NO892042L

NO892042L - Ikke-nukleotide bindingsreagenser for nukleotidprober.

Info

Publication number: NO892042L
Application number: NO89892042A
Authority: NO
Inventors: Lyle John Arnold Jr; Mark Alan Reynolds; Ram Saroop Bhatt
Original assignee: Ml Technology Ventures
Priority date: 1987-09-21
Filing date: 1989-05-22
Publication date: 1989-07-20
Also published as: NO892042D0

Description

Ikke- nukleotide bindingsreagenser for nukleotidprober Qppfinnelsesområde

Den foreliggende oppfinnelse vedrører ikke-nukleotide reagenser som passende kan tillate at enkle eller multiple rester, slik som markører eller innføyelser, bindes til en nukleotidprobe, ved ethvert spesifikt forhåndsutvalgt sted (steder) derpå.

Teknologiske tilbakeblikk

I klinisk forskning og diagnose, er en kjent teknikk for bestemmelse av tilstedeværelsen av en bestemt nukleotidsekvens ("target-nukleotidsekvensen" eller simpelthen "targetsekvensen") i enten RNA eller DNA, å gjennomføre et nukleinsyre-hybridiserings-forsøk. I et slikt forsøk, velges en nukleotid-multimer-probe (typisk et oligonukleotid) som har en nukleotidsekvens komplimentær til minst en del av target-sekvensen. Proben er typisk merket, dvs. at den er utstyrt med et atom eller en gruppe bundet dertil, hvis tilstedeværelse lett kan påvises. Når den merkede probe utsettes for en testprøve som man antar inneholder target-nukleotidsekvensen, under hybridiseringsbetingelser, vil target hybridisere med enhver slik merket probe. Tilstedeværelse av target-sekvensen i prøven kan bestemmes kvalitativt eller kvantita-tivt vanligvis ved separering av hybridisert og ikke-hybridisert probe, hvorpå man bestemmer mengden av merket probe som hybridiserte, enten ved å bestemme tilstedeværelsen av markør i probehybridene eller ved å bestemme mengden markør i ikke-hybridiserte prober.

Tidligere ble radioaktive markører anvendt. På grunn av vanskeligheter i forbindelse med håndtering, ble imidlertid ikke-isotope markører senere utviklet. Slike markører omfatter dem hvis tilstedeværelse bestemmes enten direkte eller indirekte. Eksempler på direkte markører omfatter kjemiluminescens, fosforescens, fluorescens eller spektro-skopisk påvisbare markører. Eksempler på indirekte markører omfatter forbindelser slik som biotin og forskjellige antigener som kan påvises ved hjelp av proteiner konjugert til en passende påvisbar markør.

Enkelte tidligere metoder for å binde en markør til en nukleotidprobe er typisk blitt basert på binding av en enkel markør til et nukleotid, hvorpå en eller flere av disse nukleotider innlemmes i proben. Analoger av dUTP og UTP inneholdende en biotinrest festet til C-5 stillingen i pyrimidinringen er for eksempel blitt syntetisert kjemisk og innlemmet enzymatisk i polynukleotider (P.R. Langer et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, vol. 78, side (6633, 1981)). Slike biotin-merkede nukleotider kan innelmmes i nukleinsyreprober av biologisk eller syntetisk opprinnelse ved hjelp av enzymatiske prosedyrer. I tillegg, er 5'-allylamin-forløperne av de forutgående analoger foreslått for anvendelse på en lignende måte, noe som fører til innlemmelse av nukleofile aminrester i proben, som kan bindes til markører ved anvendelse av vanlig anvendte metoder. Andre deoksynukleotid-trifosfatanaloger er innlemmet enzymatisk i prober. Spesielt er brom-dUTP og jod-dUTP innlemmet og påvist immunokjemisk (Boultwodd, J. et al., J. Pathol-. vol 148, side 61, 1986). I tillegg, er 4-tio-UTP (H. Eshaghpour et al., Nucl. Acids Res., vol. 7, side 1485, 1979), blitt festet til 3<1->enden av DNA fragmenter og deretter merket i dets nukleofile sulfhydrylrest. En PCT ansøkning av Tchen (inter-nasjonalt publikasjonsnummer WO 86/00074; publisert januar 3/86), omhandler en teknikk hvori tilsynelatende tilfeldig pyrimidin-base-nukleotider kan avpyrimideres, og de oppnådde sukkerringer åpnes slik at en amin-bærende rest kan festes dertil.

Kjemiske metoder for merking er også blitt foreslått, som i

alt vesentlig tillater at markører bindes tilfeldig til noen nukleotider i en nukleotid-multimer. N-acetoksy-N-acetyl-aminofluoren er for eksempel blitt koblet til guaninrester av

nukleinsyrer og derpå påvist ved immunokjemiske teknikker (P. Chen et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, vol. 81, side 3466, 1984). En annen slik metode, som tilveiebringer en nukleofil amingruppe hvortil en markør kan bindes, involverer bisulfitt-katalysert transaminering i C-6 stillingen av cytosinrestene av nukleinsyreprober (R.P. Viscidi et al., J. Clin. Biol. vol. 23, side 311, 1986). Både de kjemiske og enzymatiske metoder som er beskrevet over lider under det faktum at enten kan enkle nukleotider ikke merkes spesifikt eller prosedyren modifiserer de ekscykliske aminer på nukleotidbasene og interfererer således med hybridisering.

Andre teknikker er omtalt, som tillater festing av kun en enkel markør på 5' eller 3'-enden av en nukleotid-multimer, typisk et oligonukleotid. En slik teknikk er for eksempel angitt hos CF. Chu et al., Nucl. Acids res., vol. 11, side 6513, 1983 og av A. Chollet et al., nucl. Acids res., vol 13, side 1529, 1985. Lignende terminale fremgangsmåter for merking er omtalt, som er bedre egnet til markør-festing som et slutt-trinn i fast/fase oligonukleotidsyntese. For eksempel se B.A. Connolly, Nucl,. Acids Res., vol. 13, side 4485, 1985; S. Agrawal et al-. Nucl. Acids Res., vol. 14,

side 6227, 1986 og B.A. Connolly, Nucl. Acids Res., vol. 15, side 3131, 1987. Disse terminale merkemetoder er imidlertid begrenset ved at de kun tillater festing av en enkel markør på enden av den nukleotide multimer.

Der er blitt foreslått forbindelser som kan anvendes for å innføre en primær amin-modifisert nukleotidrest i utvalgte posisjoner i et syntetisk oligonukleotid under standard automatiserte synteseprosedyrer. Slike forbindelser omfatter analoger av deoksythymidin, deoksyadenin, deoksyguanin og deoksydytidin (G.B. Dreyer et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA vol 82, side 968, 1985; J.L. Ruth, PCT ansøkning med publikasjonsnummer WO 84/03285, publisert 30 august, 1984). Slike forbindelser kan teoretisk tillate at merkede nukleotider plasseres på en rekke steder langs en sekvens, og således tillate anvendelse av multiple markører for å øke påvisnings- sensitiviteten. Man har imidlertid vist at anvendelse av slike merkede nukleotider i en probe kan redusere stabiliteten av et hybrid dannet med en targetsekvens, særlig når multiple markører er tilstede. Slik redusert hybridstabilitet er bitt vist for nukleinsyreprober av biologisk opprinnelse som har multiple biotin-rester festet til enten uridin, cytidin eller adeninbaser (R.P. Viscidi et al., J. Clin. Microbiol., vol. 23, side 311, 1986; G. Gebeyehu et at., Nucl. Acids Res., vol. 15 side 4513, 1987). Redusert hybridstabilitet er også rapportert for syntetiske oligonukleotider som har multiple fluoriscerende markører festet til modifiserte uridinrester (J. Haralambidis, et al., Nucl. Acids Res., vol. 15, side 4857, 1987). Slik ustabilitet kan også demonstreres for syntetiske oligonukleotider med biotin og fluoriscerende markører festet til N-4 stillingen i cytidinbasene. For å plassere en markør eller markører på hvilken som helst ønsket stilling (stillinger) i de syntetiske oligonukleotider, vil det ytterligere være nødvendig å ha totalt 8 forskjellige forbindelser (fire for deoksyribonukleotd-multimerer, og fire for ribonukleotid-multimerer).

I tillegg er derivater av nukleotidbindings fosfatgrupper omtalt, hvis nukleofile rest kan merkes etter deres innlemmelse i et oligonukleotid (R.L. Letsinger og M.E. Schott, J. Am. Chem. Soc. 1981, vol. 103, side 7394; japanske patenter etter N. Sugimoto, med nummer 61 44,353; 61 57,595; 61 44,352, alle publisert mars 1986). Slike forbindelser som er basert på nukleotidderivater vil imidlertid utvise minst noen av de ufordelaktigheter som er diskutert over for nukleotid-baserte derivater. Videre, vil binder-eksemplene som er omtalt i det foregående ikke kunne anvendes i næværende standard fast-fase synteseteknikker, uten modifikasjoner av disse teknikker.

Definisi oner

Som anvendt i beskrivelsen og kravene heri, er følgende betegnelser definert som: nukleotid: en subenhet av en nukleinsyre bestående av en fosfatgruppe, et sukker med 5 karbonatomer og en nitrogen-inneholdende base. I RNA er sukkeret med 5 karbonatomer ribose. I DNA er det 2-deoksyribose. Betegnelsen omfatter også analoger av slike subenheter.

nukleotid- multimer: en kjede av nukleotider festet med fosfordiesterbindinger, eller analoger derav.

olio<g>nukleotid: en nukliotid-multimer med en lengde på omtrent fra 10 omtrent 100 nukleotider, men som kan ha en lengde på mere enn 100 nukleotider. De menes vanligvis å være syntetisert fra nukleotidmonomerer, men kan goså oppnås ved enzymatiske metoder.

deoksyriboliaonukleotid: et oliognukleotid bestående av deoksyribonukleotidmonomerer.

polvnukleotid: en nukleotid-multimer med generelt en lengde på omtrent 100 nukleotider eller mere. Disse er vanligvis av biologisk opprinnelse og oppnås ved enzymatiske metoder.

nukleotid- multimer- probe: en nukleotidmultimer med en nukleotidsekvens komplementær til en target-nukleotidsekvens inneholdt i en annen nukleotid-multimer, vanligvis et polynukleotid. Vanligvis velges proben til å være nøyaktig komplementær til den tilsvarende base i targetsekvensen. I noen tilfeller kan det imidlertid være passende eller til og med ønskelig at en eller flere av nukleotidene i proben ikke er komplementær til den tilsvarende base i targetsekvensen. Proben er typisk merket.

ikke- nukleotid monomerenhet: refererer til en monomerenhet som ikke i betydelig grad tar del i hybridisering av en polymer. Slike monomerenheter må for eksempel ikke ta del i eventuell signifikant hydrogenbinding med et nukleotid, og vil utelukke monomerenheter som har en av de fem nukleotid-basene eller analoger derav som en komponent.

nukleotid/ ikke- nukleotidpolvmer: en polymer omfattende nukleotid- og/ikke-nukleotid-monomerenheter. Når den anvendes som en probe, vil den typisk være merket.

Olioanukleotid/ ikke- nukleotidmultimer: en multimer av generelt syntetisk opprinnelse med mindre enn 100 nukleotider, men som kan inneholde over 200 nukleotider og som inneholder en eller flere ikke-nukleotide monomerenheter.

monomerenhet: En enhet av enten et nukleotid-reagens eller et ikke-nukleotid-reagens i henhold til oppfinnelsen, hvor reagenset medvirker til en polymer.

hybrid: komplekset dannet mellom to nukleotid-multimerer ved hjelp av Watson-Crick baseparing mellom de komplementære baser.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et ikke-nukleotid-reagens, med en ikke-nukleotid monomerenhet som kan kobles syntetisk med spesifikke nukleotide-monomerenheter fra nukleotidreagenser, for fremstilling av en definert sekvens-polymer med en hovedkjede omfattende nukleotid- og ikke-nukleotid-monomerenheter. Nevnte ikke-nukleotid reagens har også en ligand som enten er en linker-armrest som deltar i konjugeringsreaksjoner straks linker-armen er avbeskyttet eller den kan være en sidearm hvortil en anvendbar ønsket kjemisk rest er festet før initiering av polymersyntesen. Generelt, er teknikkene for å binde rester til linker-armen lik teknikkene for å binde markører til grupper på proteiner. Modifikasjoner av slike teknikker kan imidlertid være nødvendig. Eksempler på nyttige kjemiske omdannelser omfatter reaksjonen av alkylaminer med aktive estere, aktive iminer, arylflourider eller isotiocyanater, og reaksjonen av tioler med maleimider, haloacetyler, osv. (for ytterligere poten-sielle teknikker se G.M. Means og R.E. Feeney, "Chemical Modification og Proteins", Holden-Day Inc., 1971; R.E. Feeney, Int. J. Peptide Protein Res., vol. 29, 1987, side 145-161). Passende beskyttelsesgrupper som kan anvendes for å beskytte den fuksjonelle gruppen på linker-armen under dannelsen av en polymer, er også like dem som anvendes innen proteinkjemi (se f.eks. "The Peptides Analysis Synthesis, Biology," vol. 3, ed. E. Gross og J. Meienhofer Academic Press, 1971). På grunn av den kjemiske natur til det ikke-nukleotide reagens, kan det plasseres i hvilken som helst ønsket stilling innenfor hovedkjedesekvensen. Dette gjør det mulig å gi polymeren som inneholder nukleotidmonomerer en rekke egenskaper. Disse omfatter: (1) festing av spesifikke kjemiske rester på ethvert ønsket sted i polymeren, idet slike rester kan omfatte (men er ikke begrenset til) påvisbare markører, innføyings-midler, gelaterende midler, legemidler, hormoner, proteiner, peptider, haptener, radikaldannere, nukleolytiske midler, proteolytiske midler, katalysatorer, reseptor-bindingssubstanser og andre bindingssubstanser av biologisk interesse, og midler som modifiserer DNA transport over en biologisk barriere (slik som en membran), og substanser som endrer oppløseligheten av en nukleotid-multimer. Dette betyr at det er mulig å plassere slike markører og innføyingsmidler i nærheten av ethvert ønsket nukleotid; (2) evnen til å immobilisere den angitte sekvens til en fast bærer ved anvendelse av dens linker-arm for binding til en kjemisk rest av nevnte bærer for å konstruere for eksempel nukleotid-affinitetsbærere; (3) evnen til å feste multiple kjemiske rester til polymeren gjennom linker-armene ved innlemmelse av multiple ikke-nukleotid-monomerenheter i polymerene; (4) evnen til å konstruere polymerer som er forskjellig fra naturlig forekommende polynukleotider ved at de har endrede aktiviteter med proteiner og enzymer som virker på polynukleotider. For eksempel vil plassering av den ikke-nukleotide monomerenhet på den 3' terminale enden av et ellers rent polynukleotid gi motstand mot nedbrytning ved slangegift-fosfordiesterase. Slike ikke-nukleotid monomerenheter kan danne spesifikke spaltingssteder for andre nukleaser; (5) evnen til å konstruere hybridiseringsprober ved spredt anbringelse av hybridiser-bare nukleotid-monomerenheter og ikke-nukleotidmonomerenheter. For eksempel kan en blandet blokksyntese av nukleotid- og ikke-nukleotid-monomerer frembringes, hvorved en definert sekvens av nukleotidmonomerer syntetiseres etterfulgt av et stykke av en eller flere ikke-nukleotid-monomerenheter etterfulgt av en andre blokk av nukleotidmonomerer med definert sekvens; (6) evnen til å konstruere syntetiske prober som samtidig påviser target-nukleotidmultimerer som avviker med ett eller flere basepar. Dette gjennomføres ved anvendelse av ikke-nukleotid-reagenset beskrevet heri for å erstatte nukleotidene i proben med ikke-nukleotid-monomerenheter på steder hvor forskjeller forekommer i nukleotidsekvensen hos de forskj ellige target-nukleotidmultimerer.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen konstrueres merkede hybridiseringsprober med en definert sekvens omfattende nukleotid- og ikke-nukleotid-monomerer. I en annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, anvendes de ikke-nukleotide monomerenheter for å knytte sammen to eller flere nukleotid-multimerer med definert sekvens, og ikke-nukleotid-monomerenhetene er kjemisk merket for anvendelse i hybridi-seringsreaksj oner.

I en annen foretrukket utførelsesform, er det ikke-nukleotide reagens oppbygd på en slik måte at det tillates å bli tilsatt på en trinnvis måte til å gi en blandet nukleotid/ikke-nukleotid polymer ved anvendelse av en av de vanlig anvendte DNA syntesemetoder. Slike nukleotid- og ikke-nukleotidreagenser adderer vanligvis på en trinnvis måte slik at deres tilsvarende monomerenheter festes til en voksende oligo-nukleotidkjede som er kovalent immobilisert til en fast bærer. Det første nukleotid er typisk festet til bæreren gjennom en spaltbar esterbinding før initiering av syntesen. Trinnvis utvidelse av oligonukleotidkjeden gjennomføres normalt i fra 3' til 5' retningen. For standard DNA og RNA syntesemetoder, se for eksempel "Synthesis and Applications of DNA and RNA" ed. S.A. Narang, Academic Press, 1987, og M.J. Gait, "Oligonucleotid Synthesis", IRL Press, Wash. D.C. U.S.A., 1984. Når syntesen er fullstendig, spaltes polymeren fra bæreren ved hydrolysering av esterbindingen som nevnt over og nukleotidet som opprinnelig er festet til bæreren blir den 3' terminale ende av den resulterende oligomer. Ved analogi, er en alternativ måte å innføre en ikke-nukleotid-monomerenhet og samtidig feste den til en DNA syntesebærer før initiering av DNA syntese. I en foretrukket utførelsesform er den ikke-nukleotide monomerenhet festet til en DNA syntesebærer gjennom en esterbinding som er dannet ved anvendelse av den frie alkoholform av den ikke-nukleotide monomer.

Følgelig tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse et reagens for fremstilling av polymerer som inneholder en blanding av nukleotid- og ikke-nukleotid-monomerenheter. Nevnte ikke-nukleotid-monomerer inneholder ytterligere en eller flere beskyttede linker-armer eller en eller flere linker-armer konjugert til en ønsket kjemisk rest slik som en markør eller innføyningsmiddel.

En slik ikke-nukleotid-monomer har ytterligere to koblingsgrupper slik at dens trinnvise inkludering inn i en polymer av nukleotid- og ikke-nukleotid-monomerenheter tillates. En første av de nevnte koblingsgrupper har den egenskap at den kan koble effektivt til den terminale ende av en voksende kjede av monomerenheter. Den andre av nevnte koblingsgrupper er i stand til å ytterligere forlenge, på en trinnvis måte, den voksende kjede av blandede nukleotid- og ikke-nukleotid-monomerer. Dette krever at den andre koblingsgruppe inaktiv-eres mens den første koblingsgruppe kobles, slik at den ikke i vesentlig grad kobler på dette tidspunkt, men kan deretter aktiveres slik at den deretter kobler til den ikke-nukleotide-monomerenheten. "Inaktiveringen" gjennomføres foretrukket med en beskyttelsesgruppe på den andre koblingsgruppe, som kan fjernes for å "aktivere" den andre koblingsgruppe. Det er imidlertid innen rammen for oppfinnelsen at slik "inaktivering" og "aktivering" kan gjennomføres ved simpelthen å endre reaksjonsbetingelser (for eksempel pH, temperatur, endring av konsentrasjonen av enkelte andre komponenter i reaksjonsystemet) med andre koblingsgrupper av en passende kjemisk struktur, som også lar seg bruke til inaktivering og aktivering ved slike teknikker. Nevnte koblingsgrupper tillater den nærliggende festing av enten nukleotid- eller ikke-nukleotid-monomerenheter. I en foretrukket utførelses-form opererer nevnte koblingsgrupper gjennom koblings- og avbeskyttelsestrinn som er forenlige med dem i henhold til standard DNA syntesemetoder.

Slike metoder krever at syntese skjer på en ikke-retnings-bestemt måte og at alle spalting- og avbeskyttelsestrinn i forbindelse med kobling skjer under "ikke-advers" betingelser, det vil si at de ikke ugunstig påvirker polymer-hovedkjeden og dens sukker, base, linker-arm og markørkomponenter og heller ikke monomerreagensene i vesentlig grad. Den fagkyndige på området kan lett identifisere funksjonaliteter, koblingsmetod-er, avbeskyttelsesprosedyrer og spaltingsbetingelser som imøtekommer disse kriterier (se for eksempel Gait referanse, supra).

Ikke-nukleotid-monomeren har foretrukket en hovedkjede til hvis ender koblingsgrupper er bundet. Hovedkjeden er foretrukket en acylgruppe med fra en til tyve karbonatomer i kjeden, og foretrukket en acyl-hydrokarbonkjede med fra en til tyve karbonatomer.

I en utførelsesform av oppfinnelsen, velges reagenset fra begge forbindelsene I eller II under:

Enten I eller II velges, er de beskrevne grupper som følger:

(i) R2= ikke-nukleotid-hovedkjede;

er første koblingsgrupper hvori:

X2= halogen eller substituert amino

X4= halogen, amino eller 0~

R3= alkyl, alkoksy eller fenoksy

R5= alkyl, alkoksy eller aryloksy eller kan være H,

men bare dersom X4 = 0~

(iii) Ri~xi~er den beskyttede andre koblingsgruppe hvori X]_ = 0, S, NH eller HN =N-

R]_ = beskyttelsesgruppen som kan avspaltes under avbeskyttelsesbetingelser for koblingsgruppen for

å oppnå den andre koblingsgruppe H-X]_-;

(iv) n er et helt tall,

(v) R4-X3- er liganden som foretrukket velges fra en funksjonell rest eller fra en beskyttet bindingsarm som kan avbeskyttes under ikke-skadelige betingelser slik at den deretter er i stand til å binde med en funksjonell rest (igjen under ikke-skadelige betingelser). I sistnevnte tilfellet er X3bindingsarmen og R4er beskyttelsesgruppen.

Mere foretrukket er noen av de indikerte gruppene som følger: X2= Cl eller sekundært amin (foretrukket valgt fra

dialkylamino og heterocykliske N-aminer)

R3= metoksy, etoksy, klorfenoksy eller p-cyanoetoksy X3: terminerer med 0, S, NH eller HN=N- og har foretrukket fra 1 til 25 karbonatomer i kjeden som strekker seg fra R2

X4= Cl, sekundært amin eller 0~

X 2 er ytterligere foretrukket diisopropylamin, dimetylamin eller morfolin. R-|_ er ytterligere foretrukket trifenylmetyl

(som omfatter derivater derav, typisk dimetoksytrifenylmetyl)

og Xi er 0.

R2har foretrukket et sekundært karbon festet til -0-. Dette tillater anvendelse av en sekundær alkohol under syntesen, som har den fordelen at det dannes et høyere utbytte av de beskyttede reagenser fra alkoholen.

En fremgangsmåte for fremstilling av en nukleotid/ikke-nukleotidpolymer er også beskrevet. En slik fremgangsmåte omfatter anvendelse av et reagense med en ikke-nukleotid-monomerenhet og en væske (som beskrevet over) bundet dertil, og kobling av ikke-nukleotid-monomerenheten under ikke-ugunstige betingelser til en første monomerenhet, og til enten en av en andre ytterligere monomerenhet eller en fast bærer. Minst en av de ovennevnte ytterligere monomerenheter er en nukleotid-monomerenhet. Skulle en annen monomerenhet fra et ikke-nukleotid reagens velges, er det selvfølgelig mulig å deretter koble denne monomerenhet til enda en ikke-nukleotid-monomerenht osv. De ovennevnte koblinger gjennomføres typisk gjennom en første koblingsgruppe og en beskyttet andre koblingsgruppe, som begge er bundet til ikke-nukleotid-monomerenheten. Således er ikke-nukleotid-monomerenheten først koblet til en første nukleotid monomerenhet gjennom den første koblingsgruppe, hvorpå den andre koblingsgruppe deretter avbeskyttes for deretter å koble ikke-nukleotid-monomerenheten til enten et annet nukleotid- eller et annet ikke-nukleotid-monomerenhetreagens. Den foretrukne kjemiske sammensetning av reagensene som anvendes i en slik metode er beskrevet over.

Produkter som oppnås fra de ovennenvte reagenser og metoder er også beskrevet.

Polymerprober er også beskrevet som omfatter et flertall nukleotid- og ikke-nukleotid-monomerenheter og minst en acridinium-ester markørrest som typisk vil tjene som en markør, bundet til en tilsvarende monomerenhet av proben.

Acridiniumester-delen er foretrukket en kjemiluminescerende acridiniumester-markør. Der er også angitt en fremgangsmåte for fremstilling av slike prober, omfattende binding av minst en slik acridiniumester-del til en tilsvarende monomerenhet av en polymer med et flertall nukleotid-monomerenheter.

Tegninger

Utførelsesformer av oppfinnelsen vil nå bli beskrevet med henvisning til tegningene, hvori: Figur 1 viser fremstillingen av et reagens i henhold til oppfinnelsen; Figur 2 viser fremstillingen av et annet reagens i henhold til oppfinnelsen; og Figur 3 viser fremstillingen av enda et annet reagens i henhold til oppfinnelsen. Figurene 4-8 viser fremstillingen av ytterligere andre reagenser i henhold til oppfinnelsen.

Detaljert beskrivelse av utførelsesformer av oppfinnelsen.

Syntesen av tre forskjellige "linker" reagenser i henhold til oppfinnelsen vil nå bli beskrevet detaljert i etterfølgende eksempler 1-3. Eksempel 4 i det etterfølgende viser fremgangsmåter for fremstilling av substituerte nukleotider (spesielt oligonukleotider) i henhold til oppfinnelsen, som har hovedkjeden av reagenset koblet, ved forkjellige spesifikke forhåndsutvalgte steder, på oligonukleotidet. Eksempel 5 viser binding av en markør til en bindingsgruppe i en substituert nukleotid i henhold til oppfinnelsen, mens eksempel 6 viser en ytterligere fordel som kan tilveiebringes ved substituerte nukleotider i henhold til oppfinnelsen, nemlig resistens overfor hydrolyse katalysert ved en fosfordiesterase.

Eksempel 1: Syntese av 2-(3-aminopropyl)-1, 3-dihydroksypropan-linker reagens.

Den skjematiske fremstilling for denne syntese er gitt i figur 1, og er angitt under. (a) Syntese av 2-(nitrilpropyl)-dietylmalonat (1): Prosedyren som anvendes er en tilpasning av metoden i henhold R. Adams og R.M. Kamm, Organic Synthesis, vol. 1 side 250-251, Gilman&Blatt, eds.

Materialer: Dietylmalonat, 3-brompropionitril og natriumetoksyd (21 % løsning i etanol) ble skaffet tilveie fra Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Absolutt etanol (200 proof) var fra U.S. Industrila Chemicals.

Prosedyre: Natriumetoksyd (0,1 mol) ble fortynnet med absolutt etanol til et sluttvolum på 100 ml. En løsning av dietylmalonat (0,1 mol) i 50 ml absolutt etanol ble tilsatt dråpevis med omrøring, idet reaksjonsapparatet ble beskyttet mot fuktighet med et CaC12 tørkerør. Omrøring ble fortsatt i en time ved romtemperatur. En løsning av 3-bromproponitril i 50 ml absolutt etanol ble deretter tilsatt dråpevis under omrøring og blandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. Den oppnådde løsning ble filtrert for å fjerne presipitert natriumbromid, konsentrert og ekstrahert i dietyleter (50 ml). Denne løsning ble deretter ekstrahert med vann (50 ml), tørket over vannfri magnesiumsulfat og konsentrert til en olje. Tynnsjiktkromatografi på silikaplater med kloroform som mobil fase ga tre flekker etter synliggjøring med jod-damp: Rf0,58, 0,51 og 0,38, som deretter ble identifisert som henholdsvis dietylmalonat, 2-(nitrilpropyl)-dietylmalonat, og 2,2-di-(nitrilpropyl)malonat. Etter flere døgn i kjøleren, separerte krystaller fra råoljen som ble avfiltrert, oppløst i toluen (10 ml) og represipitert ved tilsetning av heksaner, noe som ga 3,28 g hvitt faststoff (12 %); tynnsjiktkromatografi (som beskrevet over), Rf 0,38. Strukturen av denne forbindelse ble bekreftet ved hjelp av NMR (CDC13) til å være 2,2-di-(nitrilpropyl)malonat (6): 61,30 (t, 6H), 2.26 (t, 4H), 2,47 (t, 4H), 4,27 (q, 4H). Den filtrerte olje ble destillert i vakuum til å gi tittelforbindelsen (1), (kokepunkt 99-103°C, 0,3 mm Hg) i 20 % utbytte;<1>H NMR analyser i CDCI3: 51,24 (t, 6H), 2,19 (q, 2H), 2,47 (t, 2H) , 3.46 (t, 1H) , 4,18 (q, 4H) . (b) Syntese av 2-(3-aminopropyl)-1, 3-dihydroksypropan (2) .

Materialer: I tillegg til dem som er gitt i del (1), ble litiumaluminiumhydrid (1,0 M løsning i dietyleter) skaffet til veie fra Aldrich Fine Chemicals, Milwaukee, Wisconsin.

Prosedyre: 2-(3-nitrilpropyl)-dietylmalonat (1, 3,21 g, 15,1 mmol) i vannfri dietyleter (50 ml) ble tilsatt dråpevis til en omrørt løsning av litiumaluminiumhydrid (0,1 mol i 100 ml dietyleter) under nitrogen. Den oppnådde blanding ble oppvarmet med tilbakeløp i to timer og deretter omrørt ved romtemperatur over natten. Deretter ble en 2,5 mM løsning av natriumhydroksyd i vann (100 ml) tilsatt sakte for å under-trykke uomsatt hydrid. Denne blanding ble omrørt i to timer og eterlaget ble dekantert og kastet. (Produktet forblir i vannlaget). Det hvite gelatinøse faststoff ble fjernet fra vannlaget ved sentrifugering, vasket med vann og den vandige supernatant og vaskevannene ble kombinert og avdampet til en sirup under vakuum. Tynnsjiktkromatografi (Analtech revers-faseplater, vann mobil fase, visualisert med ninhydrinreagens) ga en hovedflekk som ble identifisert som tittelforbindelsen (2), Rf 0,48, og en mindre flekk som tilskrives et kondensa-sjonsbiprodukt, Rf 0,29. Tittelforbindelsen (2) ble renset ved ionebytterkromatografi (Dowex 50X8, 0,5 M HC1 mobil fase)

■i et totalt utbytte på 50 %. ^-H NMR analyser (D20) : 61,36 (tydelig kvartett, 2H), 1,68 (m, 3H), 2,97 (t, 2H) 3,57 (t, 4H).

(C) Syntese av 2-(3-N-trifluoracetylaminopropyl) 1,3-dihydroksypropan (3): Prosedyren ble tilrettelagt fra metoden

etter R.F. Oldfinger i "Methods in Enzymology", vol. XI, side 317, innlemmet heri som referanse.

Materialer: ( I tillegg til dem angitt i det foregående) ble S-etyltrifluortioacetat anvendt; fra Aldrich Fine Chemicals, Milwaukee, Wisconsin.

Prosedyre: 2-(3-aminpropyl)-1, 3-dihydroksypropan (2), (3 mmol) ble oppløst i vann (25 ml). pH i løsningen ble nedsatt til 9,5 ved dråpevis tilsetning av 6 N HCl. Etter-følgende reaksjoner ble gjennnomført i avtrekk: S-etyltrifluortioacetat (2 ml) ble tilsatt dråpevis til den kraftig omrørte løsning; pH ble holdt mellom 9,5 og 10,0 ved dråpevis tilsetning av 6 N KOH. Etter tretti minutter, ble en ytterligere milliliter S-etyltrifluortioacetat tilsatt, idet pH ble bibeholdt som beskrevet over. Blandingen ble omrørt i ytterligere 45 minutter. Deretter ble pH justert til 7 ved anvendelse av 6 N KOH og blandingen ble konsentrert til tørrhet med rotasjonsavdamping under vakuum. Resten ble virvlet med aceton (20 ml) og filtrert for å fjerne kalium-acetatprecipitat. Filtratet ble konsentrert til en sirup, gjenoppløst i aceton (2 ml) og påført på en hurtig-kromatogra-fikolonne inneholdende 40 g silikagel (med gjennomsnittlig partikkeldiameter 40 um, fra J.T. Baker Chemical Co.

(Phillipsburg, New Jersey, USA). Kolonnen ble eluert med en 50:50 løsning (v/v) av metylenklorid/aceton (500 ml) med uttak av 25 ml fraksjoner. Fraksjoner ble analysert med hensyn på produktinnhold ved påsetting av 2 ul prøver på silikagelplater, spraye med 10 % piperidin i vann, la platene stå i 15 minutter hvorpå de ble tørket med en varmepistol, og deretter behandlet med ninhydrinreagens. Utelatelse av piperidin-spraybehandlingen forhindret en kolorimetrisk reaksjon med ninhydrin, noe som bekrefter trifluoracetylering på det primære amin. Under anvendelse av denne prosedyre, ble produkt funnet mellom fraksjonene 13 og 18; disse fraksjoner

fargeløs olje, Rf 0,4 (silikagel-tynnsjiktkromatografi ved anvendelse av samme løsningsmiddelsystem og visualiserings-metode som beskrevet over). (d) Syntese av 1-0-(dimetoksytrityl)-2-(3-N-trifluoracetylaminopropyl-1, 3-dihydroksypropan (4): Materialer: (I tillegg til dem angitt i det foregående). Dimetoksytritylklorid ble skaffet tilveie fra Aldrich Fine Chemicals (Milwaukee, WI, USA). Metylenklorid ble oppvarmet med tilbakeløp og destillert over CaH2og lagret over 4 Ångstrøm (4 A) molekylsikter. Pyridin ble destillert over kaliumhydroksyd-pelleter og p-toluensulfonat og lagret under tørr nitrogen.

Prosedyre: 2-(3-N-trifluroacetylaminopropyl)-1, 3-dihydroksypropan (3) (362 mg, 1,58 mmol) ble tørket med flere avdampinger av tørr pyridin under redusert trykk og deretter tørket ytterligere i flere timer under fullstendig vakuum. Resten ble deretter oppløst i 10 ml tørr pyridin under tørr nitrogen. Dimetoksytritylklorid (401 mg, 1,18 mmol) i tørr metylenklorid (1,5 ml) ble tilsatt med omrøring, og den oppnådde løsning ble omrørt i en time ved romtemperatur. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og resten ble oppløst i kloroform (50 ml). Denne løsning ble ekstrahert tre ganger med 5 % natriumbikarbonat i vann og deretter tørket over vannfri magnesiumsulfat. Den oppnådde løsning ble konsentrert til en olje, oppløst på nytt i 2 ml kloroform og fraksjonert ved hurtig-kormatografi som beskrevet i det foregående, med unntak av anvendelse av kloroform/etylacetat/- pyridin (95:5:0,2 v/v/v) som den mobile fase. Fraksjoner ble analysert ved tynnsjiktkromatografi på silikaplater ved anvendelse av det samme løsningsmiddelsystem. Flekker visualisert med HC1 damp og med Rf verdier på 0,27, 0,87 og 0,93 ble identifiset som 1-dimetoksytrityl-produktet (4), dimetoksytritanol og 1,3-di-(dimetoksytrityl)biproduktet. Det sistnevnte material kan hydrolyseres til tittelforbindelsen (4) ved rysting med en blanding av 4 % dikloreddiksyre i metylenklorid mettet med vann. Produktet (4) ble isolert ved avdamping av løsningsmidlet fra de passende fraksjoner og tørket under fullstendig vakuum, idet man oppnår et skum (370 mg, 44 %). (e) Syntese av 1-0-(dimetoksytrityl)-2-(3-N-trifluoracetylaminopropyl)-3-0-(metyl-N, N-diisopropylfosforamido)-1, 3-dihydroksypropan (5): Materialer: (I tillegg til dem angitt i det foregående). N, N-diisopropyletylamin og N, N-diisopropylmetylfosforamidklorid ble tilveiebragt fra Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA). Dimetylformamid ble oppvarmet med tilbakeløp og destillert over CaH og lagert over 4 A molekylsikter.

Prosvdvre: 1-0-(dimetyloksytrityl)-2-(3-trifluoracetylaminopropyl)-1, 3-dihydroksypropan (4, 300 mg, 0,56 mmol) tørket med flere avdampinger av tørr pyridin og oppløst i 10 ml tørr dimetylformamid. Følgende reaksjon ble gjennomført under tørr nitrogen: N, N-diisopropyletylamin (245 yl, 1,3 mmol) ble tilsatt med omrøring, etterfulgt av N, N-diisopro-pylmetylf osforamidklorid (140 ul, 0,7 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i to timer. Blandingen ble deretter konsentrert under redusert trykk og oppløst i metylenklorid (50 ml). Denne løsning ble ekstrahert tre ganger med 5 % vandig natriumbikarbonat, tørket over vannfri magnesiumsulfat og konsentrert til en olje under redusert trykk. Omdannelse av utgangsmaterialet (4) til det tilsvarende fosforamiditt (5)

31

ble bekreftet ved P NMR (CDC13, trimetylfosfat, ekstern standard): 6147,9. Renhet ble estimert til mere enn 70 %.

Eksempel 2: Syntese av 2, 2-di-(3-aminopropyl)-1,3-di-hydroksypropari linker-reagens.

Dette eksempel omfatter av en monomer for innlemmelse i fosfordiester-hovedkjeden av en syntetisk oliognukleotid som har to aminopropyl-linkere for multippel markørfesting. Den skjematiske fremstilling av syntesen er gitt i figur 2.

Materialer: Materialene er de samme som dem som er gitt i eksempel 1, unntatt når annet er spesifikt indikert. (a) Syntese av 2,2-di-(3-aminopropyl)-1, 3-dihydroksypropan (7) : Følgende prosedyre er en kort beskrivelse av en tilpasning av metoden som er beskrevet over i eksempel 1 (b). 2,2-di-(nitrilpropyl)-dietylmalonat (6) (2,00 g, 7,51 mmol), hvis syntese er beskrevet i eksempel l(a) ble oppløst i vannfri dietyleter (80 ml). Den oppnådde løsning ble tilsatt dråpevis til en omrørt løsning av litiumaluminiumhydrid (0,1 mol) i dietyleter (100 ml). Etter femten minutter, ble blandingen oppvarmet med tilbakeløp i to timer og deretter omrørt ved romtemperatur over natten. Fremstilling og utvinning av råproduktet ble gjennomført som beskrevet over i eksempel 1(b). Et tynnsjiktkromatografi, også beskrevet i eksempel l(b), ga en hovedflekk (Rf ca. 0,2). (b) Syntese av 2,2-di-(3-trifluoracetylaminopropyl)-1 3-dihydroksypropan (8) : 2,2-di-(3-aminopropyl)-1,3-dihydroksypropan (7) (3,7 mmol) ble oppløst i vann (25 ml) og pH ble deretter justert til omtrent 10 med 6 NHC1. 1,0 ml S-etyltrifluortioacetat ble tilsatt med kraftig omrøring, pH ble holdt mellom 9,5 og 10,0 ved dråpevis tilsetning av 6 N KOH. To ytterligere 1,0 ml tilsetninger av S-etyltrifluortioacetat ble tilsatt på samme måte med tretti minutters intervaller. Blandingen ble konsentrert til en olje under vakuum og deretter oppløst i aceton (30 ml). Presipitert kaliumacetat ble fjernet ved filtrering. Produktet (8) ble renset ved silikagel-hurtigkromatografering som beskrevet i eksempel l(c) ved anvendelse av metylenklorid/aceton (50:50 v/v) mobil fase. Det rensede material ga en enkel flekk (Rf 0,7) med silikagel-tynnsjiktkromatografi ved anvendelse av

samme løsningsmiddelsystem; visualisering ble gjennomført ved behandling med piperidin etterfulgt av ninhydrin som i eksempel l(c). Utbyttet var 510 mg (1,48 mmol). (c) Syntese av 1-0-(dimetoksytrityl)-2,2-di(trifluoracetylaminopropyl)-1,3-dihydroksypropan (9): 2,2-di-(3-trifluoracetylaminopropyl)-1,3-dihydroksypropan (8) (510 mg, 1,48 mmol) ble tørket ved hjelp av flere avdampinger av tørr pyridin under vakuum og deretter oppløst i 5 ml tørr pyridin under nitrogen. Dimetoksytritylklorid (3,76 mg, 1,11 mmol) i tørr metylenklorid (1,5 ml) ble tilsatt under nitrogen ved omrøring, og blandingen ble omrørt i en time. Blandingen ble konsentrert under redusert trykk og oppløst i kloroform (50 ml). Denne løsning ble ekstrahert tre ganger med mettet vandig natriumbikarbonat og en gang med mettet natriumklorid. Løsningen ble deretter tørket over vannfri magnesiumsulfat og konsentrert til en olje under vakuum. Deretter ble oljen oppløst i 2 ml kloroform og fraksjonert ved silikagel-hurtigkromatografering som beskrevet over ved anvendelse av kloroform/etylacetat/pyridin (80:20:0,2 v/v/v). Produktet (9) ble identifisert ved silikagel-tynnsjiktkromatografi med anvendelse av det samme løsningsmiddelsystem, visualisert med HC1 damper (Rf 0,3); det ble konsentrert under redusert trykk og tørket under fullstendig vakuum til å gi et lysegult skum (517 mg, 52 %). (d) Syntese av 1-0-(dimetoksytrityl)-2,2-di-(3 trifluoracetylaminopropyl)-3-0-(metyl-N, N-diisopropylfosfor-amido)-1,3-dihydroksypropan (10) : Prosedyre: 1-0-(dimetoksytrityl)-2,2-di-(trifluoracetylaminopropyl) -1,3-dihydroksypropan (9) (136 mg, 0,2 mmol) ble tørket med tre ko-avdampinger av tørr pyridin (3 ml). Den oppnådde rest ble oppløst i tørr metylenklorid (1,5 ml) under argon og N, N-diisopropyletaylamin (175 ul, 1,0 mmol) ble tilsatt med ømrøring. Deretter ble N, N-diisopropylmetylfosforamidklorid (80 u, 0,4 mmol) tilsatt, og reaksjonsbland-

ingen ble omrørt i en time. Den oppnådde blanding ble fortynnet med etylacetat/trietylamin (98,2) (50 ml) og ekstrahert to ganger med mettet vandig natriumbikarbonat (25 ml). Det organiske lag ble tørket over vannfri MgSC>4 og konsentrert til en olje (240 mg). Omdannelse til fosforamidit (10) ble

31

bekreftet ved P NMR (CDCI3trimetoksyfosfat, ekstern standard): 6145,5. Renhet ble estimert til mere enn 60

Eksempel 3: Syntese av et 3-amino-l,2-propandiol-basert linker reagens.

Syntesen er fremstilt skjematisk i figur 3, og er beskrevet under. (a) Syntese av en 3-(trifluoracetylamino)-1,2-propandiol (11) : Matereialer: 3-amino-l,2-propandiol og S-etyltrifluortioacetat ble tilveiebragt fra Aldrich Chemical Co.-(Milwaukee WI, USA). Prosedyre: S-etyltrifluortioacetat (5,13 ml 45 mmol) ble tilsatt til en raskt omrørt blanding av 3-amino-l,2-propandiol (2,32 ml, 30 mmol) og etylacetat (5,0 ml). Etter flere minutter, ble blandingen homogen. Etter en time, ble reaksjons-løsningen rystet med petroleumeter (100 ml), det ble oppnådd en olje som ble separert og konsentrert under vakuum. Dette material ble analysert ved hjelp tynnsjiktkromatografi på silikaplater ved anvendelse av etylacetat/metylenklorid (2:1) som mobil fase. Platene ble først visualisert med ninhydrinreagens, som viste et merke av uomsatt amin-utgangsmaterial i begynnelsespunktet. Deretter ble platene visualisert ved at de ble sprayet med 10 % vandig piperidin, tørket med en varmepistol etter 15 minutter og deretter behandlet med ninhydrinreagens. I sistnevnte tilfelle, var en hovedflekk synlig (Rf 0,28) som ble estimert til å omfatte mere enn 95 % av materialet. Rensing av materialet assosiert med hovedflekken (11) ble oppnådd ved tynnsjiktkromatografi i preparativ skala. (b) Syntese av 3-(trifluoracetylamino)-1-0-(dimetoksytrityl)-]., 2-propandiol (12): Materialene og generelle prosedyrer er beskrevet over i eksempel 1 (d). 3-(trifluoracetylamino)-1, 2-dihydroksypropan (11) (1,87 g, 10 mmol) ble tørket ved tre ko-avdampinger av tørr pyridin (10 ml) under redusert trykk. Materialet ble deretter oppløst i tørr pyridin (10 ml). Deretter ble en løsning av dimetoksytritylklorid (3,73 g, 11 mmol) i tørr pyridin (10 ml) tilsatt dråpevis med omrøring under nitrogen. Etter ca. en time, ble metanol (0,2 ml) tilsatt. Den oppnådde løsning ble fortynnet med etylacetat (80 ml) og ekstrahert to ganger med mettet vandig natriumbikarbonat (30 ml) og to ganger med vann (20 ml). Det organiske lag ble tørket over vannfri magnesiumsulfat og konsentrert under redusert trykk til å gi 6 g råolje. 1,1 g av råmaterialet ble fraksjonert ved hjelp av silikagel-hurtigkromatografering som beskrevet over ved anvendelse av metylenklorid/etylacetat/pyridin (10:1:0,01 v/v/v). Fraksjoner ble analysert ved tynnsjiktkromatografi på silikagelplater med samme løsningsmiddelsystem. Flekker ble visualisert med HC1 gasser, og viste to mindre komponenter ved Rf verdier på 0,94 og 0,87 og en hovedkomponent ved Rf 0,53 som ble identifisert som henholdsvis 1,2-di-(dimetoksytrityl) biproduktet, dimetoksytritanol og det beregnede produkt (12). Fraksjoner med en Rf på 0,53 bestemt ved tynnsjiktkromatografi som beskrevet over, ble samlet og avdampet til å gi 0,7 2 g av (12) , hvis struktur ble bekreftet ved hjelp av<1>H NMR. Totalt utbytte av (12) var 80 % basert på utbyttet fra hurtigkolonne. (c) syntese av 3-(trifluoracetylamino)-1-0-(dimetoksytrityl) -2-0-(metyl-N,N-diisopropylfosforamido)-1,2-propandiol (13) : Reagensene for denne syntese er gitt i det foregående i eksempel 1.

3-(trifluoracetylamino)-1-0-(dimetoksytrityl-1,2-propandiol (12) (19 6 mg, 0,4 mmol) ble oppløst i tørr metylenklorid (1,5 ml) inneholdende diisopropyletylamin (348 pl, 2 mmol).

N, N-diisopropylmetylfosforamidklorid (200 ul, 1 mmol) ble tilsatt dråpevis med omrøring under argon. Etter en time, ble etylacetat inneholdende 1 % trietylamin tilsatt (50 ml), og den oppnådde løsning ble ekstrahert tre ganger med mettet vandig natriumbikarbonat. Det organiske lag ble tørket over vannfri magnesiumsulfat og konsentert til en olje under redusert trykk. Renheten av dette material ble estimert til å

31

være større enn 95 % ved hjelp av P NMR (CD3CN, trimetoksy-fosforsyre, ekstern standard): 5147,5. Forsøk på å krystal-lisere dette material i toluen/heksan-blandinger ved -7 8°C var ikke vellykkede, og de urene prøver ble derfor anvendt direkte for linker-addisjon.

Eksempel 3( a) : Syntese av 6-amino-l,2-heksandiol basert linkerreagens.

Syntesen er vist skjematisk i figur 4, og er beskrevet i det etterfølgende. (a) Syntese av 1,2-(isopropylidin)-1,2,6-trihydroksyheksan (14): Materialer: 1,2,6-trihydroksyheksan og 2,2-dimetoksypropan ble tilveiebragt fra Aldrich Chemical Co. (Milwaukee,

WI, USA).

Prosedyre: 1,2,6-trihydroksyheksan (1,00 g, 7,45 mmol), tørr aceton (10 ml) og konsentrert svovelsyre (30ul) ble tilsatt til en 5 0 ml rundbundet kolbe sammen med en magnet for magnetisk omrøring. Kolben ble renset med nitrogen og et gummiseptum ble festet for å utelukke fuktighet. Deretter ble 2,2-dimetoksypropan (3,00 ml, 24,4 mmol) tilsatt sakte ved hjelp av en sprøyte til den omrørte løsning over en tids-periode på 30 minutter. Omrøringen ble fortsatt i to timer. Vannfri natriumkarbonat (150 mg) ble tilsatt for å stanse

reaksjonen, og blandingen ble deretter omrørt over natten.

Til slutt ble løsningen filtrert og konsentrert under vakuum til en lysegul sirup (1,6 g). Dette material ble anvendt i neste trinn uten rensing. (b) Syntese av 1,2-(isopropylidin)-6-(p-toluensulfonyl)-1,2,6-trihydroksyheksan (15): Materialer: p-toluensulfonylklorid ble tilveiebragt fra Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA).

Prosedyre: Det urene isopropylidinerte material fra det tidligere trinn (14, omtrent 7,45 mmol) ble oppløst i tørr aceton (15 ml). Deretter ble p-toluensulfonylklorid (2,8 g, 14,9 mmol) og tørr pyridin (5 ml) tilsatt, og innholdene ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur med utelukkelse av fuktighet. Løsningsmidlet ble deretter fjernet under vakuum og resten ble delt mellom etylenklorid (25 ml), tørket over vannfri magnesiumsulfat, filtrert og deretter konsentrert under vakuum til å gi et krystallinsk faststoff (15, 2,8g). Råproduktet ble renset ved silikagel-hurtigkromatografering som beskrevet over ved anvendelse av kloroform som mobil fase. Fraksjoner ble analysert ved hjelp av tynnsjikt-kromatografi på fluorescerende-silikagelplater ved anvendelse av samme løsningsmiddel. Flekker ble visualisert under en ultrafiolett lampe. Fraksjoner inneholdende produkt (R, 0,50) ble samlet og konsentrert under vakuum til å gi en olje (15, 2,37 g) i et totalt utbytte på 96,9 %. (c) Syntese av 1,2-(isopropylidin)-6-azido-l,2-di-hydroksyheksan (16): Prosedyre: Tosylatet fra det tidligere trinn (15, 2,37 g, 7,22 mmol) ble oppløst i tørr dimetylformamid (30 ml). Natriumazid (1,64 g, 25,2 mmol) ble tilsatt sammen med en magnet for magnetisk omrøring, og en refluks-kondensator og CaCl2tørkerør ble påsatt. Blandingen ble deretter omrørt i et vannbad ved 60-65°C i tre timer. Omrøringen ble fortsatt over natten ved romtemperatur. Presipitatet ble deretter fjernet ved sentrifugering, og den oppnådde løsning ble konsentrert under vakuum til et sluttvolum på omtrent 5 ml. Den konsentrerte løsning ble fordelt mellom kloroform (50 ml) og vann (15 ml). Det organiske lag ble ytterligere vasket med vann (15 ml), tørket over vannfri MgS40, filtrert og konsentrert under vakuum til en ravgul olje (16). Råproduktet ble deretter anvendt i neste trinn uten ytterligere rensing.

(d) Syntese av 6-amino-l,2-dihydroksyheksan (17):

Materialer: En løsning av litiumaluminiumhydrid

(1,9 M) i dietyleter ble skaffet tilveie fra Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA).

Prosedyre: Vannfri dietyleter (10 ml) og en løsning av litiumaluminiumhydrid (1,0 M) i dietyleter (15 ml) ble tilsatt til en 250 ml rundbundet kolbe under en argonatmosfære. En løsning av det urene azid fra det tidligere trinn (16, ca.

7 mmol) i vannfri dietyleter (25 ml) ble deretter tilsatt gjennom en tilførselstrakt med omrøring under argon. Etter fullstendig tilsetning, ble blandingen omrørt under argon. Etter fullstendig tilsetning, ble blandingen omrørt under oppvarming med tilbakeløp i 90 minutter. Den oppnådde slurry ble fortynnet med dietyleter (25 ml), og følgende løsninger ble tilsatt med omrøring i den indikerte rekkefølge: Vann

(1 ml), 5 N NaOH (1 ml) og vann (1 ml). Blandingen ble deretter filtrert gjennom en medium glass-scinter. Filtratet ble konsentrert ved destillasjon ved romtemperatur etterfulgt av høyt vakuum til å gi en lysegul olje. Deretter ble vann (10,8 ml) og 88 % maursyre (14,2 ml) tilsatt. Den oppnådde blanding fikk stå over natten ved romtemperatur og ble deretter oppvarmet til 7 0-7 5°C i 2 timer. Løsningen ble konsentrert under vakuum til en sirup, som deretter ble oppløst i vann (50 ml) og påført på en kationbytter-kolonne inneholdende AG 50W-X8 harpiks (H form, 50 ml lagvolum, Bio-Rad labs, Richmond, CA, USA). Kolonnen ble eluert med 1 N HC1. Fraksjoner som inneholder aminproduktet ble visualisert

ved flekkdannelse på silikagel-TLC plater, spraying med ninhydrinreagens og oppvarming som beskrevet over. Fraksjoner som inneholdt produktet ble samlet sammen og konsentrert under vakuum til å gi en sirup, som ble ytterligere ko-avdampet med metanol til å gi lysegule nåler (17, som hydroklorid). (e) Syntese av 6-N-(9-fluorenylmetoksykarbonyl)-amino-1,2-dihydroksypropan (18): Materialer: 9-fluorenylmetylsuccinimidylkarbonat (Fmoc-NHS) ble tilveiebragt fra Bachem, Inc. (Torrance, CA. USA). Prosedyre: 6-amino-l,2-dihydroksyheksanhydroklorid (17), i en mengde i overensstemmelse med utbyttet oppnådd i det forutgående trinn, ble oppløst i vann (10 ml) og justert med 5 N NaOH til en endelig pH på 8,7. Natriumbikarbonat (588 mg, 7 mmol), Fmoc-NHS (2,76 g, 7 mmol) og aceton (10 ml) ble tilsatt. Suspensjonen ble omrørt over natten ved romtemperatur, hvoretter alt Fmoc-NHS var gått i løsning. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under vakuum for å fjerne aceton. 1 N HC1 (50 ml) og etylacetat (150 ml) ble tilsatt, og blandingen ble overført til en separasjonstrakt. Det organiske laget ble separert og vasket med 0,1 N HC1 (50 ml) og deretter med vann (2 x 50 ml). Deretter ble det organiske lag tørket over vannfri MgS04, filtrert og konsentrert til en olje. Produktet ble renset ved hjelp av silikagel-hurtigkromatografering som beskrevet over ved anvendelse av kloroform/- aceton (50:50) som mobil fase. Fraksjoner ble analysert ved hjelp av tynnsjiktkromatografi på fluorescerende silikagelplater ved anvendelse av samme løsningsmiddelsystem. Flekker ble visualisert under en ultrafiolett lampe. Fraksjoner som inneholdt produktet (R, 0,25) ble samlet og avdampet til å gi et hvitt krystallinsk faststoff (18, 1,20 g). Totalt utbytte var 45 %, basert på mengden 1,2,6-trihydroksyheksan-utgangsmaterial. (f) Syntese av 1-0-(dimetoksytrityl)-6-N-(fluorenylmetoksykarbonyl)-6-amino-l,2-dihydroksyheksan: Prosedyre: Produktet fra det forutgående trinn (18, 0,5 g, 1,41 mmol) ble ko-avdampet med tørr pyridin (3 x 3 ml) og deretter oppløst i tørr pyridin (8 ml) under argon. En løsning av dimetoksytritylklorid (0,5736 g, 1,69 mmol) i tørr metylenklorid (2 ml) ble tilsatt ved hjelp av en sprøyte og med omrøring over en periode på flere minutter. Omrøringen ble fortsatt i 2 timer ved romtemperatur, hvoretter metanol (100 pl) ble tilsatt for å stanse reaksjonen. Løsningsmidlet ble fjenet under vakuum og resten ble oppløst i kloroform (100 ml). Denne oppnådde løsning ble overført til en separasjonstrakt og vasket med mettet vandig natriumbikarbonat (3 x 20 ml) etterfulgt av 5 M NaCl (20 ml). Det organiske lag ble deretter tørket over vannfri MgS04<filtrert og konsentrert til en olje under vakuum. Produktet ble renset ved hjelp av silikagel-hurtigkromatografering som beskrevet over ved anvendelse av et metylenklorid/etylacetat/trietylamin (95:5:0,5) løsningsmiddelsystem. Fraksjoner ble analysert ved hjelp av tynnsjiktkromatografi på silikagelplater ved anvendelse av samme løsningsmiddel; flekker ble visualisert ved å underkaste platene for HC1 damper. Fraksjoner inneholdende produkt (19, R, 0,35) ble samlet og avdampet under vakuum til et skum (910 mg, 10 0 % av det teoretiske utbytte). (g) syntese av 1-0-(dimetoksytrityl)-6-N-(fluorenylmetoksykarbonyl)-2-0-(metyl-N,N-diisopropylfosforamido)-6-amino-1,2-dihydroksyheksan (20): Materialer: Materialene er beskrevet i de foregående eksempeler.

Prosedyre: N, N-diisopropylmetoksyfosfinylklorid (102 pl,, 0,513 mmol) ble tilsatt dråpevis til en omrørt løsning av 19 (225 mg, 0,34 mmol) og N,N-diisopropyletylamin (236 pl, 1,3 6 mmol) i tørr metylenklorid (3 ml) under en argonatmosfære. Etter 9 0 minutter, ble reaksjonsblandingen fortynnet i etylacetat inneholdende 2 % trietylamin (50 ml) og vasket med mettet vandig natriumbikarbonat (2 x 25 ml). Det organiske lag ble tørket over vannfri MgSC>4, filtrert og avdampet til tørrhet under vakuum. Resten ble oppløst i toluen (2 ml) og tilsatt dråpevis med rask omrøring til petroleumeter ved -20°C. Den oppnådde blanding ble deretter lagret ved -20°C i 16 timer. Den ble deretter oppvarmet til romtemperatur og supernatanten ble dekantert. Det presipiterte produkt (20) ble deretter tørket under vakuum: utbyttet = 160 mg (58 % utbytte). Renheten av dette material ble demonstrert ved tynnsjiktkromatografi på silikagelplater ved anvendelse av et metylenklorid/etylacetat/trietylamin (10:1:0,1) løsningsmid-delsystem og visualisert under ultrafiolett lys (R, 0,9, sammenlignet med en R, på 0,25 for utgangsmaterial).

Forlengede analoger av linker-reagenset beskrevet i eksempel 3(a) ble også dannet. Strukturen av disse analoger er vist i figur 5 (21-24) . Fremstillingen av disse analoger er beskrevet i de følgende eksempler.

Eksempel 3( b) : Syntese av 3-N-(glycidyl)-amino-1,2-propandiol-basert linkerreagens (21).

Reaksjonsskjerna for denne syntese er vist i figur 6.

(a) syntese av 3-N-[B-(fluorenylmetoksykarbonyl)-glycidyl]-amino-1,2-propandiol (25) .

Materialer: N-(fluorenylmetoksykarbonyl)-glycin N-hydroksysuccinimid (Fmoc-glycin-NHS) ble tilveiebragt fra Barchem, Inc. (Torrance, CA, USA). Andre reagenser er beskrevet tidligere.

Prosedyre: 3-amino-l,2-propandiol (91 mg, 1 mmol) ble tilsatt til en løsning av Fmoc-glycin-NHS (394 mg, 1 mmol) i aceton (7 ml). Til denne løsning ble det tilsatt en løsning av natriumbikarbonat (84 mg, 1 mmol) i vann (5 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Tynn sjiktkromatografi ved anvendelse av silikagelplater og et metylenklorid/metanol/eddiksyre (20:2:0,1) løsningsmiddel-system viste at reaksjonen var fullstendig. Produktet (25) fremkom i kolben som et presipitat, som ble avfiltrert og tørket under vakuum over P2O5i to døgn. Utbyttet var 310 mg (84 %) . (b) Syntese av 1-0-(dimetoksytrityl)-3-N-[N-(fluorenylmetoksykarbonyl) -glycidyl] -amino-1 , 2-propandiol (26) .

Materialer: Materialene er beskrevet i de forutgående eksempler.

Prosedyre: Forbindelse 25 (185 mg, 0,5 mmol) ble tørket ved ko-avdamping med tørr pyridin (3 x 3 ml). Den ble deretter oppløst i tørr pyridin (3 ml) og en løsning av dimetoksytritylklorid (222 mg, 0,57 mmol) i en 1:1 blanding av metylenklorid/pyridin (4 ml) ble tilsatt dråpevis under omrøring. Omrøringen ble fortsatt i 1,5 timer, og reaksjonen ble målt ved silikagel-tynnsjiktkromatografi ved anvendelse av et metylenklorid/metanol (8:1) løsningsmiddelsystem. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av metanol (0,2 ml); omrøringen ble fortsatt i 10 minutter. Pyridin ble avdampet under vakuum. Resten ble oppløst i metylenklorid (150 ml) og vasket med mettet vandig natriumbikarbonat (2 x 50 ml) etterfulgt av vann (50 ml). Etter tørking over vannfri MgS04, ble metylenkloridløsningen avdampet til tørrhet under vakuum. Resten ble renset ved silikagel-hurtigkromatografering ved anvendelse av et metylenklorid/etylacetat (11:5) løsningsmid-delsystem inneholdende 0,1 % pyridin i overensstemmelse med metoden som er beskrevet i det foregående. Fraksjoner inneholdende produkt ble identifisert ved silikagel-tynnsjikt-kromatograf i , som beskrevet over. Disse fraksjoner ble samlet og avdampet til tørrhet, og ga 250 mg av 26 (75 % utbytte). (c) Syntese av 1-0-(dimetoksytrityl)-2-0-(N,N-diisopro-pylamino-metoksyfosfinamido)-3-N-[N-(fluorenylmetoksykarbonyl) -glycidyl] -amino-1 , 2-propandiol (21) .

Materialer: Materialene er beskrevet i forutgående eksempler.

Prosedyre: Forbindelse 21 (235 mg, 0,35 mmol) ble tørket ved ko-avdamping med tørr pyridin (2 x 3 ml). Den ble deretter oppløst i tørr metylenklorid (2 ml) og N,N-diisopropyletylamin (244 ul, 1,4 mmol) ble tilsatt. Deretter ble N,N-diisopropylaminoklor-metoksyfos fin (105 yl, 0,53 mmol) tilsatt dråpevis med omrøring under en argonatmosfære. Reaksjonen ble funnet å være fullstendig etter 20 minutter ved hjelp av silikagel-tynnsjiktkromatografi ved anvendelse av et metylenklorid/etylacetat/trietylamin (10:5:0,5) løsningsmid-delsystem. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet i etyl med mettet vandig bikarbonat (2 x 2 5 ml). Etter tørking over vannfri MgS04, ble etylacetatlaget avdampet under vakuum. Resten ble oppløst på nytt i etylacetat (3 ml) og helt inn i heksan (150 ml) ved -25°C. Presipitatet ble filtrert og tørket under vakuum til å gi 210 mg av 21 (72 %).<31>P-NMR (CDCI3, i ppm relativ til trimetylfosfat): 147,5 (d). Strukturen ble også bekreftet ved ^-H-NMR analyser.

Eksempel 3( c) : Syntese av 3-N-(4-aminobutyryl)-amino-1,2-propandiol og 3-N-(6-aminokaproyl)-amino-1,2-propandiol-basert linkerreagenser (22, 23).

Trinnene i syntesen som er unike for dette eksempel er gitt skjematisk i figur 7 og er beskrevet i det følgende. (a) Syntese av N-fluorenylmetoksykarbonyl-beskyttede former av 4-aminosmørsyre og 6-aminokapronsyre (N-Fmoc-4-aminosmørsyre, 27, og N-Fmoc-6-aminokapronsyre, 28).

Materialer: 4-aminosmørsyre og 6-aminokapronsyre ble tilveiebragt fra Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI, USA). Fmoc-NHS ble beskrevet i eksempel 3(a).

Prosedyre: Disse synteser ble gjennomført som beskrevet i

metoden i henhold til A. Paquet (Can. J. Chem., 1982, 60,

976) . (b) Kobling av både N-Fmoc-4-aminosmørsyre og N-Fmoc-6-aminokapronsyre med 3-amino-l,2-propandiol.

Materialer: Trimetylacetylklorid ble tilveiebragt fra Aldirch Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA). Andre materialer var beskrevet i forutgående eksempler.

Prosedyre: Begge forbindelsene 27 og 28 (1 mmol) ble først tørket ved ko-avdamping med pyridin (2 x 3 ml). Resten ble deretter oppløst i en blanding av tørr dimetylformamid (3 ml) og tørr tetrahydrofuran (3 ml). Den oppnådde løsning ble avkjølt i et isbad og N,N-diisopropyletylamin (1 mmol) ble tilsatt etterfulgt av sakte tilsetning av trimetylacetylklorid (1 mmol) med omrøring. Omrøring ble fortsatt i et isbad i 45 minutter. Deretter ble en løsning av 3-amino-l,2-propandiol (1,2 mmol) i tørr dimetylformamid (3 ml) tilsatt, og den oppnådde blanding ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 1 time. Reaksjonen ble målt ved hjelp av silikagel-tynn-sj iktkromatograf i ved anvendelse av et metylenklorid/metanol/- eddiksyre (10:1:0,1) løsningsmiddelsystem. Basert på denne analyse, ble reaksjonen bestemt til å ha gått til omtrent 90 % fullstendighet. Reaksjonsblandingen ble deretter konsentrert under vakuum, fortynnet med etylacetat (100 ml) overført til en separasjonstrakt. Den organiske løsning ble vasket med mettet vandig natriumbikarbonat (2 x 5 0 ml) og vann (50 ml). Etter tørking over vannfri MgS04, ble det organiske lag avdampet til tørrhet. Det oppnådde produkt ble bestemt til å ha en renhet på over 95 % og ble anvendt i de påfølgende trinn uten ytterligere rensing. I de tilfeller hvor rensing var nødvendig, ble den imidlertid gjennomført ved hjelp av silikagel-hurtigkromatografering som beskrevet i de forutgående eksempler, ved anvendelse av et metylenklorid/metanol (40:1) løsningsmiddelsystem. Renheter av 28 og 29 ble bekreftet ved<1>H-NMR analyser.

(c) 1-0-dimetoksytritylering av 28 og 29:

Materialene og prosedyren for denne syntese var som beskrevet i eksempel 3(b), del (b). Renheten av disse materialer ble bekreftet ved H-NMR. (d) Omdannelse av forbindelsene omtalt i del (c) over, til de tilsvarende 2-0-(N,N-diisopropylmetyl)-fosforamiditter (22 og 23): Materialene og prosedyren for denne syntese var som beskrevet i eksempel 3(b), del (c). Renheten av produktene 22 og 23 ble bekreftet ved<31>P-NMR.

Eksempel 3( d) : Syntese av en ytterligere forlenget analog av et 3-N-(6-aminokaproyl)-amino-1,2-propandiol-basert linker-reagens.

De unike trinn i denne syntese er angitt skjematisk i figur 8 og er beskrevet i det følgende. (a) Syntese av 1-0-(dimetoksytrityl)-3-N-6-amino-caproyl)-Amino-1,2-dihydroksypropan (31).

Materialer: Forbindelse 30 ble fremstilt som beskrevet i eksempel 3(c), del (c).

Prosedyre: Forbindelse 30 (0,89 g, 1,1 mmol) ble under-kastet ammonolyse med konsentrert ammoniumhydroksyd (10 ml) og pyridin (10 ml) ved romtemperatur over natten. Prøver fra reaksjonen ble påsatt på silikagel-TLC plater og behandlet med ninhydrinreagens for å undersøke avbeskyttelse av det primære amin. Reaksjonsblandingen ble deretter tørket under vakuum og den opppnådde rest (30) ble anvendt i det etterfølgende trinn uten rensing. (b) Kobling av forbindelse 31 med forbindelse 28.

Materialer: Forbindelse 28 ble syntetisert i overensstemmelse med prosedyren som er beskrevet i eks. 3(c) del (a).

Prosedyre: N-Fmoc-aminokapronsyre (28, 1,1 mmol) ble omsatt med trietylacetylklorid (1,1 mmol) i henhold til prosedyren som er beskrevet i eks. 3(c), del (b). Deretter ble en løsning av forbindelse 30 (1,1 mmol) i tørr dimetylformamid tilsatt, igjen i overensstemmelse med prosedyren i eks. 3(c) del (b). Det oppnådde adukt, 32, ble renset ved silikagel-hurtigkromatografering som beskrevet i de foran-nevnte eksempler ved anvendelse av et kloroform/metanol (30:1) løsningsmiddelsystem. Utbyttet av produktet var 250 mg

(23 %). (c) Omdannelse av forbindelse 32 til tilsvarende 2-0-(N,N-diisopropylamin)-metoksyfosforamiditt (24).

Prosedyre: Metoden var i alt vesentlig den samme som den som er beskrevet i eksempel 3(b), del (c). Således ble forbindelse 32 (240 mg, 0,285 mmol) omsatt med N,N-diiso-propylaminoklormetoksyfosfin (73 ul, 0,371 mmol) i tørr metylenklorid (3 ml) inneholdende N,N-diisopropyletylamin (198 yl,1,14 mmol). Reaksjonen ble gjennomført ved fortynning med 2 % trietylamin i etylacetat (50 ml) og ekstrahering med mettet vandig natriumbikarbonat (25 ml) og vann (25 ml). Det oppnådde organiske lag ble tørket over vannfri natriumsulfat, filtrert og avdampet. Resten ble oppløst i flere milliliter etylacetat og presipitert i heksaner (150 ml) som beskrevet i ovennevnte eksempel. Utbyttet av 32 var 200 mg, hvis renhet ble bekreftet ved<1>H- og<32>P-NMR spektroskopi.

Eksempel 4: Automatisert festing av 2-(3-aminopropyl)-1,3- dihydroksypropan-basert linker til syntetiske oligonukleotider .

Festing av linker-reagenset beskrevet i eksempel 1, som heretter betegnes "LI", til forskjellig syntetiske oligonukleotider vil nå bli beskrevet. (a) "LI" reagenset ble koblet på 5'-enden av et deoksyoligonukleotid. Et deoksynukleotid med sekvensen "5'-GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-3'" ble syntetisert på en kontrollert porøs glassbærer med en Applied Biosystems, Inc., Model 3 80A DNA Synthesizer med anvendelse av standard fosforamiditt-kjemi. 5'-dimetoksytrityl-gruppen ble fjernet og en løsning av "LI" (0,1M) i tørr acetonitril ble koblet to ganger ved anvendele av standard koblingssykluser. Prosent koblinger ved første og andre tilsetning av "LI" ble kvantifisert i forhold til mengden av deoksyoligonukleotid med full lengde, ved å målte absorbansen ved 49 8 nm av dimetoksytrityl frigjort på slutten av hver koblingssyklus; idet disser verdier ble bestemt til å være henholdsvis 29 og 42 %. 5'-(Ll)- og 5'-(LI)-(LI)- oligonukleotidene ble renset ved gelelektroforese på en 20 % polyakrylamidgel inneholdende 7 M urea. De tilsvarende bånd ble visualisert ved UV skygging og ble anslått å vandre saktere på gelen med mellomrom omtrent 1,5 ganger det for de tilsvarende ytterligere nukleotidmellom-rom. Disse bånd ble skåret ut og linker-modifiserte deoksy-nukleotider ble gjenvunnet og renset ved standard metoder. (b) "LI" reagenset ble koblet på 3'-enden av et deoksyoligonukleotid. For denne syntese ble en teflon oksyderbar fast bærer anvendt (Molecular Biosystems, Inc., San Diego, CA, USA, katalog #0SS-01). Når et deoksyribonukleotid spaltes fra denne bærer, forblir forbindelsen anvendt under den første koblingssyklus på 3'-enden sammen med en 3'-terminal fosfatgruppe. En løsning av "LI" (0,2 M) i tørr acetonitril ble koblet til denne bærer ved anvendelse av tre koblingssykluser med standard fosforamiditt-kjemi på et Applied Biosystems, Inc., Model 380A DNA Synthesizer. Deretter ble en deoksyoli-gonukleotidsekvens som var identisk med den som er presentert umiddelbart over i del (a) tilføyd ved anvendelse av samme koblingskjemi. Initial prosent koblinger med "LI" reagenset ble bestemt som beskrevet over til å være 40 %, 63 % og 63 % for henholdsvis første, andre og tredje kobling. Etter fjerning av den terminale dimetoksytrityl-gruppen fra den oppnådde trimer, ble et deoksyoligonukleotid med samme sekvens som i 4(a) tilføyd ved anvendelse av standard fosforamiditt-kj emi . Bærermaterialet ble deretter fjernet fra syntetiser-ingsanordningen og behandlet med konsentrert ammoniumhydroksyd ved 55°C i 16 timer. Deretter ble bæreren vasket tre ganger med vann og behandlet med 50 mM NaI04 i 20 itiM natriumfosfat-buffer (pH 7,4) i 2,5 timer ved romtemperatur. Til slutt ble bæreren vasket flere ganger med vann og behandlet med en 10 % vandig løsning av n-propylamin ved 5 5°C i 3 timer. Den oppnådde løsning ble påført på en 20 % polyakrylamidgel inneholdende 7 M urea og det ble utført elektroforese. Tilsvarende 3'-(LI)-(LI)-(LI) deoksyoligonukleotid ble fremstilt som beskrevet over.

(c) "LI" ble koblet på 3'-enden av et deoksynukleotid med sekvensen

Syntesemetoden var den samme som beskrevet i del (b), med unntak av at en Biosearch Model 8750 DNA Synthesizer ble anvendt.

(d) "LI" ble koblet på 3'-enden av et deoksyoligonukleotid med sekvensen

Igjen ble metoden som er beskrevet i del (b) anvendt med unntak av at den automatiserte del av syntesen ble utført på en Biosearch Model 8750 DNA Synthesizer. (e) Hybridisering- og smeltetemperaturer (Tm) av syntetiske deoksyoligonukleotidprober inneholdende 2-(3-aminopropyl)-1,3-dihydroksypropan-linkere ("LI") innskutt mellom nukleotidbaser.

Materialer: To Ll-derivater av en 33-mer deoksyoligonukleotid-probe ble syntetisert ved lignende metoder som dem som er beskrevet over: "Ll-innføyning" har LI innføyd mellom nukleotidrestene 21 og 22 (nummerering fra 5'-enden);

"Ll-utskiftning" gir LI mellom nukleotidrestene 20 og 22 som en utskiftning for rest 21. Begge prober har sekvenser som er komplementære til ribosomal RNA fra Clamydia trachomatis ("target rRNA"). Probene ble merket med 125j ved hjelp av en standard prosedyre utviklet ved Gen-probe Inc., "hydroksyapatitt" (HAP) var fra Behring Diagnostic, Calbiochem Division, La Jolla, CA; natriumdodecylsulfat (SDS), natriumfosfat (mono- og dibasiske salter) og saltsyre var kvalitetsbestemte reagenser fra Fisher Scientific Corp.; Betagel (scintillasjons-væskeblanding) var fra West Chem, San Dieog, CA. Alle andre materialer var kvalitetsbestemte reagenser. Manipulasjoner ble utført i 1,5 ml polypropylen-Eppendorfrør med skrukork dersom intet annet angis.

Hybridiseringer ble gjennomført som følger: 48 pl 1 M natirumfosfat (pH 6,8), 10 ul 1 % SDS (v/v), 10 ul 125x merket probe (omtrent 200.000 CPM), 29,5 pl vann og enten 25 ul rRNA løsning (0,5 ug, "target") eller 2,5 ul vann ("kontroll") ble blandet og inkubert ved 60°C i en time. 10 ul prøver ble deretter fortynnet med 1 ml 0,12 M natriumfosfat (pH 6,8)/- 0,02% SDS/0,02 % natriumazid og vortex-blandet i 5 sekunder. De fortynnede prøver ble inkubert i et vannbad som var oppvarmet fra romtemperatur til 80°C; prøvene ble fjernet ved fastsatte temperaturer og lagret på is. Prøvene ble deretter ført gjennom en liten kolonne av hydroksyapatitt ekvilibrert med 0,12 M natriumfosfat (pH 6,8)/0,02 % SDS/0,02 % natriumazid, og eluentene ble talt ved scintillasjon ved anvendelse av standard prosedyrer. (Prosent tellinger som forble bundet til kolonnen tilsvarte hybridisert probe). Tm verdiene ble beregnet som de temperaturer hvor 50 % av det initialt dannede hybrid ble denaturert termisk til enkeltkjedede spesies. Resultater:

Dataene indirerer at begge prober hybridiserer til target rRNA som ventet, hvor Tm for "innskutt" probe var omtrent tre grader høyere enn Tm for "utskifting" proben.

Eksempel 5: Evnen som "LI" modifisert deoksyoliognukleotider har til å bli merket med biotin og fluorescein ble vist.

(a) 5'-(LI)- og 5'-(LI)-(LI)-modifiserte deoksyoliognukleotider beskrevet i det foregående i eksempel 4(a)

Materialer: Alfa-32p adenosintrifosfat var tilveiebragt fra New England Nuclear (DuPont, Boston, MA, USA). Termial deoksynukleotidyltransferase (TdT) og 5X "tailing" buffer var produkter fra Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg,

MD, USA).

20 pmol 51 -(LI)-(LI)-modifiserte oliognukleotider ble omsatt med 16,5 pmol alfa-P-32 adenosintrifosfat (spesifikk

aktivitet 3000 Ci/mmol) og 40 enheter TdT i 20 ul IX "tailing" buffer ved 37°C i en time. De oppnådde P-32 merkede oliognukleotider ble renset på en Nensorb-20 (TM) kolonne (New England Nuclear, DuPont, Corp., Boston MA, USA) i overensstemmelse med forhandlerens prosedyre, som er innlemmet heri som referanse.

(b) De P-32 merkede 5'-(LI)-(LI)-oliognukleotider ble omsatt med biotin-E-aminokapronsyre-N-hydroksysuccinimid ("Bio-X-NHS", Calbiochem-Behring Corp., San Dieog, CA USA). Streptavidin-agarose var tilveiebragt fra Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD, USA), og D(+) biotin var fra Calbiochem-Behring Corp. (San Dieog, CA, USA) . 1 pmol av hvert modifisert oliognukleotid beskrevet over ble omsatt med 2,5 mM Bio-X-NHS i 125 mM boratbuffer (pH 9) inneholdende 12,5 % dimetylsulfoksyd i 1,5 timer. Små prøver av de oppnådde reaksjonsblandinger ble deretter testet for binding til streptavidinagarose i 50 mM natriumfosfat (pH 7,4)/2 mM EDTA/0,5 NaCl, enten i nærvær av ("ikke-spesifikk bundet") eller fravær av ("spesifikk bundet") 0,2 mg/ml D(+) biotin. Bundet material ble kvantifisert ved scintillasj onstelling:

Festing av biotin til disse Ll-modifiserte oliogmerer ble også bekreftet ved at det ble utført elektroforese på prøver av de ovennevnte reaksjonsblandinger på en 20 % polyakrylamid/7 M ureagel. Representative bånd ble visualisert ved autoradiografi, som indikerte nærmest kvantitativ omdannelse til biotinylerte former, som vandret saktere enn de ikke-biotinylerte kontroller.

(c) 3'-Ll-modifiserte deoksyoliognukleotider beskrevet i eksempel 4(c,d)

("%'-AAATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT-L1-3'" og

"5'-CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATTT-L1-3'") ble merket med henholdsvis fluoresceins-isotiocyanat og biotin-X-NHS. Oliognukleotidene ble først kinasebehandlet med [gamma- 32P] adenosintrifosfat ved anvendelse av T4-polynukleotidkinase i henhold til prosedyren etter Maxam og Gilbert (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1977, vol. 74, side 560), som er innlemmet heri som referanse.

Det første modifiserte oliognukleotid ble omsatt med fluorescein-isotiocyanat (FITC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). 40 pmol av denne oliogmer ble behandlet med 90 mM FITC i 0,1 M boratbuffer (pH 9) inneholdende 90 % DMSO i 12 timer. Det ble deretter utført elektroforese på reaksjonsblandingen på en 20 % polyakrylamid/7 M ureagel. Bånd ble visualisert ved autoradiografi. Det øverste bånd fra hvert felt ble skåret ut og FITC-merket oliogmer ble fremstilt fra gelen og renset.

Et bindingsforsøk til en anti-FITC antistoff derivatisert fast bærer ble anvendt for å bekrefte festingen av fluorescein til oliognukleotidet beskrevet over. Anti-FITC magnetiske mikrokuler ble tilveiebragt fra Advanced Magnetic, Inc.

32 (Cambridge, MA, USA), Cat. #4310. Prøver av det rensede P merkede FITC modifiserte oliognukleotid ble blandet med 0,5 ml bufferløsning (50 mM natriumfosfat, pH 7,4/2 mM EDTA/0,5 M NaCl) inneholdende 20 yl anti-FITC mikrokuler i nærvær av ("ikke-spesifikk binding") eller fravær av ("spesifikk binding") 20 mM hydrolysert FITC. Etter 1 time, ble kulene fjernet ved magnetisk separasjon og supernatantene ble talt ved Cerenkovstråling for å bestemme mengden bundet material:

Det andre modifiserte oliognukleotid ble omsatt med biotin-X-NHS. 40 pmol av denne oliogmer ble behandlet med 10 mM bio-X-NHA i 0,1 M boratbuffer (pH 9) inneholdende 20 % DMSO i 1 time. Den oppnådde biotinylerte oliogmer ble renset ved hjelp av polyakrylamidgel-elektroforese som beskrevet over. Tilstedeværelsen av biotin festet til dette oliognukleotid ble bekreftet ved analyse av binding på streptavidin-agarose som beskrevet tidligere i dette eksempel:

Eksempel 6: Resistens av et 3'-Ll-modifisert deoksyoli-ognukleotid overfor hydrolyse katalysert ved en fosfordiesterase.

Materialer: Fosfordiesterase fra Crotalus-durissus ble tilveiebragt fra Boehringer-Mannehim Biochemicals (Indianapolis IN, USA). Dette enzym katalyserte eksonukleo-lytisk kutting fra 3<1->enden av et oliognukleotid. Et syntetisk oksyoliognukleotid med sekvensen

"5'-AAATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT-3'" ble syntetisert på en Applied Biosystems Model 380A DNA Synthesizer ved anvendelse av standard fosforamiditt-kjemi. En probe med

samme sekvens, men en 3'-Ll-linkerfestet, ble syntetisert i henhold til prosedyren som er gitt i eksempel 4.

3 2

Begge oliognukleotider ble kinasebehandlet med P i henhold til metoden som er nevnt i eksempel 5. Omtrent 350.000 CPM av hvert merkede oliognukleotid ble omsatt i 10 ul buffer (0,1 M tris-HCl, pH 8,0/20.mM MgCl2) inneholdende enten 3 x 10~<5>eller 3 X 10 enheter fosfordiesterase. 1,5 ul prøver ble fjernet ved tidsinetervaller på 5, 10, 15 og 30 minutter; reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 3 yl 0,1 N NaOH. Deretter ble 5 yl 90 % formamid inneholdende bromfenyIblått og xylanol XCFF fargestoffer tilsatt til hver prøve, og det ble utført elektroforese på de oppnådde prøver på en 20 % polyakrylamid/7M ureagel. Gelen ble deretter analysert ved autoradiografi.

Det 3'-LI modifiserte oliognukleotid ble funnet å være mere enn 95 % resistent overfor fosfordiesterase-katalysert hydrolyse etter 30 minutter, idet begge enzymkonsentrasjoner ble testet. Der var i alt vesentlig ingen ikke-modifisert oliognukleotid med full lengde påviselig på gelen, noe som indikerer at enzymet normalt kutter oliogmeren uten en 3'-LI gruppe.

Eksempel 7: Automatisert innelemmelse av 2,2-di-(3-aminopropyl)-1,3-dihydroksypropan-basert linkerreagens inn i et syntetisk oliognukleotid.

Innlemmelsen av linker-reagenset beskrevet i eksempel 2, heretter betegnet "L2" ble innskutt mellom basene i et syntetisk oliognukleotid, og danner sekvensen

"5'-CGTTACTCGGATGCCCAAAT(L2)ATCGCCACATTOG-3'". Den anvendte metode var lik den som er beskrevet i eksempel l(a), med unntak av at en løsning av "L2" (0,1 M i acetonitril) ble omsatt i den 13.ende koblingssyklus i stedet for i en siste koblingssyklus som beskrevet i eksempel 4(a)). Utbyttet av kobling med "L2" var omtrent 3 0 %, som estimert fra mengden frigjort dimetoksytrityl (se eks. 4(a)).

Eksempel 8: Automatisert innlemmelse av 3-amino-l,2-propandiol-basert linkerreagens inn i et syntetisk oliognukleotid.

Innlemmelsen av denne linker, heretter betegnet "L3", inn i et syntetisk oliognukleotid med sekvensen

"5'CCCGCACGTCCCTATT(L3)AATCATTACGATGG-3'" ble gjennomført i overensstemmelse med prosedyren som er gitt i eksempel(a). I dette eksempel ble en løsning av "L3" (0,3 M i tørr acetonitril) omsatt i den femtende koblingssyklus; idet koblings-utbyttet i dette trinn, estimert fra dimetoksytrityl-frigivelse (se eks. 4(a)), var omtrent 60 %.

Eksempel 8( a) : Automatisert innelmmelse av linkerreagenser 20, 21, 22, 23 og 24 inn i syntetiske oliognukleotider.

Innlemmelsen av linkerreagenser 20-24, hvis syntese er beskrevet over i eksempel 3(a)-3(d), ble utført som beskrevet over i eksempel 4, del (a). De tilsvarende linkere assosiert med disse reagenser er heretter betegnet henholdsvis "L4",

"L5", "L6", "L7" og "L8". I et spesielt tilfelle tilsvarende anvendelsen av ett av de ovennevnte reagenser, ble således en 0,12-0,2 M løsning av reagenset i tørr acetonitril innsatt i

stilling #6 i en Applied Biosystems Model 380A DNA Synthesizer (Foster City, CA, USA). Innlemmelsen av reagenset i en oligo-nukleotidpolymer ble oppnådd ved anvendelse av en standard

fosforamiditt-koblingsmetode. En rekke oliognukleotider ble fremstilt, med lengde fra 17 til 35 baser, idet hver av linkerne L4-L8 var innskutt på forskjellige steder i sekvensene. Koblingsutbyttene assosiert med disse reagenser, målt ved trityl-frigivelse på slutten av koblingssyklusen, var mellom 7 5 og 98 %.

Eksempel 9: Merking av amin linker-arm probe med acridiniumester og påfølgende rensing.

En 25 mM stamløsning av acridiniumester (for sammensetning henvises til I. Weeks et al., Clin. Chem. vol. 29, side 1474, 1983) ble fremstilt i destillert DMSO. Den ønskede mengde av en polymer fremstilt i eksemplene 4, 7 eller 8(a), ble avdampet til tørrhet i et konisk polypropylenrør på 1,5 ml. Følgende væskeblanding ble fremstilt ved tilsetning av følgende bestanddeler i rekkefølgen som er gitt under:

3 uL H20

1 yL 1 m HEPES (8,0)

4 yl DMSO (destillert)

2 pl 25 mM acridiniumester i DMSO (destillert)

Blandingen ble vortex-blandet, sentrifugert i en mikrosentrifuge i 2 sekunder (for å bringe innholdene til bunnen av røret) og inkubert ved 37°C i 20 minutter. På dette tidspunkt, ble følgende bestanddeler tilsatt til reaksjons-væskeblandingen i rekkefølgen gitt under:

3,0 yl 25 mM acridiniumester i DMSO (destillert)

1,5 yl H20

0, 5 yl 1 M (HEPES (8,0)

Væskeblandingen ble igjen vortex-blandet, sentrifugert og inkubert ytterligere 20 minutter ved 37°C. Ureagert markør ble undertrykt ved anvendelse av et 5-ganger lysinoverskudd, ved tilsetning av 5 yl 0,125 M lysin i 0,1 M HEPES (8,0), 50 % DMSO og inkubert i 5 minutter ved romtemperatur.

På dette tidspunkt ble acridinium-ester-merket oliogmer renset ved anvendelse av følgende metode. Til 20 yl reaksjonsbland-ing hvor reaksjonen var avbrutt ble 3 0 yl 3 M NaOAc (5,0),

245 yl H20 og 5 yl glykogen tilsatt som en bærer (glykogen var forbehandlet for å fjerne en hver nukleaseaktivitet). Prøven ble vortex-blandet forsiktig og 640 yl absolutt EtOH ble tilsatt. Prøven ble vortex-blandet forsiktig og inkubert på is i 5 til 10 minutter, deretter sentrifugert 5 minutter ved

15.000 rpm i en mikrosentrifuge. Supernatanten ble forsiktig fjernet og pelleten ble gjenoppløst i 20 yl 0,1 M NaOSc (5,0), 0,1 % SDS. Prøven ble renset ytterligere ved ionebytter-høy-trykkvæskekromatografi (HPLC) som følger: 20 yl gjenoppløst pellet ble injisert inn i en Nukleogen-DEAE 60-7 ionebytter

HPLC kolonne montert i et IBM 9533 HPLC system. Alle bufferne som ble anvendt i denne prosess var fremstilt med HPLC kvalitetsbestemt vann, acetonitril (CH3CN) og natriumacetat (NaOAc), og kvalitetsbestemt iseddik (HOAc) og LiCl. I tillegg ble andre buffere tiltrert gjennom nylon-66 filtere med porestørrelse 0,45 ym før anvendelse. I det spesifikke tilfellet hvor en nukelotid/ikke-nukleotid-multimer med totalt 2 6 monomerenheter, hvor kun en var ikke-nukleotid-monomerenhet, ble følgende eluerings-prosedyre anvendt. Buffer A var 2 mM NaOAc, pH 5,5, 20 % CH3CN; buffer B var 20 mM NaOAC (pH 5,5), 20 % CH3CN og 1 M LiCl. Eluering ble oppnådd med en lineær gradient fra 55 % buffer A, 45 % buffer B til 30 % buffer A, 70 % buffer B i 25 minutter ved en strømningshastig-het på 1 ml/min. Absorbans ved 260 nm ble målt under kjøringen, fraksjoner på 0,5 ml ble samlet i koniske polypro-pylenrør på 1,5 ml. Umiddelbart etter kjøringen, ble 5 yl 10 % SDS tilsatt hvert rør etterfulgt av Wortex-blanding av hvert rør (dette ble utført for å sikre at den acrdinium-ester-merkede probe ikke klebet til rørveggen). 0,5 yl prøve ble fjernet fra fraksjonene 21-42 og tilsatt til 200 yl vann i et 12 x 75 mm rør (en separat pipettespiss ble anvendt for hver prøve for å unngå overføringsproblemet). Kjemiluminescens for hver prøve ble deretter bestemt i en Berthoid Clinilumat ved automatisk injeksjon av 20 0 yl 0,25 N HNO3, 0,1 % H202, etterfulgt etter 1 sekunds opphold, av 200 yl INNaOH og kjemiluminescens ble avlest i 10 sekunder.

Fraksjoner 29-33 ble EtOH presipitert ved tilsetning av 5 yl glykogen til hver, vortexblanding, tilsetning av 1 ml ETOH til hver, vortexblanding, inkubering 5-10 minutter på is og sentrifugering i 5 minutter ved 15.000 rpm i en mikrosentrifuge. Hver supernatant ble forsiktig fjernet, og hver pelett ble gjenoppløst i 20 yl 0,1 M NaOAc, pH 5, 0,1 % SDS og disse separate fraskjoner ble deretter samlet.

Ved hjelp av de ovennevnte eksempler har man således vist at reagensene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles, idet hvert har en ikke-nukleotid hovedkjede, første og andre koblingsgrupper og en ligand, alt som tidligere beskrevet under "oppsummering av oppfinnelsen".

Særlig reagens (5) har en ikke-nukleotid propyl-hovedkjede, hvortil det er bundet en første koblingsgruppe av metyl-N, N-diisopropylfosforamid,

en andre koblingsgruppe av 1-hydroksy beskyttet med dimetoksytrityl (DMT), og en ligand i form av aminopropyl-linker-armen som er beskyttet med trifluoracetyl. Reagens (10) er det samme som reagens (5) med unntak at det førstnevnte er forsynt med to identiske ligander (i form av to beskyttede trifluoracetylaminopropyl-linker-armer). Reagens (13) er også likt reagens (5) med unntak av at ikke-nukleotidhovedkjeden er etyl eller en propyl, og linker-armen er kortere, idet den kun er trifluoracetyl-beskyttet metylamin heller enn et likeledes beskyttet aminopropyl.

Som vist i det foregående, kan et enkelt reagens i henhold til oppfinnelsen anvendes for å tilveiebringe en linker-arm spesifikt i enhver forhåndsutvalgt stilling (stillinger) på en nukleotidmultimer, uten innføring av uønskede nukleotider. Som også beskrevet, ved kobling av en hovedkjede til et nukleotid og en annen hovedkjede, (som i sin tur deretter kobles til en annen hovedkjede osv. for å fremstille en kjede), tillater nå reagensene i henhold til oppfinnelsen muligheten av at en rekke nærliggende ligander (for eksempel markører eller linker-armer hvortil markører kan festes) tilveiebringes i en nukleotidmultimer. Således kan multiple nærliggende markører bindes til proben, og dermed øke sensitiviteten av et hybridiseringsforsøk ved anvendelse av en slik probe.

Videre kan anvendelse av en eller en rekke sekvens-bundne ikke-nukleotidhovedkjeder i henhold til oppfinnelsen ytterligere tjene til å bygge bro mellom to nukleotidsekvenser på proben som er komplementære til de tilsvarende sekvenser på en target-nukleotidmultimer, som kan være tilknyttet ved en enkel forskjellig nukleotid eller en forskjellig sekvens i en testprøve. Således kan target-nukleotidmultimeren egentlig være en gruppe av to eller flere nukleotidmultimerer bestående av vanlige nukleotidsekvenser av interesse, som er knyttet sammen ved et enkelt forskjellig nukelotid eller forskjellige nukleotidsekvenser som ikke er av interesse. Selv når en enkel targetsekvens er av interesse, er det mulig å fremstille proben med en komplementær sekvens og med den ikke-nukleotide monomerenhet som bærer markørgruppen koblet mellom hvilket som helst av to nukleotider. I et slikt tilfelle, hybridiserer proben target-nukleotidsekvensen på normal måte med unntak av at monomerenheten som bærer markørgruppen vil tilpasse seg på en slik måte at den ikke interfererer med den forutgående hybridisering (dvs. at den vil "bukte ut" av hybridstruk-turen). Et slikt arrangement kan være særlig fordelaktig i situasjoner hvor det er ønskelig å dra fordel av innføynings-effekter (som beskrevet av U. Asseline Et al, Proe. Nati. Acad, Sei. USA, vol. 81, side 3297-3301), for eksempel å øke probespesifisitet. Det faktum at man i den foreliggende oppfinnelse anvender ikke-nukleotid-monomerenheter reduserer selvfølgelig betraktelig interferens av den type som er beskrevet i det foregående, i forhold til tidligere prober som anvender nukleotid-monomerenheter.

Som omtalt i "oppsummering av oppfinnelsen" over, kan forbindelsene (4), (9) og (12) festes til en fast fase syntesebærer gjennom deres primære hydroksylgruppper (se Gait og Sarang for teknikker som kan tilpasses et slikt formål). De oppnådde derivatiserte bærere, når de anvendes for ytterligere polymer-syntese, resulterer i festing av en ikke-nukleotid-monomerenhet på den 3'-terminale enden av den resulterende nukleotid/ikke-nukleotid polymer.

Det vil forståes at en rekke variasjoner av den ovennevnte beskrevne oppfinnelse er mulig. Leganden kan for eksempel faktisk være en markør eller en innføyning som er tilveiebragt på reagensene i henhold til oppfinnelsen før de kobles til et nukleotid av en nukleotidmultimer. Videre, som beskrevet i "oppsummering" i det foregående, kan forskjellige andre beskyttelsesgrupper anvendes enn dem som er spesifisert i eksemplene over. Anvendelsen av enten den trifluoracetyl-eller 9-fluorenylmetoksykarbonyl-aminobeskyttende gruppe er imidlertid særlig foretrukket, da den avspaltes for å avbeskytte aminet under de samme alkaliske betingelser som anvendes i kjente standard oligonukleotidsynteser, for å avbeskytte eksocykliske nukleotidaminer (typisk konsentrert NH4OH ved 50°C i 1 til 12 timer). Likeledes tillater anvendelse av dimetoksytrityl 5'-hydroksy-beskyttelse, metyl-eller beta-cyanoetylfosfitt-O-beskyttelse og N, N-diisopropyl som en fosfitt-utgående gruppe under koblingen, alle reagenser å være helt overensstemmende med nåværende standard oligonukleotid fast fase synteseteknikker, slik at nødvendigheten for andre ytterligere spesialtrinn minimaliseres.

Andre variasjoner og endringer av utførelsesformene i henhold til oppfinnelsen som er definert over, vil være mulige for den fagkyndige på området. Følgelig er den foreliggende oppfinnelse ikke begrenset til de utførelsesformer som er beskrevet detaljert over.

Claims

1. Ikke-nukleotid reagens passende for fremstilling av en nukleotid/ikke-nukleotid polymer, karakterisert ved at det omfatter: (a) en ikke-nukleotid monomerenhet med en ligand valgt fra en sidearm med en tilknyttet kjemisk rest, og fra en bindingsarm som kan aktiveres under ikke-ugunstige betingeler for å være i stand til binding med en kjemisk rest; (b) første og andre ikke-nukleotid koblingsgrupper bundet til monomerenheten, idet første koblingsgruppe er i stand til å koble ikke-nukleotid-monomerenheten til en første ytterligere monomerenhet, mens den andre koblingsgruppe forblir inakti-vert slik at den i alt vesentlig ikke er i stand til kobling, men som deretter kan aktiveres under ikke-ugunstige betingelser til å koble ikke-nukleo-tidmonomerenheten til en andre ytterligere monomerenhet, idet minst en av den første og andre ytterligere monomerenhet er en nukleotid-monomerenhet.

2. Reagens som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte ligand velges fra en markør, en intercalator-innføyning, en metallchelator, legemidler, hormoner, proteiner, peptid, haptener, radikaldannere, nukleolytiske midler, proteolytiske midler,- katalysatorer, spesifikke bindingssubstanser, midler som modifiserer DNA transport og substanser som endrer nukleotid-multimeropp-løselighet, og fra en bindings-funksjonell gruppe som kan være bundet til hvilken som helst av de ovennevnte kjemiske rester.

3. Ikke-nukleotidreagens passende for fremstilling av en nukleotid/ikke-nukleotid polymer, karakterisert ved at det omfatter: a) en ikke-nukleotid monomerenhet med en ligand som velges fra en sidearm med en tilknyttet kjemisk rest og fra en beskyttet bindingsarm som kan avbeskyttes under ikke-ugunstige betingelser for å bli i stand til binding med en kjemisk rest; b) en ikke-nukleotid første koblingsgruppe og beskyttet andre koblingsgruppe bundet til monomerenheten, idet første koblingsgruppe er i stand til å koble ikke-nukleotid-monomerenheten til en første ytterligere monomerenhet mens den andre i alt vesentlig ikke er i stand til kobling, men som deretter kan avbeskyttes under ikke-ugunstige betingelser slik at den er i stand til å koble ikke-nukleotide-monomerenheten til en andre ytterligere monomerenhet, idet minst en av den første og andre monomerenhet er en nukleotid monomerenhet.

4. Reagens som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte ligand velges fra en markør, en intercalator-innføyning, en metallchelator, legemidler, hormoner, proteiner, peptider, haptener, radikaldannere, nukolytiske midler, proteolytiske midler, katalysatorer, spesifikke bindingssubstanser, midler som modifiserer DNA transport og substanser som endrer nukleotid-multimer-oppløselighet, og fra en bindings-funksjonell gruppe som kan bindes til hvilken som helst av de ovennevnte kjemiske rester.

5. Reagens som angitt i krav 4, karakterisert ved at den første og andre koblingsgruppe er i stand til å koble ikke-nukleotid-monomerenheten til henholdsvis en 5 <1-> hydroksylgruppe og en 3'-fosfatgruppe i en monomerenhet.

6. Reagens som angitt i krav 5, karakterisert ved at ikke-nukleotid-monomerenheten har en acyklisk hovedkjede til hvis respektive ender den første og ande koblingsgruppe er bundet.

7. Reagens som angitt i krav 5, karakterisert ved at ikke-nukleotid-monomerenheten har en hovedkjede til hvis respektive ender den første og andre koblingsgruppe er bundet, idet hovedkjeden har fra 1 til 20 atomer.

8. Reagens som angitt i krav 5, karakterisert ved at ikke-nukleotid-monomerenheten har en hovedkjede til hvis respektive ender koblingsgruppene er bundet, idet hovedkjeden er en acyklisk hydrokarbonkjede med fra 1 til 10 karbonatomer.

9. Reagens som angitt i krav 5, karakterisert ved at ikke-nukleotid-monomerenheten har en hovedkjede til hvis respektive ender koblingsgruppene er bundet og hvori bindingsarmen er en kjede med fra 1 til 25 atomer som strekker seg ut fra hovedkjeden.

10. Reagens som angitt i krav 2, karakterisert ved at det er valgt fra en av forbindelsene med formel:

hvori(a) R2 = en hovedkjede av ikke-nukleotid-monomerenheten,

er første koblingsgrupper hvori: X2 = halogen eller substituert amin X4 = halogen, amino eller0 ~ R 3 = alkyl, alkoksy eller fenoksy R5 = alkyl, alkoksy eller aryloksy eller er H kun dersom X4 = 0 (c) R^ - Xi - er den beskyttede andre koblingsgruppe hvori: X1 = 0, S, NH eller HN=N- R] _ = beskyttelsesgruppen som kan spaltes under koblingsgruppe-avbeskyttelsesbetingelser for å oppnå den andre koblingsgruppe H-X] _-, (d) n er et helt tall, (e) X3 -R4 - er liganden.

11. Reagens som angitt i krav 10, karakterisert ved at X2 = Cl eller sekundært amin, R2 = klorfenoksy, metoksy, etoksy eller beta- cyanoetoksy, X4 = Cl, sekundært amin eller 0 <_> når R5 = H R5 = metoksy, etoksy, monoklorfenoksy eller betacyanetoksy, eller er H bare dersom X4 = 0~

12. Reagens som angitt i krav 11, karakterisert ved at liganden er en beskyttet bindingsarm hvori X3 er et alkylamin bundet til R2 ved C- og til R4 ved N-, og hvori R4 er valgt fra trifluoracetyl og 9-fluormetylmetoksykarbonyl.

13. Reagens som angitt i krav 11, karakterisert ved atR2 har et sekundært karbon bundet til -0-.

14. Reagens som angitt i krav 10, karakterisert ved at de sekundære amino-gruppene velges fra dialkylamin og heterocykliske N-aminer.

15. Reagens som angitt i krav 10, 11 eller 14, karakterisert ved a t R4 er trifenylmetyl eller et alkoksyderivat derav.

16. Reagens som angitt i krav 10, 11 eller 14, karakterisert ved a t = 0 og = trifenylmetyl eller et alkoksyderivat derav.

17. Reagens som angitt krav 10, 11 eller 14, karakterisert ved atX1 =OogR^ = dimetoksytrifenylmetyl.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av et substituert nukleotid fra et reagens med: (a) en ikke-nukleotid-monomerenhet, og (b) en ligand bundet til ikke-nukleotid-monomerenheten og valgt fra en sidearm med en festet kjemisk rest og fra en bindingsarm hvortil en kjemisk rest kan bindes under ikke-ugunstige betingelser, karakterisert ved at ikke-nukleotid-monomerenheten kobles til en nukleotid-monomerenhet og til en av en andre monomerenhet og en fast bærer under ikke-ugunstige betingelser.

19. Fremgangsmåte for fremstilling av et substituert nukleotid fra et reagens med: (i) en ikke-nukleotid-monomerenhet med en ligand valgt fra en sidearm med en festet kjemisk rest og fra en beskyttet bindingsarm hvortil en kjemisk rest kan bindes, og (ii) en første koblingsgruppe og en beskyttet andre koblingsgruppe bundet til ikke-nukleotid-monomerenheten, karakterisert ved , under ikke-ugunstige betingelser, (a) først kobling av ikke-nukleotid-monomerenheten til en første ytterligere monomerenhet gjennom den første koblingsgruppe, (b) deretter avbeskyttelse av den andre koblingsgruppe, (c) deretter kobling av ikke-nukleotid-monomerenheten gjennom den andre koblingsgruppe til en andre ytterligere monomerenhet, idet minst en av den første og andre monomerenhet er en nukleotid-monomerenhet mens den andre velges fra en monomerenhet og en fast bærer.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 18 eller 19, karakterisert ved at både den første og andre ytterligere monomerenhet er nukleotid-monomerenheter.

21. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert ved at den første og andre koblingsgruppe kan koble ikke-nukelotid-monomerenheten til henholdsvis en 5 <1-> hydroksylgruppe og en 3'-fosfatgruppe i en nukleotid-monomerenhet.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 19, karakterisert ved at ikke-nukleotid-monomerenheten har en acyklisk hovedkjede til hvis respektive ender den første og andre koblingsgruppe er bundet.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 19, karakterisert ved at reagenset velges fra en av forbindelsene med formel:

hvori:(a) R2 = en hovedkjede av ikke-nukleotid-monomerenheten,

er første koblingsgrupper hvori: X2 = halogen eller substituert amin X2 = halogen, amino eller 0~ R3 = alkyl, alkoksy eller fenoksy r <5> = alkyl, alkoksy eller fenoksy eller kan være H kun der som X4 = 0~ (c) Ri~ Xi~ er den beskyttede andre koblingsgruppe hvori: X± = 0, S, NH eller HN=N - R] _ = beskyttelsesgruppen som kan spaltes under koblingsgruppe-avbeskyttelsebetingelser for å oppnå den andre koblingsgruppe H-X^ -, (d) n er et helt tall (e) X3 -R4 er liganden.

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 23, karakterisert ved at nevnte ligand velges fra en markør, en intercalator-innføyning, en metallchelator, og fra en bindings-funksjonell gruppe som kan være bundet til en markør, en intercalator-innføyning og en metallchelator.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 24, karakterisert ved at X2 = Cl eller sekundært amin R3 = klorfenoksy, metoksy, etoksy eller beta-cyanoetoksy X4 = Cl, sekundært amin eller 0~ når R5 = H R5 = metoksy, etoksy, monoklorfenoksy, beta-cyanoetoksy eller kan være H bare dersom X4 = 0".

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 24, karakterisert ved at de sekundære amino-grupper i reagenset velges fra dialkylamin og heterocykliske N-aminer.

27. Fremgangsmåte som angitt ikrav 23 eller 26, karakterisert ved Ri i reagenset er trifenylmetyl eller et alkoksyderivat derav.

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 23 eller 26, karakterisert ved at reagenset R] _ = dimetoksytrifenylmetyl.

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 23 eller 26, karakterisert ved at reagenset har = 0 og Ri = dimetoksytrifenylmetyl.

30. Fremgangsmåte som angitt i krav 23 til 26, karakterisert ved at den ytterligere omfatter kobling av ytterligere monomerenheter til den koblede nukleotid/ikke-nukleotidpolymer, for fremstilling av en polymer med en nukleotidsekvens som er komplementær til minst en del av en target-nukleotidsekvens, men hvis komplementære nukleotidsekvens har minst en ikke-nukleotid-monomerenhet anbragt deri, hvorpå nukleotid/ikke-nukleotidpolymersekvensen hybridiseres med target-sekvensen.

31. Sammensetning inneholdende en enkel sekvens nukleotid/- ikke-nukleotidpolymer som majoriteten av alle tilstedeværende nukleotid/ikke-nukleotidpolymerer, idet den enkle nukleotid/- ikke-nukleotidpolymeren omfatter: (a) en ikke-nukleotid-monomerenhet som har bundet dertil en ligand valgt fra en sidearm med en festet kjemisk rest og fra en bindingsarm som kan bindes til en kjemisk rest under ikke-ugunstige betingelser, (b) en første nukelotid-monomerenhet koblet til ikke-nukleotid-monomerenheten, og (c) en ytterligere monomerenhet koblet til ikke-nukleotid-monomerenheten .

32. Sammensetning som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ligand velges fra en markør, en intercalator-innføyning, en metall-chelator og fra en bindings-funksjonell gruppe som kan være bundet til markøren, intercalator-innføyningen og en metallchelator.

33. Sammensetning som angitt i krav 31 eller 32, karakterisert ved at den ytterligere enhet er en nukleotid-monomerenhet.

34. Sammensetning som angitt i krav 31 eller 32, karakterisert ved at den ytterligere monomerenhet er en ikke-nukleotid-monomerenhet som er koblet til en annen ikke-nukleotid-monomerenhet.

35. Sammensetning inneholdende en nukleotid ikke-nukleotidpolymer karakterisert ved at den omfatter: (a) en ikke-nukleotid-monomerenhet som har en ligand bundet dertil valgt fra en sidearm med en festet kjemisk rest bundet ti hovedkjeden gjennom en mettet bindingsgruppe, og fra en mettet bindingsarm som kan være bundet til en kjemisk rest under ikke-ugunstige betingelser, (b) en første nukleotid-monomerenhet koblet til ikke-nukleotidmonomerenheten, og (c) en ytterligere monomerenhet koblet til ikke-nukleo-tidmonomerenheten.

36. Sammensetning som angitt i krav 35, karakterisert ved at nevnte ligand velges fra en markør, en intercalator-innføyning, en metallchelator og fra en mettet bindingsarm som kan være bundet til enten en markør eller en intercalator.

37. Sammensetning som angitt i krav 36, karakterisert ved at ligandgruppen er den mettede bindingsarm.

38. Sammensetning som angitt i krav 34, karakterisert ved at ikke-nukleotid-monomerenheten har en hovedkjede til hvis ender koblingsgruppene er bundet og hvori liganden omfatter en markør bundet til hovedkjeden gjennom bindingsgruppen som er valgt fra et alkylamin og alkyltio.

39. Sammensetning som angitt i krav 37, karakterisert ved at bindingsarmen er valgt fra et alkylamin og et alkyltio.

40. Sammensetning som er angitt i krav 35, 37 eller 39, karakterisert ved at ikke-nukleotid-monomerenheten har en hovedkjede til hvis ender koblingsgruppene er bundet, idet hovedkjeden er en acyklisk hydrokarbonkjede med fra 1 til 20 karbonatomer.

41. Sammensetning som angitt i krav 35, karakterisert ved at markøren er en kjemiluminescerende acridiniumester.

42. Sammensetning som angitt i krav 36, karakterisert ved at intercalator-innføy-ningen er en acridiniumester.

43. Sammensetning som angitt i krav 35, karakterisert ved at markøren er valgt fra biotin, fluorescein, dinitrobenzen, rodamin og Texas Rød.

44. Sammensetning som angitt i krav 35, karakterisert ved at intercalator-inn-føyningen er valgt fra psoralen, akridin, akridinsalter, akriflaviner og etidium.

45. Polymerprobe, karakterisert ved at den omfatter et flertall nukleotid-monomerenheter og minst en akridiniumester-rest bundet til en tilsvarende monomerenhet i proben.

46. Probe som angitt i krav 45, karakterisert ved akridinium-estermarkøren er en kj emiluminescerende-akridiniumester-markør.

47. Fremgangsmåte for fremstilling av en probe, karakterisert ved at minst en akridinium-esterrest bindes til en tilsvarende monomerenhet av en polymer med et flertall nukleotid-monomerenheter.

48. Fremgangsmåte som angitt i krav 47, karakterisert ved akridiniumester-markøren er en kjemiluminescerende-akridiniumester-markør.

49. Reagens som angitt i krav 10, 11, 24, 25, 31 eller 35, karakterisert ved at liganden er en beskyttet bindingsarm hvori R4 er bindingsarmen og X3 er beskyttelsesgruppen.

50. Reagens som angitt i krav 10, 11, 24, 25, 31 eller 35, karakterisert ved at liganden er en beskyttet bindingsarm hvori X3 er en alkylamino-bindingsarm bundet til R 2 ved en C- og til R4 ved N-, og R4 er beskyttelsesgruppen.