JP2020531426A - オリゴヌクレオチドのアフィニティー精製のためのオルトエステル組成物 - Google Patents

オリゴヌクレオチドのアフィニティー精製のためのオルトエステル組成物 Download PDF

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Abstract

ＲＮＡおよびＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドを精製するための化合物および方法。アフィニティータグを含むオルトエステルリンカーと標的オリゴヌクレオチドを反応させて、オルトエステルオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを生成し、これに精製法を行って、短縮化オリゴヌクレオチドなどの不純物から標的オリゴヌクレオチドを分離する。次いで、オルトエステルリンカーを穏やかな条件下で除去して、標的オリゴヌクレオチドを高純度で生じさせることができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５４７，６８７号の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により組み込まれる。
本開示は、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの生体高分子の精製のための化合物および方法に関する。
固相合成は、カスタムオリゴヌクレオチド配列（例えば、カスタムＲＮＡおよびＤＮＡ）、カスタムペプチド、カスタムオリゴ糖および様々な代謝物を調製するために使用することができる極めて有用なツールである。オリゴヌクレオチドの化学合成は一般に逐次的に行われ、その場合、成長鎖の一端が固体表面に結合され、繰返しの合成サイクルを使用して反応性ヌクレオチドモノマーが逐次縮合される。これらのヌクレオチドモノマーは、反応性リン基、例えばホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネートまたは当技術分野において周知の他の反応性のリン基もしくは修飾基を含み、ビルディングブロックは、保護された２’−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびＴ）、保護されたリボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ）または保護された化学修飾ヌクレオシドから誘導される。典型的な望ましいオリゴヌクレオチド生成物は、隣接するヌクレオチドの５’ヒドロキシルと３’ヒドロキシルとの間にヌクレオチド間結合を含む。しかし、隣接するヌクレオチド上のヒドロキシル基のいずれかの間に非天然のヌクレオチド間結合を形成することが望ましい場合もある。この合成を達成するために、合成サイクルの第１のステップは一般に、表面に結合されたヌクレオシドとの保護されたモノマーの反応または表面上のヒドロキシル基との保護されたモノマーの反応である。表面上のヒドロキシル基は、切断可能なユニバーサルリンカーまたは切断可能でない表面結合の一部のいずれかであり得る。表面上のヒドロキシルとの反応性リン基の最初のカップリングの後、通常続くステップは、未反応のヒドロキシル基のキャッピング、次いで、反応性リン中間体の酸化を含む。ある修飾リン基が使用されているある条件下では、酸化試薬が修飾リン基、例えばホスホロチオエート、ボラノホスホネートまたはホスホルアミデートを生成する場合特に、キャッピングの前に酸化する必要がある場合がある。最終ステップは通常、次の保護されたヌクレオチドモノマーとカップリングするヒドロキシル基のデブロッキングである。この最終ステップにおいて除去される保護基は一般にジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）である。しかし、多くの他の保護基、例えば、９−フェニルキサンチル基（ピキシル）、ベンズヒドリルオキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル（ＢＺＨ）などが当技術分野において周知である。鎖の構築が完了すると、所望の生成物が固相から放出され、脱保護され、さらなる生物学的応用において利用される。
オリゴヌクレオチド生成物は、より短い短縮化（truncated）配列、および所望の生成物とは異なる配列を有する配列を含むべきではなく、その理由は、副生成物が存在すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験またはｉｎ ｖｉｖｏ実験において使用されたとき、望まれない効果がもたらされる恐れがあるからである。望ましいオリゴヌクレオチド合成は、完成した合成組成物が標的オリゴヌクレオチド生成物のみを含むように、選ばれたオリゴヌクレオチドを定量的収率で与えるであろう。しかし、化学的方法は一般に定量的収率未満になり、通常、収率９５％〜９９％の範囲内である。粗反応混合物は多くの場合、所望のオリゴヌクレオチドおよび短縮化配列または失敗配列の混合物を含み、クリーンなオリゴヌクレオチド目標生成物を得るために精製を必要とする。
粗合成生成物から所望のオリゴヌクレオチド生成物を精製する最も一般的な方法は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。しかし、より短いオリゴヌクレオチド配列からの標的全長オリゴヌクレオチドの単離は多くの場合、労力および時間がかかるクロマトグラフィー条件を必要とする。より長いオリゴヌクレオチド、例えば１００個以上のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの場合、ＨＰＬＣ溶離勾配は、各溶離に２〜３時間かかることがあり、このプロセスは、許容されるレベルの純度を得るために、正確な回収および分画分析を必要とする。さらに、そのようなクロマトグラフ法は多くの場合、非常に小さい粒径および十分な理論段を有する固定相を必要とする。
標準的なオリゴヌクレオチド合成法において、失敗配列は、アセチル基または他の酸に安定な反応性官能基でキャッピングされ、全長オリゴヌクレオチドは、ジメトキシトリチル基、９−フェニルキサンチル基（ピキシル）、ベンズヒドリルオキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル（ＢＺＨ）または他の周知の基を５’ヒドロキシル位に含む。合成サイクル完了時のオリゴヌクレオチド分子の５’ヒドロキシル上の化学基によって全長オリゴヌクレオチド生成物を失敗配列から区別することができると研究者らは提案している。ジメトキシトリチル基のような基はアセチル基よりもはるかに疎水性であるため、この違いを理論的に使用して、逆相ＨＰＬＣなどのクロマトグラフ法を使用して、キャッピングされた失敗生成物から全長オリゴヌクレオチド生成物を分離することができる（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．３２６，２９３−２９９；１９８５）。しかし、ＨＰＬＣ精製のためのＤＭＴの使用にはいくつかの欠点がある。ヌクレオチドが固体担体上にある間は、ＤＭＴ基は有利な平衡状態のために容易に除去されるが、固体担体からのオリゴヌクレオチドの除去後は、ＤＭＴ基は除去がはるかに困難であり、強酸条件および長い反応時間を必要とする。残念ながら、溶液中のＤＭＴ基の除去に必要な条件は、精製オリゴヌクレオチドが分解されて、最終的に純度が著しく失われる可能性がある。ＤＮＡの場合、そのような条件は、プリン塩基に対して特に過酷であり、その結果、グリコシド結合が切断される。ＲＮＡの場合、酸への曝露はよりいっそう問題となり、その理由は、そのような曝露によりヌクレオチド間結合が直接切断され、ヌクレオチド間結合の異性化が触媒されて、５’−３’および５’−２’結合されたＲＮＡ生成物の混合物が生じる可能性があるからである。
したがって、高純度のオリゴヌクレオチドを生成する、オリゴヌクレオチドの穏やかで有効な精製のための方法および化合物が必要とされている。本開示は、穏やかな条件下で切断可能であり、オリゴヌクレオチド生成物の純度もしくは完全性に対する全体的な効果がほとんどまたは全くないアフィニティータグを使用してオリゴヌクレオチドを精製するための方法および化合物を提供する。この化合物は、近づくことができるヒドロキシル基を含む新たに合成された生体高分子および生物学的に活性な代謝物と反応することもできる。このアフィニティータグを使用して、生体高分子または代謝物を精製することができる。
本方法および本化合物のこれらおよび他の特徴ならびに利点は、添付の特許請求の範囲と併せて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
１つの態様において、本開示は、標的オリゴヌクレオチドを精製する方法を提供する。この方法は、
１．固体担体上で標的オリゴヌクレオチドを合成し、標的オリゴヌクレオチドおよび短縮化オリゴヌクレオチドを含む混合物を得るステップ；
２．標的オリゴヌクレオチドをオルトエステルリンカーと反応させ、それによってオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを生成するステップであり、コンジュゲーション時にオルトエステルリンカーがアフィニティータグを含むか、またはコンジュゲーション反応後の第２の反応でアフィニティータグをオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートと反応させる、ステップ；
３．オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートおよび短縮化オリゴヌクレオチドを、固体担体から切断するステップ；
４．クロマトグラフィーカラムまたはアフィニティーキャプチャー担体上に、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートおよび短縮化オリゴヌクレオチドをローディングし、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを、アフィニティータグによりアフィニティーキャプチャー担体に結合させるステップ；
５．カラムまたはアフィニティーキャプチャー担体から、短縮化オリゴヌクレオチドを洗い落とすステップ；および
６．標的オリゴヌクレオチドからオルトエステルリンカーを切断し、クロマトグラフィーカラムまたはアフィニティーキャプチャー担体から標的オリゴヌクレオチドを溶離し、それによって精製された標的オリゴヌクレオチドを放出させるステップ
を含む。
この方法において、アフィニティータグは、オルトエステルリンカー内の１個もしくは複数の基であってもよく、またはアフィニティータグは、リンカーによりオルトエステルリンカーに結合されている。
これらの方法のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートが固体担体から切断される前または後に、第２の反応が実施される。
これらの方法のいずれかにおいて、オルトエステルリンカーは、標的オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに結合されていてもよく、またはオルトエステルリンカーは、標的オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルに結合されている。
本開示において提供される方法のいずれかにおいて、アフィニティータグは、フルオラスタグ、疎水性タグ、ビオチンタグ、グルタチオンタグ、マルトースタグ、アリールボロン酸タグ、ポリヒスチジンペプチドタグ、ポリスルフヒドリルタグ、シクロデキストリンタグ、アダマンタンタグ、ポリアミンタグ、マレイミドタグ、アルキンタグ、アジドタグ、ヒドラジドタグ、アミノタグ、ジオールタグ、チオールタグまたはそれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含み得る。
本方法は、オリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む標的オリゴヌクレオチドにより実施することができる。このＲＮＡは、チオノカルバメート（ＴＣ）保護基、ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）保護基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護基、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）保護基、ピバロイルオキシメチル（ＰｉｖＯＭ）保護基および２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）保護基から選択される２’−ヒドロキシル保護基を含み得る。ＲＮＡは、リン保護基、核酸塩基保護基またはそれらの組合せをさらに含み得る。ＲＮＡにおいて、オリゴヌクレオチドをオルトエステルリンカーと反応させる前に、リン保護基が脱保護されてもよい。ＲＮＡにおいて、標的オリゴヌクレオチドをオルトエステルリンカーと反応させた後に、核酸塩基保護基および任意選択的にリン保護基が脱保護されてもよい。これらの方法において、固体担体からのオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートの切断、ならびに核酸塩基保護基および任意選択的にリン保護基の脱保護が、単一の反応で実施されてもよい。このＲＮＡは、少なくとも７０個のヌクレオチドを含み得る。
本開示において提供される精製方法のいずれかにおいて、オルトエステルリンカーは、式（Ｉａ）：
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、カルボシクリル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環または任意の置換等価物であり、ただし、Ｒは水素であってもよい）
の化合物であってもよい。
式（Ｉａ）の化合物において、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであってもよく、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’は、それぞれ独立してアリールまたは置換アリールであってもよい。式（Ｉａ）の化合物において、Ｒは、ＨまたはＣＨ３であってもよく、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’は、フェニルまたは置換フェニルであってもよい。式（Ｉａ）の化合物において、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のうちの少なくとも１つは、疎水性タグ、部分的疎水性タグ、フルオラスタグまたは部分的フルオラスタグであってもよい。
本開示において提供される精製方法のいずれかにおいて、オルトエステルリンカーは、式（Ｉｂ）：
（式中、ＡｆＴｇはアフィニティータグであり、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立してＡｆＴｇ−ＬもしくはＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、カルボシクリル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、任意の置換等価物またはそれらの組合せであり、ただし、炭素の総数は２４個を超えず；
Ｌは、共有結合であるか、またはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択的に置換されており、Ｏ、Ｓ、Ｎから独立して選択されるヘテロ原子、またはＳ−Ｓ、ＮＲａ、ＮＲａ−ＣＯ、−ＣＯ−ＮＲａ−、ＮＲａ−ＣＯ−ＮＲｂ、ＣＯ（式中、Ｒａ、Ｒｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から独立して選択される基が任意選択的に散在する直鎖、分岐鎖、単環式もしくは多環式の飽和、部分不飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ１２炭化水素鎖である）
の化合物であってもよい。
本開示において提供される精製方法のいずれかにおいて、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリルもしくは任意の置換等価物またはそれらの組合せであり、ただし、炭素の総数は２４個を超えず；Ｒ８およびＲ９はＨであり；Ｘは、Ｈ、メチルまたは電子吸引基であり；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）
の化合物であってもよい。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つは、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニル、フルオロ置換カルボシクリル、フルオロ置換ヘテロアルキル、フルオロ置換ヘテロアルケニル、フルオロ置換ヘテロアルキニルまたはフルオロ置換ヘテロシクリルである。
本開示において提供される精製方法において、アフィニティータグは、少なくとも３のｃＬｏｇＰ値を有するフルオラスタグまたは疎水性タグであってもよい。本開示による精製方法において、アフィニティータグは、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニルまたはフルオロ置換カルボシクリルであってもよい。
いくつかの実施形態において、精製方法は、以下のオルトエステルリンカーにより実施される：
さらなる態様において、本開示は、オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートであって、前記オリゴヌクレオチドは、その５’末端または３’末端に、式（ＩＶ）
（式中、波線と結ばれた酸素は、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端の酸素であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの少なくとも１つは、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、任意の置換等価物またはそれらの組合せであり、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルキル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、任意の置換等価物またはそれらの組合せであり；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）
の部分を含み、ただし、前記部分が、
ではない、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを提供する。
式（ＩＶ）の部分を有するオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも１つが、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニルまたはフルオロ置換アリール、フルオロ置換ヘテロアルキル、フルオロ置換ヘテロアルケニル、フルオロ置換ヘテロアルキニルまたはフルオロ置換ヘテロシクリルである化合物が含まれる。さらなる実施形態において、式（ＩＶ）の部分を有するオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも１つがフルオラスタグであり、Ｒ７を含む残りのＲ基がＨである化合物が含まれる。さらなる実施形態において、式（ＩＶ）のオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも２つがフルオラスタグである化合物が含まれる。
式（ＩＶ）の部分を有するオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートには、ｎ＝０であり、アフィニティータグが、少なくとも３のｃＬｏｇＰ値を有するフルオラスタグまたは疎水性タグである化合物が含まれる。
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ）の部分を有するオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート内のオリゴヌクレオチドはオリゴリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。
オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートのいくつかの実施形態において、式（ＩＶ）の部分は、
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２３ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２３置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり、ただし、Ｒ１１およびＲ１２のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含むものとし；Ｒ７は、Ｈ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、フェニルまたはベンジルであり；Ｚは、それぞれ独立してＣＲａＲｂ、Ｏ、ＳまたはＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲａおよびＲ１１もしくはＲａおよびＲ１２は、Ｎと共に複素環を一緒に形成し；ｎは、０、１または２である）
からなる群から選択される。
式（ＩＶ）の部分を有するオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートのいくつかの実施形態において、部分は、
（式中、Ｘ１は、Ｈ、Ｆ、アジド、保護されたスルフヒドリル、保護されたポリスルフヒドリル、ポリヒスチジン、保護されたアミノ基、保護されたヒドラジド基、保護されたオキシアミン基、マレイミド、シクロオクチン、共役ジエン、Ｃ２アルケニル基、Ｃ２置換アルケニル基、Ｃ２アルキニル基またはＣ２置換アルキニル基であり；Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃ１−３ヘテロアルキルまたはＣ１−３置換アルキルであり；ｎは、１または２であり；ｍは、０〜１２の範囲の整数である）
である。
式（ＩＶ）の部分を有するオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートのいくつかの実施形態において、前記部分は、
からなる群から選択される。
本開示のさらなる態様は、式（Ｉｄ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの少なくとも１つは、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、任意の置換等価物またはそれらの任意の組合せであり、ただし、炭素の総数は２４個を超えず、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロまたはヘテロ置換等価物、Ｃ３〜Ｃ１２カルボシクリルまたはヘテロシクリルおよび置換等価物であり、ただし、Ｒ１基〜Ｒ７基のうちの２つのＲ基は、
に示される環状オルトエステルと共に縮合環を形成せず、
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換（ｈａｌｏｓｕｂｓｉｔｕｔｅｄ）メチルであり；ｎは、０または１であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）
のオルトエステルリンカーに関する。
式（Ｉｄ）のオルトエステルリンカーは、
（式中、Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２３ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２３置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり；Ｒ７は、ＨまたはＣＨ３である。Ｚは、ＣＲａＲｂ、Ｏ、Ｓ、ＮＲａ、ＮＲａＣＯ、ＣＯＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲａおよびＲ１１は、Ｎと共に複素環を一緒に形成し；Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルであり；ｎは、０または１であり、Ｒ１１はアフィニティータグを含む）
の構造を有してもよい。
式（Ｉｄ）のオルトエステルリンカーは、構造：
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２３ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２３置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり、ただし、Ｒ１１およびＲ１２のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含むものとし；Ｒ７は、ＨまたはＣＨ３である。Ｚは、それぞれ独立してＣＲａＲｂ、Ｏ、Ｓ、ＮＲａＣＯ、ＣＯＮＲａまたはＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲａおよびＲ１１もしくはＲａおよびＲ１２は、Ｎと共に複素環を一緒に形成し；Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルであり；ｎは、０または１である）
を有してもよい。
式（Ｉｄ）のオルトエステルリンカーのいずれかは、アフィニティータグが、少なくとも３のｃＬｏｇＰ値を有するフルオラスタグまたは疎水性タグであるアフィニティータグを有してもよい。
式（Ｉｄ）のオルトエステルリンカーのいくつかには、ｎが０であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも２つが、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリルまたは任意の置換等価物であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうちのすべての残りのＲ基がＨであり、ただし、Ｈではない２つのＲ基は、互いに結合して環状オルトエステルと共に縮合環を形成しない化合物が含まれる。式（Ｉｄ）のオルトエステルリンカーのいくつかには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの１つが、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニルまたはフルオロ置換アリールである化合物が含まれる。
本開示のさらなる態様は、構造：
（式中、Ｚは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＲａまたはＮＲａＣＯ（式中、Ｒａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）であり；Ｒ７は、Ｈ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、フェニルまたはベンジルであり；Ｘは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルまたはシアノであり；ｍは、０〜１２の整数であり；ｎは、１または２である）
を有するフルオラスオルトエステルリンカーを含む。
本開示のさらなる態様は、
から選択される構造を有するオルトエステルリンカーを含む。
本開示のさらなる態様は、式（ＩＩＩａ）：
（式中、Ｘ１は、Ｈ、Ｆ、アジド、保護されたスルフヒドリル、保護されたポリスルフヒドリル、ポリヒスチジン、保護されたアミノ基、保護されたヒドラジド基、保護されたオキシアミン基、シクロオクチン、共役ジエン、Ｃ２アルケニル基、Ｃ２置換アルケニル基、Ｃ２アルキニル基またはＣ２置換アルキニル基であり；Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃ１−３ヘテロアルキルまたはＣ１−３置換アルキルであり；Ｘ２は、Ｈ、ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルまたはシアノであり；ｎは、１または２であり；ｍは、０〜１２の範囲の整数である）
のオルトエステルリンカーを含む。
式（ＩＩＩａ）のオルトエステルリンカーは、以下の化合物：
であってもよい。
本方法および本化合物のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲と併せて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
固体担体上でのオリゴヌクレオチドの典型的な化学合成を示す図である。 全長配列および複数の失敗配列を含む粗オリゴヌクレオチド混合物のダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）スペクトルを示す図であり、図中、全長配列が最大ピークである。 オリゴヌクレオチドの典型的な化学合成を示す図であり、ここで、全長オリゴヌクレオチドがその５’末端上にジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を持つ間、短縮化配列または失敗配列の５’ヒドロキシルがアセチル保護基でキャッピングされ、全長オリゴヌクレオチドの５’位におけるＤＭＴ基の特異的除去およびオルトエステルリンカーの領域特異的な付加が可能になった。 ５’−３’および５’−２’結合されたＲＮＡ生成物の混合物を生じるＲＮＡのヌクレオチド間結合の酸切断およびヌクレオチド間結合の異性化を示す図である。 非環状オルトエステルリンカーによるオリゴヌクレオチドの保護を示す図であり、ここで、アフィニティータグは、オルトエステルの中心炭素に結合されたＲ基上に位置し、またはオルトエステルのすべてのＲ基上に位置し、２つのアフィニティータグを有するオルトエステルコンジュゲートオリゴヌクレオチドを与える。 環状オルトエステルによるオリゴヌクレオチドの保護およびオルトエステル保護基の酸促進切断を示す図である。 フルオラスアフィニティータグを含むオルトエステルリンカーを使用する、オリゴヌクレオチドの精製ワークフローを示す図である。このワークフローは４ステッププロセスを示し、ここで、オリゴヌクレオチドがまず、フルオロ置換オルトエステルリンカーとコンジュゲートし、次いで、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分が脱保護され、固体担体から切断され、次いで、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートが、フルオラスアフィニティータグを使用して、ＨＰＬＣまたは固相抽出カラムのいずれかにより精製される。最後のステップにおいて、フルオロ置換オルトエステルリンカーがオリゴヌクレオチドから切断され、所望の精製生成物オリゴヌクレオチドを与える。 オリゴヌクレオチドの精製のためにオルトエステル保護基およびクロマトグラフ分離を使用する精製戦略を示す図である。
定義される専門用語
本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定するためのものではないと理解されるべきである。定義される用語は、本教示の技術分野において一般に理解され、かつ受け入れられている定義される用語の技術的意味および科学的意味を補うものである。
アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、ヘテロアルケニル、アルキニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環などに関して、「置換等価物」、例えば、「置換アルキル」、「置換ヘテロアルキル」、「置換アルケニル」、「置換ヘテロアルケニル」、「置換アルキニル」、「置換ヘテロアルキニル」、「置換アリール」、「置換ヘテロアリール」および「置換複素環」と呼ばれる「置換」という用語は、１個または複数の水素原子がそれぞれ独立して非水素置換基で置き換えられているアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、ヘテロアルケニル、アルキニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環をそれぞれ意味する。典型的な置換基には、これらに限定されないが、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ−、＝Ｏ、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−、−ＮＲ２、−Ｎ＋Ｒ３、＝ＮＲ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ−Ｓ（＝Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）（Ｏ−）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、−Ｃ（＝ＮＲ）ＮＲＲ（ここで、各Ｘは、独立してハロゲン：Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；各Ｒは、独立してＨ、アルキル、アリール、アリールアルキル、複素環または保護基である）が含まれる。アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基も同様に置換されていてもよい。炭素原子の数が置換基に対して指定されているとき、炭素原子の数は、（特に記載のない限り）置換基ではなく、基について言及している。例えば、Ｃ１−４置換アルキルは、例えば４個を超える炭素原子を有する基で置換され得るＣ１−４アルキルを指す。
本明細書において使用される「アフィニティー対」という用語は、抗原と抗体との間、酵素と基質との間、または受容体とリガンドとの間または疎水性化合物と疎水性樹脂との間のものなどのような強くかつ／もしくは特異的な生物学的または化学的親和性相互作用を介して互いに会合する一対の分子または物質を指す。不溶性担体に共有結合された、またはゲル内に固定されたこれらの物質のいずれかが、比較的純粋でないサンプルから相互作用する物質の単離を可能にする吸着剤として機能し得る。物質を分離、単離または精製するために不溶性担体またはゲルの使用と共にアフィニティー対のこの種類の会合性相互作用を使用する技法は、アフィニティーキャプチャーと呼ばれる。この技法は通常、不溶性担体に結合されているアフィニティー対の他のメンバーとの会合性相互作用を介して所望のアフィニティータグ付き生体分子を不溶性担体上またはゲル上に保持し、不純物、または液相中でタグ付けされていない望まれない副生成物を溶離することを意味する。不溶性材料の濾過および濾液からの分離と、その後の不溶性担体からの所望の精製生体分子の溶離または切断によりアフィニティーキャプチャーが実施されてもよく、アフィニティー対の非限定的な例には、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、グルタチオン／ＧＳＴ、マルトース／ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ジオール／アリールボロン酸、ニッケルまたはコバルト／ヒスチジンまたはチオール、ククルビツリル／アダマンタン、シクロデキストリン／アダマンタン、フルオロアルキル／フルオロアルキルおよびトリチル／Ｃ１８樹脂が含まれる。
本明細書において使用される「アフィニティータグ」という用語は、固有特性を利用したアフィニティータグに結合された標的分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の単離または分離を可能にする固有特性（例えば疎水性、親水性、極性、電荷、親フッ素性など）を有するアフィニティー対の一メンバーまたは部分を指してもよい。アフィニティー対は、アフィニティータグおよびアフィニティータグとの特異的結合能を有する認識部分を含む。アフィニティータグは、標的分子内に（例えば、置換基として）存在してもよく、またはリンカー（例えば、オルトエステルリンカー）を介して標的分子に結合されていてもよい。アフィニティータグはまた、固体担体上に共有結合的に捕捉されていてもよい。アフィニティータグの非限定的な例には、フルオラスアフィニティータグ、疎水性タグ、ビオチンタグ、シクロデキストリンタグ、アダマンタンタグ、マルトースまたはポリアミンタグ、荷電タグなどが含まれる。アフィニティータグはまた、任意選択的に保護された化学官能基であってもよく、これは、新たに結合された標的分子の単離または分離を可能にする固有特性（例えば疎水性、親水性、極性、電荷、親フッ素性など）を与える分子上の１つの特定の化学官能基と選択的に反応し、またはこれは、固相またはアフィニティーキャプチャー媒体に結合された１つの特定の化学官能基と選択的に反応する。官能性化学タグの非限定的な例には、マレイミドタグ、アルキンタグ、アジドタグ、ヒドラジドタグ、アミノタグ、ジオールタグおよびチオールタグが含まれる。
本明細書において使用される「認識部分」という用語は、アフィニティー対の第２のメンバーを指し、これは、アフィニティータグと特異的に相互作用する。
本明細書において使用される「疎水性タグ」という用語は、疎水性置換基または炭素に富む疎水性置換基の組合せを指す。置換基の疎水性は、その分配係数（ｌｏｇＰ）の値により決定、測定または計算することができる。物質の分配係数（ｌｏｇＰ）は、２種類の混和しない溶媒におけるその溶解度の比、通常はオクタノール：水を定義する。この値が測定されるのではなく、計算されるとき、これはｃＬｏｇＰと呼ばれる。疎水性タグは、少なくとも３のｃＬｏｇＰを有し、または２つ、３つもしくは４つの「部分的疎水性タグ」の組合せは、少なくとも３のｃＬｏｇＰの総合的な値を有する。疎水性タグの非限定的な例には、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ４〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ４〜Ｃ２４アルキニル、炭素環およびアリール、トリチル、脂質、ステロイド、アダマンタンが含まれる。疎水性タグの疎水性を高めるためにフルオロ置換基またはフルオロで置換された基を使用することができる。疎水性タグは、少なくとも６個の炭素原子を含む。疎水性タグを含むオルトエステルリンカーは、その４個のＲ基のうちの１つの上にそれぞれ位置する１つ、２つ、３つまたは４つの疎水性タグを有するオルトエステルリンカーを含む。疎水性オルトエステルリンカーはまた、「部分的疎水性タグ」を有する（すなわち、それぞれ６個未満の炭素を有する）オルトエステルリンカーを含むが、互いに組み合わせられたときは少なくとも６個の炭素を含む。
本明細書において使用される「フルオラスタグ」という用語は、過フッ素化（ｐｅｒｌｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ）置換基もしくはフッ素化置換基または過フッ素化置換基もしくはフッ素化置換基の組合せ、例えばフルオロ置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、フルオロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、フルオロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、フルオロ置換カルボシクリルおよびフルオロ置換アリールを指す。フルオラスタグは、少なくとも７個のフッ素原子および３個の炭素原子を含む。フルオラスタグを含むオルトエステルリンカーは、その４個のＲ基のうちの１つの上にそれぞれ位置する１つ、２つ、３つまたは４つのフルオラスタグを有するオルトエステルリンカーを含む。フルオラスオルトエステルリンカーはまた、「部分的フルオラスタグ」を有する、すなわち、７個未満のフルオラス原子および３個未満の炭素を有するオルトエステルリンカーを含むが、これは、互いに組み合わせられたときは少なくとも７個のフッ素原子および少なくとも３個の炭素を含み、すべて一緒に組み合わせられたとき５２個のフッ素原子を超えない。「フルオラスタグ」は、「疎水性タグ」として働くことができて、フルオラス媒体ではなく疎水性媒体を使用して単離することができる。
「クロマトグラフ法」という用語は、固定相および移動相または固定相を通過もしくは横断する溶離液の使用を含む、１つまたは複数の化合物を分離する方法を指す。クロマトグラフ法の非限定的な例には、フルオラスアフィニティー精製、高性能液体クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーが含まれる。
「フルオラスアフィニティー精製」という用語は、フッ素化材料（例えば、フッ素化もしくは過フッ素化吸着材またはフッ素化もしくは過フッ素化樹脂）を分離媒体として利用して、フルオラスアフィニティータグを有する標的分子を精製するための、親和性に基づく方法を指す。この方法は、フルオラスタグと、フッ素化材料、例えばフッ素化吸着材との間の強い親和性に基づいている。
「アルキル」という用語は、好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個または２４個の炭素を有する、直鎖または分岐鎖のアルキルを指す。そのようなアルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシルなどが含まれる。いくつかの実施形態において、アルキル基はシクロアルキル基であってもよい。
アルキル基は、上で定義した通り、非置換であっても、置換されていてもよい。「ハロ置換アルキル」という用語は、１個または複数のハロゲン原子で置換されたアルキル基を指す。非限定的な例には、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、クロロメチルなどが含まれる。ハロ置換アルキル基は、上で定義した通り、非置換であっても、置換されていてもよい。「フルオロ置換アルキル」という用語は、１個または複数のフッ素原子で置換されたアルキル基を指す。
「アルケニル」という用語は、好ましくは２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個または２４個の炭素を有し、１個または複数の炭素−炭素二重結合を有する、直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。アルケニル基の非限定的な例には、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル（アリル）、ｉｓｏ−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニルおよび２−ブテニルが含まれる。アルケニル基は、上で定義した通り、非置換であっても、１個または複数の適した置換基で置換されていてもよい。「ハロ置換アルケニル」という用語は、１個または複数のハロゲン原子で置換されたアルケニル基を指す。「フルオロ置換アルケニル」という用語は、１個または複数のフッ素原子で置換されたアルケニル基を指す。
「アルキニル」という用語は、好ましくは２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個または２４個の炭素を有し、１個または複数の炭素−炭素三重結合を有する、直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。アルキニル基には、これらに限定されないが、エチニル、プロピニルおよびブチニルが含まれる。アルキニル基は、上で定義した通り、非置換であっても、１個または複数の適した置換基で置換されていてもよい。「ハロ置換アルキニル」という用語は、１個または複数のハロゲン原子で置換されたアルキニル基を指す。「フルオロ置換アルキニル」という用語は、１個または複数のフッ素原子で置換されたアルキニル基を指す。
「炭素環」または「カルボシクリル」は、飽和（すなわち、シクロアルキル）、部分不飽和（例えば、シクロアルケニル（ｃｙｃｌｏａｋｅｎｙｌ）、シクロアルカジエニルなど）または単環として３個〜７個の炭素原子を、二環として７個〜１２個の炭素原子を、多環として最大約２０個の炭素原子を有する芳香族環を指す。単環式炭素環は、３個〜６個の環原子を、さらにより典型的には５個または６個の環原子を有する。二環式炭素環は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］もしくは［６，６］系として配列された７個〜１２個の環原子を、あるいはビシクロ［５，６］もしくは［６，６］系またはスピロ縮合環として配列された９個もしくは１０個の環原子を有する。単環式炭素環の非限定的な例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペンタ−１−エニル、１−シクロペンタ−２−エニル、１−シクロペンタ−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキサ−１−エニル、１−シクロヘキサ−２−エニル、１−シクロヘキサ−３−エニルおよびフェニルが含まれる。ビシクロ炭素環の非限定的な例にはナフチルが含まれる。
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」は、１個または複数の炭素原子がヘテロ原子、例えばＯ、ＮまたはＳで置き換えられたアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基をそれぞれ指す。アルキル基内、アルケニル基内またはアルキニル基内の任意の炭素をヘテロ原子（Ｏ、ＮまたはＳ）で独立して置き換えることができて、これは、第１の炭素、末端炭素または内部炭素を意味する。例えば、親分子に結合されているアルキル基の炭素原子がヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＮまたはＳ）で置き換えられる場合、得られるヘテロアルキル基は、それぞれ、アルコキシ基（例えば、−ＯＣＨ３など）、アミンアルキル（例えば、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２など）またはチオアルキル基（例えば、−ＳＣＨ３）である。親分子に結合されていないアルキル基の非末端炭素原子がヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＮまたはＳ）で置き換えられる場合、得られるヘテロアルキル基は、それぞれ、アルキルエーテル（例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３など）、アルキルアミン（例えば、−ＣＨ２ＮＨＣＨ３、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２など）またはチオアルキルエーテル（例えば、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ３）である。アルキル基の末端炭素原子がヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＮまたはＳ）で置き換えられる場合、得られるヘテロアルキル基は、それぞれ、ヒドロキシアルキル基（例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ）、アミノアルキル基（例えば、−ＣＨ２ＮＨ２）またはアルキルチオール基（例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ）である。ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基またはヘテロアルキニル基は、例えば、１個〜２４個の炭素原子を有することができる。Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル基は、１個〜６個の炭素原子を有するヘテロアルキル基を意味する。「置換ヘテロアルキル」、「置換ヘテロアルケニル」または「置換ヘテロアルキニル」は、「置換」の定義において定義した通り１個または複数の水素原子が非水素置換基で置き換えられた、本明細書において定義されたヘテロアルキル、ヘテロアルケニルまたはヘテロアルキニルを意味する。
「アリール」という用語は、当技術分野において一般に理解されるように、単環として３個〜７個の炭素原子を、二環として７個〜１２個の炭素原子を、多環として最大約２０個の炭素原子を有する非置換または置換芳香族炭素環式置換基、例えばフェニル、ナフチル、アントラシル、インダニルなどを指す。アリールという用語は、ヒュッケル則にしたがって、平面状で４ｎ＋２個の電子を含む環状置換基に適用されるものと理解される。アリール基は、上で定義した通り、非置換であっても、１個または複数の適した置換基で置換されていてもよい。「ハロ置換アリール」という用語は、１個もしくは複数のハロゲン原子またはハロゲン含有置換基で置換されたアリールを指す。「フルオロ置換アリール」という用語は、１個もしくは複数のフッ素原子またはフッ素含有置換基で置換されたアリールを指す。
「アリールアルキル」は、炭素原子、典型的には末端炭素原子に結合された水素原子のうちの１つがアリール基で置き換えられた非環状アルキル基を指す。典型的なアリールアルキル基には、これらに限定されないが、ベンジル、２−フェニルエタン−１−イル、ナフチルメチル、２−ナフチルエタン−１−イル、ナフトベンジル、２−ナフトフェニルエタン−１−イルなどが含まれる。アリールアルキル基は、６個〜２４個の炭素原子を含み得、例えば、アルキル炭素原子およびアリール炭素原子は合計で６個〜２４個の炭素原子になり得る。アリール基は、上で定義した通り、非置換であっても、１個または複数の適した置換基で置換されていてもよい。
「カルボニル」という用語は、酸素に二重結合された炭素を含む置換基を指す。そのような置換基の例には、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、カーボネートおよびカルバメートが含まれる。カルボニル基は、上で定義した通り、非置換であっても、１個または複数の適した置換基で置換されていてもよい。
「アミノ」という用語は、任意の窒素含有部分を指す。アミノ基の非限定的な例は、ＮＨ２−（一級）、ＲＨＮ−（二級）およびＲ２Ｎ（三級）（ここで、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素環式またはヘテロアリールである）である。ＲＨＮ−基およびＲ２Ｎ基は、上で定義した通り、非置換であっても、置換されていてもよい。
「ヘテロアリール」という用語は、単環式もしくは二環式の５員環系または６員環系を指し、ここで、ヘテロアリール基は不飽和であり、ヒュッケル則を満たす。ヘテロアリール基の非限定的な例には、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、１，３，４−オキサジアゾール−２−イル、１，２，４−オキサジアゾール−２−イル、５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール、３−メチル−１，２，４−オキサジアゾール、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンゾチアゾリニル、キナゾリニルなどが含まれる。ヘテロアリール基は、上で定義した通り、非置換であっても、置換されていてもよい。
「複素環」または「ヘテロシクリル」という用語は、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個〜４個のヘテロ原子を含む単環式部分、二環式部分または三環式部分を指す。ヘテロシクリル基は任意選択的に、１個または複数の二重結合を含む。ヘテロシクリル基には、これらに限定されないが、アゼチジニル、テトラヒドロフラニル、イミダゾリジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、チオモルホリニル、テトラヒドロチアジニル、テトラヒドロチアジアジニル、モルホリニル、オキセタニル、テトラヒドロジアジニル、オキサジニル、オキサチアジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、クロマニル、イソクロマニルおよびベンゾオキサジニルが含まれる。単環式の飽和または部分飽和の環系の非限定的な例は、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、イミダゾリジン−１−イル、イミダゾリジン−２−イル、イミダゾリジン−４−イル、ピロリジン−１−イル、ピロリジン−２−イル、ピロリジン−３−イル、ピペリジン−１−イル、ピペリジン−２−イル、ピペリジン−３−イル、ピペラジン−１−イル、ピペラジン−２−イル、ピペラジン−３−イル、１，３−オキサゾリジン−３−イル、イソチアゾリジン、１，３−チアゾリジン−３−イル、１，２−ピラゾリジン−２−イル、１，３−ピラゾリジン−１−イル、チオモルホリン−イル、１，２−テトラヒドロチアジン−２−イル、１，３−テトラヒドロチアジン−３−イル、テトラヒドロチアジアジン−イル、モルホリン−イル、１，２−テトラヒドロジアジン−２−イル、１，３−テトラヒドロジアジン−１−イル、１，４−オキサジン−２−イルおよび１，２，５−オキサチアジン−４−イルである。複素環式基は、上で定義した通り、非置換であっても、１個または複数の適した置換基で置換されていてもよい。
「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。
「ヌクレオチド」は、リン酸基、糖基および複素環式塩基を含む核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのアナログかを問わない）のサブユニット、ならびにそのようなサブユニットのアナログを指す。他の基（例えば、保護基）がヌクレオチドの（１つまたは複数の）任意の成分に結合され得る。「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド部分」は、糖基および複素環式塩基を含む核酸サブユニット、ならびにそのようなサブユニットのアナログを指す。
「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリン塩基およびピリミジン塩基、例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）だけでなく、修飾された他の複素環式塩基も含む部分を含むことが意図される。ピリミジン、プリン、複素環式塩基および修飾複素環式塩基は、本明細書において「核酸塩基」と呼ばれる。そのような修飾には、メチル化プリン類もしくはピリミジン類、アシル化プリン類もしくはピリミジン類、アルキル化複素環または他の複素環が含まれる。そのような修飾には、例として、ジアミノプリンおよびその誘導体、イノシンおよびその誘導体、アルキル化プリン類もしくはピリミジン類、アシル化プリン類もしくはピリミジン類、チオール化プリン類もしくはピリミジン類などが含まれ、または保護基、例えばアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジブチルホルムアミジン、Ｎ，Ｎ−ジフェニルカルバメートなどの付加が含まれる。加えて、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語には、従来のリボース糖およびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含む部分が含まれる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分に対する修飾、例えば、ヒドロキシル基のうちの１つもしくは複数がハロゲン原子もしくは脂肪族基で置き換えられる、またはエーテル、アミンなどとして官能化される修飾を含む。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間結合または主鎖部分に対する修飾を含む。「アナログ」は、模倣体、誘導体であるとして、類似の構造を有するとして、または他の同様の用語として文献において認識されている構造的特徴を有する分子を指し、例えば、非天然の（通常、天然に存在しない）ヌクレオチド、２’−修飾ヌクレオシドなどの非天然のヌクレオチド模倣体を取り込んでいるポリヌクレオチド、ペプチド核酸、オリゴマーヌクレオシドホスホネート、および保護基または結合基などの置換基が付加された任意のポリヌクレオチドが含まれる。
「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド間結合により結合されている複数のヌクレオシド部分サブユニットを含む化合物を指す。したがって、この用語は、複数のヌクレオチド部分サブユニットまたは残基を含む化合物も指す。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオシドまたはそれらの混合物を含み得る。オリゴヌクレオチドは、天然および／または非天然のヌクレオシド、ヌクレオシドアナログおよび修飾ヌクレオシドを含み得る。
本明細書において使用される「リンカー」という用語は、任意選択的に置換基で置換された、または他の原子が散在する、−（ＣＨＲ’）ａ−Ｗｂ−（ＣＨＲ’）ｃ−Ｖｄ−（ＣＨＲ’）ｅ−（式中、ＷおよびＶは、独立して−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ’−であり；Ｒ’は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、独立して０〜１０、好ましくは０〜６、または好ましくは０〜３の整数であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅの合計は、好ましくは２〜６の整数である）により表されるヒドロカルビル鎖（例えば、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキニレン）を指す。ヒドロカルビル鎖は、−Ｏ−Ｒ’’、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’またはそれらの組合せ（式中、Ｒ’およびＲ’’は、独立してＨまたは（Ｃ１〜Ｃ６）ヒドロカルビルである）が散在していてもよい。
「オルトエステルリンカー」という用語は、オリゴヌクレオチドなどの生体高分子に結合することができるオルトエステル化合物を指す。いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーはアフィニティータグを含む。
「オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート」という用語は、オルトエステルリンカーとのオリゴヌクレオチド酸素の反応から生じる生成物を指す。
「フルオラスオルトエステル」という用語は、少なくとも１つのフルオラスタグを含むオルトエステルを指す。
「チオノカルバメート保護基」は、窒素を有するチオノカルボニルおよびチオノカルボニル炭素原子に結合された酸素を含む保護基：−Ｏ−Ｃ（Ｓ）Ｎ−を指す。
「電子吸引基」という用語は、反応中心から電子を引き離す化学基を指す。電子吸引基（ＥＷＧ）の非限定的な例は、ハロゲン基（例えば、フッ素および塩素）、ハロアルキル基（例えば、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＦ３など）、ニトリル基（−ＲＣＮ）、カルボニル基（−ＣＯＲ）、スルホニル基（−ＳＯ３Ｒ）、アンモニウム基（Ｎ＋Ｒ３）およびニトロ基（−ＮＯ２）である。
「短縮化配列」または「短縮化オリゴヌクレオチド」という用語は、標的全長オリゴヌクレオチドより長さが短いオリゴヌクレオチド配列を指す。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、さらに、それらの通常の意味に加えて、「実質的な」または「実質的に」という用語は、当業者にとって許容される限度内または程度を意味する。例えば、「実質的に相殺される（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃａｎｃｅｌｌｅｄ）」は、相殺が許容されると当業者がみなすことを意味する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、さらに、その通常の意味に加えて、「およそ」および「約」という用語は、当業者にとって許容される限度内または量を意味する。「約」という用語は一般に、示した数値の±１５％を指す。例えば、「約１０」は、８．５〜１１．５の範囲を示し得る。例えば、「およそ同じ」は、比較されている項目が同じであると当業者がみなすことを意味する。
本開示において、数値範囲は、範囲を定める数値を含む。化学構造および化学式は、例示目的で伸長または拡大されている場合があることが認識されるべきである。
構造中の原子の数の範囲が示される場合（例えば、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニルなど）は常に、部分範囲内の炭素原子のいずれかによって、または示した範囲内に入る炭素原子の任意の個々の数によって置換基が記述されることが具体的に企図される。例として、１個〜２４個の炭素原子（例えば、Ｃ１〜Ｃ２４）、１個〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）、１個〜４個の炭素原子（例えば、Ｃ１〜Ｃ４）、１個〜３個の炭素原子（例えば、Ｃ１〜Ｃ３）または２個〜２４個の炭素原子（例えば、Ｃ２〜Ｃ２４）の範囲の記述を使用したアルキル基などの基の記載は、適宜、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個および２４個の炭素原子のいずれか、ならびにそれらの任意の部分範囲（例えば、適宜、１個〜２個の炭素原子、１個〜３個の炭素原子、１個〜４個の炭素原子、１個〜５個の炭素原子、１個〜６個の炭素原子、１個〜７個の炭素原子、１個〜８個の炭素原子、１個〜９個の炭素原子、１個〜１０個の炭素原子、１個〜１１個の炭素原子、１個〜１２個の炭素原子、１個〜１３個の炭素原子、１個〜１４個の炭素原子、１個〜１５個の炭素原子、１個〜２４個の炭素原子、２個〜３個の炭素原子、２個〜４個の炭素原子、２個〜５個の炭素原子、２個〜６個の炭素原子、２個〜７個の炭素原子、２個〜８個の炭素原子、２個〜９個の炭素原子、２個〜１０個の炭素原子、２個〜１１個の炭素原子、２個〜１２個の炭素原子、２個〜１３個の炭素原子、２個〜１４個の炭素原子、２個〜１５個の炭素原子、２個〜１６個の炭素原子、３個〜４個の炭素原子、３個〜５個の炭素原子、３個〜６個の炭素原子、３個〜７個の炭素原子、３個〜８個の炭素原子、３個〜９個の炭素原子、３個〜１０個の炭素原子、３個〜１１個の炭素原子、３個〜１２個の炭素原子、３個〜１３個の炭素原子、３個〜１４個の炭素原子、３個〜１５個の炭素原子、３個〜１６個の炭素原子、３個〜１７個の炭素原子、３個〜１８個の炭素原子、３個〜１９個の炭素原子、３個〜２０個の炭素原子、３個〜２１個の炭素原子、３個〜２２個の炭素原子、３個〜２３個の炭素原子および／または３個〜２４個の炭素原子）を有するアルキル基を包含し、それらを具体的に記載する。
他に定義されていない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者に一般に理解されるような同じ意味を有する。
様々な実施形態を説明する前に、本開示の教示は、記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって、もちろん変化し得ると理解されるべきである。また、本教示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定するためのものではないと理解されるべきである。
本明細書に開示されている通り、値の範囲がいくつかが記載されている。その範囲の上限と下限との間に挟まれたそれぞれの値は、文脈により特に明確に定められていない限り、下限の単位の１０分の１まで同じく具体的に開示されているものと理解される。記載の範囲内の任意の記載の値または挟まれた値と、その記載の範囲内のその他の任意の記載の値または挟まれた値との間のさらに狭い範囲それぞれは、本発明に包含される。これらのさらに狭い範囲の上限および下限が範囲内に独立して含まれても入らなくてもよく、記載の範囲内で何らかの具体的に除外された限定を受けるさらに狭い範囲内に上下限のいずれかが含まれる、いずれも含まれない、または両方が含まれる各範囲も本発明に包含される。記載の範囲が上下限の一方または両方を含む場合、それらの含まれる上下限のいずれかまたは両方を除く範囲も本発明に含まれる。
他に定義されていない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者に一般に理解されるような同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料も本教示の実施または試験において使用することができるが、いくつかの例示的な方法および材料をここで説明する。
本明細書において言及されるすべての特許および特許公報は、参照により明示的に組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈により特に明確に定められていない限り、単数および複数両方の指示対象を含む。したがって、例えば、「部分（ａ ｍｏｉｅｔｙ）」は、１つの部分および複数の部分を含む。
ＲＮＡ、ＤＮＡまたはキメラなどのオリゴヌクレオチドを精製するために使用することができる方法および化合物が提供される。本方法は、オルトエステルリンカーとのオリゴヌクレオチドのコンジュゲーション、および例えば、クロマトグラフ分離またはアフィニティーキャプチャーを使用した、得られたオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートの精製を含む。本方法および本化合物は、短縮化配列または失敗配列から全長オリゴヌクレオチドを分離するのに特に有用である。本方法は、同様のサイズのオリゴヌクレオチドの高分割を提供し、望まれない副生成物からのオリゴヌクレオチドの迅速な分離が可能になる。本方法の別の利点は、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートが塩基に安定であり、オリゴヌクレオチドからオルトエステルが切断するリスクなしに塩基性条件下でオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートの合成操作が可能になることである。分離媒体（ゲルまたは樹脂）上でオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートのアフィニティー精製を実施した後、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを弱酸性条件下で切断し、精製オリゴヌクレオチドを高収率で放出させることができる。本方法は、固相オリゴヌクレオチド合成において調製されたオリゴヌクレオチドを含む、様々な合成法により調製されたオリゴヌクレオチドを精製するのに有効である。
精製されるオリゴヌクレオチドは、天然物から得られても、合成法を使用して調製されてもよい。合成オリゴヌクレオチドは、当技術分野において既知の任意の方法を使用して調製されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、固相オリゴヌクレオチド合成を介して調製される。そのような実施形態において、合成は、固体担体上で行われる。固体担体は一般に、試薬および溶媒の自由な通過を可能にするカラム内の２つのフィルター間に保持される。
いくつかの実施形態において、合成は、平面状の表面上で行われる。いくつかの実施形態において、合成は、非平面状の表面上で行われる。そのような実施形態において、合成は、実質的に固体の実質的に滑らかな表面上で行われる。表面に関して本明細書において使用される「実質的に固体の」という用語は、オリゴヌクレオチド合成が起こる担体の表面上の（１つまたは複数の）部位が、担体の表面を越える、担体の本体内へのオリゴヌクレオチド合成の関連する試薬および化学薬品の拡散、吸収または浸透に対して耐性があることを意味する（そのような拡散および浸透を許し、したがって、担体の本体内でオリゴ合成が起こる市販のポリマーオリゴ合成装置担体とは対照的）。表面に関して本明細書において使用される「実質的に滑らかな」という用語は、オリゴヌクレオチド合成が起こる担体の表面上の（１つまたは複数の）部位がせいぜい表面的に不規則であり、したがって、不規則性が存在したとしても、試薬を表面に均一に適用したり、表面上で混合したり、または表面から除去したりすることができる速さに実質的に影響するような程度ではないことを意味する（試薬の適用および除去を遅くする孔および不規則性を含む市販の「制御された孔ガラス」オリゴ合成装置担体とは対照的に）。実質的に固体の実質的に滑らかな表面は、平坦である必要はなく、例えば、平坦な表面、管、円柱、凹凸の配列およびこれらの要素の組合せ、ならびに上述の属性を有する表面部分を与える他の設計が含まれるであろう。例えば、実質的に固体の実質的に滑らかな表面は、インクジェット印刷ヘッドによって扱うことができる表面（または表面の部分）である。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、制御された孔ガラスなどの固体担体、またはポリマー担体、例えばポリスチレン（ＰＳ）担体に結合されている。適した固体担体は、場合によってはポリマー性であり、様々な形態および組成を有することができ、天然に存在する材料、合成的に修飾された天然に存在する材料または合成材料から誘導することができる。適した担体材料の例には、これらに限定されないが、多糖、例えばアガロース（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａからＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）として市販されているもの）およびデキストラン（例えば、同じくＰｈａｒｍａｃｉａからＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）およびＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）という商品名で市販されているもの）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリレートおよびメチルメタクリレートのコポリマー、シリカ、テフロン、ガラスなどが含まれる。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法を使用して調製される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成法は、５’ＤＭＴ保護基を有する担体結合されたヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成法は、３’−ＤＭＴ保護基を有する担体結合されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成法は、５’シリル保護基を有する担体結合されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成法は、酸化除去可能な保護基を有する担体結合されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成は、脱トリチル化、ヌクレオシドホスホルアミダイトモノマーとの担体結合されたヌクレオシドのカップリング、未反応の５’ヒドロキシル基のキャッピングおよびホスホルアミダイト酸化のステップを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成は自動化されている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本発明の方法を実施する前に脱トリチル化される。
ある実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドを精製する方法を提供する。この方法は、固体担体上でオリゴヌクレオチドを合成するステップ；オリゴヌクレオチドをオルトエステルリンカーと反応させて、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを生成するステップであり、オルトエステルリンカーがアフィニティータグを含む、ステップ；合成のために使用された固体担体からオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを切断するステップ；クロマトグラフ法またはアフィニティーキャプチャー法を使用してオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを単離するステップ；およびオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートからオルトエステルリンカーを切断し、それによって精製オリゴヌクレオチドを放出させるステップを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、アフィニティータグおよびアルコキシル脱離基を含むオルトエステルリンカーとオリゴヌクレオチドを反応させるステップを含む。この反応は、オルトエステルリンカーに結合されたオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを生成し、ここで、オルトエステルリンカーは、アフィニティータグに結合されている。アフィニティータグは望ましいことに、１種または複数種の不純物からオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを分離するための精製法において利用することができる構造特性および／または官能基特性を有する。例えば、いくつかの実施形態において、フルオラスアフィニティークロマトグラフィーを使用して、１種または複数種の不純物からオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを分離することができる。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは環状オルトエステルである。いくつかの実施形態において、環状オルトエステルは５員環状オルトエステルである。いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは６員環状オルトエステルである。いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは７員環状オルトエステルである。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーはフルオラスオルトエステルである。いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、少なくとも１個のフッ素原子、少なくとも２個のフッ素原子、少なくとも３個のフッ素原子、少なくとも４個のフッ素原子、少なくとも５個のフッ素原子、少なくとも６個のフッ素原子、少なくとも７個のフッ素原子、少なくとも８個のフッ素原子、少なくとも９個のフッ素原子、少なくとも１０個のフッ素原子、少なくとも１１個のフッ素原子、少なくとも１２個のフッ素原子、少なくとも１３個のフッ素原子、少なくとも１４個のフッ素原子、少なくとも１５個のフッ素原子、少なくとも１７個のフッ素原子、少なくとも１９個のフッ素原子、少なくとも２１個のフッ素原子、少なくとも２３個のフッ素原子もしくは少なくとも２５個のフッ素原子または最大でも５２個を超えないフッ素原子を含む。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式ＲＣ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）（ＯＲ’’’）、
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換アルキル、ハロ置換アルケニル、ハロ置換アルキニル、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環または任意の置換等価物である。Ｒは水素であってもよい）
の化合物（Ｉａ）である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉａ）（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、カルボシクリル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環または任意の置換等価物であり、ただし、Ｒは水素であってもよい）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉａ）（式中、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’は、それぞれ独立してアリールまたは置換アリールである）の化合物である。
いくつかの実施形態において、Ｒは、ＨまたはＣＨ３であり、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’はすべて、フェニルまたは置換フェニルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のうちの１つは脱離基であり、電子吸引基「ＥＷＧ」、例えばトリフルオロアルキル基、ハロゲン（例えば、塩素）基またはシアノエチル基を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、メチルまたはエチルである。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉａ）（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のうちの少なくとも１つは、疎水性タグまたは部分的疎水性タグであり、Ｒｓ基の残りは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロまたはヘテロ置換等価物、Ｃ３〜Ｃ１２カルボシクリルまたはヘテロシクリルおよび置換等価物である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のうちの少なくとも２つは、疎水性タグまたは部分的疎水性タグであり、Ｒｓ基の残りは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロまたはヘテロ置換等価物、Ｃ３〜Ｃ１２カルボシクリルまたはヘテロシクリルおよび置換等価物である。
オルトエステルリンカーが、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のうちの少なくとも１つまたは２つが疎水性タグまたは部分的疎水性タグである式（Ｉａ）の化合物である実施形態において、疎水性タグは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択的に置換されており、Ｏ、ＳおよびＮから独立して選択されるヘテロ原子が任意選択的に散在する、またはＮＲａ−Ｒｂ、−ＮＲａ−ＣＯ−Ｒｂ、−ＣＯ−ＮＲａ−Ｒｂ、−ＣＯ−Ｒａ（式中、Ｒａ、Ｒｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から独立して選択される基が任意選択的に散在する直鎖、分岐鎖、単環式もしくは多環式の飽和、部分不飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２４炭化水素鎖を指す。単独でまたは合わせて、疎水性タグまたは部分的疎水性タグの合計は、少なくとも３のｃＬｏｇＰ値を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’の間で共有される炭素原子の総数は５０個以下である。いくつかの実施形態において、Ｒは水素である。いくつかの実施形態において、Ｒは、メチルまたはエチルである。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカー化合物（Ｉａ）は、
（式中、ＳＧは、各フェニル基上に独立して存在するもしくは存在しない０個、１個、２個、３個、４個または５個の置換基であり、ハロゲン基、ＮＯ２基、メチル基およびメトキシ基から独立して選択される）の２種類の構造から選択される。
好ましくは、置換フェニル基のうちの少なくとも２つは同じである。
好ましい実施形態において、ＳＧは、３個のフェニル基上に存在しない。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉａ）（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のうちの少なくとも１つは、フルオラスタグまたは部分的フルオラスタグであり、他のＲｓ基の残りは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロまたはヘテロ置換等価物、Ｃ３〜Ｃ１２カルボシクリルまたはヘテロシクリルおよび置換等価物である）の化合物である。
フルオラスタグは、フッ素原子で部分的または完全に（パーフルオロ）置換されている、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択的に置換されている、Ｏ、Ｓ、Ｎから独立して選択されるヘテロ原子が任意選択的に散在する、またはＮＲａ−Ｒｂ、−ＮＲａ−ＣＯ−Ｒｂ、−ＣＯ−ＮＲａ−Ｒｂ、−ＣＯ−Ｒａ（式中、Ｒａ、Ｒｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から独立して選択される基が任意選択的に散在する直鎖、分岐鎖、単環式もしくは多環式の飽和、部分不飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２４炭化水素鎖を指す。フルオラスタグにおいて、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’の間で共有される炭素の総数は少なくとも３個であり、フッ素原子の総数は少なくとも７個である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、化合物（Ｉａ）（式中、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’は、それぞれ独立してＣ２〜Ｃ１２フルオロアルキルである）である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカー化合物（Ｉａ）は、
の化合物の構造を有する。
式中、ｎは、１〜５から選択される整数である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、少なくとも１つのアフィニティータグ（ＡｆＴｇ）を含む。いくつかの実施形態において、アフィニティータグ（ＡｆＴｇ）は、上述のオルトエステルリンカーのＲ基の化学構造の一部または全体であってもよい（例えば、疎水性タグまたはフルオラスタグ）。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグ（ＡｆＴｇ）は、疎水性タグまたはフルオラスタグではなく、例えばビオチンタグ、マルトースタグ、アダマンタンタグまたは化学官能性タグであり、共有結合を介して直接またはリンカーＬを介して間接的にオルトエステルリンカーに結合されていてもよい。これらの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉｂ）
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立してＡｆＴｇ−Ｌであるか、またはＯ、Ｓ、Ｎから独立して選択されるヘテロ原子で、またはＮＲａ−Ｒｂ、−ＮＲａ−ＣＯ−Ｒｂ、−ＣＯ−ＮＲａ−Ｒｂ、−ＣＯ−Ｒａ（式中、Ｒａ、Ｒｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から独立して選択される基で任意選択的に置換された、およびそれらが任意選択的に散在する、直鎖、分岐鎖、単環式もしくは多環式の飽和、部分不飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ１２炭化水素鎖であり；Ｌは、共有結合であるか、またはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択的に置換されており、Ｏ、Ｓ、Ｎから独立して選択されるヘテロ原子が、またはＮＲａ−Ｒｂ、−ＮＲａ−ＣＯ−Ｒｂ、−ＣＯ−ＮＲａ−Ｒｂ、−ＣＯ−Ｒａ（式中、Ｒａ、Ｒｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から独立して選択される基が任意選択的に散在する直鎖、分岐鎖、単環式もしくは多環式の飽和、部分不飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ１２炭化水素鎖である）
の化合物である。
いくつかの実施形態において、Ｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択的に置換されており、Ｏ、Ｓ、Ｎから独立して選択されるヘテロ原子が、またはＮＲａ−Ｒｂ、−ＮＲａ−ＣＯ−Ｒｂ、−ＣＯ−ＮＲａ−Ｒｂ、−ＣＯ−Ｒａ（式中、Ｒａ、Ｒｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から独立して選択される基が任意選択的に散在する直鎖、分岐鎖、単環式もしくは多環式の飽和、部分不飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ１２炭化水素鎖であり、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロまたはヘテロ置換等価物、Ｃ３〜Ｃ１２カルボシクリルまたはヘテロシクリルおよび置換等価物である。Ｒは水素であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ’およびＲ’’のうちの１つは脱離基であり、電子吸引基ＥＷＧ、例えばトリフルオロアルキル（例えば、ＣＨ２ＣＦ３）基またはシアノエチル基を含み得る。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉｂ）（式中、ＡｆＴｇはアフィニティータグであり、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立してＡｆＴｇ−ＬまたはＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、カルボシクリル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、任意の置換等価物またはそれらの組合せであり、ただし、炭素の総数は２４個を超えず；Ｌは、共有結合であるか、またはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択的に置換されており、Ｏ、Ｓ、Ｎから独立して選択されるヘテロ原子が、またはＳ−Ｓ、ＮＲａ、ＮＲａ−ＣＯ、−ＣＯ−ＮＲａ−、ＮＲａ−ＣＯ−ＮＲｂ、ＣＯ（式中、Ｒａ、Ｒｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から独立して選択される基が任意選択的に散在する直鎖、分岐鎖、単環式もしくは多環式の飽和、部分不飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ１２炭化水素鎖である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉｃ）（式中、オルトエステルリンカーのＲ’基、Ｒ’’基およびＲ’’’基のうちの２つは、炭素−炭素結合を介して互いに結合されており、
に示される環状オルトエステルを形成する）の化合物である。
オルトエステルリンカー化合物（Ｉａ）がオリゴヌクレオチドと反応すると、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート（ＩＶａ）が得られる。
（式中、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’のうちの少なくとも１つは、疎水性タグまたはフルオラスタグであり、
Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換アルキル、ハロ置換アルケニル、ハロ置換アルキニル、カルボシクリル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環または任意の置換等価物であり；好ましくは、Ｒ’および／またはＲ’’は、疎水性タグまたはフルオラスタグであり、Ｒは、Ｈまたはメチルであり；
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、保護されたヒドロキシル、Ｏ−メトキシまたはＯ−ＭＯＥ（メトキシエトキシ）であり；
Ｂは、保護された、または保護されていない核酸塩基である）。
オルトエステルリンカー（Ｉｂ）がオリゴヌクレオチドと反応すると、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート（ＩＶｂ）が得られる。
（式中、ＡｆＴｇはアフィニティータグであり；
Ｌは、共有結合であるか、またはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択的に置換されており、Ｏ、Ｓ、Ｎから独立して選択されるヘテロ原子が、またはＮＲａ−Ｒｂ、−ＮＲａ−ＣＯ−Ｒｂ、−ＣＯ−ＮＲａ−Ｒｂ、−ＣＯ−Ｒａ（式中、Ｒａ、Ｒｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から独立して選択される基が任意選択的に散在する直鎖、分岐鎖、単環式もしくは多環式の飽和、部分不飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ１２炭化水素鎖であり；
ＲおよびＲ’は、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換アルキル、ハロ置換アルケニル、ハロ置換アルキニル、カルボシクリル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環または任意の置換等価物であり；
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、保護されたヒドロキシル、Ｏ−メトキシまたはＯ−ＭＯＥ（メトキシエトキシ）であり、Ｂは、保護された、または保護されていない核酸塩基である）。
好ましい実施形態において、ＲはＨであり、Ｒ’は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロまたはヘテロ置換等価物、Ｃ３〜Ｃ１２カルボシクリルまたはヘテロシクリルおよび置換等価物である。
いくつかの実施形態において、アフィニティー精製が、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを単離または精製するために使用される。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、オリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシルと反応し、それによってオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに結合する。したがって、いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに結合されている。いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルと反応し、それによってオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルに結合する。したがって、いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルに結合されている。いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、ヌクレオチド塩基上に存在するヒドロキシル基に結合されている。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも７０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも７５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長〜約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長〜約３００ヌクレオチド長である。
同じアフィニティー対のアフィニティータグおよび認識部分は、生体分子もしくは生体高分子または不溶性担体に交換可能に結合させることができて、この選択は、コンジュゲーション反応の容易さならびに生体分子からのタグの脱保護および切断に使用される条件の適合性に基づいて行われる。これを考慮して、当業者は、アフィニティー対のどのメンバーを生体分子および固体担体に結合させるか決めることができる。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはフルオラスアフィニティータグである。フルオラスアフィニティータグの非限定的な例には、フッ素化置換基、例えばフルオロ置換アルキル置換基、フルオロ置換ヘテロアルキル置換基、フルオロ置換アルケニル置換基、フルオロ置換アルキニル置換基、フルオロ置換カルボシクリル置換基、フルオロ置換ヘテロシクリル置換基およびフルオロ置換アリール置換基が含まれる。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、フルオラスアフィニティータグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、フルオラスアフィニティータグに直接（Ｒ基として）またはリンカーＬを介して間接的に結合されており、オリゴヌクレオチドに結合されている。いくつかの実施形態において、フルオラスアフィニティー精製が、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたフルオラスタグコンジュゲートを単離または精製するために使用される。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグは疎水性タグである。疎水性アフィニティータグの非限定的な例には、フッ素化基、トリチル、ステロイド、脂質、長いアルキル飽和鎖または不飽和鎖、例えばオクタデシル置換基およびカルボシクリルを含む分子が含まれる。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、疎水性アフィニティータグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、疎水性アフィニティータグに直接（Ｒ基として）またはリンカーＬを介して間接的に結合されており、オリゴヌクレオチドにも結合されている。いくつかの実施形態において、疎水性アフィニティー精製が、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合された疎水性タグコンジュゲートを単離または精製するために使用される。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはビオチンタグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、ビオチンタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、ビオチンタグに直接（Ｒ基として）またはリンカーＬを介して間接的に結合されており、オリゴヌクレオチドにも結合されている。いくつかの実施形態において、アビジンまたはストレプトアビジンが固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたビオチンコンジュゲートを捕捉するために使用される。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはグルタチオンタグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、グルタチオンタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、グルタチオンタグに直接（Ｒ基として）またはリンカーＬを介して間接的に結合されており、オリゴヌクレオチドにも結合されている。いくつかの実施形態において、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）（ＧＳＴ）が固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたグルタチオン（ｇｌｕｔｈａｔｈｉｏｎｅ）コンジュゲートを捕捉するために使用される。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはマルトースタグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、マルトースタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、マルトースタグに直接（Ｒ基として）またはリンカーＬを介して間接的に結合されており、オリゴヌクレオチドにも結合されている。いくつかの実施形態において、マルトース結合タンパク質が固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたマルトースコンジュゲートを捕捉するために使用される。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはアリールボロン酸タグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、アリールボロン酸タグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、アリールボロン酸タグに直接（Ｒ基として）またはリンカーＬを介して間接的に結合されており、オリゴヌクレオチドにも結合されている。いくつかの実施形態において、ジオール含有分子が固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたアリールボロン酸コンジュゲートを捕捉するために使用される。いくつかの実施形態において、アフィニティータグはジオール含有化合物であり、アリールボロン酸誘導体は固体担体に結合されている。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはポリヒスチジンペプチドタグである。ポリヒスチジンペプチドタグの非限定的な例には、イミダゾリル置換基、例えばイミダゾールおよびヒスチジンが含まれる。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、ポリヒスチジンペプチドタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、ポリヒスチジンペプチドタグに直接（Ｒ基として）またはリンカーＬを介して間接的に結合されており、オリゴヌクレオチドにも結合されている。いくつかの実施形態において、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製が、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたヒスチジンまたはイミダゾリルコンジュゲートを単離または精製するために使用される。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはポリスルフヒドリルタグである。ポリスルフヒドリルタグの非限定的な例には、システインおよびジチオトレイトールなどの置換基が含まれる。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、ポリスルフヒドリルタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、ポリスルフヒドリルタグに直接（Ｒ基として）またはリンカーＬを介して間接的に結合されており、オリゴヌクレオチドにも結合されている。いくつかの実施形態において、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製が、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたポリスルフヒドリルコンジュゲートを単離または精製するために使用される。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはマレイミドタグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、マレイミドタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、マレイミドタグに直接（Ｒ基として）またはリンカーＬを介して間接的に結合されており、オリゴヌクレオチドにも結合されている。いくつかの実施形態において、スルフヒドリル含有分子が固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたマレイミドコンジュゲートを捕捉するために使用される。いくつかの実施形態において、アフィニティータグはスルフヒドリル含有化合物であり、マレイミド誘導体は固体担体に結合されている。別の実施形態において、アフィニティータグはスルフヒドリル含有化合物であり、アルファ−ハロカルボニル誘導体は固体担体に結合されている。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはアダマンタンタグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、アダマンタンタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、アダマンタンに直接またはリンカーＬを介して結合されており、オリゴヌクレオチドに結合されている。いくつかの実施形態において、ククルビツリルまたはシクロデキストリンが固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたアダマンタンコンジュゲートを捕捉するために使用される。他の実施形態において、アフィニティー精製のためにシクロデキストリン化合物またはククルビツリル化合物がオルトエステルリンカーに結合されており、アダマンタンが固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれている。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはアジドタグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、アジドタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、リンカーＬを介してアジドに結合されており、オリゴヌクレオチドに結合されている。いくつかの実施形態において、アルキンまたはシクロオクチンが固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたアジドコンジュゲートを捕捉するために使用される。別の実施形態において、アジド部分が、固体担体またはゲルに結合されており、アルキンまたはシクロオクチンが、オルトエステルリンカーに直接または間接的に結合されている。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはシクロオクチンタグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、シクロオクチンタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、リンカーＬを介してシクロオクチンに結合されており、オリゴヌクレオチドに結合されている。いくつかの実施形態において、ニトロンが固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたシクロオクチンコンジュゲートを捕捉するために使用される。別の実施形態において、シクロオクチン部分が、固体担体またはゲルに結合されており、ニトロン含有化合物が、オルトエステルリンカーに直接または間接的に結合されている。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはアルケニルタグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、アルケニルタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、リンカーＬを介してアルケンに結合されており、オリゴヌクレオチドに結合されている。いくつかの実施形態において、共役ジエンが固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、ディールス−アルダー型反応（［４＋２］環化付加）においてオリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたアルケンコンジュゲートを捕捉するために使用される。別の実施形態において、アルケン含有化合物が、固体担体またはゲルに結合されており、共役ジエンが、オルトエステルリンカーに直接または間接的に結合されている。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグはアミノタグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、アミノタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、リンカーＬを介してアミンに結合されており、オリゴヌクレオチドに結合されている。いくつかの実施形態において、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの活性化エステルが固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたアミノコンジュゲートを捕捉するために使用される。
いくつかの実施形態において、アフィニティータグは、ヒドラジドタグまたはオキシアミンタグである。いくつかの実施形態において、オルトエステルは、ヒドラジドタグまたはオキシアミンタグとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして働く。言い換えれば、オルトエステル（すなわち、オルトエステルリンカー）は、リンカーＬを介してヒドラジドまたはオキシアミンに結合されており、オリゴヌクレオチドに結合されている。いくつかの実施形態において、アルデヒドまたはケトン含有化合物が固相に結合されており、またはゲルに埋め込まれており、オリゴヌクレオチド−オルトエステル結合されたヒドラジドまたはオキシアミンコンジュゲートを捕捉するために使用される。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはリン保護基を含み、それによってオリゴヌクレオチドのリン部分はリン保護基に結合されている。いくつかの実施形態において、リン部分は、リン酸、ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネート基である。いくつかの実施形態において、リン保護基は、メチル基またはシアノエチル基（例えば、ベータ−シアノエチル基）である。メチル基は、例えば、チオフェノールまたはジナトリウム２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレートを使用して除去することができる。シアノエチル基は、例えば、非求核性アミンまたはヒンダードアミン、例えばジエチルアミン、ｔ−ブチルアミンまたは１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）を使用して除去することができる。いくつかの実施形態において、この方法は、オリゴヌクレオチドをオルトエステルリンカーと反応させる前に、オリゴヌクレオチドのリン保護基を脱保護するステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、オリゴヌクレオチドをオルトエステルリンカーと反応させた後に、核酸塩基保護基および任意選択的にリン保護基を脱保護するステップを含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基保護基を含む。オリゴヌクレオチド内の任意の核酸塩基が核酸塩基保護基を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基保護基は、アセチル、イソブチリル、ベンゾイルなどである。例えば、保護された核酸塩基は、Ｎ６−ベンゾイル−Ａ、Ｎ６−イソブチリル−Ａ、Ｎ４−アセチル−Ｃ、Ｎ４−イソブチリル−ＣまたはＮ２−イソブチリル−Ｇであってもよい。いくつかの実施形態において、核酸塩基保護基は、オリゴヌクレオチドをポリアミンに接触させることにより除去される。いくつかの実施形態において、核酸塩基保護基は、オリゴヌクレオチドを１，２−ジアミノエタンなどのジアミンと接触させることにより除去される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを１，２−ジアミノエタンに室温で２時間曝露すると、核酸塩基が脱保護される。いくつかの実施形態において、核酸塩基保護基は、フェノキシアセチル、ｔ−ブチルフェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジメチルアセトアミジンなどである。いくつかの実施形態において、核酸塩基保護基は、オリゴヌクレオチドをオルトエステルリンカーと反応させる前に除去される。
いくつかの実施形態において、核酸塩基保護基は、オリゴヌクレオチドをオルトエステルリンカーと反応させた後に除去される。
いくつかの実施形態において、固体担体からのオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートの切断、ならびに核酸塩基保護基および任意選択的にリン保護基の脱保護は、同時にかつ／または同じ反応で実施される。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２’−ヒドロキシル保護基を含むオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、２’−ヒドロキシル保護基はチオノカルバメート（ＴＣ）保護基である。いくつかの実施形態において、２’−ヒドロキシル保護基は、ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）保護基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護基、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）保護基、ピバロイルオキシメチル（ＰｉｖＯＭ）保護基または２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）保護基である。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの合成は、（スクシネートリンカーもしくはＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔリンカー（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵｎｙＳｕｐｐｏｒｔ）、またはＵｎｙＬｉｎｋｅｒなどの）塩基不安定性リンカーにより固相に結合された３’末端ヌクレオチドを含む固相（例えば、ＣＰＧ）上で実施される。合成サイクルは、５’−ＯＨ保護基（例えば、トリチルまたはＤＭＴ）の脱保護、活性化剤（ａｃｉｔｖａｔｏｒ）の存在下のホスホルアミダイトのカップリング、塩基不安定性保護基（例えば、アセチル保護基）による未反応のヒドロキシル基のキャッピング、亜リン酸トリエステル（ｐｈｏｓｈｉｔｅｔｒｉｅｓｔｅｒ）結合のリン酸トリエステル結合への酸化を含む。
新たに合成されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは修飾オリゴヌクレオチドは、固体担体上で合成される。得られる全長生成物は、デブロッキングステップにおいて最終保護基を除去することにより、アフィニティータグを含むオルトエステルリンカーを結合するために調製される。その保護基は、文献において周知の様々な基であり得、最も典型的にはＤＭＴ、ピキシルまたはＢＺＨであり得る。オリゴヌクレオチドの合成は３’から５’方向に起こり得、ここで最終保護基は、得られたオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルから除去され、またはこの合成は、５’から３’方向に起こり得、ここで最終保護基は、得られたオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルから除去される。この時点で、新たに合成されたオリゴヌクレオチドからリン保護基を任意選択的に除去することができる。短縮化配列のヒドロキシルは、合成中に例えばアセテート保護基でキャッピングされており、したがってオルトエステルリンカーと反応することができないため、アフィニティータグを含むオルトエステルリンカーは、全長生成物および全長生成物のみのヒドロキシル基と反応する。ヒドロキシル基は、ｔｒａｎｓ−オルトエステル化触媒として弱酸を使用して実施されてもよい最終のデブロッキングステップにおいて遊離された。全長オリゴヌクレオチドとのオルトエステルリンカーのコンジュゲーションは典型的には、高誘電率溶媒（例えば、アセトニトリル、ＤＭＦ、ジオキサン、ＴＨＦ、炭酸プロピレンなど）中、室温でまたは最高９５℃のより高い温度で実施され、酸溶液（無水溶媒、例えばアセトニトリル中の酸）が、約０．００１Ｍ〜約０．１Ｍの、好ましくは約０．０２Ｍの濃度で反応物に加えられ（例えば、ペルフルオロヘプタン酸またはヘプタフルオロ酪酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、２−ジクロロプロピオン、２ ３−ジクロロプロピオン、２，６−ビス（トリフルオロメチル）安息香酸、２−（トリフルオロメチル）安息香酸、４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，９−トリデカフルオロノナン酸および４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサン酸）、反応は、オルトエステルリンカーの反応性に応じて約１５分間〜約１２時間行われる。
様々な保護基、核酸塩基保護基および存在する場合はＴＣまたはＰｉｖＯＭなどの塩基不安定性２’−ヒドロキシル保護基を任意選択的に除去するために、おそらくはリンカーを、典型的にはオリゴヌクレオチドを固体担体に結合するスクシネートリンカーまたはｕｎｙｌｉｎｋｅｒを切断するために、得られたオルトエステルリンカー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびタグなし短縮化オリゴヌクレオチドをここで様々な塩基性アミン（アンモニア、水酸化アンモニウム、メチルアミン、エチレンジアミンなど）で処理することができる。
全長オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートおよびタグなし短縮化配列（粗サンプル）は、固体担体から、バッファー中に、典型的には０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．６Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）および１０％ジメチルホルムアミド（ローディングバッファー）を含むバッファー中に溶離される。
次いで、遊離された粗オリゴヌクレオチドは、アフィニティー対を利用したクロマトグラフ分離または固相抽出カラム（例えば、カートリッジ）を使用して精製することができる。アフィニティータグに結合された全長オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートおよびタグなし短縮化配列を含む粗オリゴヌクレオチドサンプルは、ローディングバッファーを使用して、捕捉部分を含む樹脂またはビーズまたはポリマー材料で充填されたカラム上またはカートリッジ上にローディングされる。全長オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートに結合されたアフィニティータグは、樹脂またはビーズに埋め込まれた捕捉部分に−親和性によりまたは共有結合的に−結合し、タグなし短縮化配列が洗浄バッファー、通常０．０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝７．４）を使用してカラムまたはカートリッジから溶出される間、樹脂上またはビーズ上に保持される。
次いで、カラムまたはカートリッジに弱酸溶液（切断バッファー）、例えば３．０Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）を加え、これを室温で３０分間〜３時間そのままにすることによって、オルトエステルリンカーを全長オリゴヌクレオチドコンジュゲートから切断することができる。オリゴヌクレオチドを合成するために、ＡＣＥ、ＣＥＭ、ＴＢＤＭＳもしくはＴＯＭまたはその他などの非塩基不安定性２’−ヒドロキシル保護基を有するモノマーが使用された場合−それらの非塩基不安定性２’−ヒドロキシル保護基（例えば、ＴＢＤＭＳ、ＴＯＭまたはＣＥＭ）の脱保護は、全長オリゴヌクレオチドからのオルトエステルリンカーの切断の前（アフィニティーキャプチャー材料が化学的脱保護処理に対して耐性がある場合）または後にフッ化物イオンにより実施することができる。あるいは、ＡＣＥなどの酸不安定性２’−ヒドロキシル保護基が使用される場合、これらの基の脱保護は、全長オリゴヌクレオチドからのオルトエステルリンカーの切断中に行うことができる。オルトエステルリンカーの切断後、次いで、溶離液のｐＨが約７に戻るまで洗浄バッファーを使用して、切断バッファーがカラムから除去される。吸着された精製全長オリゴヌクレオチドは、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない水中の１０％アセトニトリルを使用して、樹脂またはビーズから溶離される。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーのコンジュゲーションは、酸の存在下、合成カラム上で実施される。オルトエステル−オリゴヌクレオチドのコンジュゲーションに続いて、合成固相（例えば、ＣＰＧ）からのオリゴヌクレオチド−オルトエステルコンジュゲートの切断ならびに様々なオリゴヌクレオチド保護基（ＲＮＡが合成されるとき、リン保護基、核酸塩基保護基および２’Ｏ−ヒドロキシル保護基）の脱保護が実施される。
オリゴヌクレオチド（すなわち、モノマー組成物）を合成するために使用される化学に応じて、保護基の脱保護は、塩基または塩基性試薬（例えば、１，２−ジアミノエタン、アンモニア、水酸化アンモニウムなど）を室温でまたはより高い温度で使用して実施される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの合成は、切断可能な非塩基不安定性リンカー（例えば、光切断可能なリンカー）により結合された３’末端ヌクレオチドを含む固相上で達成される。この実施形態において、伸長中のオリゴヌクレオチド上の未反応の５’ヒドロキシル基のキャッピングは、非塩基不安定性試薬（例えば、Ｕｎｉｃａｐ）を使用して達成され、この試薬は、脱保護すると、短縮化オリゴヌクレオチド配列上に遊離ヒドロキシル基ではなくリン酸基を残す。そのような実施形態において、アミン塩基によるリン保護基およびヌクレオチド保護基の脱保護は、固相に依然として結合された、しかし、オルトエステルリンカーとのコンジュゲーションに利用可能な５’末端ヒドロキシル基のみを有する脱保護されたオリゴヌクレオチドを与える。オルトエステルリンカーと、固相に依然として結合されているがヌクレオチドおよびリンが脱保護されたオリゴヌクレオチドとのコンジュゲーションに続いて、オリゴヌクレオチドを固相から切断し、アフィニティー精製を行って、所望の全長オルトエステル−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを単離することができる。最後に、オルトエステルリンカーが、弱酸性溶液（ｐＨ＝５〜６）中の精製全長オリゴヌクレオチドから切断され、アフィニティー分離媒体から溶離される。
２’−ヒドロキシル保護基は、任意の適した条件を使用して除去することができる。いくつかの実施形態において、ＴＣ保護基またはＰｉｖＯＭ保護基は、オリゴリボヌクレオチドを１，２−ジアミノエタンなどのジアミンと接触させることにより２’−ヒドロキシルから除去される。いくつかの実施形態において、ＰｉｖＯＭ保護基は、オリゴリボヌクレオチドをアンモニアまたはアルキルアミンと接触させることによりオリゴリボヌクレオチドから除去される。いくつかの実施形態において、オリゴリボヌクレオチドをジアミン、アンモニアまたはアルキルアミンと接触させると、同時に２’−ヒドロキシル基が脱保護され、固体担体からオリゴリボヌクレオチドが切断される。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ保護基は、オリゴリボヌクレオチドを酸と接触させることにより除去される。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ保護基およびオルトエステルリンカーは同時に除去される。いくつかの実施形態において、２’−ヒドロキシル保護基は、ＴＢＤＭＳ保護基またはＴＯＭ保護基であり、フッ化物を含む組成物とオリゴリボヌクレオチドを接触させることにより除去される。ＴＢＤＭＳ保護基またはＴＯＭ保護基は、オリゴリボヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを単離した後、およびオルトエステルリンカーを切断する前に、切断すると同時に、または切断した後に除去することができる。
いくつかの実施形態において、２’−ヒドロキシル保護基は、オリゴリボヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを単離する前に除去される。いくつかの実施形態において、２’−ヒドロキシル保護基は、オリゴリボヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを単離した後に除去される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１，２−ジアミノエタンで処理され、その結果、同時に保護基が、オリゴヌクレオチドから除去され、オリゴリボヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートが、固体担体から切断される。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、リン保護基または核酸塩基保護基を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、リン保護基および核酸塩基保護基を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、リン保護基、核酸塩基保護基および２’−ヒドロキシル保護基を含むＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１，２−ジアミノエタンで処理され、それによって２’−ＯＨ保護基（例えば、ＴＣまたはＰｉｖＯＭ）が、オリゴヌクレオチドから除去され、同時にオリゴリボヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートが、合成固体担体から切断される。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカー（Ｉａ）のＲ’基、Ｒ’’基およびＲ’’’基のうちの２つは、炭素−炭素結合を介して互いに結合されており、式（Ｉ）の化合物に示される５員環、６員環または７員環環状オルトエステルを形成する。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニルまたは置換アリールであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも１つはＨではなく；Ｘは、Ｈ、メチルまたは電子吸引基であり；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含み；好ましくは、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はＨである）
ｎが２であるとき、オルトエステルリンカー部分は、以下の構造に示される７員環環状オルトエステルを形成し、Ｒ１基〜Ｒ６基のいずれかとして、それぞれ独立して定義される別の炭素上の２個の別のＲ基Ｒ’５およびＲ’６を有する：
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のオルトエステルリンカーにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリルもしくは任意の置換等価物またはそれらの組合せであり、ただし、炭素の総数は２４個を超えず；Ｒ８およびＲ９はＨであり；Ｘは、Ｈ、メチルまたは電子吸引基であり；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のオルトエステルリンカーにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つは、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニル、フルオロ置換カルボシクリル、フルオロ置換ヘテロアルキル、フルオロ置換ヘテロアルケニル、フルオロ置換ヘテロアルキニルまたはフルオロ置換ヘテロシクリルである。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉｄ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの少なくとも１つは、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、任意の置換等価物またはそれらの任意の組合せであり、ただし、炭素の総数は２４個を超えず、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロまたはヘテロ置換等価物、Ｃ３〜Ｃ１２カルボシクリルまたはヘテロシクリルおよび置換等価物であり、ただし、Ｒ１基〜Ｒ７基のうちの２つのＲ基は、
（式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルであり；ｎは、０または１であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）
に示される環状オルトエステルと共に縮合環を形成しない）
の化合物である。
式（Ｉｄ）のオルトエステルリンカーには、ｎが０であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも２つが、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリルまたは任意の置換等価物であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうちのすべての残りのＲ基がＨであり、ただし、Ｈではない２つのＲ基は、互いに結合して環状オルトエステルと共に縮合環を形成しない化合物が含まれる。
式（Ｉｄ）のオルトエステルリンカーには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの１つが、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニルまたはフルオロ置換アリールである化合物が含まれる。
式（Ｉｄ）のオルトエステルリンカーにおいて、アフィニティータグは、少なくとも３のｃＬｏｇＰ値を有するフルオラスタグまたは疎水性タグであってもよい。
アフィニティータグ（ＡｆＴｇ）は、Ｒ基（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７）の化学構造の一部もしくは全体であってもよく、または
に示されるリンカーＬを介してオルトエステルに結合されていてもよい。
式中、ＡｆＴｇはアフィニティータグであり、Ｌは、共有結合であり、あるいはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択的に置換されており、Ｏ、Ｓ、Ｎから独立して選択されるヘテロ原子が、またはＮＲａ−Ｒｂ、−ＮＲａ−ＣＯ−Ｒｂ、−ＣＯ−ＮＲａ−Ｒｂ、−ＣＯ−Ｒａ（式中、Ｒａ、Ｒｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から独立して選択される基が任意選択的に散在する直鎖、分岐鎖、単環式もしくは多環式の飽和、部分不飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ１２炭化水素鎖である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ５およびＲ６はＨである）の化合物である。いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はＨである）の化合物である。好ましくは、ｎは０である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうちの１つは、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニルまたは置換アリールであり、すべての他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＨであり；Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はＨであり；Ｘは、Ｈまたは電子吸引基であり；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）の化合物である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１はアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ２はアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ３はアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ４はアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ５はアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ６はアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ７はアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも２つはアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも３つはアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも４つはアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも５つはアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のそれぞれはアフィニティータグを含む。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つは、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニル、フルオロヘテロアルキルまたはフルオロ置換アリールである）の化合物である。いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも１つは、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニルまたはフルオロ置換アリールである）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６は、１個または複数のヘテロ原子を含むＣ１〜Ｃ２４アルキルである）の化合物である。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子は酸素である。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子は窒素である。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子は、異なるヘテロ原子の組合せである。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ７はＨである）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＨであり、Ｒ４はＣ１〜Ｃ２４アルキルである）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は水素であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキルまたはＣ６〜Ｃ２４アリールアルキルおよび置換等価物である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ８およびＲ９は水素である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ８またはＲ９のうちの１つはメチルである）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ８またはＲ９のうちの１つはハロゲンである）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｘは水素である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｘはハロ置換アルキルである）の化合物である。いくつかの実施形態において、ハロ置換アルキルは、ＣＦ３、ＣＦ２Ｈ、ＣＦＨ２、ＣＣｌ３、ＣＣｌ２ＨまたはＣＣｌＨ２である。いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、ＸはＣＦ３である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｆ、ＳＯ３Ｈ、ＮＯ２、ＳＯ２Ｒ１０、ＣＨ２ＳＯ２Ｒ１０、ＣＯＲ１０、ＣＨ２ＣＯＲ１０、ＮＯ２、ＣＨ２ＣＮまたはカルボニルであり、Ｒ１０は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルである）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、ｎは０である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６は、置換基
（式中、Ｗはフルオロ置換アルキル基であり、ｍは１〜１２である）である）の化合物である。いくつかの実施形態において、フルオロ置換アルキルは、１個〜２５個のフッ素原子を含む。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４において、置換基
（式中、Ｗはハロ置換アルキル基であり、ｍは１〜１２である）を含む式（Ｉ）の化合物である。いくつかの実施形態において、この置換基は、１個〜１４個の別のフッ素原子を含む。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６において、置換基
（式中、ｍは０〜６である）を含む式（Ｉ）の化合物である。いくつかの実施形態において、Ｒ５およびＲ６は水素である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６において、置換基
を含む式（Ｉ）の化合物である。いくつかの実施形態において、Ｒ５およびＲ６は水素である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６において、置換基
（式中、ｍは０〜６である）を含む式（Ｉ）の化合物である。いくつかの実施形態において、Ｒ５およびＲ６は水素である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４、Ｒ５およびＲ６はＨであり、Ｒ３またはＲ４は、１個または複数のヘテロ原子を任意選択的に含むＣ１〜Ｃ２４フルオロアルキルであり；ＸはＣＦ３であり；ｎは、０または１である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４、Ｒ５およびＲ６はＨであり、Ｒ３またはＲ４は、１個または複数のヘテロ原子を任意選択的に含むＣ１〜Ｃ２４アルキルであり；ＸはＣＦ３であり；ｎは、０または１である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、
（式中、Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２４置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり；Ｒ７は、ＨまたはＣＨ３である。Ｚは、ＣＲａＲｂ、Ｏ、ＳまたはＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；Ｚ’は、それぞれ独立してＯおよびＳから選択され；Ｘは、Ｈ、ＣＨ３または電子吸引基であり；ｎは、０、１または２である）である。いくつかの実施形態において、Ｒ１１はアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１１はアフィニティータグである。好ましくはｎは０である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、
（式中、Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２４置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり；Ｒ７は、ＨまたはＣＨ３である。Ｚは、ＣＲａＲｂ、Ｏ、ＳまたはＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。Ｘは、Ｈ、ＣＨ３または電子吸引基であり；ｎは、０、１または２である）である。いくつかの実施形態において、Ｒ１１はアフィニティータグを含む。好ましくはｎは０である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、
（式中、Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２３ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２３置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり；Ｒ７は、ＨまたはＣＨ３である。Ｚは、ＣＲａＲｂ、Ｏ、Ｓ、ＮＲａ、ＮＲａＣＯ、ＣＯＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲａおよびＲ１１は、Ｎと共に複素環を一緒に形成し；Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルであり；ｎは、０または１であり、Ｒ１１はアフィニティータグを含む）である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２３ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２３置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり、ただし、Ｒ１１およびＲ１２のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含むものとし；Ｒ７は、ＨまたはＣＨ３である。Ｚは、それぞれ独立してＣＲａＲｂ、Ｏ、Ｓ、ＮＲａＣＯ、ＣＯＮＲａまたはＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲａおよびＲ１１もしくはＲａおよびＲ１２は、Ｎと共に複素環を一緒に形成し；Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルであり；ｎは、０または１である）である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、
（式中、Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２４置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり；Ｘは電子吸引基であり；ｎは、０、１または２である）である。いくつかの実施形態において、Ｒ１１はアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、少なくとも４個のフッ素原子で任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｘは、ＣＦ３、ＣＦ２Ｈ、ＣＦＨ２、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＳＯ３Ｈ、ＮＯ２、ＣＮまたはカルボニルである。いくつかの実施形態において、Ｘは、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルである。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２４置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり；Ｒ７は、ＨまたはＣＨ３である。Ｚは、それぞれ独立してＣＲａＲｂ、Ｏ、ＳまたはＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただし、Ｒ１１およびＲ１２は、サイクルを一緒に形成せず；Ｚ’は、それぞれ独立してＯおよびＳから選択され；Ｘは、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、モノ、ビスまたはトリスハロ置換メチルであり；Ｘ１は、ビニル、アセチレン、フェニルまたは任意の置換等価物であり；ｎは、０、１または２である）である。いくつかの実施形態において、Ｘは、ＣＦ３、ＣＦ２Ｈ、ＣＦＨ２、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＳＯ３Ｈ、ＮＯ２、ＣＮまたはカルボニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１およびＲ１１はアフィニティータグを含み、またはアフィニティータグである。好ましくはｎは０である。
適したオルトエステルリンカーには、
の構造のうちの１つを有するオルトエステルリンカーが含まれる。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、
（式中、Ｚは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＲａまたはＮＲａＣＯ（式中、Ｒａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）であり；Ｒ７は、Ｈ、メチル、エチル．ｎ−プロピル、フェニルまたはベンジルであり；Ｘは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルまたはシアノ−であり；ｍは、０〜１２の整数であり；ｎは、１または２である）
の構造を有するフルオラスオルトエステルリンカーである。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、
（式中、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環であり；Ｘは電子吸引基であり；ｍおよびｎのそれぞれは、独立して１、２、３または４である）
である。
別の実施形態において、本発明は、式（ＩＩ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、置換アリール、置換ヘテロアリールまたは置換ヘテロシクリルであり；Ｙは脱離基であり；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）
のオルトエステルリンカーを提供する。好ましくは、Ｒ７はＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つは、ＣＦ３−（ＣＦ２）ｑ−（ＣＲ１２Ｒ１３）ｐ−Ｚ−（ＣＲ１４Ｒ１５）ｍ（式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨまたはＣＲ１６Ｒ１７であり；（ＣＲ１２Ｒ１３）、（ＣＲ１４Ｒ１５）および（ＣＲ１６Ｒ１７）のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ３アルキレン、ハロ置換Ｃ１〜Ｃ３アルキレン、Ｃ２〜Ｃ３アルケニレン、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ３アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ３アルキニレン、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ３アルキニレン、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−またはＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−であり；ｍは、１または２であり；ｐは、０、１または２であり；ｑは、０〜７の整数である）である。
いくつかの実施形態において、脱離基ＹはＯ−Ｙ’であり、式ＨＯ−Ｙ’のアルコールから誘導される。いくつかの実施形態において、Ｙ’はＣ１〜Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｙ’は、置換Ｃ１〜Ｃ８アルキル、好ましくはハロ置換アルコールである。いくつかの実施形態において、Ｙ’は、ビニル、アセチレン、フェニルまたは任意の置換等価物であり、ここで（１個または複数の）置換基は電子吸引基ＥＷＧである。いくつかの実施形態において、Ｙ’は、メチル、エチルまたは任意の置換等価物であり、ここで置換基は、ハロ、シアノまたはニトロである。いくつかの実施形態において、式ＨＯ−Ｙ’のアルコールは、約８〜約１５の、好ましくは約９〜１３のｐＫａを有する。
いくつかの実施形態において、式ＨＯ−Ｙ’のアルコールは、メタノール、エタノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、２，２，２−トリクロロエタノール、２，２−ジフルオロエタノール、２，２−ジクロロエタノール、２−メトキシエタノール、ヒドロキシアセトアルデヒド、２−プロペン−１−オール、２−シリルエタノール、１−ヒドロキシ−２−プロピン、２−クロロエタノール、２−フルオロエタノール、３−ブテニルアルコール、３−ブチン−１−オール、２−ブチン−１−オール、２，３−ブタジエン−１−オール、１−クロロ−２−プロパノール、１−フルオロ−２−プロパノール、２−シアノエタノール、２−（メチルチオ）エタン−１−オール、２−ブテン−１−オール、２−クロロ−１−プロパノール、２−エトキシエタノール、２−クロロ−１−プロパノール、１−ヒドロキシ−２−プロパノン、２，２−ジフルオロエタノール、３−フルオロ−１−プロパノール、２−メチル−３−ブチン−１−オール、２，２−ジクロロエタノール、４−ペンテン−２−オール、３−クロロ−１−プロパノール、４−ペンチン−２−オール、２−フルオロ−１−プロパノール、２−メチレン−１−ブタノール、２−メチル−３−ブテン−１−オール、１−クロロ−１−プロパノール、１−シクロプロペン−１−メタノール、２−フルオロ−１−プロパノール、２−シクロプロペン−１−メタノール、３−メチル−３−ブテン−１−オール、１，４−ペンタジエン−３−オール、１−ペンテン−４−イン−３−オール、３，４−ペンタジエン−２−オール、２−メチル−２，３−ブタジエン−１−オール、３−ペンチン−２−オール、２−メチル−２−ブテン−１−オール、４−メチル−１−ペンテン−３−オール、４−ペンチン−１−オール、３，４−ペンタジエン−１−オール、２−ペンチン−１−オール、３−メチル−２−メチレン−１−ブタノール、３−ヒドロキシ−２−メチルプロパナール、３−メチル−２−ブテン−２−オール、３−ヒドロキシブタナール、２−シクロプロペン−１−オール、３−ヒドロキシブタナール、１−メトキシ−２−プロパノール、２−（１−メチルエトキシ）エタノール、４−メトキシ−１−ブタノール、２−（２−メトキシエトキシ）エタノール、α−メチルシクロプロパンメタノール、３−メチル−４−ペンテン−２−オール、３−メトキシ−１−プロパノール、２−メチル−１−ペンテン−３−オール、１−エトキシエタノール、３−ペンチン−１−オール、３−ペンチン−１−オール、２−ペンテン−１−オール、４−ヒドロキシブタナール、４−ヒドロキシブタナール、２−ヒドロキシブタナール、２−ペンテン−３−オール、２，３−ジメチル−３−ブテン−１−オール、３−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリル、３−メチレン−２−ペンタノール、２−エチル−３−ブテン−１−オール、３，４−ジメチル−２−ペンタノール、２−クロロ−２−プロパノール、１−（メチルジオキシ）エタノール、２−エチル−３−ブチン−１−オール、ベンゼンメタノール、２−（エチルチオ）エタノール、３−エトキシ−１−プロパノール、１−クロロ−３−フルオロ−２−プロパノール、１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、２−３−ヒドロキシ−ブタノン、２−メチル−１−ヘキサノール、２−（エテニルオキシ）エタノール、２，２−ジメチル−３−ブテン−１−オール、４−メチル−４−ペンテン−２−オール、２−プロポキシエタノール、３−ヒドロキシブタンニトリル、２−フルオロ−２−プロペン−１−オール、２，４−ジメチル−１−ペンタノール、１−メトキシ−１−プロパノール、２，３−ジメチル−２−ブテン−１−オール、３−クロロ−２−プロペン−１−オール、３−ペンテン−１−オール、２，４−ペンタジイン−１−オール、２，２−ジメチル−３−ブチン−１−オール、２−エチル−２，３−ブタジエン−１−オール、３−クロロ−２−プロピン−１−オール、１，１−ジフルオロ−２−プロパノール、１，５−ヘキサジイン−３−オール、２，３−ヘキサジエン−１−オール、２−ペンテン−２−オール、１−メトキシ−１，２−エタンジオール、２−メチレン−３−ブチン−１−オール、２−（クロロメトキシ）エタノール、α−メチル−１−シクロプロペン−１−メタノール、２−ヒドロキシブタンチアール、１−クロロ−２−メチル−１−プロパノール、３−（メチルチオ）−１−プロパノール、１−ヘキシン−３−オール、３−クロロ−２−ブタノール、１，５−ヘキサジエン−３−オール、５−ヘキシン−１−オール、１−クロロ−２−ブタノール、１−メチルシクロプロパンメタノール、４−ペンテン−２−イン−１−オール、５−ヒドロキシペンタナール、４−メチル−３−ペンテン−２−オール、１−ヘキセン−３−オール、１−ヒドロキシ−２−ブタノン、３，４−ヘキサジエン−１−オール、３−クロロ−２−メチル−１−プロパノール、２−メトキシ−１−ブタノール、２−エトキシ−１−プロパノール、５−ヘキシン−３−オール、３−メトキシ−２−ブタノール、２−メチル−１，４−ペンタジエン−３−オール、２−メチル−１−ペンテン−４−イン−３−オール、４，５−ヘキサジエン−３−オール、２−（メチルチオ）−１−プロパノール、２，５−ヘキサジイン−１−オール、２−（ヒドロキシメチル）ブタナール、３−フルオロ−２−ブタノール、２−（ヒドロキシメチル）−２−プロペナール、２−エテニル−３−ブテン−１−オール、１−（エチルチオ）エタノール、２−シクロブテン−１−メタノール、２−ヒドロキシ−３−ブテナール、２−（１−メチルエチル）−３−ブテン−１−オール、１−シクロプロペン−１−エタノール、１−フルオロ−２−ブタノール、３−フルオロ−２−メチル−１−プロパノール、１−（１−メチルエトキシ）エタノール、３−ヒドロキシ−１−ブテン−１−オン、３−ヘキシン−２−オール、４−エトキシ−１−ブタノール、４−フルオロ−１−ブタノール、５−ヘキセン−２−オール、２−ヘキシン−１−オール、４−クロロ−１−ブタノール、３−ヘキシン−１−オール、１−エトキシ−２−プロパノール、４−クロロ−２−ブタノール、４−メチル−２，３−ペンタジエン−１−オール、２，４−ペンタジエン−１−オール、３−プロポキシ−１−プロパノール、２−メチレン−１−ペンタノール、２，４−ペンタジエン−１−オール、２−ペンテン−４−イン−１−オール、２−メチル−４−ペンテン−１−オール、１−（メチルチオ）−２−プロパノール、４−メチル−２−ペンチン−１−オール、３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロパンニトリル、４−（メチルチオ）−１−ブタノール、２−クロロ−１−ブタノール、４，４−ジメチル−１−ペンチン−３−オール、４，５−ヘキサジエン−１−オール、３−メチル−４−ペンテン−１−オール、３−メチレン−１−ペンタノール、２，４−ヘキサジイン−１−オール、２−（２−ヒドロキシエトキシ）アセトアルデヒド、４，５−ヘキサジエン−２−オール、３−メチル−２−メチレン−３−ブテン−１−オール、２−メチル−３，４−ペンタジエン−１−オール、２−シクロプロピリデンエタノール、４−ヒドロキシ−３−メチルブタナール、４−３−メチレン−ペンテン−２−オール、２，３−ヘプタジエン−１−オール、２，５−ヘプタジイン−１−オール、３−メチル−４−ペンチン−１−オール、２−メチル−４−ペンチン−１−オール、１−シクロブテン−１−メタノール、２−フルオロ−１−ブタノール、３，４−ヘプタジエン−１−オール、４−フルオロ−２−ブタノール、２−（１−メチルエチル）−２，３−ブタジエン−１−オール、４−メチル−３−メチレン−２−ペンタノール、３−ヒドロキシ−２−メチルブタンニトリル、１−１−メトキシ−２−メチル−プロパノール、３−エチル−３，４−ペンタジエン−２−オール、１−メチル−２−シクロプロペン−１−メタノール、３−ヘキセン−１−オール、２−クロロ−２−メチル−１−プロパノール、４−ヒドロキシブタンニトリル、２−チイランメタノール、３−クロロ−１−ブタノール、２−ヘキセン−１−オール、３−メトキシ−１−ブタノール、５−ヘキセン−２−イン−１−オール、２−（エテニルチオ）エタノール、２−フルオロ−２−メチル−１−プロパノール、４−メチル−２−ペンテン−１−オール、３−ヘプチン−１−オール、３−（エチルチオ）−１−プロパノール、２−［（１−メチルエチル）チオ］エタノール、４−メトキシ−２−ブタノール、４−ヘキシン−２−オール、１−メトキシ−２−ブタノール、３，３−ジフルオロ−１−プロパノール、３−フルオロ−１−ブタノール、２−クロロ−１−メトキシエタノール、２，３，５−ヘキサトリエン−１−オール、２−（ヒドロキシメチル）ブタンニトリル、２，４，６−ヘプタトリイン−１−オール、１−フルオロ−３−メチル−２−ブタノール、２−シクロブテン−１−オール、２−ブトキシエタノール、２−クロロ−２，２−ジフルオロエタノール、２−オキシランメタノール、１−クロロ−３−ブテン−２−オール、１−プロポキシ−２−プロパノール、３−ヘプテン−１−オール、２−プロポキシ−１−プロパノール、２−（プロピルチオ）エタノールまたは３−シクロペンテン−１−メタノールである。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６は、１個または複数のヘテロ原子を含むＣ１〜Ｃ２４アルキルである）の化合物である。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子は酸素である。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子はＮである。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子は、異なるヘテロ原子の組合せである。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩ）（式中、Ｒ７はＨである）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４のうちの１つ、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はＨであり、Ｒ３またはＲ４のうちの他の１つは、Ｃ１〜Ｃ２４アルキルまたはＣ１〜Ｃ２４ヘテロアルキルである）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ７は水素であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ２４アルキルまたはＣ１〜Ｃ２４ヘテロアルキルである）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩ）（式中、ｎは０である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩ）（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＨであり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ２４アルキルまたはＣ１〜Ｃ２４ヘテロアルキルであり；ｎは、０または１である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、本発明は、式（ＩＩＩ）
（式中、Ｘ１およびＸ２のそれぞれは、独立してＨまたは電子吸引基であり；ｍは、１または２であり；ｎは、４〜１２の範囲の整数である）
のオルトエステルリンカーを提供する。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩＩ）（式中、Ｘ１またはＸ２は、Ｈ、ＣＨ３またはＣＦ３である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩＩ）（式中、Ｘ１およびＸ２は、Ｈ、ＣＨ３またはＣＦ３である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩＩ）（式中、Ｘ１およびＸ２はＣＦ３である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩＩ）（式中、ｍは１である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩＩ）（式中、ｎは、６〜１２の整数である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩＩ）（式中、ｎは、８〜１２の整数である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩＩａ）
（式中、Ｘ１は、Ｈ、Ｆ、保護されたアミノ基、保護されたカルボン酸、Ｃ２アルケニル基またはＣ２置換アルケニル基、Ｃ２アルキニル基またはＣ２置換アルキニル基であり；Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃ１−３ヘテロアルキルまたはＣ１−３置換アルキルであり；Ｘ２は、Ｈ、ＣＨ３またはＣＦ３であり；ｎは、１または２であり；ｍは、０〜１２の範囲の整数である）
の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、式（ＩＩＩａ）（式中、Ｘ１は、Ｈ、Ｆ、アジド、保護されたスルフヒドリル、保護されたポリスルフヒドリル、ポリヒスチジン、保護されたアミノ基、保護されたヒドラジド基、保護されたオキシアミン基、シクロオクチン、共役ジエン、Ｃ２アルケニル基、Ｃ２置換アルケニル基、Ｃ２アルキニル基またはＣ２置換アルキニル基であり；Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃ１−３ヘテロアルキルまたはＣ１−３置換アルキルであり；Ｘ２は、Ｈ、ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルまたはシアノ−であり；ｎは、１または２であり；ｍは、０〜１２の範囲の整数である）の化合物である。
いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、
である。
本発明のオルトエステルリンカーは、任意の適した方法を使用して調製することができる。いくつかの実施形態において、オルトエステルリンカーは、酸の存在下、１，２−ジオール、１，３−ジオールまたは１，４−ジオールをアルコールと反応させることにより生成される。いくつかの実施形態において、酸は準化学量論的な量で使用される。いくつかの実施形態において、酸はブレンステッド酸である。いくつかの実施形態において、酸はルイス酸である。特定の実施形態において、酸は、（例えば、約０．２Ｍ以下の濃度の）希鉱酸である。いくつかの実施形態において、アルコールは、約３０℃〜約１２０℃の沸点を有する。したがって、いくつかの実施形態において、アルコールは、約３０℃〜約１２０℃、約３０℃〜約１１０℃、約３０℃〜約１００℃、約３０℃〜約９５℃、約３０℃〜約９０℃、約３０℃〜約８５℃、約３０℃〜約８０℃、約３０℃〜約７５℃、約３０℃〜約７０℃、約３０℃〜約６５℃、約３０℃〜約６０℃、約３０℃〜約５５℃、約３０℃〜約５０℃、約３５℃〜約１２０℃、約４０℃〜約１２０℃、約４５℃〜約１２０℃、約５０℃〜約１２０℃、約５５℃〜約１２０℃、約６０℃〜約１２０℃、約４０℃〜約１００℃、約５０℃〜約１００℃、約４０℃〜約９０℃または約４０℃〜約８０℃の沸点を有する。
別の実施形態において、本発明は、式（ＩＶ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、置換アリール、置換ヘテロアリールまたは置換ヘテロシクリルであり；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）の部分を含むオリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート）を提供する。好ましくは、Ｒ７はＨである。
ｎが２であるとき、オルトエステルリンカー部分は、以下の構造に示される７員環環状オルトエステルを形成し、Ｒ１基〜Ｒ６基のいずれかとして、それぞれ独立して定義される別の炭素上の２個の別のＲ基Ｒ’５およびＲ’６を有する：
式（ＩＶ）の部分において、波線と結ばれた酸素は、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端の酸素である。
式（ＩＶ）の部分（ｍｏｉｔｙ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの少なくとも１つは、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、任意の置換等価物またはそれらの組合せであってもよく、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルキル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、任意の置換等価物またはそれらの組合せであってもよく；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含み；ただし、前記部分は、
ではない。
これらのオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートのいくつかにおいて、ｎ＝０であり、アフィニティータグは、少なくとも３のｃＬｏｇＰ値を有するフルオラスタグまたは疎水性タグである。
これらのオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートには、オリゴヌクレオチドがオリゴリボ核酸（ＲＮＡ）を含むものが含まれる。
オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも１つは、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニル、フルオロ置換アリール、フルオロ置換ヘテロアルキル、フルオロ置換ヘテロアルケニル、フルオロ置換ヘテロアルキニルまたはフルオロ置換ヘテロシクリルであってもよい。
オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも１つはフルオラスタグであってもよく、Ｒ７を含む残りのＲ基はＨであってもよい。
オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも２つはフルオラスタグであってもよい。
オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートにおいて、式（ＩＶ）の部分は、
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２３ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２３置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり、ただし、Ｒ１１およびＲ１２のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含むものとし；Ｒ７は、Ｈ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、フェニルまたはベンジルであり；Ｚは、それぞれ独立してＣＲａＲｂ、Ｏ、ＳまたはＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲａおよびＲ１１もしくはＲａおよびＲ１２は、Ｎと共に複素環を一緒に形成し；ｎは、０、１または２である）
からなる群から選択されてもよい。
式（ＩＶ）の部分は、
（式中、Ｘ１は、Ｈ、Ｆ、アジド、保護されたスルフヒドリル、保護されたポリスルフヒドリル、ポリヒスチジン、保護されたアミノ基、保護されたヒドラジド基、保護されたオキシアミン基、マレイミド、シクロオクチン、共役ジエン、Ｃ２アルケニル基、Ｃ２置換アルケニル基、Ｃ２アルキニル基またはＣ２置換アルキニル基であり；Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃ１−３ヘテロアルキルまたはＣ１−３置換アルキルであり；ｎは、１または２であり；ｍは、０〜１２の範囲の整数である）
の構造を有してもよい。
式（ＩＶ）の部分は、
からなる群から選択されてもよい。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’位においてオルトエステルリンカーに結合されている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、３’位においてオルトエステルリンカーに結合されている。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはリボ核酸（ＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも７５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、式（ＩＶ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４は、ヘテロ原子を含むＣ１〜Ｃ２４アルキルである）の部分を含む。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子は酸素である。
いくつかの実施形態において、ｎは０である。
いくつかの実施形態において、Ｒ５はＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ６はＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は水素であり、Ｒ４は、Ｃ６〜Ｃ２４アリールアルキルまたは置換等価物である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＨであり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ２４アルキルまたは置換アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＨであり、Ｒ４は、１個または複数のヘテロ原子を任意選択的に含むＣ１〜Ｃ２４アルキルであり；ｎは、０または１である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｃ４〜Ｃ２４アルキルまたはヘテロアルキルであり、少なくとも９個のフッ素原子を含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、部分
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、置換アリール、置換ヘテロアリールまたは置換ヘテロシクリルであり；Ｘは、Ｈ、Ｆ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシルまたはアルコキシアルキルであり；ｎは、０、１または２であり；Ｂはヌクレオシド塩基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）
を含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、部分
（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環であり；Ｘは、Ｈ、Ｆ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシルまたはアルコキシアルキルであり；ｍおよびｎのそれぞれは、独立して０、１または２であり；Ｂはヌクレオシド塩基である）
を含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、部分
（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環であり；Ｘは、Ｈ、Ｆ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシルまたはアルコキシアルキルであり；Ｂはヌクレオシド塩基である）
を含む。
別の実施形態において、本開示は、式（ＩＶ）
の部分を含むオリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート）を合成する方法を提供する。
この方法は、オリゴヌクレオチドをオルトエステルリンカーと接触させて、式（ＩＶ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、置換アリール、置換ヘテロアリールまたは置換ヘテロシクリルであり；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）の部分を含むオリゴヌクレオチドを生成するステップを含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを、酸の存在下、オルトエステルリンカーと反応させる。いくつかの実施形態において、この反応は酸触媒交換反応である。いくつかの実施形態において、酸はブレンステッド酸である。いくつかの実施形態において、酸はルイス酸である。いくつかの実施形態において、酸は、鉱酸、例えば塩酸、硫酸または硝酸である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを、約０．２Ｍ以下の酸濃度の鉱酸の存在下、オルトエステルと反応させる。いくつかの実施形態において、酸は、有機酸、例えば酢酸、またはその誘導体、例えばジ−もしくはトリ−クロロ酢酸、ギ酸、安息香酸、トルエンスルホン酸およびトリフル酸である。いくつかの実施形態において、酸は、酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５．５）、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ、ＳｉＯ２、モンモリロナイト−Ｋ１０、モンモリロナイト−ＫＳＦまたはＡｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５である。
いくつかの実施形態において、以下の例示的な例に示す通り酸触媒反応を経由してカップリングされた後、デブロッキングステップにより最終のヌクレオチドシントン上で遊離されるヒドロキシル基とオルトエステルリンカーが反応する。
いくつかの実施形態において、モノマーシントンのブロッキング基のうちの１つにオルトエステルリンカーが存在し、以下の例示的な例に示す通り最終のカップリングステップにおいて、その独特のモノマーシントンが使用される。
特定の実施形態において、以下の例に示す通り、オルトエステルリンカーがオリゴヌクレオチドに結合された後、アフィニティータグがこのリンカーに結合される。以下でＲ基により表されるアフィニティータグは、脱保護および固体担体からの切断の前にオリゴヌクレオチドに結合され得るか、または脱保護および固体担体からの切断の後にオルトエステルリンカーに結合され得る。Ｒ基は、任意のアフィニティータグであり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ基は、フルオロ置換アルキル置換基、フルオロ置換アルケニル置換基、フルオロ置換アルキニル置換基およびフルオロ置換アリール置換基から選択されるアフィニティータグである。いくつかの実施形態において、Ｒ基は、オレフィンメタセシス、環化付加反応（例えば、ディールス−アルダー反応、４＋１環化付加、３＋２環化付加、ノルボルネン環化付加、オキサノルボルナジエン環化付加）、クリックケミストリー（例えば、テトラゾールフォトクリックケミストリー、銅触媒クリックケミストリー、歪み促進型クリックケミストリー）、鈴木クロスカップリング、シュタウディンガーライゲーション、マイケル付加、クアドリシクランライゲーション、テトラジンライゲーションまたは酸化カップリングを使用してオルトエステルリンカーに結合され得る。当技術分野において周知の他のコンジュゲーションスキームを使用して、アフィニティータグをオルトエステルリンカー部分に結合することができる。これらのコンジュゲーションの非限定的な例には、Ｎ−ヒドロスクシンアミド（ＮＨＳ）部分または他の活性化エステルとのアミン末端部分の反応、アルファ−ハロカルボニル含有部分とのチオール末端部分の反応などが含まれる。
特定の実施形態において、オルトエステルリンカーは、保護基との反応がブロックされている化学的部分（例えば、チオール、アミン、アルコールなど）を含む。オルトエステルリンカーの結合後、保護基は除去することができて、化学的部分は、固相上の別の化学的部分と共有結合的および特異的に反応することができる。
オルトエステル保護基を除去するために、任意の適した方法を使用してオリゴヌクレオチドが脱保護されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、酸を使用して脱保護される。いくつかの実施形態において、酸は触媒量（すなわち、準化学量論的な量）である。いくつかの実施形態において、酸はブレンステッド酸である。いくつかの実施形態において、酸はルイス酸である。いくつかの実施形態において、酸は、鉱酸、例えば塩酸、硫酸または硝酸である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、約０．２Ｍ以下の酸濃度の鉱酸の存在下、脱保護される。いくつかの実施形態において、酸は、有機酸、例えば酢酸、ギ酸、安息香酸、トルエンスルホン酸およびトリフル酸である。いくつかの実施形態において、酸は、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ、ＳｉＯ２、モンモリロナイトＫ１０、モンモリロナイト−ＫＳＦまたはＡｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５である。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、弱酸性条件下で脱保護される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、約３以上のｐＨにおいて脱保護される。したがって、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、約３以上、約３．５以上、約４以上、約４．５以上、約５以上、約５．５以上、約６以上、約６．５以上または約７以上のｐＨにおいて脱保護される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約３〜約７のｐＨにおいて脱保護される。したがって、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約３〜約７、約３．５〜約７、約４〜約７、約４．５〜約７、約５〜約７、約５．５〜約７、約６〜約７、約３〜約６．５、約３〜約６、約３〜約５または約４〜約６のｐＨにおいて脱保護される。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド生成物は、オルトエステルの除去後、少なくとも約６０％の純度を有する。したがって、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド生成物は、オルトエステルの除去後、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９５％または少なくとも約９９．９９％の純度を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド生成物は、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下、約０．１％以下、約０．０５％以下または約０．０１％以下の量の１種または複数種の不純物を含む。
本開示のオリゴヌクレオチドは、任意の適したクロマトグラフ法を使用して精製することができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、フルオラスアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、カラムクロマトグラフィーを使用して精製される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、液体クロマトグラフィー（例えば、高圧液体クロマトグラフィー）を使用して精製される。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、フルオラスアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される。フルオラスアフィニティークロマトグラフィーは、フッ素化化合物が、他のフッ素化化合物に対する親和性を有する傾向があるという親フッ素性の概念を利用する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、フルオラスタグを含むオルトエステルに結合されている。オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、フルオラスカラムを通過する。フルオラスカラムは一般に、フッ素化有機基が結合されているポリマー樹脂を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートはカラムに強く結合する一方、標識されていない不純物（例えば、短縮化配列または失敗した配列）はカラムと相互作用せず、カラムを通過する。その後の洗浄では、フルオラスカラムとの親フッ素性相互作用の強度のために、フッ素化オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートはカラムから放出されない。すべての不純物がカラムから除去された後、オルトエステル保護基からのオリゴヌクレオチドの切断を経て、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートがカラムから放出される。オリゴヌクレオチドは弱酸性条件下で一般に切断され、これにより、オリゴヌクレオチドとフルオラスカラムとの間の相互作用が破壊される。次いで、適切な溶媒を使用してオリゴヌクレオチドがカラムから溶離され、精製オリゴヌクレオチドが得られる。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、オルトエステルリンカーに結合されており、精製のためにＨＰＬＣシステムに導入される。オルトエステルオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、少なくとも１種の不純物を含む混合物としてＨＰＬＣに一般に導入される。いくつかの実施形態において、本方法は、同様のサイズの不純物からのオリゴヌクレオチド生成物の分離を可能にする。少なくとも１種の不純物は、任意のタイプのものであってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１種の不純物は、オリゴヌクレオチド合成中に生成された短縮化配列または失敗配列である。いくつかの実施形態において、オルトエステルオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、逆相ＨＰＬＣを使用して精製される。そのような実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、逆相カラム（例えば、Ｃ５またはＣ１８炭化水素カラム）上で精製される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、順相ＨＰＬＣカラム上で精製される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、ＨＰＬＣシステムから回収され、脱保護されて、所望のオリゴヌクレオチドを与える。ＨＰＬＣシステムは、インジェクター、ポンプ、ＨＰＬＣカラムおよび検出器を備え得る。いくつかの実施形態において、検出器は、吸光度検出器（例えば、ＵＶ／ＶＩＳまたはＰＤＡ）、示差屈折率検出器、散乱検出器（例えば、蒸発または多角度）、質量分析計、伝導度検出器、蛍光検出器、化学発光検出器、旋光検出器または電気化学検出器である。いくつかの実施形態において、ＨＰＬＣシステムは、三連四重極ＬＣ−ＭＳ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＬＣ−ＭＳ、イオントラップＬＣ−ＭＳまたはＴＯＦ ＬＣ−ＭＳである。いくつかの実施形態において、精製方法は、部分的または完全に自動化されている。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートは、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート上にアフィニティー部分を結合する化合物を含むカートリッジを使用して精製される。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、マルチプレックス合成プラットホーム上で合成され、オリゴヌクレオチドの単離は、マルチプレックス精製プラットホーム上で並行して実施される。
いくつかの実施形態において、マルチプレックス合成または精製プラットホームは、４個、１２個、４８個、９６個、１９２個または３８４個のオリゴヌクレオチド合成の精製を並行して実施することを可能にする。
本発明のいくつかの化合物は不斉中心を含み得、したがって、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、ジアステレオマー混合物ならびに個々のジアステレオマーとして存在し得る。別の不斉中心が、分子上の様々な置換基の性質に応じて存在し得る。そのような不斉中心はそれぞれ独立して２種の光学異性体を生じ、混合物中の可能性のある光学異性体およびジアステレオマーのすべてが、純粋な化合物または部分的に精製された化合物として、本発明の範囲内に含まれることが意図される。本発明は、これらの化合物のすべてのそのような異性体型を包含することを意図する。
図１を参照すると、これは、固体担体上でのオリゴヌクレオチドの典型的な化学合成の概略図である。典型的な望ましいオリゴヌクレオチド生成物は、隣接するヌクレオチドの５’ヒドロキシルと３’ヒドロキシルとの間にヌクレオチド間結合を含む。この合成を達成するために、合成サイクルの第１のステップは一般に、表面に結合されたヌクレオシドとの保護されたモノマーの反応または表面上のヒドロキシル基との保護されたモノマーの反応である。表面上のヒドロキシル基は、切断可能なユニバーサルリンカーまたは切断可能でない表面結合の一部のいずれかであり得る。表面上のヒドロキシルとの反応性リン基の最初のカップリングの後、通常続くステップは、未反応のヒドロキシル基のキャッピング、次いで、反応性リン中間体の酸化を含む。ある修飾リン基が使用されているある条件下では、酸化試薬が修飾リン基、例えばホスホロチオエート、ボラノホスホネートまたはホスホルアミデートを生成する場合特に、キャッピングの前に酸化する必要がある場合がある。最終ステップは通常、次の保護されたヌクレオチドモノマーとカップリングするヒドロキシル基のデブロッキングである。この最終ステップにおいて除去される保護基は一般にジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）である。しかし、多くの他の保護基、例えば、９−フェニルキサンチル基（ピキシル）、ベンズヒドリルオキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル（ＢＺＨ）などが当技術分野において周知である。鎖の構築が完了すると、所望の生成物が固相から放出され、脱保護され、さらなる生物学的応用において利用される。
図２を参照すると、これは、固体担体上での化学合成において得られた粗オリゴヌクレオチド混合物のダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）スペクトルを示す。この混合物は、全長標的オリゴヌクレオチドおよび合成の副生成物である複数の失敗短縮化オリゴヌクレオチドを含む。図２に示す通り、全長標的オリゴヌクレオチドが最大ピークである。
図３を参照すると、これは、オリゴヌクレオチドの典型的な化学合成の概略図であり、ここで、全長オリゴヌクレオチドがその５’末端上にジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を持つ間、短縮化配列または失敗配列の５’ヒドロキシルがアセチル保護基でキャッピングされ、全長オリゴヌクレオチドの５’位におけるＤＭＴ基の特異的除去およびオルトエステルリンカーの領域特異的な付加が可能になった。
図４を参照すると、これは、５’−３’および５’−２’結合されたＲＮＡ生成物の混合物を生じるＲＮＡのヌクレオチド間結合の酸切断およびヌクレオチド間結合の異性化の概略図である。
図５を参照すると、これは、非環状オルトエステルリンカーによりオリゴヌクレオチドを保護する概略図である。上のパネルにおいて、アフィニティータグは、オルトエステルリンカーの中心炭素に結合されたＲ基上に位置する。このオルトエステルリンカーとのオリゴヌクレオチドの反応は、１つのアフィニティータグを有するオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを与える。下のパネルにおいて、アフィニティータグは、オルトエステルリンカーの３個すべてのＲ基上に位置する。この反応は、２つのアフィニティータグを有するオルトエステルリンカーコンジュゲートオリゴヌクレオチドを与える。
図６を参照すると、上のパネルは、環状オルトエステルによるオリゴヌクレオチドの保護の概略図である。下のパネルは、オルトエステル保護基の酸促進切断の概略図である。
図７を参照すると、これは、フルオラスアフィニティータグを含むオルトエステルリンカーを使用する、オリゴヌクレオチドの精製ワークフローの概略図である。このワークフローは４ステッププロセスを示し、ここで、オリゴヌクレオチドがまず、ステップａにおいてフルロロ置換オルトエステルリンカーとコンジュゲートする。ステップｂにおいて、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分が脱保護され、固体担体から切断される。ステップｃにおいて、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートが、フルオラスアフィニティータグを使用して、ＨＰＬＣまたは固相抽出カラムのいずれかにより精製される。ステップｄにおいて、フルオロ置換オルトエステルリンカーがオリゴヌクレオチドから切断され、所望の精製生成物オリゴヌクレオチドを与える。
図８を参照すると、これは、アフィニティータグを使用することによりオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを精製するためにオルトエステル保護基およびクロマトグラフ分離を使用する精製戦略を示す。
本開示を読むことで当業者には明らかになるであろう通り、本明細書において説明および例示される個々の実施形態のそれぞれは、本教示の範囲または趣旨から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離することができる、またはそれらと容易に組み合わせることができる別々の成分および特徴を有する。記載された任意の方法を、記載された事象の順番で、または論理的に可能なその他の任意の順番で行うことができる。
［実施例１］
２−メトキシ−４−（（（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ）メチル）−１，３−ジオキソランの合成。３−［（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ］−１，２−プロパンジオール（１ｅｑ．、ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をトリフルオロトルエン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に２Ｍの濃度で溶解した。丸底フラスコ内で、オルトギ酸トリメチル（３ｅｑ．、Ａｌｄｒｉｃｈ）を無水シクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に３．５Ｍの濃度で溶解した。触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）をＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。撹拌しながら３−［（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ］−１，２−プロパンジオールのトリフルオロトルエン溶液を加え、フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。３時間後、反応が完了し、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。残留物を減圧下、分別蒸留（１０ｍｍＨｇにおいてｂ．ｐ．＝１３０〜１３５℃）により精製し、表題化合物を単離収率９４％で得た。
［実施例２］
４−（（（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ）メチル）−２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−１，３−ジオキソラン。丸底フラスコ内で、トリス（２，２，２−トリフルオロエチル）オルトギ酸（５０ｇ、１６１ｍｍｏｌ、ＳｙｎＱｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および３−［（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ］−１，２−プロパンジオール（２５ｇ、５７ｍｍｏｌ、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を８００ｍＬの無水シクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。トリフルオロトルエン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を５ｍＬずつ、溶液が透明になるまで加えた（３０ｍＬ）。触媒量のｐ−トルエンスルホン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）をＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、トリフルオロエタノールを６５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。３時間後、反応が完了し、フラスコを室温まで冷却した。反応混合物をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。残留物を減圧下、分別蒸留（０．０５ｍｍＨｇにおいてｂ．ｐ．＝９５〜１００℃）により精製し、表題化合物を単離収率７４％で得た。
［実施例３］
２−メトキシ−４−（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）−１，３−ジオキソランの合成。５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１０−トリデカフルオロデカン−１，２−ジオール（２５ｇ、６１ｍｍｏｌ、１ｅｑ．、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｈｅｍｈｅｒｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を３００ｍＬのシクロヘキサン／トリフルオロトルエン（Ａｌｄｒｉｃｈ）の９０／１０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物に２Ｍの濃度で溶解した。オルトギ酸トリメチル（９ｇ、８５ｍｍｏｌ、１．４ｅｑ．、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。４時間後、メタノール共沸混合物がさらに蒸留されないことから、反応が完了したとみなし、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。残留物を減圧下、分別蒸留（１０ｍｍＨｇにおいてｂ．ｐ．＝１２０〜１３０℃）により精製し、表題化合物を単離収率６４％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、４５１．１ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例４］
４−（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）−２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−１，３−ジオキソランの合成。丸底フラスコ内で、トリス（２，２，２−トリフルオロエチル）オルトギ酸（１．４ｅｑ．、４８ｍｍｏｌ、１５ｇ、ＳｙｎＱｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１０−トリデカフルオロデカン−１，２−ジオール（１４ｇ、３４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｈｅｍｈｅｒｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を２４０ｍＬの無水シクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。得られた溶液はわずかに濁っており、トリフルオロトルエン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液が透明になるまで滴加した（５ｍＬ）。触媒量のｐ−トルエンスルホン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）をＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、トリフルオロエタノールを６５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。１時間後、反応が完了し、フラスコを室温まで冷却した。反応混合物をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。残留混合物を減圧下、分別蒸留（０．０５ｍｍＨｇにおいてｂ．ｐ．＝８５〜１０４℃）により精製し、表題化合物を単離収率４４％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、５１９．１、５２０．１ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例５］
２−メトキシ−４−（３，３，４，４，５，５，６，６，６−ノナフルオロヘキシル）−１，３−ジオキソランの合成。５，５，６，６，７，７，８，８，８−ノナフルオロオクタン−１，２−ジオール（１ｅｑ．、６５ｍｍｏｌ、２０ｇ、Ｐｏｌｙｏｒｇ Ｉｎｃ．（レミンスター、ＭＡ））を３００ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。オルトギ酸トリメチル（２７．５ｇ、２６０ｍｍｏｌ、４ｅｑ．、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。残留混合物を減圧下、分別蒸留（１０ｍｍＨｇにおいてｂ．ｐ．＝８９〜１０５℃）により精製し、表題化合物を単離収率３２％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、３５１．１ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例６］
４−（３，３，４，４，５，５，６，６，６−ノナフルオロヘキシル）−２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−１，３−ジオキソランの合成。５，５，６，６，７，７，８，８，８−ノナフルオロオクタン−１，２−ジオール（２０ｇ、６５ｍｍｏｌ、１ｅｑ．、Ｐｏｌｙｏｒｇ Ｉｎｃ．（レミンスター、ＭＡ））を２００ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。トリス（２，２，２−トリフルオロエチ）オルトギ酸（６０ｇ、１９５ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．、ＳｙｎＱｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、トリフルオロエタノールを６５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。残留混合物を減圧下、分別蒸留（０．１ｍｍＨｇにおいてｂ．ｐ．＝９９〜１１６℃）により精製し、表題化合物を単離収率２０％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、４１９．１ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例７］
４−（２，２，３，３，４，４，５，５，５−ノナフルオロペンチル）−２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−１，３−ジオキソランの合成。１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロヘプタン−１，２−ジオール（２５ｇ、８５ｍｍｏｌ、１ｅｑ．、ＳｙｎＱｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（アラチュア、ＦＬ））を２５０ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。オルトギ酸トリメチル（１８ｇ、１７０ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを６５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。４時間後、トリフルオロエタノール共沸混合物がさらに蒸留されないことから、反応が完了したとみなし、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。残留混合物を減圧下、分別蒸留（１０ｍｍＨｇにおいてｂ．ｐ．＝１０５〜１１０℃）により精製し、表題化合物を単離収率３９％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、４０５．０ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例８］
４，５−ビス（（（３，３，４，４，５，５，５−ヘプタフルオロペンチル）オキシ）メチル）−２−メトキシ−１，３−ジオキソランの合成。（５−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イル）−メタノール（１０ｇ、６２ｍｍｏｌ、Ｃｏｍｂｉ−Ｂｌｏｃｋｓ，Ｉｎｃ．（サンディエゴ、ＣＡ））を２００ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解した。水素化ナトリウム（１０ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、９５％）をフラスコに加え、混合物を３０分間加熱還流し、次いで、室温まで徐冷した。１，１，１，２，２，３，３−ヘプタフルオロ−５−ヨードペンタン（４２．７ｇ、１２４ｍｍｏｌ、Ｏａｋｗｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（エスティル、ＳＣ））をフラスコに加え、反応物を２時間加熱還流した。反応物を室温まで冷却し、過剰の塩基を塩化アンモニウムの添加により中和し、溶媒をロータリーエバポレーターで減圧下で蒸発させた。粗混合物をジクロロメタンに溶解し、重炭酸ナトリウム、続いて水および塩水で抽出した。ジクロロメタン溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、酢酸エチルおよびヘキサンを使用してシリカゲルで出発材料から生成物を精製した。風袋を量ったフラスコ内で生成物分画を蒸発させ、２０．６ｇの黄色の粘性オイル（収率≒６０％）を得た。このオイルを２００ｍＬのメタノールに溶解し、氷／水浴中で０℃まで冷却した。最終濃度が９％になるまで撹拌しながら濃Ｈ２ＳＯ４を滴加し、反応物を２時間撹拌した。反応物を室温まで昇温させ、指示薬としてｐＨ紙を使用しながらトリエチルアミンを加え、酸を中和した。メタノールを蒸発乾固し、酢酸エチルおよびヘキサンを使用してシリカゲルで生成物を精製し、１３．６ｇの精製された１，４−ビス（（３，３，４，４，５，５，５−ヘプタフルオロペンチル）オキシ）ブタン−２，３−ジオールを得た。
１，４−ビス（（３，３，４，４，５，５，５−ヘプタフルオロペンチル）オキシ）ブタン−２，３−ジオール（２６．５ｍｍｏｌ、１３．６ｇ）を１５０ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。オルトギ酸トリメチル（５．６ｇ、５３ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。４時間後、メタノール共沸混合物がさらに蒸留されないことから、反応が完了したとみなし、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。残留混合物を減圧下、分別蒸留（１０ｍｍＨｇにおいてｂ．ｐ．＝１８５〜１９０℃）により精製し、表題化合物を単離収率６１％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、５５７．２ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例９］
２−メトキシ−４，５−ビス（２，２，３，３，４，４，５，５，５−ノナフルオロペンチル）−１，３−ジオキソランの合成。Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｐ．ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６２（２−３），１６１−７１；１９９３）によって記載された方法により、１，１，１，２，２，３，３，４，４，９，９，１０，１０，１１，１１，１２，１２，１２−オクタデカフルオロ−６，７−ドデカンジオールを調製した。ジオール（１２ｇ、２２．８ｍｍｏｌ）を１２０ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。オルトギ酸トリメチル（４．８ｇ、４５．６ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。４時間後、メタノール共沸混合物がさらに蒸留されないことから、反応が完了したとみなし、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。残留混合物を減圧下、分別蒸留（１０ｍｍＨｇにおいてｂ．ｐ．＝１６２〜１７３℃）により精製し、表題化合物を単離収率５２％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、５６９．１ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例１０］
４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１１−ヘプタデカフルオロ−Ｎ−（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）ウンデカンアミドの合成。ヘプタデカフルオロウンデカン酸のニトロフェニルエステル（ＳｙｎＱｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、アラチュア、ＦＬ）との３−アミノプロパン−１，２−ジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ）の反応により、Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１１−ヘプタデカフルオロウンデカンアミドを調製した。
ヘプタデカフルオロウンデカン酸（１０．０ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）、ｐ−ニトロフェノール（２．８ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（４．２ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（２５０ｍｇ）を３５０ｍＬの無水ジオキサンに溶解した。反応物を室温で一晩撹拌し、次いで、蒸発させてオイルを生成した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、（９：１で開始する）ヘキサン：酢酸エチルの勾配で溶離しながら生成物を精製した。生成物４−ニトロフェニル４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１１−ヘプタデカフルオロウンデカノエートを収率９０＋％で単離した。
４−ニトロフェニル４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１１−ヘプタデカフルオロウンデカノエート（１０ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）、３−アミノプロパン−１，２−ジオール（１．４ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．７ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２００ｍＬおよび８０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合物に溶解した。反応物を室温で３時間撹拌した。塩化メチレンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより反応混合物を精製し、生成物が単離収率８７％で生じた。
Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１１−ヘプタデカフルオロウンデカンアミド（８．６ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。オルトギ酸トリメチル（３．２ｇ、３０．４ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。４時間後、メタノール共沸混合物がさらに蒸留されないことから、反応が完了したとみなし、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。ジクロロメタンおよびトリエチルアミンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留混合物を精製し、表題化合物を単離収率６０％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、６０８．０ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例１１］
４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，９−トリデカフルオロ−Ｎ−（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）ノナンアミドの合成。実施例１０のために記載の通り、３−（ペルフルオロヘキシル）プロピオン酸のニトロフェニルエステル（ＳｙｎＱｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、アラチュア、ＦＬ）との３−アミノプロパン−１，２−ジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ）の反応により、Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，９−トリデカフルオロノナンアミドを調製した。
Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，９−トリデカフルオロノナンアミド、１０．０ｇ、２１．５ｍｍｏｌを１２０ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。オルトギ酸トリメチル（４．６ｇ、４３．０ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。４時間後、メタノール共沸混合物がさらに蒸留されないことから、反応が完了したとみなし、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。ジクロロメタンおよびトリエチルアミンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製し、表題化合物を収率７１％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、５０８．１ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例１２］
４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−Ｎ−（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）ヘキサンアミドの合成。実施例１０のために記載の通り、２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロヘキサン酸のニトロフェニルエステル（ＳｙｎＱｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、アラチュア、ＦＬ）との３−アミノプロパン−１，２−ジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ）の反応により、Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサンアミドを調製した。
Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサンアミド（１０．０ｇ、３１．７ｍｍｏｌ）を１６０ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。オルトギ酸トリメチル（６．７ｇ、６３．４ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。４時間後、メタノール共沸混合物がさらに蒸留されないことから、反応が完了したとみなし、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。ジクロロメタンおよびトリエチルアミンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留混合物を精製し、表題化合物を単離収率５５％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、３５８．１ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例１３］
Ｎ−（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）−３−（ペルフルオロフェニル）プロペンアミドの合成。実施例１０のために記載の通り、３−（ペンタフルオロフェニル）プロピオン酸のニトロフェニルエステル（ＳｙｎＱｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、アラチュア、ＦＬ）との３−アミノプロパン−１，２−ジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ）の反応により、Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−３−（ペルフルオロフェニル）プロパンアミドを調製した。
Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−３−（ペルフルオロフェニル）プロパンアミド（１０．０ｇ、３２．０ｍｍｏｌ）を１６０ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。オルトギ酸トリメチル（６．８ｇ、６４．０ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。４時間後、メタノール共沸混合物がさらに蒸留されないことから、反応が完了したとみなし、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。ジクロロメタンおよびトリエチルアミンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製し、表題化合物を単離収率７８％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、３５５．１ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例１４］
Ｎ，Ｎ’−（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４，５−ジイル）ビス（メチレン））ビス（３−（ペルフルオロフェニル）プロパンアミド）の合成。３−（ペンタフルオロフェニル）プロピオン酸のニトロフェニルエステル（ＳｙｎＱｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、アラチュア、ＦＬ）との１，４−ジアミノブタン−２，３−ジオール（Ｃｈｅｍｓｐａｃｅ、リガ、ラトビア）の反応により、Ｎ，Ｎ’−（２，３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジイル）ビス（３−（ペルフルオロフェニル）プロパンアミド）を調製した。
４−ニトロフェニル３−（ペルフルオロフェニル）プロパノエート（２０ｇ、５５．４ｍｍｏｌ）、１，４−ジアミノブタン−２，３−ジオール（３．３ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５．６ｇ、５５．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２５０ｍＬおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１００ｍＬの混合物に溶解した。反応物を室温で３時間撹拌した。塩化メチレン中のシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより反応混合物を精製し、生成物を単離収率８２％で得た。
Ｎ，Ｎ’−（２，３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジイル）ビス（３−（ペルフルオロフェニル）プロパンアミド）（１０．０ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解し、その結果、濁った溶液になり、次いで、トリフルオロトルエン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を滴加することにより、この溶液を透明にした。オルトギ酸トリメチル（３．８ｇ、３５．４ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。４時間後、メタノール共沸混合物がさらに蒸留されないことから、反応が完了したとみなし、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。ジクロロメタンおよびトリエチルアミンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留混合物を精製し、表題化合物を単離収率４１％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、６０７．２ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例１５］
Ｎ，Ｎ’−（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４，５−ジイル）ビス（メチレン））ビス（４，４，５，５，６，６，７，７，７−ノナフルオロヘプタンアミド）の合成。実施例１４のために記載の反応条件を使用して、４，４，５，５，６，６，７，７，７−ノナフルオロヘプタン酸のニトロフェニルエステル（ＳｙｎＱｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、アラチュア、ＦＬ）との１，４−ジアミノブタン−２，３−ジオール（Ｃｈｅｍｓｐａｃｅ、リガ、ラトビア）の反応により、Ｎ，Ｎ’−（２，３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジイル）ビス（４，４，５，５，６，６，７，７，７−ノナフルオロヘプタンアミド）を調製した。
Ｎ，Ｎ’−（２，３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジイル）ビス（４，４，５，５，６，６，７，７，７−ノナフルオロヘプタンアミド）（１０．０ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。トリフルオロトルエン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を滴加することにより、この溶液を透明にした。オルトギ酸トリメチル（３．２ｇ、３０．０ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を触媒量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ型、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子と共にフラスコに加えた。フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。４時間後、メタノール共沸混合物がさらに蒸留されないことから、反応が完了したとみなし、フラスコを室温まで冷却した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。ジクロロメタンおよびトリエチルアミンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留混合物を精製し、表題化合物を単離収率６４％で得た。この生成物を、１Ｈ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよびＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（Ｍ＋１、７１１．１ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例１６］
４−（クロロメチル）−２−メトキシ−１，３−ジオキソランの合成。Ｎｇｕｙｅｎ−Ｂａ Ｎ．ら（抗ウイルス化合物、米国特許第５，７８９，３９４（Ａ）号、１９９８年８月４日）によって記載された方法により、４−（クロロメチル）−２−メトキシ−１，３−ジオキソランを単離収率９４％で調製した。
［実施例１７］
Ｓ−（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）エタンチオエートの合成。Ｐｏｌｓｔｅｒ Ｊ．ら（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，６３，１４１９−１４３２；２０１５）によって記載された方法により、Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）エタンチオエートを調製した。Ｔｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子を入れた丸底フラスコ内で、ジオール（１０．２１ｇ、６８ｍｍｏｌ）をシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に０．７Ｍの濃度で溶解した。オルトギ酸トリメチル（１．５ｅｑ、Ａｌｄｒｉｃｈ）および触媒量のｐ−トルエンスルホン酸（５ｍｏｌ％、Ａｌｄｒｉｃｈ）を丸底フラスコに加え、フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。２時間後、反応が完了し、フラスコを室温まで冷却し、続いてロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。（９：１ヘキサン：酢酸エチル中の１％トリエチルアミンでコンディショニングした）シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、（９：１ヘキサン：酢酸エチルから開始した）ヘキサン：酢酸エチルの勾配で溶離しながら生成物を精製した。表題化合物を収率７２％で単離した。この生成物を、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲにおける特徴的なピークおよび正モードＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（［Ｍ−ＯＭｅ］＋、１６１．０ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例１８］
１，２−ビス（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）ジスルファンの合成。Ｐｏｌｓｔｅｒ Ｊ．ら（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，６３，１４１９−１４３２；２０１５）によって記載された方法により、（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メタンチオールを調製した。Ｔｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子を入れた丸底フラスコ内で、チオール（３．００ｇ、２０ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（Ａｌｄｒｉｃｈ）に０．３３Ｍの濃度で溶解した。この溶液にＮａＩ（５４ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）および３０％ Ｈ２Ｏ２（４．０ｍＬ、３６ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、混合物を２３℃で０．５時間撹拌した。飽和水性チオ硫酸ナトリウム１００ｍＬの添加により反応を停止した。混合物を酢酸エチル（Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５０ｍＬずつ３回抽出した。合わせた有機抽出物を１５０ｍＬの飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）で乾燥し、ロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、（９：１から開始する）ヘキサン：酢酸エチルの勾配で溶離することにより粗残留物を精製した。表題化合物を収率７８％で単離した。この生成物を、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲにおける特徴的なピークならびに正モードＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（［Ｍ−ＯＭｅ］＋、２６７．０ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例１９］
２−メトキシ−４−（（フェニルジスルファニル（ｐｈｅｎｙｌｄｉｓｕｌｆａｎｅｙｌ））メチル）−１，３−ジオキソランの合成。Ｈｕｎｔｅｒ Ｒ．ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７１，８２６８−８２７１；２００６）によって記載された方法により、３−（フェニルジスルファニル）プロパン−１，２−ジオールを調製した。Ｔｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子を入れた丸底フラスコ内で、ジオール（１０２ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）をシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に０．１Ｍの濃度で溶解した。オルトギ酸トリメチル（１．５ｅｑ、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびｐ−トルエンスルホン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）を丸底フラスコに加え、フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。３時間後、反応が完了し、フラスコを室温まで冷却し、続いてロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、（ヘキサンから開始する）ヘキサン：酢酸エチルの勾配で溶離しながら生成物を精製した。表題化合物を収率６８％で単離した。この生成物を、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲにおける特徴的なピークならびに正モードＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（［Ｍ−ＯＭｅ］＋、２２７．０ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例２０］
１−（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）−１Ｈ−ピロールの合成。Ｔｅｆｌｏｎ被覆磁気撹拌子を入れた丸底フラスコ内で、３−（１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパン−１，２−ジオール（５．０ｇ、３５．４ｍｍｏｌ、Ａｕｒｕｍ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ）をシクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に０．２Ｍの濃度で溶解した。オルトギ酸トリメチル（１．５ｅｑ、Ａｌｄｒｉｃｈ）および触媒量のｐ−トルエンスルホン酸（５ｍｏｌ％、Ａｌｄｒｉｃｈ）を丸底フラスコに加え、フラスコにＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ蒸留ヘッドを取り付けた。反応物をゆっくり加熱して還流し、メタノールを４５℃の沸点で共沸蒸留により除去した。３時間後、反応が完了し、フラスコを室温まで冷却し、続いてロータリーエバポレーターで減圧で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、（純粋なヘキサンから開始する）ヘキサン：酢酸エチルの勾配で溶離しながら生成物を精製した。表題化合物を収率６６％で単離した。この生成物を、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲにおける特徴的なピークならびに正モードＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析における分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］、１８３．１ｍ／ｚ）により確認した。
［実施例２１］
１−（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−ヒドロキシ−５−（（（４−（（（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）ジスルファニル（ｄｉｓｕｌｆａｎｅｙｌ））メチル）−１，３−ジオキソラン−２−イル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンの合成。３’−ｄＴ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０ｍｇをジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μＬで１分間、２回処理し、続いてアセトニトリル５ｍＬで処理し、窒素流で乾燥させた。１，２−ビス（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）ジスルファンオルトエステル（４５μＬ）、アセトニトリル（４５μＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸（１０μＬ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を３’−ｄＴ−ＣＰＧに加えた。混合物を６０℃で１時間加熱した。残液を除去後、ＣＰＧをアセトニトリル８ｍＬで洗浄し、続いて窒素流で乾燥させた。３’−ｄＴ−ＣＰＧ−オルトエステルコンジュゲートを２８％濃水酸化アンモニウム（１００μＬ）で、２３℃で２時間処理した。得られた濾液をＳａｖａｎｔ ｓｐｅｅｄｖａｃで、減圧下で濃縮し、水５００μＬに溶解し、ＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析法（［Ｍ−ＯＭｅ］＋、４７７．１ｍ／ｚ）により分析した。
［実施例２２］
１，２−ビス（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）ジスルファン：ｄＴコンジュゲート、Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋ捕捉および放出。３’−ｄＴ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）３０ｍｇを１００μＬのジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で１分間、２回、続いてアセトニトリル５ｍＬで処理し、窒素流で乾燥させた。１，２−ビス（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）ジスルファンオルトエステル（４５μＬ）、アセトニトリル（４５μＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸（１０μＬ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｃｈ）を３’−ｄＴ−ＣＰＧに加えた。混合物を６０℃で１時間加熱した。残液を除去後、ＣＰＧをアセトニトリル８ｍＬで洗浄し、続いて窒素流で乾燥させた。ｄＴ−ＣＰＧ：オルトエステルコンジュゲートを、重炭酸アンモニウム（２００ｍＭ）（ｐＨ８．０）中で調製した５０ｍＭ ＴＣＥＰ（２００μＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液で２３℃で１時間処理した。還元されたチオール含有コンジュゲートを脱保護し、濃水酸化アンモニウム（１００μＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ）による２３℃で１時間の処理によりＣＰＧから放出させた。Ｓａｖａｎｔ ｓｐｅｅｄｖａｃ内で１時間の濾液の濃縮に続いて、残留物を５０ｍＭトリス．ＨＣｌ ２００μＬ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）に溶解した。Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）３００μＬを使用して、この溶液を２３℃で１２時間インキュベートした。樹脂を５０ｍＭトリス．ＨＣｌ ２００μＬ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）、続いてアセトニトリル８ｍＬで洗浄した。２０％ｖ／ｖ水性ギ酸１００μＬを使用して２３℃で６０分間インキュベートすることにより、生成物３’−ｄＴを樹脂から放出させた。得られた濾液をＳａｖａｎｔ ｓｐｅｅｄｖａｃで濃縮し、ＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析法（Ｍ＋Ｈ、ｍ／ｚ２４３．１）により分析した。
［実施例２３］
１−（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）−１Ｈ−ピロール：ＰＴＡＤ：ＲＮＡコンジュゲート。１０ｍｇの２０ｍｅｒ ＲＮＡ−ＣＰＧをジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μＬで１分間、２回処理し、続いてアセトニトリル５ｍＬで処理し、窒素流で乾燥させた。４５μＬの１−（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）−１Ｈ−ピロールおよび５μＬのジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を２０ｍｅｒ ＲＮＡ ＣＰＧに加え、混合物を７０℃で２時間加熱した。残液を除去後、ＣＰＧをアセトニトリル８ｍＬで洗浄し、続いて窒素流で乾燥させた。乾燥したＣＰＧをアセトニトリル中の０．２Ｍ ４−フェニル−１，２，４−トリアゾール−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μＬで３０秒間処理した。ＰＴＡＤ溶液を除去し、ＣＰＧを乾燥ＡＣＮ８ｍＬで洗浄し、窒素流下で乾燥した。２０ｍｅｒ ＲＮＡ−ＣＰＧ−オルトエステル−ＰＴＡＤコンジュゲートをニートのエチレンジアミンで、２３℃で２時間処理し、続いてＣＰＧを乾燥アセトニトリル３ｍＬですすいだ。切断された２０ｍｅｒ ＲＮＡ：オルトエステル：ＰＴＡＤコンジュゲートを０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ＝６．９）０．３ｍＬを使用して溶離し、デコンボリューションしたＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析法（Ｍ＝６７６３．８６ｍ／ｚ）により分析し、１個のピロロオルトエステル（ｐｙｒｒｏｌｏ ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ）および２個のＰＴＡＤ分子の付加が示された。
［実施例２４］
固体担体上で新たに合成されたオリゴヌクレオチドとの１，３−ジオキサランオルトエステルリンカーおよび１，４−ジオキサランオルトエステルリンカーの結合のための一般的な手順。
新たに合成されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは修飾オリゴヌクレオチドは、固体担体上で合成される。得られる全長生成物は、デブロッキングステップにおいて最終保護基を除去することにより、オルトエステルリンカーを結合するために調製される。その保護基は、文献において周知の様々な基であり得、最も典型的にはＤＭＴ、ピキシルまたはＢＺＨであり得る。オリゴヌクレオチドの合成は３’から５’方向に起こり得、ここで最終保護基は、得られたオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルから除去され、またはこの合成は、５’から３’方向に起こり得、ここで最終保護基は、得られたオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルから除去される。この時点で、新たに合成されたオリゴヌクレオチドからリン保護基を任意選択的に除去することができる。アフィニティータグ（ＡＴ）に結合された１，３−ジオキサランオルトエステルリンカーまたは１，４−ジオキサランオルトエステルリンカーを、ｔｒａｎｓ−オルトエステル化触媒として弱酸を使用する最終のデブロッキングステップにおいて遊離されたヒドロキシ基と反応させる。ＴＣまたはＰｉｖＯＭなどの様々な保護基を任意選択的に除去するために、おそらくは固体担体結合を切断するために、オルトエステルリンカー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む得られたアフィニティータグをここで様々な塩基性アミンで処理することができる。次いで、遊離されたオリゴヌクレオチドを、アフィニティータグを利用したクロマトグラフ分離または固相抽出カラムを使用して精製することができる。次いで、オルトエステルリンカーを、任意の別の酸不安定性保護基、例えばＡＣＥと共に弱酸を使用して除去することができて、次いで、精製オリゴヌクレオチドを、様々な試薬、例えば、ＴＯＭまたはＴＢＤＭＳなどのフッ化物イオンを使用して任意選択的にさらに脱保護することができる。
［実施例２５］
ＴＣホスホルアミダイトを使用して調製された２１ヌクレオチドＲＮＡとの２−メトキシ−４−（（（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ）メチル）−１，３−ジオキソランの結合。
デオキシチミジンを含む制御された孔ガラス（ＣＰＧ；Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ａｓｔｏｎ、ＰＡ）上のＴＣホスホルアミダイトを使用し、ＡＴＫＡ １００ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）および１２ｍｌカラムを使用して２１−ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチドを合成し、所望の粗オリゴリボヌクレオチド（５’−ＧＵＧＵＣＡＧＵＡＣＡＧＡＵＧＡＧＧＣＣＴ−３’、配列番号１）を含む６．５ｇのＣＰＧを得た。およそ、ＣＰＧのローディングに基づいて１マイクロモルの粗オリゴヌクレオチド、３０ｍｇを、ハイスループットＤＮＡ／ＲＮＡ合成カラム（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）に入れた。１００マイクロリットルの２−メトキシ−４−（（（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ）メチル）−１，３−ジオキソラン（オルトエステル）を、８０マイクロリットルの無水アセトニトリルおよび２０マイクロリットルの無水ジクロロメタン中のジクロロ酢酸の３％ｗｔ／ｗｔ溶液（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と混合した。オルトエステル溶液をカラムに加え、６０℃に１時間加熱した。カラムを無水アセトニトリル（１ｍｌ）ですすぎ、次いで、２００マイクロリットルのニートの無水エチレンジアミンをカラムに加え、２時間反応させた。アセトニトリル（１ｍｌ）を使用してカラムからエチレンジアミンを洗い落とし、次いで、３００マイクロリットルの水中の０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７．０）を使用してカラムからＲＮＡを除去した。逆相Ｃ−１８カラムおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ（２０分で０％ Ｂから５０％ Ｂまでの勾配を使用；Ａ：水中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）、Ｂ：３０／７０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）水／アセトニトリル中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を使用して、ＨＰＬＣ分析によりオルトエステルリンカー変換の収率を決定した。この反応は、全長生成物からオルトエステルリンカーを含む生成物への５５％の変換を示した。
［実施例２６］
ＴＣホスホルアミダイトを使用して調製された１００ヌクレオチドＲＮＡとの２−メトキシ−４−（（（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ）メチル）−１，３−ジオキソランの結合
保護されたウリジン−２’−ＯＴＣ（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ａｓｔｏｎ、ＰＡ）を含むＣＰＧ上のＴＣホスホルアミダイトを使用し、ＡＴＫＡ １００ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）および１２ｍｌカラムを使用して１００−ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチドを合成し、所望の粗オリゴリボヌクレオチド（５’−ＣＵＵ ＧＣＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＧＵ ＡＡＧ ＵＵＵ ＵＡＧ ＡＧＣ ＵＡＧ ＡＡＡ ＵＡＧ ＣＡＡ ＧＵＵ ＡＡＡ ＡＵＡ ＡＧＧ ＣＵＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＵＡＵ ＣＡＡ ＣＵＵ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＵＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＡＧＵ ＣＧＧ ＵＧＣ ＵＵＵ Ｕ−３’、配列番号２）を含む６．８ｇのＣＰＧを得た。およそ、ＣＰＧのローディングに基づいて１マイクロモルの粗オリゴヌクレオチド、４０ｍｇを、ハイスループットＤＮＡ／ＲＮＡ合成カラム（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）に入れた。１００マイクロリットルの２−メトキシ−４−（（（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ）メチル）−１，３−ジオキソラン（オルトエステル）を、８０マイクロリットルの無水アセトニトリルおよび２０マイクロリットルの無水ジクロロメタン中のジクロロ酢酸の３％ｗｔ／ｗｔ溶液（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と混合した。オルトエステル溶液をカラムに加え、６０℃に１時間加熱した。カラムを無水アセトニトリル（１ｍｌ）ですすぎ、次いで、２００マイクロリットルのニートの無水エチレンジアミンをカラムに加え、２時間反応させた。アセトニトリル（１ｍｌ）を使用してカラムからエチレンジアミンを洗い落とし、次いで、３００マイクロリットルの水中の０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７．０）を使用してカラムからＲＮＡを除去した。逆相Ｃ−１８カラムおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ（２０分で０％ Ｂから５０％ Ｂまでの勾配を使用；Ａ：水中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）、Ｂ：３０／７０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）水／アセトニトリル中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を使用して、ＨＰＬＣ分析によりオルトエステルリンカー変換の収率を決定した。この反応は、全長生成物からオルトエステルリンカーを含む生成物への２５％の変換を示した。
［実施例２７］
ＴＣホスホルアミダイトを使用して調製された１００ヌクレオチドＲＮＡとの４−（（（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ）メチル）−２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−１，３−ジオキソランの結合。
保護されたウリジン−２’−ＯＴＣ（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ａｓｔｏｎ、ＰＡ）を含むＣＰＧ上のＴＣホスホルアミダイトを使用し、ＡＴＫＡ １００ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）および１２ｍｌカラムを使用して１００−ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチドを合成し、所望の粗オリゴリボヌクレオチド（５’−ＣＵＵ ＧＣＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＧＵ ＡＡＧ ＵＵＵ ＵＡＧ ＡＧＣ ＵＡＧ ＡＡＡ ＵＡＧ ＣＡＡ ＧＵＵ ＡＡＡ ＡＵＡ ＡＧＧ ＣＵＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＵＡＵ ＣＡＡ ＣＵＵ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＵＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＡＧＵ ＣＧＧ ＵＧＣ ＵＵＵ Ｕ−３’、配列番号２）を含む６．８ｇのＣＰＧを得た。およそ、ＣＰＧのローディングに基づいて１マイクロモルの粗オリゴヌクレオチド、４０ｍｇを、ハイスループットＤＮＡ／ＲＮＡ合成カラム（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）に入れた。１００マイクロリットルの４−（（（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ）メチル）−２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−１，３−ジオキソラン（オルトエステル）を、８０マイクロリットルの無水アセトニトリルおよび２０マイクロリットルの無水ジクロロメタン中のジクロロ酢酸の３％ｗｔ／ｗｔ溶液（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と混合した。オルトエステル溶液をカラムに加え、６０℃に１時間加熱した。カラムを無水アセトニトリル（１ｍｌ）ですすぎ、次いで、２００マイクロリットルのニートの無水エチレンジアミンをカラムに加え、２時間反応させた。アセトニトリル（１ｍｌ）を使用してカラムからエチレンジアミンを洗い落とし、次いで、３００マイクロリットルの水中の０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７．０）を使用してカラムからＲＮＡを除去した。逆相Ｃ−１８カラムおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ（２０分で０％ Ｂから５０％ Ｂまでの勾配を使用；Ａ：水中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）、Ｂ：３０／７０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）水／アセトニトリル中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を使用して、ＨＰＬＣ分析によりオルトエステルリンカー変換の収率を決定した。この反応は、全長生成物からオルトエステルリンカーを含む生成物への５２％の変換を示した。
［実施例２８］
オルトエステルリンカーとのフルオラスアフィニティータグの２ステップ結合
３０ｍｇの３’−ＲＮＡ−ＣＰＧをジクロロメタン中の３％ジクロロ酢酸（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μＬで１分間、２回処理し、続いてアセトニトリル８ｍＬで処理し、窒素流で乾燥させた。４５μＬの１，２−ビス（（２−メトキシ−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル）ジスルファンオルトエステル、アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）４５ｕＬおよびジクロロメタン中の３％ジクロロ酢酸（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１０μＬを遊離５’ヒドロキシル基を有する３’−ＲＮＡ−ＣＰＧに加え、混合物を６０℃で１時間加熱する。残液を除去後、ＣＰＧをアセトニトリル８ｍＬで洗浄し、続いて窒素流で乾燥させた。ＲＮＡ−ＣＰＧ：オルトエステルコンジュゲートを、２００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）中で調製した５０ｍＭ ＴＣＥＰ（Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液２００μＬで２３℃で１時間処理する。次いで、ＣＰＧ上の還元されたチオール含有ＲＮＡコンジュゲートを、アセトニトリル中１０ｍＭの濃度の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクチルヨージド（Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を使用してインキュベートする。次いで、ニートのエチレンジアミン１００ｕＬによる２３℃で５時間の処理によりコンジュゲートを脱保護し、ＣＰＧから放出させ、続いて８ｍＬのアセトニトリルで洗浄する。０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ＝６．９）０．３ｍＬを使用してフッ素化−ＲＮＡコンジュゲートをＣＰＧ樹脂から溶離し、デコンボリューションしたＥＳＩ／ＴＯＦ質量分析法により分析する。
［実施例２９］
フルオラスアフィニティータグを有するオリゴヌクレオチドのカートリッジ精製または固相抽出カラム精製
３０ｍｇの１００ｍｅｒ ＲＮＡ−ＣＰＧをジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００ｕＬで１分間、２回処理し、続いてアセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）８ｍＬで処理し、窒素流で乾燥させた。８０μＬの４−（（（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチル）オキシ）メチル）−２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−１，３−ジオキソラン、アセトニトリル８０μＬおよび４０μＬのジクロロメタン中の３％ジクロロ酢酸（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１００ｍｅｒ ＲＮＡ ＣＰＧに加え、混合物を７５℃で１５分間加熱した。残液を除去後、ＣＰＧをアセトニトリル８ｍＬで洗浄し、続いて窒素流で乾燥させた。次に、ＣＰＧをニートのエチレンジアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）０．５ｍＬで４０℃で１時間処理した。残液を除去後、ＣＰＧをアセトニトリル８ｍＬで洗浄し、続いて窒素流で乾燥させた。５％ｖ／ｖジメチルホルムアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１ｍＬの１０％ｗ／ｖ塩化ナトリウムを使用してフルオラスオルトエステル：ＲＮＡコンジュゲートをＣＰＧから溶離した。
「Ｆｌｕｏｒｏ−ｐａｋ ＩＩ」カートリッジ（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を、アセトニトリル１ｍＬ、続いて０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１ｍＬ、および５％ｖ／ｖジメチルホルムアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１ｍＬの１０％ｗ／ｖ塩化ナトリウムの添加によりコンディショニングした。溶離されたフルオラスオルトエステル：１滴あたりおよそ２秒の速度で樹脂から押し出されるシリンジ１本分の空気を使用して、バッファーが樹脂の上部に到達するまでＲＮＡコンジュゲートをこのカートリッジの上部にシリンジで加えた。樹脂を１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）中の１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）で２ｍＬずつ２回洗浄し、続いて１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）中の１２．５％アセトニトリル（ｖ／ｖ）で２ｍＬずつ２回洗浄した。１ｍＬの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ５．５）中の８０％ ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）を使用してフルオラスオルトエステル：ＲＮＡコンジュゲートを樹脂から溶離した。溶離された分画をＳａｖａｎｔ ｓｐｅｅｄｖａｃで濃縮乾固し、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ５．５）２１２μＬに溶解し、２３℃でインキュベートさせた。１時間後、アセトニトリル３８μＬを反応溶液に加え、別のコンディショニングしたＦｌｕｏｒｏ−ｐａｋ ＩＩカートリッジを通過させ、続いて１ｍＬの１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）中の１２．５％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を通過させた。２つの分画を合わせ、Ｓａｖａｎｔ ｓｐｅｅｄｖａｃで蒸発乾固して、アフィニティー精製された１００ｍｅｒ ＲＮＡ ０．７ｍｇを生成した。
この手順は、フリットおよびバルクフルオラス樹脂を含むプレートを使用する６、１２、２４、４８、９６、３８４または１５３６ウェルのマイクロタイターフォーマットに拡張される。真空マニホールドを使用して、回収または廃棄されるすべての溶液を樹脂を介して吸引することができる。このプロセスは、実験室用ロボット；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｒａｖｏ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ上で自動化できることが示されている。
本開示を鑑み、本方法は、本教示にしたがって実施することができることに留意されたい。さらに、様々な成分、材料、構造およびパラメータは、単に説明および例として記載されており、限定的な意味では記載されていない。本開示を鑑み、本教示は、添付の特許請求の範囲内に留まりながら他の用途において実施することができて、これらの用途を実施するための成分、材料、構造および装置を決定することができる。

Claims (43)

  1. 標的オリゴヌクレオチドを精製する方法であって、
    固体担体上で前記標的オリゴヌクレオチドを合成し、前記標的オリゴヌクレオチドおよび短縮化オリゴヌクレオチドを含む混合物を得るステップ；
    前記標的オリゴヌクレオチドをオルトエステルリンカーと反応させ、それによってオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを生成するステップであり、前記オルトエステルリンカーがコンジュゲーション時にアフィニティータグを含むか、または前記コンジュゲーション反応後の第２の反応で前記アフィニティータグを前記オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートと反応させる、ステップ；
    前記オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートおよび前記短縮化オリゴヌクレオチドを、前記固体担体から切断するステップ；
    クロマトグラフィーカラムまたはアフィニティーキャプチャー担体上に、前記オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートおよび前記短縮化オリゴヌクレオチドをローディングし、前記オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートを、前記アフィニティータグにより前記アフィニティーキャプチャー担体に結合させるステップ；
    前記カラムまたは前記アフィニティーキャプチャー担体から、前記短縮化オリゴヌクレオチドを洗い落とすステップ；および
    前記標的オリゴヌクレオチドから前記オルトエステルリンカーを切断し、前記クロマトグラフィーカラムまたは前記アフィニティーキャプチャー担体から前記標的オリゴヌクレオチドを溶離し、それによって精製された標的オリゴヌクレオチドを放出させるステップ
    を含む、方法。
  2. 前記アフィニティータグが、前記オルトエステルリンカー内の１個または複数の基であるか、または前記アフィニティータグが、リンカーにより前記オルトエステルリンカーに結合されている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートが前記固体担体から切断される前または後に、前記第２の反応が実施される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記オルトエステルリンカーが、前記標的オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに結合されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記オルトエステルリンカーが、前記標的オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルに結合されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記アフィニティータグが、フルオラスタグ、疎水性タグ、ビオチンタグ、グルタチオンタグ、マルトースタグ、アリールボロン酸タグ、ポリヒスチジンペプチドタグ、ポリスルフヒドリルタグ、シクロデキストリンタグ、アダマンタンタグ、ポリアミンタグ、マレイミドタグ、アルキンタグ、アジドタグ、ヒドラジドタグ、アミノタグ、ジオールタグ、チオールタグまたはそれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記標的オリゴヌクレオチドがオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ＲＮＡが、チオノカルバメート（ＴＣ）保護基、ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）保護基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護基、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）保護基、ピバロイルオキシメチル（ＰｉｖＯＭ）保護基および２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）保護基から選択される２’−ヒドロキシル保護基を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＲＮＡが、リン保護基、核酸塩基保護基またはそれらの組合せをさらに含む、請求項７または８に記載の方法。
  10. 前記オリゴヌクレオチドを前記オルトエステルリンカーと反応させる前に、前記リン保護基が脱保護される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記標的オリゴヌクレオチドを前記オルトエステルリンカーと反応させた後に、前記核酸塩基保護基および任意選択的に前記リン保護基が脱保護される、請求項９に記載の方法。
  12. 前記固体担体からの前記オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートの前記切断、ならびに前記核酸塩基保護基および任意選択的に前記リン保護基の前記脱保護が、単一の反応で実施される、請求項７に記載の方法。
  13. 前記ＲＮＡが、少なくとも７０個のヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。
  14. 前記オルトエステルリンカーが、式（Ｉａ）：
    （式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、カルボシクリル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環または任意の置換等価物であり、ただし、Ｒは水素であってもよい）
    の化合物である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. Ｒが、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’が、それぞれ独立してアリールまたは置換アリールである、請求項１４に記載の方法。
  16. Ｒが、ＨまたはＣＨ３であり、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’が、フェニルまたは置換フェニルである、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記オルトエステルリンカーが、式（Ｉａ）の化合物であり、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’のうちの少なくとも１つが、疎水性タグ、部分的疎水性タグ、フルオラスタグまたは部分的フルオラスタグである、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記オルトエステルリンカーが、式（Ｉｂ）：
    （式中、ＡｆＴｇはアフィニティータグであり、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立してＡｆＴｇ−ＬもしくはＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、ハロ置換Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、ハロ置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、カルボシクリル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、任意の置換等価物またはそれらの組合せであり、ただし、炭素の総数は２４個を超えず；
    Ｌは、共有結合であるか、またはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＣ１〜Ｃ３アルキルで任意選択的に置換されており、Ｏ、Ｓ、Ｎから独立して選択されるヘテロ原子、またはＳ−Ｓ、ＮＲａ、ＮＲａ−ＣＯ、−ＣＯ−ＮＲａ−、ＮＲａ−ＣＯ−ＮＲｂ、ＣＯ（式中、Ｒａ、Ｒｂは、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から独立して選択される基が任意選択的に散在する直鎖、分岐鎖、単環式もしくは多環式の飽和、部分不飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ１２炭化水素鎖である）
    の化合物である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記オルトエステルリンカーが、式（Ｉ）
    （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリルもしくは任意の置換等価物またはそれらの組合せであり、ただし、炭素の総数は２４個を超えず；Ｒ８およびＲ９はＨであり；Ｘは、Ｈ、メチルまたは電子吸引基であり；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）
    の化合物である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  20. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つが、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニル、フルオロ置換カルボシクリル、フルオロ置換ヘテロアルキル、フルオロ置換ヘテロアルケニル、フルオロ置換ヘテロアルキニルまたはフルオロ置換ヘテロシクリルである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記アフィニティータグが、少なくとも３のｃＬｏｇＰ値を有するフルオラスタグまたは疎水性タグである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記オルトエステルリンカーが、
    である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記アフィニティータグが、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニルまたはフルオロ置換カルボシクリルである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  24. オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲートであって、前記オリゴヌクレオチドは、その５’末端または３’末端に、式（ＩＶ）
    （式中、波線と結ばれた酸素は、前記オリゴヌクレオチドの前記５’末端または前記３’末端の酸素であり；
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの少なくとも１つは、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、任意の置換等価物またはそれらの組合せであり、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルキル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、任意の置換等価物またはそれらの組合せであり；ｎは、０、１または２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）
    の部分を含み、ただし、前記部分が、
    ではない、オリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート。
  25. ｎ＝０であり、前記アフィニティータグが、少なくとも３のｃＬｏｇＰ値を有するフルオラスタグまたは疎水性タグである、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート。
  26. 前記オリゴヌクレオチドがオリゴリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート。
  27. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも１つが、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニル、フルオロ置換アリール、フルオロ置換ヘテロアルキル、フルオロ置換ヘテロアルケニル、フルオロ置換ヘテロアルキニルまたはフルオロ置換ヘテロシクリルである、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート。
  28. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも１つがフルオラスタグであり、Ｒ７を含む残りのＲ基がＨである、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート。
  29. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも２つがフルオラスタグである、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
  30. 前記部分が、
    （式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２３ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２３置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり、ただし、Ｒ１１およびＲ１２のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含むものとし；Ｒ７は、Ｈ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、フェニルまたはベンジルであり；Ｚは、それぞれ独立してＣＲａＲｂ、Ｏ、ＳまたはＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲａおよびＲ１１もしくはＲａおよびＲ１２は、Ｎと共に複素環を一緒に形成し；ｎは、０、１または２である）
    からなる群から選択される、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート。
  31. 前記部分が、
    （式中、Ｘ１は、Ｈ、Ｆ、アジド、保護されたスルフヒドリル、保護されたポリスルフヒドリル、ポリヒスチジン、保護されたアミノ基、保護されたヒドラジド基、保護されたオキシアミン基、マレイミド、シクロオクチン、共役ジエン、Ｃ２アルケニル基、Ｃ２置換アルケニル基、Ｃ２アルキニル基またはＣ２置換アルキニル基であり；Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃ１−３ヘテロアルキルまたはＣ１−３置換アルキルであり；ｎは、１または２であり；ｍは、０〜１２の範囲の整数である）
    である、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート。
  32. 前記部分が、
    からなる群から選択される、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド−オルトエステルリンカーコンジュゲート。
  33. 式（Ｉｄ）
    （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの少なくとも１つは、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、任意の置換等価物またはそれらの任意の組合せであり、ただし、炭素の総数は２４個を超えず、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロまたはヘテロ置換等価物、Ｃ３〜Ｃ１２カルボシクリルまたはヘテロシクリルおよび置換等価物であり、ただし、Ｒ１基〜Ｒ７基のうちの２つのＲ基は、
    に示される環状オルトエステルと共に縮合環を形成せず、
    Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルであり；ｎは、０または１であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含む）
    のオルトエステルリンカー。
  34. 前記アフィニティータグが、少なくとも３のｃＬｏｇＰ値を有するフルオラスタグまたは疎水性タグである、請求項３３に記載のオルトエステルリンカー。
  35. ｎが０であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも２つが、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ２４アルキル、Ｃ１〜Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアルキニル、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリルまたは任意の置換等価物であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうちのすべての残りのＲ基がＨであり、ただし、Ｈではない２つのＲ基は、互いに結合して前記環状オルトエステルと共に縮合環を形成しない、請求項３３に記載のオルトエステルリンカー。
  36. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの１つが、フルオロ置換アルキル、フルオロ置換アルケニル、フルオロ置換アルキニルまたはフルオロ置換アリールである、請求項３３に記載のオルトエステルリンカー。
  37. 構造：
    （式中、Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２３ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２３置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり；Ｒ７は、ＨまたはＣＨ３である。Ｚは、ＣＲａＲｂ、Ｏ、Ｓ、ＮＲａ、ＮＲａＣＯ、ＣＯＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲａおよびＲ１１は、Ｎと共に複素環を一緒に形成し；Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルであり；ｎは、０または１であり、Ｒ１１はアフィニティータグを含む）
    を有する、請求項３３に記載のオルトエステルリンカー。
  38. 構造：
    （式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ２３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２３ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２３置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ２３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ２３置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり、ただし、Ｒ１１およびＲ１２のうちの少なくとも１つはアフィニティータグを含むものとし；Ｒ７は、ＨまたはＣＨ３である。Ｚは、それぞれ独立してＣＲａＲｂ、Ｏ、Ｓ、ＮＲａＣＯ、ＣＯＮＲａまたはＮＲａであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲａおよびＲ１１もしくはＲａおよびＲ１２は、Ｎと共に複素環を一緒に形成し；Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルであり；ｎは、０または１である）
    を有する、請求項３３に記載のオルトエステルリンカー。
  39. ｎが０であり、ＺがＯである、請求項３７または３８に記載のオルトエステル。
  40. 構造：
    （式中、Ｚは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＲａまたはＮＲａＣＯ（式中、Ｒａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）であり；Ｒ７は、Ｈ、メチル、エチル．ｎ−プロピル、フェニルまたはベンジルであり；Ｘは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルまたはシアノ−であり；ｍは、０〜１２の整数であり；ｎは、１または２である）
    を有するフルオラスオルトエステルリンカー。
  41. から選択される構造を有するオルトエステルリンカー。
  42. 式（ＩＩＩａ）：
    （式中、Ｘ１は、Ｈ、Ｆ、アジド、保護されたスルフヒドリル、保護されたポリスルフヒドリル、ポリヒスチジン、保護されたアミノ基、保護されたヒドラジド基、保護されたオキシアミン基、シクロオクチン、共役ジエン、Ｃ２アルケニル基、Ｃ２置換アルケニル基、Ｃ２アルキニル基またはＣ２置換アルキニル基であり；Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃ１−３ヘテロアルキルまたはＣ１−３置換アルキルであり；Ｘ２は、Ｈ、ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはモノ、ビスもしくはトリスハロ置換メチルまたはシアノ−であり；ｎは、１または２であり；ｍは、０〜１２の範囲の整数である）
    のオルトエステルリンカー。
  43. である、請求項４２に記載のオルトエステルリンカー。
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