TW202300504A - 用於ｄｎａ合成之通用連接子試劑 - Google Patents

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Abstract

本發明提供利用通用連接子胺基亞磷酸酯進行寡核苷酸合成之方法及組合物。方法及試劑與使用可控孔徑玻璃（CPG）固體撐體且在用於電化學DNA合成之鉑塗佈電極上進行DNA合成一起描述。通用連接子可用作單一管柱PCR引子合成中之間隔子以在裂解之後產生2個具有游離3'-羥基末端之股。該等方法及組合物利用用於合成寡核苷酸之固體撐體系統，其中該撐體具有鉑電極及通用連接子，視情況其中該鉑電極經胺塗佈。該等方法及組合物進一步描述通用連接子胺基亞磷酸酯之用途，且鉑電極經單醣或雙醣塗佈。

Description

用於DNA合成之通用連接子試劑
本發明提供一種用於藉助於通用連接子技術與具有經塗佈之電極（例如鉑電極）之固體撐體裝置組合來電化學合成寡聚物的電極陣列。
DNA微陣列領域之快速發展已產生許多用於合成製備DNA之方法。此類方法包括點樣預合成寡核苷酸、使用遮罩或無遮罩技術之光微影、藉由印刷試劑進行原位合成及使用保護基之電化學解阻斷在電極微陣列上進行原位平行合成。寡核苷酸微陣列合成之評述由例如Gao等人, Biopolymers 2004, 73:579提供。1991年報導了使用光遮罩技術合成製備肽陣列。此方法在2000年經擴展以包括使用光生酸及/或與用於解阻斷之光敏劑組合的可定址遮罩技術。使用光不穩定解阻斷之肽微陣列合成的評述由以下提供：Pellois等人, J. Comb. Chem. 2000, 2:355及Fodor等人, Science, 1991, 251:767。點樣預合成肽或經分離蛋白質已用於產生肽陣列。蛋白質或肽陣列之評述由以下提供：Cahill及Nordhoff, Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 2003, 83:177。通用撐體可用於DNA合成，此係由於使用四種不同固體撐體（或更多）製備3'-未經修飾寡核苷酸耗費大量人力。
兩種不同類型之通用連接子（UL）為可商購的。兩種類型連接子具有鄰二醇結構，其分別經保護為酸敏感性4,4'-二甲氧基三苯甲基（DMT）（用於寡核苷酸延伸）及鹼敏感性醯基（用於在脫除保護基期間釋放寡核苷酸）。第一類型連接子（通用撐體III，USIII）藉由用無水氨處理而釋放（Azhayev, 2001, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 20(4-7):539-50；Yagodkin, 2011, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 30(7-8):475-89），且描述於例如美國專利第6,770,754號中。第二類型UL（UNYLINKER™或UNYSUPPORT™）用氨水（Guzaev, 2003）或無水甲胺氣體（美國專利7,202,264）釋放。已所描述互補金氧半導體（CMOS）型電極陣列上之電化學平行DNA合成（Maurer等人, 2006, PLoS One.2006年12月20日; 1(1):e34；美國專利第10,525,436號）。在此申請案中，在DNA合成之前塗佈CMOS晶片表面，各鉑電極上方具有經吸收多孔反應層。DNA合成始於多孔層上之羥基。在DNA合成之後，寡核苷酸留在晶片上或寡核苷酸自晶片表面裂解。經吸收多孔塗層之一個問題為釋放寡核苷酸之裂解時間長。長裂解時間減緩DNA合成產生且可影響DNA品質。所釋放之寡核苷酸仍可具有連接至3'末端之經吸收塗佈分子。DNA股之3'-修飾對於一些應用（諸如PCR引子）而言成問題，因為3'-修飾阻斷聚合酶延伸。電極上經吸收塗層之另一問題為在DNA合成期間或在用於多重雜交分析時降解。
本發明藉由提供利用具有通用連接子之改良固體撐體介質合成寡核苷酸之方法來解決此等挑戰。
本文提供在經塗佈電極上利用通用連接子或在單管柱PCR引子合成中利用通用連接子作為間隔子進行寡核苷酸合成的方法及組合物。
在一個實施例中，方法及組合物可包含用於合成寡核苷酸之固體撐體系統，其中撐體包含鉑電極及通用連接子。在各種實施例中，鉑電極首先用經取代或未經取代之脂族基、經取代或未經取代之脂族醚、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳族基（例如聚苯甲醇基團）、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環基塗佈，以允許DNA合成起始。經醇塗佈之電極進一步經可裂解通用連接子官能化，以允許在合成及脫除保護基之後釋放DNA。在本發明之一些實施例中，固體撐體可在經塗佈表面中包括鉑電極及分隔鉑電極之介電質（絕緣體）。介電質可為選自由以下組成之群的至少一者：氮氧化矽、氮化矽、二氧化矽及正矽酸四乙酯（TEOS）。
在一實施例中，合成寡核苷酸之方法可包含使用本文所描述之組合物。
在一範疇中，本發明可關於用於合成寡核苷酸之固體撐體系統，其中撐體可包括平面表面及通用連接子，其中通用連接子可偶合（附接或連接）至平面表面。
在另一範疇中，平面表面可在附接通用連接子之前經胺塗佈。
在另一範疇中，平面表面可經羧酸塗佈。
在另一範疇中，平面表面可為矽、鈦或鉑。
在另一範疇中，固體撐體系統可含有式（I）、（III）或（IV），視情況，其中通用連接子可藉由使平面表面與式（II）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）化合物或其組合反應而偶合至平面表面， （a）式（I）：
Figure 02_image001
其中，當A為包含經取代或未經取代之脂族基、經取代或未經取代之脂族醚、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳族基、經取代或未經取代之雜環基之附接至經塗佈鉑電極的連接部分時，W或Q中之一者為在鹼性或中性條件下可裂解之阻斷基團，而W或Q中之另一者為H或在酸性條件下可裂解之阻斷基團；或 其中，當A為H、經取代或未經取代之脂族基、經取代或未經取代之脂族醚、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳族基、經取代或未經取代之雜環基時，Q或W中之一者為在鹼性或中性條件下可裂解之附接至經塗佈鉑電極的連接子部分，而W或Q中之另一者為H或在酸性條件下可裂解之阻斷基團； （b）式（II）：
Figure 02_image002
； （c）式（III）：
Figure 02_image003
其中 R為附接至鉑電極或其他基底材料之烷基、芳基、雜烷基或雜芳基； A為NH、O、S、烷基或芳基； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （d）式（IV）：
Figure 02_image005
； R 1為附接至鉑電極或其他基底材料之烷基、芳基、雜烷基或雜芳基 （e）式（V）：
Figure 02_image006
； （f）式（VI）：
Figure 02_image007
其中 A為
Figure 02_image008
； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （g）式（VII）：
Figure 02_image010
； （h）式（VIII）：
Figure 02_image007
其中 A為
Figure 02_image012
； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （i）式（IX）：
Figure 02_image014
； （j）式（X）：
Figure 02_image016
。
在另一範疇中，化合物可為式（II）、（IV）、（V）、（VII）、（IX）、（X）或其組合。
在另一範疇中，化合物可為式（VII）、（IX）或（X）。
在另一範疇中，平面表面可經單醣或雙醣塗佈。
在另一範疇中，單醣可選自由以下組成之群：阿洛糖、阿卓糖、阿拉伯糖、去氧核糖、赤藻糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、來蘇糖、甘露糖、阿洛酮糖、L-鼠李糖、核糖、核酮糖、景天庚酮糖、D-山梨糖醇、山梨糖、賽盧糖（sylulose）、塔格糖、塔羅糖、蘇糖、木酮糖及木糖，且雙醣選自由以下組成之群：蔗糖、直鏈澱粉、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、蜜二糖、巴拉金糖及海藻糖。
在一範疇中，本發明可關於一種用於合成寡核苷酸之方法，其包含：（a）提供具有平面表面之電極裝置；（b）使表面與通用連接子偶合；及（c）合成寡核苷酸。
在另一範疇中，方法可進一步包括沈積羧酸電化學還原羧酸於平面表面上之步驟。
在另一範疇中，方法可進一步包括將胺塗層沈積於經活化羧酸上。
在另一範疇中，平面表面可含有矽、鈦或鉑。
在另一範疇中，固體撐體系統可含有式（I）、（III）或（IV），視情況，其中通用連接子可藉由使平面表面與式（II）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）化合物或其組合反應而偶合至平面表面。
在一範疇中，本發明可關於一種用於合成寡核苷酸引子對之方法，其包含提供固體撐體，固體撐體包含固定在固體撐體之表面上之第一通用連接子；進行第一胺基亞磷酸酯DNA合成以產生第一寡核苷酸引子，其中第一寡核苷酸引子之3'端附接至第一通用連接子；將第二通用連接子偶合至第一寡核苷酸引子之5'端；進行第二胺基亞磷酸酯DNA合成以產生第二寡核苷酸引子，其中第二寡核苷酸引子之3'端附接至第二通用連接子；及使固體撐體與釋放劑接觸，藉此自固體撐體釋放第一及第二寡核苷酸引子，其中所釋放之第一寡核苷酸引子及所釋放之第二寡核苷酸引子中之各者含有3'-羥基。
在另一範疇中，第一通用連接子可藉由使固體撐體與式（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）之第一化合物或其組合反應而固定於固體撐體。
在另一範疇中，第一化合物為式（VII）、（IX）或（X）。
在另一範疇中，第二通用連接子可藉由使第一寡核苷酸引子與式（VII）、（IX）或（X）之第二化合物反應而附接至第一寡核苷酸引子。
在另一範疇中，釋放劑可包括4 M甲胺/MeOH或TEA:3HF。
在另一範疇中，方法可進一步包括用AMA（1:1，37%氫氧化銨:40%甲胺）自所釋放之第一寡核苷酸引子及所釋放之第二寡核苷酸引子移除保護基。
在另一範疇中，所釋放之第一寡核苷酸引子及所釋放之第二寡核苷酸引子的長度可大約相同。
在另一範疇中，所釋放之第一寡核苷酸引子與所釋放之第二寡核苷酸引子的濃度比可為約1:1。
在另一範疇中，方法可在單一管柱中進行。
在另一範疇中，化合物可為式（X）。
在一範疇中，本發明可關於式（XI）化合物，
Figure 02_image018
（XI）， 其中 A為
Figure 02_image008
， X為醯基、芳醯基或矽基，且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基。
在另一範疇中，n可為5。
在另一範疇中，X可為矽基。
在另一範疇中，矽基可為三甲基矽基、三乙基矽基、三級丁基二苯基矽基、三級丁基二甲基矽基或三異丙基矽基。
在另一範疇中，矽基可為三級丁基二甲基矽基。
在另一範疇中，Y可為二甲氧基三苯甲基。
在另一範疇中，化合物可包括(R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2,2,3,3-四甲基-8-側氧基-4-氧雜-7,9-二氮雜-3-矽雜十五烷-15-基2-氰基乙基二異丙基胺基亞磷酸酯。
在一範疇中，本發明可關於一種用於合成寡核苷酸之方法，其包括：（a）提供本發明之固體撐體系統；（b）使表面與通用連接子偶合；及（c）合成寡核苷酸。
在另一範疇中，鈦可包括氮化鈦。
在另一範疇中，平面表面可包括由至少一種介電質分隔開之複數個鉑電極。
在另一範疇中，至少一種介電質可選自由以下組成之群：氮氧化矽、氮化矽、二氧化矽及正矽酸四乙酯（TEOS）。
在進一步描述本發明之前，應理解，本發明不限於下文所描述之本發明之特定實施例，因為可對該等特定實施例作出變化，且其仍屬於隨附申請專利範圍之範圍內。亦應理解，所用術語係出於描述特定實施例之目的且不意欲為限制性的。實情為，本發明之範圍將由隨附申請專利範圍建立。
本發明之優點可包括例如（1）藉由使用矽基保護通用連接子之二級羥基來改良寡核苷酸產率，（2）二級羥基碳處之單一異構體允許更容易對通用連接子胺基亞磷酸酯進行化學分析，因為可存在較少胺基亞磷酸酯試劑之異構形式，（3）藉由在通用連接子中使用「預先組織」鄰位同側氧官能化基團改良裂解，及（4）藉由在單次操作中自動合成及純化引子對之1:1混合物減少勞動。
隨著高通量DNA合成器之引入，通用固體撐體之相關性似乎比以往更加重要。習知合成撐體含有第一鹼基附接至連接子之連接子。舉例而言，合成寡去氧核糖核苷酸需要四種（A、T、G、C）固體撐體。相比之下，通用固體撐體含有不具有與之附接之第一鹼基的通用連接子。因此，通用固體撐體可允許使用一種撐體進行所有合成。因此，通用連接子可（1）消除對核苷-連接子-撐體之庫存的需要，（2）使在選擇正確核苷-連接子-撐體類型時出錯之可能性降至最低，（3）在高通量合成器中產生核苷-連接子-撐體陣列時縮短時間且消除可能錯誤，及（4）允許製備含有任何所選核苷（A、T、G、C）之3'-OH末端的寡核苷酸（當給定撐體習知地可能不會提供此選項時）。
本文提供一種在DNA合成電極上合成3'-未經修飾寡核苷酸之改良方法。3'-未經修飾寡核苷酸之合成極大地簡化，且經合成之寡核苷酸的品質及裂解效率改良。此處所描述之用於DNA合成之試劑含有可施加至經塗佈電極表面之通用連接子。
存在兩種不同類型之通用連接子（參見例如圖1），其已經商業化且由Glen Research（Sterling, VA）銷售。兩種類型連接子具有鄰二醇結構，其分別經保護為酸敏感性DMT基團（用於寡核苷酸延伸）及鹼敏感性醯基（用於在脫除保護基期間釋放寡核苷酸）。在各種情況下，DNA合成始於連接子結構中之二甲氧基三苯甲基（DMT）。用鹼處理釋放具有未經修飾3'-羥基末端之寡核苷酸（參見圖2）。
組合物及方法包含使用包含經塗佈之鉑電極的通用連接子固體撐體結構，其中經塗佈表面與通用連接子偶合。對於具有通用撐體III之結構的連接子，用無水氨之甲醇溶液對二級羥基上之二氯乙醯基進行保護基脫除釋放3'-未經修飾核酸股用於進一步脫除保護基及純化。二氯乙醯基對鹼極具反應性，但氨水脫除保護基亦自磷酸酯快速裂解氰基乙基保護基且使自電極表面釋放之合成寡核苷酸的產率較低。亦可用三級丁胺或DBU選擇性移除氰基乙基以將合成寡核苷酸股固定於固體撐體。
儘管二級羥基上之二氯乙醯基保護基已在通用撐體III中展示良好效能，但氰基乙基之競爭性水解導致低產率。舉例而言，文獻中已描述「通用連接子胺基亞磷酸酯」（參見Yagodkin, 2009）。其使用更穩定的2,4-二氯乙醯基保護基，且展示與二氯乙醯基保護基相比所釋放之寡核苷酸的產率低15-25%。在本文中，吾人揭示矽基（諸如TBDMS或TBDPS）可用於保護二級羥基。此基團可用氟離子（諸如TBAF或TREAT HF）移除，因此防止氰基乙基之競爭性水解且使所釋放之寡核苷酸的產率較高。
通用連接子可具有構形剛性且化學穩定之橋頭環氧原子，其攜帶以同側定向鎖定之4,4'-二甲氧基三苯甲基（DMT）及丁二醯基（Ravikumar等人, Org. Process Res. Dev. 2008, 12, 3, 399-410）。鄰位同側氧官能化基團之幾何結構允許在標準氨水脫除保護基條件下快速且乾淨地裂解。如圖3中所示，結構經「預先組織」而在剛性環系統之同一側上具有鄰位羥基。當鹼敏感性丁二酸酯鍵水解時，發生3'-羥基寡核苷酸之去磷酸化及釋放。
本文所描述之方法及系統包含固體撐體系統，其包含經塗佈之鉑電極與通用連接分子的組合，該通用連接分子基於UNYLINKER™或UNYSUPPORT™系統，在本文中由式（II）表示，且用氨水（Guzaev, 2003, J Am Chem Soc, 125(9):2380-1）或無水甲胺氣體（美國專利7,202,264）釋放，此等參考文獻中之各者的內容以全文引用的方式併入本文中。
用於合成其中通用連接子之方法可見於例如Guzaev, 2003及Yagodkin, 2011中，其各自以全文引用之方式併入本文中，特定言之關於製備通用連接分子之方法。
在一個實施例中，基於通用撐體III系統之連接子始於3-胺基-1,2-丙二醇之純(R)或(S)-異構體，如圖4中所示。連接子系統之先前合成使用化合物之外消旋混合物（黏稠糖漿，在739 mm Hg下bp 264-265），而純異構體為固體（mp 54-56℃）。諸位發明人使用出人意料地廉價的(R)異構體作為合成所需連接子之起始物質。二級羥基碳處之單一立體異構體簡化了合成通用連接子胺基亞磷酸酯所需之許多中間物的下游合成。舉例而言，本文所描述之通用連接子胺基亞磷酸酯為2種非鏡像異構物之混合物，而先前努力產生4種非鏡像異構物之混合物。儘管一些物理特性不同，但單一異構體通用連接子與混合異構體在釋放3'-OH未經修飾寡核苷酸之方面的表現相同，且吾人主張單一及混合異構體結構兩者。
在一個實施例中，本文所提供之方法及系統包含固體撐體系統，其包含經塗佈之鉑電極與基於通用撐體III系統之通用連接分子的組合。用於合成其中通用連接子之方法可見於例如Azhayev, 2001及Yagodkin, 2011中，其各自以引用之方式併入本文中，且特定言之關於製備通用連接分子之方法。如上所指出，其使用混合立體異構體，但化學製備與單一異構體類似。
在一個實施例中，固體撐體系統包含式（I）中所闡述之通用連接子：
Figure 02_image021
其中，當A為包含經取代或未經取代之脂族基、經取代或未經取代之脂族醚、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳族基、經取代或未經取代之雜環基之附接至經塗佈鉑電極的連接部分時，W或Q中之一者為在鹼性或中性條件下可裂解之阻斷基團，而W或Q中之另一者為H或在酸性條件下可裂解之阻斷基團；或 其中，當A為H、經取代或未經取代之脂族基、經取代或未經取代之脂族醚、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳族基、經取代或未經取代之雜環基時，Q或W中之一者為在鹼性或中性條件下可裂解之附接至經塗佈鉑電極的連接子部分，而W或Q中之另一者為H或在酸性條件下可裂解之阻斷基團。
在另一實施例中，固體撐體系統包含式（II）中所闡述之通用連接子：
Figure 02_image002
在另一實施例中，固體撐體系統包含式（III）中所闡述之通用連接子（混合及單一異構體）：
Figure 02_image022
其中 R為附接至鉑電極或其他基底材料之烷基、芳基、雜烷基或雜芳基； A為NH、O、S、烷基或芳基； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性條件下可移除之保護基。
在另一實施例中，固體撐體系統包含式（IV）中所闡述之通用連接子（混合及單一立體異構體）：
Figure 02_image005
R 1為附接至鉑電極或其他基底材料之烷基、芳基、雜烷基或雜芳基。
在另一實施例中，固體撐體系統包含式（V）中所闡述之通用連接分子（混合及單一立體異構體）：
Figure 02_image006
在此實施例中，用疊氮化物處理含有胺之固體撐體以形成脲鍵（參見圖2）。此方法已成功用於合成USIII（Yagodkin 2011）。在固定期間，二氯乙醯基保護基可能脫離，且所公開之方案用1,1'-羰基二咪唑（CDI）活化之二氯乙酸再封端，隨後用於DNA合成。
在本文之其他實施例中，通用連接子為胺基亞磷酸酯。
在另一實施例中，固體撐體系統包含式（VI）中所闡述之通用連接子（混合及單一立體異構體）：
Figure 02_image024
其中 A為
Figure 02_image008
； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基。
在另一實施例中，固體撐體系統包含式（VII）中所闡述之通用連接子（混合及單一立體異構體）。合成描述於圖5中。
Figure 02_image025
在本文之其他實施例中，通用連接子為胺基亞磷酸酯。
在一個實施例中，固體撐體系統包含式（VIII）中所闡述之通用連接子（混合及單一立體異構體）：
Figure 02_image027
其中 A為
Figure 02_image028
； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基。
在另一實施例中，固體撐體系統包含式（IX）中所闡述之通用連接子（混合及單一立體異構體）：
Figure 02_image014
以上連接子結構展示先前未報導之脂族連接子與受保護胺基丙二醇結構之間的胺基甲酸酯鍵。合成描述於圖6中。
在另一實施例中，固體撐體系統包含式（X）中所闡述之通用連接子（混合及單一立體異構體）。合成描述於圖7中。
Figure 02_image016
本文所描述之脂族基可具有約1與約10個之間的碳、約1與約8個之間的碳、約2與約6個之間的碳，且可為飽和或不飽和的。適合之脂族基包括但不限於甲烷、乙炔、乙烯、乙烷、丙炔、丙烯、丙烷、1,2-丁二烯、1-丁炔、1-丁烯、丁烷、正戊基、壬基或其組合。
本文所描述之低碳數烷基可具有1至6個碳。舉例而言，低碳數烷基包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、三級丁基、異丁基或正己基。
本文所描述之芳族有機基團可為環狀碳鏈，或者根據休克耳規則（Hückel Rule）定義。芳族有機基團包括但不限於苯、苯基、苯胺、苯乙酮、苯甲醛、苯甲酸、苯甲腈、苯乙烯、鄰二甲苯或其組合。
本文所描述之低碳數醇基可為可溶於水中之醇，例如甲醇、乙醇及丙醇。
本文所描述之雜芳族基團可為含有雜原子（例如O、N、S）作為環狀共軛╥系統之一部分的芳族化合物。
本文所描述之雜環基可經取代或未經取代，可為具有至少兩個不同類型之原子的環狀基團。雜環基一般包含碳及氮、硫或氧，且可為3、4、5、6、7或8員環。飽和雜環基之實例包括但不限於氮
Figure 02_image031
、氧
Figure 02_image031
、硫
Figure 02_image031
、氮呾、氧呾、硫呾、吡咯啶、氧
Figure 02_image034
、硫
Figure 02_image034
、吡啶、
Figure 02_image036
烷、噻烷、氮
Figure 02_image038
、氧
Figure 02_image038
、硫
Figure 02_image038
、氮咁、氧咁、硫咁、氮喃、氧喃及硫喃。不飽和雜環基之實例包括但不限於氮吮、氧吮、硫吮、氮唉、氧唉、硫唉、吡咯、呋喃、噻吩、吡啶、哌喃、噻喃、氮呯、氧呯、硫呯、氮
Figure 02_image040
、氧
Figure 02_image040
、硫
Figure 02_image040
、氮嚀、氧嚀及硫嚀。
本文所描述之核苷基部分可為由核苷分子損失-OH而形成之基團。核苷分子包括但不限於胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、胸苷及肌苷。
寡核苷酸基可為DNA或RNA之短股。舉例而言，長度為1-250個核苷酸（或核糖核苷酸）。
本文提供用於在固體撐體介質上進行寡核苷酸合成之方法。如本文件中所用之術語「寡核苷酸」具有其習知含義。一個非限制性範疇，術語「寡核苷酸」泛指聚去氧核苷酸（含有2-去氧-D-核糖）、聚核糖核苷酸（含有D-核糖）、任何其他類型之聚核苷酸（其為嘌呤或嘧啶鹼基之N-醣苷）及含有非核苷酸主鏈之其他聚合物，其限制條件為該等聚合物含有呈諸如DNA及RNA中所發現之允許鹼基配對及鹼基堆疊之組態的核鹼基。應瞭解，如本文所用，術語「核苷」及「核苷酸」將包括不僅含有已知嘌呤及嘧啶鹼基，且亦含有經修飾嘌呤及嘧啶鹼基及已經修飾之其他雜環鹼基的彼等部分（此等部分有時統稱為「嘌呤及嘧啶鹼基及其類似物」）。此類修飾包括甲基化嘌呤或嘧啶、醯基化嘌呤或嘧啶及其類似物。本文中之方法及組合物利用通用連接子將寡核苷酸附接至固體撐體，其中非核苷連接子附接至固體撐體材料。不管待合成之寡核苷酸的序列如何，此方法允許使用相同固體撐體。
描述新穎通用連接子胺基亞磷酸酯（ULP）試劑，其可施加至經塗佈之鉑電極以允許合成3'-未經修飾核酸股。如本文中所體現的ULP之實例闡述於式（VII）、（VIII）（IX）及（X）中且可使用本文所描述之方法製備。通用連接子胺基亞磷酸酯與例如Caruthers等人（美國專利第4,415,732號；第4,458,066號；第4,500,707號；第4,668,777號；第4,973,679號；及第5,132,418號)所揭示之標準核苷酸胺基亞磷酸酯相關，各專利之內容以全文引用的方式併入本文中。
ULP結構中二氯乙酸（DCA）保護基之敏感性可導致合成方面的困難。舉例而言，如美國專利8,779,194（以全文引用之方式併入本文中）中所描述，將連接子疊氮化物（式V）偶合至1-胺基-6-己醇得到脲鍵之初始嘗試不成功，因為DCA基團經受不住偶合條件。如本文所描述，諸位發明人發現，矽基（諸如三級丁基二甲基矽基（TBDMS））可用於在一個早期步驟處保護一級醇基團，且可在最後一個反應步驟處用氟化物試劑（諸如四丁基氟化銨（TBAF）水溶液）移除，隨後轉化為胺基亞磷酸酯。此方法提供高產率且允許合成目標ULP，諸如圖5中所示。
雖然主要歸因於商業可用性在圖5中所描述之方法中使用1-胺基-6-己醇，但該方法不限於此連接子。可使用任何適合連接子。其他烷基長度及結構可存在於反應性胺基亞磷酸酯（在一級羥基處）與胺基丙二醇觸發劑（受DMT保護）之間的連接子中。舉例而言，芳基或雜芳基可存在於連接子中，只要該等基團在DNA合成偶合循環中不具反應性即可。胺基酸酯基團與胺基丙二醇觸發劑之間的連接子之選擇在圖6及7中所描述之其他ULP中同樣可調整。
在圖5中所示之合成方法期間選擇使用TBDMS來保護一級羥基，因為其可藉由用如TBAF之氟化物試劑處理而移除。可使用其他矽基保護基（例如TBDPS）代替TBDMS。類似地，其他氟化物脫除保護基試劑為可用的且可代替TBAF使用。在任何情況下，移除矽基保護基必須使酸敏感性DMT基團及鹼敏感性DCA基團未受影響。可使用其他羥基保護基如（例如苯甲基），且將其在溫和氫化條件下移除。一級羥基上之保護基的選擇在圖6及7中所描述之其他ULP中同樣可調整。
在一個實施例中，所需胺基亞磷酸酯選自圖5中所示之式。
在一個實施例中，提供一種產生ULP，諸如根據式（VII）之ULP的方法，其中1-胺基-6-己醇與氯甲酸對硝基苯酯（4-NPC）反應，且一級醇進一步經TBDMS保護。隨後將所得化合物偶合至連接子胺3（結構展示於圖4中），得到受TBDMS保護之脲。亦可使用胺基丙二醇連接子胺3之S-異構體或外消旋混合物，且將可能具有與R-異構體相當的環化及裂解速率。對於S-異構體化合物，僅化合物之旋光性將相反，且外消旋化合物將不為光學活性的。在任何情況下，需要存在脲、醯胺或胺基甲酸酯質子以促進圖2中所描述之DCA觸發劑水解之後的重排。DCA酯可例如藉由如先前所描述（Yagodkin 2011）用羰基二咪唑活化而形成。引入DCA酯之其他方法為可能的，但吾人發現，CDI方法方便且在合理規模上得到良好產率。最後，TBDMS基團用TBAF移除且醇經亞磷酸酯化，得到所需胺基亞磷酸酯（例如，ULP 1）。根據此實施例之用於產生ULP 1之例示性方法展示於圖5中。
在另一實施例中，提供一種產生ULP，諸如根據式（IX）之ULP的方法，其中首先製備受TBDPS保護之1,6-己二醇且將其用氯甲酸對硝基苯酯（4-NPC）活化。隨後使所得化合物與連接子胺3偶合，得到受TBDPS保護之胺基甲酸酯。亦可使用胺基丙二醇連接子胺3之S-異構體或外消旋混合物，且將可能具有與R-異構體相當的環化及裂解速率。DCA酯可例如藉由用羰基二咪唑活化而形成，但其他方法為可能的。最後，TBDPS基團用TBAF移除且醇經亞磷酸酯化，得到所需胺基亞磷酸酯（例如，ULP 2）。根據此實施例之用於產生ULP 2之例示性方法展示於圖6中。
在另一實施例中，提供一種產生ULP，諸如根據式（X）之ULP的方法，其中ULP（例如ULP3）使用氟化物觸發之矽基保護基而非鹼觸發之DCA保護基製備。根據此實施例，合成始於如圖4中所示之(R)胺基丙二醇，但使用TBDMS-Cl來保護二級羥基（3個步驟產率為66%）。隨後用氫氧化銨移除三氟乙醯胺保護基。胺與氯甲酸對硝基苯酯（4-NPC）活化之6-胺基己醇反應產生脲鍵。一級醇直接亞磷酸酯化，得到所需胺基亞磷酸酯（例如ULP 3）。根據此實施例之用於產生ULP 3之例示性方法展示於圖7中。
適用於寡核苷酸合成之任何撐體材料可與本發明一起使用。舉例而言，固體撐體可為珠粒、粒子、薄片、量桿、桿、膜、過濾器、纖維（例如光學或玻璃）、半導體裝置，或呈任何其他適合形式。其他適合固體撐體包含以下材料，包括但不限於硼矽酸鹽玻璃、瓊脂糖（agarose）、瓊脂糖凝膠（sepharose）、磁性珠粒、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、膜、二氧化矽、半導體材料、矽、有機聚合物、陶瓷、玻璃、金屬、塑膠聚碳酸酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯啶酮及鹼石灰玻璃。基體可呈以下形式：珠粒、盒、管柱、圓柱、碟、盤（例如玻璃盤、皮氏培養皿（PETRI dish））、纖維、膜、過濾器、微量滴定盤（例如96孔微量滴定盤）、多葉片棒狀物、網狀物、集結粒、培養盤、環、桿、輥、薄片、載片、棒、托盤、管或小瓶。基板可為單個離散體（例如單個管、單個珠粒）、任何數目之複數個基體（例如10個管之支架、若干珠粒）或其組合（例如包含複數個微量滴定盤之托盤、填充有珠粒之管柱、填充有珠粒之微量滴定盤）。
固體撐體材料之材料組成可為任何適合之材料，諸如聚合或二氧化矽類撐體材料。特定實例包括塑膠、耐綸、玻璃、二氧化矽、金屬、金屬合金、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、交聯聚葡萄糖及其組合。 固體撐體
在一範疇中，用於寡核苷酸合成之撐體材料可包含平坦（平面）電極。平坦電極視開槽電極之定向而定產生發散或均勻場。平坦電極可定向為電極之開槽側面向彼此以產生用於電細胞融合之發散場。或者，其可定向為平坦側面向彼此，提供用於電穿孔之均勻場。
平坦電極可為包含複數個單元及表面之密集電極陣列，其中複數個單元中之各單元包括陽極及環形陰極，其中陽極中之各者為可單獨定址電極，且其中多孔反應層吸附至表面。
可使用標準CMOS技術製造電極陣列裝置。此裝置利用盤狀活性電極及連續環形相對電極的交替陣列。在CMOS製程中，使用鋁佈線及電極製造半導體矽晶圓，且隨後藉由濺鍍另一金屬進行「後處理」。在某些實施例中，金屬為鉑。
另一格式為具有由排列成列及行之盤狀電極製成的標準電極陣列裝置，存在將電極陣列之各「單元」分隔開的線。單元包含電極及獨立地以電子方式分別接入各電極所需的相關聯電路。在某些實施例中，分隔各單元之線可升高至電極陣列表面（其中電極具有表面暴露）且充當相對電極之陣列寬網格，在各電化學合成步驟中電極對其接通。
寡核苷酸合成可在包含複數個可單獨定址之鉑電極的撐體介質上進行。電極可使用芳基重氮鹽塗佈。芳基重氮鹽由通式R−Ar-N 2 +X −表示，其中R可為任何有機基團，諸如烷基或芳基，且X為無機或有機陰離子，諸如鹵素或四氟硼酸根。術語「鹵素」表示氯、氟、溴或碘。在一個實施例中，可使用胺基苯基乙酸（APA）之重氮鹽及電化學還原（亦稱為電沈積或電接枝）將羧酸塗層施加至電極表面。已針對用苯乙醇基團塗佈金電極以用於DNA合成描述類似化學方法（Levrie, 2018, Jpn. J. Appl. Physics, 04FM01，其以全文引用之方式併入本文中）。 寡核苷酸合成
寡核苷酸之標準合成方法為此項技術中已知的（例如美國專利第5,750,666號、第6,111,086號、第6,008,400號及第5,889,136號），其各自以全文引用之方式併入本文中。
撐體結合之寡核苷酸合成依賴於將核苷酸依序添加至生長鏈之一端。在本發明中，本文所描述之通用連接子反應於固體表面撐體上，例如用於寡核苷酸合成之經胺塗佈之鉑上。通常，將第一核苷（在存在之任何環外胺官能基上具有保護基）附接至固體撐體介質，且逐步添加活化亞磷酸酯化合物（其亦攜帶適當保護基）以延長生長的寡核苷酸。用於固相合成之其他方法可見於Caruthers美國專利第4,415,732號；第4,458,066號；第4,500,707號；第4,668,777號；第4,973,679號；及第5,132,418號；及Koster美國專利第4,725,677號，其各自之內容以全文引用之方式併入。
能夠自分子上之化學官能基電化學移除保護基的電化學試劑藉由向所選電極施加足夠電勢在所選電極處產生。根據本發明，移除保護基或「脫除保護基」在由電極產生之化學試劑用於自所選分子脫除例如酸或鹼不穩定保護基之保護或移除該保護基時在所選分子處發生。矽基保護基可用氟離子源脫除保護基。因此，在一些實施例中，化學試劑為氟化物試劑。適合之氟化物試劑的實例包括但不限於四丁基氟化銨（TBAF）、吡啶·(HF) x、三氫氟化三乙胺（TREAT HF）、氫氟酸、參(二甲胺基)鋶二氟三甲基矽酸鹽（TASF）及氟化銨。
在本發明之一個實施例中，根據本發明提供單體核苷酸或連接分子（亦即，將例如單體或核苷酸「連接」至基板的分子）之末端，其受可藉由電化學產生之試劑移除的保護基保護。保護基暴露於在電極處電化學產生之試劑，且在第一所選區中自單體、核苷酸或連接分子移除以暴露反應性官能基。隨後使基板與第一單體或預先形成之分子接觸，該第一單體或預先形成之分子與暴露官能基鍵結。此第一單體或預先形成之分子亦可攜帶至少一個可藉由電化學產生之試劑移除的受保護化學官能基。
如本文所用，術語「保護基」（或「阻斷基團」）係指此項技術中已知在合成程序期間保護羥基、胺基或硫醇基免於非所需反應的不穩定化學部分。如此項技術中已知之保護基一般描述於T. H. Greene及P. G. M. Wuts, 1999, Protective Groups in Organic Synthesis, 第3版, John Wiley & Sons, New York中。羥基保護基之實例包括但不限於苯甲氧基羰基、4-硝基苯甲氧基羰基、4-溴苯甲氧基羰基、4-甲氧基苯甲氧基羰基、甲氧基羰基、三級丁氧基羰基（BOC）、異丙氧基羰基、二苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基矽基)乙氧基羰基、2-糠氧基羰基、烯丙氧基羰基（Alloc）、乙醯基（Ac）、甲醯基、氯乙醯基、三氟乙醯基、甲氧基乙醯基、苯氧基乙醯基、苯甲醯基（Bz）、甲基、三級丁基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基矽基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苯甲基（Bn）、對甲氧基苯甲基二苯基甲基、三苯甲基（trityl）、4,4'-二甲氧基三苯基甲基（DMT）、經取代或未經取代之9-(9-苯基)
Figure 02_image043
基（pixyl）、四氫呋喃基、甲氧基甲基、甲硫基甲基、苯甲氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基矽基)乙氧基甲基、甲磺醯基、對甲苯磺醯基、三甲基矽基、三乙基矽基及三異丙基矽基。在一些實施例中，保護基為DMT。
在一些實施例中，羥基保護基為矽基保護基。矽基保護基之實例包括但不限於2-(三甲基矽基)乙氧基羰基、2-三甲基矽基乙基、2-(三甲基矽基)乙氧基甲基、三甲基矽基（TMS）、三乙基矽基（TES）、三異丙基矽基（TIPS）、異丙基二甲基矽基（IPDMS）、二乙基異丙基矽基（DEIPS）、三級丁基二甲基矽基（TBS）、三級丁基二苯基矽基（TBDPS）、四異丙基二亞矽氧烷基（TIPDS）、二-三級丁基亞矽基（DTBS）及三級丁基二甲基矽基（TBDMS）。
單體或預先形成之分子隨後可以相同方式脫除保護基，得到第二組反應性化學官能基。隨後使第二單體或預先形成之分子（其亦可攜帶至少一個可藉由電化學產生之試劑移除的保護基）與基板接觸以與第二組暴露官能基鍵結。任何未反應之官能基可視情況在合成方法期間之任何時間點封端。脫除保護基及鍵結步驟可在基板上此位點處依序重複，直至獲得所需序列及長度之聚合物或寡核苷酸。
具有一種或多種攜帶至少一個與之鍵結的受保護化學官能基之分子的基板可接近電極陣列，該陣列與緩衝或清除溶液接觸。在向陣列中所選電極施加足以產生能夠使受保護化學官能基脫除保護基之電化學試劑的電勢之後，接近所選電極之分子脫除保護基以暴露反應性官能基，藉此使其準備好進行鍵結。隨後使單體溶液或預先形成之分子（諸如蛋白質、核酸、多醣及卟啉）之溶液與該基板表面接觸，且單體或預先形成之分子與脫除保護基之化學官能基鍵結。
本文所描述之方法可進一步包含使該單體官能化撐體介質與封端劑反應；及視情況用氧化劑處理該單體官能化撐體介質。
在寡核苷酸合成之後，寡核苷酸可自固體撐體介質釋放或固定於固體撐體介質上。此等方法可包含用可有效自撐體介質、較佳自附接至自撐體介質之連接子裂解寡核苷酸之試劑處理寡核苷酸的步驟。在一些此類實施例中，用可有效裂解寡核苷酸之試劑處理寡核苷酸移除寡核苷酸上存在之保護基。在一些實施例中，裂解寡核苷酸在裂解位點處具有3'未經修飾末端羥基。在各種實施例中，用無水氨處理固體撐體介質持續足以裂解寡核苷酸之時段。
隨後可藉由此項技術中已知的程序，例如藉由尺寸排阻層析、高效液相層析（例如反相HPLC）、微差沈澱等來製備裂解寡核苷酸。在根據本發明之一些實施例中，寡核苷酸自固體撐體介質裂解，而5'-OH保護基仍在最終核苷上。隨後對此所謂的帶DMT（或帶三苯甲基）寡核苷酸進行層析，之後藉由在有機酸中處理來移除DMT基團，之後將寡核苷酸去鹽且進一步純化以形成最終產物。
在一些實施例中，固定化寡核苷酸可由本文所描述之通用撐體連接子系統製備。寡核苷酸結合撐體結構首先用20%三級丁胺之乙腈溶液處理1小時（Chang及Horn, 1999, Nucleosides and Nucleotides, 2006, 第1205-6頁）以移除氰基乙基及丙烯腈副產物。所得磷酸二酯穩定，且當二氯乙酸酯基團用氨水或AMA（1:1，37%氫氧化銨:40%甲胺）處理水解時不裂解（參見例如圖3）。在保護基裂解完成之後，洗滌晶片且寡核苷酸保持固定在電極上。 寡核苷酸之用途
本文所提供之方法及組合物適用於基因體編輯庫，諸如CRISPR gRNA篩選庫及shRNA篩選庫；靶向定序，諸如雜交捕獲或分子倒置探針（MIP）；突變誘發庫；產生用於原位雜交應用之寡核苷酸；及產生用於DNA資料儲存之寡核苷酸池。
自動化DNA合成之常見應用係用於產生PCR引子。PCR使用一對定製引子在所擴增之序列的相對端引導DNA朝向彼此延伸。此等引子之長度通常在18與24個鹼基之間，且應僅編碼所擴增之序列的特定上游及下游位點，如圖10中所示。
本文所描述之通用連接子胺基亞磷酸酯可用於在單一合成管柱中製備2個引子，如圖11中所示。ULP在引子1與引子2 DNA序列之間引入間隔子，如圖11中所示。在「脫除三苯甲基」DNA合成之後，可用4 M氨/MeOH處理固體撐體。引子1序列自固體撐體釋放，照常具有3'-羥基。通用連接子間隔子同時裂解，得到具有3'-羥基之引子2序列。用氨水或AMA移除保護基產生引子1及引子2之1:1混合物。蒸發留下引子之1:1混合物，以及污染失效序列及經移除之保護基。
通常，PCR引子藉由移除寡核苷酸上之5'-三苯甲基及使用凝膠過濾管柱簡單地「去鹽」來純化。凝膠過濾係基於分子大小來分離混合物之組分，且為用於寡核苷酸純化之最簡單層析形式之一。裂解保護基及短截短序列保留在凝膠基質中，而較大寡核苷酸分子經由凝膠過濾管柱快速溶離。由於引子1及引子2之長度大約相同，因此其以相同溶離份溶離。使用2種寡核苷酸之組合消光係數，藉由260 nm吸光度來確定引子之1:1混合物的濃度。1:1混合物可直接用於PCR而不必分別溶解2種寡核苷酸，確定各引子之濃度，計算各引子之體積以達成1:1混合物，吸移且混合所需體積，及再乾燥混合物。因此，藉由在單次操作中自動合成兩種引子之1:1混合物及純化節省許多勞動。
使用胺基亞磷酸酯DNA合成，化學分子可在固體撐體基板表面上以逐步反應合成，該反應一般在3'至5'方向上進行且由以下組成：（1）去三苯甲基化步驟，以自先前添加之核苷移除保護基，（2）將下一核苷偶合至生長DNA寡聚物，（3）氧化以將亞磷酸三酯中間物轉化成更穩定的磷酸三酯，（4）不可逆地封端任何未反應之5'羥基。以不受理論約束為前提，封端未反應之5'羥基可藉由避免在後續循環中自此類3'羥基繼續聚合來幫助防止合成序列具有相對於預選核酸序列之缺失。可重複循環以添加下一鹼基。固體撐體可包含多種單元，諸如珠粒，包括但不限於高度多孔聚合珠粒；玻璃或二氧化矽珠粒，包括但不限於熔融二氧化矽（非晶純二氧化矽）、石英（結晶純二氧化矽）、金屬（鈦，例如氮化鈦，或鉑），或本文所描述或此項技術中另外已知的其他任何其他適合之珠粒，其可裝入腔室或管柱中，合成試劑遞送至該腔室或管柱中。本文所描述之方法、裝置及組合物可用於使用微流體方法按比例調整核酸合成方法。
脫除三苯甲基寡核苷酸合成係指在偶合及氧化步驟期間使用保護目標寡核苷酸之5'-羥基的5'-O'三苯甲基。在合成完成後，可用酸將三苯甲基自目標寡核苷酸（例如「脫除三苯甲基序列」）裂解。
酸性條件可包括約1至約6.9、約2至約6.9、約3至約6.9、約4至約6.9、約5至約6.9及約6至約6.9的pH。
中性條件可包括約6.9至約7、約7、約7至約7.1、約7至約7.2、約7至約7.3、約7至約7.4及約7至約7.5的pH。 定義
「胺基亞磷酸酯」(RO) 2PNR 2係指亞磷酸二酯之單醯胺。胺基亞磷酸酯之特徵可包括其由弱酸（例如三乙基氯化銨或1 H-四唑）催化之對親核試劑的高反應性。在此等反應中，進入的親核試劑可置換NR 2部分。
「脂族」係指開鏈烴基，無論直鏈還是分支鏈，其不含任何類型之環；及環烴基，若其不為芳族。
「脂族醚」係指分子中醚基上不存在芳基之醚。
「芳族」係指單環及多環芳族烴基。
「醯基」係指藉由自包括無機酸之含氧酸移除一個或多個羥基衍生之部分。其可含有雙鍵氧原子及烷基（R-C=O）。
「芳醯基」係指衍生自芳族羧酸之任何單價基團R-CO-。
「鄰二醇」係指佔據鄰位之兩個羥基，亦即，其附接至相鄰原子。
「烷基」係指僅由碳原子及氫原子組成，不含不飽和度，具有一至十二個碳原子、較佳一至八個碳原子或一至六個碳原子之直鏈或分支鏈烴鏈基團，且其藉由單鍵附接至分子之其餘部分，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基（異丙基）、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基（三級丁基）及其類似基團。
「雜烷基」係指經以下基團中之一者或多者取代的烷基：烷基、烯基、鹵基、鹵烷基、氰基、芳基、環烷基、雜環基、雜芳基、-OR 14、-OC(O)-R 14、-N(R 14) 2、-C(O)R 14、-C(O)OR 14、-C(O)N(R 14) 2、-N(R 14)C(O)OR 16、-N(R 14)C(O)R 16、-N(R 14)(S(O) tR 16)（其中t為1至2）、-S(O) tOR 16、-SR 16（其中t為1至2）、-S(O) tR 16（其中t為0至2）及-S(O) tN(R 14) 2（其中t為1至2），其中各R 14獨立地為氫、烷基、鹵烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、芳烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基或雜芳基烷基；且各R 16為烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、芳烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基或雜芳基烷基。
「芳基」係指僅由氫及碳組成且含有六至十九個碳原子、較佳六至十個碳原子之芳族單環或多環烴環系統，其中環系統可為部分飽和的。芳基包括但不限於諸如茀基、苯基及萘基之基團。除非本說明書中另外具體說明，否則術語「芳基」或字首「芳」（諸如在「芳烷基」中）意欲包括視情況經一個或多個選自由以下組成之群之取代基取代的芳基：烷基、烯基、炔基、鹵基、鹵烷基、氰基、硝基、芳基、芳烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基、雜芳基烷基、-R 15-OR 14、-R 15-OC(O)-R 14、-R 15-N(R 14) 2、-R 15-C(O)R 14、-R 15-C(O)OR 14、-R 15-C(O)N(R 14) 2、-R 15-N(R 14)C(O)OR 16、-R 15-N(R 14)C(O)R 16、-R 15-N(R 14)(S(O) tR 16)（其中t為1至2）、-R 15-S(O) tOR 16（其中t為1至2）、-R 15-SR 16、-R 15-S(O) tR 16（其中t為0至2）及-R 15-S(O) tN(R 14) 2（其中t為1至2），其中各R 14獨立地為氫、烷基、鹵烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、芳烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基或雜芳基烷基；各R 15獨立地為直接鍵或直鏈或分支鏈伸烷基或伸烯基鏈；且各R 16為烷基、鹵烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、芳烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基或雜芳基烷基。
「雜環基」係指由碳原子及一至五個選自由氮、氧及硫組成之群的雜原子組成之穩定3至18員非芳環基團。出於本發明之目的，雜環基可為單環、雙環或三環環系統，其可包括稠合或橋接環系統，其可為部分不飽和的；且雜環基中之氮、碳或硫原子可視情況經氧化；氮原子可視情況經烷基化/取代；且雜環基可為部分或完全飽和的。此類雜環基之實例包括但不限於二氧雜環戊烷基、十氫異喹啉基、咪唑啉基、咪唑啶基、異噻唑啶基、異
Figure 02_image036
唑啶基、
Figure 02_image046
啉基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、2-側氧基哌
Figure 02_image048
基、2-側氧基哌啶基、2-側氧基吡咯啶基、
Figure 02_image036
唑啶基、哌啶基、哌
Figure 02_image048
基、4-哌啶酮基、吡咯啶基、吡唑啶基、噻唑啶基、四氫呋喃基、三噻烷基、四氫哌喃基、硫代
Figure 02_image046
啉基、噻
Figure 02_image046
啉基、1-側氧基-硫代
Figure 02_image046
啉基及1,1-二側氧基-硫代
Figure 02_image046
啉基、高哌啶基、高哌
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基及奎寧環基。除非本說明書中另外具體說明，否則術語「雜環基」意欲包括如上文所定義之雜環基，其視情況經一個或多個選自由以下組成之群的取代基取代：烷基、烯基、鹵基、鹵烷基、氰基、側氧基、硫酮基、芳基、芳烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基、雜芳基烷基、-R 15-OR 14、-R 15-OC(O)-R 14、-R 15-N(R 14) 2-R 15-C(O)R 14、-R 15-C(O)OR 14、-R 15-C(O)N(R 14) 2、-R 15-N(R 14)C(O)OR 16、-R 15-N(R 14)C(O)R 16、-R 15-N(R 14)(S(O) tR 16)（其中t為1至2）、-R 15-S(O) tOR 16（其中t為1至2）、-R 15-SR 16、-R 15-S(O) tR 16（其中t為0至2）及-R 15-S(O) tN(R 14) 2（其中t為1至2），其中各R 14獨立地為氫、烷基、鹵烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、芳烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基或雜芳基烷基；各R 15獨立地為直接鍵或直鏈或分支鏈伸烷基或伸烯基鏈；且各R 16為烷基、鹵烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、芳烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基或雜芳基烷基，且其中以上取代基中之各者未經取代。
「雜芳基」係指由碳原子及一至五個選自由氮、氧及硫組成之群的雜原子組成之5至18員芳環基團。出於本發明之目的，雜芳基可為單環、雙環或三環環系統，其可包括稠合或橋接環系統，其可為部分飽和的；且雜芳基中之氮、碳或硫原子可視情況經氧化；氮原子可視情況經烷基化/取代。實例包括但不限於氮呯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并噻二唑基、苯并萘并呋喃基、苯并
Figure 02_image036
唑基、苯并二氧雜環戊烯基、苯并二氧雜環己烯基、苯并哌喃基、苯并哌喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基（benzothienyl,benzothiophenyl）、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、
Figure 02_image040
啉基、二苯并呋喃基、呋喃基、呋喃酮基、異噻唑基、咪唑基、吲哚基、吲唑基、異吲哚基、吲哚啉基、異吲哚啉基、吲
Figure 02_image051
基、異
Figure 02_image036
唑基、
Figure 02_image053
啶基、
Figure 02_image036
二唑基、2-側氧基氮呯基、
Figure 02_image036
唑基、啡
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基、啡噻
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基、啡
Figure 02_image036
Figure 02_image048
基、呔
Figure 02_image048
基、喋啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡
Figure 02_image048
基、嘧啶基、嗒
Figure 02_image048
基、喹唑啉基、喹
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啉基、喹啉基、異喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三
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基及噻吩基。除非本說明書中另外具體說明，否則術語「雜芳基」意欲包括如上文所定義之雜芳基，其視情況經一個或多個選自由以下組成之群的取代基取代：烷基、烯基、炔基、鹵基、鹵烷基、氰基、側氧基、硫酮基、硝基、芳基、芳烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基、雜芳基烷基、-R 15-OR 14、-R 15-OC(O)-R 14、-R 15-N(R 14) 2、-R 15-C(O)R 14、-R 15-C(O)OR 14、-R 15-C(O)N(R 14) 2、-R 15-N(R 14)C(O)OR 16、-R 15-N(R 14)C(O)R 16、-R 15-N(R 14)(S(O) tR 16)（其中t為1至2）、-R 15-S(O) tOR 16（其中t為1至2）、-R 15-SR 16、-R 15-S(O) tR 16（其中t為0至2）及-R 15-S(O) tN(R 14) 2（其中t為1至2），其中各R 14獨立地為氫、烷基、鹵烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、芳烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基或雜芳基烷基；各R 15獨立地為直接鍵或直鏈或分支鏈伸烷基或伸烯基鏈；且各R 16為烷基、鹵烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、芳烷基、雜環基、雜環基烷基、雜芳基或雜芳基烷基。
「矽基醚」係指一組化合物，其含有共價鍵結至烷氧基之矽原子。通式結構為R 1R 2R 3Si−O−R 4，其中R 4為烷基或芳基。由於R 1R 2R 3可為不同基團之組合，其可改變以提供多種矽基醚，因此此組化合物為保護基化學提供廣泛範圍之選擇性。矽基醚可包括但不限於三甲基矽基（TMS）、三乙基矽基（TES）、三級丁基二苯基矽基（TBDPS）、三級丁基二甲基矽基（TBS/TBDMS）及三異丙基矽基（TIPS）。 實例 實例1：DNA合成之後的多功能通用連接子裂解
在DNA合成之後，對於ULP1及ULP2，通用連接子結構可用4-9 M氨之無水甲醇溶液自電極表面裂解；或對於ULP3，通用連接子結構可用1.6%（v/v）TEA:3HF之無水甲醇溶液自電極表面裂解。或者，通用連接子可使用20%三級丁胺或10% 1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一-7-烯（DBU）之乙腈（ACN）溶液固定於表面，如圖2中針對ULP1及ULP3所示。
用無水氨之甲醇溶液處理ULP1及ULP 2快速裂解二氯乙醯基且去磷酸化釋放寡核苷酸。用TEA:3HF處理ULP3裂解TMDMS保護基，其亦引起去磷酸化及寡核苷酸釋放。用三級丁胺或DBU之ACN溶液處理ULP1、ULP2及ULP3快速裂解氰基乙基且將寡核苷酸固定於表面。
在寡核苷酸自撐體釋放之後，溶液自固體撐體移出且在螺旋蓋管中與氨水（37%）或AMA（1:1，37%氫氧化銨:40%甲胺）組合。加熱之後，將完全脫除保護基之寡核苷酸真空乾燥且使用標準方法純化。
對於固定化寡核苷酸，固體撐體首先用20%三級丁胺之乙腈溶液處理1小時（參見例如Chang及Horn, 1999, Nucleosides and Nucleotides, 2006, 第1205-6頁）以移除氰基乙基及丙烯腈副產物。所得磷酸二酯穩定，且當二氯乙酸酯基團用氨水或AMA處理水解時不裂解。在保護基裂解完成之後，洗滌固體撐體且寡核苷酸保持固定在電極上。 實例2：連接子胺3 (R)異構體
連接子胺3（圖4）使用外消旋混合物之公開程序（參見例如Azhayev, 2001）的修改分離為單一立體異構體。(R)-3-胺基-1,2-丙二醇用三氟乙酸甲酯進行三氟乙醯胺保護，接著與有限量之二甲氧基三苯甲基氯之吡啶溶液反應。產物容易藉由萃取處理分離，因為過量三氟乙酸酯容易用水洗滌掉。在氫氧化銨脫除保護基之後藉由自己烷沈澱移除痕量雜質，得到呈白色固體狀之(R)連接子胺3，產率為91%。外消旋混合物先前報導為無色糖漿。製備連接子胺3（圖4）之方法中產生的中間化合物展示如下： 1.                                 (R)-N-(2,3-二羥丙基)-2,2,2-三氟乙醯胺。（MW 187.12） 1H NMR（CD 3CN） 2.                                 (R)-N-(3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-2-羥丙基)-2,2,2-三氟乙醯胺（MW 489.48） 3.                                 (R)-1-胺基-3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)丙-2-醇（MW 393.48） 實例3：通用連接子胺基亞磷酸酯（脲鍵）-ULP 1
ULP結構中二氯乙酸（DCA）保護基之敏感性導致合成方面的困難。吾人發現三級丁基二甲基矽基（TBDMS）可用於在一個早期步驟處保護一級醇基團，且可在最後一個反應步驟處用四丁基氟化銨（TBAF）水溶液移除，隨後轉化為胺基亞磷酸酯。此方法提供高產率且允許合成圖5中所示之目標ULP。吾人首先嘗試更穩定的三級丁基二苯基矽基（TBDPS），如圖6中所示。TBDPS起作用，但在四丁基氟化銨（TBAF）水溶液中反應時間較長引起DCA之一定水解。
吾人首先嘗試將連接子疊氮化物（結構V）偶合至1-胺基-6-己醇，得到脲鍵，如美國專利8,779,194中所描述。然而，吾人發現二氯乙醯基經受不住偶合條件。實際上，吾人使1-胺基-6-己醇與氯甲酸對硝基苯酯（4-NPC）反應且進一步用TBDMS保護一級醇。將此化合物偶合至連接子胺3（結構展示於圖4中），得到受TBDMS保護之脲。DCA酯藉由用羰基二咪唑活化而形成，如先前所描述（Yagodkin 2011）。最後，TBDMS基團用TBAF移除且醇經亞磷酸酯化，得到所需胺基亞磷酸酯（ULP 1）。製備ULP1（圖5）之方法中產生的中間化合物展示如下： 1.                                 6-(三級丁基二甲基矽氧基)己基胺基甲酸4-硝基苯酯 2.                                 (R)-1-(3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-2-羥丙基)-3-(6-(三級丁基二甲基矽氧基)己基)脲 3.                                 2,2-二氯乙酸(R)-1,1-雙(4-甲氧基苯基)-16,16,17,17-四甲基-7-側氧基-1-苯基-2,15-二氧雜-6,8-二氮雜-16-矽雜十八烷-4-酯 4.                                 2,2-二氯乙酸(R)-1-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-3-(3-(6-羥己基)脲基)丙-2-酯 實例4：通用連接子胺基亞磷酸酯（胺基甲酸酯鍵）-ULP2
ULP2使用與實例3中所描述類似之流程用碳酸酯結構製備（參見圖6）。在此實例中，首先製備受TBDPS保護之1,6-己二醇且將其用氯甲酸對硝基苯酯（4-NPC）活化。此化合物與連接子胺3偶合，得到受TBDMS保護之胺基甲酸酯。DCA酯照常藉由用羰基二咪唑活化而形成。最後，TBDPS基團用TBAF移除且醇經亞磷酸酯化，得到所需胺基亞磷酸酯（ULP 2）。製備ULP2（圖6）之方法中產生的中間化合物展示如下： 1.                                 6-(三級丁基二苯基矽氧基)己-1-醇 2.                                 6-(三級丁基二苯基矽氧基)己基4-硝基苯基碳酸酯 3.                                 3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-2-羥基丙基胺基甲酸(R)-6-(三級丁基二苯基矽氧基)己酯 4.                                 2,2-二氯乙酸(R)-1,1-雙(4-甲氧基苯基)-17,17-二甲基-7-側氧基-1,16,16-聯三苯-2,8,15-三氧雜-6-氮雜-16-矽雜十八烷-4-酯 5.                                 2,2-二氯乙酸(R)-1-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-3-((6-羥基己氧基)羰基胺基)丙-2-酯 實例5：通用連接子胺基亞磷酸酯（受TBDMS保護）-ULP3
ULP3使用氟化物觸發之矽基保護基而非鹼觸發之DCA保護基來製備（圖7）。合成始於如圖4中所示之(R)胺基丙二醇，但使用TBDMS-Cl來保護二級羥基（3個步驟產率為66%）。用氫氧化銨移除三氟乙醯胺保護基。胺與氯甲酸對硝基苯酯（4-NPC）活化之6-胺基己醇反應產生脲鍵。在此實例中，一級醇直接亞磷酸酯化，得到所需胺基亞磷酸酯（ULP 3）。製備ULP3（圖7）之方法中產生的中間化合物描述如下： 1.                                 (R)-N-(3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-2-羥丙基)-2,2,2-三氟乙醯胺（MW 489.48） 2.                                 (R)-N-(3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-2-(三級丁基二甲基矽氧基)丙基)-2,2,2-三氟乙醯胺（MW 603.74） TLC（乙酸乙酯-己烷[1:5]）R f= 0.59；質譜（EI模式） m/z604 [M + H] +。 3.                                  (R)-3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-2-(三級丁基二甲基矽氧基)丙-1-胺（MW 507.74） TLC（甲醇-乙酸乙酯[1:5]）R f= 0.60； 1H NMR（二甲基-d 6 亞碸）δ 7.63 (br s), 7.31 (5H, m), 7.21 (4H, d, J = 9.3 Hz), 6.87 (4H, d, J = 9.3 Hz), 3.94 (1H, m), 3.71 (6H, s), 3.08 - 2.81 (4H, 2 x m), 0.77 (9H, s), 0.00 (3H, s), -0.10 (3H, s)；質譜（EI模式） m/z508 [M + H] +。 4.                                 (R)-1-(3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-2-(三級丁基二甲基矽氧基)丙基)-3-(6-羥己基)脲（MW 650.92） TLC（乙酸乙酯）R f= 0.54； 1H NMR（二甲基-d 6 亞碸）δ 7.38 - 7.16 (9H, m & d, J = 9.0 Hz，雙重峰), 6.84 (4H, d, J = 9.0 Hz), 5.88 (1H, t, J = 6.0 Hz), 5.52 (1H, t, J = 6.0 Hz), 4.29 (1H, t, J = 3.0 Hz), 3.79 (1H, m), 3.70 (6H, s), 3.34 (2H, m), 3.08 (2H, m), 2.90 (4H, m), 1.27 (8H, m), 0.80 (9H, s), 0.00 (3H, s), -0.05 (3H, s)；質譜（EI模式） m/z651 [M + H] +。 5.                                 (R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2,2,3,3-四甲基-8-側氧基-4-氧雜-7,9-二氮雜-3-矽雜十五烷-15-基2-氰基乙基二異丙基胺基亞磷酸酯（ULP3）（MW 851.14） 1H NMR（二甲基-d 6 亞碸）δ 7.37 (2H, d, J = 6.0 Hz), 7.22 (7H, d & m, J = 9.0 Hz，雙重峰), 6.84 (4H, d, J = 9.0 Hz), 5.88 (1H, t, J = 6.0 Hz), 5.22 (1H, t, J = 6.0 Hz), 3.79 (1H, m), 3.74 - 3.64 (8H, m & s), 3.54 (4H, m), 3.07 (2H, m), 2.89 (4H, m), 2.72 (2H, t, J = 6.0 Hz), 1.49 (2H, m), 1.26 (6H, m), 1.11 (12H, m), 0.80 (9H, s), 0.00 (3H, s), -0.05 (3H, s)； 31P NMR (乙腈-d 3 ) δ 146.98；質譜（EI模式） m/z851 [M + H] +。 實例6：製備DMT-CPG
使用可控孔徑玻璃（CPG）固體撐體評估通用連接子胺基亞磷酸酯之效能。首先，如圖8中所示製備模型撐體（DMT-CPG）。長鏈烷基胺CPG（LCAA-CPG）商業獲得且經改質以提供每公克CPG具有已知負載量之二甲氧基三苯甲基的固體表面。新穎試劑首先藉由氯甲酸對硝基苯酯與6-胺基己醇之反應製備。在胺與氯甲酸酯發生特異性反應（如TLC所證明）之後，將DMT-氯化物添加至同一罐中以與一級醇反應。所得受DMT保護之PNP胺基甲酸酯在矽膠層析之後以純產物形式獲得。與LCAA-CPG（147微莫耳/公克）進一步反應得到DMT-CPG（99微莫耳/公克），且此用於ULP之進一步分析，如圖9中所示。 實例7：評估ULP試劑之固定、偶合及裂解的DMT-CPG分析
使用DMT-CPG評估通用連接子胺基亞磷酸酯在不同裂解條件下之行為，如圖9中針對ULP1及ULP3所示。舉例而言，稱取3微莫耳（30 mg）CPG（DMT負載量=99微莫耳/公克），且將其置放於具有拋棄式玻璃料之流通DNA合成管柱（Biosearch Technologies，部件號CL-1501-10）中。DMT基團用5% TCA/DCM移除（在RT下5分鐘）。使用76 mL cm -1微莫耳 -1之消光係數，自吸光度最大值（約498 nm）處之可見光譜峰記錄三苯甲基陽離子濃度。CPG用乙腈沖洗，且隨後與1 mL 0.1 M ULP及0.1 M二氰基咪唑（DCI）於乙腈中之1:1混合物偶合。5分鐘後，用乙腈自CPG洗滌掉ULP，隨後將其用於吡啶/水中之碘氧化（5分鐘）。用5% TCA/DCM處理CPG且量測三苯甲基陽離子濃度，且計算ULP與CPG之偶合%。UL-CPG用乙腈沖洗，且隨後與1 mL 0.1 M黑洞猝滅劑1（BHQ-1）DMT胺基亞磷酸酯（Biosearch Technologies，部件號BNS-5051-50）及0.1 M 4,5-二氰基咪唑（DCI）之1:1混合物偶合。5分鐘後，用乙腈自CPG洗滌掉BHQ-1胺基酸酯，隨後將其用於吡啶/水中之碘氧化（5分鐘）。用5% TCA/DCM處理UL-BHQ-1 CPG，量測三苯甲基陽離子濃度，且計算BHQ-1與UL-CPG之偶合%。真空乾燥UL-BHQ-CPG（約30 mg），且將其用於研究BHQ-1向溶液中之釋放。使用34 mL cm -1微莫耳 -1之消光係數，自吸光度最大值（約534 nm）處之可見光譜峰記錄BHQ-1濃度。如實例1中所描述，用4 M氨之無水甲醇溶液處理2-3 mg UL1-BHQ-CPG或UL2-BHQ-CPG，且隨時間推移量測BHQ-1釋放%。以類似方式，用1.6%（v/v）TEA:3HF之無水甲醇溶液處理UL3-BHQ-CPG，且隨時間推移量測BHQ-1釋放%。圖12展示如藉由分光光度法分析所測定，在22℃（+/-0.2℃）下1.6%（v/v）TEA:3HF/MeOH中BHQ1自CPG-UL3-BHQ1之裂解動力學。 實例8：用通用胺基亞磷酸酯同時合成DNA引子對
自動化DNA合成之常見應用係用於產生PCR引子。PCR使用一對定製引子在所擴增之序列的相對端引導DNA朝向彼此延伸。此等引子之長度通常在18與24個鹼基之間，且必須僅編碼所擴增之序列的特定上游及下游位點，如圖10中所示。
需要高濃度PCR引子，防止其在陣列儀器上合成。但引子之標準DNA合成將得益於在單一合成管柱中使用通用連接子胺基亞磷酸酯製備2個引子的新穎方法。UL胺基亞磷酸酯作為引子1與引子2 DNA序列之間的間隔子引入，如圖11中所示。在「脫除三苯甲基」DNA合成之後，用4 M甲胺/MeOH處理固體撐體。引子1序列自固體撐體釋放，照常具有3'-羥基。通用連接子間隔子同時裂解，得到具有3'-羥基之引子2序列。用AMA移除保護基產生引子1及引子2之1:1混合物。蒸發AMA留下引子之1:1混合物，以及污染失效序列及經移除之保護基。AMA需要使用受乙醯基保護之dC（Ac-dC）代替受苯甲醯基保護之dC以防止由甲胺水溶液引起之轉醯胺作用。寡核苷酸使用濃氨（55℃，1小時）或AMA（55℃，10分鐘）脫除保護基。
通常，PCR引子藉由移除寡核苷酸上之5'-三苯甲基及使用凝膠過濾管柱簡單地「去鹽」來純化。凝膠過濾係基於分子大小來分離混合物之組分，且為用於寡核苷酸純化之最簡單的層析形式。裂解保護基及短截短序列保留在凝膠基質中，而較大寡核苷酸分子經由凝膠過濾管柱快速溶離。由於引子1及引子2之長度大約相同，因此其以相同溶離份溶離。使用2種寡核苷酸之組合消光係數，藉由260 nm吸光度來確定引子之1:1混合物的濃度。最終使用者可直接在PCR中使用1:1混合物而不必分別測定各引子之濃度且計算各引子之體積。
本說明書中提及之所有公開案及專利申請案指示熟習本發明所屬技術者之技術水準。所有公開案及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其程度如同各個別公開案或專利申請案特定且單獨地指示為以引用之方式併入一般。
儘管出於清晰理解的目的已經藉助於說明及實例相當詳細地描述了前述發明，但顯而易見可在隨附申請專利範圍之範圍內實踐某些改變及修改。
無
圖1展示通用撐體結構之比較。在各種情況下，DNA合成始於連接子結構中之二甲氧基三苯甲基（DMT）。用鹼處理釋放具有未經修飾3'-羥基末端之寡核苷酸。
圖2展現合成寡核苷酸之釋放與固定。用無水氨之甲醇溶液處理快速裂解氯乙醯基，而用氟離子處理裂解矽基保護基。所得去磷酸化釋放寡核苷酸。用三級丁胺之ACN溶液處理快速裂解氰基乙基且將寡核苷酸固定於表面。
圖3展示UNYLINKER™酸與經胺塗佈之固體撐體的反應。UNYLINKER™結構經「預先組織」而在剛性環系統之同一側上具有鄰位羥基。當鹼敏感性丁二酸酯鍵水解時，3'-羥基寡核苷酸之去磷酸化及釋放極快速。
圖4展示用於合成連接子胺3之方法。新穎(R)異構體易於製備且用作各通用連接子胺基亞磷酸酯（ULP）之合成子
圖5展示用於合成ULP 1之方法。首先製備6-(三級丁基二甲基矽氧基)己基胺基甲酸4-硝基苯酯且將其與連接子胺3偶合，得到脲鍵。在二氯乙醯化之後，用四丁基氟化銨（TBAF）選擇性移除TBDMS基團，之後進行亞磷酸酯化，得到胺基亞磷酸酯。
圖6展示用於合成ULP 2之方法。與ULP 1之結構類似，但胺基甲酸酯鍵藉由受TBDPS保護之1,6-己二醇與氯甲酸對硝基苯酯反應且偶合至連接子胺3而產生。在二氯乙醯化之後，用TBAF選擇性移除TBDMS基團，之後進行亞磷酸酯化，得到胺基亞磷酸酯。
圖7展示用於合成ULP 3之方法。與ULP 1之結構類似，但使用矽基保護基（TBDMS）代替二氯乙醯基保護基。
圖8展示使用新穎對硝基苯基（PNP）酯合成DMT-CPG之方法。對硝基苯基（PNP）酯將經胺塗佈之表面轉化為受DMT保護之醇表面。此方法在1個步驟中產生穩定脲鍵（無EDC偶合）。胺基己醇提供額外長連接子。可在DNA合成之前準確量測DMT CPG之負載量。
圖9展示使用DMT-CPG分析評估通用連接子之偶合效率及裂解效率。
圖10為展示如何使用2個引子（正向及反向）來包圍dsDNA擴增區（擴增子）之圖解。PCR引子必須具有未經修飾3'端否則其在聚合酶鏈反應期間將不會由Taq聚合酶延伸。
圖11表示PCR引子對之同時DNA合成。DNA照常合成，引子序列之間具有通用連接子胺基亞磷酸酯間隔子。脫除保護基產生具有未經修飾3'-OH之引子的1:1混合物。引子1具有殘餘5'-UL片段，其不會影響PCR效能。
圖12展示如藉由分光光度法分析所測定，在22℃（+/-0.2℃）下1.6%（v/v）TEA:3HF/MeOH中BHQ1自CPG-UL3-BHQ1之裂解動力學。
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Claims (42)

  1. 一種用於合成寡核苷酸之固體撐體系統，其中該撐體包含平面表面及通用連接子，其中該通用連接子偶合至該平面表面。
  2. 如請求項1之固體撐體系統，其中該平面表面在附接該通用連接子之前經胺塗佈。
  3. 如請求項1或2之固體撐體系統，其中該平面表面經羧酸塗佈。
  4. 如請求項1至3中任一項之固體撐體系統，其中該平面表面包含矽、鈦或鉑。
  5. 如請求項1之固體撐體系統，其包含式（I）、（III）或（IV），視情況，其中該通用連接子藉由使該平面表面與式（II）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）化合物或其組合反應而偶合至該平面表面， （a）式（I）：
    Figure 03_image001
    其中，當A為包含經取代或未經取代之脂族基、經取代或未經取代之脂族醚、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳族基、經取代或未經取代之雜環基之附接至經塗佈鉑電極的連接部分時，W或Q中之一者為在鹼性或中性條件下可裂解之阻斷基團，而W或Q中之另一者為H或在酸性條件下可裂解之阻斷基團；或 其中，當A為H、經取代或未經取代之脂族基、經取代或未經取代之脂族醚、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳族基、經取代或未經取代之雜環基時，Q或W中之一者為在鹼性或中性條件下可裂解之附接至經塗佈鉑電極的連接子部分，而W或Q中之另一者為H或在酸性條件下可裂解之阻斷基團； （b）式（II）：
    Figure 03_image002
    ； （c）式（III）：
    Figure 03_image003
    其中 R為附接至鉑電極或其他基底材料之烷基、芳基、雜烷基或雜芳基； A為NH、O、S、烷基或芳基； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （d）式（IV）：
    Figure 03_image005
    ； R 1為附接至鉑電極或其他基底材料之烷基、芳基、雜烷基或雜芳基 （e）式（V）：
    Figure 03_image006
    ； （f）式（VI）：
    Figure 03_image007
    其中 A為
    Figure 03_image008
    ； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （g）式（VII）：
    Figure 03_image010
    ； （h）式（VIII）：
    Figure 03_image007
    其中 A為
    Figure 03_image012
    ； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （i）式（IX）：
    Figure 03_image014
    ； （j）式（X）：
    Figure 03_image016
    。
  6. 如請求項5之固體撐體系統，其中該化合物係式（II）、（IV）、（V）、（VII）、（IX）、（X）或其組合。
  7. 如請求項6之固體撐體系統，其中該化合物係式（VII）、（IX）或（X）。
  8. 如請求項1至4中任一項之固體撐體系統，其中該平面表面經單醣或雙醣塗佈。
  9. 如請求項8之固體撐體系統，其中該單醣係選自由以下組成之群：阿洛糖、阿卓糖、阿拉伯糖、去氧核糖、赤藻糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、來蘇糖、甘露糖、阿洛酮糖、L-鼠李糖、核糖、核酮糖、景天庚酮糖、D-山梨糖醇、山梨糖、賽盧糖（sylulose）、塔格糖、塔羅糖、蘇糖、木酮糖及木糖，且該雙醣係選自由以下組成之群：蔗糖、直鏈澱粉、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、蜜二糖、巴拉金糖及海藻糖。
  10. 一種用於合成寡核苷酸之方法，其包含： （a）提供具有平面表面之電極裝置； （b）將該表面與通用連接子偶合；及 （c）合成該寡核苷酸。
  11. 如請求項10之方法，其中該方法進一步包含沈積羧酸電化學還原該羧酸於該平面表面上之步驟。
  12. 如請求項10或11之方法，其中該方法進一步包含將胺塗層沈積於經活化羧酸上。
  13. 如請求項10之方法，其中該平面表面包含矽、鈦或鉑。
  14. 如請求項10之方法，其中該電極裝置包含式（I）、（III）或（IV），視情況，其中該通用連接子藉由使該平面表面與式（II）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）化合物或其組合反應而偶合至該平面表面， （a）式（I）：
    Figure 03_image001
    其中，當A為包含經取代或未經取代之脂族基、經取代或未經取代之脂族醚、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳族基、經取代或未經取代之雜環基之附接至經塗佈鉑電極的連接部分時，W或Q中之一者為在鹼性或中性條件下可裂解之阻斷基團，而W或Q中之另一者為H或在酸性條件下可裂解之阻斷基團；或 其中，當A為H、經取代或未經取代之脂族基、經取代或未經取代之脂族醚、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳族基、經取代或未經取代之雜環基時，Q或W中之一者為在鹼性或中性條件下可裂解之附接至經塗佈鉑電極的連接子部分，而W或Q中之另一者為H或在酸性條件下可裂解之阻斷基團； （b）式（II）：
    Figure 03_image002
    ； （c）式（III）：
    Figure 03_image003
    其中 R為附接至鉑電極或其他基底材料之烷基、芳基、雜烷基或雜芳基； A為NH、O、S、烷基或芳基； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （d）式（IV）：
    Figure 03_image005
    ； R 1為附接至鉑電極或其他基底材料之烷基、芳基、雜烷基或雜芳基； （e）式（V）：
    Figure 03_image006
    ； （f）式（VI）：
    Figure 03_image007
    其中 A為
    Figure 03_image008
    ； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （g）式（VII）：
    Figure 03_image062
    ； （h）式（VIII）：
    Figure 03_image007
    其中 A為
    Figure 03_image064
    ； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （i）式（IX）：
    Figure 03_image014
    ； （j）式（X）：
    Figure 03_image016
    。
  15. 如請求項14之方法，其中該化合物係選自式（II）、（IV）、（V）、（VII）、（IX）、（X）及其組合。
  16. 如請求項15之方法，其中該化合物係選自（VII）、（IX）及（X）。
  17. 如請求項10之方法，其中該平面表面經單醣或雙醣塗佈。
  18. 一種用於合成寡核苷酸引子對之方法，其包含 提供固體撐體，該固體撐體包含固定在該固體撐體之表面上的第一通用連接子， 進行第一胺基亞磷酸酯DNA合成以產生第一寡核苷酸引子，其中該第一寡核苷酸引子之3'端附接至該第一通用連接子， 將第二通用連接子偶合至該第一寡核苷酸引子之5'端， 進行第二胺基亞磷酸酯DNA合成以產生第二寡核苷酸引子，其中該第二寡核苷酸引子之3'端附接至該第二通用連接子，及 使該固體撐體與釋放劑接觸，藉此自固體撐體釋放該第一寡核苷酸引子及該第二寡核苷酸引子，其中所釋放之第一寡核苷酸引子及所釋放之第二寡核苷酸引子中之各者包含3'-羥基。
  19. 如請求項18之方法，其中該第一通用連接子係藉由使該固體撐體與以下第一化合物反應而固定於該固體撐體： （a）式（VI）：
    Figure 03_image007
    其中 A為
    Figure 03_image008
    ； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （b）式（VII）：
    Figure 03_image067
    ； （c）式（VIII）：
    Figure 03_image007
    其中 A為
    Figure 03_image069
    ； X為醯基、芳醯基或矽基；且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基； （d）式（IX）：
    Figure 03_image014
    ； （e）式（X）：
    Figure 03_image016
    ； 或其組合。
  20. 如請求項18或19之方法，其中該第一化合物係式（VII）、（IX）或（X）。
  21. 如請求項18至20中任一項之方法，其中該第二通用連接子係藉由使該第一寡核苷酸引子與式（VII）、（IX）或（X）之第二化合物反應而附接至該第一寡核苷酸引子。
  22. 如請求項18至21中任一項之方法，其中該釋放劑包含4 M甲胺/MeOH或TEA:3HF。
  23. 如請求項18至22中任一項之方法，其進一步包含用AMA（1:1，37%氫氧化銨:40%甲胺）自所釋放之第一寡核苷酸引子及所釋放之第二寡核苷酸引子移除保護基。
  24. 如請求項23之方法，其中所釋放之第一寡核苷酸引子及所釋放之第二寡核苷酸引子的長度大約相同。
  25. 如請求項24之方法，其中所釋放之第一寡核苷酸引子與所釋放之第二寡核苷酸引子的濃度比為約1:1。
  26. 如請求項18至25中任一項之方法，其中該方法在單一管柱中進行。
  27. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該化合物係式（X）。
  28. 如請求項18至26中任一項之方法，其中該第一化合物及該第二化合物係式（X）。
  29. 一種式（XI）化合物，
    Figure 03_image018
    （XI）， 其中 A為
    Figure 03_image008
    ， X為醯基、芳醯基或矽基，且 Y為二甲氧基三苯甲基或在酸性或中性條件下可移除之保護基。
  30. 如請求項29之化合物，其中n為5。
  31. 如請求項29或30之化合物，其中X為矽基。
  32. 如請求項29至31中任一項之化合物，其中該矽基係三甲基矽基、三乙基矽基、三級丁基二苯基矽基、三級丁基二甲基矽基或三異丙基矽基。
  33. 如請求項32之化合物，其中該矽基為三級丁基二甲基矽基。
  34. 如請求項29至33中任一項之化合物，其中Y為二甲氧基三苯甲基。
  35. 如請求項29之化合物，其包含(R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2,2,3,3-四甲基-8-側氧基-4-氧雜-7,9-二氮雜-3-矽雜十五烷-15-基2-氰基乙基二異丙基胺基亞磷酸酯。
  36. 一種用於合成寡核苷酸之方法，其包含： （a）提供如請求項1至9中任一項之固體撐體系統； （b）將該表面與通用連接子偶合；及 （c）合成該寡核苷酸。
  37. 如請求項4之固體撐體系統，其中該鈦包含氮化鈦。
  38. 如請求項13之方法，其中該鈦包含氮化鈦。
  39. 如請求項1至9之固體撐體系統，其中該平面表面包含由至少一種介電質分隔開之複數個鉑電極。
  40. 如請求項39之固體撐體系統，其中該至少一種介電質係選自由以下組成之群：氮氧化矽、氮化矽、二氧化矽及正矽酸四乙酯（TEOS）。
  41. 如請求項10至17之方法，其中該平面表面包含由至少一種介電質分隔開之複數個鉑電極。
  42. 如請求項41之固體撐體系統，其中該至少一種介電質係選自由以下組成之群：氮氧化矽、氮化矽、二氧化矽及正矽酸四乙酯（TEOS）。
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