的产物(20)真空干燥,得到160mg(58%产率)。该材料的纯度通过硅胶板上的薄层色谱法使用二氯甲烷/乙酸乙酯/三乙胺(10:1:0.1)溶剂体系进行证实,并在紫外光下可视化(Rf 0.9,与Rf为0.25的起始材料相比)。
还产生了上文实施例3(A)中描述的接头试剂的扩展的类似物。这些类似物的结构示于图5(21-24)。这些类似物的制备在以下实施例中进行描述。
实施例3(B):基于3-N-(缩水甘油基)-氨基-1,2-丙二醇的接头试剂(21)的合成
该合成的方案在图6中概述。
(a)3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)缩水甘油基]-氨基-1,2-丙二醇(25)的合成。
材料:N-(芴基甲氧基羰基)-甘氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺(Fmoc-甘氨酸-NHS)购自巴亨公司(Bachem)。其他试剂已在上文中描述。
步骤:将3-氨基-1,2-丙二醇(91mg,1mmol)加入到Fmoc-甘氨酸-NHS(394mg,1mmol)的丙酮溶液(7mL)中。向该溶液中加入碳酸氢钠(84mg,1mmol)的水溶液(5mL)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。使用硅胶板和二氯甲烷/甲醇/乙酸(20:2:0.1)溶剂体系的薄层色谱法显示反应已经完成。产物(25)以沉淀物的形式在烧瓶中产生,将其滤出并在五氧化二磷上真空干燥2天。产量为310mg(84%)。
(b)1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-缩水甘油基]-氨基-1,2-丙二醇(26)的合成。
材料:材料在前面的实施例中描述,见上。
步骤:化合物(25)(185mg,0.5mmol)通过与无水吡啶(3×3mL)共蒸发进行干燥。然后,将其溶解在无水吡啶(3mL)中,并在搅拌下滴加二甲氧基三苯甲基氯(222mg,0.57mmol)在二氯甲烷/吡啶的1:1混合物中的溶液(4mL)。继续搅拌1.5小时,并通过硅胶薄层色谱法使用二氯甲烷/甲醇(8:1)溶剂体系监测反应。通过加入甲醇(0.2mL)淬灭反应;继续搅拌10分钟。通过减压旋转蒸发除去吡啶。将残余物溶解在二氯甲烷(150mL)中,并用饱和碳酸氢钠水溶液(2×50mL)洗涤,然后用水(50mL)洗涤。用无水硫酸镁干燥后,通过减压旋转蒸发除去二氯甲烷溶液。根据上文所述的方法,使用含有0.1%吡啶的二氯甲烷/乙酸乙酯(11:5)溶剂体系通过硅胶快速色谱法纯化残余物。如上所述,通过硅胶薄层色谱法鉴定含有产物的级分。合并这些级分,通过减压旋转蒸发除去溶剂,得到250mg(26)(75%产率)。
(c)1-O-DMT-2-O-(N,N-二异丙基氨基-甲氧基膦酰氨基)-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-缩水甘油基]-氨基-1,2-丙二醇(21)的合成。
材料:材料在前面的实施例中描述,见上。
步骤:化合物(26)(235mg,0.35mmol)通过与无水吡啶(2×3mL)共蒸发进行干燥。然后,将其溶解在无水二氯甲烷(2mL)中并加入N,N-二异丙基乙胺(244μL,1.4mmol)。接着,在氩气气氛下在搅拌下滴加N,N-二异丙基氨基-氯甲氧基膦(105μL,0.53mmol)。使用二氯甲烷/乙酸乙酯/三乙胺(10:5:0.5)溶剂体系,通过硅胶薄层色谱法发现反应在20分钟后完成。然后,将反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(2×25mL)稀释到乙酸乙酯(ethyl)中。用无水硫酸镁干燥后,通过减压旋转蒸发除去乙酸乙酯层。将残余物重新溶解在乙酸乙酯(3mL)中,并在-25℃下倒入己烷(150mL)中。将沉淀物过滤并真空干燥,得到210mg(21)(72%)。31P-NMR(CDCl3,磷酸三甲酯,外标):(ppm)147.5(d)。结构通过1H-NMR分析也得到证实。
实施例3(C):基于3-N-(4-氨基丁酰基)-氨基-1,2-丙二醇和3-N-(6-氨基己酰基)-氨基-1,2-丙二醇的接头试剂(22、23)的合成
该实施例特有的合成步骤图解在图7中,并在下文描述。
(a)N-芴基甲氧基羰基保护形式的4-氨基丁酸和6-氨基己酸(N-Fmoc-4-氨基丁酸(27)和N-Fmoc-6-氨基己酸(28))的合成。
材料:4-氨基丁酸和6-氨基己酸购自奥德里奇(Aldrich)。Fmoc-NHS在实施例3(A)中描述。
步骤:这些合成是按照记载于A.Paquet(加拿大化学杂志(Can.J.Chem.),1982,60,976)的方法进行的。
(b)N-Fmoc-4-氨基丁酸和N-Fmoc-6-氨基己酸中任一种与3-氨基-1,2-丙二醇的偶联。
材料:三甲基乙酰氯购自奥德里奇(Aldrich)。其他材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:化合物(27)和(28)中的任一种(1mmol)首先通过与吡啶(2×3mL)共蒸发进行干燥。然后,将残余物溶解在无水二甲基甲酰胺(3mL)和无水四氢呋喃(3mL)的混合物中。将所得溶液在冰浴中冷却,并加入N,N-二异丙基乙胺(1mmol),随后在搅拌下缓慢加入三甲基乙酰氯(1mmol)。在冰浴中继续搅拌45分钟。接着,加入3-氨基-1,2-丙二醇(1.2mmol)的无水二甲基甲酰胺溶液(3mL),将所得混合物升温至室温并搅拌1小时。使用二氯甲烷/甲醇/乙酸(10:1:0.1)溶剂体系通过硅胶薄层色谱法监测反应。基于该分析,确定反应已经进行到大约90%完成。然后,通过减压旋转蒸发浓缩反应混合物,用乙酸乙酯(100mL)稀释并转移至分液漏斗。有机溶液用饱和碳酸氢钠水溶液(2×50mL)和水(50mL)洗涤。用无水硫酸镁干燥后,通过减压旋转蒸发将有机层浓缩至干。通常,所得产物经测定纯度大于95%,无需进一步纯化即用于后续步骤。然而,在需要纯化的情况下,如前述实施例所述,使用二氯甲烷/甲醇(40:1)溶剂体系,通过硅胶快速色谱法进行纯化。(29)和(30)的纯度通过1H-NMR分析得到证实。
(c)(29)和(30)的1-O-二甲氧基三苯甲基化:
用于该合成的材料和步骤如实施例3(B),部分(b)中所述。这些材料的纯度通过1H-NMR得到证实。
(d)将上文(c)部分中提及的化合物转化为相应的2-O-(N,N-二异丙基甲基)亚磷酰胺(22和23):
用于该合成的材料和步骤如实施例3(B),部分(c)中所述。产物(22)和(23)的纯度通过31P-NMR得到证实。
实施例3(D):基于3-N-(6-氨基己酰基)-氨基-1,2-丙二醇的进一步扩展类似物的接头试剂的合成
该合成的独特步骤图解在图8中,并在下文描述。
(a)1-O-DMT-3-N-(6-氨基己酰基)-氨基-1,2-丙二醇(32)的合成。
材料:如实施例3(C),部分(c)中所述制备化合物(31)。
步骤:将化合物(31)(0.89g,1.1mmol)在室温下用浓氢氧化铵(10mL)和吡啶(10mL)氨解过夜。将来自反应的等分试样点样到硅胶TLC板上,并用茚三酮试剂处理,以监测伯胺的脱保护。然后,通过减压旋转蒸发将反应混合物浓缩至干,所得残余物(32)不经纯化即用于后续步骤。
(b)化合物(32)与化合物(28)的偶联。
材料:根据实施例3(C),部分(a)中描述的步骤合成化合物(28)。
步骤:N-Fmoc-氨基己酸(28)(1.1mmol)根据上文实施例3(C),部分(b)中描述的步骤与三甲基乙酰氯(1.1mmol)反应。接着,再次根据实施例3(C),部分(b)中的步骤加入化合物(32)(1.1mmol)的无水二甲基甲酰胺溶液。所得加合物(33)通过硅胶快速色谱法纯化,如前述实施例所述,使用氯仿/甲醇(30:1)溶剂体系。产物的产量为250mg(23%)。
(c)将化合物(33)转化为相应的2-O-(N,N-二异丙基氨基)-甲氧基亚磷酰胺(34)。
步骤:该方法与上述实施例3(B),部分(c)中所述的方法基本相同。因此,使化合物(33)(240mg,0.285mmol)与N,N-二异丙基氨基氯甲氧基膦(73μL,0.371mmol)于含有N,N-二异丙基乙胺(198μL,1.14mmol)的无水二氯甲烷(3mL)中进行反应。通过用2%三乙胺于乙酸乙酯(50mL)中将反应稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液(25mL)和水(25mL)萃取来处理该反应。所得有机层经无水硫酸钠干燥,过滤,并通过减压旋转蒸发除去溶剂。如前述实施例中所述,将残余物溶解在几毫升乙酸乙酯中,并沉淀到己烷(150mL)中。(34)的产量为200mg,其纯度通过1H-NMR和32P-NMR光谱得到证实。实施例4:基于2-(3-氨基丙基)-1,3-丙二醇的接头与合成寡核苷酸的自动连接
现将描述接头试剂与各种合成寡核苷酸的连接,所述接头试剂描述于实施例1,试剂(5)中,下文将其称为“L1”。
(a)“L1”试剂在脱氧寡核苷酸的5'-末端上偶联。具有序列“5'-GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-3'”(SEQ ID NO 1)的脱氧寡核苷酸在受控孔玻璃载体上用应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.)(美国加利福尼亚州福斯特城(FosterCity,CA,U.S.A.)),380A型DNA合成仪使用标准的3'-β-氰乙基亚磷酰胺化学合成。除去5'-二甲氧基三苯甲基基团,使用标准偶联循环将“L1”(0.1M)的无水乙腈的溶液偶联两次。通过测量在每个偶联循环结束时释放的二甲氧基三苯甲基在498nm处的吸光度来量化“L1”的第一次和第二次加成相对于全长脱氧寡核苷酸的量的偶联百分比;这些值分别确定为29%和42%。5'-(L1)-和5'-(L1)-(L1)-寡核苷酸通过凝胶电泳在含有7M尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶上进行纯化。相应的条带通过紫外阴影可视化,估计在凝胶上迁移较慢,间距为相应另外的核苷酸间距的约1.5倍。切除这些条带,并通过标准方法回收和纯化接头修饰的脱氧核苷酸。
(b)“L1”试剂在脱氧寡核苷酸的3'-末端上偶联。对于该合成,使用了特氟龙(Teflon)可氧化固体载体(美国加利福尼亚州圣地亚哥的分子生物系统公司(MolecularBiosystems,Inc.,San Diego,CA,USA),产品目录#OSS-01)。当脱氧核糖核苷酸从该载体上切割下来时,在第一个偶联循环中使用的化合物与3'-末端磷酸基团一起保留在3'-末端。在应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.)380A型DNA合成仪上使用标准亚磷酰胺化学方法,使用三个偶联循环将“L1”(0.2M)的无水乙腈溶液与该载体偶联。接下来,使用相同的偶联化学添加与上文部分(a)中呈现的相同的脱氧寡核苷酸序列(SEQ ID NO 1)。对于第一次、第二次和第三次偶联,如上所述测定与“L1”试剂的初始偶联百分比分别为40%、63%和63%。在从所得三聚体中除去末端二甲氧基三苯甲基后,使用标准亚磷酰胺化学连接具有与4(a)中相同序列的脱氧寡核苷酸。然后,将载体材料从合成仪中取出,并在55℃下用浓氢氧化铵处理16小时。接着,将载体用水洗涤3次,并在室温下用50mM高碘酸钠于20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中处理2.5小时。最后,将载体用水洗涤数次,并在55℃下用10%的正丙胺水溶液处理3小时。将所得溶液施加到含有7M尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶上,并进行电泳分离。如上所述回收相应的3'-(L1)-(L1)-(L1)脱氧寡核苷酸。
(c)“L1”在具有序列“5'-AAATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT-3'”(SEQ IDNO 2)的脱氧寡核苷酸的3'-末端上偶联。合成方法与(b)部分中描述的方法相同,不同之处在于使用Biosearch 8750型DNA合成仪。
(d)“L1”在具有序列“5'-CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATTT-3'”(SEQ IDNO 3)的脱氧寡核苷酸的3'-末端上偶联。同样地,使用部分(b)中描述的方法,不同之处在于合成的自动化部分是在Biosearch8750型DNA合成仪上完成的。
(e)含有插入核苷酸碱基之间的2-(3-氨基丙基)-1,3-丙二醇接头(“L1”)的合成脱氧寡核苷酸探针的杂交和熔融温度(Tm)。
材料:通过与上述方法相似的方法合成了33个核苷酸长的脱氧寡核苷酸探针的两个L1衍生物:“L1-插入”具有插入在核苷酸残基21和22之间的L1(从5'-末端开始编号);“L1-替换”具有在核苷酸残基20和22之间的L1,作为残基21的替代物。两种探针都具有与沙眼衣原体核糖体RNA(“靶rRNA”)互补的序列。探针使用125I通过基因探针公司(Gen-ProbeIncorporated)开发的标准协议进行标记;羟基磷灰石(HAP)来自贝林诊断(BehringDiagnostic)(Calbiochem Division,美国加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla,CA,U.S.A.));十二烷基硫酸钠(SDS)、磷酸钠(一元盐和二元盐)和盐酸是购自费舍尔科学公司(FisherScientific Corp.)的试剂级;Betagel(液体闪烁体)来自西部化学(WestChem)(SanDiego,CA,USA)。所有其他材料均为试剂级。除非另有说明,否则在1.5mL螺旋盖聚丙烯艾本德(Eppendorf)管中进行操作。
杂交如下进行:将48μL 1M磷酸钠(pH 6.8)、10μL 1%SDS(v/v)、10μL 125I标记的探针(约200,000CPM)、29.5μL水、以及2.5μL rRNA溶液(0.5μg,“目标”)或2.5μL水(“对照”)混合,并在60℃下温育1小时。接下来,将10μL等分试样稀释到1mL 0.12M磷酸钠(pH6.8)/0.02%SDS/0.02%叠氮化钠中,并涡旋5秒。将稀释的等分试样在从室温加热到80℃的水浴中温育;在指定温度下取出等分试样并储存在冰上。然后,将样品通过用0.12M磷酸钠(pH6.8)/0.02%SDS/0.02%叠氮化钠平衡的羟基磷灰石小柱,并使用标准步骤通过闪烁法(scintillation)对洗脱液进行计数。(与柱保持结合的计数百分比对应于杂交探针)。Tm值计算为50%最初形成的杂合体热变性为单链物质时的温度。带有L1-插入的探针的Tm为69℃,带L1-替换的探针的Tm为66℃。数据表明,两种探针都与预期的靶标rRNA杂交,“插入”探针的Tm比“替换”探针的Tm高约3度。
实施例5:证明了“L1”修饰的脱氧寡核苷酸被生物素和荧光素标记的能力
(a)使用32P标记5'-(L1)-和5'-(L1)-(L1)-修饰的脱氧寡核苷酸“5'-L1-GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-3'”(SEQ ID NO 1)和“5'-L1-L1-GCTCGTTGCCCCACTTAACCCAACAT-3'”(SEQ ID NO 3)。
材料:α-32P三磷酸腺苷购自新英格兰核(New England Nuclear)(美国马萨诸塞州波士顿杜邦(DuPont,Boston,MA,USA))。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和5X拖尾缓冲液(tailing buffer)是贝塞斯达研究实验室(Bethesda Research Laboratories)(美国马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,MD,U.S.A.))的产品。
在37℃下使20pmol 5'-(L1)-(L1)修饰的寡核苷酸与16.5pmol的α-32P三磷酸腺苷(比活度为3000Ci/mmol)和40单位的TdT于20μL 1X拖尾缓冲液中反应1小时。所得32P标记的寡核苷酸在Nensorb-20(TM)柱(New England Nuclear,DuPont Corp.,Boston,MA,U.S.A.)上根据制造商的步骤(其通过引用并入本文)进行纯化。
(b)使32P标记的5'-(L1)-(L1)-寡核苷酸与生物素-ε-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺(“Bio-X-NHS”,Calbiochem-Behring Corp.,SanDiego,CA,USA)反应。链霉亲和素-琼脂糖购自贝塞斯达研究实验室(Bethesda Research Laboratories),并且D(+)生物素购自Calbiochem-Behring Corp。
使1pmol上述每种修饰寡核苷酸与2.5mM Bio-X-NHS在含有12.5%二甲基亚砜的125mM硼酸盐缓冲液(pH 9)中反应1.5小时。然后,然后在存在(“非特异性结合”)或不存在(“特异性结合”)0.2mg/mL D(+)生物素的情况下,在50mM磷酸钠(pH 7.4)/2mM乙二胺四乙酸/0.5M氯化钠中测试所得反应混合物的小等分试样与链霉亲和素-琼脂糖的结合情况。通过闪烁计数对结合材料进行量化:对于寡核苷酸5'-(L1),非特异性结合百分比为0.3%,特异性结合百分比为71.8%;对于寡核苷酸5'-(L1)-(L1),非特异性结合百分比为0.5%,特异性结合百分比为90.3%。
通过在20%聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶上对上述反应混合物的等分试样中的寡聚体进行电泳分离,也证实了生物素与这些L1修饰的寡聚体的连接。通过放射自显影使代表性条带可视化,表明几乎定量转化为生物素化的形式,其迁移速度比非生物素化的对照慢。
(c)实施例4(c、d)中描述的3'-L1-修饰的脱氧寡核苷酸{“5'-AAATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT-L1-3'”(SEQ ID NO 2)和“5'-CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATTT-L1-3'”(SEQ ID NO 4)}分别用异硫氰酸酯荧光素和生物素-X-NHS进行标记。寡核苷酸首先用[.γ.-32P]三磷酸腺苷根据Maxam和Gilbert的方法(美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.),第74卷,第560页,1977)使用T4-多核苷酸激酶进行标记。
使第一个修饰的寡核苷酸与异硫氰酸酯荧光素(FITC,美国密苏里州圣路易斯西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA))反应。40pmol该寡聚体用90mMFITC于含有90%二甲基亚砜的0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9)中处理寡聚体12小时。然后,通过在20%聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶上电泳分离反应混合物。通过放射自显影使条带可视化。切除每个泳道的最上面的条带,从凝胶中回收FITC标记的寡聚体并纯化。
使用抗FITC抗体衍生的固体载体的结合测定来确认荧光素与上述寡核苷酸的连接。抗FITC磁性微球购自先进磁学公司(Advanced Magnetics,Inc.)(美国马萨诸塞州剑桥市(Cambridge,MA,U.S.A.)),产品目录#4310。在存在(“非特异性结合”)或不存在(“特异性结合”)20mM水解FITC的情况下,纯化的32P标记的FITC修饰的寡核苷酸的等分试样与含有20μL抗FITC微球的0.5mL缓冲溶液(50mM磷酸钠,pH 7.4/2mM乙二胺四乙酸/0.5M氯化钠)混合。1小时后,通过磁分离除去微球,通过契伦科夫辐射(Cherenkov radiation)对上清液进行计数,以确定结合材料的量:非特异性结合百分比为0.1%,特异性结合百分比为80.2%。
使第二个修饰的寡核苷酸与生物素-X-NHS反应。该寡聚体使用10mM Bio-X-NHS于含有20%二甲基亚砜的0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9)中处理40pmol 1小时。所得生物素化的寡聚体通过如上所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。如本实施例中所述,通过分析链霉亲和素-琼脂糖上的结合来证实生物素与该寡核苷酸的连接的存在:非特异性结合百分比为0.3%,特异性结合百分比为87.4%。
实施例6:3'-L1修饰的脱氧寡核苷酸对磷酸二酯酶催化水解的抗性
材料:来自南美响尾蛇(Crotalus durissus)的磷酸二酯酶购自勃林格曼海姆生物化学公司(Boehringer-Mannheim Biochemicals)(美国印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN,U.S.A.))。这种酶催化从寡核苷酸的3'-末端进行核酸外切。使用标准亚磷酰胺化学在应用生物系统公司(Applied Biosystems)380A型DNA合成仪上合成具有序列“5'-AAATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT-3'”(SEQ ID NO 2)的合成脱氧寡核苷酸。根据实施例4中给出的步骤合成具有相同序列但连接有3'-L1接头的探针。
两种寡核苷酸均用32P根据实施例5所述的方法进行标记。使大约350,000CPM的各标记的寡核苷酸在含有3×10-5或3×10-6单位的磷酸二酯酶的10μL缓冲液(0.1M三(羟甲基)氨基甲烷)盐酸盐,pH 8.0/20mM氯化镁)中反应。以5分钟、10分钟、15分钟和30分钟的时间间隔取出1.5μL(一又二分之一微升(one and1/2μL))等分试样;通过添加3μL 0.1N氢氧化钠淬灭反应。接下来,将5μL的含有溴苯蓝和二甲苯青(xylene cyanol)FF染料的90%甲酰胺添加到每个等分试样中,并将所得样品在20%聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶上进行电泳分离。然后,通过放射自显影分析凝胶。
发现对于两种测试酶的浓度而言,3'-L1修饰的寡核苷酸在30分钟后对磷酸二酯酶催化的水解具有大于95%的抗性。然而,在凝胶上基本上没有可见的全长未修饰的寡核苷酸,这表明该酶通常切割不含3'-L1基团的寡聚体。
实施例7:基于2,2-二-(3-氨基丙基)-1,3-丙二醇的接头试剂自动引入合成寡核苷酸
实施例2,试剂10中描述的接头试剂(下文称为“L2”)插入在合成寡核苷酸的碱基之间,产生序列“5'-CGTTACTCGGATGCCCAAAT(L2)ATCGCCACATTCG-3'”(SEQ ID NO 5)。所用方法类似于实施例4(a)中所述的方法,不同之处在于使“L2”溶液(0.1M于乙腈中)在第十三个偶联循环中反应,而不是在实施例4(a)中描述的最后一个偶联循环中反应。与“L2”偶联的效率为约30%,如根据释放的二甲氧基三苯甲基的量所估计的(参见实施例4(a))。
实施例8:基于3-氨基-1,2-丙二醇的接头试剂自动结合到合成寡核苷酸
根据实施例4(a)给出的步骤,将该接头(试剂(13),下文称为“L3”)引入具有序列“5'-CCCGCACGTCCCTATT(L3)AATCATTACGATGG-3'”(SEQ ID NO 6)的合成寡核苷酸中。在本实施例中,“L3”溶液(0.3M于无水乙腈中)在第十五次偶联循环中反应;该步骤的偶联效率为约60%,根据二甲氧基三苯甲基释放估计(参见实施例4(a))。
实施例8(A):接头试剂(20)、(21)、(22)、(23)和(24)自动引入合成寡核苷酸
接头试剂(20-24)(其合成如上文实施例3(A)-3(D)中所述)的引入如上文实施例4,部分(a)中所述。与这些试剂相关的相应接头在下文中分别称为“L4”、“L5”、“L6”、“L7”和“L8”。因此,在对应于使用上述试剂之一的特定情况下,在应用生物系统公司(AppliedBiosystems)380A型DNA合成仪的#6位置加载0.12-0.2M的所述试剂的无水乙腈溶液。使用标准亚磷酰胺偶联方案将试剂引入寡核苷酸聚合物中。制备了一系列寡核苷酸,长度范围为17至35个碱基,每个接头L4-L8插入序列内的不同位置。与这些试剂相关的偶联效率在75%和98%之间,如偶联循环结束时二甲氧基三苯甲基释放所测得的。
实施例9:用吖啶酯标记胺接头臂探针以及随后的纯化。
吖啶酯N-羟基琥珀酰亚胺标记试剂的25mM储备溶液(关于组成,请参阅I.Weeks等人,临床化学(Clin.Chem.),第29卷,第1474页,1983)在经蒸馏的二甲基亚砜中制备。将实施例4、7或8(A)中产生的所需量的聚合物在1.5mL锥形聚丙烯管中蒸发至干。通过按所列顺序添加以下成分来构建以下组合物:3μL水、1μL 1M的4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(pH8.0)、4μL二甲基亚砜(蒸馏)和2μL 25mM吖啶酯N-羟基琥珀酰亚胺标记试剂于二甲基亚砜(蒸馏)中。将混合物涡旋,在微量离心机中旋转2秒(以将内容物带到管底),并在37℃下温育20分钟。此时,将以下组分按所列顺序添加到反应组合物中:3.0μL 25mM吖啶酯N-羟基琥珀酰亚胺标记试剂的二甲基亚砜(蒸馏)、1.5μL水和0.5μL 1M 4-(2-羟乙基))哌嗪-1-乙磺酸(pH8.0)。再次将组合物涡旋,旋转,并在37℃下再温育20分钟。通过加入5μL0.125M赖氨酸于0.1M 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(pH 8.0)、50%二甲基亚砜中,使用5倍过量的赖氨酸淬灭未反应的标记物,并在室温下温育5分钟。
此时,使用以下方法纯化吖啶酯标记的寡聚体。向20μL猝灭反应混合物中加入30μL 3M乙酸钠(pH 5.0)、245μL水和5μL糖原作为载体(对糖原进行预处理以去除任何核酸酶活性)。将样品短暂涡旋,并加入640μL无水乙醇。将样品短暂涡旋,并在冰上温育5-10分钟,然后在微量离心机中以15,000rpm离心5分钟。小心去除上清液,并将沉淀物重新溶解在20μL 0.1M乙酸钠(pH 5.0)、0.1%SDS中。样品通过离子交换高效液相色谱(HPLC)进一步纯化如下:将20μL重新溶解的沉淀物注射到安装在IBM 9533 HPLC系统中的Nucleogen-DEAE60-7离子交换HPLC柱。该过程中使用的所有缓冲液均由HPLC级水、乙腈和乙酸钠以及试剂级冰醋酸和氯化锂制成。此外,所有缓冲液在使用前都通过0.45um孔径Nylon-66过滤器过滤。在具有总共26个单体单元且其中只有一个是非核苷酸单体单元的核苷酸/非核苷酸多聚体的特定情况下,采用以下洗脱方案。缓冲液A为20mM乙酸钠(pH5.5)、20%乙腈;缓冲液B为20mM乙酸钠(pH 5.5)、20%乙腈和1M氯化锂。以1mL/min的流速在25分钟内使用从55%缓冲液A、45%缓冲液B到30%缓冲液A、70%缓冲液B的线性梯度进行洗脱。在运行期间,监测在260nm处的吸光度;在1.5mL锥形聚丙烯管中收集0.5mL级分。运行后立即将5μL的10%SDS添加到每个管中,然后将每个管涡旋(这是为了确保吖啶酯标记的探针不会吸附到管壁上)。从级分21-42中取出0.5μL等分试样,并添加到12×75mm管中的200μL水中(每个等分试样使用单独的移液管尖端以避免残留问题)。然后在Berthold Clinilumat中通过自动注入200μL0.25N硝酸、0.1%过氧化氢来测定每个等分试样的化学发光,然后在延迟1秒后加入200μL1N氢氧化钠,并读取化学发光10秒。
级分29-33通过向各级分加入5μL糖原、涡旋(vortexing)、向各级分加入1mL乙醇、涡旋、在冰上温育5-10分钟并在微量离心机中以15,000rpm离心5分钟进行乙醇沉淀。小心去除各上清液,将各沉淀物重新溶解在20μL 0.1M乙酸钠(pH 5)、0.1%SDS中,然后合并这些单独的级分。
实施例10:N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-3-氨基-1,2-丙二醇的合成
下文描述了基于3-N-(6-氨基己酰基)-氨基-1,2-丙二醇的接头试剂(23)的3-氨基-1,2-丙二醇异构体氰乙基衍生物的单一丙二醇对映体的合成。
实施例10(A):N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(38)的合成
(a)N-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护形式的6-氨基己酸(N-Fmoc-6-氨基己酸,化合物(28))的合成。
材料:9-芴基甲基N-琥珀酰亚胺碳酸酯来自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,U.S.A.))。其他材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:该合成基本上如实施例3(C)(a)中所述和图7a所示进行。简而言之,向656mg(5mmol)的6-氨基己酸和420mg(5mmol)的碳酸氢钠在水(7mL)和丙酮(7mL)的混合物中的搅拌溶液中加入1.68g(5mmol))的9-芴基甲基N-琥珀酰亚胺碳酸酯。在环境温度下搅拌过夜后,用浓盐酸将混合物酸化至pH 2,真空除去丙酮。将产品溶于氯仿中,并用0.1N HCl和水洗涤。通过减压旋转蒸发将合并的有机相浓缩至干,并将残余物从二氯甲烷-己烷中结晶,得到化合物(28),为白色固体(1.66g,4.70mmol,94%)。液相色谱质谱(LCMS)分析表明产物的纯度为99.9%,m/z为354.2(M+1)。
(b)N-Fmoc-6-氨基己酸(28)与(S)-3-氨基-1,2-丙二醇的偶联形成化合物(36)。
材料:(S)-3-氨基-1,2-丙二醇来自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。其他材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:该合成如下进行,类似于实施例3(C)(b)中的描述并且如图9a所示。化合物(28)(1.3g,3.68mmol)首先通过与吡啶(2×5mL)共蒸发进行干燥。然后,将残余物溶解在无水二甲基甲酰胺(2.5mL)和无水四氢呋喃(2.5mL)的混合物中。将所得溶液冷却至0–5℃的冰浴中,在该温度下加入N,N-二异丙基乙胺(0.7mL,4.02mmol),然后在相同温度下在搅拌下在5分钟内缓慢加入三甲基乙酰氯(1mmol)。在冰浴中继续搅拌45分钟以形成化合物(35),其无需分离即可使用。接下来,在0-5℃下在5分钟内加入(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(4.02g,4.41mmol)的无水二甲基甲酰胺溶液(2.5mL),并使所得混合物升温至室温并搅拌3小时。LCMS分析表明反应已完成91%。然后,反应混合物通过减压旋转蒸发浓缩,用乙酸乙酯(100mL)稀释并转移至分液漏斗。有机溶液用饱和碳酸氢钠水溶液(2×50mL)和水(50mL)洗涤。用无水硫酸镁干燥后,通过减压旋转蒸发将有机层浓缩至干。将粗产物溶解在甲醇(2mL)中,并施用到含有40克硅胶的快速色谱柱上。用二氯甲烷/甲醇的40:1溶液(v/v)(500mL)洗脱柱,同时提取25mL级分。通过薄层色谱法分析级分的产物含量,将含有产物的级分和并,并通过减压旋转蒸发浓缩。反应产生1.289g(3.02mmol,82%)化合物(36),为白色固体,LCMS分析纯度为98.0%,m/z为427.3(M+1)。
(c)化合物36的1-O-二甲氧基三苯甲基化以形成1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇(37)。
材料:材料在在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:该合成如下进行,类似于实施例3(C)(c)中的描述,并且如图9b所示。化合物(36)(0.644g,1.51mmol)通过与无水吡啶(2x5mL)共蒸发进行干燥。然后,将其溶解在无水吡啶(6.5mL)中,并在环境温度下在搅拌下滴加4,4'-二甲氧基三苯基甲基氯(0.588g,1.74mmol)在二氯甲烷/吡啶(6.5mL)的9:1混合物中的溶液。通过硅胶薄层色谱法使用二氯甲烷/甲醇(8:1)溶剂体系监测反应表明反应完成时,继续搅拌2小时。通过加入甲醇(0.2mL)淬灭反应;继续搅拌10分钟。通过减压旋转蒸发除去吡啶。将残余物溶解在二氯甲烷(150mL)中,并用饱和碳酸氢钠水溶液(2×50mL)洗涤,然后用水(50mL)洗涤。用无水硫酸镁干燥后,通过减压旋转蒸发除去二氯甲烷溶液。根据上述方法,使用含有0.1%吡啶的二氯甲烷/乙酸乙酯(11:5)溶剂体系通过硅胶快速色谱法纯化残余物。如上所述,通过硅胶薄层色谱法鉴定含有产物的级分。合并这些级分,并通过减压旋转蒸发浓缩,得到0.96g(1.32mmol,87%产率)中间体1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇(37),为白色固体。TLC分析的单个斑点证实了该材料的纯度。
(d)1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(37)转化为N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(38)。
材料:材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:该合成如下进行,类似于实施例3(C)(d)中的描述,并且如图9c所示。1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(37)(0.84g,1.15mmol)通过与无水吡啶(2×6mL)共蒸发进行干燥。然后,将其溶解在无水二氯甲烷(6mL)中,并在环境温度下在搅拌下加入N,N-二异丙基乙胺(0.8mL,4.59mmol)。接着,在氩气气氛下在搅拌下在5分钟内滴加2-氰乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.385mL,1.72mmol)。使用二氯甲烷/乙酸乙酯/三乙胺(10:5:0.5)溶剂体系,通过硅胶薄层色谱法发现反应在20分钟后完成。然后,将反应混合物稀释到乙酸乙酯中,并用饱和碳酸氢钠水溶液(2×25mL)洗涤。用无水硫酸镁干燥后,乙酸乙酯层通过减压旋转蒸发浓缩至干。将残余物重新溶解在乙酸乙酯(3mL)中,并在-25℃下倒入己烷(150mL)中。将沉淀物过滤并真空干燥5小时,得到0.882g(0.950mmol,82%产率)的所需产物N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(38),为白色泡沫状物。结构通过1H-NMR(苯-d6)分析得到证实:(ppm)1.08-1.17(m,20H),1.47-1.54(m,2H),1.71-1.74(m,1H),1.84-1.87(m,2H),2.91-2.95(m,1H),3.32,3.34(2s,6H),3.40-3.50(m,4H),3.66-3.75(m,2H),4.04(q,1H),4.45-4.48(m,2H),5.48(t,0.5H),5.75(t,0.5H),6.79(t,4H),7.08(t,1H),7.19-7.24(m,6H),7.48-7.52(m,6H),7.60(d,2H),7.67(t,2H)。
实施例10(B):N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O的合成1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(39)
N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(39),如图10所示,除了使用(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(Sigma-Aldrich)代替(S)-3-氨基-1,2-丙二醇之外,基本上与试剂(38)一样进行合成。下面仅给出结果。
(b)N-Fmoc-6-氨基己酸(28)与(R)-3-氨基-1,2-丙二醇偶联形成化合物(40)。
材料:(R)-3-氨基-1,2-丙二醇来自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。其他材料在前述实施例中进行了描述,见上。
结果:反应产生1.3g(3.05mmol,83%)化合物(40),为白色固体,LCMS分析纯度为98.3%,m/z为427.3(M+1)。
(c)化合物(40)的1-O-二甲氧基三苯甲基化以形成1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(R)-氨基-1,2-丙二醇(41)。
材料:材料在前述实施例中进行了描述,见上。
结果:反应产生1.01g(1.38mmol,90%)中间体1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(R)-氨基-1,2-丙二醇(41),为白色固体。TLC分析证实了该材料的纯度。
(d)1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(41)转化为N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(39)。
材料:材料在前述实施例中进行了描述,见上。
结果:反应产生1.00g(1.08mmol,96%)所需产物N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(39),为白色泡沫状物。结构通过1H-NMR分析(苯-d6)得到证实:(ppm)1.03(d,4H),1.10-1.15(m,10H),1.15(t,6H),1.50-1.54(m,2H),1.69-1.74(m,1H),1.85-1.88(m,2H),2.92-2.96(m,1H),3.33,3.34(2s,6H),3.43-3.49(m,4H),3.67-3.73(m,2H),4.05(q,1H),4.45-4.48(m,2H),5.52(t,0.5H),5.78(t,0.5H),6.79(t,4H),7.07(t,1H),7.19-7.25(m,6H),7.48-7.52(m,6H),7.60(d,2H),7.67(t,2H)。
实施例11:更短和更长的N-(芴基甲氧基羰基氨基)烷基酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-3-氨基-1,2-丙二醇的合成
实施例11(A):更短和更长的N-(芴基甲氧基羰基氨基)烷基酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(40、41、42、43)的合成
具有更短和更长烷基的N-(芴基甲氧基羰基氨基)烷基酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(40、41、42、43)在图11中说明。它们基本上与实施例10(A)中的试剂(38)一样进行合成,不同之处在于使用4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸或8-氨基辛酸(Sigma-Aldrich)代替6-氨基己酸。从本实施例可以看出,技术人员可以理解的是,可容易地合成具有更短或更长烷基的产品。
实施例11(B):更短和更长的N-(芴基甲氧基羰基氨基)烷基酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(44、45、46、47)的合成
具有更短和更长烷基的N-(芴基甲氧基羰基氨基)烷基酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(44、45、46、47)在图11中说明。它们基本上与实施例10(B)中的试剂(39)一样进行合成,不同之处在于使用4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸或8-氨基辛酸(Sigma-Aldrich)代替6-氨基己酸。从本实施例可以看出,技术人员可以理解的是,可容易地合成具有更短或更长烷基的产品。
实施例12:N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-3-氨基-1,2-丙二醇的合成
实施例12(A):N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(48)的合成
N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(48)在图12中说明,其基本上如P.S.Nelson等人所述(核酸研究(Nucleic Acids Res.),第17卷,第7179页,1989)进行合成,不同之处在于使用(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(Sigma-Aldrich)代替(±)-3-氨基-1,2-丙二醇。
实施例12(B):N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(49)的合成
N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(49)示于图12中,其基本上如P.S.Nelson等人所述(核酸研究(Nucleic Acids Res.),第17卷,第7179页,1989)进行合成,不同之处在于使用(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(Sigma-Aldrich)代替(±)-3-氨基-1,2-丙二醇。
实施例13:N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇的合成
实施例13(A):N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(50)的合成
N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(50)示于图13中,其基本上如实施例12中所述合成,不同之处在于使用2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(Sigma-Aldrich)代替(±)-3-氨基-1,2-丙二醇。然而,有一个附加步骤,在合成过程中,用二甲氧基三苯甲基保护羟基基团导致碳2变为手性,中间体变为N-Fmoc-O1-DMT-(±)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇的外消旋混合物。该混合物的对映体在烷基、芳基或手性相柱或层介质上进行色谱分离。收集N-Fmoc-O1-DMT-(R)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇异构体并用于最后的合成步骤,得到N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(50)。或者,N-Fmoc-O1-DMT-(±)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇的外消旋混合物不分离为其对映体。取而代之的是,该混合物用于最后一步合成非对映体N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(±)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇混合物。从该混合物中,在烷基、芳基或手性相柱或层介质上色谱分离N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(50),并作为产物收集。
实施例13(B):N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(51)的合成
N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(51)示于图13中,并且其基本上如实施例12中所述合成,不同之处在于使用2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(Sigma-Aldrich)代替(±)-3-氨基-1,2-丙二醇。本实施例中使用了与实施例13(A)相同的附加步骤或其替代步骤,但在本实施例中为收集N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-2-(氨基甲基)-1,3-丙二醇(51)作为产物。
实施例14:N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-2-氨基丁基-1,3-丙二醇的合成
实施例14(A):N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(52)的合成
N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(52)示于图14,并且其基本上如P.S.Nelson等人所述(核酸研究(Nucleic AcidsRes.),第20卷,第6253页,1992)进行合成。然而,有一个附加步骤,在合成过程中,用二甲氧基三苯甲基保护羟基基团导致碳2变为手性,中间体变为N-Fmoc-O1-DMT-(±)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇的外消旋混合物。该混合物的对映体在烷基、芳基或手性相柱或层介质上进行色谱分离。收集N-Fmoc-O1-DMT-(R)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇异构体并用于最后的合成步骤,得到N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(52)。或者,N-Fmoc-O1-DMT-(±)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇的外消旋混合物不分离为其对映体。取而代之的是,该混合物用于最后一步合成非对映体N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(±)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇混合物。从该混合物中,在烷基、芳基或手性相柱或层介质上进行色谱分离N-Fmoc-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(52),并作为产物收集。
实施例14(B):N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(53)的合成
N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(53)示于图14中,其基本上如P.S.Nelson等人所述(核酸研究(Nucleic AcidsRes.),第20卷,第6253页,1992)进行合成。。本实施例中使用了与实施例14(A)相同的附加步骤或其替代步骤,但在本实施例中为收集N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(53)作为产物。
实施例15:N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-2-氨基-1,3-丙二醇的合成
实施例15(A):N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(S)-2-氨基-1,3-丙二醇(54)的合成
N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(S)-2-氨基-1,3-丙二醇(54)示于图51中,并且其基本上按照P.S.Nelson等人(美国专利号8,394,948,2013年3月12日授权)中的描述进行合成。然而,有一个附加步骤,在合成过程中,用二甲氧基三苯甲基保护羟基导致碳2变为手性,中间体变为N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-(±)-2-氨基-1,3-丙二醇的外消旋混合物。该混合物的对映体在烷基、芳基或手性相柱或层介质上进行色谱分离。收集N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-(R)-2-氨基-1,3-丙二醇异构体并用于最后的合成步骤,得到N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(S)-2-氨基-1,3-丙二醇(54)。或者,N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-(±)-2-氨基-1,3-丙二醇的外消旋混合物不分离为其对映体。取而代之的是,该混合物用于最后一步合成非对映体N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(±)-2-氨基-1,3-丙二醇混合物。从该混合物中,在烷基、芳基或手性相柱或层介质上进行色谱分离N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(S)-2-氨基-1,3-丙二醇(54),并作为产物收集。
实施例15(B):N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(R)-2-氨基-1,3-丙二醇(55)的合成
N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(R)-2-氨基-1,3-丙二醇(55)示于图15中,并且其基本上按照P.S.Nelson等人(美国专利号8,394,948,2013年3月12日授权)中的描述进行合成。在本实施例中使用与实施例15(A)相同的附加步骤或其替代步骤,但在本实施例中为收集N-(芴基甲氧基羰基氨基)丙酰氨基-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-(R)-2-氨基-1,3-丙二醇(55)作为产物。
实施例16:N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-3-氨基-1,2-丙二醇接头(38、39)与寡核苷酸的自动连接
现在将描述实施例10中描述的接头试剂与各种合成寡核苷酸的连接,得到5'-3'3-氨基-1,2-丙二醇接头。
(a)使用标准3'-β-氰乙基亚磷酰胺化学,在合成寡核苷酸的碱基之间插入实施例10(A)中描述的接头试剂——试剂(38),下文称为“L9”,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCG(L9)ACGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 7)。所用方法类似于实施例4(a)中所述的方法,不同之处在于使“L9”溶液(0.1M于乙腈中)在第十三个偶联循环中反应,而不是如实施例4(a)中所述在最后一个偶联循环中反应。
(b)“L9”的引入是使用标准3'-β-氰乙基亚磷酰胺化学在合成寡核苷酸的碱基之间,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCA(L9)GCGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 8)。所用方法类似于实施例16(a)中描述的方法。
(c)使用标准3'-β-氰乙基亚磷酰胺化学,在合成寡核苷酸的碱基之间插入实施例10(B)中描述的接头试剂——试剂(39),下文称为“L10”,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCG(L10)ACGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 7),实施例16(a)中序列的差向异构体。所用方法类似于实施例16(a)中描述的方法,不同之处在于使用“L10”而不是“L9”。接头附近的结构如图16中的(56)所示。
(d)“L10”的引入是使用标准3'-β-氰乙基亚磷酰胺化学在合成寡核苷酸的碱基之间,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCA(L10)GCGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 8),实施例16(b)中序列的差向异构体。所用方法类似于实施例16(c)中描述的方法。
实施例17:N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-3-氨基-1,2-丙二醇接头(38、39)与寡核苷酸的自动连接
现将描述实施例10中描述的接头试剂与各种合成寡核苷酸的连接,产生5'至3'2'-氨基-1,2-丙二醇接头。
(a)接头试剂“L9”的引入使用5'-β-氰乙基亚磷酰胺化学在合成寡核苷酸的碱基之间插入,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCG(L9)ACGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 7)。所用方法类似于实施例16(a)中所述的方法,不同之处在于使用5'-β-氰乙基亚磷酰胺而不是3'-β-氰乙基亚磷酰胺。
(b)“L9”的引入是使用5'-β-氰乙基亚磷酰胺化学在合成寡核苷酸的碱基之间,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCA(L9)GCGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 8)。所用方法类似于实施例17(a)中描述的方法。
(c)接头试剂“L10”的引入使用5'-β-氰乙基亚磷酰胺化学在合成寡核苷酸的碱基之间插入,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCG(L10)ACGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 7),实施例17(a)中序列的差向异构体。所用方法类似于实施例17(a)中描述的方法,不同之处在于使用“L10”的方案而不是“L9”。接头附近的结构如图16中的(57)所示。
(d)“L10”的引入是使用5'-β-氰乙基亚磷酰胺化学在合成寡核苷酸的碱基之间,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCA(L10)GCGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 8),实施例17(b)中序列的差向异构体。所用方法类似于实施例17(c)中描述的方法。
实施例18:用吖啶酯标记胺接头臂探针以及纯化
吖啶酯N-羟基琥珀酰亚胺标记试剂的25mM储备溶液(关于组成,请参阅I.Weeks等人,临床化学(Clin.Chem.),第29卷,第1474页,1983)在无水二甲基亚砜(AMRESCO,美国俄亥俄州索伦(Solon,OH,U.S.A.))中制备。实施例16中产生的聚合物通过阴离子交换HPLC纯化并脱盐。实施聚合物通过在1.5mL锥形聚丙烯管中沉淀浓缩如下:合并1-10nmol聚合物、水至85μL,5μL 40mg/mL糖原(美国加利福尼亚州圣克拉拉市昂飞(Affymetrix,SantaClara,CA,U.S.A.))和10μL 2M氯化钠(美国马塞诸塞州沃德希尔的阿法埃莎(Alfa Aesar,Ward Hill,MA,U.S.A.)),涡旋混合,加入250μL冷乙醇(美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德的电镜显微科学公司(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA,U.S.A.)),涡旋混合,在4℃下温育过夜;在室温下在微量离心机中以12,000×g离心30分钟,去除上清液,加入500μL冷70%乙醇,去除上清液,室温风干1-2小时。
通过将成分添加到聚合物沉淀物中并按所列顺序处理来构建以下标记组合物:8μL 50%二甲基亚砜于0.125M 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(pH8.0;AMRESCO)中,涡旋混合,2μL 25mM吖啶酯N-羟基琥珀酰亚胺标记试剂(加拿大安大略省多伦多市的多伦多研究化学公司(Toronto Research Chemicals,Toronto,Ontario,Canada))于二甲基亚砜中混合,涡旋混合,在微量离心机中旋转2秒(以将内容物带到管底),在37℃下温育20分钟,3μL 25mM吖啶酯N-羟基琥珀酰亚胺标记试剂于二甲基亚砜中,涡旋混合,2μL 0.25M 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(pH 8.0),涡旋混合,在37℃下温育20分钟。
将标记聚合物于15μL反应物中从未反应的吖啶酯标记物中分离如下:将15μL反应物、75μL水和10μL 2M氯化钠混合,涡旋混合,加入250μL冷乙醇,涡旋混合,在20℃下温育60分钟;在室温下在微量离心机中以12,000x g离心10分钟,去除上清液,加入500μL冷70%乙醇,去除上清液,室温风干沉淀物1-2小时;加入50μL探针试剂(10mM琥珀酸(美国俄勒冈州波特兰的TCI美国公司(TCI America,Portland,OR,U.S.A.))、0.1%十二烷基硫酸锂(美国伊利诺伊州伍德戴尔市的Chem-Impex公司(Chem-Impex,Wood Dale,IL,U.S.A.)),pH5.0),涡旋混合,在室温下避光温育30分钟,混合,在-20℃下保存。
无论采用何种纯化方法,吖啶酯标记的聚合物都按照N.C.Nelson等人(在“非同位素探测、印迹和测序”中通过化学发光检测吖啶酯(Detection of Acridinium Esters byChemiluminescence in“Nonisotopic Probing,Blotting,and Sequencing),”Kricka,L.J.,(Ed.),第391-428页,1995,学术出版社(Academic Press))对核酸含量和发光比活性进行量化。
(b)或者,未标记的聚合物通过在1.5mL锥形聚丙烯管中沉淀浓缩如下:合并1-10nmol聚合物、水至40μL-100μL,糖原至约2mg/mL且氯化钠至约0.2M,涡旋混合,加入比水相多2.5倍的冷乙醇,涡旋混合,在4℃下温育过夜或在-20℃下温育60-120分钟;在室温下微量离心机中以12,000×g离心30分钟,去除上清液,加入约500μL冷70%乙醇,去除上清液,室温风干1-2小时。
(c)或者,标记的聚合物与未反应的吖啶酯标记物通过在1.5mL锥形聚丙烯管中沉淀分离,如下所示:合并标记反应物、水至40μL-100μL,氯化钠至约0.2M,涡旋混合,加入比水/二甲基亚砜级分多2.5倍的冷乙醇,涡旋混合,在-20下温育60-120分钟;在室温下在微量离心机中以12,000x g离心10分钟,去除上清液,加入200-500μL冷70%乙醇,去除上清液,室温风干沉淀1-2小时;加入20-50μL探针试剂(约10mM琥珀酸、约0.1%十二烷基硫酸锂,约pH 5.0),涡旋混匀,在室温下避光温育30分钟,混合,在-20℃下保存。
在吖啶酯标记的聚合物进一步纯化的情况下,方法同实施例9所述。
实施例19:吖啶酯标记的聚合物与核酸的杂交
使吖啶酯标记的聚合物与核酸在溶液中结合,所述溶液含有与聚合物互补的序列(完全匹配)、除一个位置外与聚合物互补的序列(单核苷酸错配)以及与聚合物基本上不互补的序列。此外,以相同方式处理吖啶酯标记的聚合物,不同之处在于不存在其他核酸序列。与实施例18相同的材料来自相同的来源。
(a)发生这些结合反应的杂交试剂由缓冲剂、盐、金属离子螯合剂和表面活性剂组成:0.1M琥珀酸、0.4M氯化锂(AMRESCO)、0.001M乙二胺四乙酸(Alfa Aesar)、0.001M乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(J.T.Baker)和5%的十二烷基硫酸锂,用氢氧化锂(美国新泽西州的阿克罗斯有机物公司(Acros Organics,NJ,U.S.A.))将pH值调节至4.9。
(b)杂交反应如下。将1pmol吖啶酯标记的聚合物和5pmol匹配或错配的核酸序列或没有额外的核酸序列,以200μL的总体积和实施例19(a)中杂交试剂的最终浓度进行混合。该混合物在60℃下温育15min,然后室温温育15min,以形成杂交产物。
(c)杂交试剂的替代制剂包括缓冲剂、盐、金属离子螯合剂和表面活性剂,浓度范围如下:0.02-0.40M琥珀酸、0.05-0.8M氯化锂、0-0.02M乙二胺四乙酸、0-0.02M乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸和1-10%十二烷基硫酸锂,用氢氧化锂将pH值调节至4.5-5.5。
(d)杂交试剂的其他替代制剂包括除琥珀酸以外的缓冲剂(例如柠檬酸或乙酸)、除氯离子以外的阴离子(例如溴离子或硫酸根)以及除锂以外的阳离子(例如钠或钾)。这些组分的浓度范围如实施例19(c)所示。
(e)替代步骤用于杂交。这些步骤使用约0.001至10pmol的吖啶酯标记的聚合物和约1amol至100pmol的匹配或错配的核酸序列。体积范围从约10μL至约1,000μL。制剂如实施例19(a)、19(c)和19(d)中所述。这些混合物在约30-70℃下温育约5-60分钟,甚至长达约16-24小时,然后在室温下温育约1-60分钟,以形成杂交产物。
(f)其他替代步骤用于杂交。混合物在约30-70℃下温育约5-60分钟,然后以约0.1-5℃/min的受控速率冷却,直到它们达到预设温度,以形成杂交产物。
实施例20:吖啶酯探针的可控水解
通过水解对连接到聚合物上的吖啶酯进行修饰会产生不化学发光的吖啶羧酸。吖啶酯探针的受控水解是基于不与其他核酸结合的或与部分错配的核酸结合的吖啶酯标记的聚合物比与接头附近完全匹配的核酸结合的那些具有更大的修饰程度。在短时间间隔后,测量修饰程度以确定反应的相对有效性。较大程度的修饰由较低的化学发光信号证明,而较小程度的修饰由较高的化学发光信号证明。
(a)如实施例19(a)和19(b)中所述,使吖啶酯标记的聚合物与完全匹配或错配的核酸结合(或类似地反应但不存在其他核酸)。将这些溶液稀释10倍,混合,然后将25μL等分试样分配到12×75mm聚苯乙烯管中。通过向每个管中添加250μL碱性水解试剂{0.15M四硼酸钠(Alfa Aesar),pH 8.5、5%(v/v)Triton X-100(美国爱荷华州波伊斯塔的IBI科学(IBI Scientific,Peosta,IA,U.S.A.))}进行吖啶酯探针的受控水解,涡旋混合管,并在60℃下温育不同时间,最长15分钟。然后将管在冰水浴中冷却1分钟,并在室温水浴中冷却1分钟。用湿布擦拭每个管的外部,然后插入光度计(如Leader50)。然后通过自动注入200μL第一引发试剂{0.0044%(v/v)硝酸水溶液(美国马萨诸塞州比勒利卡的EMD(EMD,Billerica,MA,U.S.A.))和0.1%(v/v)过氧化氢(EMD)},然后在2秒延迟后注入200μL第二引发试剂{4%(w/v)氢氧化钠水溶液(AMRESCO)}并读取化学发光2秒来测定各等分试样的化学发光。在这些条件下,约3分钟后,信号的下降转变至非线性或以较慢速率下降的第二线性阶段。
(b)吖啶酯探针的受控水解如实施例20(a)中进行,不同之处在于将150至500μL的水解试剂添加到每个管中。
(c)吖啶酯探针的受控水解如实施例20(a)进行,不同之处在于水解试剂由0.05-0.5M四硼酸钠,pH 7.5-9.1、0.5-5%Triton X-100组成。
(d)吖啶酯探针的受控水解如实施例20(a)进行,不同之处在于含有反应物的管在约40℃至约70℃的温度温育下约0.5分钟至约100分钟的时间。
(e)吖啶酯探针的受控水解如实施例20(a)进行,不同之处在于在高温下温育后,通过在室温下温育约1-15分钟在室温水浴中温育约1-15分钟或在冷水浴(低于室温,但高于0℃)温育约1-15分钟对含有反应物的管进行冷却。或者,吖啶酯探针的受控水解如实施例20(a)进行,不同之处在于在高温下温育后,管在不冷却的情况下读数。
(f)吖啶酯探针的受控水解如实施例20(a)进行,不同之处在于随后通过自动注入约50-400μL约0.0001-0.01%(v/v)硝酸水溶液和约0.02-2%(v/v)过氧化氢,然后自动注入约50-400μL的1-8%(w/v)氢氧化钠水溶液来测定每个等分试样的化学发光。
(g)吖啶酯探针的受控水解如实施例20(a)中进行,不同之处在于在注入第一引发试剂和第二引发试剂之间延迟约0-100秒后收集化学发光,并且收集化学发光约1-10秒。
(h)吖啶酯探针的受控水解如实施例20(a)中进行,不同之处在于化学发光收集在除Leader50之外的光度计中,例如LeaderI、a Leader450、a LeaderHC、a LeaderHC+、anOptocomp I(MGM Instruments)、Optocomp II、Lumat3 LB 9508单管光度计(美国田纳西州橡树岭的伯托科技(Berthold Technologies,Oak Ridge,TN,U.S.A.))或其他。
(i)吖啶酯探针的受控水解如实施例20(a)中进行,不同之处在于反应物在微量滴定板(例如,96孔)的孔中,并且化学发光收集在板光度计中,例如PHERAstar读数器(美国北卡罗来纳州凯里的BMG实验科技(BMG Labtech,Cary,NC,U.S.A.))、MicroLumatPlus读数器(伯托科技(Berthold Technologies))、GloMax Microplate读数器(美国威斯康辛州麦迪逊的普洛麦格(Promega,Madison,WI,U.S.A.))或其他。
(j)如实施例19(a)和19(b)中所述,使吖啶酯标记的聚合物与完全匹配或错配的核酸结合(或类似地反应但不存在其他核酸)。将这些溶液稀释10倍,混合,然后将100μL等分试样分配到12×75mm聚苯乙烯管中。通过向每个管中加入250μL碱性水解试剂(0.15M四硼酸钠,pH 8.5、5%(v/v)Triton X-100)进行吖啶酯探针的受控水解,并涡旋混合管,并在60℃下温育不同时间,最长15分钟。然后将管在冰水浴中冷却1分钟,并在室温水浴中冷却1分钟。用湿布擦拭每个管的外部,然后插入光度计(如Leader50)。然后通过自动注入200μL第一引发试剂(0.0044%(v/v)硝酸水溶液和0.1%(v/v)过氧化氢),然后在2秒延迟后注入200μL第二引发试剂(4%(w/v)氢氧化钠水溶液)并读取化学发光2秒来测定各等分试样的化学发光。在这些条件下,约3分钟后,信号的下降转变至非线性或以较慢速率下降的第二线性阶段。
实施例21:N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-O2-DMT-(±)-3-氨基-1,2-丙二醇的合成
实施例21(A):N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-O2-DMT-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(58)的合成
N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-O2-DMT-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(58)如图17所示,其基本上与试剂(38)一样进行合成,不同之处在于在胺保护和N-Fmoc-6-氨基己酸与(S)-3-氨基-1,2-丙二醇偶联后,伯氧用叔丁基二甲基甲硅烷基氯保护,仲氧用4,4'-二甲氧基三苯基甲基氯保护,叔丁基二甲基甲硅烷基用氟化物除去,伯氧用2-氰乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺活化。硅烷化和脱硅烷化是通过T.W.Green和P.G.M.Wuts(纽约,Wiley-Interscience出版社,有机合成中的保护基团(ProtectiveGroups in Organic Synthesis,Wiley-Interscience,New York),第127-141和708-711页,1999)中的一般步骤进行的。本领域普通技术人员可以设计替代方案以选择性地保护具有所需基团的伯醇和仲醇以产生试剂58。仅描述不同的步骤。
(c1)化合物(36)的1-O-叔丁基二甲基甲硅烷基化,以形成1-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇。
材料:叔丁基二甲基甲硅烷基氯、咪唑和二甲基甲酰胺来自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。其他材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:向溶解在二甲基甲酰胺中的化合物(36)中加入2.5当量的咪唑和1.2当量的叔丁基二甲基甲硅烷基氯。将该溶液在室温下混合30分钟以产生1-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇。
(c2)1-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇的2-O-二甲氧基三苯甲基化,以形成1-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇。
材料:材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:该反应基本上与实施例10(A)(c)相同,不同之处在于1,2-丙二醇的2-羟基被二甲氧基三苯甲基化。
(c3)从1-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇中选择性去除叔丁基二甲基甲硅烷基保护基团。
材料:四丁基氟化铵、四氢呋喃和磷酸二钾来自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。其他材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:将1-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇溶于四氢呋喃和0.1M磷酸二钾水溶液中,pH 7.1。加入四丁基氟化铵(0.5当量)并在室温下与溶液混合30分钟,得到2-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇。
(d)2-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇转化为N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-O2-DMT-(S)-3-氨基-1,2-丙二醇(58)。
材料:材料在前述实施例中进行了描述,见上。
步骤:反应基本上与实施例10(A)(d)相同,不同之处在于1,2-丙二醇的1-羟基被氧膦基化。
实施例21(B):N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-O2-DMT-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(59)的合成
N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-O2-DMT-(R)-3-氨基-1,2-丙二醇(59)如图17所示,其基本上与试剂(58)一样进行合成,不同之处在于使用(R)-3-氨基-1,2-丙二醇前体。
实施例22:N-(芴基甲氧基羰基氨基)己酰氨基-O1-DMT-O2-氰基乙氧基二异丙基氧膦基-3-氨基-1,2-丙二醇接头(58、59)与寡核苷酸的自动连接
描述了实施例21中描述的接头试剂与各种合成寡核苷酸的连接,产生5'至3'2'-氨基-1,2-丙二醇接头。
(a)使用3'-β-氰乙基亚磷酰胺化学将实施例21(A)中描述的接头试剂——试剂(58),下文称为“L11”)——插入合成寡核苷酸的碱基之间,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCG(L11)ACGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 7)。所用方法类似于实施例16(a)中描述的方法。
(b)“L11”的引入是使用3'-β-氰乙基亚磷酰胺化学在合成寡核苷酸的碱基之间,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCA(L11)GCGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 8)。所用方法类似于实施例22(a)中描述的方法。
(c)使用3'-β-氰乙基亚磷酰胺化学将实施例21(B)中描述的接头试剂——试剂(59),下文称为“L12”——插入合成寡核苷酸的碱基之间,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCG(L12)ACGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 7),实施例22(a)中序列的差向异构体。所用方法类似于实施例22(a)中描述的方法,不同之处在于使用“L12”的方案而不是“L11”。接头附近的结构如图16中的(57)所示。
(d)“L12”的引入是使用3'-β-氰乙基亚磷酰胺化学在合成寡核苷酸的碱基之间,产生序列“5'-GATCTGAGCGTCA(L12)GCGTCGTGACATG-3'”(SEQ ID NO 8),实施例22(b)中序列的差向异构体。所用方法类似于实施例22(c)中描述的方法。
实施例23:吖啶酯探针的受控水解在特定序列中的应用
使用来自实施例16(a)和16(c)的寡核苷酸如实施例20(a)进行吖啶酯探针的受控水解,均如实施例18中所述用吖啶酯标记并纯化。从零时的1×106相对光单位(relativelight unit,RLU)信号起始,水解3分钟后化学发光的减少如下(此处仅显示接头位点周围的核苷酸):
表1
出乎意料的是,在杂交条件下,不同对映体接头在5'-G A-3'位点之间与完全匹配的序列杂交时的性能表明,L10对修饰显著地更稳定,这从与L9相比,由L10组成的寡核苷酸多出的大于140,000RLU得到证明。在杂交条件下,相同对映体接头在5'-G A-3'位点之间与错配序列杂交时的性能表明,L10对修饰更不稳定,这从与L10相比,由L9组成的寡核苷酸多出的大于4,000RLU得到证明。总之,对于在3分钟时的判别比(discrimination ratio;DR=RLU完全匹配/RLU错配)而言,具有L10的序列(DR=174)比具有L9的相同序列(DR=64)大得多。
(b)使用来自实施例16(b)和16(d)的寡核苷酸如实施例20(a)进行吖啶酯探针的受控水解,均如实施例18中所述用吖啶酯标记并纯化。从零时的1×106RLU信号起始,水解3分钟后化学发光的减少如下(此处仅显示接头位点周围的核苷酸):
表2
同样出乎意料的是,在杂交条件下,不同对映体接头在5'-A G-3'位点之间与完全匹配的序列杂交时的性能表明,L10对修饰显著地更稳定,这从与L9相比,由L10组成的寡核苷酸多出的大于78,000RLU得到证明。在杂交条件下,相同对映体接头在5'-A G-3'位点之间与错配序列杂交时的性能表明,L10更容易修饰,这从与L10相比,由L9组成的寡核苷酸多出的大于9,000RLU得到证明。总之,对于在3分钟时的DR而言,具有L10的序列(DR=82)比具有L9的相同序列(DR=36)大得多。
(c)使用来自实施例16(d)的寡核苷酸如实施例20(j)中进行吖啶酯探针的受控水解,如实施例18中所述用吖啶酯标记并纯化。从零时的1×106RLU信号起始,水解3分钟后化学发光的减少如下(此处仅显示接头位点周围的核苷酸):
表3
当杂交序列在100μL杂交试剂(实施例23(c))或25μL杂交试剂(实施例23(b))中时,L10对映体接头在5'-A G-3'位点之间与完全匹配和错配序列杂交时的性能通过相当的(comparable)化学发光信号和DR(=80)得到证明。
这些实施例表明,一种接头对映体(R)比另一种接头对映体(S)具有更高的报告信号(RLU)。此外,与S接头对映体相比,R接头对映体的更高DR表明能够更好地区分匹配序列和错配序列。此外,吖啶酯探针的受控水解在一系列杂交试剂条件下产生一致的结果。
实施例24:由4-氨基丁烷-1,3-二醇组成的连接试剂的合成
实施例24(A):N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-4-氨基丁烷-1,3-二醇(60)的合成
N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(S)-4-氨基丁烷-1,3-二醇(60)示于图18中,并且其基本上与上述实施例一样进行合成,不同之处在于使用(S)-4-氨基丁烷-1,3-二醇作为初始二醇。
实施例24(B):N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-4-氨基丁烷-1,3-二醇(61)的合成
N-Fmoc-O1-DMT-O3-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-(R)-4-氨基丁烷-1,3-二醇(61)示于图18中,并且其基本上与上述实施例一样进行合成,不同之处在于使用(R)-4-氨基丁烷-1,3-二醇作为初始二醇。
实施例24(C):N-Fmoc-O1-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-O3-DMT-(S)-4-氨基丁烷-1,3-二醇(62)的合成
N-Fmoc-O1-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-O3-DMT-(S)-4-氨基丁烷-1,3-二醇(62)示于图18中,并且其基本上与上述实施例一样进行合成,不同之处在于使用(S)-4-氨基丁烷-1,3-二醇作为初始二醇。
实施例24(D):N-Fmoc-O1-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-O3-DMT-(R)-4-氨基丁烷-1,3-二醇(63)的合成
N-Fmoc-O1-氰基乙氧基二异丙基氨基氧膦基-O3-DMT-(R)-4-氨基丁烷-1,3-二醇(63)示于图18中,并且其基本上与上述实施例一样进行合成,不同之处在于使用(R)-4-氨基丁烷-1,3-二醇作为初始二醇。
实施例25:吖啶酯探针的受控加合物形成。
与聚合物连接的吖啶酯上的加合物形成会导致产品不化学发光(P.W.Hammond等人,生物发光化学发光杂志(J.Biolum.Chemilum.),第6卷,第35页,1991;L.J.Arnold Jr.等人,美国专利号4,950,613;M.Becker等人,美国专利号5,731,148)。不与其他核酸结合或与部分错配的核酸结合的吖啶酯标记的聚合物产生更大程度的加合物形成,而与接头附近完全匹配的核酸结合的吖啶酯标记的聚合物产生更低程度的加合物形成。在很短的时间间隔后,测量修饰程度以确定加合物形成反应的相对有效性。更大程度的加合物形成修饰由较低的化学发光信号证明,而较低程度的修饰由较高的化学发光信号证明。这些观察结果用作受控加合物形成测定的基础。
(a)吖啶酯标记的聚合物可以在12×75mm聚苯乙烯管中以100μL体积与完全匹配或错配的核酸结合(或类似地反应但在不存在其他部分匹配的核酸),如实施例19所述。通过向每个管中加入100μL加合物形成组合物(0.01M亚硫酸钠、0.03M四硼酸钠,pH 8.7)进行受控的加合物形成,并涡旋混合管,并在室温下温育60秒。在此期间,用湿布擦拭每个管的外部,然后插入光度计(如Leader50)。在30秒时,通过自动注入200μL酸性氧化剂Trigger 1制剂(0.0063%(v/v)硝酸水溶液和0.1%(v/v)过氧化氢),然后在2秒延迟后注通过自动注入200μL碱性Trigger 2制剂(4%(w/v)氢氧化钠水溶液)读取化学发光2秒来测定各等分试样的化学发光。来自杂交的完全匹配核酸的化学发光非常高且稳定,而在不存在互补核酸的情况下来自探针的化学发光非常低且稳定。
(b)受控的加合物形成如实施例25(a)中进行,不同之处在于将10至500μL的加合物形成组合物添加到每个管中。
(c)受控的加合物形成如实施例25(a)和25(b)进行,不同之处在于加合物形成组合物由0.005-0.20M亚硫酸钠、0.05-0.5M四硼酸钠,pH 7.5-9.1和0-5%Triton X-100组成。
(d)受控的加合物形成如实施例25(a)、25(b)和25(c)进行,不同之处在于随后通过自动注入约50-400μL的约0.0001-0.01%(v/v)硝酸水溶液和约0.02-2%(v/v)过氧化氢以及约50-400μL的1-8%(w/v)氢氧化钠水溶液。
(e)受控的加合物形成如实施例25(a)、25(b)、25(c)和25(d)的方法进行,不同之处在于在注入Trigger 1和Trigger 2之间延迟约0-10秒后收集化学发光,以及收集化学发光约1-10秒。
(f)受控的加合物形成如实施例25(a)、25(b)、25(c)、25(d)和25(e)进行,不同之处在于加合物形成组合物和过氧化氢/碱性溶液的添加之间的间隔为约1-200秒。
(g)受控的加合物形成如实施例25(a)、25(b)、25(c)、25(d)、25(e)和25(f)进行,不同之处在于约50-400μL的加合物形成组合物自动注入管中,然后延迟约1-200秒,注入约50-400μL注射液,所述注射液包含约1-8%(w/v)氢氧化钠水溶液和约0.02-2%(v/v)过氧化氢。
(h)受控的加合物形成如实施例25(a)、25(b)、25(c)、25(d)、25(e)、25(f)和25(g)进行,不同之处在于加合物形成组合物由约0.01-0.20M的四氢噻吩、丙硫醇、苄硫醇、亚硫酸盐、乙二醇亚硫酸盐、次硫酸盐、偏亚硫酸氢盐(metabisulfite)、硫代硫酸盐、硫代磷酸盐、偏亚硫酸氢盐(metabisulfite salt)或巯基乙磺酸组成。
(i)受控的加合物形成如实施例25(a)、25(b)、25(c)、25(d)、25(e)、25(f)、25(g)和25(h)进行,不同之处在于化学发光收集在除Leader50之外的发光计中,例如LeaderI、aLeader450、a LeaderHC、a LeaderHC+、an Optocomp I(MGM Instruments)、Optocomp II、Lumat3 LB 9508单管光度计(美国田纳西州橡树岭的伯托科技(Berthold Technologies,Oak Ridge,TN,U.S.A.))或其他。
(j)受控加合物形成如实施例25(a)、25(b)、25(c)、25(d)、25(e)、25(f)、25(g)和25(h)进行,不同之处在于反应物在多孔板(例如,96孔)的孔中,并且化学发光收集在板光度计中,例如PHERAstar读数器(BMG Labtech,Cary,NC,U.S.A.)、MicroLumatPlus读数器(伯托科技(Berthold Technologies))、GloMax Microplate读数器(美国威斯康辛州麦迪逊的普洛麦格(Promega,Madison,WI,U.S.A.))或其他。
实施例26:1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇和1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-已基]-(R)-氨基-1,2-丙二醇接头与受控孔玻璃(Controlled Pore Glass,CPG)的连接。
可以通过在最终引入步骤中使用接头亚磷酰胺、使用连接到固体载体的可裂解接头、或同时使用两者而将接头引入一个、另一个或两个核酸末端中。特别有用的固体载体包括大孔聚苯乙烯和受控孔玻璃(CPG)颗粒。
(a)2mmol前体{1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇(37)(实施例10(A))或1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(R)-氨基-1,2-丙二醇(实施例10(B)}溶解在5mL 1,2-二氯乙烷中。向该混合物中加入240mg琥珀酸酐(2.4mmol)、122mg二甲氨基吡啶(DMAP,1.0mmol)和0.56mL三乙胺(4.0mmol)。将该合并的混合物加热至50℃保持45分钟。加入75mL乙酸乙酯,并全部转移至分液漏斗。有机层用3×35mL 5%冰冷的柠檬酸、3×35mL水、1×35mL盐水洗涤,并用无水硫酸钠干燥。加入2mL吡啶并真空蒸发。将残余物溶解在100mL二氯甲烷中。向该溶液中加入0.56mL三乙胺(4.0mmol)、270mg 1-羟基苯并三唑(HBT,2.0mmol)和25g 1,000埃CPG。最后,加入885mg苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)六氟磷酸鏻(BOP,2.0mmol),并立即涡旋混合。随后在定轨振荡器上搅拌2小时。通过过滤收集改性的CPG,并用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤3次、用甲醇洗涤5次和乙醚洗涤2次进行充分洗涤。将固体材料在高真空下干燥1小时。
所得CPG用吡啶-乙酸酐-DMAP溶液封盖,反应0.25-1.0小时。通过过滤收集CPG并用吡啶洗涤2次、用DMF洗涤3次、用二氯甲烷洗涤4次、用甲醇洗涤5次和用乙醚洗涤2次进行彻底洗涤。洗涤后的材料在高真空下干燥过夜,得到改性的CPG,其分别连接有1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(S)-氨基-1,2-丙二醇和1-O-DMT-3-N-[N-(芴基甲氧基羰基)-己基]-(R)-氨基-1,2-丙二醇。
表8
上述实施例已经证明,可以制备本发明的试剂,每种试剂都具有非核苷酸骨架、第一和第二偶联基团以及配体。具体地,试剂(5)具有非核苷酸丙基骨架,其上键合有第一偶联基团甲基-N,N-二异丙基磷酰氨基、第二偶联基团由二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的1-羟基,以及配体,所述配体为由三氟乙酰基保护的氨基丙基接头臂形式。试剂(10)与试剂(5)相同,不同之处在于试剂(10)具有两个相同的配体(为两个受保护的接头臂三氟乙酰氨基丙基的形式)。试剂(13)也类似于试剂(5),不同之处在于非核苷酸骨架是乙基而不是丙基,并且接头臂的长度更短,所述接头臂仅为由三氟乙酰保护的甲胺而不是类似地保护的氨基丙基。
还如上文所证明的,本发明的单一试剂可用于在核苷酸多聚体上的任何预选位置处仅特异性地提供接头臂,而不引入不需要的核苷酸。还如已经描述的,通过将骨架与核苷酸以及另一个骨架偶联(然后将其与另一个骨架偶联,依此类推,以产生链),本发明的试剂可以使在核苷酸多聚体中提供一系列相邻配体(例如,标记物或可以连接标记物的接头臂)。因此,多个相邻标记物可以连接到探针,从而提高使用所述探针的杂交测定的灵敏度。
此外,本发明的一个或一系列顺序连接的非核苷酸骨架的使用还可以用于在探针上的与靶核苷酸多聚体上的相应序列互补的两个核苷酸序列之间进行桥接,在测试样品中,所述非核苷酸骨架可以通过单个不同核苷酸或不同序列进行桥接。因此,靶核苷酸多聚体实际上可以是由两个或更多个核苷酸多聚体组成的组,所述核苷酸多聚体由共同的目标核苷酸序列组成,所述共同的目标核苷酸序列由单个不同的核苷酸桥接,或由不同的非目标核苷酸序列组成。即使对单个靶序列为目标序列,也可以制备具有互补序列的探针,所述互补序列具有带有标记基团的非核苷酸单体单元,偶联在任意两个核苷酸之间。在这种情况下,探针以正常方式杂交靶核苷酸序列,不同之处在于带有标记基团的单体单元倾向于使其本身以不干扰上述杂交的方式存在(即,其倾向于混合结构的“环出(loop out)”)。这种布置在希望利用嵌入效应的情况下特别有利,例如,以可能提高探针的特异性。当然,与使用核苷酸单体单元的现有探针相比,本发明使用非核苷酸单体单元这一事实显著降低了前述类型的干扰。
如上所述,化合物(4)、(9)和(12)可以通过它们的伯羟基连接到固相合成载体上。当用于另外的聚合物合成时,所得衍生载体导致非核苷酸单体单元连接在所得核苷酸/非核苷酸聚合物的3'-末端。或者,如果寡核苷酸合成为5'-至-3',则非核苷酸单体单元将位于所得核苷酸/非核苷酸聚合物的5'末端。
应当理解,对上述发明的各种变化是可能的。例如,配体实际上可以是在与核苷酸多聚体的核苷酸偶联之前,本发明的试剂上提供的标记物或嵌入剂。此外,如上所述,除了上述具体实施例的保护基之外,还可以使用各种其他保护基。然而,特别优选使用三氟乙酰基和9-芴基甲氧基羰基氨基保护基团之一,因为它们在与已知标准寡核苷酸合成中使用的相同碱性条件下裂解以使胺脱保护,以使环外核苷酸胺脱保护(通常在浓氢氧化铵在50℃下1至12小时)。同样地,在偶联期间使用二甲氧基三苯甲基5'-羟基保护、甲基或β-氰乙基亚磷酸酯O保护以及N,N-二异丙基作为亚磷酸酯离去基团,都可以使试剂与目前标准的寡核苷酸固相合成技术完全相容,以尽量减少对任何额外特殊步骤的需求。
本领域技术人员可以想到本发明的上述实施方案的其他变化和改变。因此,本发明不限于以上详细描述的那些实施方案。
上述公开内容中引用的所有参考文献通过引用整体并入。
序列表
<110> K·A·布朗
<120> 用于核苷酸探针的非对映体连接试剂
<130> BBA-4
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸(Synthetic Oligonucleotide)
<400> 1
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<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸(Synthetic Oligonucleotide)
<400> 2
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<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸(Synthetic Oligonucleotide)
<400> 3
cagtcaaact ctagccatta cctgctaaag tcattt 36
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸(Synthetic Oligonucleotide)
<400> 4
gctcgttgcc ccacttaacc caacat 26
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸(Synthetic Oligonucleotide)
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 26
<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸(Synthetic Oligonucleotide)
<400> 8
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Claims (43)
1.一种非对映体连接试剂,所述非对映体连接试剂包含具有下式的基于亚磷酰胺的化合物:
D—X1—R2(X3—M)n—Z或Z—X1—R2(X3—M)n—D
其中:
Z是连接到R2末端的反应性含磷基团、第一个核苷酸的OH基团或通过可裂解的酯键连接到R2末端的DNA合成载体;
R2包含与X1以及Z相连的长度为2-20个原子的原子链,其中R2对DNA合成和脱保护条件稳定;
X1是O、S、NH或-N=N-;
D是可改变或可去除的保护基团,所述保护基团在改变或去除后允许X1与第二个核苷酸的磷基团偶联;
每个X3独立地是在第一端连接到R2并在第二端连接到M的接头臂,其中每个X3对DNA合成和脱保护条件稳定;
每个M独立地是对DNA合成和去保护条件稳定的标记物,或是可改变或可去除的保护基团,所述保护基团在改变或去除后允许X3偶联到标记物;和
n是正整数。
2.一种非对映体连接试剂,所述非对映体连接试剂包含具有下式的基于亚磷酰胺的化合物:
其中:
Z是反应性含磷基团、第一个核苷酸的OH基团或连接至DNA合成载体的可裂解的酯;
D是可改变或可去除的保护基团,所述保护基团在改变或去除后允许所述非核苷酸连接试剂与第二个核苷酸偶联;
i为0、1、2或3,且j为0、1、2或3,条件是i+j为至少1;
L1是第一接头臂;
L2是H或非连接烷基链或非连接混合烷基链或第二接头臂;
其中所述第一接头臂和所述第二接头臂各自独立地具有下式:(CH2)k—NH—(CO—(CH2)qNH)r—M;
其中每个M独立地是H、芴基甲氧基羰基、三氟乙酰基或对DNA合成和去保护条件稳定的标记物,
每个k独立地为介于0和4之间的整数,包括0和4,
每个q独立地为介于1和11之间的整数,包括1和11,
每个r独立地是0、1或2,条件是所述第一接头臂和所述第二接头臂中的每个k+1+(2+q)r独立地为介于1和25之间的整数,包括1和25。
3.根据权利要求1或2所述的连接试剂,其中,所述化合物是R对映体。
4.根据权利要求1或2所述的连接试剂,其中,所述化合物是S对映体。
7.根据权利要求6所述的连接试剂,其中,X2是Cl或仲氨基;和
R3选自由氯苯氧基、甲氧基、乙氧基和β-氰基乙氧基所组成的组。
8.根据权利要求7所述的连接试剂,其中,X2选自二异丙基氨基、二甲基和吗啉代所组成的组。
10.根据权利要求9所述的连接试剂,其中,X4选自由Cl、仲氨基和O-所组成的组;且R5选自由甲氧基、乙氧基、一氯苯氧基、β-氰基乙氧基和H所组成的组,条件是仅当X4是O-时,R5可以是H。
11.根据权利要求5所述的连接试剂,其中,X1是O。
12.根据权利要求1或3至11中任一项所述的连接试剂,其中,R2基本上由任选地被一个或多个杂原子取代的烃链组成,每个杂原子独立地选自由氧、氮和硫所组成的组;且每个X3独立地是NH、O、S、-NNH-、或长度为1-25个原子的末端为NH、O、S或-NNH-的链,其中所述X3原子链中的每一个基本上由任选地被一个或多个独立地选自由氧、氮和硫所组成的组中的杂原子取代的烃链组成。
13.根据权利要求12所述的连接试剂,其中,R2是无环的。
14.根据权利要求1或3至13中任一项所述的连接试剂,其中,R2是无环烃链。
15.根据权利要求14所述的连接试剂,其中,所述烃链具有2至10个碳原子的长度。
16.根据权利要求15所述的连接试剂,其中,所述烃链具有2至3个碳原子的长度。
17.根据权利要求16所述的连接试剂,其中,n为1。
18.根据权利要求1或3至17中任一项所述的连接试剂,其中,每个X3通过碳连接到R2并通过氮连接到M,并且每个M独立地是三氟乙酰基或9-三芴基甲氧基羰基。
19.根据权利要求1或3至18中任一项所述的连接试剂,其中,D为三苯甲基或二甲氧基三苯甲基。
20.根据权利要求1或3至19中任一项所述的连接试剂,其中,M是对DNA合成和去保护条件稳定的所述标记物。
21.根据权利要求5所述的连接试剂,其中,M是所述保护基团,其可被除去以允许X3偶联到所述标记物。
22.根据权利要求2至11中任一项所述的连接试剂,其中,j为0。
23.根据权利要求2至11或22中任一项所述的连接试剂,其中,L2是H。
24.根据权利要求2至11或22至23中任一项所述的连接试剂,其中,L2是H且j是0。
25.根据权利要求2至11或22至24中任一项所述的连接试剂,其中,i为1。
26.根据权利要求2至11或22至25中任一项所述的连接试剂,其中,i为1且j为1。
27.根据权利要求2至11或22至26中任一项所述的连接试剂,其中,每个r为0。
28.根据权利要求2至11或22至27中任一项所述的连接试剂,其中,每个r为0且R5是H。
29.根据权利要求2至11或22至28中任一项所述的连接试剂,其中,每个q为介于1和6之间的整数,包括1和6。
30.根据权利要求2至11或22至29中任一项所述的连接试剂,其中,每个q为介于1和6之间的整数,包括1和6。
31.根据权利要求2至11或22至30中任一项所述的连接试剂,其中,每个k独立地为介于1和3之间的整数,包括1和3。
32.根据权利要求2至11或22至31中任一项所述的连接试剂,其中,i为0。
33.根据权利要求2至11或22至32中任一项所述的连接试剂,其中,L2是H且i是0。
34.根据权利要求2至11或22至33中任一项所述的连接试剂,其中,j为1。
35.一种寡核苷酸,其引入前述权利要求中任一项所述的连接试剂。
36.根据权利要求35所述的寡核苷酸,所述寡核苷酸还包括可检测的标记物。
37.一种制备根据权利要求1至34中任一项所述的连接试剂的方法,所述方法包括以下步骤:(a)合成接头和(b)纯化异构体。
38.一种制备根据权利要求1至34中任一项所述的连接试剂的方法,所述方法包括使用异构体特异性试剂合成接头的步骤。
39.一种制造寡核苷酸的方法,所述寡核苷酸引入有根据权利要求1至34中任一项所述的连接试剂,所述方法包括以下步骤:(a)在DNA合成条件下将所述连接试剂的反应性磷基团偶联至第一个核苷酸或链或多个核苷酸,和(b)去除保护基D以允许第二个核苷酸或第二连接试剂的活化的磷基团进行偶联。
40.一种试剂盒,所述试剂盒包含根据权利要求1至34中任一项所述的连接试剂和使用说明书。
41.一种试剂盒,所述试剂盒包含根据权利要求35或36所述的寡核苷酸和使用说明书。
42.一种包含根据权利要求1至34中任一项所述的连接试剂的测定方法。
43.一种包含根据权利要求35或36所述的寡核苷酸的测定方法。
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