CN111650315B

CN111650315B - 使用荧光衍生化-高效液相色谱检测丁二烯的醇类代谢产物的方法

Info

Publication number: CN111650315B
Application number: CN202010543463.8A
Authority: CN
Inventors: 李炯函; 相明辉; 张新宇; 栾洋
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2040-06-15
Also published as: CN111650315A

Abstract

本发明公开了一种使用荧光衍生化‑高效液相色谱检测丁二烯的醇类代谢产物的方法，是一种能用于1,3‑丁二烯(简称丁二烯)的醇类代谢产物(包括1‑氯‑3‑丁烯‑2‑醇、反式和顺式‑4‑氯‑2‑丁烯‑1‑醇，以及3‑丁烯‑1,2‑二醇)的荧光衍生化‑高效液相色谱检测方法，它属于化学检测方法领域，包括液液萃取样品中丁二烯的醇类代谢产物，再通过9‑芴乙酸、均三甲基磺酰氯和4‑二甲氨基吡啶衍生化，最后使用高效液相色谱‑荧光检测，外标法定量。经验证，本发明所述的荧光衍生化‑高效液相色谱方法具有专一性强和准确性高等特点，为研究丁二烯的醇类代谢产物提供了一个可靠的工具，具有一定的实际应用价值。

Description

使用荧光衍生化-高效液相色谱检测丁二烯的醇类代谢产物的方法

技术领域

本发明涉及一种检测丁二烯的醇类代谢产物的方法，应用于分析化学技术领域。

背景技术

丁二烯是一种无色具有微弱芳香气味的气体，是一种重要的石油化工原料。化石燃料燃烧和生物质燃烧等都会产生丁二烯。丁二烯在环境中来源广泛，如汽车尾气，森林火灾和香烟烟雾等。这也导致丁二烯在环境中普遍存在，其浓度为0.04-0.9ppb。丁二烯是一种致癌物且具有很高的致癌风险，职业暴露丁二烯与淋巴造血系统癌症相关。

目前，丁二烯的致癌机理尚不清楚，但已确定丁二烯本身并不致癌，其致癌性来源于代谢产物。丁二烯经过细胞色素P450酶代谢为3,4-环氧-1-丁烯等一系列代谢产物，这些代谢产物已经被证明在活体内存在，且具有致突变性和致癌性。

丁二烯也可以通过髓过氧化酶在H₂O₂和高浓度Cl^-条件下转化为CHB、E-CBol和Z-CBol，这些化合物具有遗传毒性，但目前丁二烯经过髓过氧化酶转化仅通过纯化的酶以及细胞实验证明，在生物体内仍缺乏证据。证明该转化过程在体内存在，需要一种灵敏和特异性的检测CHB、E-CBol和Z-CBol的方法。

由于这些化合物沸点不高且在生物样品中含量很少，即使使用低沸点溶剂如乙醚萃取，在溶剂除去过程中大部分化合物也被同时除去，因此无法通过简单的萃取-浓缩-GC/MS方法进行检测，需要开发针对性的检测方法。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种使用荧光衍生化-高效液相色谱检测丁二烯的醇类代谢产物的方法，解决了没有合适方法检测这些化合物的问题。此方法通过摸索最优的衍生化反应条件和液相色谱条件，配合样本提取、溶液配制、衍生化产物荧光检测条件以及外标法定量，提供了一种检测丁二烯的醇类代谢产物的方法。本方法使用9-芴乙酸(9-fluorenylacetic acid，FAA)和三乙胺(triethylamine，TEA)的混合CH₂Cl₂溶液、均三甲基磺酰氯(2-mesitylenesulfonylchloride，METS)和4-二甲氨基吡啶((4-dimethylamino)pyridine，DMAP)的CH₂Cl₂溶液与丁二烯的醇类代谢产物一锅反应，将其衍生化为对应的酯。本发明方法具有专一性强和准确性高等特点，为研究丁二烯的醇类代谢产物提供了一个可靠的工具，具有一定的实际应用价值。

为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：

一种使用荧光衍生化-高效液相色谱检测丁二烯的醇类代谢产物的方法，包含以下步骤：

(1)试剂配制：

分别配制9-芴乙酸和三乙胺的混合CH₂Cl₂溶液、均三甲基磺酰氯和4-二甲氨基吡啶的CH₂Cl₂溶液，备用；

并配制待测丁二烯的醇类代谢产物的标准化合物母液，将不同的标准化合物母液分装存储，备用；

(2)丁二烯的醇类代谢产物提取：

从样本中，以CH₂Cl₂液液萃取丁二烯的醇类代谢产物，得到待测样品的CH₂Cl₂溶液；

(3)衍生化反应过程：

将在所述步骤(1)中配制的9-芴乙酸和三乙胺的混合CH₂Cl₂溶液、均三甲基磺酰氯和4-二甲氨基吡啶的CH₂Cl₂溶液和在所述步骤(3)中的萃取出的待测样品的CH₂Cl₂溶液混合，进行一锅反应，将其衍生化为对应的酯类产物；

(4)使用高效液相色谱-荧光检测，外标法进行定量检测，从而得出待测丁二烯的醇类代谢产物。本发明方法包含以下步骤：试剂配制、丁二烯的醇类代谢产物提取、衍生化反应流程、高效液相色谱方法及荧光检测器设置和外标法定量。通过该方法可实现丁二烯的醇类代谢产物化合物的准确和快速定量，该方法具有较大的应用前景。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(1)中，待测丁二烯的醇类代谢产物包括1-氯-3-丁烯-2-醇、反式-4-氯-2-丁烯-1-醇、顺式-4-氯-2-丁烯-1-醇和3-丁烯-1,2-二醇中的至少一种。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(1)中，进行试剂配制时，9-芴乙酸和三乙胺的CH₂Cl₂溶液浓度分别为10和13.8mg/mL，均三甲基磺酰氯的CH₂Cl₂溶液浓度为3mg/mL，4-二甲氨基吡啶的CH₂Cl₂溶液浓度为2.5mg/mL，现配现用。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(3)中，进行衍生化反应过程时，将50μL的浓度为10mg/mL的FAA和TEA的CH₂Cl₂溶液，依次加入150μL含有待测样品的CH₂Cl₂溶液，500μL的3mg/mL METS的CH₂Cl₂溶液以及500μL 2.5mg/mL的DMAP的CH₂Cl₂溶液，进行混合；各衍生化试剂FAA、TEA、METS、DMAP的摩尔比为1:1.5:2.2:4.5，该比例可调，并保证TEA、METS和DMAP均过量于FAA，DMAP过量于METS；各衍生化试剂浓度可变，FAA浓度在0.001-100mg/mL范围内选择，其它衍生化试剂浓度按照上述各衍生化试剂FAA、TEA、METS、DMAP的摩尔比进行相应调节。优选衍生化反应溶剂优选采用氯仿、乙酸乙酯和丙酮等；衍生化反应时间不应少于1.5h，至少可延伸到3h。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(3)中，进行衍生化反应过程时，反应至少1.5h，然后除去溶剂，采用200μL甲醇重溶，经0.22μm滤膜过滤待分析。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(3)中，衍生化反应后的溶剂去除使用旋蒸、氮吹和离心浓缩中至少一种方式。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(2)中，进行丁二烯的醇类代谢产物提取时，每次使用200μL CH₂Cl₂萃取300μL样本中的丁二烯的醇类代谢产物，萃取至少两次，最终合并有机相用于使用或分析。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(4)中，进行液相色谱分析时，对E-CBol、Z-CBol和BDD检测的液相色谱条件如下：

Welch Ultimate PAH柱(250×4.6mm，5μm)，柱温50℃，A相为水，B相为乙腈，流速1mL/min；梯度洗脱程序从60％B相开始，18min升至69％，24min升至99％并维持至30min，30.1min降至60％，34min结束(E-CBol、Z-CBol和BDD的保留时间分别为14.9、15.6和25.7min)；

对CHB检测仍使用上述色谱柱、流动相和流速，但柱温改为35℃，并使用72％B相等度洗脱40min，CHB的保留时间为11.3min。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(4)中，进行荧光检测器设置，荧光检测器激发波长264nm，发射波长319nm，此时衍生化产物响应最强。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(4)中，进行外标法定量，用PBS(phosphate buffered saline)稀释CHB、E-CBol、Z-CBol和BDD标样的DMSO母液，配制1、5、10、25和50μM的标样混合溶液以及对照组，取300μL按照上述的液液萃取-荧光衍生化-液相色谱方法分析，得到的各化合物对应的峰面积扣除本底作为纵坐标，以标样浓度为横坐标，以y＝kx进行拟合，获得工作曲线；分析时样本时，需要配制空白对照组，并将实验组峰面积扣除本底后代入工作曲线得到实测值。优选荧光检测器激发波长264nm，发射波长319nm。优选进样体积可在0.1-10μL范围内改变。

作为本发明优选的技术方案，具体包括以下步骤：

S1：试剂配制：

10mg/mL FAA和13.8mg/mL TEA的混合CH₂Cl₂溶液：称取2mg(8.9μmol)FAA溶于200μL CH₂Cl₂，加入2μL三乙胺(2.8mg，27.2μmol)；3mg/mL METS的CH₂Cl₂溶液：6mg(27.4μmol)METS溶于2mL CH₂Cl₂；2.5mg/mL DMAP的CH₂Cl₂溶液：5mg(40.9μmol)DMAP溶于2mL CH₂Cl₂；这些衍生化反应物的CH₂Cl₂溶液均为现配现用；

标准化合物母液配制如下：

11mM E-CBol的DMSO溶液：称量2.4mg E-CBol(98％，22.1μmol)，溶于少量DMSO，最后用DMSO定容至2mL；11mM Z-CBol的DMSO溶液：称量2.4mg Z-CBol(98％，22.1μmol)，溶于少量DMSO，最后用DMSO定容至2mL；10mM CHB的DMSO溶液：称量2.4mg CHB(90％，20.3μmol)，溶于少量DMSO，最后用DMSO定容至2mL；10mM BDD的DMSO溶液：称量1.8mg BDD(20.4μmol)，溶于少量DMSO，最后用DMSO定容至2mL；这些溶液作为母液，分装并储存于-20℃条件下；

S2：从样本中以CH₂Cl₂液液萃取丁二烯的醇类代谢产物：

取待测样本300μL，加入200μL CH₂Cl₂充分震荡，静置至分层，取出有机相；重复一次，合并有机相；

S3：衍生化反应流程：

取50μL上述FAA和TEA混合溶液(含2.2μmol FAA和3.6μmol TEA)，依次加入150μLS2中萃取出的待测样品的CH₂Cl₂溶液，500μL 3mg/mL METS(6.8μmol)和500μL 2.5mg/mLDMAP(10.2μmol)的CH₂Cl₂溶液，室温反应1.5h，除去溶剂，200μL甲醇重溶，0.22μm滤膜过滤待分析；

S4：液相色谱方法及荧光检测器设置：

检测E-CBol、Z-CBol和BDD的液相色谱条件：Welch Ultimate PAH柱(250×4.6mm，5μm)，柱温50℃，A相为水，B相为乙腈，流速1mL/min；梯度洗脱程序从60％B相开始，18min升至69％，24min升至99％并维持至30min，30.1min降至60％，34min结束；CHB检测仍使用上述色谱柱、流动相和流速，但柱温改为35℃，并使用72％B相等度洗脱40min；

荧光检测器激发波长264nm，发射波长319nm；

S5：外标法定量：

取2μL衍生化反应后的溶液分析，得到待测化合物的荧光峰面积；

用PBS(phosphate buffered saline)稀释各标准化合物DMSO母液，配制单个化合物浓度为1、5、10、25和50μM的CHB、E-CBol、Z-CBol和BDD的混合溶液以及不含这些化合物的对照组，每个溶液取300μL，按照上述的液液萃取-荧光衍生化-液相色谱方法分析；

分析得到的各衍生化产物的峰面积，扣除本底(对照组在相应保留时间处的峰面积)作为纵坐标，待测化合物在PBS中的浓度为横坐标，以y＝kx进行拟合，获得工作曲线。

待测化合物在1-50μM范围内具有良好的线性关系，最低检测限为1μM，准确度81-110％。

优选本发明步骤S2中，样本包括了各种类型的细胞培养液、血液和缓冲盐溶液等水相溶液。

本发明步骤S3中给出了衍生化试剂的摩尔比FAA:TEA:METS:DMAP＝1:1.5:2.2:4.5，但该比例可以改变，只要保证TEA、METS和DMAP均相对于FAA过量，DMAP相对于METS过量即可；FAA可使用的浓度范围为0.001-10mg/mL；衍生化反应溶剂也可改用氯仿、乙酸乙酯和丙酮等；衍生化反应时间不应少于1.5h，至少可延伸到3h。

优选本发明步骤S4中，液相色谱系统基于Agilent 1260Infinity II高效液相色谱仪，配置Agilent 1260荧光检测器G7121B，操作软件为Agilent CDS 2.4，但其它品牌或型号均可适用。色谱柱使用Welch Ultimate PAH柱，但C18柱或其它品牌色谱柱也可使用。

优选本发明中步骤S5中，进样体积可在0.1-10μL范围内改变。

照液液萃取-荧光衍生化-液相色谱方法分析，对照组相应保留时间处的峰面积，得到的各化合物对应的峰面积扣除本底作为纵坐标，以标样浓度为横坐标，以y＝kx进行拟合，获得工作曲线。待测化合物在1-50μM范围内具有良好的线性关系，最低检测限为1μM，准确度81-110％。经验证，此条件下在1-50μM范围内具有良好的线性关系，检测限低，且具有准确性和特异性。

本发明步骤(2)中，样本包括细胞培养液、血液和缓冲盐溶液各种类型中至少一种水相溶液。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明通过利用FAA、TEA、METS和DMAP产生混合酸酐与丁二烯的醇类代谢产物反应，对其进行荧光标记，该衍生化反应具有反应效率高，反应速度快以及反应产物稳定等特点；

2.本发明采用荧光衍生化-液相色谱检测建立了丁二烯的醇类代谢产物的定量检测方法，具有良好的线性关系、较低的检测限和较高的准确度；

3.本发明方法简单易行，成本低，适合推广使用。

附图说明

图1是衍生化反应的原理图。

图2是CHB、E-CBol、Z-CBol和BDD的衍生化产物的紫外吸收光谱图，激发波长最大值为264nm。

图3是CHB、E-CBol、Z-CBol和BDD的衍生化产物的发射光谱图，发射波长最大值319nm。

图4是CHB、E-CBol、Z-CBol和BDD衍生化反应程度随反应时间的变化情况。

图5是衍生化反应后的色谱图。其中，图5中的图A是检测E-CBol和Z-CBol的衍生化反应后的色谱图。图5中的图B是检测CHB的衍生化反应后的色谱图。“↓”指示待测化合物衍生化后的峰，洗脱顺序为E-CBol、Z-CBol、CHB和BDD。

具体实施方式

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

实施例一：

在本实施例中，一种使用荧光衍生化-高效液相色谱检测丁二烯的醇类代谢产物的方法，绘制CHB、E-CBol和Z-CBol的工作曲线和得到检测限，包含以下步骤：

S1：配制CHB、E-CBol和Z-CBol的PBS混合溶液：

以PBS稀释各化合物的DMSO母液至1-50μM范围，设置浓度为1、5、10、25和50μM以及空白对照组，每份300μL，设置三个平行样；

配制10mg/mL FAA和7.3mg/mL TEA的CH₂Cl₂混合溶液：

称量10mg FAA，溶解于1mL CH₂Cl₂，加入10μL TEA；3mg/mL METS的CH₂Cl₂溶液：30mg METS溶于10mL CH₂Cl₂溶液；2.5mg/mL DMAP的CH₂Cl₂溶液：25mg DMAP溶于10mL CH₂Cl₂溶液；

S2：样品萃取：

取CHB、E-CBol和Z-CBol的PBS混合溶液300μL，加入200μL CH₂Cl₂震荡，静置至分层，取出有机相，重复一次，合并有机相；

S3：衍生化反应：

取50μL上述FAA和TEA混合溶液，含2.2μmol FAA和3.6μmol TEA，加入150μL标准样品CH₂Cl₂溶液，500μL 3mg/mL METS(6.8μmol)和500μL 2.5mg/mL DMAP(10.2μmol)的CH₂Cl₂溶液，室温反应1.5h，除去溶剂，200μL甲醇重溶，0.22μm滤膜过滤待分析；

S4：液相色谱分析：

200μL甲醇溶液分为两半，一半用于E-CBol和Z-CBol的分析，另一半用于CHB的分析；分析E-CBol和Z-CBol使用的程序为：

Welch Ultimate PAH柱(250×4.6mm，5μm)，柱温50℃，A相为水，B相为乙腈，流速1mL/min；梯度洗脱程序从60％B相开始，18min升至69％，24min升至99％并维持至30min，30.1min降至60％，34min结束；分析CHB仍使用上述色谱柱、流动相和流速，但柱温改为35℃，并使用72％B相等度洗脱40min。

荧光检测器激发波长264nm，发射波长319nm是最优激发和发射波长。

S5：外标法定量结果：

以CHB、E-CBol和Z-CBol衍生化产物的峰面积扣除本底后作为纵坐标，标样浓度为横坐标，以y＝kx拟合工作曲线，获得结果如表1所示。

表1各化合物的工作曲线和检测限

经验证，本实施例所述的荧光衍生化-高效液相色谱方法具有专一性强和准确性高等特点，为研究丁二烯的醇类代谢产物提供了一个可靠的工具，具有一定的实际应用价值。

实施例二：

本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，进行CHB、E-CBol和Z-CBol的检测准确度测试：

S1：配制CHB、E-CBol和Z-CBol的混合溶液：

以PBS稀释三种化合物的DMSO母液至低(5μM)、中(30μM)和高(50μM)三种浓度，每份300μL，设置三个平行样；

配制10mg/mL FAA和7.3mg/mL TEA的CH₂Cl₂混合溶液：称量8mg FAA，溶解于0.8mLCH₂Cl₂，加入8μL TEA；3mg/mL METS的CH₂Cl₂溶液：21mg METS溶于7mL CH₂Cl₂溶液；2.5mg/mLDMAP的CH₂Cl₂溶液：18mg DMAP溶于7.2mL CH₂Cl₂溶液；

S2：样品萃取：

在上述CHB、E-CBol和Z-CBol的混合溶液中加入200μL CH₂Cl₂，充分震荡，静置至分层，取出有机相，重复一次，合并有机相；

S3：衍生化反应：

取上述FAA和TEA混合溶液50μL(含2.2μmol FAA和3.6μmol TEA)，加入150μL标准样品CH₂Cl₂溶液，500μL 3mg/mL METS(6.8μmol)和500μL 2.5mg/mL DMAP(10.2μmol)的CH₂Cl₂溶液，室温反应1.5h，除去溶剂，200μL甲醇重溶，0.22μm滤膜过滤待分析；

S4：液相色谱分析：

按照前文所述，进样2μL，分别对E-CBol和Z-CBol以及CHB进行分析；

S5：外标法定量结果：

分析得到的峰面积求得平均值后扣去本底，代入实例1中工作曲线，得到实测值，实测值与理论值的比值即准确度，计算各组的相对标准偏差为精密度。结果如表2所示。

表2.衍生化方法的准确度和精密度(n＝3)

本实施例采用荧光衍生化-液相色谱检测建立了丁二烯的醇类代谢产物的定量检测方法，具有良好的线性关系、较低的检测限和较高的准确度。

上述实施例通过利用FAA、TEA、METS和DMAP产生混合酸酐与丁二烯的醇类代谢产物反应，对其进行荧光标记，该衍生化反应具有反应效率高，反应速度快以及反应产物稳定等特点。

上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种使用荧光衍生化-高效液相色谱检测丁二烯的醇类代谢产物的方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）试剂配制：

（2）丁二烯的醇类代谢产物提取：

从待测样品中，以CH₂Cl₂液液萃取丁二烯的醇类代谢产物，得到待测样品的CH₂Cl₂溶液；所述待测样品中样本包括细胞培养液、血液和缓冲盐溶液各种类型中至少一种水相溶液；

（3）衍生化反应过程：

将在所述步骤（1）中配制的9-芴乙酸和三乙胺的混合CH₂Cl₂溶液、均三甲基磺酰氯和4-二甲氨基吡啶的CH₂Cl₂溶液和在所述步骤（2）中的萃取出的待测样品的CH₂Cl₂溶液混合，进行一锅反应，将其衍生化为对应的酯类产物；

（4）使用高效液相色谱-荧光检测，外标法进行定量，从而得出待测丁二烯的醇类代谢产物的浓度；

在所述步骤（4）中，进行液相色谱分析时，对E-CBol、Z-CBol和BDD检测的液相色谱条件如下：

Welch Ultimate PAH柱：250 × 4.6 mm，5 μm，柱温50 ℃，A相为水，B相为乙腈，流速1mL/min；梯度洗脱程序从60% B相开始，18 min升至69%，24 min升至99%并维持至30 min，30.1 min降至60%，34 min结束；E-CBol、Z-CBol和BDD的保留时间分别为14.9、15.6和25.7min；

对CHB检测仍使用上述色谱柱、流动相和流速，但柱温改为35℃，并使用72% B相等度洗脱40 min，CHB的保留时间为11.3 min；

在所述步骤（1）中，待测丁二烯的醇类代谢产物包括1-氯-3-丁烯-2-醇、反式-4-氯-2-丁烯-1-醇、顺式-4-氯-2-丁烯-1-醇和3-丁烯-1,2-二醇。

2.根据权利要求1中所述使用荧光衍生化-高效液相色谱检测丁二烯的醇类代谢产物的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，进行丁二烯的醇类代谢产物提取时，每次使用200μL CH₂Cl₂萃取300 μL样本中的丁二烯的醇类代谢产物，萃取至少两次，最终合并有机相用于分析。

3.根据权利要求1中所述使用荧光衍生化-高效液相色谱检测丁二烯的醇类代谢产物的方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，进行荧光检测器设置，荧光检测器激发波长264nm，发射波长319 nm，此时衍生化产物响应最强。

4.根据权利要求1中所述使用荧光衍生化-高效液相色谱检测丁二烯的醇类代谢产物的方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，进行外标法定量，用PBS（phosphate bufferedsaline）稀释CHB、E-CBol、Z-CBol和BDD标样的DMSO母液，配制1、5、10、25和50 μM的标样混合溶液以及对照组，取300 μL按照上述步骤（2）-（4）的液液萃取-荧光衍生化-液相色谱方法分析，得到的各化合物对应的峰面积扣除本底作为纵坐标，以标样浓度为横坐标，以y =kx进行拟合，获得工作曲线；分析样本时，需要配制空白对照组，并将实验组峰面积扣除本底后代入工作曲线得到实测值。