KR20200037256A - 올리고뉴클레오티드의 친화성 정제를 위한 오르토에스터 조성물 - Google Patents

올리고뉴클레오티드의 친화성 정제를 위한 오르토에스터 조성물 Download PDF

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조엘 마이어슨
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애질런트 테크놀로지스, 인크.
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Abstract

본 발명은 올리고뉴클레오티드, 예컨대 RNA 및 DNA를 정제하기 위한 화합물 및 방법에 관한 것이다. 표적 올리고뉴클레오티드는 친화성 태그를 포함하는 오르토에스터 연결자와 반응하여 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 형성하고, 이는 정제 기법을 거쳐 불순물, 예컨대 절두된 올리고뉴클레오티드로부터 표적 올리고뉴클레오티드로 분리된다. 이어서, 오르토에스터 연결자는 표적 올리고뉴클레오티드를 고순도로 생성하는 온화한 조건 하에 제거될 수 있다.

Description

올리고뉴클레오티드의 친화성 정제를 위한 오르토에스터 조성물
관련 출원에 관한 상호 참조
본원은 2017년 8월 18일 출원된 US 62/547,687을 우선권 주장하고, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 혼입된다.
기술분야
본 발명은 생체고분자, 예컨대 RNA 및 DNA의 정제를 위한 화합물 및 방법에 관한 것이다.
고체-상 합성은 맞춤형 올리고뉴클레오티드 서열(예를 들어 맞춤형 RNA 및 DNA), 맞춤형 펩티드, 맞춤형 올리고사카라이드 및 다양한 대사물을 제조하는데 사용될 수 있는 매우 가치있는 수단이다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 연장되는 쇄의 하나의 말단이 고체 표면에 부착되고, 반응성 뉴클레오티드 단량체가 반복적인 합성 사이클을 사용하여 순차적으로 축합되는 순차적 방식으로 일어난다. 이러한 뉴클레오티드 단량체는 반응성 인 기, 예컨대 포스포라미다이트, H-포스포네이트 또는 당업계에 주지되어 있는 기타 반응성 인 기 또는 개질된 기를 함유하고, 빌딩 블록(building block)은 보호된 2'-데옥시뉴클레오시드(dA, dC, dG 및 T), 보호된 리보뉴클레오시드(A, C, G 및 U), 또는 보호된 화학 개질된 뉴클레이시드로부터 유도된다. 전형적인 목적 올리고뉴클레이티드 생성물은 인접하는 뉴클레오티드들의 5'-하이드록시와 3'-하이드록시 사이의 뉴클레오티드간 결합을 함유한다. 그러나, 인접한 뉴클레오티드들의 임의의 하이드록시 기들 사이의 인위적인 뉴클레오티드간 연결을 형성하는 것도 바람직할 수 있다. 합성을 성취하기 위해, 합성 사이클의 제1 단계는 일반적으로, 보호된 단량체와 표면에 부착된 뉴클레오시드와의 반응, 또는 보호된 단량체와 표면 상의 하이드록시 기와의 반응이다. 표면 상의 하이드록시 기는 보편적인 절단가능 연결자의 일부 또는 절단불가능한 표면 부착물일 수 있다. 반응성 인 기와 표면 상의 하이드록시의 초기 커플링 후, 이어지는 단계는 전형적으로, 미처리된 하이드록시 기의 캐핑(capping)에 이은 반응성 인 중간체의 산화를 포함한다. 특정한 개질된 인 기가 사용되는 특정한 조건하에, 캐핑 전에 산화가, 특히 산화제가 개질된 인 기, 예컨대 포스포로티오에이트, 보라노포스포네이트 또는 포스포라미데이트를 생성하는 경우에 필수적일 수 있다. 통상적으로, 최종 단계는 후속의 보호된 뉴클레오티드 단량체에 커플링될 하이드록시 기를 탈블록(deblocking)하는 단계이다. 상기 최종 단계에서 제거된 보호기는 일반적으로 다이메톡시트라이틸 기(DMT)이다. 그러나, 다수의 다른 보호기들이 주지되어 있는데 이의 예는 9-페닐잔틸 기(Pixyl) 및 벤즈하이드릴옥시-비스(트라이메틸실릴옥시)실릴(BZH)이다. 쇄 조립의 완료시, 목적 생성물은 고체 상으로부터 방출되고 탈보호되고 더 나아가 생물학적 적용례에 이용된다.
부생성물의 존재가 시험관 또는 생체내에서 사용될 때 바람직하지 않은 효과를 야기할 수 있기 때문에, 올리고뉴클레오티드 생성물은 짧은 절두된 서열 및 목적 생성물 이외의 상이한 서열을 갖는 서열을 미함유하여야 한다. 바람직한 올리고뉴클레오티드 합성은 완성된 합성 조성물이 표적 올리고뉴클레오티드 생성물만을 함유할 수 있도록 하는 선택된 올리고뉴클레오티드를 정량적 수율로 제공하여야 한다. 그러나, 일반적으로, 화학적인 방법은 정량적 수율 미만을 제공하고 통상적으로 95 내지 99% 수율이다. 미정제 반응 혼합물은 종종 목적 올리고뉴클레오티드 및 절두된 서열 또는 실패 서열을 포함하고, 순수한 표적 올리고뉴클레오티드 생성물을 얻기 위해서는 정제를 요한다.
미정제 합성 생성물로부터 목적하는 올리고뉴클레오티드 생성물을 정제해 내는 가장 통상적인 방법은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)이다. 그러나, 표적 전장 올리고뉴클레오티드를 짧은 올리고뉴클레오티드 서열로부터 단리하는 것은 종종 번거롭고 시간 소모적인 크로마토그래피 조건을 요한다. 긴 올리고뉴클레오티드, 예컨대 100개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 위해, HPLC 용리 구배는 각각의 실행당 2 내지 3시간을 요할 수 있고, 상기 과정은 허용되는 수준의 순도를 얻는데 있어서 정밀한 수집 및 분획 분석을 요한다. 게다가, 이러한 크로마토그래피 방법은 종종 매우 작은 입자 크기를 갖는 고정상 및 많은 이론 단수를 요한다.
표준적인 올리고뉴클레오티드 합성법에서, 실패 서열은 아세틸 기 또는 다른 산-안정 반응성 작용기로 캐핑되고, 전장 올리고뉴클레오티드는 5'-하이드록시 위치에서 다이메톡시트라이틸 기, 9-페닐잔틸 기(Pixyl), 벤즈하이드릴옥시-비스(트라이메틸실릴옥시)실릴(BZH) 또는 기타 주지된 기들을 포함한다. 연구자들은 제안되는 전장 올리고뉴클레오티드 생성물이 합성 사이클의 완료시 올리고뉴클레오티드 분자의 5'-하이드록시 상의 화학기에 의해 실패 서열로부터 구별될 수 있음을 제안해 왔다. 다이메톡시트라이틸 기와 같은 기는 아세틸 기보다 훨씬 더 소수성이기 때문에, 이론적으로는, 이러한 차이가 크로마토그래피 방법, 예컨대 역상 HPLC를 사용하여 전장 올리고뉴클레오티드 생성물을 캐핑된 실패 생성물로부터 분리하는데 사용될 수 있다(문헌[J. Chrom. 326, 293-299; 1985]). 그러나, HPLC 정제에 DMT를 사용하는 것에는 몇몇 단점이 있다. DMT 기는 바람직한 평형 조건에 기인하여 뉴클레오티드가 고체 상에 존재하는 동안에는 용이하게 제거되지만, 올리고뉴클레오티드의 제거 후에는 DMT 기를 고체 지지체로부터 제거하기가 현저히 어려워지고 강한 산 조건 및 긴 반응 시간을 요한다. 불행히도, 용액 중 DMT 기를 제거하는데 요하는 조건은 정제된 올리고뉴클레오티드를 감성시킴으로써 궁극적으로는 순도의 현저한 손실을 야기할 수 있다. DNA의 경우, 이러한 조건은 퓨린 염기에 특히 가옥하여 글리코시드 결합이 절단되게 한다. RNA의 경우, 산에 대한 노출은 이러한 노출이 뉴클레오티드간 결합을 직접적으로 절단하고 뉴클레오티드간 결합의 이성질체화를 촉매하여 5'-3' 및 5'-2' 연결된 RNA 생성물을 야기하기 때문에 훨씬 더 문제가 된다.
따라서, 고순도의 올리고뉴클레오티드를 생성하는 온화하고 효과적인 올리고뉴클레오티드 정제를 위한 방법 및 화합물이 필요하다. 본 발명은 온화한 조건하에 절단가능하고 올리고뉴클레오티드 생성물의 순도 또는 무결성에 전반적으로 거의 또는 전혀 영향을 주지 않는 친화성 태그(affinity tag)를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 정제하기 위한 방법 및 화합물을 제공한다. 또한, 이러한 화합물은 접근가능한 하이드록시 기를 함유하는 신생 합성된 생체고분자 및 생물학적 활성의 대사물과도 반응할 수 있다. 친화성 태그는 생체고분자 또는 대사물을 정제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 화합물의 상기 및 기타 장점은 청구범위와 결부하여 하기 상세 설명으로부터 명백할 것이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 표적 올리고뉴클레오티드의 정제 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
1. 표적 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체 상에 합성하고 표적 올리고뉴클레오티드 및 절두된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
2. 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 오르토에스터 연결자와 반응시킴으로써 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 형성하는 단계로서, 상기 오르토에스터 연결자가 접합시 친화성 태그를 포함하거나 상기 친화성 태그를 접합 반응 후의 제2 반응에서 상기 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체와 반응시키는, 단계;
3. 상기 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체 및 절두된 올리고뉴클레오티드를 상기 고체 지지체로부터 절단하는 단계;
4. 상기 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체 및 절두된 올리고뉴클레오티드를 크로마토그래피 컬럼 또는 친화성 포획 지지체 위에 재하하고, 상기 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 상기 친화성 태그에 의해 상기 친화성 포획 지지체에 결합시키는 단계;
5. 상기 절두된 올리고뉴클레오티드를 상기 크로마토그래피 컬럼 또는 친화성 포획 지지체로부터 세척해 내는 단계; 및
6. 상기 오르토에스터 연결자를 상기 표적 올리고뉴클레오티드로부터 절단하고, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 상기 크로마토그래피 컬럼 또는 친화성 포획 지지체로부터 용리시킴으로써, 정제된 표적 올리고뉴클레오티드를 방출시키는 단계.
상기 방법에서, 친화성 태그는 오르토에스터 연결자 내의 하나 이상의 기일 수 있거나, 연결자에 의해 오르토에스터 연결자에 연결된다.
임의의 상기 방법에서, 제2 반응은 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체가 고체 지지체로부터 절단되기 전 또는 후에 수행된다.
임의의 상기 방법에서, 오르토에스터 연결자는 표적 올리고뉴클레오티드의 5'-하이드록시에 부착되거나, 오르토에스터 연결자는 표적 올리고뉴클레오티드의 3'-하이드록시에 부착된다.
본원에 제공되는 임의의 방법에서, 친화성 태그는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 불소 태그, 소수성 태그, 비오틴 태그, 글루타티온 태그, 말토스 태그, 아릴보론산 태그, 폴리-히스티딘 펩티드 태그, 폴리-설프하이드릴 태그, 사이클로덱스트린 태그, 아다만탄 태그, 폴리아민 태그, 말레이미드 태그, 알킨 태그, 아지도 태그, 하이드라지드 태그, 아미노 태그, 다이올 태그, 티올 태그 및 이의 임의의 조합.
본 발명은 올리고리보뉴클레오티드(RNA)를 포함하는 표적 올리고뉴클레오티드에 의해 수행될 수 있다. 이러한 RNA는 티오노카바메이트(TC) 보호기, 비스(2-아세톡시에톡시)메틸(ACE) 보호기, t-부틸다이메틸실릴(TBDMS) 보호기, 트라이이소프로필실릴옥시메틸(TOM) 보호기, 피발로일옥시메틸(PivOM) 보호기 및 2-시아노에톡시메틸(CEM) 보호기로부터 선택되는 2'-하이드록시 보호기를 포함할 수 있다. RNA는 인 보호기, 핵염기 보호기 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. RNA에서, 인 보호기는 올리고뉴클레오티드를 오르토에스터 연결자와 반응시키기 전에 탈보호될 수 있다. RNA에서, 핵염기 보호기 및 임의적으로 인 보호기는 표적 올리고뉴클레오티드와 오르토에스터 연결자를 반응시킨 후에 탈보호될 수 있다. 상기 방법에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체의 고체 지지체로부터의 절단, 및 핵염기 보호기 및 임의적으로 인 보호기의 탈보호는 단일 반응으로 수행될 수 있다. RNA는 70개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 제공되는 임의의 정제 방법에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 Ia의 화합물일 수 있다:
[화학식 Ia]
Figure pct00001
상기 식에서,
R, R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 C1-C24 알킬, 할로치환된 C2-C24 알켄일, 할로치환된 C2-C24 알킨일, 카보사이클릴, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로고리 또는 임의의 치환된 등가물이되, R은 수소일 수 있다.
화학식 Ia의 화합물에서, R은 H 또는 C1-C3 알킬이고, R, R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 아릴 또는 치환된 아릴일 수 있다. 화학식 Ia의 화합물에서, R은 H 또는 CH3이고, R, R', R'' 및 R'''은 페닐 또는 치환된 페닐일 수 있다. 화학식 Ia의 화합물에서, R, R', R'' 및 R''' 중 하나 이상은 소수성 태그, 부분 소수성 태그, 불소 태그 또는 부분 불소 태그일 수 있다.
본원에 제공되는 임의의 정제 방법에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 Ia의 화합물일 수 있다:
[화학식 Ib]
Figure pct00002
상기 식에서,
AfTg는 친화성 태그이고;
R, R' 및 R''은 각각 독립적으로 AfTg-L 또는 C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 C1-C24 알킬, 할로치환된 C2-C24 알켄일, 할로치환된 C2-C24 알킨일, 카보사이클릴, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로고리, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 조합이되, 탄소의 총 개수가 24개 이하이고;
L은 공유 결합 또는 직쇄, 분지쇄, 단일고리 또는 다고리의 포화, 부분 불포화 또는 불포화 C1-C12 탄화수소 쇄이되, F, Cl, Br, I 또는 C1-C3 알킬로 임의적으로 치환되고, O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자가 임의적으로 산재하거나 S-S, NRa, NRa-CO, -CO-NRa- 및 NRa-CO-NRb로부터 독립적으로 선택되는 기가 임의적으로 산재하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다.
본원에 제공되는 임의의 정제 방법에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 I의 화합물일 수 있다:
[화학식 I]
Figure pct00003
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 각각은 독립적으로 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 조합이되, 탄소 원자의 총 개수는 24개 이하이고, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고;
R8 및 R9는 H이고;
X는 H, 메틸 또는 전자 구인성 기이고;
n은 0, 1 또는 2이다. 일부 양태에서, 화학식 I의 화합물의 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일, 플루오로치환된 카보사이클릴, 플루오로치환된 헤테로알킬, 플루오로치환된 헤테로알켄일, 플루오로치환된 헤테로알킨일 또는 플루오로치환된 헤테로사이클릴이다.
본원에 제공되는 정제 방법에서, 친화성 태그는 3 이상의 CLogP 값을 갖는 불소 태그 또는 소수성 태그일 수 있다. 본 발명에 따른 정제 방법에서, 친화성 태그는 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일 또는 플루오로치환된 카보사이클릴일 수 있다.
일부 양태에서, 정제 방법은 하기 화학식 1의 오르토에스터 연결자에 의해 수행된다:
[화학식 1]
Figure pct00004
.
추가의 양상에서, 본 발명은 5'-말단 또는 3'-말단에서 하기 화학식 IV의 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 제공한다:
[화학식 IV]
Figure pct00005
상기 식에서,
파선에 연결된 산소는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 또는 3'-말단의 산소이고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 조합이고, 나머지 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, C6-C12 아릴알킬, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 조합이되, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고;
n은 0, 1 또는 2이되,
상기 화학식 IV의 잔기는 하기 화학식 2의 잔기가 아니다:
[화학식 2]
Figure pct00006
.
화학식 IV의 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상이 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일, 플루오로치환된 아릴, 플루오로치환된 헤테로알킬, 플루오로치환된 헤테로알켄일, 플루오로치환된 헤테로알킨일 또는 플루오로치환된 헤테로사이클릴인, 화합물을 포함한다. 추가의 양태에서, 화학식 IV의 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상이 불소 태그이고 R7을 비롯한 나머지 R 기가 H인, 화합물을 포함한다. 추가의 양상에서, 화학식 IV의 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 2개 이상이 불소 태그인, 화합물을 포함한다.
화학식 IV의 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 n이 0이고, 친화성 태그가 3 이상의 cLogP 값을 갖는 불소 태그 또는 소수성 태그인, 화합물을 포함한다.
일부 양태에서, 화학식 IV의 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자의 올리고뉴클레오티드는 올리고리보핵산(RNA)을 포함한다.
올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체의 일부 양태에서, 화학식 IV의 잔기는 하기 화학식의 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00007
상기 식에서,
R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, C1-C23 알킬, C1-C23 헤테로알킬, C1-C23 치환된 알킬, C2-C23 알켄일, C2-C23 헤테로알켄일, C2-C23 치환된 알켄일, C2-C23 알킨일, C2-C23 헤테로알킨일, C2-C23 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이되, R11 및 R12 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고;
R7은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 페닐 또는 벤질이고;
Z는 각각 독립적으로 CRaRb, O, S 또는 NRa이되, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, Ra 및 R11 또는 Ra 및 R12는 함께 N을 갖는 헤테로고리를 형성하고;
n은 0, 1 또는 2이다.
화학식 IV의 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자의 일부 양태에서, 잔기는 하기 화학식 3의 잔기이다:
[화학식 3]
Figure pct00008
상기 식에서,
X1은 H, F, 아지도, 보호된 설프하이드릴, 보호된 폴리-설프하이드릴, 폴리-히스티딘, 보호된 아미노 기, 보호된 하이드라지드 기, 보호된 옥시아민 기, 말레이미드, 사이클로옥틴, 공액 다이엔, C2 알켄일 기, C2 치환된 알켄일 기, C2 알킨일 기 또는 C2 치환된 알킨일 기이고;
R18 및 R19는 각각 독립적으로 H, F, C1-3 헤테로알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이고;
n은 1 또는 2이고;
m은 0 내지 12의 정수이다.
화학식 IV의 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자의 일부 양태에서, 상기 잔기는 하기 화학식의 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00009
및
Figure pct00010
.
본 발명의 추가의 양상은 하기 화학식 Id의 오르토에스터 연결자에 관한 것이다:
[화학식 Id]
Figure pct00011
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상이 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 임의의 조합이되, 탄소의 총 개수는 24개 이하이고, 나머지 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, 할로- 또는 헤테로-치환된 등가물, C3-C12 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴, 또는 치환된 등가물이되, R1 내지 R7 중 2개의 R 기는 고리 오르토에스터를 갖는
Figure pct00012
로 제시되는 융합된 고리를 형성하지 않고;
X는 F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이고;
n은 0 또는 1이되,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함한다.
화학식 Id의 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 4의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 4]
Figure pct00013
상기 식에서,
R11은 H, C1-C23 알킬, C1-C23 헤테로알킬, C1-C23 치환된 알킬, C2-C23 알켄일, C2-C23 헤테로알켄일, C2-C23 치환된 알켄일, C2-C23 알킨일, C2-C23 헤테로알킨일, C2-C23 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고;
R7은 H 또는 CH3이고;
Z는 CRaRb, O, S, NRa, NRaCO 또는 CONRa이되, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, Ra 및 R11은 함께 N을 갖는 헤테로고리를 형성하고;
X는 F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이고;
n은 0 또는 1이고;
R11은 친화성 태그를 포함한다.
화학식 Id의 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 5의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 5]
Figure pct00014
상기 식에서,
R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, C1-C23 알킬, C1-C23 헤테로알킬, C1-C23 치환된 알킬, C2-C23 알켄일, C2-C23 헤테로알켄일, C2-C23 치환된 알켄일, C2-C23 알킨일, C2-C23 헤테로알킨일, C2-C23 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이되, R11 및 R12 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고;
R7은 H 또는 CH3이고;
Z는 각각 독립적으로 CRaRb, O, S, NRaCO, CONRa, NRa이되, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, Ra 및 R11 또는 Ra 및 R12는 함께 N을 갖는 헤테로고리를 형성하고;
X는 F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이고;
n은 0 또는 1이다.
임의의 화학식 Id의 오르토에스터 연결자는 3 이상의 cLogP 값을 갖는 불소 태그 또는 소수성 태그인 친화성 태그를 가질 수 있다.
일부의 화학식 Id의 오르토에스터 연결자는 n이 0이고 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 2개 이상이 각각 독립적으로 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴 또는 임의의 치환된 등가물이고, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 나머지 모든 R 기는 H이되, H가 아닌 2개의 R 기가 함께 연결되어 고리 오르토에스터를 갖는 융합된 고리를 형성하지 않는 화합물을 포함한다. 일부의 화학식 Id의 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나가 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일 또는 플루오로치환된 아릴인, 화합물을 포함한다.
본 발명의 추가의 양상은 하기 화학식 6의 구조를 갖는 불소 오르토에스터 연결자를 포함한다:
[화학식 6]
Figure pct00015
상기 식에서,
Z는 CH2, O, S, NRa, 또는 NRaCO이되, Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R7은 H, 메틸, 에틸. n-프로필, 페닐 또는 벤질이고;
X는 H, F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸 또는 시아노이고;
m은 0 내지 12의 정수이고;
n은 1 또는 2이다.
본 발명의 추가의 양상은 하기 화학식으로부터 선택되는 구조를 갖는 오르토에스터 연결자를 포함한다:
Figure pct00016
.
본 발명의 추가의 양상은 하기 화학식 IIIa의 오르토에스터 연결자를 포함한다:
[화학식 IIIa]
Figure pct00017
상기 식에서,
X1은 H, F, 아지도, 보호된 설프하이드릴, 보호된 폴리-설프하이드릴, 폴리-히스티딘, 보호된 아미노 기, 보호된 하이드라지드 기, 보호된 옥시아민 기, 사이클로옥틴, 공액 다이엔, C2 알켄일 기, C2 치환된 알켄일 기, C2 알킨일 기 또는 C2 치환된 알킨일 기이고;
R18 및 R19는 각각 독립적으로 H, F, C1-3 헤테로알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이고;
X2는 H, CH3, F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸 또는 시아노이고;
n은 1 또는 2이고;
m은 0 내지 12의 정수이다.
화학식 IIIa의 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 7의 화합물일 수 있다:
[화학식 7]
Figure pct00018
.
본 발명의 방법 및 화합물의 상기 및 기타 특징 및 장점은 청구범위와 결부하여 하기 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
도 1은 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오티드의 전형적인 화학 합성을 도시한 것이다.
도 2는 전장 서열 및 다수의 실패 서열을 포함하는 미정제 올리고뉴클레오티드 혼합물의 다이오드 어레이 검출기(diode array detector, DAD) 스펙트럼을 도시한 것이고, 여기서 전장 서열은 가장 큰 피크이다.
도 3은 절두된 서열 또는 실패 서열의 5'-하이드록시가 아세틸 보호기로 캐핑되고, 전장 올리고뉴클레오티드가 이의 5'-말단에 다이메톡시트라이틸(DMT) 보호기를 보유함으로써 상기 전장 올리고뉴클레오티드의 5'-위치에서 DMT 기의 특이적 제거 및 영역-특이적 첨가를 가능하게 하는 올리고뉴클레오티드의 전형적인 화학적 합성을 도시한 것이다.
도 4는 5'-3' 및 5'-2' 연결된 RNA 생성물의 혼합물을 야기하는 RNA의 뉴클레오티드간 결합의 산 절단 및 뉴클레오티드간 결합의 이성질체화를 도시한 것이다.
도 5는 친화성 태그가 오르토에스터의 중심 탄소에 또는 오르토에스터의 모든 R 기에 연결된 R 기에 위치하여 2개의 친화성 태그를 갖는 오르토에스터 접합된 올리고뉴클레오티드를 생성하는 비-고리 오르토에스터 연결자에 의한 올리고뉴클레오티드의 보호를 도시한 것이다.
도 6은 고리 오르토에스터에 의한 올리고뉴클레오티드의 보호 및 오르토에스터 보호기의 산-촉진 절단을 도시한 것이다.
도 7은 불소 친화성 태그를 포함하는 오르토에스터 연결자를 사용한 올리고뉴클레오티드의 정제 작업 흐름도를 도시한 것이다. 이 작업 흐름도는 먼저 올리고뉴클레오티드가 플루오로치환된 오르토에스터 연결자에 접합된 후, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체의 올리고뉴클레오티드 부분이 탈보호되고 고체 지지체로부터 절단된 후, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체가 불소 친화성 태그를 사용하여 HPLC 또는 고체-상 추출에 의해 정제되는 4-단계 과정을 제시한다. 최종 단계에서, 플루오로치환된 오르토에스터 연결자는 올리고뉴클레오티드로부터 절단되어 목적하는 정제된 올리고뉴클레오티드 생성물이 수득된다.
도 8은 올리고뉴클레오티드의 정제를 위해 오르토에스터 보호기 및 크로마토그래피 분리를 사용하는 정제 계획도를 도시한 것이다.
용어 정의
본원에 사용되는 용어는 특정 양태들을 설명하기 위한 것이되 한정하고자 함이 아님이 이해되어야 한다. 정의된 용어는 본 발명의 교시의 기술 분야에서 통상적으로 이해되고 인용되는 상기 정의된 용어의 기술적 및 과학적 의미에 추가적 의미가 더해진 것이다.
알킬, 헤테로알킬, 알켄일, 헤테로알켄일, 알킨일, 헤테로알킨일, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로고리 등을 언급함에 있어서 용어 "치환된", 및 용어 "치환된 등가물", 예를 들어 "치환된 알킬", "치환된 헤테로알킬", "치환된 알켄일", "치환된 헤테로알켄일", "치환된 알킨일", "치환된 헤테로알킨일", "치환된 아릴", "치환된 헤테로아릴" 및 "치환된 헤테로고리"는 각각 하나 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 비-수소 치환기로 대체된 알킬, 헤테로알킬, 알켄일, 헤테로알켄일, 알킨일, 헤테로알킨일, 알킨일, 헤테로알킨일, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로고리를 의미한다. 전형전인 치환기는 비한정적으로 ―X, ―R, ―O-, ＝O, ―OR, ―SR, ―S＝, ―NR2, ―N+R3, -NR, ―CX3, ―CN, ―OCN, ―SCN, ―N-C＝O, ―NCS, ―NO, ―NO2, -N2, ―N3, ―NHC(-O)R, ―NHS(＝O)2R, ―C(-O)R, ―C(＝O)NRR―S(＝O)2O-, ―S(＝O)2OH, ―S(-O)2R, ―OS(-O)2OR, ―S(-O)2NR, ―S(-O)R, ―OP(＝O)(OR)2, ―P(-O)(OR)2, ―P(-O)(O＝)2, ―P(-O)(OH)2, ―P(O)(OR)(O-), ―C(＝O)R, ―C(＝O)OR, ―C(＝O)X, ―C(S)R, ―C(O)OR, ―C(O)O＝, ―C(S)OR, ―C(O)SR, ―C(S)SR, ―C(O)NRR, ―C(S)NRR 및 ―C(＝NR)NRR을 포함하되, 각각의 X는 독립적으로 할로겐(F, Cl, Br 또는 I)이고; 각각의 R은 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 보호기이다. 알킬렌, 알켄일렌 및 알킨일렌 기도 유사하게 치환될 수 있다. 탄소 원자의 개수가 치환된 기에 대해 표시될 때, 상기 탄소 원자의 개수는 (달리 지시되지 않는 한) 치환기가 아닌 기를 지칭하는 것이다. 예를 들어, C1-4 치환된 알킬은 C1-4 알킬을 지칭하고, 이는, 예컨대 4개 초과의 탄소 원자를 갖는 기로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "친화성 짝"은 강하고/거나 특이적인 생물학적 또는 화학적 친화성 상호작용, 예컨대 항원-항체, 효소-기질, 수용체-리간드, 또는 소수성 화합물-소수성 수지 등의 상호작용을 통해 또 다른 분자 또는 물질과 회합되는 분자 또는 물질의 짝을 지칭한다. 불용성 지지체에 공유 결합되거나 겔에서 부동화된 임의의 이러한 물질은 상호작용하는 물질이 상대적으로 불순한 샘플로부터 단리되게 하는 흡착제로서 작용할 것이다. 물질을 분리, 단리 또는 정제하기 위해 불용성 지지체 또는 젤의 사용을 동반하여 상기 종류의 친화성 짝의 회합성 상호작용을 사용하는 기법은 친화성 포획(affinity capture)으로 명명된다. 통상적으로, 상기 기법은 불용성 지지체에 연결된 친화성 짝의 다른 구성원과의 회합성 상호작용을 통해 상기 불용성 지지체에 또는 젤에 목적하는 친화성-태그된 생체분자가 존속함, 및 액체-상 중에 태깅되지 않는 불순물 또는 목적하지 않은 부산물이 용리됨을 수반한다. 친화성 포획은 불용성 물질의 여과 및 여과물로부터의 분리 후, 불용성 지지체로부터 목적하는 정제된 생체분자의 용리 또는 절단에 의해 수행될 수 있다. 친화성 짝의 비한정적인 예는 비오틴/아미딘, 비오틴/스트렙타비딘, 글루타티온/GST, 말토스/MBP(말토스 결합 단백질), 다이올/아릴보론산, 니켈 또는 코발트/히스티딘 또는 티올, 쿠쿠르비투릴(cucurbituril)/아다만탄, 사이클로덱스티린/아다만탄, 플루오로알킬/플루오로알킬, 및 트라이틸/C18 수지를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "친화성 태그"는 고유의 특성(예컨대 소수성, 친수성, 극성, 전하 및 불소친화성(fluorophilicity) 등)을 갖는 친화성 짝의 하나의 구성원 또는 잔기를 지칭하고, 이는 고유의 특성을 사용하여 친화성 태그에 연결되는 표적 분자(예를 들어 올리고뉴클레오티드)의 단리 또는 분리를 가능하게 한다. 친화성 짝은 친화성 태그 및 상기 친화성 태그에 대한 특이적 결합 능력을 갖는 인식 잔기를 포함한다. 친화성 태그는 (예를 들어 치환기로서) 표적 분자에 존재하거나 연결자(예를 들어 오르토에스터 연결자)를 통해 표적 분자에 부착된다. 또한, 친화성 태그는 고체 지지체에 공유 결합적으로 포획될 수 있다. 친화성 태그의 비한정적인 예는 불소 친화성 태그, 소수성 태그, 비오틴 태그, 사이클로덱스트린 태그, 아다만탄 태그, 말토스 또는 폴리아민 태그 및 하전된 태그 등을 포함한다. 또한, 친화성 태그는 임의적으로 보호된 화학 작용기일 수 있고, 이는 새롭게 연결된 표적 분자의 단리 또는 분리를 가능하게 하는 고유의 특성(예컨대 소수성, 친수성, 극성, 전하 및 불소친화성 등)을 부여하는 분자의 특이적 화학 작용기와 선택적으로 반응하거나, 고체-상 또는 친화성 포획 매질에 부착된 특이적 화학 작용기와 선택적으로 반응한다. 작용성 화학 태그의 비한정적인 예는 말레이미드 태그, 알킨 태그, 아지도 태그, 하이드라지드 태그, 아미노 태그, 다이올 태그 및 티올 태그를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "인식 잔기"는 친화성 짝의 제2 구성원을 지칭하고, 이는 친화성 태그와 특이적으로 상호작용한다.
본원에 사용된 용어 "소수성 태그"는 탄소가 풍부한 소수성 치환기 또는 소수성 치환기의 조합을 지칭한다. 치환기의 소수성은 이의 분배 계수(logP)의 값을 통해 결정, 측정 또는 계산될 수 있다. 물질의 분배 계수(logP)는 2개의 비혼화성 용매, 통상적으로는 옥탄올:물 중 상기 물질의 용해도 비로 정의된다. 상기 값이 측정치가 아니라 계산치일 때, cLogP로 명명된다. 소수성 태그는 3 이상의 cLogP를 갖거나, 2, 3 또는 4개의 "부분 소수성 태그"의 조합은 3 이상의 cLogP의 공동 값(collective value)을 갖는다. 소수성 태그의 비한정적인 예는 C6-C24 알킬, C4-C24 알켄일, C4-C24 알킨일, 탄소고리 및 아릴, 트라이틸, 지질, 스테로이드 및 아다만탄을 포함한다. 플루오로 치환기 또는 플루오로치환된 기는 소수성 태그의 소수성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 소수성 태그는 6개 이상의 탄소 원자를 포함한다. 소수성 태그를 포함하는 오르토에스터 연결자는 이의 4개의 라디칼 R 기 중 각각의 하나에 위치하는 1, 2, 3 또는 4개의 소수성 태그를 갖는 오르토에스터 연결자를 포함한다. 또한, 소수성 오르토에스터 연결자는 "부분 소수성 태그"(즉 각각 6개 미만의 탄소 원자를 가짐)를 갖지만, 합으로는 6개 이상의 탄소 원자를 포함하는 오르토에스터 연결자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "불소 태그"는 과불화 또는 불화 치환기, 또는 과불화 또는 불화 치환기들의 조합, 예를 들어 플루오로치환된 C1-C24 알킬, 플루오로치환된 C2-C24 알켄일, 플루오로치환된 C2-C24 알킨일, 플루오로치환된 카보사이클릴 및 플루오로치환된 아릴을 지칭한다. 불소 태그는 적어도 7개의 불소 원자 및 3개의 탄소 원자를 포함한다. 불소 태그를 포함하는 오르토에스터 연결자는 이의 각각의 4개의 라디칼 R 기 중 각각의 하나에 위치하는 1, 2, 3 또는 4개의 불소 태그를 갖는 오르토에스터 연결자를 포함한다. 또한, 불소 오르토에스터 연결자는 "부분 불소 태그"(즉 7개 미만의 불소 원자 및 3개 미만의 탄소 원자를 가짐)를 갖지만, 합으로는 7개 이상의 불소 원자 및 3개 이상의 탄소를 갖고, 전부 합으로는 52개 이하의 불소 원자를 갖는 오르토에스터 연결자를 포함한다. 불소 태그는 소수성 태그로서 작용할 수 있고, 불소 매질보다는 소수성 매질을 사용하여 단리될 수 있다.
용어 "크로마토그래피 방법"은 고정상 및 이동상, 또는 상기 고정상을 통과하거나 가로질러 이동하는 용리액의 사용을 수반하는 하나 이상의 화합물의 분리 방법을 지칭한다. 크로마토그래피 방법의 비한정적인 예는 친화성 정제, 고성능 액체 크로마토그래피 및 기체 크로마토그래피를 포함한다.
용어 "불소 친화성 정제"는 분리 매질로서 불화 물질(예를 들어 불화 또는 과불화 흡착제 또는 불화 또는 과불화 수지)을 이용하는 불소 친화성 태그를 갖는 표적 분자를 정제하기 위한 친화성-기반 방법을 지칭한다. 상기 방법은 불소 태그와 불화 물질, 예컨대 불화 흡착제간의 강한 친화성을 기반으로 한다.
용어 "알킬"은, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 탄소를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬을 지칭한다. 이러한 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소아밀 및 헥실 등을 포함한다. 일부 양태에서, 알킬 기는 사이클로알킬 기일 수 있다.
알킬 기는 상기 정의된 바와 같이 비치환 또는 치환될 수 있다. 용어 "할로치환된 알킬"은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 알킬 기를 지칭한다. 비한정적인 예는 트라이플루오로메틸, 트라이플루오로에틸, 펜타플루오로에틸, 2,2,2-트라이클로로에틸 및 클로로메틸 등을 포함한다. 할로치환된 알킬 기는 상기 정의된 바와 같이 비치환 또는 치환될 수 있다. 용어 "플루오로치환된 알킬"은 하나 이상의 불소 원자로 치환된 알킬 기를 지칭한다.
용어 "알켄일"은, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 탄소를 갖고 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 지칭한다. 알켄일 기의 비한정적인 예는 에텐일, 1-프로펜일, 2-프로펜일(알릴), 이소-프로펜일, 2-메틸-1-프로펜일, 1-부텐일 및 2-부텐일을 포함한다. 알켄일 기는 상기 정의된 바와 같이 비치환되거나 하나 이상의 적합한 치환기로 치환될 수 있다. 용어 "할로겐치환된 알켄일"은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 알켄일 기를 지칭한다. 용어 "플루오로치환된 알켄일"은 하나 이상의 불소 원자로 치환된 알켄일 기를 지칭한다.
용어 "알킨일"은, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 지칭한다. 알킨일 기는 비한정적으로 에틴일, 프로핀일 및 부틴일을 포함한다. 알킨일 기는 상기 정의된 바와 같이 비치환되거나 하나 이상의 적합한 치환기로 치환될 수 있다. 용어 "할로겐치환된 알킨일"은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 알킨일 기를 지칭한다. 용어 "플루오로치환된 알킨일"은 하나 이상의 불소 원자로 치환된 알킨일 기를 지칭한다.
"탄소고리" 또는 "카보사이클릴"은 단일고리로서 3 내지 7개의 탄소 원자, 이고리로서 7 내지 12개의 탄소 원자, 및 다고리로서 약 20개 이하의 탄소 원자를 갖는 포화(즉 사이클로알킬), 부분 불포화(예를 들어 사이클로알켄일 및 사이클로알카다이엔일 등) 또는 방향족 고리를 지칭한다. 단일고리 탄소고리는 3 내지 6개의 고리 원자, 보다 더 전형적으로는 5 또는 6개의 고리 원자를 갖는다. 이고리 탄소고리는 7 내지 12개의 고리 원자(예를 들어 바이사이클로[4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서 정렬됨), 9 또는 10개의 고리 원자(바이사이클로 [5.6] 또는 [6,6] 시스템으로서 정렬됨), 또는 스피로-융합된 고리를 갖는다. 단일고리형 탄소고리의 비한정적인 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 1-사이클로펜트-1-엔일, 1-사이클로펜트-2-엔일, 1-사이클로펜트-3-엔일, 사이클로헥실, 1-사이클로헥스-1-엔일, 1-사이클로헥스-2-엔일, 1-사이클로헥스-3-엔일 및 페닐을 포함한다. 이고리 탄소고리의 비한정적인 예는 나프틸을 포함한다.
"헤테로알킬", "헤테로알켄일" 및 "헤테로알킨일"은 각각 하나 이상의 탄소 원자가 헤테로원자, 예컨대 O, N 또는 S로 대체된 알킬 기, 알켄일 기 및 알킨일 기를 지칭한다. 알킬 기, 알켄일 기 또는 알킨일 기 내의 임의의 탄소, 즉 제1 탄소, 말단 탄소 또는 내부 탄소는 독립적으로 헤테로원자(O, N 또는 S)로 대체될 수 있다. 예를 들어, 모 분자에 부착되는 알킬 기의 탄소 원자가 헤테로원자(예컨대 O, N 또는 S)로 대체되는 경우, 생성되는 헤테로알킬은 각각 알콕시 기(예컨대 OCH3 등), 아민 알킬(예컨대 ―NHCH3 및 ―N(CH3)2 등) 또는 티오알킬 기(예컨대 SCH3)이다. 모 분자에 부착되지 않은 알킬 기의 비-말단 탄소 원자가 헤테로원자(예컨대 O, N 또는 S)로 대체되는 경우, 생성되는 헤테로알킬 기는 각각 알킬 에터(예컨대 ―CH2CH2―O―CH3, 등), 알킬 아민(예컨대 ―CH2NHCH3, ―CH2N(CH3)2, 등) 또는 티오알킬 에터(예컨대 ―CH2―S―CH3)이다. 알킬 기의 말단 탄소 원자가 헤테로원자(예컨대 O, N 또는 S)로 대체되는 경우, 생성되는 헤테로알킬 기는 각각 하이드록시알킬 기(예컨대 ―CH2CH2―OH), 아미노알킬 기(예컨대 ―CH2NH2) 또는 알킬 티오 기(예컨대 ―CH2CH2―SH)이다. 헤테로알킬 기, 헤테로알켄일 기 또는 헤테로알킨일 기는, 예를 들어 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 수 있다. C1-C6 헤테로알킬 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 헤테로알킬 기를 의미한다. "치환된 헤테로알킬", "치환된 헤테로알켄일" 또는 "치환된 헤테로알킨일"은 하나 이상의 수소 원자가 "치환된" 정의에 정의된 비-수소 치환기로 대체된 본원에 정의된 헤테로알킬, 헤테로알켄일 또는 헤테로알킨일을 의미한다.
용어 "아릴"은, 당분야에서 통상적으로 이해되는 바와 같이, 단일고리로서 3 내지 7개의 탄소 원자, 이고리로서 7 내지 12개의 탄소 원자, 및 다고리로서 약 20개 이하의 탄소 원자를 갖는 비치환되거나 치환된 방향족 탄소고리 치환기를 지칭하고, 예컨대 페닐, 나프틸, 안트라실 및 인단일 등이다. 용어 "아릴"은 평면형이고 휘켈의 법칙(Huckel's Rule)에 따라 4n+2개의 전자를 포함하는 고리 치환기에 적용된다. 아릴 기는 상기 정의된 바와 같이 비치환되거나 하나 이상의 적합한 치환기로 치환될 수 있다. 용어 "할로겐치환된 아릴"은 하나 이상의 할로겐 원자 또는 할로겐-함유 치환기로 치환된 아릴을 지칭한다. 용어 "플루오로치환된 아릴"은 하나 이상의 불소 원자 또는 불소-함유 치환기로 치환된 아릴을 지칭한다.
"아릴알킬"은 탄소 원자, 전형적으로는 말단 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나가 아릴 기로 대체된 비-고리 알킬 기를 지칭한다. 전형적인 아릴알킬 기는 비한정적으로 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 나프토벤질 및 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함한다. 아릴알킬 기는 6 내지 24개의 탄소 원자를 포함할 수 있는데, 예컨대 알킬 탄소 원자 및 아릴 탄소 원자는 합하여 6 내지 24개의 탄소 원자이다. 아릴 기는 상기 정의된 바와 같이 비치환되거나 하나 이상의 적합한 치환기로 치환될 수 있다.
용어 "카보닐"은 산소에 이중 결합된 탄소를 포함하는 치환기를 지칭한다. 이러한 치환기의 예는 알데히드, 케톤, 카복시산, 에스터, 아미드, 카보네이트 및 카바메이트를 포함한다. 카보닐 기는 상기 정의된 바와 같이 비치환되거나 하나 이상의 적합한 치환기로 치환될 수 있다.
용어 "아미노"는 임의의 질소-함유 잔기를 지칭한다. 아미노 기의 비한정적인 예는 NH2-(1차), RHN-(2차) 및 R2N(3차)이되, R은 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로고리 또는 헤테로아릴이다. RHN- 및 R2N 기는 상기 정의된 바와 같이 비치환되거나 치환될 수 있다.
용어 "헤테로아릴"은 단일고리 또는 이고리 5- 또는 6-구성원 고리계를 지칭하고, 여기서 헤테로아릴 기는 불포화이고 휘켈의 법칙을 충족한다. 헤테로아릴 기의 비한정적인 예는 퓨라닐, 티오페닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 1,2,3-트라이아졸릴, 1,2,4-트라이아졸릴, 이속사졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 티아졸릴, 1,3,4-옥사다이아졸-2-일, 1,2,4-옥사다이아졸-2-일, 5-메틸-1,3,4-옥사다이아졸, 3-메틸-1,2,4-옥사이다이아졸, 피리딘일, 피리미딘일, 피라진일, 트라이아진일, 벤조퓨란일, 벤조티오페닐, 인돌릴, 퀴놀린일, 이소퀴놀린일, 벤즈이미다졸릴, 벤족사졸린일, 벤조티아졸린일 및 퀴나졸린일 등을 포함한다. 헤테로아릴 기는 상기 정의된 바와 같이 비치환되거나 치환될 수 있다.
용어 "헤테로고리" 또는 "헤테로사이클릴"은 O, N 및 S로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 단일고리, 이고리 또는 삼고리 잔기를 지칭한다. 헤테로사이클릴 기는 임의적으로 하나 이상의 이중 결합을 함유한다. 헤테로사이클릴 기는 비한정적으로 아제티딘일, 테트라하이드로퓨란일, 이미다졸리딘일, 피롤리딘일, 피페리딘일, 피페라진일, 옥사졸리딘일, 티아졸리딘일, 피라졸리딘일, 티오모르폴린일, 테트라하이드로티아진일, 테트라하이드로-티아다이아진일, 모르폴린일, 옥세탄일, 테트라하이드로다이아진일, 옥사진일, 옥사티아진일, 인돌린일, 이소인돌린일, 퀴누클리딘일, 크로만일, 이소크로만일 및 벤조옥사진일을 포함한다. 단일고리 포화 또는 부분 불포화 고리계의 비한정적인 예는 테트라하이드로퓨란-2-일, 테트라하이드로퓨란-3-일, 이미다졸리딘-1-일, 이미다졸리딘-2-일, 이미디졸리딘-4-일, 피롤리딘-1-일, 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피페리딘-1-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페라진-1-일, 피페라진-2-일, 피페라진-3-일, 1,3-옥사졸리딘-3-일, 이소티아졸리딘, 1,3-티아졸리딘-3-일, 1,2-피라졸리딘-2-일, 1,3-피라졸리딘-1-일, 티오모르폴린일, 1,2-테트라하이드로티아진-2-일, 1,3-테트라하이드로티아진-3-일, 테트라하이드로티아진일, 모르폴린일, 1,2--테트라하이드로다이아진-2-일, 1,3-테트라하이드로다이아진-1-일, 1,4-옥사진-2-일 및 1,2,5-옥사티아진-4-일을 포함한다. 헤테로고리 기는 상기 정의된 바와 같이 비치환되거나 하나 이상의 적합한 치환기로 치환될 수 있다.
"할로겐" 또는 "할로"는 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 지칭한다.
"뉴클레오티드"는 포스페이트 기, 당 기 및 헤테로고리 염기를 포함하는 핵산(DNA, RNA 또는 이의 유사체)의 소단위, 및 이러한 소단위의 유사체를 지칭한다. 다른 기(예를 들어 보호기)는 뉴클레오티드의 임의의 부분에 부착될 수 있다. "뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 잔기"는 당 기 및 헤테로고리 염기를 포함하는 헥산 소단위, 및 이러한 소단위의 유사체를 지칭한다.
용어 "뉴클레오시드" 및 "뉴클레오티드"는 알려진 피리미딘 염기, 예컨대 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 우라실(U) 뿐만 아니라 변형된 다른 헤테로고리 염기도 함유하는 잔기를 포함하고자 하는 것이다. 피리미딘, 퓨린, 헤테로고리 염기 및 변형된 헤테로고리 염기는 본원에서 "핵염기"로 명명된다. 이러한 변형은 메틸화된 퓨린 또는 피리딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 알킬화된 헤테로고리 또는 기타 헤테로고리를 포함한다. 이러한 변형은 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 알킬화된 헤테로고리 또는 기타 헤테로고리를 포함한다. 이러한 변형은 예를 들어 다이아미노퓨린 및 이의 유도체, 이노신 및 이의 유도체, 알킬화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 티올화된 퓨린 또는 피리미딘 등, 또는 보호기, 예컨대 아세틸, 다이플루오로아세틸, 트라이플루오로아세틸, 이소부티릴, 벤조일, 9-플루오렌일메톡시카보닐, 페녹시아세틸 또는 다이메틸포름아미딘 또는 N,N-다이페닐 카바메이트 등의 첨가를 포함한다. 또한, 용어 "뉴클레오시드" 및 "뉴클레오티드"는 보편적인 리보스 및 데옥시리보스 당뿐만 아니라 기타 당도 함유하는 잔기를 포함한다. 또한, 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 당 잔기에서의 변형을 포함하고, 예컨대 여기서 하이드록시 기 중 하나 이상은 할로겐 원자 또는 지방족 기로 대체되거나, 에스터 또는 아민 등으로서 작용화된다. 또한, 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 연결 또는 주쇄 잔기에서의 변형을 포함한다. "유사체"는 문헌에서 모방체, 유도체, 유사 구조 보유, 또는 기타 이와 유사한 용어로서 인식되는 구조적 특징을 갖는 분자를 지칭하고, 예를 들어 비-천연(통상적으로는 천연 발생되지 않는) 뉴클레오티드를 혼입하는 폴리뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드 모방체, 예컨대 2'-변형된 뉴클레오시드, 펩티드 핵산, 올리고머 뉴클레오시드 포스포네이트, 및 첨가된 치환기, 예컨대 보호기 또는 연결기를 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드간 결합에 의해 연결된 다수의 뉴클레오시드 잔기 소단위를 함유하는 화합물을 지칭한다. 마찬가지로, 상기 용어는 다수의 뉴클레오티드 잔기 소단위 또는 잔기를 함유하는 화합물도 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오시드, 데옥시리보뉴클레오시드 또는 이의 혼합물을 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 천연 및/또는 비-천연 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 유사체 및 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결자"는 치환기로 임의적으로 치환되거나 다른 원자가 산재하는 하이드로카빌 쇄(예를 들어 (C1-C12)알킬렌, (C2-C12)알켄일렌 또는 (C2-C12)알킨일렌)를 지칭하고, -(CHR')a-Wb-(CHR')c-Vd-(CHR')e-로서 제시되는데, 여기서 W 및 V는 독립적으로 -O-, -S- 또는 -NR'-이고; R'은 H 또는 (C1-C6)알킬이고; a, b, c, d 및 e는 독립적으로 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 6, 바람직하게는 0 내지 3의 정수이고, a, b, c, d 및 e의 합은 바람직하게는 2 내지 6이다. 하이드로카빌 쇄는 -O-R", -O-CO-R", -NR'-R", -NR'-CO-R", -CO-NR'-R", -CO-R" 또는 이의 조합이 산재할 수 있고, 여기서 R' 및 R"는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)하이드로카빌이다.
용어 "오르토에스터 연결자"는 생체고분자, 예컨대 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있는 오르토에스터 화합물을 지칭한다. 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 친화성 태그를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자"는 올리고뉴클레오티드 산소와 오르토에스터 연결자의 반응으로부터 생성되는 생성물을 지칭한다.
용어 "불소 오르토에스터"는 하나 이상의 불소 태그를 포함하는 오르토에스터를 지칭한다.
"티오노카바메이트 보호기"는 티오카보닐 탄소 원자에 결합된 질소 및 산소를 갖는 티오노카보닐(-O-C(S)N-)을 포함하는 보호기를 지칭한다.
용어 "전자 구인성 기"는 반응 중심으로부터 전자를 끌어당기는 화학기를 지칭한다. 전자 구인성 기(EWG)의 비한정적인 예는 할로겐(예컨대 불소 및 염소), 할로알킬(예컨대 CH2Cl 및 CF3 등), 니트릴(-RCN), 카보닐(-COR), 설포닐(-SO3R), 암모늄(N+R3) 및 니트로 기(-NO2)이다.
용어 "절두된 서열" 또는 "절두된 올리고뉴클레오티드"는 표적 전장 올리고뉴클레오티드보다 길이가 짧은 올리고뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원 및 청구범위에 사용된 용어 "실질적인" 또는 "실질적으로"는 이의 통상적인 의미 이외에도 통상의 기술자에게 허용가능한 한계 또는 정도 내에 있음을 의미한다. 예를 들어, "실질적으로 취소되는"은 통상의 기술자가 상기 취소가 허용가능한 것으로 여김을 의미한다.
본원 및 청구범위에 사용된 용어 "대략" 또는 "약"은 이의 통상적인 의미 이외에도 통상의 기술자에게 허용가능한 한계 또는 양 내에 있음을 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 지시되는 숫자의 ±15%를 지칭한다. 예를 들어, "약 10"은 8.5 내지 11.5의 범위를 지시할 수 있다. 예를 들어, "대략 동일한"은 통상의 기술자가 비교되는 대상들이 동일한 것으로 여김을 의미한다.
본원에서, 숫자 범위는 상기 범위를 한정하는 숫자를 포괄하는 것이다. 화학 구조 및 화학식은 설명의 목적을 위해 연장되거나 확대될 수 있다.
구조에서 원자의 개수 범위가 지시될 때마다(예컨대 C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일 및 C2-C24 알킨일 등), 치환기가 하위-범위의 임의의 탄소 원자 또는 지시되는 범위 내에 속하는 탄소 원자의 개별적인 개수에 의해 설명될 수 있음이 명확하다. 예를 들어, 기, 예컨대 1 내지 24개의 탄소 원자(예컨대 C1-C24), 1 내지 6개의 탄소 원자(예컨대 C1-C6), 1 내지 4개의 탄소 원자(예를 들어 C1-C4), 1 내지 3개의 탄소 원자(예컨대 C1-C3) 또는 2 내지 24개의 탄소 원자(예컨대 C2-C24)의 열거를 사용한 알킬 기의 설명은 적절하다면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24개 중 임의의 개수의 탄소 원자, 및 적절하다면 이의 임의의 하위-범위(적절하다면, 예컨대 1 내지 2개의 탄소 원자, 1 내지 3개의 탄소 원자, 1 내지 4개의 탄소 원자, 1 내지 5개의 탄소 원자, 1 내지 6개의 탄소 원자, 1 내지 7개의 탄소 원자, 1 내지 8개의 탄소 원자, 1 내지 9개의 탄소 원자, 1 내지 10개의 탄소 원자, 1 내지 11개의 탄소 원자, 1 내지 12개의 탄소 원자, 1 내지 13개의 탄소 원자, 1 내지 14개의 탄소 원자, 1 내지 15개의 탄소 원자, 1 내지 24개의 탄소 원자, 2 내지 3개의 탄소 원자, 2 내지 4개의 탄소 원자, 2 내지 5개의 탄소 원자, 2 내지 6개의 탄소 원자, 2 내지 7개의 탄소 원자, 2 내지 8개의 탄소 원자, 2 내지 9개의 탄소 원자, 2 내지 10개의 탄소 원자, 2 내지 11개의 탄소 원자, 2 내지 12개의 탄소 원자, 2 내지 13개의 탄소 원자, 2 내지 14개의 탄소 원자, 2 내지 15개의 탄소 원자, 2 내지 16개의 탄소 원자, 3 내지 4개의 탄소 원자, 3 내지 5개의 탄소 원자, 3 내지 6개의 탄소 원자, 3 내지 7개의 탄소 원자, 3 내지 8개의 탄소 원자, 3 내지 9개의 탄소 원자, 3 내지 10개의 탄소 원자, 3 내지 11개의 탄소 원자, 3 내지 12개의 탄소 원자, 3 내지 13개의 탄소 원자, 3 내지 14개의 탄소 원자 3 내지 15개의 탄소 원자, 3 내지 16개의 탄소 원자, 3 내지 17개의 탄소 원자, 3 내지 18개의 탄소 원자, 3 내지 19개의 탄소 원자, 3 내지 20개의 탄소 원자, 3 내지 21개의 탄소 원자, 3 내지 22개의 탄소 원자, 3 내지 23개의 탄소 원자 및/또는 3 내지 24개의 탄소 원자)의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 포괄하고 구체적으로 설명한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원과 관련된 분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
상세한 설명
다양한 양태를 설명하기에 앞서, 본원의 교시는 기재된 특정 양태에 한정되지 않고, 이를테면 당연히 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원의 교시의 범주는 청구범위에 의해서만 한정될 것이기에, 본원에 사용된 용어는 특정 양태를 단지 설명하기 위한 것이고, 한정하고자 함이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 바와 같이, 범위 값의 숫자가 제공된다. 문맥상 명확히 달리 지시되지 않는 한, 범위의 상한치와 하한치 사이의 각각의 개재된 값(하한치의 단위의 10분의 1까지)도 구체적으로 개시된다. 임의의 언급된 범위 사이의 각각의 더 작은 범위 또는 언급된 범위 내의 개재된 값, 및 상기 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값이 본 발명에 포괄된다. 이러한 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 상기 범위 상기 범위에 포함 또는 배제되고, 한계치 둘 중 하나이거나 둘 다가 아니거나 둘다가 더 작은 범위에 포함되는 각각의 범위도 본 발명에 포괄된다(언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계치에도 적용됨). 언급된 범위가 한계치 하나 또는 둘다를 포함하는 경우, 이러한 포함된 한계치의 둘 중 하나 또는 둘다를 배제하는 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명에 관한 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 교시에 사용될 수 있으나, 일부 예시적인 방법 및 물질이 이후로 기재된다.
본원에 언급된 모든 특허 및 특허 공개는 명확히 본원에 참조로 혼입된다.
달리 명확히 지시되지 않는 한, 본원 및 청구범위에 사용된 단수 용어는 단수 및 복수 지시대상 둘다를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "잔기"는 하나의 잔기 및 복수의 잔기를 포함한다.
방법 및 화합물은 올리고뉴클레오티드, 예컨대 RNA, DNA 또는 키메라를 정제하는데 사용되도록 제공된다. 본 발명의 방법은 올리고뉴클레오티드와 오르토에스터 연결자의 접합, 및 예를 들어 크로마토그래피 분리 또는 친화성 포획을 사용한 생성된 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체의 정제를 수반한다. 본 발명의 방법 및 화합물은 절두된 서열 또는 실패 서열로부터 전장 올리고뉴클레오티드를 분리하는데 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 유사한 크기의 올리고뉴클레오티드의 높은 분리능(resolution)을 제공함으로써, 목적하지 않는 부산물로부터 올리고뉴클레오티드의 신속한 분리를 가능하게 한다. 본 발명의 방법의 또 다른 장점은 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체가 염기-안정성임으로써 올리고뉴클레오티드로부터 오르토에스터의 절단의 위험 없이 염기성 조건하에 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자의 합성 취급을 가능하게 한다는 점이다. 분리 매질(젤 또는 수지)에서 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체의 친화성 정제를 수행한 후, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 온화하게 산성인 조건하에 절단됨으로써, 정제된 올리고뉴클레오티드를 고수율로 방출한다. 본 발명의 방법은 다양한 합성법에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드, 예컨대 고체-상 올리고뉴클레오티드 합성으로 제조된 올리고뉴클레오티드를 정제하는데 효과적이다.
정제되는 올리고뉴클레오티드는 천연 공급원으로부터 수득가능하거나 합성법을 사용하여 제조될 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 고체-상 올리고뉴클레오티드 합성을 통해 제조된다. 이러한 양태에서, 합성은 고체 지지체에서 수행된다. 일반적으로, 고체 지지체는 시약 및 용액을 자유롭게 통과하게 하는 컬럼 내의 2개의 필터들 사이에 고정되어 있다.
일부 양태에서, 합성은 평면형 표면에서 수행된다. 일부 양태에서, 합성은 비-평면형 표면에서 수행된다. 이러한 양태에서, 합성은 실질적으로 고체이면서 실질적으로 매끈한 표면에서 수행된다. 표면에 대해 본원에 사용된 용어 "실질적으로 고체"는 올리고뉴클레오티드 합성이 일어나는 지지체의 표면 상의 지점이 올리고뉴클레오티드 합성의 관련 시약 및 화학물질이 상기 표면 너머 및 상기 지지체의 몸체 내로 확산, 흡수 또는 투과됨에 내성이 있음을 의미한다(지지체의 몸체 내에서 올리고 합성이 일어나도록 확산 및 투과를 허용하는 시판되는 중합체 올리고 합성기(synthesizer) 지지체와는 대조적임). 표면에 대해 본원에 사용된 용어 "실질적으로 매끈한"은 올리고뉴클레오티드 합성이 일어나는 지지체의 표면 상의 지점이 불규칙성이 존재하는 경우 이러한 불규칙성이 시약이 표면에 균일하게 도포되거나 혼합되거나 제거될 수 없도록 속도에 실질적인 영향을 주는 규모가 아닌 기껏해야 피상적으로만 불규칙함을 의미한다(시약의 도포 및 제거를 둔화시키는 세공 및 불규칙성을 함유하는 시판되는 "제어 세공 유리" 올리고 합성기 지지체와는 대조적임). 실질적으로 고체이면서 실질적으로 매끈한 표면은 편평할 필요는 없고, 예를 들어 편평 표면, 관, 실린더, 요지(depression) 또는 웰(well)의 배열, 및 상기 요소들의 조합, 및 전술한 특질을 갖는 표면부를 나타내는 기타 디자인을 포함할 것이다. 예를 들어, 실질적으로 고체이면서 실질적으로 매끈한 표면은 잉크젯 프린트 헤드에 의해 어드레싱(addressing)될 수 있는 표면(또는 표면부)이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체, 예컨대 제어된-세공 유리,중합체 지지체, 예를 들어 폴리스티렌(PS) 지지체에 부착된다. 적합한 고체 지지체는 일부 경우 중합체이고, 다양한 형태 및 조성을 가질 수 있고, 천연 발생 물질, 합성 변형된 천연 발생 물질, 또는 합성 물질로부터 유도될 수 있다. 적합한 고체 지지체 물질은 비한정적으로 폴리사카라이드, 예컨대 아가로스(예를 들어 파마시아(Pharmacia)로부터의 세파로스(Sepharose: 등록상표) 및 덱스트란(예를 들어 마찬가지로 파마시아로부터 상표명 세파덱스(Sephadex: 등록상표) 및 세파크릴(Sephacryl: 등록상표)로 시판 중인 것), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올, 하이드록시에틸 메트아크릴레이트와 메틸 메트아크릴레이트의 공중합체, 실리카, 테플론 및 유리 등을 포함한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포라미다이트(phosphoramidite) 방법을 사용하여 제조된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 합성법은 5'-DMT 보호기를 갖는 지지체-결합된 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 합성법은 3'-DMT 보호기를 갖는 지지체-결합된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 합성법은 5'-실릴 보호기를 갖는 지지체-결합된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 합성법은 산화 제거가능 보호기를 갖는 지지체-결합된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 합성은 탈트라이틸화 단계, 지지체-결합된 뉴클레오시드와 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체의 커플링 단계, 미처리된 5'-하이드록시 기의 캐핑 단계, 및 포스포라미다이트 산화 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 합성은 자동화된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 방법을 수행하기에 선행하여 탈트라이틸화된다.
일부 양태에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드의 정제 방법을 제공한다. 상기 방법은 고체 지지체에서 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; 상기 올리고뉴클레오티드를 오르토에스터 연결자와 반응시켜 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 형성하는 단계(여기서 오르토에스터 연결자는 친화성 태그를 포함함); 크로마토그래피 또는 친화성 포획 방법을 사용하여 상기 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 단리하는 단계; 및 상기 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체로부터 오르토에스터 연결자를 절단함으로써, 정제된 올리고뉴클레오티드를 방출시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 친화성 태그 및 알콕시 이탈기(leaving 기)를 포함하는 오르토에스터 연결자와 반응시키는 단계를 포함한다. 상기 반응은 오르토에스터 연결자에 부착된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 생성하는데, 여기서 오르토에스터 연결자는 친화성 태그에 부착된다. 친화성 태그는 바람직하게는 하나 이상의 불순물로부터 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자를 분리하는 정제 방법에 이용될 수 있는 구조적 및/또는 작용기 특성을 갖는다. 예를 들어, 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 불소 친화성 크로마토그래피를 사용하여 하나 이상의 불순물로부터 분리될 수 있다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 고리 오르토에스터이다. 일부 양태에서, 고리 오르토에스터는 5-구성원 고리 오르토에스터이다. 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 6-구성원 고리 오르토에스터이다. 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 7-구성원 고리 오르토에스터이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 불소 오르토에스터이다. 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하나 이상의 불소 원자, 2개 이상의 불소 원자, 3개 이상의 불소 원자, 4개 이상의 불소 원자, 5개 이상의 불소 원자, 6개 이상의 불소 원자, 7개 이상의 불소 원자, 8개 이상의 불소 원자, 9개 이상의 불소 원자, 10개 이상의 불소 원자, 11개 이상의 불소 원자, 12개 이상의 불소 원자, 13개 이상의 불소 원자, 14개 이상의 불소 원자, 15개 이상의 불소 원자, 17개 이상의 불소 원자, 19개 이상의 불소 원자, 21개 이상의 불소 원자, 23개 이상의 불소 원자 또는 25개 이상의 불소 원자를 갖되 52개 이하의 불소 원자를 갖는다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 Ia의 화합물(RC(OR')(OR'')(OR'''))이다:
[화학식 Ia]
Figure pct00019
상기 식에서,
R, R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 알킬, 할로치환된 알켄일, 할로치환된 알킨일, 알킬, 알켄일, 알킨일, 카보사이클릴, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로고리 또는 임의의 치환된 등가물이되, R은 수소일 수 있다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R, R', R'' 및 R'''이 각각 독립적으로 C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 C1-C24 알킬, 할로치환된 C2-C24 알켄일, 할로치환된 C2-C24 알킨일, 카보사이클릴, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로고리 또는 임의의 치환된 등가물이되 R이 수소일 수 있는, 화학식 Ia의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R이 H 또는 C1-C3 알킬이고 R', R'' 및 R'''이 각각 독립적으로 아릴 또는 치환된 아릴인, 화학식 Ia의 화합물이다.
일부 양태에서, R은 H 또는 CH3이고 R', R'' 및 R'''은 모두 페닐 또는 치환된 페닐이다.
일부 양태에서, R', R'' 및 R''' 중 하나는 이탈기이고, 전자 구인성 기(EWG), 예컨대 할로겐(예를 들어 염소) 또는 시아노에틸 기를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, R, R', R'' 및 R'''은 메틸 또는 에틸이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R, R', R'' 및 R''' 중 하나 이상이 소수성 태그 또는 부분 소수성 태그이고 나머지 R 기가 C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, 할로- 또는 헤테로-치환된 등가물, C3-C12 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴, 또는 치환된 등가물인, 화학식 Ia의 화합물이다.
일부 양태에서, R, R', R'' 및 R''' 중 2개 이상은 소수성 태그 또는 부분 소수성 태그이고 나머지 R 기는 C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, 할로- 또는 헤테로-치환된 등가물, C3-C12 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴, 또는 치환된 등가물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R, R', R'' 및 R''' 중 1 또는 2개 이상이 소수성 태그 또는 부분 소수성 태그(상기 소수성 태그는 F, Cl, Br, I 또는 C1-C3 알킬로 임의적으로 치환되고, O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자자 임의적으로 산재되거나 독립적으로 NRa-Rb, -NRa-CO-Rb, -CO-NRa-Rb 및 -CO-Ra로부터 선택되는 기(여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬임)이 산재된 직쇄, 분지쇄, 단일고리 또는 다고리의 포화, 부분 불포화 또는 불포화 C1-C24 탄화수소 쇄를 지칭함)인, 화학식 Ia의 화합물이다. 단독으로 또는 합하여 소수성 태그 또는 부분 소수성 태그의 합은 3 이상의 cLogP 값을 갖는다. 일부 양태에서, R, R', R'' 및 R'''간에 공유되는 탄소 원자의 총 개수는 50개 이하이다. 일부 양태에서, R은 수소이다. 일부 양태에서, R은 메틸 또는 에틸이다.
일부 양태에서, 화학식 Ia의 오르토에스터 연결자 화합물은 하기 2개의 화학식의 화합물로부터 선택된다:
Figure pct00020
상기 식에서, SG는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기이고(독립적으로 각각의 페닐 기에 존재하거나 부재함), 독립적으로 할로겐, NO2, 메틸 기 및 메톡시 기로부터 선택된다. 바람직하게는, 치환된 페닐 기의 2개 이상은 동일하다.
바람직한 양태에서, SG는 3개의 페닐 기에 부재한다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R, R', R'' 및 R''' 중 하나 이상이 불소 태그 또는 부분 불소 태그이고 나머지 다른 R 기가 C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, 할로- 또는 헤테로-치환된 등가물, C3-C12 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴, 또는 치환된 등가물인, 화학식 Ia의 화합물이다.
불소 태그는 불소 원자로 부분 치환 또는 완전 치환(과불화)되고 Cl, Br, I 또는 C1-C3 알킬로 임의적으로 치환되고, O, S 및 N으로부터 선택되는 헤테로원자가 임의적으로 산재되거나 독립적으로 NRa-Rb, -NRa-CO-Rb, -CO-NRa-Rb 및 -CO-Ra로부터 선택되는 기(여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬임)로 산재된 직쇄, 분지쇄, 단일고리 또는 다고리의 포화, 부분 불포화 또는 불포화 C1-C24 탄화수소 쇄를 지칭한다. 불소 태그에서, R, R', R'' 및 R'''간에 공유되는 탄소 원자의 총 개수는 3 이상이고, 불소 원자의 총 개수는 7 이상이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R이 H 또는 C1-C3 알킬이고, R', R'' 및 R'''이 각각 독립적으로 C2-C12 플루오로알킬인, 화학식 Ia의 화합물이다.
일부 양태에서, 화학식 Ia의 오르토에스터 연결자 화합물은 하기 2개의 화학식의 화합물 구조를 갖는다:
Figure pct00021
상기 식에서, n은 1 내지 5이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하나 이상의 친화성 태그(AfTg)를 포함한다. 일부 양태에서, 친화성 태그(AfTg)는 전술한 오르토에스터 연결자의 R 기의 화학적 구조의 부분 또는 전부일 수 있다(예를 들어 소수성 태그 또는 불소 태그).
일부 양태에서, 친화성 태그(AfTg)는 소수성 태그 또는 불소 태그이고, 예를 들어 비오틴 태그, 말토스 태그, 아다만탄 태그 또는 화학 작용성 태그이고, 공유 결합을 통해 직접적으로 또는 연결자 L을 통해 간접적으로 오르토에스터 연결자에 부착될 수 있다. 이러한 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 Ib의 화합물이다:
[화학식 Ib]
Figure pct00022
상기 식에서,
R, R' 및 R''은 각각 독립적으로 AfTg-L이거나 직쇄, 분지쇄, 단일고리 또는 다고리의 포화, 부분 불포화 또는 불포화 C1-C12 탄화수소 쇄이되, 임의적으로 치환되고 임의적으로 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자가 임의적으로 산재하거나 NRa-Rb, -NRa-CO-Rb, -CO-NRa-Rb 및 -CO-Ra로부터 독립적으로 선택되는 기가 임의적으로 산재하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고; L은 공유 결합 또는 직쇄, 분지쇄, 단일고리 또는 다고리의 포화, 부분 불포화 또는 불포화 C1-C12 탄화수소 쇄이되, F, Cl, Br, I 또는 C1-C3 알킬로 임의적으로 치환되고, O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자가 임의적으로 산재하거나 NRa-Rb, -NRa-CO-Rb, -CO-NRa-Rb 및 -CO-Ra로부터 독립적으로 선택되는 기가 임의적으로 산재하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다.
일부 양태에서, L은 직쇄, 분지쇄, 단일고리 또는 다고리의 포화, 부분 불포화 또는 불포화 C1-C12 탄화수소 쇄이되, F, Cl, Br, I 또는 C1-C3 알킬로 임의적으로 치환되고, O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자가 임의적으로 산재하거나 NRa-Rb, -NRa-CO-Rb, -CO-NRa-Rb 및 -CO-Ra로부터 독립적으로 선택되는 기가 임의적으로 산재하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고, R, R' 및 R''은 각각 독립적으로 C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, 할로- 또는 헤테로-치환된 등가물, C3-C12 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴, 또는 치환된 등가물이다. R은 수소일 수 있다. 일부 양태에서, R' 및 R''은 이탈기이고, 전자 구인성 기(EWG), 예를 들어 트라이플루오로알킬(예컨대 CH2CF3) 또는 시아노에틸 기를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 AfTg가 친화성 태그이고, R, R' 및 R''이 각각 독립적으로 AfTg-L 또는 C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 C1-C24 알킬, 할로치환된 C2-C24 알켄일, 할로치환된 C2-C24 알킨일, 카보사이클릴, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로고리, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 조합이되, 탄소의 총 개수가 24개 이하이고; L이 공유 결합 또는 직쇄, 분지쇄, 단일고리 또는 다고리의 포화, 부분 불포화 또는 불포화 C1-C12 탄화수소 쇄이되, F, Cl, Br, I 또는 C1-C3 알킬로 임의적으로 치환되고, O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자가 임의적으로 산재하거나 S-S, NRa, NRa-CO, -CO-NRa-, NRa-CO-NRb 및 CO로부터 독립적으로 선택되는 기가 임의적으로 산재하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬인, 화학식 Ib의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 상기 오르토에스터 연결자의 R', R'' 및 R''' 기 중 2개가 탄소-탄소 결합을 통해 함께 연결되어 하기 화학식 Ic의 고리 오르토에스터를 형성하는, 화학식 Ic의 화합물이다:
[화학식 Ic]
Figure pct00023
.
화학식 Ia의 오르토에스터 연결자 화합물과 올리고뉴클레오티드의 반응시, 하기 화학식 IVa의 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체가 수득된다:
[화학식 IVa]
Figure pct00024
상기 식에서,
R, R' 및 R'' 중 하나 이상은 소수성 태그 또는 불소 태그이되, R, R' 및 R''은 각각 독립적으로 C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 알킬, 할로치환된 알켄일, 할로치환된 알킨일, 카보사이클릴, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로고리 또는 임의의 치환된 등가물이고, 바람직하게는 R' 및/또는 R''은 소수성 태그 또는 불소 태그이고, R은 H 또는 메틸이고;
X는 H, OH, F, 보호된 하이드록시, O-메톡시 또는 O-MOE(메톡시에톡시)이고;
B는 보호되거나 비-보호된 핵염기이다.
화학식 Ib의 오르토에스터 연결자와 올리고뉴클레오티드의 반응시, 하기 화학식 IVb의 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체가 수득된다:
[화학식 IVb]
Figure pct00025
상기 식에서,
AfTg는 친화성 태그이고;
L은 공유 결합 또는 직쇄, 분지쇄, 단일고리 또는 다고리의 포화, 부분 불포화 또는 불포화 C1-C12 탄화수소 쇄이되, F, Cl, Br, I 또는 C1-C3 알킬로 임의적으로 치환되고, O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자가 임의적으로 산재하거나 NRa-Rb, -NRa-CO-Rb, -CO-NRa-Rb 및 -CO-Ra로부터 독립적으로 선택되는 기가 임의적으로 산재하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R 및 R'은 각각 독립적으로 C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 알킬, 할로치환된 알켄일, 할로치환된 알킨일, 카보사이클릴, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로고리 또는 임의의 치환된 등가물이고;
X는 H, OH, F, 보호된 하이드록시, O-메톡시 또는 O-MOE(메톡시에톡시)이고;
B는 보호되거나 비-보호된 핵염기이다.
바람직한 양태에서, R은 H이고, R'은 C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, 할로- 또는 헤테로-치환된 등가물, C3-C12 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴, 또는 치환된 등가물이다.
일부 양태에서, 친화성 정제는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 단리하거나 정제하는데 사용된다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 올리고뉴클레오티드의 5'-하이드록시와 반응함으로써 올리고뉴클레오티드의 5'-하이드록시에 부착된다. 이에 따라, 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 올리고뉴클레오티드의 5'-하이드록시에 부착된다. 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 올리고뉴클레오티드의 3'-하이드록시와 반응함으로써 올리고뉴클레오티드의 3'-하이드록시에 부착된다. 이에 따라, 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 올리고뉴클레오티드의 3'-하이드록시에 부착된다. 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 뉴클레오티드 염기에 존재하는 하이드록시 기에 부착된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고리보뉴클레오티드(RNA)이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고데옥시리보뉴클레오티드(DNA)이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 15개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 50개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 70개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 75개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 100개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 125개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 150개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 15개 내지 약 500개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 40개 내지 약 300개의 뉴클레오티드 길이이다.
친화성 태그 및 동일한 친화성 짝의 인식 잔기는 생체분자 또는 생체고분자, 또는 불용성 지지체에 상호교환가능하게 연결될 수 있고, 접합 반응의 용이함, 및 탈보호 및 생체분자로부터 태그의 절단에 사용되는 조건의 호환성을 기반으로 선택될 것이다. 이를 고려하면, 통상의 기술자는 친화성 짝의 구성원이 생체분자 및 고체 지지체에 부착될지 여부를 판단할 것이다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 불소 친화성 태그이다. 불소 친화성 태그의 비한정적인 예는 불화 치환기, 예컨대 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 헤테로알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일, 플루오로치환된 카보사이클릴, 플루오로치환된 헤테로사이클릴 및 플루오로치환된 아릴 치환기를 포함한다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 불소 친화성 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 불소 친화성 태그에 (R 기로서) 직접적으로 또는 연결자 L을 통해 간접적으로 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 불소 친화성 정제는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결된 불소 태그 접합체를 단리하거나 정제하는데 사용된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 소수성 태그이다. 소수성 친화성 태그의 비한정적인 예는 불화 기, 트라이틸, 스테로이드, 지질, 포화 또는 불포화 알킬 장쇄, 예컨대 옥타데실 치환기 또는 카보사이클릴을 포함하는 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 소수성 친화성 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 소수성 친화성 태그에 (R 기로서) 직접적으로 또는 연결자 L을 통해 간접적으로 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 소수성 친화성 정제는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결된 불소 태그 접합체를 단리하거나 정제하는데 사용된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 비오틴 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 비오틴 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 비오틴 태그에 (R 기로서) 직접적으로 또는 연결자 L을 통해 간접적으로 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 아비딘 또는 스트렙타비딘은 고체-상에 부착되거나 젤에 내장되고, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결된 비오틴 접합체를 포획하는데 사용된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 글루타티온 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 글루타티온 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 글루타티온 태그에 (R 기로서) 직접적으로 또는 연결자 L을 통해 간접적으로 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 글루타티온 S-전달효소(GST)는 고체-상에 부착되거나 젤에 내장되고, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결된 글루타티온 접합체를 포획하는데 사용된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 말토스 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 말토스 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 말토스 태그에 (R 기로서) 직접적으로 또는 연결자 L을 통해 간접적으로 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 말토스 결합 단백질은 고체-상에 부착되거나 젤에 내장되고, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결된 말토스 접합체를 포획하는데 사용된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 아릴보론산 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 아릴보론산 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 아릴보론산 태그에 (R 기로서) 직접적으로 또는 연결자 L을 통해 간접적으로 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 다이올-함유 분자는 고체-상에 부착되거나 젤에 내장되고, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결된 아릴보론산 접합체를 포획하는데 사용된다. 일부 양태에서, 친화성 태그는 다이올-함유 화합물이고, 아릴보론산 유도체는 고체 지지체에 연결된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 폴리-히스티딘 펩티드 태그이다. 폴리-히스티딘 펩티드 태그의 비한정적인 예는 이미다졸 치환기, 예컨대 이미다졸 및 히스티딘을 포함한다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 폴리-히스티딘 펩티드 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 폴리-히스티딘 펩티드 태그에 (R 기로서) 직접적으로 또는 연결자 L을 통해 간접적으로 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 부동화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 정제는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 연결된 히스티딘 또는 이미다졸 접합체를 단리하거나 정제하는데 사용된다
일부 양태에서, 친화성 태그는 폴리-설프하이드릴 태그이다. 폴리-설프하이드릴 태그의 비한정적인 예는 치환기, 예컨대 시스테인 및 다이티오트레이졸을 포함한다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 폴리-설프하이드릴 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 폴리-설프하이드릴 태그에 (R 기로서) 직접적으로 또는 연결자 L을 통해 간접적으로 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 부동화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 정제는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 연결된 폴리-설프하이드릴 접합체를 단리하거나 정제하는데 사용된다
일부 양태에서, 친화성 태그는 말레이미드 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 말레이미드 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 말레이미드 태그에 (R 기로서) 직접적으로 또는 연결자 L을 통해 간접적으로 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태서, 설프하이드릴-함유 분자는 고체-상에 부착되거나 젤에 내장되고, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 말레이미드 접합체를 포획하는데 사용된다. 일부 양태에서, 친화성 태그는 설프하이드릴-함유 화합물이고, 말레이미드 유도체는 고체 지지체에 연결된다. 또 다른 양태에서, 친화성 태그는 설프하이드릴-함유 화합물이고, 알파-할로카보닐 유도체는 고체 지지체에 연결된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 아다만탄 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 아다만탄 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 연결자 L을 통해 아다만탄에 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 쿠쿠르비투릴 또는 사이클로덱스트린은 고체-상에 부착되거나 젤에 내포되고, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결되어 아다만탄 접합체를 포획하는데 사용된다. 또 다른 양태에서, 사이클로덱스트린 또는 쿠쿠르비투릴 화합물은 오르토에스터 연결자에 부착되고, 아다만탄은 친화성 정제를 위해 고체 상에 부착되거나 젤에 내포된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 아지도 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 아지도 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 연결자 L을 통해 아지드에 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 알킨 또는 사이클로옥틴은 고체-상에 부착되거나 젤에 내포되고, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결되 아지드 접합체를 포획하는데 사용된다. 또 다른 양태에서, 아지도 잔기는 고체 지지체 또는 젤을 통해 고체 지지체에 부착되고, 알킨 또는 사이클로옥틴은 오르토에스터 연결자에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 사이클로옥틴 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 사이클로옥틴 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 연결자 L을 통해 사이클로옥틴에 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 니트론은 고체-상에 부착되거나 젤에 내포되고, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 연결된 사이클로옥틴 접합체를 포획하는데 사용된다. 또 다른 양태에서, 사이클로옥틴 잔기는 고체 지지체 또는 젤에 부착되고, 니트론-함유 화합물은 오르토에스터 연결자에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 알켄일 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 알켄일 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 연결자 L을 통해 알켄에 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 공액 다이엔은 고체-상에 부착되거나 젤에 내포되고, 디엘스-알더형(Diels-Alder type) 반응([4+2] 고리첨가)에서 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결된 알켄 접합체를 포획하는데 사용된다. 또 다른 양태에서, 알켄-함유 화합물은 고체 지지체 또는 젤에 부착되고, 공액 다이엔은 오르토에스터 연결자에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 아미노 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 아미노 태그와 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 연결자 L을 통해 아민에 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 활성화된 에스터, 예컨대 N-하이드록시숙신이미드는 고체-상에 부착되거나 젤에 내포되고, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 연결된 아미노 접합체를 포획하는데 사용된다.
일부 양태에서, 친화성 태그는 하이드라지드 또는 옥시아민 태그이다. 일부 양태에서, 오르토에스터는 하이드라지드 또는 옥시아민과 올리고뉴클레오티드간의 연결자로서 작용한다. 즉, 오르토에스터(즉 오르토에스터 연결자)는 연결자 L을 통해 하이드라지드 또는 옥시아민에 부착되고, 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 양태에서, 알데히드 또는 케톤-함유 화합물은 고체-상에 부착되거나 젤에 내포되고, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결된 하이드라지드 또는 옥시아민 접합체를 포획하는데 사용된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인 보호기를 포함함으로써, 올리고뉴클레오티드의 인 잔기가 인 보호기에 부착된다. 일부 양태에서, 인 잔기는 포스페이트, 포스포라미다이트 또는 H-포스포네이트 기이다. 일부 양태에서, 인 보호기는 메틸 또는 시아노에틸 기(예를 들어 베타-시아노에틸 기)이다. 메틸 기는, 예를 들어 티오페놀 또는 다이나트륨 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트를 사용하여 제거될 수 있다. 시아노에틸 기는, 예를 들어 비-친핵성 또는 장애 아민, 예컨대 다이에틸아민, tert-부틸아민 또는 1,8-다이아자바이사이클로운데크-7-엔(DBU)을 사용하여 제거될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드와 오르토에스터 연결자를 반응시키기 전에 올리고뉴클레오티드의 인 보호기를 탈보호시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드와 오르토에스터 연결자를 반응시킨 후에 핵염기 보호기 및 임의적으로 인 보호기를 탈보호시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 핵염기 보호기를 포함한다. 올리고뉴클레오티드에서 임의의 핵염기는 핵염기 보호기를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 핵염기 보호기는 아세틸, 이소부티릴 또는 벤조일 등이다. 예를 들어, 보호된 핵염기는 N6-벤조인-A, N6-이소부티릴-A, N4-아세틸-C, N4-이소부티릴-C 또는 N2-이소부티릴-G일 수 있다. 일부 양태에서, 핵염기 보호기는 올리고뉴클레오티드를 폴리아민에 접촉시킴으로써 제거된다. 일부 양태에서, 핵염기 보호기는 올리고뉴클레오티드와 다이이만, 예컨대 1,2-다이아미노에탄을 접촉시킴으로써 제거된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드를 1,2-다이아미노에탄에 2시간 동안 실온에서 노출시키는 것은 핵염기의 탈보호를 야기한다. 일부 양태에서, 핵염기 보호기는 페녹시아세틸, tert-부틸페녹시아세틸, 다이메틸포름아미딘 또는 다이메틸아세트아미딘 등이다. 일부 양태에서, 핵염기 보호기는 올리고뉴클레오티드와 오르토에스터 연결자를 반응시키기 전에 제거된다.
일부 양태에서, 핵염기 보호기는 올리고뉴클레오티드와 오르토에스터 연결자를 반응시킨 후에 제거된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 고체 지지체로부터 절단하고 핵염기 보호기 및 임의적으로 인 보호기를 탈보호시키는 것은 동시에 및/또는 동일 반응으로 수행된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 2'-하이드록시 보호기를 포함하는 올리고리보뉴클레오티드(RNA)이다. 일부 양태에서, 2'-하이드록시 보호기는 티오노카바메이트(TC) 보호기이다. 일부 양태에서, 2'-하이드록시 보호기는 비스(2-아세톡시에톡시)메틸(ACE) 보호기, tert-부틸다이메틸실릴(TBDMS) 보호기, 트라이이소프로필실리옥시메틸(TOM) 보호기, 피발로일옥시메틸(PivOM) 보호기 또는 2-시아노에톡시메틸(CEM) 보호기이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 합성은 염기 불안정성 연결자(예컨대 숙시네이트 연결자 또는 유니버셜 서포트(Universal Support)(예를 들어 글렌 리서치 유니서포트(Glen Research UnySupport)), 또는 유니링커(UnyLinker))를 갖는 고체-상에 부착된 3'-말단 뉴클레오티드를 함유하는 고체-상(예를 들어 세공 조절 유리(CPG))에서 수행된다. 합성 사이클은 5'-OH 보호기(예컨대 트라이틸 또는 DMT)의 탈보호, 활성제의 존재하에 포스포라미다이트의 커플링, 염기 불안정성 보호기(예컨대 아세틸 보호기)에 의한 미처리된 하이드록시 기의 캐핑, 및 포스파이트트라이에스터 연결의 포스페이트트라이에스터 연결로의 산화를 포함한다.
신생 합성된 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 변형된 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에서 합성된다. 생성된 전장 생성물은 친화성 태그를 포함하는 오르토에스터 연결자를 부착하기 위해 탈블록 단계에서 최종 보호기를 제거함으로써 제조된다. 상기 보호기는 문헌에 주지되어 있는 다양한 기, 가장 전형적으로는 DMT, Pixyl 또는 BZH일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어날 수 있고, 여기서 최종 보호기는 생성된 올리고뉴클레오티드의 5'-하이드록시로부터 제거되거나, 합성은 5'에서 3' 방향으로 일어날 수 있고, 여기서 최종 보호기는 생성된 올리고뉴클레오티드의 3'-하이드록시로부터 제거된다. 이 시점에서, 인 보호기는 신생 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 임의적으로 제거될 수 있다. 친화성 태그를 포함하는 오르토에스터 연결자는 전장 생성물의 하이드록시 기 및 단지 전장 생성물과만 반응할 수 있는데, 이는 절두된 서열의 하이드록시가 합성 중, 예를 들어 아세테이트 보호기에 의해 캐핑됨에 따라 오르토에스터 연결자와 반응할 수 없음에 기인한다. 하이드록시 기는 최종 탈블록 단계에서 분리될 수 있고, 이는 온화한 산을 트랜스-오스토에스터화 촉매로서 사용하여 수행될 수 있다. 전형적으로, 오르토에스터 연결자와 전장 올리고뉴클레오티드의 접합은 높은 유전 상수의 용매(예를 들어 아세토니트릴, DMF, 다이옥산, THF 및 프로필렌 카보네이트 등) 중 실온 이상이고 95℃ 이하의 온도에서 수행되고, 산 용액(무수 용매, 예컨대 아세토니트릴 중 산(예를 들어 퍼플루오로헵타노산 또는 헵타플루오로부티르산, 트라이클로로아세트산, 다이클로로아세트산, 2-다이클로로프로피온산, 2,3-다이클로로프로피온산, 2,6-비스(트라이플루오로메틸)벤조산, 2-(트라이플루오로메틸)벤조산, 4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-트라이데카플루오로노난산 및 4,4,5,5,6,6,6-헵타플루오로헥산산)이 상기 반응에 약 0.001 M 내지 약 0.1 M, 바람직하게는 약 0.02 M의 농도로 첨가되고, 상기 반응은 오르토에스터 연결자의 반응성에 따라 약 15분 내지 약 12시간 동안 수행된다.
이어서, 생성된 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체 및 미태깅된 절두된 올리고뉴클레오티드는 다양한 염기성 아민(암모니아, 암모늄 하이드록사이드, 메틸아민 및 에틸렌다이아민 등)에 의해 처리되어 다양한 작용기, 핵염기 및 존재하는 경우 염기 불안정성 2'-하이드록시 보호기, 예컨대 TC 또는 PivOM이 임의적으로 제거되고, 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에 부착시키는 연결자, 전형적으로는 숙시네이트 연결자 또는 유니링커가 절단될 수 있다.
전장 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체 및 미태깅된 절두된 서열(미정제 샘플)은 완충액, 전형적으로는 0.2 M 나트륨 포스페이트, 0.6 M 나트륨 클로라이드, pH 7.4 및 10% 다이메틸포름아미드를 함유하는 완충액(재하(loading) 완충액)에서 고체 지지체로부터 용리된다.
이어서, 분리된 미정제 올리고뉴클레오티드는 친화성 짝에 의해 보조되는 크로마토그래피 분리 또는 고체-상 추출(예를 들어 카트리지)을 사용하여 정제될 수 있다. 친화성 태그 및 미태깅된 절두된 서열에 부착된 전장 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 함유하는 미정제 올리고뉴클레오티드 샘플은 재하 완충액과 함께 수지, 비드 또는 중합체 물질(포획 잔기를 함유함)로 채워진 컬럼 또는 카트리지 위에 재하된다. 전장 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체에 부착된 친화성 태그는 친화성에 의해 또는 공유 결합으로 수지 또는 비드에 내장된 포획 잔기에 결합하고, 상기 수지 또는 비드는 미태깅된 절두된 서열이 세척 완충액, 통상적으로는 0.01 M 나트륨 포스페이트 완충액(pH = 7.4)에 의해 상기 컬럼 또는 카트리지 밖으로 용리되는 동안 유지된다.
이어서, 오르토에스터 연결자는 상기 컬럼 또는 카트리지에 온화한 산 용액(절단 완충액), 예를 들어 3.0 M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.5)을 첨가하고 이를 30분 내지 3시간 동안 실온에서 방치함에 의해 전장 올리고뉴클레오티드 접합체로부터 절단될 수 있다. 비-염기 불안정성 2'-하이드록시 보호기를 갖는 단량체, 예컨대 ACE, CEM, TBDMS 또는 TOM 등이 올리고뉴클레오티드를 합성하는데 사용되는 경우, 상기 비-염기 불안정성 탈보호기(예컨대 TBDMS, TOM 또는 CEM)의 탈보호는 오르토에스터 연결자를 전장 올리고뉴클레오티드로부터 절단하기 전(친화성 포획 물질이 화학적 탈보호 처리에 내성인 경우) 또는 후에 불화 이온에 의해 수행될 수 있다. 다르게는, 산 불안정성 2'-하이드록시 보호기, 예컨대 ACE가 사용되는 경우, 상기 기의 탈보호는 오르토에스터 연결자를 전장 올리고뉴클레오티드로부터 절단하는 동안 수행될 수 있다. 오르토에스터 연결자의 절단 후, 절단 완충액은 용리액의 pH가 약 7로 돌아올 때까지 세척 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 제거된다. 흡착되고 정제된 전장 올리고뉴클레오티드는 DNase/RNase-미함유 물 중 10% 아세토니트릴을 사용하여 수지 또는 비드로부터 용리된다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자 접합은 산의 존재하에 합성 컬럼에서 수행된다. 오르토에스터-올리고뉴클레오티드 접합 후, 합성 고체-상(예컨대 CPG)로부터 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 접합체의 절단 및 올리고뉴클레오티드의 다양한 보호기(RNA가 합성될 때 인 보호기, 핵염기 보호기 및 2'O-하이드록시 보호기)의 탈보호가 수행된다.
올리고뉴클레오티드를 합성하는데 사용되는 화학(즉 단량체의 조성)에 따라, 보호기의 탈보호는 염기 또는 염기성 시약(예컨대 1,2-다이아미노에탄, 암모니아 및 암모늄 하이드록사이드 등)에 의해 실온 이상의 온도에서 수행된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 합성은 비-염기 불안정성 절단가능 연결자(예컨대 광절단가능(photocleavable) 연결자)에 의해 부착된 3'-말단 뉴클레오티드를 함유하는 고체-상에서 성취된다. 이러한 양태에서, 연장되는 올리고뉴클레오티드의 미반응 5'-하이드록시 기의 캐핑은 비-염기 불안정성 시약(예컨대 유니캡(Unicap))에 의해 성취되고, 이때 탈보호는 절두된 올리고뉴클레오티드 서열에 유리 하이드록시 기가 아닌 포스페이트 기를 남긴다. 이러한 양태에서, 아민 염기에 의한 인 보호기 및 뉴클레오티드 보호기의 탈보호는 여전히 고체-상에 부착되어 있는 탈보호된 올리고뉴클레오티드를 생성하지만, 단지 5'-말단 하이드록시 기만이 오르토에스터 연결자와의 결합에 이용가능하다. 오르토에스터 연결자와 올리고뉴클레오티드(고체-상에 여전히 부착되어 있지만 뉴크렐오티드 및 인은 탈보호됨)간의 접합 후, 올리고뉴클레오티드는 상기 고체-상으로부터 절단될 수 있고, 친화성 정제를 거쳐 목적하는 전장 오르토에스터-올리고뉴클레오티드 접합체로 단리된다. 최종적으로, 오르토에스터 연결자는 온화한 산성 용액(pH = 5 내지 6)에서 정제된 전장 올리고뉴클레오티드로부터 절단되고 친화성 분리 매질로부터 용리된다.
2'-하이드록시 보호기는 임의의 적합한 조건을 사용하여 제거될 수 있다. 일부 양태에서, TC 또는 PivOM 보호기는 올리고리보뉴클레오티드를 다이아민, 예컨대 1,2-다이아미노에탄과 접촉시킴으로써 2'-하이드록시로부터 제거된다. 일부 양태에서, PivOM 보호기는 올리고리보뉴클레오티드와 암모니아 또는 알킬 아민을 접촉시킴으로써 올리고리보뉴클레오티드로부터 제거된다. 일부 양태에서, 올리고리보뉴클레오티드를 다이아민, 암모니아 또는 알킬 아민과 접촉시키는 것은 2'-하이드록시 기의 탈보호 및 고체지지체로부터 올리고리보뉴클레오티드의 절단을 동시에 야기한다. 일부 양태에서, ACE 보호기는 올리고리보뉴클레오티드를 산과 접촉시킴으로써 제거된다. 일부 양태에서, ACE 보호기 및 오르토에스터 연결자는 동시에 제거된다. 일부 양태에서, 2'-하이드록시 보호기는 TBDMS 또는 TOM 보호기이고, 올리고리보뉴클레오티드와 불화물을 포함하는 조성물을 접촉시킴으로써 제거된다. TBDMS 또는 TOM 보호기는 올리고리보뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 단리한 후, 및 오르토에스터 연결자를 절단하기 전, 동시 또는 후에 제거될 수 있다.
일부 양태에서, 2'-하이드록시 보호기는 올리고리보뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 단리하기 전에 제거된다. 일부 양태에서, 2'-하이드록시 보호기는 올리고리보뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 단리한 후에 제거된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1,2-다이아미노에탄으로 처리되어, 올리고뉴클레오티드로부터 보호기의 제거 및 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자의 절단을 동시에 야기한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인 보호기 또는 핵염기 보호기를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인 보호기 및 핵염기 보호기를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인 보호기, 핵염기 보호기 및 2'-하이드록시 보호기를 포함하는 RNA이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1,2-다이아미노탄으로 처리됨으로써 2'-OH 보호기(예컨대 TC 또는 PivOM)가 올리고뉴클레오티드로 제거되는 동시에 합성 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체가 절단된다.
일부 양태에서, 화학식 Ia의 오르토에스터 연결자의 R', R'' 및 R''' 기 중 2개는 탄소-탄소 결합을 통해 함께 연결되고, 하기 화학식 I의 화합물로 제시되는 5, 6, 또는 7-구성원 고리의 고리 오르토에스터를 형성한다:
[화학식 I]
Figure pct00026
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 각각은 독립적으로 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 카보사이클릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 치환된 C1-C24 알킬, 치환된 C2-C24 알켄일, 치환된 C2-C24 알킨일 또는 치환된 아릴이되, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 하나 이상은 H가 아니고, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고, 바람직하게는 R7, R8 및 R9는 H이고;
X는 H, 메틸, 또는 전자 구인성 기이고;
n은 0, 1 또는 2이다.
n이 2일 때, 오르토에스터 연결자 잔기는 하기 구조로 제시되는 7-구성원 고리의 고리 오르토에스터 연결자를 형성하고, 추가의 탄소의 2개의 추가의 R 기 R'5 및 R'6(각각 독립적으로 R1 내지 R6 기 중 임의의 것과 마찬가지로 정의됨)을 갖는다.
Figure pct00027
일부 양태에서, 화학식 I의 오르토에스터 연결자에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 각각은 독립적으로 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 조합이되, 탄소의 총 개수는 24 이하이고;
R8 및 R9는 H이고;
X는 H, 메틸 또는 전자 구인성 기이고;
n은 0, 1 또는 2이되,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함한다.
일부 양태에서, 화학식 I의 오르토에스터 연결자에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일, 플루오로치환된 카보사이클릴, 플루오로치환된 헤테로알킬, 플루오로치환된 헤테로알켄일, 플루오로치환된 헤테로알킨일 또는 플루오로치환된 헤테로사이클릴이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 Id의 화합물이다:
[화학식 Id]
Figure pct00028
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴, 이의 임의의 치환된 등가물 또는 임의의 조합이되, 탄소의 총 개수는 24 이하이고, 나머지 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, 할로- 또는 헤테로-치환된 등가물, C3-C12 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 및 치환된 등가물이되, R1 내지 R7 중 2개의 R 기는 하기 화학식으로 제시되는 고리 오르토에스터를 갖는 융합된 고리를 형성하지 않는다:
Figure pct00029
상기 식에서,
X는 F, Cl, Br, 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이고;
n은 0 또는 1이되,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함한다.
화학식 Id의 오르토에스터 연결자는 n이 0이고, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 2개 이상이 각각 독립적으로 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴 또는 임의의 치환된 등가물이고, 나머지 모든 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6이 H이되, H가 아닌 2개의 R 기는 서로 연결되어 고리 오르토에스터를 갖는 융합된 고리를 형성하지 않는다.
화학식 Id의 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 하나 이상이 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일 또는 플루오로치환된 아릴인, 화합물을 포함한다.
화학식 Id의 오르토에스터 연결자에서, 친화성 태그는 3 이상의 CLogP 값을 갖는 불소 태그 또는 소수성 태그일 수 있다.
친화성 태그(AfTg)는 R 기(R1, R2, R3, R4, R5, R6 또는 R7)의 화학 구조의 일부 또는 전부일 수 있거나, 이는 하기 제시되는 바와 같이 연결자 L을 통해 오르토에스터에 부착될 수 있다:
Figure pct00030
상기 식에서,
AfTg는 친화성 태그이고;
L은 공유 결합이거나 직쇄, 분지쇄, 일고리 또는 다고리의 포화, 부분 불포화 또는 불포화 C1-C12 탄화수소 쇄이되, F, Cl, Br, I 또는 C1-C3 알킬로 임의적으로 치환되고, O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자가 산재하거나 NRa-Rb, -NRa-CO-Rb, -CO-NRa-Rb 및 -CO-Ra로부터 독립적으로 선택되는 기가 임의적으로 산재하되, 여기서 Ra 및 Rb 각각은 H 또는 C1-C6 알킬이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R5 및 R6이 H인 화학식 I의 화합물이다. 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R5, R6, R7, R8 및 R9이 H인, 화학식 I의 화합물이다. 바람직하게는, n은 0이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6이 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 치환된 C1-C24 알킬, 치환된 C2-C24 알켄일, 치환된 C2-C24 알킨일 또는 치환된 아릴이고, 다른 모든 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6이 H이고; R7, R8 및 R9가 H이고; X가 H 또는 전자 구인성 기이고; n이 0, 1 또는 2이고, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 하나 이상이 친화성 태그인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, R1은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R2는 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R3은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R4는 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R5는 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R6은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R7은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 2개 이상은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 3개 이상은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 4개 이상은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 5개 이상은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 각각은 친화성 태그를 포함한다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상이 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일, 플루오로헤테로알킬 또는 플루오로치환된 아릴인, 화학식 I의 화합물이다. 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 하나 이상이 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일 또는 플루오로치환된 아릴인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5 또는 R6이 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 C1-C24 알킬인, 화학식 I의 화합물이다. 일부 양태에서, 헤테로원자는 산소이다. 일부 양태에서, 헤테로원자는 질소이다. 일부 양태에서, 헤테로원자는 상이한 헤테로원자의 조합이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R7이 H인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2 및 R3이 H이고, R4가 C1-C24 알킬인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R5, R6 및 R7이 수소이고, R4가 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C6-C24 아릴알킬 또는 치환된 등가물인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R8 및 R9가 수소인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R8 및 R9 중 하나가 메틸인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R8 및 R9 중 하나가 할로겐인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 X가 수소인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 X가 할로치환된 알킬인, 화학식 I의 화합물이다. 일부 양태에서, 할로치환된 알킬은 CF3, CF2H, CFH2, CCl3, CCl2H 또는 CClH2이다. 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 X가 CF3인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 X가 Cl, F, SO3H, NO2, SO2R10, CH2SO2R10, COR10, CH2COR10, NO2, CH2CN 또는 카보닐이되, R10이 C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, 치환된 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 n이 0인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5 또는 R6이 치환기
Figure pct00031
이되, 여기서 W는 불소 치환된 알킬 기이고 m은 1 내지 12인, 화학식 I의 화합물이다. 일부 양태에서, 불소치환된 알킬은 1 내지 25개의 불소 원자를 포함한다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3 또는 R4에 치환기
Figure pct00032
를 포함하되, 여기서 W는 할로치환된 알킬 기이고 m은 1 내지 12인, 화학식 I의 화합물이다. 일부 양태에서, 상기 치환기는 1 내지 14개의 추가의 불소 원자를 포함한다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5 또는 R6에 치환기
Figure pct00033
를 포함하되, 여기서 m은 0 내지 6인, 화학식 I의 화합물이다. 일부 양태에서, R5 및 R6은 수소이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5 또는 R6에 치환기
Figure pct00034
를 포함하는 화학식 I의 화합물이다. 일부 양태에서, R5 및 R6은 수소이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5 또는 R6에 치환기
Figure pct00035
를 포함하되, 여기서 m은 0 내지 6인, 화학식 I의 화합물이다. 일부 양태에서, R5 및 R6은 수소이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3 또는 R4, R5 및 R6이 H이고, R3 또는 R4가 하나 이상의 헤테로원자를 임의적으로 포함하는 C1-C24 플루오로알킬이고; X는 CF3이고; n은 0 또는 1인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3 또는 R4, R5 및 R6이 H이고, R3 또는 R4가 하나 이상의 헤테로원자를 임의적으로 포함하는 C1-C24 알킬이고; X는 CF3이고; n은 0 또는 1인, 화학식 I의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00036
상기 식에서,
R11은 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C1-C24 치환된 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 치환된 알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, C2-C24 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고;
R7은 H 또는 CH3이고;
Z는 CRaRb, O, S 또는 NRa이되, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
Z'은 각각 독립적으로 O 및 S로부터 선택되고;
X는 H, CH3 또는 전자 구인성 기이고;
n은 0, 1 또는 2이다. 일부 양태에서, R11은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R11은 친화성 태그이다. 바람직하게는, n은 0이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00037
상기 식에서,
R11은 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C1-C24 치환된 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 치환된 알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, C2-C24 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고;
R7은 H 또는 CH3이고;
Z는 CRaRb, O, S 또는 NRa이되, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
X는 H, CH3 또는 전자 구인성 기이고;
n은 0, 1 또는 2이다. 일부 양태에서, R11은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R11은 친화성 태그를 포함한다. 바람직하게는, n은 0이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00038
상기 식에서,
R11은 H, C1-C23 알킬, C1-C23 헤테로알킬, C1-C23 치환된 알킬, C2-C23 알켄일, C2-C23 헤테로알켄일, C2-C23 치환된 알켄일, C2-C23 알킨일, C2-C23 헤테로알킨일, C2-C23 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고;
R7은 H 또는 CH3이고;
Z는 CRaRb, O, S, NRa, NRaCO 또는 CONRa이되, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
Ra 및 R11은 함께 N을 갖는 헤테로고리를 형성하고;
X는 F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이고;
n은 0 또는 1이고;
R11은 친화성 태그를 포함한다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00039
상기 식에서,
R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, C1-C23 알킬, C1-C23 헤테로알킬, C1-C23 치환된 알킬, C2-C23 알켄일, C2-C23 헤테로알켄일, C2-C23 치환된 알켄일, C2-C23 알킨일, C2-C23 헤테로알킨일, C2-C23 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이되, R11 및 R12 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고;
R7은 H 또는 CH3이고;
Z는 각각 독립적으로 CRaRb, O, S, NRaCO, CONRa 또는 NRa이되, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, Ra 및 R11 또는 Ra 및 R12는 함께 N을 갖는 헤테로고리를 형성하고;
X는 F, Cl, Br 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이고;
n은 0 또는 1이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00040
상기 식에서,
R11은 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C1-C24 치환된 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 치환된 알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, C2-C24 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고;
n은 0, 1 또는 2이다. 일부 양태에서, R11은 친화성 태그를 포함한다. 일부 양태에서, R11은 4개 이상의 불소 원자로 임의적으로 치환된 C1-C12 알킬이다. 일부 양태에서, X는 CF3, CF2H, CFH2, Br, Cl, F, SO3H, NO2, CN 또는 카보닐이다. 일부 양태에서, X는 Br, Cl, F, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00041
상기 식에서,
R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C1-C24 치환된 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 치환된 알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, C2-C24 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고;
R7은 H 또는 CH3이고;
Z는 각각 독립적으로 CRaRb, O, S 또는 NRa이되, Ra 및 Rb은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이되, R11 및 R12는 함께 고리를 형성하지 않고;
Z'은 각각 독립적으로 O 및 S로부터 선택되고;
X는 Br, Cl, F, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이고;
X1은 비닐, 아세틸렌, 페닐 또는 임의의 치환된 등가물이고;
n은 0, 1 또는 2이다. 일부 양태에서, X는 CF3, CF2H, CFH2, Br, Cl, F, SO3H, NO2, CN 또는 카보닐이다. 일부 양태에서, R11 및 R12는 친화성 태그를 포함하거나 친화성 태그이다. 바람직하게는, n은 0이다.
적합한 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 중 하나의 구조를 갖는 오르토에스터 연결자를 포함한다.
Figure pct00042
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식의 구조를 갖는 불소 오르토에스터이다:
Figure pct00043
상기 식에서,
Z는 CH2, O, S, NRa 또는 NRaCO이되, Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R7은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 페닐 또는 벤질이고;
X는 H, F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸 또는 시아노이고;
m은 0 내지 12의 정수이고;
n은 1 또는 2이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00044
상기 식에서,
R7은 H, C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로고리이고;
X는 전자 구인성 기이고;
m 및 n 각각은 독립적으로 1, 2, 3 또는 4이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 II의 오르토에스터 연결자를 제공한다:
[화학식 II]
Figure pct00045
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 각각은 독립적으로 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일 C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 치환된 C1-C24 알킬, 치환된 C2-C24 알켄일, 치환된 C2-C24 알킨일, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고;
Y는 이탈기이고;
n은 0, 1 또는 2이되,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함한다. 바람직하게는, R7은 H이다.
일부 양태에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 CF3-(CF2)q-(CR12R13)p-Z-(CR14R15)m이되, 여기서 Z는 O, S, SO2, NH, NHCO, CONH 또는 CR16R17이고; (CR12R13), (CR14R15) 및 (CR16R17) 각각은 독립적으로 C1-C3 알킬렌, 할로치환된 C1-C3 알킬렌, C2-C3 알켄일렌, 할로치환된 C2-C3 알켄일렌, C2-C3 알킨일렌, 할로치환된 C2-C3 알킨일렌, CH2-CH2-O- 또는 CH2-CH2-NH-이고; m은 1 또는 2이고; p는 0, 1 또는 2이고; q는 0 내지 7의 정수이다.
일부 양태에서, 이탈기 Y는 O-Y'이고 화학식 HO-Y'의 알코올로부터 유도된다. 일부 양태에서, Y'은 C1-C8 알킬이다. 일부 양태에서, Y'은 치환된 C1-C8 알킬, 바람직하게는 할로치환된 알코올이다. 일부 양태에서, Y'은 비닐, 아세틸렌, 페닐 또는 임의의 치환된 등가물이되, 여기서 치환기는 전자 구인성 기(EWG)이다. 일부 양태에서, Y'은 메틸, 에틸 또는 임의의 치환된 등가물이되, 여기서 치환기는 할로, 시아노 또는 니트로이다. 일부 양태에서, 화학식 HO-Y'의 알코올은 약 8 내지 약 15, 바람직하게는 약 9 내지 13의 pKa를 갖는다.
일부 양태에서, 화학식 HO-Y'의 알코올은 메탄올, 에탄올, 2,2,2-트라이플루오로에탄올, 2,2,2-트라이클로로에탄올, 2,2-다이플루오로에탄올, 2,2-다이클로로에탄올, 2-메톡시에탄올, 하이드록시아세트알데히드, 2-프로펜-1-올, 2-실릴에탄올, 1-하이드록시-2-프로핀, 2-클로로에탄올, 2-플루오로에탄올, 3-부텐일 알코올, 3-부틴-1-올, 2-부틴-1-올, 2,3-부타다이엔-1-올, 1-클로로-2-프로판올, 1-플루오로-2-프로판올, 2-시아노에탄올, 2-(메틸티오)에탄-1-올, 2-부텐-1-올, 2-클로로-1-프로판올, 2-에톡시에탄올, 2-클로로-1-프로판올, 1-하이드록시-2-프로판온, 2,2-다이플루오로-에탄올, 3-플루오로-1-프로판올, 2-메틸-3-부틴-1-올, 2,2-다이클로로-에탄올, 4-펜텐-2-올, 3-클로로-1-프로판올, 4-펜틴-2-올, 2-플루오로-1-프로판올, 2-메틸렌-1-부탄올, 2-메틸-3-부텐-1-올, 1-클로로-1-프로판올, 1-사이클로프로펜-1-메탄올, 2-플루오로-1-프로판올, 2-사이클로프로펜-1-메탄올, 3-메틸-3-부텐-1-올, 1,4-펜타다이엔-3-올, 1-펜텐-4-인-3-올, 3,4-펜타다이엔-2-올, 2-메틸-2,3-부타다이엔-1-올, 3-펜틴-2-올, 2-메틸-2-부텐-1-올, 4-메틸-1-펜텐-3-올, 4-펜틴-1-올, 3,4-펜타다이엔-1-올, 2-펜틴-1-올, 3-메틸-2-메틸렌-1-부탄올, 3-하이드록시-2-메틸-프로판알, 3-메틸-2-부텐-2-올, 3-하이드록시-부탄알, 2-사이클로프로펜-1-올, 3-하이드록시-부탄알, 1-메톡시-2-프로판올, 2-(1-메틸에톡시)-에탄올, 4-메톡시- 1-부탄올, 2-(2-메톡시에톡시)-에탄올, α-메틸-사이클로프로판메탄올, 3-메틸-4-펜텐-2-올, 3-메톡시-1-프로판올, 2-메틸-1-펜텐-3-올, 1-에톡시-에탄올, 3-펜틴-1-올, 3-펜틴-1-올, 2-펜텐-1-올, 4-하이드록시-부탄알, 4-하이드록시-부탄알, 2-하이드록시-부탄알, 2-펜텐-3-올, 2,3-다이메틸-3-부텐-1-올, 3-하이드록시-2-메틸-프로판니트릴, 3-메틸렌-2-펜탄올, 2-에틸-3-부텐-1-올, 3,4-다이메틸-2-펜탄올, 2-클로로-2-프로판올, 1-(메틸다이옥시)-에탄올, 2-에틸-3-부틴-1-올, 벤젠메탄올 , 2-(에틸티오)- 에탄올, 3-에톡시-1-프로판올, 1-클로로-3-플루오로-2-프로판올, 1,3-다이플루오로-2-프로판올, 2-3-하이드록시-부탄온, 2-메틸-1-헥산올, 2-(에텐일옥시)-에탄올, 2,2-다이메틸-3-부텐-1-올, 4-메틸- 4-펜텐-2-올, 2-프로폭시-에탄올, 3-하이드록시-부탄니트릴, 2-플루오로-2-프로펜-1-올, 2,4-다이메틸-1-펜탄올, 1-메톡시-1-프로판올, 2,3-다이메틸-2-부텐-1-올, 3-클로로-2-프로펜-1-올, 3-펜텐-1-올, 2,4-펜타다이인-1-올, 2,2-다이메틸-3-부틴-1-올, 2-에틸-2,3-부타다이엔-1-올, 3-클로로-2-프로핀-1-올, 1,1-다이플루오로-2-프로판올, 1,5-헥사다이인-3-올, 2,3-헥사다이엔-1-올, 2-펜텐-2-올, 1-메톡시-1,2-에탄다이올, 2-메틸렌-3-부틴-1-올, 2-(클로로메톡시)-에탄올, α-메틸-1-사이클로프로펜-1-메탄올, 2-하이드록시-부탄티알, 1-클로로-2-메틸-1-프로판올, 3-(메틸티오)-1-프로판올, 1-헥신-3-올, 3-클로로-2-부탄올, 1,5-헥사다이엔-3-올, 5-헥신-1-올, 1-클로로-2-부탄올, 1-메틸-사이클로프로판메탄올, 4-펜텐-2-인-1-올, 5-하이드록시-펜탄알, 4-메틸-3-펜텐-2-올, 1-헥센-3-올, 1-하이드록시-2-부탄온, 3,4-헥사다이엔-1-올, 3-클로로-2-메틸-1-프로판올, 2-메톡시-1-부탄올, 2-에톡시-1-프로판올, 5-헥신-3-올, 3-메톡시-2-부탄올, 2-메틸-1,4-펜타다이엔-3-올, 2-메틸-1-펜텐-4-인-3-올, 4,5-헥사다이엔-3-올, 2-(메틸티오)-1-프로판올, 2,5-헥사다이인-1-올, 2-(하이드록시메틸)-부탄알, 3-플루오로-2-부탄올, 2-(하이드록시메틸)-2-프로펜알, 2-에텐일-3-부텐-1-올, 1-(에틸티오)-에탄올, 2-사이클로부텐-1-메탄올, 2-하이드록시-3-부텐알, 2-(1-메틸에틸)-3-부텐-1-올, 1-사이클로프로펜-1-에탄올, 1-플루오로-2-부탄올, 3-플루오로-2-메틸-1-프로판올, 1-(1-메틸에톡시)-에탄올, 3-하이드록시-1-부텐-1-온, 3-헥신-2-올, 4-에톡시-1-부탄올, 4-플루오로-1-부탄올, 5-헥센-2-올, 2-헥신-1-올, 4-클로로-1-부탄올, 3-헥신-1-올, 1-에톡시-2-프로판올, 4-클로로-2-부탄올, 4-메틸-2,3-펜타다이엔-1-올, 2,4-펜타다이엔-1-올, 3-프로폭시-1-프로판올, 2-메틸렌-1-펜탄올, 2,4-펜타다이엔-1-올, 2-펜텐-4-인-1-올, 2-메틸-4-펜텐-1-올, 1-(메틸티오)-2-프로판올, 4-메틸-2-펜틴-1-올, 3-하이드록시-2,2-다이메틸-프로판니트릴, 4-(메틸티오)-1-부탄올, 2-클로로-1-부탄올, 4,4-다이메틸-1-펜틴-3-올, 4,5-헥사다이엔-1-올, 3-메틸-4-펜텐-1-올, 3-메틸렌-1-펜탄올, 2,4-헥사다이인-1-올, 2-(2-하이드록시에톡시)-아세트알데히드, 4,5-헥사다이엔-2-올, 3-메틸-2-메틸렌-3-부텐-1-올, 2-메틸-3,4-펜타다이엔-1-올, 2-사이클로프로필리딘-에탄올, 4-하이드록시-3-메틸-부탄알, 4-3-메틸렌-펜텐-2-올, 2,3-헵타다이엔-1-올, 2,5-헵타다이인-1-올, 3-메틸-4-펜틴-1-올, 2-메틸-4-펜틴-1-올, 1-사이클로부텐-1-메탄올, 2-플루오로-1-부탄올, 3,4-헵타다이엔-1-올, 4-플루오로-2-부탄올, 2-(1-메틸에틸)-2,3-부타다이엔-1-올, 4-메틸-3-메틸렌-2-펜탄올, 3-하이드록시-2-메틸-부탄니트릴, 1-1-메톡시-2-메틸-프로판올, 3-에틸-3,4-펜타다이엔-2-올, 1-메틸-2-사이클로프로펜-1-메탄올, 3-헥센-1-올, 2-클로로-2-메틸-1-프로판올, 4-하이드록시-부탄니트릴, 2-티이란메탄올, 3-클로로-1-부탄올, 2-헥센-1-올, 3-메톡시-1-부탄올, 5-헥센-2-인-1-올, 2-(에텐일티오)-에탄올, 2-플루오로-2-메틸-1-프로판올, 4-메틸-2-펜텐-1-올, 3-헵틴-1-올, 3-(에틸티오)-1-프로판올, 2-[(1-메틸에틸)티오]-에탄올, 4-메톡시-2-부탄올, 4-헥신-2-올, 1-메톡시-2-부탄올, 3,3-다이플루오로-1-프로판올, 3-플루오로-1-부탄올, 2-클로로-1-메톡시-에탄올, 2,3,5-헥사트라이엔-1-올, 2-(하이드록시메틸)-부탄니트릴, 2,4,6-헵타트라이인-1-올, 1-플루오로-3-메틸-2-부탄올, 2-사이클로부텐-1-올, 2-부톡시-에탄올, 2-클로로-2,2-다이플루오로-에탄올, 2-옥시란메탄올, 1-클로로-3-부텐-2-올, 1-프로폭시-2-프로판올, 3-헵텐-1-올, 2-프로폭시-1-프로판올, 2-(프로필티오)-에탄올 또는 3-사이클로펜텐-1-메탄올이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3, R4, R5 또는 R6이 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 C1-C24 알킬인, 화학식 II의 화합물이다. 일부 양태에서, 헤테로원자는 산소이다. 일부 양태에서, 헤테로원자는 N이다. 일부 양태에서, 헤테로원자는 상이한 헤테로원자의 조합이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R7이 H인, 화학식 II의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3과 R4 중 하나, R6 및 R7이 H이고, R3 및 R4 중 다른 하나가 C1-C24 알킬 또는 C1-C24 헤테로알킬인, 화학식 II의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2, R3 및 R7이 수소이고, R4가 C1-C24 알킬 또는 C1-C24 헤테로알킬인, 화학식 II의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 n이 0인, 화학식 II의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 R1, R2 및 R3이 H이고 R4가 C1-C24 알킬 또는 C1-C24 헤테로알킬이고 n이 0 또는 1인, 화학식 II의 화합물이다.
일부 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 III의 오르토에스터 연결자를 제공한다:
[화학식 III]
Figure pct00046
상기 식에서,
X1 및 X2 각각은 독립적으로 H 또는 전자 구인성 기이고;
m은 1 또는 2이고;
n은 4 내지 12의 정수이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 X1 또는 X2가 H, CH3 또는 CF3인, 화학식 III의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 X1 및 X2가 H, CH3 또는 CF3인, 화학식 III의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 X1 및 X2가 CF3인, 화학식 III의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 m이 1인, 화학식 III의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 n이 6 내지 12의 정수인, 화학식 III의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 n이 8 내지 12의 정수인, 화학식 III의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식 IIIa의 화합물이다:
[화학식 IIIa]
Figure pct00047
상기 식에서,
X1은 H, F, 보호된 아미노 기, 보호된 카복시 기, C2 알켄일 기 또는 C2 치환된 알켄일 기, C2 알킨일 기 또는 C2 치환된 알킨일 기이고;
R18 및 R19는 각각 독립적으로 H, F, C1-3 헤테로알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이고;
X2는 H, CH3 또는 CF3이고;
n은 1 또는 2이고;
m은 0 내지 12의 정수이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 X1이 H, F, 아지도, 보호된 설프하이드릴, 보호된 폴리-설프하이드릴, 폴리-히스티딘, 보호된 아미노 기, 보호된 하이드라지드 기, 보호된 옥시아민 기, 사이클로옥틴, 공액 다이엔, C2 알켄일 기, C2 치환된 알켄일 기, C2 알킨일 기 또는 C2 치환된 알킨일 기이고; R18 및 R19가 각각 독립적으로 H, F, C1-3 헤테로알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이고; X2가 H, CH3, F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로겐치환된 메틸 또는 시아노이고; n이 1 또는 2이고; m이 0 내지 12의 정수인, 화학식 IIIa의 화합물이다.
일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 하기 화학식의 화합물이다.
Figure pct00048
본 발명의 오르토에스터 연결자는 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 양태에서, 오르토에스터 연결자는 산의 존재하에 1,2-다이올, 1,3-다이올 또는 1,4-다이올과 알코올을 반응시킴으로써 형성된다. 일부 양태에서, 산은 화학량론적 양으로 사용된다. 일부 양태에서, 산은 브뢴스테스 산이다. 일부 양태에서, 산은 루이스 산이다. 특정 양태에서, 산은 희석 무기산(예를 들어 약 0.2 M 이하의 농도)이다. 일부 양태에서, 알코올은 약 30 내지 약 120℃의 비점을 갖는다. 이에 따라, 일부 양태에서, 알코올은 약 30 내지 약 120℃, 약 30 내지 약 110℃, 약 30 내지 약 100℃, 약 30 내지 약 95℃, 약 30 내지 약 90℃, 약 30 내지 약 85℃, 약 30 내지 약 80℃, 약 30 내지 약 75℃, 약 30 내지 약 70℃, 약 30 내지 약 65℃, 약 30 내지 약 60℃, 약 30 내지 약 55℃, 약 30 내지 약 50℃, 약 35 내지 약 120℃, 약 40 내지 약 120℃, 약 45 내지 약 120℃, 약 50 내지 약 120℃, 약 55 내지 약 120℃, 약 60 내지 약 120℃, 약 40 내지 약 100℃, 약 50 내지 약 100℃, 약 40 내지 약 90℃ 또는 약 40 내지 약 80℃의 비점을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IV의 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(즉 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체)를 제공한다:
[화학식 IV]
Figure pct00049
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 각각은 독립적으로 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일 C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 치환된 C1-C24 알킬, 치환된 C2-C24 알켄일, 치환된 C2-C24 알킨일, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고;
n은 0, 1 또는 2이되,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함한다. 바람직하게는, R7은 H이다.
n이 2일 때, 오르토에스터 연결자 하기 구조로 제시되는 7-구성원 고리의 고리 오르토에스터를 형성하고, 2개의 추가의 R 기 R'5 및 R'6(각각 독립적으로 R1 내지 R6 기 중 임의의 것과 마찬가지로 정의됨)을 갖는다.
Figure pct00050
화학식 IV의 잔기에서, 파선에 연결된 산소는 올리고뉴클레오티드 5'-말단 또는 3'-말단의 산소이다.
화학식 IV의 잔기에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴, 또는 이의 임의의 치호나된 등가물 또는 조합이고, 나머지 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, C6-C12 아릴알킬, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 임의의 치환된 등가물 또는 조합일 수 있되, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고; n은 0, 1 또는 2이되, 상기 잔기는
Figure pct00051
가 아니다.
이러한 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체의 일부에서, n은 0이고, 친화성 태그는 3 이상의 cLogP를 갖는 불소 태그 또는 소수성 태그이다.
이러한 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 올리고리보핵산(RNA)을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체에서, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 하나 이상은 불소치환된 알킬, 불소치환된 알켄일, 불소치환된 알킨일, 불소치환된 아릴, 불소치환된 헤테로알킬, 불소치환된 헤테로알켄일, 불소치환된 불소치환된 헤테로알킨일 또는 불소치환된 헤테로사이클릴일 수 있다.
올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체에서, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 하나 이상은 불소 태그이고 R7을 비롯한 나머지 R 기는 H일 수 있다.
올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체에서, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 2개 이상은 불소 태그일 수 있다.
올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체에서, 화학식 IV의 화합물의 잔기는 하기 화학식의 잔기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00052
상기 식에서,
R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, C1-C23 알킬, C1-C23 헤테로알킬, C1-C23 치환된 알킬, C2-C23 알켄일, C2-C23 헤테로알켄일, C2-C23 치환된 알켄일, C2-C23 알킨일, C2-C23 헤테로알킨일, C2-C23 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이되, R11 및 R12 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고; R7은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 페닐 또는 벤질이고; Z는 각각 독립적으로 CRaRb, O, S 또는 NRa이되, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, Ra 및 R11 또는 Ra 및 R12는 함께 N을 갖는 헤테로고리를 형성하고; n은 0, 1 또는 2이다.
화학식 IV의 잔기는 하기 화학식의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00053
상기 식에서,
X1은 H, F, 아지도, 보호된 설프하이드릴, 보호된 폴리-설프하이드릴, 폴리-히스티딘, 보호된 아미노 기, 보호된 하이드라지드 기, 보호된 옥시아민 기, 말레이미드, 사이클로옥틴, 공액 다이엔, C2 알켄일 기, C2 치환된 알켄일 기, C2 알킨일 기 또는 C2 치환된 알킨일 기이고;
R18 및 R19는 각각 독립적으로 H, F, C1-3 헤테로알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이고;
n은 1 또는 2이고;
m은 0 내지 12의 정수이다.
화학식 IV의 잔기는 하기 화학식의 잔기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00054
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 5'-위치에서 오르토에스터 연결자에 부착된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 3'-위치에서 오르토에스터 연결자에 부착된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 리보핵산(RNA)이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA)이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 25개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 50개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 75개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 100개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 125개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 150개 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 R1, R2, R3 또는 R4가 헤테로원자를 포함하는 C1-C24 알킬을 포함한다. 일부 양태에서, 헤테로원자는 산소이다.
일부 양태에서, n은 0이다.
일부 양태에서, R5는 H이다.
일부 양태에서, R6은 H이다.
일부 양태에서, R1, R2 및 R3은 수소이고, R4는 C6-C24 아릴알킬 또는 치환된 등가물이다.
일부 양태에서, R1, R2 및 R3은 H이고, R4는 C1-C24 알킬 또는 치환된 알킬이다.
일부 양태에서, R1, R2 및 R3은 H이고, R4는 하나 이상의 헤테로원자를 임의적으로 포함하는 C1-C24 알킬이고, n은 0 또는 1이다.
일부 양태에서, R1은 C4-C24 알킬, 또는 헤테로알킬이고, 9개 이상의 불소 원자를 포함한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식의 잔기를 포함한다:
Figure pct00055
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 각각은 독립적으로 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일 C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 치환된 C1-C24 알킬, 치환된 C2-C24 알켄일, 치환된 C2-C24 알킨일, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고;
X는 H, F, 하이드록시, 보호된 하이드록시, 알콕시 또는 알콕시알킬이고;
n은 0, 1 또는 2이고;
B는 뉴클레오시드 염기이되,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식의 잔기를 포함한다:
Figure pct00056
상기 식에서,
R은 H, C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로고리이고;
X는 H, F, 하이드록시, 보호된 하이드록시, 알콕시 또는 알콕시알킬이고;
m 및 n 각각은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
B는 뉴클레오시드 염기이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식의 잔기를 포함한다:
Figure pct00057
상기 식에서,
R은 H, C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로고리; X는 H, F, 하이드록시, 보호된 하이드록시, 알콕시 또는 알콕시알킬이고;
X는 H, F, 하이드록시, 보호된 하이드록시, 알콜시 또는 알콕시알킬이고;
B는 뉴클레오시드 염기이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IV의 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(즉 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체)의 합성 방법을 제공한다.
[화학식 IV]
Figure pct00058
.
상기 방법은 올리고뉴클레오티드를 오르토에스터 연결자와 접촉시켜 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 각각이 독립적으로 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일 C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 치환된 C1-C24 알킬, 치환된 C2-C24 알켄일, 치환된 C2-C24 알킨일, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고; n이 0, 1 또는 2이되, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상이 친화성 태그를 포함하는, 화학식 IV의 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 산의 존재하에 오르토에스터 연결자와 반응한다. 일부 양태에서, 반응은 산-촉매된 교환 반응이다. 일부 양태에서, 산은 브뢴스테드 산이다. 일부 양태에서, 산은 루이스 산이다. 일부 양태에서, 산은 무기산, 예컨대 염산, 황산 또는 질산이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 0.2 M 이하의 산 농도의 무기산의 존재하에 오르토에스터와 반응한다. 일부 양태에서, 산은 유기산, 예컨대 아세트산 또는 이의 유도체, 예컨대 다이- 또는 트라이-클로로아세트산, 포름산, 벤조산, 톨루엔설폰산 또는 트라이플산(triflic acid)이다. 일부 양태에서, 산은 나트륨 아세테이트(pH = 5.5), BF3ㆍEt2O, SiO2, 몬모릴로나이트-K10, 몬모릴로나이트-KSF 또는 앰버리스트(Amberlyst) 15이다.
일부 양태에서, 하기 예시되는 반응식 1에 제시되는 바와 같이, 오르토에스터 연결자는 산 촉매된 반응을 통해 커플링된 후, 최종 뉴클레오티드 신톤(synthon)에서 탈블록 단계에 의해 분리된 하이드록시 기와 반응한다.
[반응식 1]
Figure pct00059
일부 양태에서, 하기 예시되는 반응식 2에 제시되는 바와 같이, 오르토에스터 연결자는 단량체 신톤의 블록 기(blocking 기) 중 하나에 존재하고, 상기 고유한 단량체 신톤은 최종 커플링 단계에서 사용된다.
[반응식 2]
Figure pct00060
특정 양태에서, 하기 예시되는 바와 같이, 친화성 태그는 오르토에스터 연결자가 올리고뉴클레오티드에 부착된 후, 상기 오르토에스터 연결자에 부착된다. 하기 R 기로 제시되는 친화성 태그는 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단 전에 올리고뉴클레오티드에 부착되거나 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단 후에 오르토에스터 연결자에 부착될 수 있다. R 기는 임의의 친화성 태그일 수 있다. 일부 양태에서, R 기는 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일 및 플루오로치환된 아릴 치환기로부터 선택된다. 일부 양태에서, R 기는 올레핀 복분해(metathesis), 고리첨가 반응(예를 들어 딜스-알더 반응, 4+1 고리첨가, 3+2 고리첨가, 노르보르넨(norbornene) 고리첨가, 옥사노르보르나다이엔 고리첨가), 클릭 화학(click chemistry)(예컨대 테트라졸 광클릭(photoclick) 화학, 구리-촉매된 클릭 화학, 변형-촉진된(strain-promoted) 클릭 화학), 스즈키(Suzuki) 교차-커플링, 슈타우딩거(Staudinger) 리게이션, 마이클 첨가, 쿼드리시클란 리게이션, 테트라진 리게이션 또는 산화적 커플링을 사용하여 오르토에스터 연결자에 부착될 수 있다. 주지된 다른 접합 안(scheme)이 친화성 태그를 오르토에스터 연결자 잔기에 연결하는데 사용될 수 있다. 이러한 접합의 비한정적인 예는 아민 종결된 잔기와 N-하이드로숙신아미드(NHS) 잔기 또는 기타 활성화된 에스터를 반응시키는 것, 및 티올 종결된 잔기를 잔기를 함유하는 알파-할로카보닐과 반응시키는 것 등을 포함한다.
특정 양태에서, 오르토에스터 연결자는 보호기와의 반응이 차단된 화학 잔기(예컨대 티올, 아민 또는 알콜 등)를 함유한다. 오르토에스터 연결자의 부착 후, 보호기는 제거될 수 있고, 화학 잔기는 고체-상에서 또 다른 화학 잔기와 공유결합적으로 및 특이적으로 반응할 수 있다.
[반응식 3]
Figure pct00061
올리고뉴클레오티드는 임의의 적합한 방법을 사용하여 탈보호되어 오르토에스터 보호기가 제거될 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 산을 사용하여 탈보호된다. 일부 양태에서, 산은 촉매량(아화학량론적 양)으로 존재한다. 일부 양태에서, 산은 브뢴스테드 산이다. 일부 양태에서, 산은 루이스 산이다. 일부 양태에서, 산은 무기산, 예컨대 염산, 황산 또는 질산이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 0.2 M 이하의 산 농도의 무기산의 존재하에 오르토에스터와 반응한다. 일부 양태에서, 산은 유기산, 예컨대 아세트산, 포름산, 벤조산, 톨루엔설폰산 및 트라이플산이다. 일부 양태에서, 산은 BF3ㆍEt2O, SiO2, 몬모릴로나이트-K10, 몬모릴로나이트-KSF 또는 앰버리스트 15이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 온화한 산 조건하에 탈보호된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 약 3 이상의 pH에서 탈보호된다. 이에 따라, 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 약 3 이상, 약 3.5 이상, 약 4 이상, 약 4.5 이상, 약 5 이상, 약 5.5 이상, 약 6 이상, 약 6.5 이상, 약 7 이상의 pH에서 탈보호된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 3 내지 약 7의 pH에서 탈보호된다. 이에 따라, 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 3 내지 약 7, 약 3.5 내지 약 7, 약 4 내지 약 7, 약 5 내지 약 7, 약 5.5 내지 약 7, 약 6 내지 약 7, 약 3 내지 약 6.5, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5 또는 약 4 내지 약 6의 pH에서 탈보호된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 생성물은 오르토에스터의 제거 후, 약 60% 이상의 순도를 갖는다. 이에 따라, 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 생성물은 오르토에스터의 제거 후, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 약 99.95% 이상 또는 약 99.99% 이상의 순도를 갖는다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 생성물은 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.05% 이하 또는 약 0.01% 이하의 양으로 하나 이상의 불순물을 포함한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 임의의 적합한 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 불소 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 액체 크로마토그래피(예컨대 고압 액체 크로마토그래피)를 사용하여 정제된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 불소 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제된다. 불소 친화성 크로마토그래피는 불소 화합물이 다른 불소 화합물에 친화성을 갖는 경향이 있는 친불소성의 개념을 이용한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 불소 태그를 포함하는 오르토에스터에 부착된다. 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 불소 컬럼을 통과한다. 일반적으로, 불소 컬럼은 불화 유기 기가 결합되는 중합체 수지를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 상기 컬럼에 강하게 결합하는 한편, 비-표지된 불순물(예컨대 절두된 서열 또는 실패 서열)은 상기 컬럼과 상호작용하지 않고 상기 컬럼을 통과한다. 후속 세척은 불소 컬럼과의 친불화성의 세기에 기인하여 상기 컬럼으로부터 불화 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 방출하지 않는다. 모든 불순물이 상기 컬럼으로부터 제거된 후, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 오르토에스터 보호기로부터 올리고뉴클레오티드의 절단을 통해 상기 컬럼으로부터 방출된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 온화한 산성 조건하에 절단되고, 이는 올리고뉴클레오티드와 불소 컬럼사이의 상호작용을 파괴한다. 이어서, 올리고뉴클레오티드는 적절한 용매를 사용하여 상기 컬럼으로부터 용리되어 정제된 올리고뉴클레오티드가 수득된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 HPLC를 사용하여 정제된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 오르토에스터 연결자에 부착되고 정제를 위한 HPLC 시스템에 도입된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 하나 이상의 불순물을 포함하는 혼합물로서 HPLC에 도입된다. 일부 양태에서, 본 발명의 방법은 유사한 크기의 불순물로부터 올리고뉴클레오티드의 분리를 가능하게 한다. 하나 이상의 불순물은 임의의 유형일 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 불순물은 올리고뉴클레오티드 합성 동안 생성된 절두된 서열 또는 실패 서열이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자는 역상 HPLC를 사용하여 정제된다. 이러한 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 역상 컬럼(예컨대 C5 또는 C18 탄화수소 컬럼)에서 정제된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 정상 HPLC 컬럼에서 정제된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 HPLC 시스템으로부터 채집되고 탈보호되어 목적 올리고뉴클레오티드가 수득된다. HPLC 시스템은 주입기, 펌프, HPLC 컬럼 및 검축기를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 검출기는 흡광 검출기(예컨대 자외선/가시광선 또는 PDA), 굴절률 검출기, 산란 검출기(예컨대 증발식 또는 다각도), 질량 스펙트럼계, 전도성 검출기, 형광 검출기, 화학발광 검출기, 광학 회전 검출기 또는 전자화학 검출기이다. 일부 양태에서, HPLC 시스템은 3중의 4중극자 LC-MS, 오르비트랩(Orbitrap) LC-MS, 이온 트랩(Ion Trap) LC-MS 또는 TOF LC-MS이다. 일부 양태에서, 정제 방법은 부분 또는 전적으로 자동화된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체의 친화성 잔기에 결합하는 화합물을 포함하는 카트리지를 사용하여 정제된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 멀티플렉스 합성 플랫폼(multiplex synthesis platform)에서 합성되고, 올리고뉴클레오티드의 단리는 멀티플렉스 정제 플랫폼과 병렬로 수행된다.
일부 양태에서, 멀티플렉스 합성 또는 정제 플랫폼은 4, 12, 48, 96, 192, 또는 384개의 올리고뉴클레오티드 합성과 병렬로 정제가 수행되게 한다.
본 발명의 일부 화합물은 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 이에 따라 라세미체 및 라세미 화합물, 단일 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 혼합물 및 개별 부분입체 이성질체로서 나타날 수 있다. 추가의 비대칭 중심이 분자의 다양한 치환기의 성질에 따라 존재할 수 있다. 각각의 이러한 비대칭 중심은 독립적으로 2개의 광학 이성질체를 생성할 것이고, 이는 혼합물 중 가능한 광학 이성질체 및 부분입체 이성질체 및 순수 또는 부분 정제된 화합물 모두를 본 발명의 범주에 포함시키고자 함이다. 본 발명은 상기 화합물의 모든 이러한 이성질체 형태를 포괄하고자 한다.
도 1은 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오티드의 전형적인 화학적 합성의 개략도를 도시한 것이다. 전형적인 목적 올리고뉴클레오티드 생성물은 인접한 뉴클레오티드의 5'-하이드록시와 3'-하이드록시 사이의 뉴클레오티드간 결합을 함유한다. 상기 합성을 성취하기 위해, 일반적으로, 상기 합성 사이클의 제1 단계는 보호된 단량체와 표면에 부착된 뉴클레오시드의 반응, 또는 보호된 단량체화 표면 상의 하이드록시 기의 반응이다. 표면 상의 하이드록시 기는 절단가능한 보편적인 연결자의 일부 또는 절단불가능한 표면 부착물일 수 있다. 반응성 인 기와 표면 상의 하이드록시와의 초기 커플링 후, 이어지는 단계는 전형적으로, 미반응 하이드록시 기의 캐핑에 이은 반응성 인 중간체의 산화를 포함한다. 특정 개질된 인 기가 사용되는 특정한 경우, 특히 산화 시약이 변형된 인 기, 예컨대 포스포로티오에이트, 보라노포스포네이트 또는 포스포라미데이트를 생성하는 경우, 캐핑에 선행하여 산화가 필요할 수 있다. 통상적으로, 최종 단계는 후속의 보호된 뉴클레오티드 단량체에 커플링하게 되는 하이드록시 기의 탈블록(deblocking)이다. 일반적으로, 상기 최종 단계에서 제거되는 보호기는 다이메톡시트라이틸 기(DMT)이다. 그러나, 다수의 다른 보호기가 당업계에 주지되어 있는데, 이의 예는 9-페닐잔틸 기(Pixyl) 및 벤즈하이드릴옥시-비스(트라이메틸실릴옥시)실릴(BZH)이다. 쇄 조립의 완료시, 목적 생성물은 고체-상으로부터 방출되고 탈보호되고 추가의 생물학적 정용례에 이용된다.
도 2는 고체 지지체에서의 화학 합성에서 수득된 미정제 올리고뉴클레오티드 혼합물의 다이오드 어레이 검출기(DAD) 스펙트럼을 도시한 것이다. 상기 혼합물은 전장 표적 올리고뉴클레오티드 및 다수의 실패 절두된 올리고뉴클레오티드(합성의 부산물임)를 포함한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 전장 표적 올리고뉴클레오티드가 가장 큰 피크이다.
도 3은 절두된 서열 또는 실패 서열의 5'-하이드록시가 아세틸 보호기로 캐핑되는 한편, 전장 올리고뉴클레오티드가 이의 5'-말단에 다이메톡시트라이틸(DMT) 보호기를 보유하여 전장 올리고뉴클레오티드의 5'-위치에서 DMT 기의 특이적 제거 및 오르토에스터 연결자의 영역-특이적 첨가를 가능하게 하는 올리고뉴클레오티드의 전형적인 화학 합성의 개략도를 도시한 것이다.
도 4는 5'-3' 및 5'-2' 연결된 RNA 생성물을 생성하는 RNA의 뉴클레오티드간 결합의 산 절단 및 뉴클레오티드간 결합의 이성질체화의 개략도를 도시한 것이다.
도 5는 비고리 오르토에스터 연결자에 의한 올리고뉴클레오티드의 보호를 도시한 것이다. 위쪽 칸에서, 친화성 태그는 오르토에스터 연결자의 중심 탄소에 연결된 R 기에 위치한다. 올리고뉴클레오티드를 상기 오르토에스터 연결자와 반응시킴으로써 하나의 친화성 태그를 갖는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체가 수득된다. 아래쪽 칸에서, 친화성 태그는 오르토에스터 연결자의 3개의 R 기 모두에 위치한다. 상기 반응은 2개의 친화성 태그를 갖는 오르토에스터 연결자 접합된 올리고뉴클레오티드를 생성한다.
도 6에서, 위쪽 칸은 고리 오르토에스터에 의한 올리고뉴클레오티드의 보호의 개략도를 도시한 것이다. 아래쪽 칸은 오르토에스터 보호기의 산-촉진된 절단의 개략도를 도시한 것이다.
도 7은 불소 친화성 태그를 포함하는 오르토에스터 연결자를 사용한 올리고뉴클레오티드의 정제 작업 흐름의 개략도를 도시한 것이다. 상기 작업 흐름은 단계 a에서 먼저 올리고뉴클레오티드가 플루오로치환된 오르토에스터 연결자에 접합되는 4-단계 과정을 나타낸다. 단계 b에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 연결자 접합체의 올리고뉴클레오티드 부분은 탈보호되고 고체 지지체로부터 절단된다. 단계 c에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체는 불소 친화성 태그를 사용하여 HPLC 또는 고체 상 추출에 의해 정제된다. 단계 d에서, 플루오로치환된 오르토에스터 연결자가 올리고뉴클레오티드로부터 절단되어 목적하는 정제된 올리고뉴클레오티드 생성물이 수득된다.
도 8은 친화성 태그를 사용함으로써 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체의 정제를 위해 오르토에스터 보호기 및 크로마토그래피 분리를 사용하는 정제 계획도를 도시한 것이다.
본원의 판독시, 본원에 기재되고 설명된 개별 양태 각각이 본 발명의 범주 또는 교시로부터 벗어남 없이 용이하게 임의의 몇몇 다른 양태들의 특징으로부터 분리되거나 합쳐질 수 있는 구별된 성분 및 특징을 가짐이 통상의 기술자에게 명확할 것이다. 임의의 설명된 방법은 설명된 사건 순서 또는 논리적으로 가능한 다른 임의의 순서로 수행될 수 있다.
실시예
실시예 1: 2 - 메톡시 -4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8- 트라이데카플루오로옥틸 )옥시)메틸)-1,3-다이옥솔란의 합성
3-[(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸)옥시]-1,2-프로판다이올(1 당량, 비오씨 사이언시스(BOC Sciences))을 트라이플르우로톨루엔(알드리치(Aldrich) 중에 2 M의 농도로 용해시켰다. 환저 플라스크에서, 트라이메틸 오르토포르메이트(3 당량, 알드리치)를 무수 사이클로헥산(알드리치) 중에 3.5 M의 농도로 용해시켰다. 촉매량의 앰버리스트 15(H 형태, 알드리치)를 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 3-[(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸)옥시]-1,2-프로판다이올의 트라이플루오로톨루엔 용액을 교반하면서 첨가하고, 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드(Dean-Stark distillation head)를 장착하였다. 상기 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 3시간 후, 반응을 완결하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사를 감압하에 분별 증류에 의해 정제하여(10 mmHg에서 130 내지 135℃의 비점), 표제 화합물을 94% 단리 수율로 수득하였다.
[반응식 4]
Figure pct00062
실시예 2: 4 -(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸)옥시)메틸)-2-(2,2,2-트라이플루오로에톡시)-1,3-다이옥솔란의 합성
트리스(2,2,2-트라이플루오로에틸)오르토포르메이트(50 g, 161 mmol, 신퀘스트 래버러토리스(SynQuest Laboratories)) 및 3-[(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸)옥시]-1,2-프로판다이올(25 g, 57 mmol, 와코 케미칼스(Wako Chemicals))을 환저 플라스크에서 무수 사이클로헥산(알드리치)(800 mL) 중에 용해시켰다. 용액이 투명해질 때까지, 트라이플루오로톨루엔(알드리치)을 5 mL 분할로 30 mL 첨가하였다. 촉매량의 p-톨루엔설폰산(알드리치)을 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 상기 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 트라이플루오로에탄올을 65℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 3시간 후, 반응을 완결하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 반응 혼합물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사를 감압하에 분별 증류에 의해 정제하여(0.05 mmHg에서 95 내지 100℃의 비점), 표제 화합물을 74% 단리 수율로 수득하였다.
[반응식 5]
Figure pct00063
실시예 3: 2 -메톡시-4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이 데카플루오로 옥틸)-1,3-다이옥솔란의 합성
5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-트라이데카플루오로데칸-1,2-다이올(25 g, 61 mmol, 1 당량, 상하이 켐히어 컴퍼니 리미티드(Shanghai Chemhere Co., Ltd.))을 사이클로헥산/트라이플루오로톨루엔(알드리치)의 90/10(부피/부피) 혼합물(300 mL) 중에 2 M의 농도로 용해시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(9 g, 85 mmol, 1.4 당량, 알드리치)를 촉매량의 앰버리스트 15(H 형태, 알드리치)와 함께 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 상기 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 4시간 후, 메탄올 공비물의 추가의 증류가 없음에 의해 반응이 완결된 것으로 간주하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사를 감압하에 분별 증류에 의해 정제하여(10 mmHg에서 120 내지 130℃의 비점), 표제 화합물을 64% 단리 수율로 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 451.1 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 6]
Figure pct00064
실시예 4: 4 -(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이 데카플루오로옥틸 )-2-(2,2,2-트라이플루오로에톡시)-1,3-다이옥솔란의 합성
트리스(2,2,2-트라이플루오로에틸)오르토포르메이트(1.4 당량, 48 mmol, 15 g, 신퀘스트 래버러토리스) 및 5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-트라이데카플루오로데칸-1,2-다이올(14 g, 34 mmol, 1 당량, 상하이 켐히어 컴퍼니 리미티드)을 환저 플라스크에서 무수 사이클로헥산(알드리치)(240 mL) 중에 용해시켰다. 생성된 용액은 약간 탁했고, 트라이플루오로톨루엔(알드리치)을 상기 용액이 투명해질 때까지 5 mL 적가하였다. 촉매량의 p-톨루엔설폰산(알드리치)를 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 트라이플루오로에탄올을 65℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 1시간 후, 반응을 완결하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 반응 혼합물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사 혼합물을 감압하에 분별 증류에 의해 정제하여(0.05 mmHg에서 85 내지 104℃의 비점), 44% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 519.1, 520.1 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 7]
Figure pct00065
실시예 5: 2 - 메톡시 -4-(3,3,4,4,5,5,6,6,6- 노나플루오로헥실 )-1,3- 다이옥솔란의 합성
5,5,6,6,7,7,8,8,8-노나플루오로옥탄-1,2-다이올(1 당량, 65 mmol, 20 g, 폴리오르그 인코포레이티드(Polyorg Inc.)(미국 메사추세츠주 레오미니스터))을 사이클로헥산(알드리치)(300 mL) 중에 용해시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(27.5 g, 260 mmol, 4 당량, 알드리치)를 촉매량의 앰버리스트 15(H 형태, 알드치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사 혼합물을 감압하에 분별 증류에 의해 정제하여(10 mmHg에서 89 내지 105℃의 비점), 32% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 351.1 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 8]
Figure pct00066
실시예 6: 4 -(3,3,4,4,5,5,6,6,6- 노나플루오로헥실 )-2-(2,2,2- 트라이플루오로에톡시 )-1,3-다이옥솔란의 합성
5,5,6,6,7,7,8,8,8-노나플루오로옥탄-1,2-다이올(20 g, 65 mmol, 1 당량, 폴리오르그 인코포레이티드(미국 메사추세츠주 레오미니스터))을 사이클로헥산(알드리치)(200 mL) 중에 용해시켰다. 트리스(2,2,2-트라이플루오로ethy)오르토포르메이트(60 g, 195 mmol, 3.0 당량, 신퀘스트 래버러토리스)를 촉매량의 앰버리스트 15(H 형태, 알드리치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 트라이플루오로에탄올을 65℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사 혼합물을 감압하에 분별 증류에 의해 정제하여(0.1 mmHg에서 99 내지 116℃의 비점), 20% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 419.1 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 9]
Figure pct00067
실시예 7: 4 -(2,2,3,3,4,4,5,5,5- 노나플루오로펜틸 )-2-(2,2,2- 트라이플루오로에톡시 )-1,3-다이옥솔란의 합성
1H, 1H, 2H, 3H, 3H-퍼플루오로헵탄-1,2-다이올(25 g, 85 mmol, 1 당량, 신퀘스트 래버러토리스 인코포레이티드, 미국 플로리다주 알라추아)을 사이클로헥산(알드리치)(250 mL) 중에 용해시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(18 g, 170 mmol, 2.0 당량, 알드리치)를 촉매량의 앰버리스트 15(H 형태, 알드리치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 65℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 4시간 후, 트라이플루오로에탄올 공비물의 추가의 증류가 없음에 의해 반응이 완결된 것으로 간주하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사 혼합물을 감압하에 분별 증류에 의해 정제하여(10 mmHg에서 105 내지 110℃의 비점), 39% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 405.0 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 10]
Figure pct00068
실시예 8: 4 ,5-비스(((3,3,4,4,5,5,5-헵타 플루오로펜틸 )옥시)메틸)-2-메톡시-1,3-다이옥솔란의 합성
(5-하이드록시메틸-2,2-다이메틸-[1,3]다이옥솔란-4-일)-메탄올(10 g, 62 mmol, 콤비-블록스 인코포레이티드(Combi-Blocks, Inc.)(미국 캘리포니아주 샌디에고(San Diego, CA))을 무수 테트라하이드로퓨란(200 mL) 중에 용해시켰다. 나트륨 하이드라이드(10 g, 알드리치, 95%)를 상기 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 가열하여 환류시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3-헵타플루오로-5-iodo펜탄e(42.7 g, 124 mmol, 오크우드 케미칼(Oakwood Chemical)(미국 사우스캐롤라이나주 에스틸))을 상기 플라스크에 첨가하고 2시간 동안 가열하여 환류시켰다. 반응 생성물을 실온으로 냉각하고, 과량의 염기를 암모늄 클로라이드의 첨가에 의해 중화시키고, 용매를 회전식 증발기에서 감압하에 증발시켰다. 미정제 혼합물을 다이클로로메탄 중에 용해시키고 나트륨 바이카보네이트에 의해 추출한 후, 물 및 염수로 세척하였다. 다이클로로메탄 용액을 나트륨 설페이트로 건조시키고, 생성물을 에틸 아세테이트 및 헥산을 사용하는 실리카겔에서 출발 물질로부터 정제하였다. 생성물 분획을 자체 중량을 잰(tared) 플라스크에서 증발시켜 황색 점성 오일(20.6 g, 약 60% 수율)을 수득하였다. 상기 오일을 메탄올(200 mL) 중에 용해시키고, 얼음/물 수조에서 0℃로 냉각하였다. 농축 H2SO4를 최종 농도가 9%가 될 때까지 교반하면서 적가하고, 반응 생성물을 2시간 동안 교반하였다. 반응 생성물을 실온으로 가온하고, 트라이메틸아민을 첨가함으로써 pH 종이를 지시자로서 사용하여 산을 중화시켰다. 메탄올을 증발 건조시키고, 생성물을 에틸 아세테이트 및 헥산을 사용한 실리카겔로 정제하여 정제된 1,4-비스((3,3,4,4,5,5,5-헵타플루오로펜틸)옥시)-부탄-2,3-다이올(13.6 g)을 수득하였다.
1,4-비스((3,3,4,4,5,5,5-헵타플루오로펜틸)옥시)부탄-2,3-다이올(26.5 mmol, 13.6 g)을 사이클로헥산(알드리치)(150 mL) 중에 용해시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(5.6 g, 53 mmol, 알드리치)를 상기 플라스크에 촉매량의 앰버리스트(H 형태, 알드리치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 4시간 후, 메탄올 공비물의 추가의 증류가 없음에 의해 반응이 완결된 것으로 간주하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사 혼합물을 감압하에 분별 증류에 의해 정제하여(10 mmHg에서 185 내지 190℃의 비점), 61% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 557.2 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 11]
Figure pct00069
실시예 9: 2 -메톡시-4,5-비스(2,2,3,3,4,4,5,5,5- 노나플루오로펜틸 )-1,3-다이옥솔란의 합성
1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 4, 4, 9, 9, 10, 10, 11, 11, 12, 12, 12- Octa데카플루오로-6,7-도데칸다이올을 문헌[Laurent, P. et al (Journal of Fluorine Chemistry, 62(2-3), 161-71; 1993)]에 기재된 방법에 의해 제조하였다. 다이올(12 g, 22.8 mmol)을 사이클로헥산(알드리치)(120 mL) 중에 용해시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(4.8 g, 45.6 mmol, 2.0 당량, 알드리치)를 앰버리스트 15(H 형태, 알드리치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 4시간 후, 메탄올 공비물의 추가의 증류가 없음에 의해 반응이 완결된 것으로 간주하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사 혼합물을 감압하에 분별 증류에 의해 정제하여(10 mmHg에서 162 내지 173℃의 비점), 52% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 569.1 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 12]
Figure pct00070
실시예 10: 4 ,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11- 헵타데카플루오로 -N-((2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4-일)메틸)운데칸아미드의 합성
N-(2,3-다이하이드록시프로필)-4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-헵타데카플루오로운데칸아미드를 3-아미노프로판-1,2-다이올(알드리치)과 헵타데카플루오로운데칸산의 니트로페닐 에스터(신퀘스트 래버러토리스 인코포레이티드, 미국 플로리다주 알라추아)의 반응에 의해 제조하였다.
헵타데카플루오로운데칸산(10.0 g, 20.3 mmol), p-니트로페놀(2.8 g, 20.3 mmol), N,N'-4.2 g, 20.3 mmol) 및 N,N-다이메틸피리딘-4-아민(250 mg)을 무수 다이옥산(350 mL) 중에 용해시켰다. 반응 생성물을 밤새 실온에서 교반한 후, 증발시켜 오일을 형성하였다. 생성물을 헥산:에틸 아세테이트의 구배(9:1로 출발)에 의해 용리하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 4-니트로페닐 4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-헵타데카플루오로-운데카노에이트를 90% 이상의 수율로 단리하였다.
[반응식 13]
Figure pct00071
4-니트로페닐 4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-헵타데카플루오로운데카노에이트(10 g, 16.3 mmol), 3-아미노프로판-1,2-다이올(1.4 g, 16.3 mmol) 및 트라이에틸아민(1.7 g, 16.3 mmol)을 다이클로로메탄(200 mL)와 N,N-다이메틸-포름아미드(80 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 반응 생성물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 메틸렌 클로라이드를 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 생성물을 87% 수율로 생성하였다.
[반응식 14]
Figure pct00072
N-(2,3-다이하이드록시프로필)-4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-헵타데카플루오로-운데칸아미드(8.6 g, 15.2 mmol)을 사이클로헥산(알드리치) 중에 용해시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(3.2 g, 30.4 mmol, 2.0 당량, 알드리치)를 앰버리스트 15(H 형태, 알드리치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 4시간 후, 메탄올 공비물의 추가의 증류가 없음에 의해 반응이 완결된 것으로 간주하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사 혼합물을 다이클로로메탄 및 트라이에틸아민을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 60% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 608.0 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 15]
Figure pct00073
실시예 11: 4 ,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9- 트라이데카플루오로 -N-((2- 메톡시 -1,3-다이옥솔란-4-일)메틸)노난아미드의 합성
N-(2,3-다이하이드록시프로필)-4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-트라이데카플루오로노난아미드를 3-아미노프로판-1,2-다이올(알드리치)와 3-(퍼플루오로헥실)프로피온산의 니트로페닐 에스터(신퀘스트 래버러토리스 인코포레이티드, 미국 플로리다주 알라추아)의 반응에 의해 실시예 10에 기재된 바와 같이 제조하였다.
N-(2,3-다이하이드록시프로필)-4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-트라이데카플루오로노난아미드(10.0 g, 21.5 mmol)를 사이클로헥산(알드리치)(120 mL) 중에 용해시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(4.6 g, 43.0 mmol, 2.0 당량, 알드리치)를 촉매량의 앰버리스트 15(H 형태, 알드리치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 4시간 후, 메탄올 공비물의 추가의 증류가 없음에 의해 반응이 완결된 것으로 간주하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 및 트라이에틸아민을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 71% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 508.1 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 16]
Figure pct00074
실시예 12: 4 ,4,5,5,6,6,6-헵타 플루오로 -N-((2-메톡시-1,3-다이 옥솔란 -4-일)메틸)헥산아미드의 합성
N-(2,3-다이하이드록시프로필)-4,4,5,5,6,6,6-헵타플루오로헥산아미드를 3-아미노프로판-1,2-다이올(알드리치)와 2H, 2H, 3H, 3H-퍼플루오로헥산산의 니트로페닐 에스터(신퀘스트 래버러토리스 인코포레이티드, 미국 플로리다주 알라추아)의 반응에 의해 실시예 10에 기재된 바와 같이 제조하였다.
N-(2,3-다이하이드록시프로필)-4,4,5,5,6,6,6-헵타플루오로헥산아미드(10.0 g, 31.7 mmol)를 사이클로헥산(알드리치)(160 mL) 중에 용해시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(6.7 g, 63.4 mmol, 2.0 당량, 알드리치)를 촉매량의 앰버리스트 15(H 형태, 알드리치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 4시간 후, 메탄올 공비물의 추가의 증류가 없음에 의해 반응이 완결된 것으로 간주하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사 혼합물을 다이클로로메탄 및 트라이에틸아민을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 55% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 358.1 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 17]
Figure pct00075
실시예 13: N-((2-메톡시-1,3-다이 옥솔란 -4- 일 )메틸)-3-(퍼플루오로페닐)프로펜아미드의 합성
N-(2,3-다이하이드록시프로필)-3-(퍼플루오로페닐)프로판아미드를 3-아미노프로판-1,2-다이올(알드리치)과 3-(펜타플루오로페닐)프로피온산의 니트로페닐 에스터(신퀘스트 래버러토리스 인코포레이티드, 미국 플로리다주 알라추아)의 반응에 의해 실시예 10에 기재된 바와 같이 제조하였다.
N-(2,3-다이하이드록시프로필)-3-(퍼플루오로페닐)프로판아미드(10.0 g, 32.0 mmol)을 사이클로헥산(알드리치)(160 mL) 중에 용해시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(6.8 g, 64.0 mmol, 2.0 당량, 알드리치)를 촉매량의 앰버리스트(H 형태, 알드리치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 4시간 후, 메탄올 공비물의 추가의 증류가 없음에 의해 반응이 완결된 것으로 간주하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 및 트라이에틸아민을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 78% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 355.1 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 18]
Figure pct00076
실시예 14: N,N '- ((2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4,5-다이일)비스(메틸렌))비스(3-(퍼플루오로페닐) 프로판아미드)의 합성
N,N'-(2,3-다이하이드록시부탄-1,4-다이일)비스(3-(퍼플루오로페닐)프로판아미드)를 1,4-다이아미노부탄-2,3-다이올(켐스페이스(Chemspace), 라트비아 리가)과 3-(펜타플루오로페닐)프로피온산의 니트로페닐 에스터(신퀘스트 래버러토리스 인코포레이티드, 미국 플로리다주 알라추아)의 반응에 의해 제조하였다.
[반응식 19]
Figure pct00077
4-니트로페닐 3-(퍼플루오로페닐)프로파노에이트(20 g, 55.4 mmol), 1,4-다이아미노부탄-2,3-다이올(3.3 g, 27.7 mmol) 및 트라이에틸아민(5.6 g, 55.4 mmol)을 다이클로로메탄(250 mL)과 N,N-다이메틸-포름아미드(100 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 반응 생성물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 메틸렌 클로라이드에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 생성물을 82% 단리 수율로 수득하였다.
[반응식 20]
Figure pct00078
N,N'-(2,3-다이하이드록시부탄-1,4-다이일)비스(3-(퍼플루오로페닐)프로판아미드)(10.0 g, 17.7 mmol)를 사이클로헥산(알드리치)(100 mL) 중에 용해시켜, 탁한 용액을 생성하고, 이를 트라이플루오로톨루엔(알드리치)의 적가에 의해 투명화시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(3.8 g, 35.4 mmol, 2.0 당량, 알드리치)를 촉매량의 앰버리스트(H 형태, 알드리치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 4시간 후, 메탄올 공비물의 추가의 증류가 없음에 의해 반응이 완결된 것으로 간주하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사 혼합물을 다이클로로메탄 및 트라이에틸아민을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 41% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 607.2 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 21]
Figure pct00079
실시예 15: N,N '-( (2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4,5-다이일)비스 (메틸렌))- 비스 (4,4,5,5,6,6,7,7,7-노나플루오로-헵탄아미드)의 합성
N,N'-(2,3-다이하이드록시부탄-1,4-다이일)비스(4,4,5,5,6,6,7,7,7-노나플루오로헵탄아미드)를 1,4-다이아미노부탄-2,3-다이올(켐스페이스, 라트비아 리가)와 4,4,5,5,6,6,7,7,7-노나플루오로헵탄산의 니트로페닐 에스터의 반응에 의해, 실시예 14에 기재된 반응 조건을 사용하여 제조하였다.
N,N'-(2,3-다이하이드록시부탄-1,4-다이일)비스(4,4,5,5,6,6,7,7,7-노나플루오로헵탄아미드)(10.0 g, 15.0 mmol)를 사이클로헥산(알드리치)(100 mL) 중에 용해시켰다. 용액을 트라이플루오로톨루엔(알드리치)의 적가에 의해 투명화시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(3.2 g, 30.0 mmol, 2.0 당량, 알드리치)를 촉매량의 앰버리스트(H 형태, 알드리치) 및 테플론 코팅된 자석 교반 막대와 함께 상기 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃ 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 4시간 후, 메탄올 공비물의 추가의 증류가 없음에 의해 반응이 완결된 것으로 간주하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각하였다. 앰버리스트 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 잔사 혼합물을 다이클로로메탄 및 트라이에틸아민을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 64% 단리 수율의 표제 화합물을 수득하였다. 생성물을 1H NMR에서의 특징적 피크 및 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+1, 711.1 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 22]
Figure pct00080
실시예 16: 4 -( 클로로메틸 )-2-메톡시-1,3-다이옥솔란 의 합성
4-(클로로메틸)-2-메톡시-1,3-다이옥솔란을 응우옌-바 엔.(Nguyen-Ba N.) 등에 의해 기재된 방법(1998년 8월 4일 출원된 US 5,789,394 A, 항바이러스 화합물)에 의해 94% 단리 수율로 제조하였다.
[반응식 23]
Figure pct00081
실시예 17: S-((2- 메톡시 -1,3- 다이옥솔란 -4-일) 메틸 ) 에탄티오에이트의 합성
S-(2,3-다이하이드록시프로필) 에탄티오에이트를 문헌[Polster J. et al (J. Agric. Food Chem., 63, 1419-1432; 2015)]에 기재된 방법에 의해 제조하였다. 테플론 코팅된 자석 교반 막대를 함유하는 환저 플라스크에서, 다이올(10.21 g, 68 mmol)을 사이클로헥산(알드리치) 중에 0.7 M의 농도로 용해시켰다. 트라이메틸 오르토포르메이트(1.5 당량, 알드리치) 및 촉매량의 p-톨루엔설폰산(5 mol%, 알드리치)을 상기 환저 플라스크에 첨가하고, 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃의 비점에서의 공비 증류에 의해 제거하였다. 2시간 후, 반응을 완결하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각한 후, 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 생성물을 헥산:에틸 아세테이트의 구배(9:1 헥산:에틸 아세테이트로부터 출발)로 용리하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(9:1 헥산:에틸 아세테이트 중 1% 트라이에틸아민으로 조건화됨)에 의해 정제하였다. 표제 화합물을 72% 수율로 단리하였다. 생성물을 1H 및 13C NMR에서의 특징적 피크 및 양의 모드 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석([M-OMe]+, 161.0 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 24]
Figure pct00082
실시예 18: 1 ,2-비스((2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4-일)메틸)다이설판의 합성
(2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4-일)메탄티올을 문헌[Polster J. et al (J. Agric. Food Chem., 63, 1419-1432; 2015)]에 기재된 방법에 의해 제조하였다. 테플론 코팅된 자석 교반 막대를 함유하는 환저 플라스크에서, 티올(3.00 g, 20 mmol)을 EtOAc 중에 0.33 M의 농도로 용해시켰다. 용액에 NaI(54 mg, 0.36 mmol, 알드리치) 및 30% H2O2(4.0 mL, 36 mmol, 알드리치)를 첨가하고, 혼합물을 23℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 생성물을 포화 수성 나트륨 티오설페이트(100 mL)의 첨가에 의해 ?칭(quenching)하였다. 혼합물을 3개의 150 mL 분할의 에틸 아세테이트(알드리치)에 의해 추출하였다. 합친 유기 추출물을 150 mL 분할의 포화 나트륨 클로라이드에 의해 세척하고 마그네슘 설페이트(알드리치)로 건조시키고 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 미정제 잔사를 헥산:에틸 아세테이트의 구배(9:1로부터 출발)로 용리하는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 표제 화합물을 78% 수율로 단리하였다. 생성물을 1H 및 13C NMR에서의 특징적 피크 및 양의 모드 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석([M-OMe]+, 267.0 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 25]
Figure pct00083
실시예 19: 2 - 메톡시 -4-(( 페닐다이설판일 ) 메틸 )-1,3- 다이옥솔란의 합성
3-(페닐다이설판일)프로판-1,2-다이올을 문헌[Hunter R. et al (Journal of Organic Chemistry, 71, 8268-8271; 2006)]에 기재된 방법에 의해 제조하였다. 테플론 코팅된 자석 교반 막대를 함유하는 환저 플라스크에서, 다이올(102 mg, 0.47 mmol)을 사이클로헥산(알드리치) 중에 0.1 M의 농도로 용해시켰다. 트라이메틸 오르토포르메이트(1.5 당량, 알드리치) 및 p-톨루엔설폰산(알드리치)을 상기 환저 플라스크에 첨가하고, 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃의 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 3시간 후, 반응을 완료하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각한 후, 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 생성물을 헥산:에틸 아세테이트의 구배(헥산으로부터 출발)로 용리하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 표제 화합물을 68% 수율로 단리하였다. 생성물을 1H 및 13C NMR에서의 특징적 피크 및 양의 모드 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석([M-OMe]+, 227.0 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 26]
Figure pct00084
실시예 20: 1 -((2- 메톡시 -1,3- 다이옥솔란 -4-일) 메틸 )-1H- 피롤의 합성
테플론 코팅된 자석 교반 막대를 함유하는 환저 플라스크에서, 3-(1H-피롤-1-일)프로판-1,2-다이올(5.0 g, 35.4 mmol, 아우룸 파마테크(Aurum Pharmatech))을 사이클로헥산(알드리치) 중에 0.2 M 농도로 용해시켰다. 트라이메틸오르토포르메이트(1.5 당량, 알드리치) 및 촉매량의 p-톨루엔설폰산(5 mol%, 알드리치)을 상기 환저 플라스크에 첨가하고, 상기 환저 플라스크에 첨가하고, 상기 플라스크에 딘-스타크 증류 헤드를 장착하였다. 반응 생성물을 서서히 가열하여 환류시키고, 메탄올을 45℃의 비점의 공비 증류에 의해 제거하였다. 3시간 후, 반응을 완료하고, 상기 플라스크를 실온으로 냉각한 후, 회전식 증발기에서 감압하에 농축하였다. 생성물을 헥산:에틸 아세테이트의 구배(헥산으로부터 출발)로 용리하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 표제 화합물을 66% 수율로 단리하였다. 생성물을 1H 및 13C NMR에서의 특징적 피크 및 양의 모드 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석([M+H], 183.1 m/z)에서의 분자 이온에 의해 검증하였다.
[반응식 27]
Figure pct00085
실시예 21: 1-((2R,4S,5R)-4-하이드록시-5-(((4-((((2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4-일)메틸)다이설판일)메틸)-1,3-다이옥솔란-2-일)옥시)메틸)테트라하이드로퓨란-2-일)-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-다이온의 합성
20 mg의 3'-dT-CPG(글렌 리서치(Glen Research))를 다이클로로메탄 중 3% 트라이클로로아세트산(글렌 리서치)(100 μL)으로 1분 동안 2회에 이어서 5 mL 아세토니트릴로 처리하고, 질소 류로 건조시켰다. 1,2-비스((2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4-일)메틸)다이설판 오르토에스터(45 μL), 아세토니트릴(45 μL, 알드리치), 및 다이클로로메탄 중 3% 트라이클로로아세트산(글렌 리서치)(10 μL)을 3'-dT-CPG에 첨가하였다. 혼합물을 60℃로 1시간 동안 가열하였다. 잔류 액체의 제거 후, CPG를 8 mL의 아세토니트릴로 세척한 후, 질소 류로 건조시켰다. 3'-dT-CPG-오르토에스터 접합체를 23℃에서 2시간 동안 농축 28% 암모늄 하이드록사이드(100 μL)로 처리하였다. 생성된 여과물을 사반트 스피드백(Savant speedvac)에서 감압하에 농축하고 500 μL의 물 중에 용해시키고 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석([M-OMe]+, 477.1 m/z)으로 분석하였다.
[반응식 28]
Figure pct00086
실시예 22: 1 ,2-비스((2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4-일)메틸)다이설판:dT 접합체, 설포링크 포획(Sulfolink capture) 및 방출
30 mg 3'-dT-CPG(글렌 리서치)를 다이클로로메탄 중 3% 트라이클로로아세트산(글렌 리서치)(100 μL)으로 1분 동안 2회에 이어서 5 mL의 아세토니트릴로 처리하고, 질소 류로 건조시켰다. 1,2-비스((2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4-일)메틸)다이설판 오르토에스터(45 μL), 아세토니트릴(45 μL, 알드리치), 및 다이클로로메탄 중 3% 트라이클로로아세트산(글렌 리서치)(10 μL)을 3'-dT-CPG에 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 잔류 액체의 제거 후, CPG를 8 mL의 아세토니트릴로 세척한 후, 질소 류로 건조시켰다. dT-CPG-오르토에스터 접합체를 암모늄 바이카보네이트(200 mM) 중에 제조된 50 mM TCEP 용액(200 μL, 알드리치)(pH 8.0)으로 1시간 동안 23℃에서 처리하였다. 접합체를 함유하는 환원된 티올을 탈보호시키고 농축 암모늄 하이드록사이드(100 μL, 알드리치)로 1시간 동안 23℃에서 처리함으로써 CPG로부터 방출시켰다. 여과물을 사반트 스피드백에서 1시간 동안 농축한 후, 잔사를 200 μL의 50mM 트리스.HCl, 5mM EDTA, pH 8.5 중에 용해시켰다. 용액을 300 μL 설포링크 수지(터모피셔(ThermoFisher))에 의해 12시간 동안 23℃에서 항온배양하였다. 상기 수지를 200 μL의 50mM 트리스.HCl, 5mM EDTA, pH 8.5에 이어서 8 mL의 아세토니트릴로 세척하였다. 100 μL의 20% v/v 수성 포름산에 의해 23℃에서 60분 동안 항온배양함으로써 생성물 3'-dT를 상기 수지로부터 방출시켰다. 생성된 여과물을 사반트 스피드백에서 농축하고 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+H, m/z 243.1)에 의해 분석하였다.
[반응식 29]
Figure pct00087
실시예 23: 1 -((2-메톡시-1,3-다이 옥솔란 -4- 일 )메틸)-1H-피롤 :PTAD:RNA 접합체
20체(20mer)의 RNA-CPG를 다이클로로메탄 중 3% 트라이클로로아세트산(글렌 리서치)(100 μL)로 2회 1분 동안에 이어서 5 mL의 아세토니트릴로 처리하고, 질소 류로 건조시켰다. 1-((2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4-일)메틸)-1H-피롤(45 μL) 및 다이클로로메탄 중 3% 트라이클로로아세트산(글렌 리서치)(5 μL)을 상기 20체 RNA CPG에 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 가열하였다. 잔류 액체의 제거 후, CPG를 8 mL의 아세토니트릴로 세척한 후, 질소 류로 건조시켰다. 건조된 CPG를 아세토니트릴 중 0.2 M 4-페닐-1,2,4-트라이아졸-3,5-다이온(PTAD)(알드리치)으로 30초 동안 처리하였다. PTAD 용액을 제거하고, CPG를 8 mL 건성 ACN으로 세척하고 질소 류 하에 건조시켰다. 20체 RNA-CPG-오르토에스터-PTAD 접합체를 순수 에틸렌다이아민으로 23℃에서 2시간 동안 처리한 후, 3 mL의 건성 아세토니트릴로 CPG를 세척하였다. 절단된 20체 RNA:오르토에스터:PTAD 접합체를 0.3 mL의 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충액(pH = 6.9)으로 용리시키고, 데콘볼루션된(deconvoluted) ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M = 6763.86 m/z)에 의해 분석하여, 하나의 피롤로 오르토에스터 및 2개의 PTAD 분자의 첨가를 보였다.
[반응식 30]
Figure pct00088
실시예 24: 1 ,3- 다이옥살란 및 1,4- 다이옥살산 오르토에스터 연결자의 고체 지지체 상 신생 합성된 올리고뉴클레오티드로의 부착을 위한 일반적 절차
[반응식 31]
Figure pct00089
신생 합성된 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 변형된 올리고뉴클레오티드 고체 지지체 상에서 합성하였다. 생성된 전장 생성물을 오르토에스터 연결자에 부착시키기 위해 탈블록 단계에서 최종 보호기를 제거함으로써 제조하였다. 상기 보호기는 문헌에 주지된 다양한 기, 가장 전형적으로는 DMP, Pixyl 또는 BZH일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어날 수 있거나(여기서 최종 보호기는 생성되는 올리고뉴클레오티드의 5'-하이드록시로부터 제거됨), 상기 합성은 5'에서 3' 방향으로 일어날 수 있다(여기서 최종 보호기는 생성되는 올리고뉴클레오티드의 3'-하이드록시로부터 제거됨). 이 시점에서, 인 보호기는 신생 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 임의적으로 제거될 수 있다. 친화성 태그(AT)에 부착된 1,3-다이옥살란 또는 1,4-다이옥살란 오르토에스터 연결자는 온화한 산을 트랜스-오르토에스터화 촉매로서 사용하여 최종 탈블록 단계에서 분리된 하이드록시 기와 반응한다. 이 시점에서, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 함유하는 생성되는 친화성 태그는 다양한 보호기, 예컨대 TC 또는 PivOM을 임의적으로 제거하는 다양한 염기성 아민으로 처리되고 고체 지지체 부착이 절단될 수 있다. 이어서, 분리된 올리고뉴클레오티드는 친화성 태그에 의해 보조되는 크로마토그래피 분리 또는 고체-상 추출을 사용하여 정제될 수 있다. 이어서, 오르토에스터 연결자는 온화한 산과 추가의 산 취약성 보호기, 예컨대 ACE를 사용하여 제거된 후, 정제된 올리고뉴클레오티드는 다양한 시약, 예컨대 플루오라이드 이온, 예컨대 TOM 또는 TBDMS에 의해 임의적으로 추가로 탈보호될 수 있다.
실시예 25: TC 포스포라미다이트를 사용하여 제조되는 21-뉴클레오티드 RNA에 대한 2-메톡시-4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸)옥시)메틸)-1,3-다이옥솔란의 부착
[반응식 32]
Figure pct00090
21-뉴클레오티드의 올리고리보뉴클레오티드를 세공 조절 유리(CPG, 프라임 신테시스(Prime Synthesis), 미국 펜실베니아주 아스톤)를 함유하는 데옥시-티미딘에서 TC 포스포라미다이트를 사용하고, ATKA 100 DNA/RNA 합성장치(제네럴 일렉트릭(General Electric)) 및 12 mL 컬럼을 사용하여 합성하여 목적 미정제 올리고뉴클레오티드(5'-GUGUCAGUACAGAUGAGGCCT-3', 서열번호 1)를 함유하는 CPG(6.5 g)을 수득하였다. 대략적으로, 30 mg의 CPG 양을 기준으로 1 μmol의 미정제 올리고뉴클레오티드를 고출력 DNA/RNA 합성 컬럼(바이오서치 테크놀로지스 인코포레이티드(Biosearch Technologies, Inc.), 미국 캘리포니아주 노바토)에 넣었다. 100 μL의 2-메톡시-4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸)-옥시)메틸)-1,3-다이옥솔란(오르토에스터)을 무수 아세토니트릴(80 μL) 및 무수 다이클로로메탄 중 다이클로로아세트산의 3 중량% 용액(글렌 리서치)(20 μL)과 혼합하였다. 오르토에스터 용액을 컬럼에 투입하고 60℃로 1시간 동안 가열하였다. 컬럼을 무수 아세토니트릴(1 mL)로 헹군 후, 200 μL의 순수 무수 에틸렌 다이아민을 상기 컬럼에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 에틸렌 다이아민을 아세토니트릴(1 mL)을 사용하여 상기 컬럼으로부터 헹군 후, RNA를 물 중 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충액(300 μL)(pH 7.0)을 사용하여 상기 컬럼으로부터 제거하였다. 오르토에스터 연결자의 전환 수율을 역상 C-18 컬럼 및 애질런트 테크놀로지스 1260 인피니티 LC(Agilent Technologies 1260 Infinity LC)(20분 동안 0% B에서 50% B의 구배를 사용함; A: 물 중 0.1 M 트라이에틸 암모늄 아세테이트, pH 7.0, B: 30/70 부피/부피의 물/아세토니트릴 중 0.1 M 트라이에틸 암모늄 아세테이트)를 사용한 HPLC 분석에 의해 측정하였다. 반응은 전장 생성물의 55%가 오르토에스터 연결자를 함유하는 생성물로 전환되었음을 나타냈다.
실시예 26: TC 포스포라미다이트를 사용하여 제조되는 100-뉴클레오티드 RNA에 대한 2- 메톡시 -4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8- 트라이데카플루오로옥틸 ) 옥시 )메틸)-1,3-다이옥솔란의 부착
[반응식 33]
Figure pct00091
100-뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드를 보호된 우리딘-2'-OTC를 함유하는 CPG(프라임 신테시스, 미국 펜실베니아주 아스톤)에서 TC 포스포라미다이트를 사용하고, ATKA 100 DNA/RNA 합성장치(제네럴 일렉트릭) 및 12 mL 컬럼을 사용하여 합성하여 목적 미정제 올리고뉴클레오티드(5'- CUU GCC CCA CAG GGC AGU AAG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U -3', 서열변호 2)를 함유하는 CPG 6.8 g을 수득하였다. 대략적으로, 40 mg의 CPG 양을 기준으로 1 μmol의 미정제 올리고뉴클레오티드를 고출력 DNA/RNA 합성 컬럼(바이오서치 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 노바토)에 넣었다. 100 μL의 2-메톡시-4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸)-옥시)메틸)-1,3-다이옥솔란(오르토에스터)을 무수 아세토니트릴(80 μL) 및 무수 다이클로로메탄 중 다이클로로아세트산의 3 중량% 용액(글렌 리서치)(20 μL)과 혼합하였다. 오르토에스터 용액을 컬럼에 투입하고 60℃로 1시간 동안 가열하였다. 컬럼을 무수 아세토니트릴(1 mL)로 헹군 후, 200 μL의 순수 무수 에틸렌 다이아민을 상기 컬럼에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 에틸렌 다이아민을 아세토니트릴(1 mL)을 사용하여 상기 컬럼으로부터 헹군 후, RNA를 물 중 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충액(300 μL)(pH 7.0)을 사용하여 상기 컬럼으로부터 제거하였다. 오르토에스터 연결자의 전환 수율을 역상 C-18 컬럼 및 애질런트 테크놀로지스 1260 인피니티 LC(20분 동안 0% B에서 50% B의 구배를 사용함; A: 물 중 0.1 M 트라이에틸 암모늄 아세테이트, pH 7.0, B: 30/70 부피/부피의 물/아세토니트릴 중 0.1 M 트라이에틸 암모늄 아세테이트)를 사용한 HPLC 분석에 의해 측정하였다. 반응은 전장 생성물의 25%가 오르토에스터 연결자를 함유하는 생성물로 전환되었음을 나타냈다.
실시예 27: TC 포스포라미다이트를 사용하여 제조되는 100-뉴클레오티드 RNA에 대한 4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8- 트라이데카플루오로옥틸 ) 옥시 ) 메틸 )-2-(2,2,2-트라이플루오로에톡시)-1,3-다이옥솔란의 부착
[반응식 34]
Figure pct00092
100-뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드를 보호된 우리딘-2'-OTC를 함유하는 CPG(프라임 신테시스, 미국 펜실베니아주 아스톤)에서 TC 포스포라미다이트를 사용하고, ATKA 100 DNA/RNA 합성장치(제네럴 일렉트릭) 및 12 mL 컬럼을 사용하여 합성하여 목적 미정제 올리고뉴클레오티드(5'- CUU GCC CCA CAG GGC AGU AAG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U -3', 서열변호 2)를 함유하는 CPG 6.8 g을 수득하였다. 대략적으로, 40 mg의 CPG 양을 기준으로 1 μmol의 미정제 올리고뉴클레오티드를 고출력 DNA/RNA 합성 컬럼(바이오서치 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 노바토)에 넣었다. 100 μL의 4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸)옥시)메틸)-2-(2,2,2-트라이플루오로에톡시)-1,3-다이옥솔란(오르토에스터)을 무수 아세토니트릴(80 μL) 및 무수 다이클로로메탄 중 다이클로로아세트산의 3 중량% 용액(글렌 리서치)(20 μL)과 혼합하였다. 오르토에스터 용액을 컬럼에 투입하고 60℃로 1시간 동안 가열하였다. 컬럼을 무수 아세토니트릴(1 mL)로 헹군 후, 200 μL의 순수 무수 에틸렌 다이아민을 상기 컬럼에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 에틸렌 다이아민을 아세토니트릴(1 mL)을 사용하여 상기 컬럼으로부터 헹군 후, RNA를 물 중 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충액(300 μL)(pH 7.0)을 사용하여 상기 컬럼으로부터 제거하였다. 오르토에스터 연결자의 전환 수율을 역상 C-18 컬럼 및 애질런트 테크놀로지스 1260 인피니티 LC(20분 동안 0% B에서 50% B의 구배를 사용함; A: 물 중 0.1 M 트라이에틸 암모늄 아세테이트, pH 7.0, B: 30/70 부피/부피의 물/아세토니트릴 중 0.1 M 트라이에틸 암모늄 아세테이트)를 사용한 HPLC 분석에 의해 측정하였다. 반응은 전장 생성물의 52%가 오르토에스터 연결자를 함유하는 생성물로 전환되었음을 나타냈다.
실시예 28: 불소 친화성 태그의 오르토에스터 연결자로의 2- 단계 부착
3'-RNA-CPG(30 mg)을 다이클로로메탄 중 3% 다이클로로아세트산(글렌 리서치)(100 μL)으로 1분 동안 2회에 이어서 8 mL 아세토니트릴로 처리하고, 질소 류로 건조시켰다. 1,2-비스((2-메톡시-1,3-다이옥솔란-4-일)메틸)다이설판 오르토에스터(45 μL), 아세토니트릴(45 μL, 알드리치), 및 다이클로로메탄 중 3% 트라이클로로아세트산(글렌 리서치)(10 μL)을 유리 5'-하이드록시 기를 갖는 3'-RNA-CPG에 첨가하고, 혼합물을 60℃로 1시간 동안 가열하였다. 잔류 액체의 제거 후, CPG를 8 mL의 아세토니트릴로 세척한 후, 질소 류로 건조시켰다. RNA-CPG:오르토에스터 접합체를 암모늄 바이카보네이트(200 mM) 중에 제조된 50 mM TCEP 용액(200 μL, 알드리치)(pH 8.0)으로 1시간 동안 23℃에서 처리하였다. 이어서, CPG 상의 RNA 접합체를 함유하는 환원된 티올을 아세토니트릴 중 10 mM 농도의 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸 요오다이드(알드리치) 용액으로 항온배양하였다. 이어서, 상기 접합체를 탈보호시키고, 5시간 동안 23℃에서 100 μL 순수 에틸렌다이아민으로 처리함으로써 CPG로부터 방출시킨 후, 8 mL의 아세토니트릴로 세척하였다. 불화 RNA 접합체를 0.3 mL의 0.1 암모늄 아세테이트 완충액(pH = 6.9)에 의해 CPG 수지로부터 용리시키고, 데콘볼루션된 ESI/TOF 질량 스펙트럼 분석(M+H, m/z 243.1)에 의해 분석하였다.
실시예 29: 불소 친화성 태그를 갖는 올리고뉴클레오티드의 카트리지 정제 또는 고체-상 추출 정제
100체 RNA-GPG(30 mg)을 다이클로로메탄 중 3% 트라이클로로아세트산(글렌 리서치)(100 μL)으로 1분 동안 2회에 이어서 8mL의 아세토니트릴(알드리치)로 처리하고 질소 류로 건조시켰다. 4-(((3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트라이데카플루오로옥틸)옥시)메틸)-2-(2,2,2-트라이플루오로에톡시)-1,3-다이옥솔란(80 μL), 아세토니트릴(80 μL), 및 다이클로로메탄 중 3% 다이클로로아세트산(글렌 리서치)(40 μL)을 100체 RNA-CPG에 첨가하고, 혼합물을 75℃에서 15분 동안 가열하였다. 잔류 액체의 제거 후, CPG를 8 mL의 아세토니트릴로 세척한 후, 질소 류로 건조시켰다. 이어서, CPG를 0.5 mL 순수 에틸렌다이아민(알드리치)으로 40℃에서 1시간 동안 처리하였다. 잔류 액체의 제거 후, CPG를 8 mL 아세토니트릴로 세척한 후, 질소 류로 건조시켰다. 불소 오르토에스터:RNA 접합체를 5% 부피/부피 다이메틸포름아미드를 함유하는 10% 중량/부피 클로라이드(알드리치)(1 mL)로부터 용리시켰다.
플루오로-팩 II(Fluoro-pak II) 카트리지(베리 & 어소시에이츠(Berry & Associates))를 1 mL 아세토니트릴에 이어 1 mL 0.1 M 트라이에틸암모늄 아세테이트, pH 7.0(글렌 리서치), 및 5% 부피/부피 다이메틸포름아미드를 함유하는 10% 중량/부피 클로라이드(알드리치)(1 mL)의 첨가에 의해 조건화하였다. 용리된 불소 오르토에스터:RNA 접합체를 주사기에 의해, 완충액이 수지의 상단에 도달할 때까지 1개 적하당 약 2초의 속도로 수지를 통해 밀어내는 공기 주사기를 사용하여 상기 카트리지의 상단으로 투입하였다. 수지를 100 mM 트라이에틸암모늄 아세테이트 중 10%(부피/부피) 아세토니트릴(pH 7.0)의 2 mL 분할로 2회에 이어 100 mM 트라이에틸암모늄 아세테이트 중 12.5%(부피/부피) 아세토니트릴(pH 7.0)의 2 mL 분할로 2회 세척하였다. 불소 오르토에스터:RNA 접합체를 0.1 M 트라이에틸암모늄 아세테이트 중 80%(부피/부피) MeOH(pH 5.5) 1 mL에 의해 수지로부터 용리시켰다. 용리된 분획을 사반트 스피드백에서 농축 건조시키고 212 μL의 0.1 트라이에틸암모늄 아세테이트(pH 5.5) 중에 용해시키고 23℃에서 항온배양하였다. 1시간 후, 38 μL 아세토니트릴을 반응 용액에 첨가하고 또 다른 조건화된 플루오로-팩 II 카트리지로 통과시키고, 100 mM 트라이에틸암모늄 아세테이트 중 12.5%(부피/부피) 아세토니트릴(pH 7.0) 1 mL를 첨가하였다. 2개의 분획을 합치고 사반트 스피드백에서 증발 건조시켜 0.7 mg의 친화성 정제된 100체 RNA를 생성하였다.
프릿(frit)을 포함하는 플레이트 및 벌크 불소 수지를 사용하여, 상기 절차를 6, 12, 24, 48, 96, 384 또는 1536개 웰로 확대된다. 진공 매니폴드(vacuum manifold)가 수지를 통해 채집될 용액 또는 폐기되어질 용액 모두를 견인하는데 사용될 수 있다. 상기 과정은 연구실용 로봇(애질런트 브라보 워크스테이션(Agilent Bravo Workstation))에서 자동화가능한 것으로 제시된 바 있다.
상기 개시내용에 의거하여, 상기 방법은 본 발명의 교시에 따라 실시될 수 있음이 주목된다. 추가로, 다양한 성분, 물질, 구조 및 매개변수는 임의의 한정적 의도가 아닌 단지 설명 및 예시로써 포함된다. 상기 개시내용에 의거하여, 본 발명의 교시는 다른 적용으로 실시될 수 있고 상기 적용을 수행하는 성분, 물질, 구조 및 장비는 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 결정될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Agilent Technologies, Inc. <120> ORTHOESTER COMPOSITIONS FOR AFFINITY PURIFICATION OF OLIGONUCLEOTIDES <130> 20170056-03 <140> PCT/US2018/000316 <141> 2018-08-17 <150> US 62/547,687 <151> 2017-08-18 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized in laboratory <400> 1 gugucaguac agaugaggcc t 21 <210> 2 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized in laboratory <400> 2 cuugccccac agggcaguaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims (43)

  1. 표적 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체 상에 합성하고 표적 올리고뉴클레오티드 및 절두된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
    상기 표적 올리고뉴클레오티드를 오르토에스터 연결자와 반응시킴으로써 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 형성하는 단계로서, 상기 오르토에스터 연결자가 접합시 친화성 태그(affinity tag)를 포함하거나 상기 친화성 태그를 접합 반응 후의 제2 반응에서 상기 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체와 반응시키는, 단계;
    상기 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체 및 절두된 올리고뉴클레오티드를 상기 고체 지지체로부터 절단하는 단계;
    상기 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체 및 절두된 올리고뉴클레오티드를 크로마토그래피 컬럼 또는 친화성 포획 지지체 위에 재하하고, 상기 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 상기 친화성 태그에 의해 상기 친화성 포획 지지체에 결합시키는 단계;
    상기 절두된 올리고뉴클레오티드를 상기 크로마토그래피 컬럼 또는 친화성 포획 지지체로부터 세척해 내는 단계; 및
    상기 오르토에스터 연결자를 상기 표적 올리고뉴클레오티드로부터 절단하고, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 상기 크로마토그래피 컬럼 또는 친화성 포획 지지체로부터 용리시킴으로써, 정제된 표적 올리고뉴클레오티드를 방출시키는 단계
    를 포함하는 표적 올리고뉴클레오티드의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    친화성 태그가 오르토에스터 연결자의 하나 이상의 기이거나, 연결자에 의해 오르토에스터 연결자에 연결되는, 정제 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제2 반응을 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체를 고체 지지체로부터 절단하기 전 또는 후에 수행하는, 정제 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    오르토에스터 연결자가 표적 올리고뉴클레오티드의 5'-하이드록시에 부착되는, 정제 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    오르토에스터 연결자가 표적 올리고뉴클레오티드의 3'-하이드록시에 부착되는, 정제 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    친화성 태그가 불소 태그, 소수성 태그, 비오틴 태그, 글루타티온 태그, 말토스 태그, 아릴보론산 태그, 폴리-히스티딘 펩티드 태그, 폴리-설프하이드릴 태그, 사이클로덱스트린 태그, 아다만탄 태그, 폴리아민 태그, 말레이미드 태그, 알킨 태그, 아지도 태그, 하이드라지드 태그, 아미노 태그, 다이올 태그, 티올 태그 및 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함하는, 정제 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 올리고뉴클레오티드가 올리고리보뉴클레오티드(RNA)를 포함하는, 정제 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    RNA가 티오노카바메이트(TC) 보호기, 비스(2-아세톡시에톡시)메틸(ACE) 보호기, t-부틸다이메틸실릴(TBDMS) 보호기, 트라이이소프로필실릴옥시메틸(TOM) 보호기, 피발로일옥시메틸(PivOM) 보호기 및 2-시아노에톡시메틸(CEM) 보호기로부터 선택되는 2'-하이드록시 보호기를 포함하는, 정제 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    RNA가 인 보호기, 핵염기 보호기 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 정제 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드를 오르토에스터 연결자와 반응시키기 전에 인 보호기를 탈보호시키는 정제 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    표적 올리고뉴클레오티드를 오르토에스터 연결자와 반응시킨 후에 핵염기 보호기 및 임의적으로 인 보호기를 탈보호시키는 정제 방법.
  12. 제7항에 있어서,
    고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체의 절단, 및 핵염기 보호기 및 임의적으로 인 보호기의 탈보호를 단일 반응으로 수행하는 정제 방법.
  13. 제7항에 있어서,
    RNA가 70개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 정제 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    오르토에스터 연결자가 하기 화학식 Ia의 화합물인, 정제 방법:
    [화학식 Ia]
    Figure pct00093

    상기 식에서,
    R, R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 C1-C24 알킬, 할로치환된 C2-C24 알켄일, 할로치환된 C2-C24 알킨일, 카보사이클릴, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로고리 또는 임의의 치환된 등가물이되, R은 수소일 수 있다.
  15. 제14항에 있어서,
    R이 H 또는 C1-C3 알킬이고;
    R', R'' 및 R'''이 각각 독립적으로 아릴 또는 치환된 아릴인, 정제 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    R이 H 또는 CH3이고;
    R', R'' 및 R'''이 페닐 또는 치환된 페닐인, 정제 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    오르토에스터 연결자가 화학식 Ia의 화합물이고, R', R'' 및 R''' 중 하나 이상이 소수성 태그, 부분 소수성 태그, 불소 태그 또는 부분 불소 태그인, 정제 방법.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    오르토에스터 연결자가 하기 화학식 Ib의 화합물인, 정제 방법:
    [화학식 Ib]
    Figure pct00094

    상기 식에서,
    AfTg는 친화성 태그이고;
    R, R' 및 R''은 각각 독립적으로 AfTg-L 또는 C1-C24 알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 알킨일, 할로치환된 C1-C24 알킬, 할로치환된 C2-C24 알켄일, 할로치환된 C2-C24 알킨일, 카보사이클릴, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로고리, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 조합이되, 탄소의 총 개수가 24개 이하이고;
    L은 공유 결합 또는 직쇄, 분지쇄, 단일고리 또는 다고리의 포화, 부분 불포화 또는 불포화 C1-C12 탄화수소 쇄이되, F, Cl, Br, I 또는 C1-C3 알킬로 임의적으로 치환되고, O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자가 임의적으로 산재하거나 S-S, NRa, NRa-CO, -CO-NRa- 및 NRa-CO-NRb로부터 독립적으로 선택되는 기가 임의적으로 산재하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    오르토에스터 연결자가 하기 화학식 I의 화합물인, 정제 방법:
    [화학식 I]
    Figure pct00095

    상기 식에서,
    R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 조합이되, 탄소 원자의 총 개수는 24개 이하이고, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고;
    R8 및 R9는 H이고;
    X는 H, 메틸 또는 전자 구인성 기이고;
    n은 0, 1 또는 2이다.
  20. 제19항에 있어서,
    R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상이 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일, 플루오로치환된 카보사이클릴, 플루오로치환된 헤테로알킬, 플루오로치환된 헤테로알켄일, 플루오로치환된 헤테로알킨일 또는 플루오로치환된 헤테로사이클릴인, 정제 방법.
  21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    친화성 태그가 3 이상의 cLogP 값을 갖는 불소 태그 또는 소수성 태그인, 정제 방법.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    오르토에스터 연결자가 하기 화학식 1의 화합물인, 정제 방법:
    [화학식 1]
    Figure pct00096
    .
  23. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    친화성 태그가 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일 또는 플루오로치환된 카보사이클릴인, 정제 방법.
  24. 하기 화학식 IV의 잔기를 5'-말단 또는 3'-말단에 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체:
    [화학식 IV]
    Figure pct00097

    상기 식에서,
    파선에 연결된 산소는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 또는 3'-말단의 산소이고;
    R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 조합이고, 나머지 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, C6-C12 아릴알킬, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 조합이되, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고;
    n은 0, 1 또는 2이되,
    상기 화학식 IV의 잔기는 하기 화학식 2의 잔기가 아니다:
    [화학식 2]
    Figure pct00098
    .
  25. 제24항에 있어서,
    n이 0이고, 친화성 태그가 3 이상의 cLogP 값을 갖는 불소 태그 또는 소수성 태그인, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체.
  26. 제24항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드가 올리고리보핵산(RNA)을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체.
  27. 제24항에 있어서,
    R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 하나 이상이 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일, 플루오로치환된 아릴, 플루오로치환된 헤테로알킬, 플루오로치환된 헤테로알켄일, 플루오로치환된 헤테로알킨일 또는 플루오로치환된 헤테로사이클릴인, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체.
  28. 제24항에 있어서,
    R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 하나 이상이 불소 태그이고, R7을 비롯한 나머지 R 기가 H인, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체.
  29. 제24항에 있어서,
    R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 하나 이상이 불소 태그인, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체.
  30. 제24항에 있어서,
    잔기가 하기 화학식의 기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체:
    Figure pct00099

    상기 식에서,
    R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, C1-C23 알킬, C1-C23 헤테로알킬, C1-C23 치환된 알킬, C2-C23 알켄일, C2-C23 헤테로알켄일, C2-C23 치환된 알켄일, C2-C23 알킨일, C2-C23 헤테로알킨일, C2-C23 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이되, R11 및 R12 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고;
    R7은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 페닐 또는 벤질이고;
    Z는 각각 독립적으로 CRaRb, O, S 또는 NRa이되, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, Ra 및 R11 또는 Ra 및 R12는 함께 N을 갖는 헤테로환을 형성하고;
    n은 0, 1 또는 2이다.
  31. 제24항에 있어서,
    잔기가 하기 화학식 3의 잔기인, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체:
    [화학식 3]
    Figure pct00100

    상기 식에서,
    X1은 H, F, 아지도, 보호된 설프하이드릴, 보호된 폴리-설프하이드릴, 폴리-히스티딘, 보호된 아미노 기, 보호된 하이드라지드 기, 보호된 옥시아민 기, 말레이미드, 사이클로옥틴, 공액 다이엔, C2 알켄일 기, C2 치환된 알켄일 기, C2 알킨일 기 또는 C2 치환된 알킨일 기이고;
    R18 및 R19는 각각 독립적으로 H, F, C1-3 헤테로알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이고;
    n은 1 또는 2이고;
    m은 0 내지 12의 정수이다.
  32. 제24항에 있어서,
    잔기가 하기 화학식의 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드-오르토에스터 연결자 접합체:
    Figure pct00101

    Figure pct00102
    .
  33. 하기 화학식 Id의 오르토에스터 연결자:
    [화학식 Id]
    Figure pct00103

    상기 식에서,
    R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴, 또는 이의 임의의 치환된 등가물 또는 임의의 조합이되, 탄소의 총 개수는 24개 이하이고, 나머지 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, 할로- 또는 헤테로-치환된 등가물, C3-C12 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴, 또는 치환된 등가물이되, R1 내지 R7 중 2개의 R 기는 고리 오르토에스터를 갖는
    Figure pct00104

    로 제시되는 융합된 고리를 형성하지 않고;
    X는 F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이고;
    n은 0 또는 1이되,
    R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함한다.
  34. 제33항에 있어서,
    친화성 태그가 3 이상의 cLogP 값을 갖는 불소 태그 또는 소수성 태그인, 오르토에스터 연결자.
  35. 제33항에 있어서,
    n이 0이고;
    R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 2개 이상이 각각 독립적으로 C1-C24 알킬, C1-C24 헤테로알킬, C2-C24 알켄일, C2-C24 헤테로알켄일, C2-C24 알킨일, C2-C24 헤테로알킨일, 할로겐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴 또는 임의의 치환된 등가물이고, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 나머지 모든 R 기는 H이되, H가 아닌 2개의 R 기가 함께 연결되어 고리 오르토에스터를 갖는 융합된 고리를 형성하지 않는, 오르토에스터 연결자.
  36. 제33항에 있어서,
    R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 중 하나가 플루오로치환된 알킬, 플루오로치환된 알켄일, 플루오로치환된 알킨일 또는 플루오로치환된 아릴인, 오르토에스터 연결자.
  37. 제33항에 있어서,
    하기 화학식 4의 구조를 갖는 오르토에스터 연결자:
    [화학식 4]
    Figure pct00105

    상기 식에서,
    R11은 H, C1-C23 알킬, C1-C23 헤테로알킬, C1-C23 치환된 알킬, C2-C23 알켄일, C2-C23 헤테로알켄일, C2-C23 치환된 알켄일, C2-C23 알킨일, C2-C23 헤테로알킨일, C2-C23 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이고;
    R7은 H 또는 CH3이고;
    Z는 CRaRb, O, S, NRa, NRaCO 또는 CONRa이되, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, Ra 및 R11은 함께 N을 갖는 헤테로환을 형성하고;
    X는 F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이고;
    n은 0 또는 1이고;
    R11은 친화성 태그를 포함한다.
  38. 제33항에 있어서,
    하기 화학식 5의 구조를 갖는 오르토에스터 연결자:
    [화학식 5]
    Figure pct00106

    상기 식에서,
    R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, C1-C23 알킬, C1-C23 헤테로알킬, C1-C23 치환된 알킬, C2-C23 알켄일, C2-C23 헤테로알켄일, C2-C23 치환된 알켄일, C2-C23 알킨일, C2-C23 헤테로알킨일, C2-C23 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이되, R11 및 R12 중 하나 이상은 친화성 태그를 포함하고;
    R7은 H 또는 CH3이고;
    Z는 각각 독립적으로 CRaRb, O, S, NRaCO, CONRa, NRa이되, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, Ra 및 R11 또는 Ra 및 R12는 함께 N을 갖는 헤테로환을 형성하고;
    X는 F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸이고;
    n은 0 또는 1이다.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서,
    n이 0이고, Z가 O인, 오르토에스터 연결자.
  40. 하기 화학식 6의 구조를 갖는 불소 오르토에스터 연결자:
    [화학식 6]
    Figure pct00107

    상기 식에서,
    Z는 CH2, O, S, NRa, 또는 NRaCO이되, Ra는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    R7은 H, 메틸, 에틸. n-프로필, 페닐 또는 벤질이고;
    X는 H, F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸 또는 시아노이고;
    m은 0 내지 12의 정수이고;
    n은 1 또는 2이다.
  41. 하기 화학식으로부터 선택되는 구조를 갖는 오르토에스터 연결자:
    Figure pct00108

    Figure pct00109
    .
  42. 하기 화학식 IIIa의 오르토에스터 연결자:
    [화학식 IIIa]
    Figure pct00110

    상기 식에서,
    X1은 H, F, 아지도, 보호된 설프하이드릴, 보호된 폴리-설프하이드릴, 폴리-히스티딘, 보호된 아미노 기, 보호된 하이드라지드 기, 보호된 옥시아민 기, 사이클로옥틴, 공액 다이엔, C2 알켄일 기, C2 치환된 알켄일 기, C2 알킨일 기 또는 C2 치환된 알킨일 기이고;
    R18 및 R19는 각각 독립적으로 H, F, C1-3 헤테로알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이고;
    X2는 H, CH3, F, Cl, Br, 또는 모노-, 비스- 또는 트리스-할로치환된 메틸 또는 시아노이고;
    n은 1 또는 2이고;
    m은 0 내지 12의 정수이다.
  43. 제42항에 있어서,
    하기 화학식 7의 오르토에스터 연결자:
    [화학식 7]
    Figure pct00111
    .
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