PL218817B1 - Sposób wytwarzania oligorybonukleotydów zawierających 5-taurynometylo-urydynę lub 5-taurynometylo-2-tiourydynę oraz hipermodyfikowanych jednostek monomerycznych do syntezy tych oligorybonukleotydów - Google Patents
Sposób wytwarzania oligorybonukleotydów zawierających 5-taurynometylo-urydynę lub 5-taurynometylo-2-tiourydynę oraz hipermodyfikowanych jednostek monomerycznych do syntezy tych oligorybonukleotydówInfo
- Publication number
- PL218817B1 PL218817B1 PL399290A PL39929012A PL218817B1 PL 218817 B1 PL218817 B1 PL 218817B1 PL 399290 A PL399290 A PL 399290A PL 39929012 A PL39929012 A PL 39929012A PL 218817 B1 PL218817 B1 PL 218817B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- formula
- room temperature
- mixture
- tbdms
- tert
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 title claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 title 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 43
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 32
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 29
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 29
- -1 5-azidomethyl-2-thiouridine Chemical compound 0.000 claims description 24
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 23
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 23
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 18
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 18
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 15
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 14
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 10
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 9
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 claims description 9
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 8
- QAEDZJGFFMLHHQ-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic anhydride Chemical compound FC(F)(F)C(=O)OC(=O)C(F)(F)F QAEDZJGFFMLHHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- XMIFBEZRFMTGRL-TURQNECASA-N OC[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1O)n1cc(CNCCS(O)(=O)=O)c(=O)[nH]c1=S Chemical compound OC[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1O)n1cc(CNCCS(O)(=O)=O)c(=O)[nH]c1=S XMIFBEZRFMTGRL-TURQNECASA-N 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 7
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000006957 Michael reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 6
- VJKJOPUEUOTEBX-TURQNECASA-N 2-[[1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2,4-dioxopyrimidin-5-yl]methylamino]ethanesulfonic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(CNCCS(O)(=O)=O)=C1 VJKJOPUEUOTEBX-TURQNECASA-N 0.000 claims description 5
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- RSIHJDGMBDPTIM-UHFFFAOYSA-N ethoxy(trimethyl)silane Chemical compound CCO[Si](C)(C)C RSIHJDGMBDPTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- BCNZYOJHNLTNEZ-UHFFFAOYSA-N tert-butyldimethylsilyl chloride Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)Cl BCNZYOJHNLTNEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZAFBFGDCEFQDFD-JXOAFFINSA-N 5-(azidomethyl)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound N(=[N+]=[N-])CC=1C(NC(N([C@H]2[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)C=1)=O)=O ZAFBFGDCEFQDFD-JXOAFFINSA-N 0.000 claims description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 125000000037 tert-butyldiphenylsilyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[Si]([H])([*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 4
- QDARKMVNJNNODU-UHFFFAOYSA-N [2-(4-tert-butylphenoxy)acetyl] 2-(4-tert-butylphenoxy)acetate Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1OCC(=O)OC(=O)COC1=CC=C(C(C)(C)C)C=C1 QDARKMVNJNNODU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 3
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 3
- 238000005731 phosphitylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- GXGKKIPUFAHZIZ-UHFFFAOYSA-N 5-benzylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound C=1C=CC=CC=1CSC=1N=NNN=1 GXGKKIPUFAHZIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 2
- IKGLACJFEHSFNN-UHFFFAOYSA-N hydron;triethylazanium;trifluoride Chemical compound F.F.F.CCN(CC)CC IKGLACJFEHSFNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 claims 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 22
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 12
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 11
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 11
- 208000035177 MELAS Diseases 0.000 description 8
- 208000035172 MERRF Diseases 0.000 description 8
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 150000003457 sulfones Chemical group 0.000 description 7
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 125000001174 sulfone group Chemical group 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 208000012268 mitochondrial disease Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 2
- FANCTJAFZSYTIS-IQUVVAJASA-N (1r,3s,5z)-5-[(2e)-2-[(1r,3as,7ar)-7a-methyl-1-[(2r)-4-(phenylsulfonimidoyl)butan-2-yl]-2,3,3a,5,6,7-hexahydro-1h-inden-4-ylidene]ethylidene]-4-methylidenecyclohexane-1,3-diol Chemical compound C([C@@H](C)[C@@H]1[C@]2(CCCC(/[C@@H]2CC1)=C\C=C\1C([C@@H](O)C[C@H](O)C/1)=C)C)CS(=N)(=O)C1=CC=CC=C1 FANCTJAFZSYTIS-IQUVVAJASA-N 0.000 description 1
- YQOLEILXOBUDMU-KRWDZBQOSA-N (4R)-5-[(6-bromo-3-methyl-2-pyrrolidin-1-ylquinoline-4-carbonyl)amino]-4-(2-chlorophenyl)pentanoic acid Chemical compound CC1=C(C2=C(C=CC(=C2)Br)N=C1N3CCCC3)C(=O)NC[C@H](CCC(=O)O)C4=CC=CC=C4Cl YQOLEILXOBUDMU-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- 125000000453 2,2,2-trichloroethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C(Cl)(Cl)Cl 0.000 description 1
- 125000004206 2,2,2-trifluoroethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C(F)(F)F 0.000 description 1
- WDKUXUZYKCXAHC-UHFFFAOYSA-N 3,3-dimethyloxolane Chemical class CC1(C)CCOC1 WDKUXUZYKCXAHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQVNMALZHZYKQM-JXOAFFINSA-N 5-(aminomethyl)-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical class O=C1NC(=O)C(CN)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZQVNMALZHZYKQM-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- LOEDKMLIGFMQKR-JXOAFFINSA-N 5-aminomethyl-2-thiouridine Chemical compound S=C1NC(=O)C(CN)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LOEDKMLIGFMQKR-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000222736 Leishmania tropica Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 208000009564 MELAS Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000009035 MERRF syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 206010069825 Myoclonic epilepsy and ragged-red fibres Diseases 0.000 description 1
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 150000007860 aryl ester derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000001369 canonical nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- JZPDBTOWHLZQFC-UHFFFAOYSA-N chloro-di(propan-2-yl)phosphane Chemical compound CC(C)P(Cl)C(C)C JZPDBTOWHLZQFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006477 desulfuration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003402 intramolecular cyclocondensation reaction Methods 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012434 nucleophilic reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 230000000258 photobiological effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000004708 ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 1
- 229940035637 spectrum-4 Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical class CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- NLVXSWCKKBEXTG-UHFFFAOYSA-N vinylsulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C=C NLVXSWCKKBEXTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania oligorybonukleotydów zawierających 5-tauryno5 5 2 metylourydynę (rm U) lub 5-taurynometylo-2-tiourydynę (rm s U), metodą amidofosforynową na nośniku oraz hipermodyfikowanych jednostek monomerycznych do syntezy tych oligorybonukleotydów.
5 2 5
Syntetyczne fragmenty RNA, modyfikowane rm5U i/lub rm5s2U (ogólne sekwencje Nn-rm5U-Nn oraz
Nn-rm5s2U-Nn, gdzie N-dowolny nukleozyd purynowy lub piramidynowy, n = 0,1,2,...) mogą znaleźć zastosowanie w:
5
- chemii bioorganicznej, gdzie metodyka syntezy fragmentów RNA modyfikowanych rm5U i/lub rm5s2U może być wykorzystywana do syntezy innych konstruktów, jak siRNA, koniugaty peptyd-RNA, 5
- inżynierii genetycznej, gdzie metodyka syntezy fragmentów RNA modyfikowanych rm5U i/lub rm5s2U może być wykorzystywana do syntezy całych mitochondrialnych cząsteczek tRNA (mt-tRNA) w oparciu o technologię rekombinacji fragmentów RNA in vitro (ligacja fragmentów RNA zbudowanych na matrycy DNA - z syntetycznym fragmentem mt-tRNA), a zwłaszcza do syntezy ludzkich cząsteczek mt-tRNA niosących leucynę (hmt-tRNALeu) i lizynę (hmt-tRNALys), modyfikowanych odpowiednio rm5U i rm5s2U, bowiem mutacje w genach kodujących h mt-tRNALeu i hmt-tRNALys są przyczyną chorób mitochondrialnych, odpowiednio MELAS i MERRF o nierozpoznanej jak dotąd patogenezie, przy czym należy podkreślić, że istnieje ograniczona dostępność do izolowanych, natywnych biocząsteczek hmt-tRNA, z kolei bezpośrednie transkrypty odpowiednich genów są pozbawione naturalnie występujących modyfikacji,
- biologii molekularnej, gdzie syntetyczne fragmenty lub pełne biocząsteczki hmt-tRNALeu i hmttRNALys mogą być wykorzystywane do określenia, na poziomie molekularnym, mechanizmu patogenezy mitochondriopatii określanych odpowiednio jako syndrom MELAS i MERRF (m.in. badania kon5 5 2 formacyjne biocząsteczek, ocena indywidualnego wpływu rm5U/rm5s2U na strukturę i stabilizację całej cząsteczki hmt-tRNALeu lub hmt-tRNALys, określenie roli modyfikacji w oddziaływaniach kodonantykodon na rybosomie),
- inżynierii komórki - do konstruowania mitochondriów pozbawionych defektów MELAS i/lub MERRF jak i komórek i/lub tkanek i/lub organów, zawierających nieuszkodzone mitochondria w wyniku wprowadzenia poprawnych, syntetycznych/półsyntetycznych hmt-tRNALeu lub hmt-tRNALys,
- biotechnologii medycznej, gdzie syntetyczne/półsyntetyczne hmt-tRNALeu oraz hmt-tRNALys mogą być wykorzystywane do testowania sposobów leczenia mitochondriopatii MELAS, MERRF w oparciu o hodowle komórkowe i/lub modele zwierzęce („mito-zwierzęta),
- biotechnologii farmaceutycznej, medycynie mitochondrialnej, gdzie syntetyczne/półsyntetyczne hmt-tRNALeu oraz hmt-tRNALys mogą być wykorzystywane w leczeniu mitochondriopatii, odpowiednio MELAS lub MERRF, na drodze mitochondrialnej terapii genowej, polegającej w założeniu na wprowadzaniu in vivo poprawnych hmt-tRNALeu lub hmt-tRNALys do zdefektowanych mitochondriów, skutkującym zwiększeniem populacji nieuszkodzonych hmt-tRNALeu lub hmt-tRNALys, a w efekcie poprawą funkcjonowania mitochondriów.
W dostępnej literaturze chemicznej oraz zbiorach literatury patentowej brak jest potwierdzonych eksperymentalnie informacji na temat chemicznej syntezy oligorybonukleotydów (fragmentów RNA) mo5 5 2 dyfikowanych 5-taurynometylourydyną (rm5U) lub 5-taurynometylo-2-tiourydyną (rm5s2U).
Z czasopisma Journal of Biological Chemistry, 2008, 283, 18801-18811 jest znany sposób otrzy5 mywania tRNA modyfikowanego rm5U z użyciem techniki inżynierii molekularnej. Użycie w tym sposobie 5 ligazy RNA umożliwiło wprowadzenie 5'-fosforanu rm5U na 3' - koniec oligomeru, a kolejne transformacje enzymatyczne (zastosowanie enzymów BAP, PNK) doprowadziły do uzyskania całej cząsteczki tRNALeu(UUR)(E.coli) modyfikowanej rm5U.
Najbardziej rozpowszechnioną chemiczną metodą syntezy fragmentów RNA jest metoda amidofosforynowa na nośniku, wykorzystująca monomery w postaci 5'-O-DMTr-2'-O-TBDMS oraz złoże typu CPG. Dla powodzenia tej metody niezbędny jest jednak właściwy dobór osłon dla grup funkcyjnych wykazujących potencjalną reaktywność podczas syntezy oligomeru. Wyselekcjonowane grupy ochronne muszą być ortogonalne z osłonami jednostek kanonicznych (A, U, C, G), stabilne podczas syntezy oligomeru oraz dawać się odblokować w warunkach niepowodujących degradacji zsyntetyzowanego RNA.
5 2
Obecność reaktywnej grupy sulfonowej w hipermodyfikowanych nukleozydach rm5U i rm5s2U, stwarza istotny problem w syntezie modyfikowanych nimi oligorybonukleotydów i wiąże się z koniecznością ich zabezpieczenia na czas syntezy.
PL 218 817 B1
Opisane w literaturze osłony silnie kwasowej grupy sulfonowej dotyczą głównie kwasów alkilo- lub arylosulfonowych. Dane eksperymentalne wskazują że najbardziej użytecznymi sposobami zabezpieczenia kwasów sulfonowych jest przekształcenie ich w estry (metylowy, etylowy, 2,2,2-trichloroetylowy, 2,2,2-trifluoroetylowy, propylowy, izopropylowy, izobutylowy, neopentylowy, N-Boc-4-amino-2,2-dimetylobutylowy, pentafluorofenylowy, 2,5-dimetylofenyloacetylowy, benzylowy) lub w sulfonamidy w reakcji z drugorzędowymi aminami, bądź w sole amoniowe - czasopisma Journal of Organic Chemistry, 1970, 35, 1226-1227, Journal of Organic Chemistry, 1990, 55, 4231-4233, Journal of Organic Chemistry 2009, 74, 3583-3586, Journal of Organic Chemistry, 2010, 75, 4632-4635, Tetrahedron Letters 1991, 32, 1267-1270, Tetrahedron Letters 1996, 37, 4443-4446, Tetrahedron Letters, 1997, 38, 355-358, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 2309-2323, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16, 61646777, Journal of Medicinal Chemistry, 2004, 47, 1031-1043, Organic Letters, 2005, 7, 843-846, Photochemical & Photobiological Sciences 2002, 1, 920-923, Chemische Berichte 1953, 86, 1246-1252, Macromolecules, 2004, 37, 4075-4080.
Osłony opisane w powyższych czasopismach są jednak nieodpowiednie do syntezy RNA z powodu zbyt dużej reaktywności/wrażliwości na odczynniki nukleofilowe, bądź warunków ich usuwania zagrażających stabilności oligorybonukleotydów (Me4NCl, DMF, 160°C; kwas trifluorooctowy; 2 M NaOH, 70°C; 1 N HCl, temperatura wrzenia).
W materiałach konferencyjnych Nucleic Acids Symposium Series, 2006, 50, 9-10 i 2008, 52, 3235
324 proponuje się (bez podawania szczegółów eksperymentalnych) syntezę 3'-0-amidofosforynów Tm U i Tm5s2U, oraz ich wykorzystanie w syntezie dimerów metodą amidofosforynową na nośniku. Do osłony funkcji sulfonowej tauryny stosuje się estry arylowe. Pomimo braku danych eksperymentalnych, wart pod5 5 2 kreślenia jest sposób syntezy łańcucha bocznego Tm5U i Tm5s2U poprzez kondensację reszty nukleozydowej z estrem kwasu winylosulfonowego via addycja Michaela.
W czasopiśmie 0rganic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 132-138 opisano grupę 4-(tert-butylodifenylosilanyloksy)-2,2-dimetylobutylową jako nową grupę ochronną funkcji sulfonowej w syntezie N,N-dipodstawionych pochodnych tauryny. Zaproponowana grupa ochronna ulega, pod wpływem fluorku tetrabutyloamoniowego (TBAF) w tetrahydrofuranie (THF) w temperaturze pokojowej, odblokowaniu do odpowiedniego kwasu sulfonowego, szybko i z wysokimi wydajnościami. Etapem pośrednim procesu odszczepienia wspomnianej grupy ochronnej jest stadium anionu alkoksylowego, który w wyniku wewnątrzcząsteczkowej cyklizacji uwalnia grupę sulfonową w formie soli tetrabutyloamoniowej oraz 3,3-dimetylotetrahydrofuran jako produkt uboczny. Warto podkreślić, że obecność geminalnych grup metylowych w dyskutowanej osłonie nadaje jej charakter grupy typu neopentylowego, zwiększając tym samym jej stabilność wobec czynników nukleofilowych oraz przyspieszając proces cyklizacji anionu alkoksylowego poprzez efekt Thorpego-Ingolda.
5
Sposób wytwarzania oligorybonukleotydów zawierających 5-taurynometylourydynę (Tm5U) lub
5-taurynometylo-2-tiourydynę (Tm5s2U), metodą amidofosforynową na nośniku, polegający na poddaniu złoża CPG, zawierającego przyłączoną adenozynę (rA(tac)-CPG) w ilości 32 μmola rA(tac)/1 g złoża, detrytylacji za pomocą 3% roztworu kwasu trichlorooctowego w dichlorometanie, w temperaturze pokojowej w czasie 90 s, następnie kondensacji z jednostką monomeryczną w postaci 5'-0-DMTr-2'-0-TBDMS-3'-0-(β-cyjanoetylo-W,W-diizopropylo)amidofosforynu, w którym DMTr oznacza grupę 4,4'-dimetoksytrytylową, zaś TBDMS grupę tert-butylodimetylosililową przy 10-krotnym nadmiarze molowym jednostki monomerycznej użytej w postaci 0,1 M roztworu w acetonitrylu, w obecności aktywatora w postaci 0,35 M roztworu 5-(benzylomerkapto)-1H-tetrazolu w acetonitrylu, użytego w stosunku objętościowym 1,1:1 względem roztworu jednostki monomerycznej, w temperaturze pokojowej w czasie 6 min, reakcji acylowania nieprzereagowanych grup 5'-hydroksylowych za pomocą mieszaniny bezwodnika p-tert-butylofenoksyoctowego (tac2O) i tetrahydrofuranu (THF) o stosunku składników 5/100, w/v oraz mieszaniny N-metyloimidazolu i THF o stosunku objętościowym składników 16/84, przy stosunku objętościowym mieszanin tac2O/THF i N-metyloimidazol/THF 1:1, w temperaturze pokojowej, utlenieniu fosforynu do fosforanu, powtórzeniu opisanych wyżej operacji począwszy od procesu detrytylacji aż do osiągnięcia wymaganej długości oligorybonukleotydu, detrytylacji ostatniej dołączonej jednostki monomerycznej w warunkach jak opisano wyżej, odblokowaniu oligomeru i odcięciu od złoża, strąceniu poprzez dodanie eteru etylowo-trimetylosililowego w ilości 3 ml /1 ml substancji użytej w procesie odblokowywania do usuwania krzemoorganicznych grup ochronnych, a następnie wytrząsanie i dodanie eteru tert-butylowo-metylowego w ilości 5 ml /1 ml eteru etylowo-trimetylosililowego, ponowne wytrząsanie, odwirowanie przy szybkości obrotów 13 300 rpm w temperaturze 4°C w czasie 5 min i dwukrotne przemycie strąconego oligomeru za pomocą eteru tert-butylowo-metylowego dodanego w ilości jak opisano
PL 218 817 B1 wyżej, wytrząsanie i odwirowanie w opisanych wyżej warunkach, następnie oczyszczaniu odblokowanego oligorybonukleotydu techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) na kolumnie anionowymiennej termostatowanej w temperaturze 38°C oraz odsoleniu otrzymanego oligorybonukleotydu, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że jako hipermodyfikowane jednostki monomeryczne stosuje się 3'-0-amidofosforyny 5-taurynometylourydyny lub 5-laurynometylo-2-tiourydyny, o wzorze 1
w którym X = O lub S. Jako układ utleniający w syntezie oligorybonukleotydu stosuje się 0,02 M roztwór jodu w mieszaninie tetrahydrofuran/woda/pirydyna (I2 w THF/H2O/pirydyna ) o stosunku objętościowym składników 90,54/9,05/0,41, w ilości 6,25 ml / 1 g rA(tac)-CPG, w temperaturze pokojowej w czasie 90 s, zaś w etapie odblokowania oligomeru najpierw usuwa się grupy β-cyjanoetylowe z funkcji fosforanowych działając mieszaniną trietyloaminy i acetonitrylu o stosunku objętościowym składników 1:1, użytą w ilości 40 ml/1 g rA(tac)-CPG, w temperaturze pokojowej w czasie 20 min, następnie usuwa supernatant, złoże suszy się pod próżnią, zalewa 7 M roztworem alkoholu etylowego nasyconego gazowym amoniakiem użytym w ilości 53 ml /1 g rA(tac)-CPG i pozostawia w temperaturze pokojowej w czasie 8 h, supernatant usuwa się znad złoża i odparowuje pod próżnią, pozostałość rozpuszcza się w N-metylo-2-pirolidonie (NMP) użytym w ilości 6,25 ml/1 g rA(tac)-CPG, po czym odblokowuje się w oligomerze jednocześnie grupy 2'-hydroksylowe i grupę sulfonową działając trifluorowodorkiem trietyloaminy (Et3N x 3HF) stosowanym w ilości 6,25 ml/1 g rA(tac)-CPG, w temperaturze pokojowej w czasie 24 h.
Sposób wytwarzania hipermodyfikowanych jednostek monomerycznych do syntezy oligorybonu5 5 2 kleotydów zawierających 5-taurynometylourydynę (Tm U) lub 5-tauryno-metylo-2-tiourydynę (Tm s U), o wzorze 1, według wynalazku, polega na tym, że 5-azydometylourydynę lub 5-azydometylo-2-tiourydynę, o wzorze ogólnym 2
w którym X = O lub S, zabezpiecza się na funkcji 5'-hydroksylowej grupą DMTr w drodze reakcji z chlorkiem 4,4'-dimetoksytrytylu (DMTr-Cl), użytym w 1,2-krotnym nadmiarze molowym względem nukleozydu o wzorze 2, w obecności pirydyny w temperaturze pokojowej w czasie 24 h, w wyniku czego otrzymuje się związki o wzorze ogólnym 3
PL 218 817 B1 w którym X = O lub S, które poddaje się sililowaniu za pomocą chlorku tert-butylo-dimetylosililu (TBDMS-Cl) stosowanego w 1,25-krotnym nadmiarze molowym względem nukleozydu o wzorze 3, w obecności imidazolu użytego w 3-krotnym nadmiarze molowym względem nukleozydu o wzorze 3 i pirydyny, w temperaturze pokojowej w czasie 20 h dla X = O i 46 h dla X = S. Jako produkt sililowania otrzymuje się dwa regiomeryczne produkty o ogólnym wzorze 4
z których w jednym R1 = H, R2 = TBDMS, zaś X = O lub S, zaś w drugim R1 = TBDMS, R2 = H, zaś X = O lub S. Produkty te poddaje się najpierw działaniu trifenylofosfiny stosowanej w 1,6-krotnym nadmiarze molowym względem mieszaniny nukleozydów o wzorze 4, w pirydynie w temperaturze pokojowej w czasie 18 h, a następnie 25% wody amoniakalnej użytej w ilości 6 ml/mmol mieszaniny nukleozydów o wzorze 4, w temperaturze pokojowej w czasie 3 h, w wyniku czego powstaje mieszanina dwóch produktów izomerycznych o wzorze ogólnym 5
z których w jednym R1 = H, R2 = TBDMS, zaś X = O lub S, zaś w drugim R1 = TBDMS, R2 = H, zaś X = O lub S. Produkty te poddaje się reakcji Michaela z estrem winylosulfonowym o wzorze 6
w którym TBDPS oznacza grupę tert-butylodifenylosililową, stosowanym w ilości równomolowej względem mieszaniny regiomerycznych nukleozydów o wzorze 5, w metanolu, w temperaturze 0°C w czasie 7 h, otrzymując izomeryczne produkty reakcji Michaela, o wzorze ogólnym 7
X = O lub S, które wyizolowuje się i bez oczyszczania poddaje reakcji z bezwodnikiem trifluorooctowym stosowanym w 3-krotnym nadmiarze molowym względem mieszaniny nukleozydów o wzorze 7, w pirydynie w temperaturze 0°C w czasie 2 h, a otrzymany w wyniku tego produkt w postaci mieszaniny izomerycznych nukleozydów, o wzorze ogólnym 8
PL 218 817 B1
wzór 8, z których w jednym R1 = H, R2 = TBDMS, zaś X = O lub S, zaś w drugim R1 = TBDMS, R2 = H, zaś X = O lub S, rozdziela się z wykorzystaniem chromatografii kolumnowej i nukleozyd o wzorze 9
w którym X = O lub S, poddaje się reakcji fosfitylacji za pomocą β-cyjanoetylo-W.Wdiizopropylochlorofosfiny i etylodiizopropyloaminy użytych odpowiednio w nadmiarze molowym 2 i 4-krotnym względem nukleozydu o wzorze 9, w chlorku metylenu w temperaturze pokojowej w czasie 4 h, w wyniku czego powstaje monomer o wzorze 1.
Schemat syntezy monomerów o wzorze 1 przedstawiono poniżej.
PL 218 817 B1 (a) DMTr-Cl, pirydyna, temperatura pokojowa, 24 h; (b) TBDMS-Cl, imidazol, pirydyna, temperatura pokojowa, 20-46 h; (c) Ph3P, pirydyna, temperatura pokojowa, 18 h; (d) 25% NH4OH, temperatura pokojowa, 3 h; (e) CH3OH, 0°C, 7 h; (f) (CF3CO)2O, pirydyna, 0°C, 2 h; (g) β-cyjanoetylo-WW-diizopropylochlorofosfina, etylodiizopropyloamina, CH2CI2, temperatura pokojowa, 4 h.
W sposobie według wynalazku stosuje się następujące grupy ochronne 3'-O-amidofosforynów o wzorze 1: 5'-O-DMTr, 2-O-TBDMS, β-cyjanoetyl na W,W-diizopropyloamidofosforynie, grupę trifluoroacetylową na drugorzędowej funkcji aminowej w łańcuchu bocznym oraz grupę 4-(tert-butylodifenylosilanyloksy)-2,2-dimetylobutylową na funkcji sulfonowej. Szczególnie istotne znaczenie ma grupa 4-(tert-butylodifenylosilanyloksy)-2,2-dimetylobutylowa jako osłona funkcji sulfonowej związków o wzorze 1.
W syntezie oligorybonukleotydów według wynalazku stosuje się system utleniający w postaci 0,02 M roztworu I2 w THF/H2O/pirydyna, o stosunku objętościowym składników 90,54/9,05/0,41 w temperaturze pokojowej w czasie 90 s. Zastosowanie rozcieńczonego roztworu jodu, w miejsce standardowo stosowanego 0,16 M roztworu jodu, ogranicza zachodzenie ubocznych reakcji utleniania i/lub oksydatyw52 nej desulfuracji z udziałem grupy 2-tiokarbonylowej rm s U.
W procedurze odblokowania oligomeru w pierwszej kolejności usuwa się osłony β-cyjanoetylowe przy użyciu mieszaniny trietyloaminy i acetonitrylu o stosunku objętościowym składników 1:1, co jest korzystne, ponieważ eliminuje niepożądane reakcje alkilowania zasad nukleinowych oligorybonukleotydu przez uwolniony akrylonitryl, na drodze reakcji Michaela. Następnie wykorzystuje się bezwodny etanol nasycony gazowym amoniakiem do usunięcia grup zasadowolabilnych oraz odcięcia oligomeru od nośnika. Odblokowanie w etapie końcowym jednocześnie grup 2'-hydroksylowych w resztach cukrowych oraz
5 2 funkcji sulfonowej rm5U lub rm5s2U przy wykorzystaniu do tego celu Et3N x 3HF w NMP jest korzystne, ponieważ ogranicza ilość etapów deblokowania i ilość dodatkowo wprowadzanych reagentów. Korzystne jest zastosowanie Et3N x 3HF w miejsce fluorku tetrabutyloamoniowego (TBAF), ponieważ umożliwia łatwą izolację odblokowanego oligorybonukleotydu poprzez strącenie, bez pośredniego etapu odsolenia. Ponad52 to okazało się, że jedyną skuteczną metodą otrzymania oligomerów zawierających rm5s2U jest użycie Et3N 52 x 3HF ze względu na ograniczony stopień degradacji funkcji 2-tiokarbonylowej rm5s2U.
Do osłony funkcji sulfonowej tauryny w jednostkach monomerycznych o wzorze 1 wykorzystano grupę 4-(tert-butylodifenylosilanyloksy)-2,2-dimetylobutylową. Grupa ta cechuje się stabilnością podczas syntezy jednostek monomerycznych o wzorze 1, jak również podczas syntezy oligorybonukleotydów, jest odporna na alkaliczne warunki ich deblokowania oraz odcinania oligomeru od nośnika (bezwodny EtOH nasycony gazowym amoniakiem). Ponadto osłona ta jest usuwana w łagodnych warunkach, za pomocą Et3N x 3HF, co nie powoduje znaczącej degradacji syntetycznego oligomeru. Jak chodzi o syntezę jednostek monomerycznych należy podkreślić, że rozdział izomerycznych produktów sililowania jak i redukcji grupy azydkowej (związki o wzorach 4, 5) nie jest konieczny, ponieważ zarówno reakcja redukcji azydku do aminy jak i następcza reakcja Michaela są prowadzone w warunkach sprzyjających procesowi izomeryzacji (2'-O-TBDMS * 3'-O-TBDMS).
W syntezie jednostek monomerycznych o wzorze 1 korzystne jest zachowanie odpowiedniej kolejności usuwania/wprowadzania grup ochronnych, a mianowicie wprowadzenie kolejno osłon 5'-O-DMTr i 2'(3')-O-TBDMS, następnie reakcja Michaela pomiędzy nukleozydami i estrem winylosulfonowym oraz wprowadzenie osłony trifluoroacetylowej. Takie rozwiązanie pozwala uniknąć ryzykownego, wobec osłony 4-(tert-butylodifenylosilanyloksy)-2,2-dimetylobutylowej, usuwania kwasowolabilnych grup ochronnych tj. grupa 2',3'-O-izopropylidenowa w sytuacji przeprowadzenia syntezy według odmiennej strategii.
Sposób według wynalazku można wykorzystać do syntezy dowolnych fragmentów RNA zawie5 5 2 rających 5-taurynometylourydynę (rm5U) lub 5-taurynometylo-2-tiourydynę (rm5s2U) lub złożonych konstruktów chemicznych jak siRNA, koniugaty peptyd-RNA.
Sposób według wynalazku jest szczególnie korzystny jako sposób syntezy fragmentów mitochondrialnych tRNALeu lub tRNALys niosących, odpowiednio rm5U i rm5s2U, ponieważ pozwala uzyskać modelowe biopolimery tRNALeu lub tRNALys umożliwiające wyjaśnienie strukturalnych uwarunkowań ich aktywności biologicznej, w szczególności wpływu podstawnika taurynowego na konformację ramienia antykodonu oraz jego rolę w procesie dekodowania informacji genetycznej. Badania tego typu mogą być prowadzone w roztworze i na krystalicznym rybosomie, według metod zaprezentowanych w czasopiśmie Wature Structural and Molecular Biology, 2007,14, 498-502; Biochemistry, 2008,
47, 6117-6129. W 2008 roku podjęto próbę wyjaśnienia funkcji podstawnika taurynowego w strukturze 5 rm5U34 na proces dekodowania informacji genetycznej [czasopismo Journal of Biological Chemistry,
2008, 283, 18801-18811]. Wykorzystano jednak nienatywną sekwencję oligorybonukleotydu oraz użyto cytozolowe rybosomy drożdżowe w miejsce rybosomów mitochondrialnych. Analiza gęstości
PL 218 817 B1 elektronowej podstawnika taurynowego w strukturze krystalicznej kompleksu [tRNA - podjednostka 30S rybosomy - mRNA] nie dała jednoznacznych wyników.
W oparciu o doniesienia literaturowe istnieje realna możliwość wykorzystania sposobu według wynalazku do syntezy całych cząsteczek hmt-tRNALeu oraz hmt-tRNALys, w oparciu o technologię rekombinacji fragmentów RNA in vitro (ligacja fragmentów RNA - zbudowanych na matrycy DNA - z syntetycznym fragmentem hmt-tRNALeu,Lys) [czasopismo RNA, 2005, 11, 1909-1914]. Nie wyklucza się również możliwości przeprowadzenia chemicznej syntezy całych cząsteczek hmt-tRNA. Warto podkreślić, że istnieje ograniczona dostępność do izolowanych, natywnych biocząsteczek hmt-tRNA, a bezpośrednie transkrypty odpowiednich genów pozbawione są naturalnie występujących modyfikacji. Syntetyczne cząsteczki hmt-tRNALeu lub hmt-tRNALys uzyskane w wyniku zastosowania wynalazku mogą przynieść szereg korzyści. W pierwszej kolejności mogą umożliwić określenie trzeciorzędowej struktury tych bio5 5 2 cząsteczek, oraz indywidualnego wpływu modyfikowanych nukleozydów, Tm U lub Tm s U, na aranżację przestrzenną obu RNA [czasopismo Chemistry & Biology, 2011, 18(7), 928-36]. To z kolei przyczyniłoby się do określenia molekularnego mechanizmu patogenezy chorób mitochondrialnych MELAS i/lub MERRF spowodowanych punktowymi mutacjami w genach odpowiednio hmtRNALeu i hmtRNALys.
Najważniejszym skutkiem wynalazku jest możliwość wykorzystania syntetycznych/ półsyntetycznych hmt-tRNALeu i hmt-tRNALys w leczeniu mitochondriopatii MELAS i/lub MERRF. Ostatnie doniesienia wskazują, że w badaniach in vitro, egzogenne RNA ulegają transportowi do komórek ssaczych, i dalej do mitochondriów, z wykorzystaniem - jako nośnika RNA - kompleksu RIC z Leishmania tropica [czasopismo Journal of Biological Chemistry 2005, 280, 5141-5144; czasopismo Science, 2006, 314, 471-474; czasopismo Mitochondrion, 2011, 11, 607-614; czasopismo Mitochondrion, 2012, 12(2), 262-270], Efektem transportu egzogennych RNA, w tym również tRNA, była poprawa translacji w zdefektowanych mitochondriach. Co więcej omawiana strategia okazała się efektywna w warunkach in vivo, umożliwiając wydajny transport RNA-RIC, między innymi, do zdefektowanych mitochondriów mięśni szkieletowych szczura.
Podkreśla się, że opisane rezultaty mogą mieć zastosowanie dla opracowania mitochondrialnej terapii genowej.
Wobec opisanych powyżej faktów, istnieje możliwość wykorzystania syntetycznych/ półsyntetycznych hmt-tRNALeu i hmt-tRNALys, otrzymanych z zastosowaniem sposobu według wynalazku, do konstruowania mitochondriów i/lub komórek i/lub tkanek i/lub organów, pozbawionych defektów MELAS i/lub MERRF, jak również do testowania in vivo sposobów leczenia mitochondriopatii na modelach zwierzęcych („mito-zwierzętach). Nie wyklucza się również wykorzystania syntetycznych/półsyntetycznych hmt-tRNALeu, hmt-tRNALys, otrzymanych z zastosowaniem sposobu według wynalazku do leczenia mitochondriopatii MELAS i/lub MERRF poprzez na przykład wprowadzenie in vivo poprawnych mt-tRNALeu, mt-tRNALys (z zastosowaniem mitochondriotopowego nośnika) do zdefektowanych mitochondriów, co spowoduje zwiększenie populacji nieuszkodzonych hmt-tRNA i w efekcie poprawę funkcjonowania mitochondriów.
Sposób według wynalazku ilustruje poniższy przykład, z powołaniem się na oznaczenia zamieszczone na powyższym schemacie.
P r z y k ł a d.
5
Syntezy 13-merów i 17-merów RNA modyfikowanych 5-taurynometylourydyną (Tm5U) i 5-tauryno-metylo-2-tiourydyną (Tm5s2U), o sekwencjach odpowiadających ramieniu antykodonu hmt-tRNALeu (a,b) oraz hmt-tRNALys(c,d):
(a) 5'-A26UAAAACU-Tm5U34-AAAA38-3' (b) 5'-U27AAAACU-Tm5U34-AAAACUUUA43-3' (c) 5 ' -A26UUAACCU-Tm5s2U34-UUAA38-3' (d) 5 '-U27UAACCU-Tm5s2U34-UUAAGUUAA43-3' przeprowadzono w skali 1 μmola na syntetyzerze DNA/RNA, wykorzystując handlowo dostępne jednostki kanoniczne A, U, C, G w postaci 5'-0-DMTr-2'-0-TBDMS-3'-0-(β-cyjanoetylo-W,W-diizopropylo)amidofosforynów, z funkcjami egzaminowymi zabezpieczonymi grupą tac (Proligo®) oraz w pełni 5 zabezpieczone 3'-O-amidofosforyny 5-taurynometylourydyny (Tm5U) lub 5-taurynometylo-2-tiourydyny (Tm5s2U), o wzorze 1.
Hipermodyfikowane jednostki monomeryczne, o wzorze 1, otrzymano w wyniku wieloetapowego cyklu reakcji chemicznych, zgodnie z zamieszczonym wcześniej schematem. Materiałem wyjściowym były 5 azydometylourydyna 2a (X=O) oraz 5-azydometylo-2-tiourydyna 2b (X=S), które zabezpieczono na funkcji 5'-hydroksylowej, grupą DMTr, według następującej procedury: 5-azydometylourydynę/5-azydometylo-2-tiourydynę (2a, 2b) (1,71 mmola) rozpuszczono w 20 ml bezwodnej pirydyny, dodano
PL 218 817 B1
DMTr-Cl (2 mmol), następnie całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h, po czym dodano 10 ml wody i ekstrahowano chloroformem (CHCI3) (3 x 20 ml), połączone ekstrakty organiczne przemyto wodą (2 x 20 ml) i suszono nad bezwodnym siarczanem magnezu (MgSO4), odsączono środek suszący, odparowano rozpuszczalniki, a surowy produkt oczyszczono techniką chromatografii kolumnowej, eluując w gradiencie układem CHCl3:MeOH, w wyniku czego uzyskano nukleozyd 3a z wydajnością 69%, zaś 3b z wydajnością 74%. Nukleozydy 3a i 3b poddano reakcji sililowania według następującej procedury:
nukleozyd 3a/3b (1 mmol) rozpuszczono w 10 ml bezwodnej pirydyny, dodano imidazol (3 mmol), po 5 min dodano TBDMS-Cl (1,25 mmola) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 20 h w przypadku związku 3a, zaś 46 h w przypadku związku 3b, po tym czasie do mieszaniny reagentów dodano 10 ml wody i ekstrahowano CHCI3 (3 x 17 ml), połączone ekstrakty organiczne suszono nad MgSO4, odsączono środek suszący, rozpuszczalniki odparowano, a pozostałość oczyszczono techniką chromatografii kolumnowej, eluując chloroformem, w wyniku czego uzyskano mieszaninę izomerycznych urydyn 4a, 5a (X=O) z wydajnością 83% zaś mieszaninę 4b, 5b (X=S) z wydajnością 80%.
W kolejnym etapie przeprowadzono redukcję grupy azydkowej mieszanin izomerów 4a, 5a (X=O) oraz 4b, 5b (X=S) według następującej procedury:
mieszaninę izomerów 4a, 5a/4b, 5b (0,86 mmol) rozpuszczono w 5 ml bezwodnej pirydyny, dodano trifenylofosfinę (1,38 mmol) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 h, następnie dodano 5 ml 25% wodnego roztworu NH4OH, mieszanie kontynuowano przez 3 h, po czym odparowano amoniak, a pozostałość ekstrahowano CHCl3 (3 x 15 ml), połączone ekstrakty organiczne suszono nad MgSO4, środek suszący odsączono, rozpuszczalniki odparowano, a surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej eluując w gradiencie układem CHCl3:MeOH, w wyniku czego uzyskano mieszaninę izomerycznych urydyn 6a, 7a (X=O) z wydajnością 98%, zaś mieszaninę 6b, 7b (X=S) z wydajnością 86%.
Izomeryczne pochodne 5-aminometylourydyny 6a, 7a i 5-aminometylo-2-tiourydyny 6b, 7b poddano reakcji Michaela z estrem winylosulfonowym o wzorze 12 (ester winylosulfonowy otrzymano w oparciu o procedurę opisaną w czasopiśmie Organic and Biomolecular Chemistry. 2007, 5, 132-138) według następującej procedury:
mieszaninę związków 6a, 7a/6b, 7b (0,75 mmol) rozpuszczono w 2,6 ml bezwodnego MeOH, schłodzono do 0°C, następnie wkroplono roztwór estru kwasu winylosulfonowego ( 0,75 mmol) w 375 μl bezwodnego MeOH, reagenty mieszano w temperaturze 0°C przez 7 h, po czym odparowano rozpuszczalnik, w wyniku czego uzyskano mieszaniny odpowiednich estrów 8a, 9a oraz 8b, 9b, w postaci białej piany. Surowe produkty, bez oczyszczania poddano reakcji z bezwodnikiem trifluorooctowym. W tym celu mieszaninę regiomerycznych nukleozydów rozpuszczono w 15 ml bezwodnej pirydyny. Po ochłodzeniu roztworu do temperatury 0°C wkroplono bezwodnik trifluorooctowy (2,25 mmol) i całość mieszano w tej temperaturze przez 2 h. Do mieszaniny reagentów dodano 5% wodny roztwór NaHCO3 (50 ml) i całość mieszano w temperaturze 0°C przez 10 min. Zawartość kolby przeniesiono następnie do rozdzielacza. Warstwę wodną ekstrahowano CHCI3 (3 x 50 ml), połączone ekstrakty organiczne przemyto wodą (1 x 50 ml) oraz solanką (1 x 50 ml), warstwę organiczną suszono nad MgSO4, środek suszący odsączono, rozpuszczalniki odparowano, a regiomery 2'-O-TBDMS 10a, 10b rozdzielono od 3'-O-TBDMS 11a, 11b techniką chromatografii kolumnowej stosując gradientowy układ eluujący CH2Cl2:aceton. Izomer 2'-O-TBDMS 10a (X=O) i 10b (X=S) otrzymano z wydajnością odpowiednio 65% i 60%.
Jako ostatni etap syntezy wykonano reakcję fosfitylacji nukleozydów 10a (X=O) i 10b (X=S), według następującej procedury:
nukleozyd 10a i 10b (0,5 mmol) rozpuszczono w 3,2 ml CH2CI2, dodając jednocześnie DIPEA (2 mmol) i e-cyjanoetylo-W,W-diizopropyloaminochlorofosfinę (1 mmol), reakcję prowadzono w atmosferze argonu, w temperaturze pokojowej przez 4 h, po czym mieszaninę reagentów rozcieńczono 12-krotnie za pomocą CH2CI2, następnie przemyto 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (1 x 8,5 ml) oraz wodą (1 x 8,5 ml), warstwę organiczną suszono nad MgSO4 i po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu rozpuszczalników, surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej stosując układ eter naftowy/AcOEt (2:1, v/v) oraz nadciśnienie argonu; docelowe 3'-O-amidofosforyny 1a, 1b, otrzymane z wydajnością 85%, zliofilizowano z benzenu i przechowywano w temperaturze -20°C do chwili użycia.
Dla przeprowadzenia syntezy oligorybonukleotydów odważono 32 mg handlowo dostępnego złoża
CPG, 500 A, z przyłączoną adenozyną (rA(tac)-CPG, Proligo®), o obsadzeniu 32 μmol rA(tac)/1 g złoża.
Następnie przygotowano 0,1 M roztwory amidofosforynów w acetonitrylu, z założeniem użycia ich
PL 218 817 B1 w 10-krotnym nadmiarze molowym w stosunku do rA(tac)-CPG. W pierwszym cyklu syntezy prowadzono kolejno:
- detrytylację pierwszej jednostki przyłączonej do złoża za pomocą handlowo dostępnego 3% roztworu kwasu trichlorooctowego w chlorku metylenu (Proligo®), użytego w ilości 480 μ|, w temperaturze pokojowej w czasie 2 x 45s,
- sprzęganie jednostki monomerycznej z fragmentem przyłączonym do złoża, stosując 100 μ| jednostki monomerycznej oraz 110 μ| aktywatora w postaci 0,35 M roztworu 5-(benzy|omerkapto)-1H-tetrazo|u w acetonitrylu (MeCN), reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej w czasie 6 min,
- acylowanie za pomocą mieszaniny bezwodnika p-tert-buty|ofenoksyoctowego (tac2O) i tetrahydrofuranu (THF) o stosunku składników 5/100, w/v, o nazwie hand|owej Fast Deprotection Cap A (Pro|igo®), oraz mieszaniny N-mety|oimidazo|u i THF o stosunku objętościowym składników 16/84, o nazwie handlowej Cap B (Proligo®), stosując mieszaninę 125 μ| CapA oraz 125 μ| Cap B, reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej w czasie 40 s,
- utlenienie fosforynu do fosforanu przy użyciu 200 μ| 0,02 M roztworu jodu w mieszaninie tetrahydrofuran/woda/pirydyna (THF/H2O/pirydyna) o stosunku objętościowym składników 90,54/9,05/0,41 (Proligo®), w temperaturze pokojowej w czasie 90 s.
Opisane wyżej operacje powtórzono aż do osiągnięcia wymaganej długości oligorybonuk|eotydu. Na koniec przeprowadzono detrytylację ostatniej dołączonej jednostki monomerycznej w warunkach jak opisano wyżej. Następnie prowadzono deblokowanie oraz odcięcie oligorybonukleotydów od złoża w następującym porządku:
- usunięcie grup β-cyjanoetylowych z funkcji fosforanowych, za pomocą 1,3 ml mieszaniny Et3N i MeCN (1:1, v/v) w temperaturze pokojowej, w czasie 20 min,
- usunięcie supernatantu,
- wysuszenie złoża z oligomerem i zalanie 1,7 ml 7 M bezwodnego EtOH nasyconego gazowym amoniakiem, w temperaturze pokojowej w czasie 8 h, w celu usunięcia grup ochronnych -tac, -C(O)CF3 oraz odcięcia oligomeru od złoża,
- odparowanie supernatantu i rozpuszczenie pozostałości w 200 μl W-metylo-2-pirolidonu (ACROS Organics®),
- dodanie 200 μl Et3N x 3HF (ACROS Organics®) w temperaturze pokojowej w czasie 24 h,
5 2 w celu odblokowania grup 2'-hydroksylowych oligomeru oraz funkcji sulfonowej rm U /rm s U,
- strącenie oligomeru poprzez dodanie 600 μl eteru etylowo-trimetylosililowego, a następnie wytrząsanie przez 10 min i dodanie 3 ml eteru tert-butylowo-metylowego (Sigma-Aldrich®), ponownie wytrząsanie, odwirowanie (13 300 rpm, 4°C, 5 min) i dwukrotne przemycie strąconego oligomeru za pomocą 3 ml eteru tert-butylowo-metylowego, wytrząsanie i odwirowanie w opisanych powyżej warunkach.
Oczyszczanie w pełni odblokowanego oligorybonukleotydu przeprowadzono techniką HPLC, na kolumnie anionowymiennej Source™ 15Q 4.6/100PE (Amersham Bioscences), termostatowanej w temperaturze 38°C. Zastosowano liniowy gradient NaBr (50 mM - 0.65 M) w 20 mM buforze Na2HPO4-NaH2PO4 (pH 7.5), zawierającym EDTA (100 μM) i 10% objętościowych CH3CN; przepływ 1 ml/min. Frakcje zawierające żądany oligorybonukleotyd odsolono na kolumienkach Sep-Pack® C18 50-105 μm (Waters).
Otrzymano 10-20 OD260 syntetycznych oligorybonukleotydu, których homogeniczność i prawidłowy ciężar cząsteczkowy potwierdzono analizami MS MALDI-ToF, co ilustrują przedstawione poniżej widma, na których znaleziona masa jonu molekularnego (m/z) jest w zgodzie z masą obliczoną: widmo 1 jest wid5 mem masowym 13-meru 5'-AUAAAACU-rm5U-AAAA-3' dla którego masa obliczona wynosi 4261.77 Da, +5 znaleziona 4262.32 m/z (dla jonu [M+H]+); widmo 2 jest widmem masowym 17-meru 5'-UAAAACU-rm5UAAAACUUUA-3', dla którego masa obliczona wynosi 5485.48 Da, znaleziona 5484.8 m/z (dla jonu [M-H]-; T18 - wewnętrzny wzorzec do kalibracji masy dla którego [M-H]- = 5412.6 m/z); widmo 3 jest widmem masowym 13-meru 5'-AUUAACCU-rm5s2U-UUAA-3', dla którego masa obliczona wynosi 4184.69 Da, znale+ 5 2 ziona 4185.696 m/z (dla jonu [M+H]+); widmo 4 jest widmem masowym 17-meru 5'-UUAACCU-rm5s2UUUAAGUUAA-3', dla którego masa obliczona wynosi 5471.47 Da, znaleziona 5470.5 m/z (dla jonu [M-H]-;
T18 - wewnętrzny wzorzec do kalibracji masy dla którego [M-H]- = 5412.6 m/z).
PL 218 817 B1
PL 218 817 B1
widmo 3.
% Iłitensćty
widmo 4.
PL 218 817 B1
Claims (2)
1. Sposób wytwarzania oligorybonukleotydów zawierających 5-taurynometylourydynę lub 5-taurynometylo-2-tiourydynę, metodą amidofosforynową na nośniku, polegający na poddaniu złoża CPG, zawierającego przyłączoną adenozynę o obsadzeniu 32 μmola adenozyny/1 g złoża, detrytylacji za pomocą 3% roztworu kwasu trichlorooctowego w dichlorometanie, w temperaturze pokojowej w czasie 90 s, następnie kondensacji z jednostką monomeryczną w postaci 5'-0-DMTr-2'-0-TBDMS-3'-0-(β-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo)amidofosforynu, w którym DMTr oznacza grupę 4,4'-dimetoksytrytylową, zaś TBDMS grupę tert-butylodimetylosililową, przy 10-krotnym nadmiarze molowym jednostki monomerycznej użytej w postaci 0,1 M roztworu w acetonitrylu, w obecności aktywatora w postaci 0,35 M roztworu 5-(benzylomerkapto)-1H-tetrazolu w acetonitrylu, użytego w stosunku objętościowym 1,1:1 względem roztworu jednostki monomerycznej, w temperaturze pokojowej w czasie 6 min, reakcji acylowania nieprzereagowanych grup 5'-hydroksylowych za pomocą mieszaniny bezwodnika p-tert-butylofenoksyoctowego i tetrahydrofuranu, o stosunku składników 5/100, w/v, oraz mieszaniny N-metyloimidazolu i tetrahydrofuranu, o stosunku objętościowym składników 16/84, przy stosunku objętościowym mieszanin bezwodnik p-tert-butylofenoksyoctowy i tetrahydrofuran /N-metyloimidazol i tetrahydrofuran 1:1, w temperaturze pokojowej, utlenieniu fosforynu do fosforanu, powtórzeniu opisanych wyżej operacji począwszy od procesu detrytylacji aż do osiągnięcia wymaganej długości oligorybonukleotydu, detrytylacji ostatniej dołączonej jednostki monomerycznej w warunkach jak opisano wyżej, odblokowaniu oligomeru i odcięciu od złoża, strąceniu poprzez dodanie eteru etylowo-trimetylosililowego w ilości 3 ml / 1 ml substancji użytej w procesie odblokowywania do usuwania krzemoorganicznych grup ochronnych, a następnie wytrząsanie i dodanie eteru tert-butylowo-metylowego w ilości 5 ml /1 ml eteru etylowotrimetylosililowego, ponowne wytrząsanie, odwirowanie przy szybkości obrotów 13 300 rpm w temperaturze 4°C w czasie 5 min i dwukrotne przemycie strąconego oligomeru za pomocą eteru tert-butylowometylowego dodanego w ilości jak opisano wyżej, wytrząsanie i odwirowanie w opisanych wyżej warunkach, następnie oczyszczaniu odblokowanego oligorybonukleotydu techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej na kolumnie anionowymiennej termostatowanej w temperaturze 38°C oraz odsoleniu otrzymanego oligorybonukleotydu, znamienny tym, że jako hipermodyfikowane jednostki monomeryczne stosuje się 3'-0-amido-fosforyny 5-taurynometylourydyny lub 5-taurynometylo-2-tiourydyny, o wzorze 1 w którym X = O lub S, przy czym jako układ utleniający w syntezie oligorybonukleotydów stosuje się 0,02 M roztwór jodu w mieszaninie tetrahydrofuran/woda/pirydyna o stosunku objętościowym składników 90,54/9,05/0,41, w ilości 6,25 ml /1 g złoża CPG z przyłączoną adenozyną, w temperaturze pokojowej w czasie 90 s, zaś w etapie odblokowania oligomeru najpierw usuwa się grupy β-cyjanoetylowe z funkcji fosforanowych działając mieszaniną trietyloaminy i acetonitrylu o stosunku objętościowym składników 1:1, użytą w ilości 40 ml /1 g złoża CPG z przyłączoną adenozyną, w temperaturze pokojowej w czasie 20 min, następnie usuwa supernatant, złoże suszy się pod próżnią, zalewa 7 M roztworem alkoholu etylowego nasyconego gazowym amoniakiem użytym w ilości 53 ml /1 g złoża CPG z przyłączoną adenozyną i pozostawia w temperaturze pokojowej w czasie 8 h, supernatant usuwa się znad złoża i odparowuje pod próżnią pozostałość rozpuszcza się w N-metylo-2-pirolidonie użytym w ilości 6,25 ml /1 g złoża CPG z przyłączoną adenozyną, po czym odblokowuje się w oligomerze jednocześnie grupy
PL 218 817 B1
2'-hydroksylowe i grupę sulfonową działając trifluorowodorkiem trietyloaminy stosowanym w ilości 6,25 ml /1 g złoża CPG z przyłączoną adenozyną, w temperaturze pokojowej w czasie 24 h.
2. Sposób wytwarzania hipermodyfikowanych jednostek monomerycznych do syntezy oligorybonukleotydów zawierających 5-taurynometylourydynę lub 5-taurynometylo-2-tiourydynę, o wzorze 1, określonych w zastrz. 1, znamienny tym, że 5-azydometylourydynę lub 5-azydometylo-2-tiourydynę, o wzorze ogólnym 2 w którym X = O lub S, zabezpiecza się na funkcji 5'-hydroksylowej grupą DMTr w drodze reakcji z chlorkiem 4,4'-dimetoksytrytylu, użytym w 1,2-krotnym nadmiarze molowym względem nukleozydu o wzorze 2, w obecności pirydyny w temperaturze pokojowej w czasie 24 h, w wyniku czego otrzymuje się związki o wzorze ogólnym 3 w którym X = O lub S, które poddaje się sililowaniu za pomocą chlorku tert-butylo-dimetylosililu stosowanego w 1,25-krotnym nadmiarze molowym względem nukleozydu o wzorze 3, w obecności imidazolu użytego w 3-krotnym nadmiarze molowym względem nukleozydu o wzorze 3 i pirydyny, w temperaturze pokojowej w czasie 20 h dla X = O i 46 h dla X = S, powstałe w wyniku sililowania dwa regiomeryczne produkty o ogólnym wzorze 4 o
wzór 4, z których w jednym R1 = H, R2 = TBDMS, zaś X = O lub S, zaś w drugim R1 = TBDMS, R2 = H, zaś X = O lub S, poddaje się najpierw działaniu trifenylofosfiny stosowanej w 1,6-krotnym nadmiarze molowym względem mieszaniny nukleozydów o wzorze 4, w pirydynie w temperaturze pokojowej w czasie 18 h, a następnie 25% wody amoniakalnej użytej w ilości 6 ml/mmol mieszaniny nukleozydów o wzorze 4, w temperaturze pokojowej w czasie 3 h, w wyniku czego powstaje mieszanina dwóch produktów izomerycznych o wzorze ogólnym 5
PL 218 817 B1 z których w jednym R1 = H, R2 = TBDMS, zaś X = O lub S, zaś w drugim R1 = TBDMS, R2 = H, zaś X = O lub S, produkty te poddaje się reakcji Michaela z estrem winylosulfonowym o wzorze 6
O-TBDPS wzór 6, w którym TBDPS oznacza grupę tert-butylodifenylosililową, stosowanym w ilości równomolowej względem mieszaniny regiomerycznych nukleozydów o wzorze 5, w metanolu, w temperaturze 0°C w czasie 7 h, w wyniku której otrzymuje się izomeryczne produkty reakcji Michaela, o wzorze ogólnym 7 z których w jednym R1 = H, R2 = TBDMS, zaś X = O lub S, zaś w drugim R1 = TBDMS, R2 = H, zaś X = O lub S, które wyizolowuje się i bez oczyszczania poddaje reakcji z bezwodnikiem trifluorooctowym stosowanym w 3-krotnym nadmiarze molowym względem mieszaniny nukleozydów o wzorze 7, w pirydynie w temperaturze 0°C w czasie 2 h, a otrzymany w wyniku tego produkt w postaci mieszaniny izomerycznych nukleozydów, o wzorze ogólnym 8 z których w jednym R1 = H, R2 = TBDMS, zaś X = O lub S, zaś w drugim R1 = TBDMS, R2 = H, zaś X = O lub S, rozdziela się z wykorzystaniem chromatografii kolumnowej i nukleozyd o wzorze 9 w którym X = O lub S, poddaje się reakcji fosfitylacji za pomocą β-cyjanoetylo-W,W-diizopropylochlorofosfiny i etylodiizopropyloaminy użytych odpowiednio w nadmiarze molowym 2 i 4-krotnym względem nukleozydu o wzorze 9, w chlorku metylenu w temperaturze pokojowej w czasie 4 h, w wyniku czego powstaje monomer o wzorze 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL399290A PL218817B1 (pl) | 2012-05-24 | 2012-05-24 | Sposób wytwarzania oligorybonukleotydów zawierających 5-taurynometylo-urydynę lub 5-taurynometylo-2-tiourydynę oraz hipermodyfikowanych jednostek monomerycznych do syntezy tych oligorybonukleotydów |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL399290A PL218817B1 (pl) | 2012-05-24 | 2012-05-24 | Sposób wytwarzania oligorybonukleotydów zawierających 5-taurynometylo-urydynę lub 5-taurynometylo-2-tiourydynę oraz hipermodyfikowanych jednostek monomerycznych do syntezy tych oligorybonukleotydów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL399290A1 PL399290A1 (pl) | 2013-11-25 |
| PL218817B1 true PL218817B1 (pl) | 2015-01-30 |
Family
ID=49626505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL399290A PL218817B1 (pl) | 2012-05-24 | 2012-05-24 | Sposób wytwarzania oligorybonukleotydów zawierających 5-taurynometylo-urydynę lub 5-taurynometylo-2-tiourydynę oraz hipermodyfikowanych jednostek monomerycznych do syntezy tych oligorybonukleotydów |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL218817B1 (pl) |
-
2012
- 2012-05-24 PL PL399290A patent/PL218817B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL399290A1 (pl) | 2013-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8431693B2 (en) | Process for desilylation of oligonucleotides | |
| EP2370451B1 (en) | Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids | |
| CN103068834B (zh) | 用于反向合成rna的亚磷酰胺 | |
| US7741472B2 (en) | Polynucleotide containing a phosphate mimetic | |
| EP2599784B1 (en) | Nucleotide and/or oligonucleotide and preparation process thereof | |
| Lönnberg | Synthesis of oligonucleotides on a soluble support | |
| Johannsen et al. | Amino acids attached to 2′-amino-LNA: synthesis and excellent duplex stability | |
| Beaucage et al. | Recent advances in the chemical synthesis of RNA | |
| EP2961757B1 (en) | Cell-penetrating oligonucleotides | |
| ES2211222T3 (es) | Purificacion de oligomeros usando seleccion de final dual. | |
| Johnsson et al. | New light labile linker for solid phase synthesis of 2′-O-acetalester oligonucleotides and applications to siRNA prodrug development | |
| US7723495B2 (en) | Amidite for nucleic acid synthesis and nucleic acid synthesizing method | |
| PL218817B1 (pl) | Sposób wytwarzania oligorybonukleotydów zawierających 5-taurynometylo-urydynę lub 5-taurynometylo-2-tiourydynę oraz hipermodyfikowanych jednostek monomerycznych do syntezy tych oligorybonukleotydów | |
| Neuner et al. | Synthesis of aminoacylated N6, N6-dimethyladenosine solid support for efficient access to hydrolysis-resistant 3′-charged tRNA mimics | |
| Mikhailov et al. | Synthesis of RNA Containing O‐β‐d‐Ribofuranosyl‐(1 ″ 2′)‐adenosine‐5 ″‐phosphate and 1‐Methyladenosine, Minor Components of tRNA | |
| JP5424236B2 (ja) | オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド誘導体を用いたオリゴヌクレオチド構築物、オリゴヌクレオチド誘導体を合成するための化合物及びオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法 | |
| US20040157794A1 (en) | Calix[4]arene-nucleoside and calix[4]oligonucleotide hybrids | |
| WO2026062247A1 (en) | Liquid-phase oligonucleotide synthesis using 2-(2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl (nppoc) as a protecting group | |
| AU2011203074B2 (en) | Processes and reagents for oligonucleotide synthesis and purification | |
| Greco | Synthesis and bio-pharmacological activity of antisense phosphatidyl-oligonucleotides | |
| HK1000191B (en) | Modified oligodeoxyribonucleotides, their preparation and their therapeutic use | |
| HK1000191A1 (en) | Modified oligodeoxyribonucleotides, their preparation and their therapeutic use | |
| HK1179975A (en) | Process and reagents for oligonucleotide synthesis and purification |