JP3754449B2 - 3’窒素含有ポリヌクレオチドの合成のための固体支持体試薬 - Google Patents
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Description
本発明は一般に官能化ポリヌクレオチドの合成に使用される固体支持体試薬に関するものであり、さらに特に、3’末端に位置する窒素原子を有するポリヌクレオチドの合成に関するものである。
非同位体ポリヌクレオチドプローブ、DNA/RNA増幅法、およびバイオ活性アンチセンスおよびトリプレックス合成試薬を連続して迅速に開発することにより、化学的に修飾されたポリヌクレオチドに対する需要を大いに増加した。ポリヌクレオチド修飾への一般的なアプローチのひとつはポリヌクレオチドの一端に第一脂肪族アミンを導入することであり、これによって親電子的部分を含有する置換体、例えば、イソチオシアネートまたは活性化エステルを用いてポリヌクレオチドを容易に官能化することができる。通常の置換体は発螢光団、酵素、ビオチン、挿入剤、架橋剤、核酸開裂試薬、細胞取込みの改質剤等を含む。
合成ポリヌクレオチドの一端に窒素原子を導入する最も有効で手軽な方法は適当に官能化した合成支持体を使用し、支持体から窒素官能化ポリヌクレオチドを選択的に開裂することである。多くの方法は修飾支持体を使用する3’窒素官能化ポリヌクレオチドを合成するために現存するが、これらの方法の全ては生成物のラセミ混合物を生成しおよび/または非標準自動化ポリヌクレオチド合成試薬および/または方法を必要とし、これによってこれら化合物の精製および/または合成を複雑にしている。
前記理由のため、標準のポリヌクレオチド合成試薬、システムおよび手順を使用する非ラセミ調製において3’窒素官能化ポリヌクレオチドを合成することができる固体支持体試薬が必要である。さらに特に、(i)無水酢酸およびピリジンのようなポリヌクレオチド合成キャッピング試薬、(ii)ヨウ素のような酸化剤、(iii)トリクロロ酢酸のような中位の強度の酸、および(iv)ホスホルアミダイトのようなリン酸化剤に安定な修飾固体支持体は、同時に水酸化アンモニウムのような代表的なポリヌクレオチド合成開裂試薬に不安定である。
概要
本発明は3’窒素官能化ポリヌクレオチドを合成するために有用な自動化ポリヌクレオチド合成に使用するためのポリヌクレオチド合成支持体を見出したことに向けられている。
本発明の目的は、標準のポリヌクレオチド合成試薬、システムおよび手順を使用する非ラセミ製品においてポリヌクレオチドの合成を支持できる固体支持体試薬を提供することである。
本発明は、ひとつの局面において、次式の化合物からなるポリヌクレオチド合成試薬を含む。
式中の可変要素は次のように定義される:Tは酸開裂性ヒドロキシル保護基であり;Qは窒素および酸素を結合するリンカーであり;R1は不活性窒素置換基であり;R2からR4までは別々に水素または低級アルキル基であり;Yは炭素に対して負に帯電した原子であり;X1は炭素に対して負に帯電した原子であり;Zはボンドまたはスペーサーアームであり;そしてWはZに結合できる誘導化固体合成支持体である。
第二の局面では、本発明は次式の化合物からなるポリヌクレオチド合成試薬を含む。
式中の可変要素は次のように定義される:Tは酸開裂性ヒドロキシル保護基であり;Qは窒素および酸素を結合するリンカーであり;R1は不活性窒素置換基であり;R2およびR3は別々に水素または低級アルキル基であり;Yは炭素に対して負に帯電した原子であり;X2は炭素に対して負に帯電した原子であり;Zはボンドまたはスペーサーアームであり;WはZに結合できる固体合成支持体である。
いずれかの局面のひとつの好適例では、Tは4,4'−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチル、またはトリ(p−メトキシフェニル)メチルである。さらに好ましくは、Tは4,4'−ジメトキシトリチルである。
いずれかの局面の他の好適例では、Qは、低級アルキル、低級アルキレンオキシド、または、固体支持体の窒素と組み合わせるとき、アミド、カルバメート、スルホンアミド、または尿素、またはそれらのいずれかの組合せである。さらに好ましくは、Qは低級アルキルまたは低級アルキレンオキシドである。
いずれかの局面の他の好適例では、R2からR4までは水素である。
いずれかの局面の他の好適例では、Yは酸素または硫黄である。さらに好ましくは、Yは酸素である。
本発明の第一の局面の好適例では、X1はスルホニル、カルボニル、スルホキシド、パーフルオロ低級アルキル、またはスルホニル−、カルボニル−、スルホキシド−、ニトロ−、シアノ−、またはパーフルオロ低級アルキル置換アリールである。さらに好ましくは、X1はスルホニル、カルボニル、スルホキシドである。
本発明の第二の局面の好適例では、X2はスルホニル、カルボニル、スルホキシド、シアノ、パーフルオロ低級アルキル、またはスルホニル−、カルボニル−、スルホキシド−、ニトロ−、シアノ−、またはパーフルオロ低級アルキル置換アリールである。さらに好ましくは、X2はスルホニル、カルボニル、またはシアノである。
いずれかの局面の他の好適例では、Zは、窒素終端リンカーで誘導化された固体合成支持体の終端窒素と組み合わせて、カルバメート、尿素、スルホンアミド、または次式の基である。
式中のvは0と20の間である。
いずれかの局面の他の好適例では、Wはアミノ終端リンカーで誘導化されたCPGである。
いずれかの局面の最後の好適例では、Wはアミノ終端リンカーで誘導化された有孔ポリスチレンである。
第三の局面では、本発明は本発明の固体支持体を使用する3’窒素原子を含むポリヌクレオチドの合成方法を含む。この合成は次式を有する固体支持体試薬で行われる。
または
式中、Tは酸開裂性ヒドロキシル保護基であり;Qは窒素および酸素を結合するリンカーであり;R1は窒素置換基であり;R2からR4までは別々に水素または低級アルキル基であり;Yは炭素に対して負に帯電した原子であり;X1は炭素に対して負に帯電した原子であり;X2は炭素に対して負に帯電した原子であり;Zはボンドまたはスペーサーアームであり;WはZに結合できる誘導化固体合成支持体である。次に、固体支持体は酸で処理して酸開裂性ヒドロキシル保護基を除去する。次に保護ヌクレオシド単量体を弱酸と共に添加し、ヌクレオシドと成長する支持体結合鎖との間に連鎖を形成する。次に固体支持体の未反応部位をキャッピング試薬を用いてキャッピングして酸化試薬を添加する。上記工程をポリヌクレオチド鎖の伸長が完了するまで繰り返す。この地点で、オリゴヌクレオチドはまだホスフェートおよび基剤の環外アミン上の保護基で固体支持体に結合している。濃縮水酸化アンモニウムで処理してオリゴヌクレオチドを支持体から開裂させて、保護基は高温、例えば、55℃で水酸化アンモニウムの粗DNA溶液を処理して除去する。
詳細な説明
I.定義
ここで使用される「低級アルキル」の語は直鎖、分枝鎖、および1ないし8個の炭素原子を含有する環状アルキル基を示す。
ここで使用される「低級アルキレンオキシド」の語は直鎖、分枝鎖、および2ないし8個の炭素原子を含有する環状アルキレンオキシド基、例えばポリエチレンオキシドを含む。
「電子求引性」の語は、近隣原子から原子価電子を引き寄せる置換基の傾向を示す、即ち、置換基は近隣の原子に対して負に帯電している。ひとつの一般的で良く受け入れられる電気陰性度のインデックスはポーリングインデックスである。
II.詳細な説明
本発明の好適例を以下に詳細に説明する。本発明は好適例により説明するが、これらの例によって本発明が制限されるものではない。また、本発明は本発明の請求の範囲内に含まれる代替、改変、および等価のものを含む。
第一の好適例では、本発明の固体支持体は次式によって定義される。
式中、Tは一般に酸開裂性ヒドロキシル保護基である。好ましくは、Tはトリフェニルメチル基およびその電子供与置換誘導体であり、ここでは、語「電子供与」は、一部分である、即ち、分子内の隣接原子に関して電子陽性である、分子中の隣接原子に価電子を放出する置換体の傾向を示す。好ましくは、電子供与置換体はアミノ、1ないし8個の炭素原子を有する低級アルキル、1ないし8個の炭素原子を有する低級アリール、1ないし8個の炭素原子を有する低級アルコキシ等を含む。さらに好ましくは、電子供与置換体はメトキシである。例示的なトリチルは4,4'−ジメトキシトリチル(即ち、ビス(p−アニシル)フェニルメチル)、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチル、トリ(p−メトキシフェニル)メチル等を含む。これらおよび他のトリチルの結合と開裂の条件はGreene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition(John Wiley, New York, 1991)に見出すことができる。
Qはリンカーであり、3’窒素官能化オリゴヌクレオチドが支持体から開裂するとき、酸素を介して3’窒素をオリゴヌクレオチドと結合する働きがある。ある場合には、Qはまたオリゴヌクレオチドと3’窒素との間に空間的分離度を与え、例えば、オリゴヌクレオチドによって生じる立体的阻害を減らすことによって3’窒素の反応性を増加するように作用する。最後に、Qは高められたヌクレアーゼ耐性、溶解性、移送性、ハイブリッド形成、変化した電気泳動移動度等のような3’窒素オリゴヌクレオチドへ機能性を付加することができる。Qは代表的なDNA合成試薬に安定でなければならない。Qは本発明の中心的特徴ではなく一般的な作用を提供するので、Qは広範囲の形態をもつことができる。好ましくは、Qは低級アルキル、低級アルキレンオキシド、または、固体支持体試薬の窒素と組み合わせるとき、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、またはそれらの組合せである。さらに好ましくは、Qは低級アルキルまたは低級アルキレンオキシドである。
R1は窒素置換基であり、所望の最終生成物の性質に大いに依存して変化することができる。R1は本発明の中心的特徴ではなく一般的な機能を提供するので、R1は広範囲の形態をもつことができる。R1は結合した窒素原子が合成および続くオリゴヌクレオチド開裂の間に化学的に安定であるように選択される。好ましくは、R1は標準のポリヌクレオチド合成試薬に安定であり、ポリヌクレオチド開裂中にY=C=O基の除去を妨げない。反応性アミノ基が次のポリヌクレオチド開裂に望ましいならば、R1は実質的に窒素の反応性を妨げない。この場合、R1は好ましくは低級アルキルまたは水素である。最も好ましくは、R1は水素である。
反応性のアミノ基が最終生成物に不要であるならば、R1は標準のポリヌクレオチド合成化学に安定であり、ポリヌクレオチド開裂中にY=C=O基の除去を妨げないことだけが必要である。好ましくは、R1は低級アルキレンオキシド、水素、アルキル、スルホニル、アシル、アルコキシカルボニル、またはカルバモイルである。あるいは、R1は染料、特異的結合試薬、移送増進試薬、例えば、コレステロール等のような官能部分である。
Yはそれ自身と結合炭素との間の二重結合を極性化するように作用する官能基であり、結合炭素を電子陽性にして、これにより支持体から塩基開裂の際にY=C=O基の除去を有利にする。好ましくはYは炭素に対して電子陰性である。好ましくは、Yは酸素または硫黄である。さらに好ましくは、Yは酸素である。
X1は電子求引性の官能基であり、酸性、すなわち、pKaが15と35との間のX1と同じ炭素に結合する水素を作るように作用し、これによってアンモニアによる除去を容易にする。好ましくは、X1はスルホニル、カルボニル、スルホキシド、パーフルオロ低級アルキル、またはスルホニル−、カルボニル−、スルホキシド−、ニトロ−、シアノ−、またはパーフルオロ低級アルキル置換アリールである。さらに好ましくは、X1はスルホニル、カルボニル、スルホキシドである。
Zはボンドまたはスペーサーアームであり、固体支持体と本発明の官能領域を結合するように作用する。多くの場合に、Zはまた、固相合成に関連した移送阻止を除くため、本発明の固体支持体と官能領域との間に空間分離を与えるように働く、すなわち、液相動力学でオリゴヌクレオチド合成を進行させる。Zは代表的なDNA合成試薬に安定でなければならない。好ましくは、Zは、誘導化固体合成支持体、カルバメート、尿素、アミド、スルホンアミド、または次式の基の末端窒素と組合せる。
式中、vは0と20の間の整数である。
R2からR4までは支持体の化学的に活性な部位間で安定な空間を形成するように選択される。好ましくは、R2からR4までは別々に水素または低級アルキルを示す。さらに好ましくは、R2からR4までは別々に水素を示す。
Wはポリヌクレオチド合成を行う誘導化固体基体である。Wは種々の形態および構成を有するが、固体基体は、(i)反応溶媒に実質的に不溶性であり、(ii)標準のポリヌクレオチド合成試薬に化学的に安定であり、(iii)化学誘導化が可能であり、(iv)所望のオリゴヌクレオチド装填を与え、(v)処理中に出合う高圧に耐える十分な圧縮力を有し、(vi)所望の粒径範囲と分布で入手できることが必要である。さらに、オリゴヌクレオチドの支持体への結合を容易にするためWは誘導化される。
ひとつの好適例では、Wは無機ポリマー支持体である。広範囲の無機ポリマーが本発明では使用することができ、これらは、例えば、シリカ、有孔ガラス、アルミノシリケート、ボロシリケート、アルミナおよび酸化ニッケルのような金属酸化物、種々のクレイ等を含む。好ましくは、無機固体基体は制御細孔ガラス(CPG)である。制御細孔ガラスは制御した大きさの細孔でハチの巣状にしたほぼ純粋なシリカを均一に粉砕し篩分けした粒子からなる。特に加熱処理してシリケートからホウ酸塩を分離したホウ珪酸塩物質から製造される。細孔は酸性のエッチング法によってホウ酸塩を除去して形成され、それらの寸法は加熱工程の性質に依存する。さらに好ましくは、CPGは500Åの細孔を有する直径150μmの粒子の形態であり、例えばUsers Manual Model 392および394 Polynucleotide Synthesizers, 6-5から6-9頁、Applied Biosystems, Ver.2.00, Doc. Rev. A, Part No.902351 (1992)。
アミノ終端リンカーを用いたCPG支持体の誘導化はポリヌクレオチド合成の技術分野で良く知られており、例えば、Gait, Editor, Oligonucleotide Synthesis, 45-49頁(IRL Press, 1984)、そして実際に、約100mmol/gの一次アミノ装填量のアルキルアミンで誘導化したCPGビーズが市販品として入手できる(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)。簡単には、アルキルアミノ基体の場合には、CPG粒子の懸濁液をアミノアルキルトリメトキシシラン試薬と反応させて、濾過し、乾燥させる。
第二の好ましい固体基体は非膨潤性の有孔ポリスチレンである。ここで使用されるように、「非膨潤性」は、有孔ポリスチレン材料が実質的に機械的に硬く、特にホスホルアミダイトおよび/またはホスホン酸水素塩ポリヌクレオチド合成化学品の溶媒、反応物および生成物に曝すとき、認められるほどは容量が増加しないことを意味する。個々で使用されるように、「有孔」は、非膨潤性ポリスチレンが100と4000Åの範囲内の実質的に均一な直径の細孔を含むことを意味する。
ポリスチレン支持体は、標準法によってアミノ誘導化される、例えば、Wallace et al., 638-639頁in Scouten ed., Solid Phase Biochemistry (John Wiley & Sons, 1980); Wright et al. Tet. Lett., 34: 3373-3376 (1993); Bayer et al, U.S. Pat. No. 4,908,405; Applied Biosystems Research News, Model 390Z, 1994年2月。簡単に述べると、ヒドロキシメチルフタルイミドは触媒量のメチルスルホン酸を用いてポリスチレン支持体と反応させてフタルイミドメチルポリスチレンを形成する。次にこの物質はヒドラジンで処理してフタルイミド保護基を除き、アミノメチル化ポリスチレンを与える。一般に、アミノ装填量は、非膨潤性有孔ポリスチレン1グラム当たり、アミノ官能基20ないし60μモルに変化する。装填水準は試薬濃度と反応時間を調整することによって制御することができる。
最近開発された代替のポリスチレン誘導化学は、ポリヌクレオチドと結合するために入手できる遊離ヒドロキシル基をもつ幾つかのポリオキシエチレン残基または鎖を結合して、末端アミノ基を遊離ヒドロキヒル基と置換する、例えば、Bayer and Rapp, U.S. Pat. No. 4,908,405; Gao et al., Tetrahedron Lett., 32 (40): 5477-5480 (1991)。
第三の好適例では、Wは非ポリスチレン有機ポリマーである。このポリマー支持体は合成により改質される天然産材料、および合成材料から誘導することができる。特に関係するものは多糖類、特に架橋多糖類、例えばSepharose(登録商標)として入手できるアガロース、Sephadex(登録商標)として入手できるデキストラン、セルロース、澱粉等である(SepharoseとSephadexはファーマシアファインケミカルス、ピスカタウェイ、NJの登録商標の製品である)。他の適当な材料はポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、シリコーン、Teflon(登録商標)等がある。
第二の好適例では、本発明の固体支持体は次式によって定義される。
式中のX2は電子求引性の官能基であり、酸性のX2と同じ炭素に結合する任意の水素を作るように作用し、これによってアンモニアによる除去を容易にする。好ましくは、X2はスルホニル、カルボニル、スルホキシド、シアノ、パーフルオロ低級アルキル、またはスルホニル−、カルボニル−、スルホキシド−、ニトロ−、シアノ−、またはパーフルオロ低級アルキル置換アリールである。さらに好ましくは、X2はスルホニル、カルボニル、またはシアノである。
式IIの化合物中の全ての他の可変要素は式Iの化合物に関連して上に定義されたものと同じである。
III.一般の合成法
A.式IのX1含有固体支持体の合成:
以下は式Iの化合物のための好ましい一般の合成法である。一般に、反応機構はヒドロキシル保護アルコールアミン(Tアミン)を調製し、ジオールを当量のホスゲン、次いでTアミンと反応させてヒドロキシル保護カルバメートアルコール(T−CA)を調製することを含む。T−CAを次に処理して活性T−CAリンカーを形成し、アミノ誘導化固体基体と反応させる。
Tアミンを形成するために、先ず、アミノアルコールのアミン部分を塩基に不安定な保護基で保護する。次式
HOQNHR1
(式中の可変要素は上に定義されている)で示されるアミノアルコール(約1.0当量)を有機溶媒、例えば、メタノール、エーテル、塩化メチレン等に溶解し、塩基に不安定なアミノ保護試薬(約1.1当量)、例えば、エチルトリフルオロアセテートを−5ないし25℃の温度にてアミノアルコール溶液に一滴ずつ添加し、0ないし40℃の温度にて1〜6時間攪拌し、その後、真空下に蒸発させる。市販品として入手できるアミノアルコールの例としてはアミノエタノール、6−アミノ−1−ヘキサノール、アミノシクロヘキサノール、2−(2−アミノエトキシ)エタノール、ロイシノール等を含む。残渣を水と混合できない有機溶媒、例えば、塩化メチレン、エーテル、エチルアセテート等に溶解し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。次いで溶媒を真空下に蒸発させて保護アミノアルコール生成物を与える。
次に、保護アミノアルコールのアルコール部分を保護する。保護アミノアルコール(約1.0当量)および第三アミン(約1.5当量)、例えば、ジイソプロピル エチルアミン、トリエチルアミン等を非プロトン性有機溶媒、例えば、塩化メチレン、エーテル等に溶解し、そして酸に不安定なヒドロキシル保護剤、(約1.1当量)、例えば、ジメトキシトリチルクロリドのようなトリチル化剤を、−10と+10℃の間の温度にて添加する。混合物を5ないし25時間、0と25℃の間で攪拌し、その後に反応に使用した等容量の有機溶媒で希釈する。次に反応溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下に濃縮し、T保護アミノアルコールを得る。
最後に、T保護アミノアルコールのアミン部分を塩基で処理して脱保護する。T保護アミノアルコールを極性有機溶媒、例えばメタノールに溶解し、、塩基性水溶液、例えば、4Nの水酸化ナトリウムを0と25℃の間で添加し、反応物を10分と2時間の間、25と60℃の間で攪拌する。有機溶媒を真空下に蒸発させ、残渣を水と混合しない有機溶媒、例えば、エチルアセテート、エーテル等に溶解し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒を真空下に蒸発させて次の式で示されるTアミンを与える。
TOQNHR1
(式中の可変要素は上に定義されている。)
T−CAを形成するために、次式の乾燥ジオールを使用する。
HOCR2R3CHR4X1Z'OH
(式中、Z'は若干のケースではZに等しく、他のケースではZへの前駆体であり、後にT−CAを活性化するために使用される方法に依存する。他の可変要素は上に示した通りである。乾燥ジオール(2ないし10当量)および第三アミン(1.0当量)、例えばジイソプロピルエチルアミンを非プロトン性有機溶媒、例えば、ピリジンに溶解し、ホスゲン当量(1.0当量)、例えば、4−ニトロフェニルクロロホルメートを0と25℃の間で添加し、溶液を室温にて10分と2時間の間攪拌する。この溶液を次に上記で調製した(約0.25ないし1当量)Tアミンおよび第三アミン(約1.0当量)、例えばジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン等を非プロトン性溶媒、例えばピリジンに溶解した溶液に添加する。反応物を10分と2時間の間、0と25℃の間で攪拌し、溶媒を真空下に蒸発させ、残渣を水と混合しない有機溶媒、例えば、エチルアセテートに溶解し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒を真空下に蒸発させて次の式で示されるTカルバメートアルコールアミン(T−CA)を得た。
(式中の可変要素は上に定義されている。)
上のT−CAを次に二つの好適法のいずれか一つを使用して活性リンカーに変換する。第一の好適法では、T−CAをアミン塩基、例えば、4−ジメチルアミノピリジン、および無水物、例えば無水琥珀酸を用いて、非プロトン性溶媒、例えば、塩化メチレン中で、10と60℃の間にて10と60分の間、処理する。溶液を弱酸水溶液、例えばクエン酸で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下に濃縮してTカルバメートアルコールリンカー(T−CAリンカー)を得る。このT−CAリンカーを次に等モル溶液の1−ビドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)および2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3-テトラメチルウロニウム(HBTU)(N,N−ジメチルホルムアミドの0.45M溶液)を極性非プロトン性溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド中で処理し、次に第三アミン、例えば、ジイソプロピルエチルアミンを添加して、活性化する。反応物を10と60分の間、5と35℃の間で攪拌し、活性T−CAリンカーを得る。
第二の好適な活性化法では、T−CAを当量のホスゲン(約1.1当量)、例えば4−ニトロフェニルクロロホルメート、および第三アミン(約1.1当量)、例えばジイソプロピルエチルアミンを非プロトン性溶媒、例えば、ピリジン中で、10分と2時間の間、0と25℃の間で処理し、活性T−CAリンカーを得る。
最後に、活性T−CAリンカーを、アミノ終端リンカーを有する固体基体に結合するため、例えば、アミノアルキル固体基体、例えばアミノプロピルCPG、アミノプロピルポリスチレン、アミノアルキルポリエチレングリコールポリスチレン等を、活性T−CAリンカーに添加して5〜40℃で1〜10時間、反応容器を時々振り動かし攪拌させる。誘導化固体支持体生成物を次に濾過し、有機溶媒、例えば、塩化メチレンで洗浄し、10分と2時間の間にキャッピング試薬(1:1:1 V/V/V無水酢酸:N−メチルイミダゾール:ルチジン)で処理し、濾過し、有機溶媒で洗浄し、真空下に乾燥して式Iの固体支持体試薬を白色固体として得る。
B.式IのX1含有固体支持体の他の集中合成:
次は式Iの化合物のための好適な代替の一般化した合成法である。上記のようなジオール(1ないし5当量)および第三アミン(1.1当量)、例えば、トリエチルアミンを非プロトン性有機溶媒、例えば、塩化メチレンに溶解し、酸に不安定なアルコール保護試薬(1当量)、例えばジメトキシトリチルクロリドを添加し、0と25℃の間で10分から5時間攪拌する。溶液を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、モノ保護ジオールを得る。
モノ保護ジオールを次に活性リンカーに移し、方法AのT−CAに同様のアミノアルキル固体基体に結合し、Tリンカー支持体を与える。
Tリンカー支持体を次に酸、例えば、塩化メチレン中のトリクロロ酢酸を用いて、10と30℃の間で1と30分間脱保護し、有機溶媒、例えば、塩化メチレンで洗浄し、乾燥し、アルコールリンカー支持体を得る。
アルコールリンカー支持体を当量のホスゲン、例えば4−ニトロフェニルクロロホルメート、および第三アミン、例えば、ジイソプロピルエチルアミンを、非プロトン性有機溶媒、例えばピリジン、塩化メチレン、アセトニトリル等に溶解し、10と30℃の間、5分と60分の間で処理する。次に支持体を非プロトン性有機溶媒、例えば塩化メチレンで処理して、カーボネートリンカー支持体を得る。
次にカーボネートリンカー支持体を塩基性有機溶媒中のTアミン(上記方法A参照)で、例えばアセトニトリル中のピリジン、塩化メチレン中のトリエチルアミン等で、10と30℃の間、10分と2時間の間で処理する。支持体を非プロトン性有機溶媒、例えば、塩化メチレンで洗浄し、10分と2時間の間でポリヌクレオチド合成キャッピング試薬(上記方法A参照)で処理し、非プロトン性有機溶媒で洗浄し、乾燥させて式Iの固体支持体を得る。
C.式IIのX2含有固体支持体の合成:
次は式IIの化合物のための好ましい一般的合成法である。出発物質は次式によって定義されるX2リンカーである。
(式中、Z"はZに対する前駆体であり、他の可変要素は先に定義されている。)
X2リンカーがアミン、アルコール、またはチオールを含むならば、先ず塩基に不安定でなく、酸に不安定でない保護基、例えば、ベンジルまたはシリルで保護される。これらおよび他の応用できる保護基を使用するためのプロトコルはほかの場所で見出すことができる、例えば、Greene and Wuts, Protective Groups in organic Synthesis, 2nd Edition (John Wiley, New York, 1991)。
X2リンカーは次に強塩基(2当量)、例えば、リチウムジイソプロピルアミド、水素化ナトリウム等を用いて、乾燥極性非プロトン性溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド中でアルゴン下に攪拌しながら処理して、アルコールに変換される。乾燥極性非プロトン性溶媒中のケトンまたはアルデヒド(1当量)を−40と0℃の間で一滴ずつ添加し、反応物を−40と25℃の間で10分と2時間の間で攪拌し、反応物を水で冷却し、真空下に蒸発させて濃縮する。次に残渣を水に混合しない溶媒、例えば酢酸エチル、エーテル、塩化メチレン等に溶解し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下に濃縮し、次の式で定義されるアルコールリンカーを得る。
(式中の可変要素は先に定義されている。)
次にアルコールリンカーを先の方法Aの活性T−CAリンカーのための上記第二の好ましい活性化法に従って活性化し、活性化アルコールリンカーを与える。
Tアミン(1当量)と第三アミン(1当量)、例えば、ジイソプロピルエチルアミンを0と25℃の間で、10分と2時間の間で攪拌する。溶媒を真空下に蒸発させて残渣を水と混合しない溶媒、例えば、酢酸エチルに溶解する。溶液を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。次に溶媒を真空下に蒸発させてTカルバメートリンカーを得る。
生成物がベンジル保護アミン、アルコール、またはチオールを含むならば、例えば、パラジウム触媒と組み合わせて水素を使用して、水素化分解によって脱保護する。あるいは、生成物がシリル保護アミン、アルコール、またはチオールを含むならば、フッ化物試薬、例えば、テトラブチルアンモニウムフルオリドで処理して脱保護する。
Tカルバメートリンカーがアミン、アルコール、またはチオールである場合、次に方法Aの活性T−CAリンカーに対して上記のように活性化することができる。Tカルバメートリンカーがカルボン酸またはスルホン酸である場合、上記のようにHOBT/HBTU試薬で処理して活性化することができる。得られた活性化Tカルバメートリンカーは次に上記のようにアミノアルキル固体基体と反応させて式IIに示される固体支持体を得る。
IV.有用性
本発明の固体支持体の好適な有用性はその3’末端に位置する窒素原子を含有するポリヌクレオチドの合成にある。ポリヌクレオチドを生成するために使用される化学の詳細な説明は他にもある、例えば、Caruthers et al., 米国特許第4,458,066号; Caruthers et al., 米国特許第4,415,732号; Caruthers et al., Genetic Engineering, 4: 1-17(1982); Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, 6-1から6-22頁まで, Applied Biosystems, Part No. 901237(1991)。従って、これらの文献はこれらの記述について参考文献として組み込まれる。
ポリヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法は有効で迅速なカップリングと出発物質の安定のために好ましい方法である。この合成は固体基体に結合した成長するポリヌクレオチド鎖で行われ、液相にある過剰の試薬が濾過によって容易に除去され、これによりサイクル間の精製工程の必要がなくなる。
次に代表的なポリヌクレオチド合成の工程を簡単に述べる。合成サイクルの第一工程は、固体支持体を酸で処理し、ヒドロキシル保護基を除去し、次のカップリング反応のためにヒドロキシル基をフリーにする。次にホスホルアミダイトヌクレオシド単量体と弱酸、例えば、テトラゾール等を反応物に同時に添加して活性化中間体が形成される。弱酸は反応性中間体を形成するホスホルアミダイトの窒素をプロトン化する。この中間体は反応性があるので添加が30秒以内に完了する。次の工程、キャッピングは、添加されなかった任意のポリヌクレオチド鎖を終端させる。好ましくはキャッピングは無水酢酸と1−メチルイミダゾールを用いて行われる。最後に、インターヌクレオチドリンケージがホスファイトから一層安定なホスホトリエステルに変換される。好適な酸化剤としてヨウ素、酸素ドナーとして水が使用される。酸化後、ヒドロキシル保護基はプロトン性の酸、例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸を用いて除去され、サイクルは鎖伸長が完了するまで繰りかえされる。合成後、ポリヌクレオチド鎖は塩基、例えば水酸化アンモニウムを用いて支持体から開裂される。またアンモニア処理はシアノエチルホスフェート保護基を除去する。最後に、塩基の環外アミンの保護基は高温、例えば、55℃にて水酸化アンモニウム中ポリヌクレオチド溶液を処理して除去される。
本発明が他の合成法、例えば、リン酸水素塩またはホスホトリエステル化学品に関連して使用することもできることは、ポリヌクレオチド合成の当業者には明らかであろう。
V.実施例
次の実施例は本発明の固体支持体試薬の調製と応用を示すものである。使用されるパラメーターの数値は本発明の例示であり制限されるものではない。
実施例1
N−トリフルオロアセチル−6−アミノ−1−ヘキサノールの合成
6−アミノ−1−ヘキサノール(179g)(Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI)をメタノール(358ml)に溶解し、エチルトリフルオロアセテート(239g)(Aldrich)を20分かけて溶液に滴下した。反応物を2.5時間攪拌した後、溶媒を真空下に除去し、残渣を塩化メチレン(250ml)に溶解し、その後、溶液を水(3×300ml)および飽和塩化ナトリウム溶液(200ml)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。最後に、溶媒を真空下に除去し、白色固体を得た(299g)。
薄層クロマトグラフィ(TLC)分析:TLC板(シリカゲルGF、250μm厚さ、10×20cmスコア板、Analtech, Inc., Newark DE)を100%酢酸エチルで展開し、イソプロピルアルコール中5%ホスホモリブデン酸で着色した。6−アミノ−1−ヘキサノールとN−トリフルオロアセチル−6−アミノ−1−ヘキサノールのRfは、それぞれ、0および0.25であった。
実施例2
1−O−(4,4'−ジメトキシトリチル)−N−トリフルオロアセチル−6−アミノヘキサンの合成
実施例1からのN−トリフルオロアセチル−6−アミノ−1−ヘキサノール(10g)およびジイソプロピルエチルアミン(12.1g)(Aldrich)を塩化メチレン(100ml)に溶解し、5℃まで氷冷却し、ジメトキシトリチルクロライド(17.5g)(Aldrich)を冷却混合物に添加した。混合物を終夜(15時間)攪拌し、その間に温度は最初の1時間5℃に保持し、次いで室温まで上昇させた。塩化メチレン(100ml)を添加し、混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液(100ml)で、次に飽和塩化ナトリウム溶液(100ml)で洗浄した。次に混合物を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下に除去して所望の生成物(29g)を得た。
TLC分析:TLC板(上記と同じタイプ)をヘキサン中50%酢酸エチル1%トリエチルアミンで展開した。1−O−(4,4'−ジメトキシトリチル)−N−トリフルオロアセチル−6−アミノヘキサンのRfは0.9であった。
実施例3
1−O−(4,4'−ジメトキシトリチル)−6−アミノヘキサンの合成
実施例2からの1−O−(4,4'−ジメトキシトリチル)−N−トリフルオロアセチル−6−アミノヘキサン(20.9g)をメタノール(100ml)に溶解し、氷冷し、4N水酸化ナトリウム(16.6ml)を添加した。反応物を室温まで温め、ヒートガンを使用して10分間50℃まで加熱し、次に終夜(15時間)室温で攪拌した。メタノールを真空下に除去し、残渣を水(100ml)および酢酸エチル(150ml)と混合した。次に有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液(2×100ml)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空下に除去し、オイル(16.9g)として生成物を得た。
実施例4
1−O−(4,4'−ジメトキシトリチル)−6−アミノヘキサンおよび2.2'−スルホニルジエタノールのカルバメート付加物の合成
1−O−(4,4'−ジメトキシトリチル)−6−アミノヘキサンおよび2.2'−スルホニルジエタノールのカルバメート付加物の合成前に、2,2'−スルホニルジエタノール(Aldrich)を次の方法を用いて乾燥した。2,2'−スルホニルジエタノール(65%水溶液200g)をアセトニトリル(200ml)と混合し、混合物を蒸溜し、蒸溜物を70℃と90℃の沸点範囲で収集した(240ml)。蒸溜ポットを室温まで冷却し、さらにアセトニトリルを添加し(200ml)、蒸溜工程を繰り返し、さらに蒸溜物を収集した(270ml)。蒸溜頭部を次にスタークトラップと置き換え、トルエン(150ml)を添加し、混合物を還流させた。トラッピング3時間後、水を回収し(12ml)、溶媒を真空下に除去し、粘性オイル(105g)を得た。
乾燥した2,2'−スルホニルジエタノール(14.7g)を次にテトラヒドロフラン(100ml)に溶解し、ロータリーエバンレーションでストリッピングし乾燥させた。残渣をピリジン(100ml)とジイソプロピルエチルアミン(12.3g)にアルゴン下に溶解し、氷浴を使用して約10℃まで冷却し、その後4−ニトロフェニルクロロホルメート(9.6g)(Aldrich)を攪拌溶液に添加し反応物を約25℃まで温めた。45分後、反応物を15℃まで冷却し実施例3からの1−O−(4,4'−ジメトキシトリチル)−6−アミノヘキサン(5g)を添加した。5分後、反応を炭酸カリウム(5%水溶液50ml)を用いて終わらせた。5分後、溶媒を真空下に除去し、残渣を酢酸エチル(150ml)に溶解し、水(2×各200ml)、炭酸カリウム(5%水溶液、2×各100ml)、冷水酸化ナトリウム(0.5N水溶液、8×各100ml)、および飽和塩化ナトリウム(2×各100ml)で洗浄した。次に有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下に除去し、オイル(7.9g)として生成物を得た。
TLC分析:TLC板(上記と同じタイプ)を塩化メチレン中5%メタノールと1%トリエチルアミンで展開した。1−O−(4,4'−ジメトキシトリチル)−6−アミノヘキサン、および1−O−(4,4'−ジメトキシトリチル)−6−アミノヘキサンと2.2'−スルホニルジエタノールのカルバメート付加物(以下カルバメート付加物と呼ぶ)のRfは、それぞれ、0.2と0.4であった。
粗カルバメート付加物をシリカゲルクロマトグラフィ(カラム寸法:5.5cmの内径および8cmの長さ)で精製した。シリカゲルG60を分離前に酢酸エチル−トリエチルアミン−ヘキサン溶媒系(ヘキサン中50%酢酸エチルおよび0.5%トリエチルアミン)で前処理した。粗カルバメート付加物を酢酸エチル−ヘキサン溶媒(ヘキサン中50%酢酸エチル)に溶解し、前処理カラムに装填し、酢酸エチル−ヘキサン(ヘキサン中50%酢酸エチル)、酢酸エチル、次にメタノール−酢酸エチル(酢酸エチル中10%メタノール)で溶出した。10の画分を収集し、各画分をTLC(次のTLC条件を参照)で分析し、適当な画分を一緒にしてオイル(4.3g)として生成物を得た。
TLC分析:TLC板(上記と同じタイプ)を酢酸エチル中0.5%トリエチルアミンで展開した。カルバメート付加物のRfは約0.3であった。
実施例5
1−O−(4,4'−ジメトキシトリチル)−6−アミノヘキサンと2.2'−スルホニルジエタノールのカルバメート付加物のスクシニルエステルの合成
実施例4からのカルバメート付加物(2.0g)および4−ジメチルアミノピリジン(0.49g)(Aldrich)をアルゴン下に塩化メチレン(20ml)に溶解し、無水琥珀酸(0.41g)を室温にて攪拌溶液に添加した。5分後、追加の塩化メチレン(100ml)を添加し溶液を冷クエン酸(クエン酸10%水溶液、各5×100ml)および飽和塩化ナトリウム溶液(2×各100ml)で洗浄した。洗浄した溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を真空下に除去し、オイル(2.1g)として生成物を得た。
TLC分析:TLC板(上記と同じタイプ)を塩化メチレン中5%メタノールを0.5%トリエチルアミンで展開した。カルバメート付加物のRfは0.4でありカルバメート付加物のスクシニルエステル(以下、スクシニルエステルと呼ぶ)のRfは0.3であった。
粗スクシニルエステルをシリカゲルクロマトグラフィ(カラム寸法:5.5cmの内径および8cmの長さ)で精製した。シリカゲルG60を分離前にメタノール−トリエチルアミン−塩化メチレン溶媒系(塩化メチレン中1%メタノールおよび0.5%トリエチルアミン)で前処理した。粗スクシニルエステルを塩化メチレン−メタノール溶媒(塩化メチレン中1%メタノール)に溶解し、カラムに装填し、3工程溶媒グラジエント(200mlの1%メタノールおよび0.5%トリエチルアミン、200mlの5%メタノールと0.5%トリエチルアミン、および150mlの15%メタノールと0.5%のトリエチルアミン、それぞれ塩化メチレン中)で溶出した。18画分を収集し、各画分をTLC(次のTLC条件を参照)で分析した。適当な画分(画分8−13)を一緒にして溶媒を真空下に除去し、オイル(1.32g)として生成物を得た。
TLC分析:TLC板(上記と同じタイプ)を塩化メチレン中5%メタノールと0.5%トリエチルアミンで展開した。上記のようにスクシニルエステルのRfは約0.3であった。
実施例6
3'−アミノリンカー支持体を形成する3−アミノプロピル制御有孔ガラスへのスクシニルエステルの結合
実施例5からのスクシニルエステル(0.4g)をアルゴン下にジメチルホルムアミド(10ml)に溶解し、等モルの1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)および2-(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム(HBTU)(ジメチルホルムアミド中0.45M溶液1.14ml)(Applied Biosystems Division of the Perkin Elmer Corporation, Foster City, CA(ABI))を攪拌溶液に添加し、続いてジイソプロピルエチルアミン(0.14g)を添加した。室温で15分後、3−アミノプロピル−CPG(1グラムにつき40μモルの装填量を有する5.58gの物質)(ABI)を攪拌溶液に添加し、攪拌を停止し、反応物を時々静かに2.5時間攪拌した。スラリーを中粒度ガラス濾過器に移し、CPG支持体を塩化メチレン(5×20ml)で洗浄し、キャッピング試薬(テトラヒドロフラン中0.5MのN−メチルイミダゾール10mlおよびテトラヒドロフラン中10%無水酢酸10%2,6-ルチジン10ml)で処理し、30分間静止した。次に溶液を除去し、CPGを塩化メチレン(5×20ml)で洗浄し、真空下に乾燥させて白色固体(5.64g)を得た。
実施例7
本発明の固体支持体を使用する3'−アミノヘキシルポリヌクレオチドの合成
3'−アミノポリヌクレオチドの合成は標準プロトコルと試薬(ABI)を使用するApplied Biosystems 394ポリヌクレオチド合成器を使用して行われた。394ポリヌクレオチド合成器によって使用される簡単な化学は上記IV.有用性に記載されている。合成に使用される固体支持体は実施例1−6に記載されているものであった(32mg)。ポリヌクレオチドの塩基配列は5'-AGC TAG CT-3'であった。生成物はまだ結合している末端トリチル基で合成支持体から開裂され、HPLC分析によって約80%の純度であると決定された。
実施例8
3'−アミノヘキシルポリヌクレオチドへの螢光染料の結合
0.1Mトリエチルアンモニウムアセテート、pH7(100μl)中の実施例7からの粗ポリヌクレオチド(20%)を6−カルボキシフルオレセイン−N−ヒドロキシスクシンイミド(6-FAM)エステル(100μlジメチルホルムアミド中1mg)(Research Organics, Inc., Cleveland, OH)の溶液に添加し、次に1M NaHCO3/Na2CO3 pH9.0溶液(100μl)を添加した。溶液を攪拌し、室温で30分間放置した。次に混合物をPD−10ゲルフィルターカラム(Pharmacia, Piscataway, NJ)に加え、単一の画分を収集し(2.5mlの空隙容量を溶出した後に収集した1ml画分)、5'-AGCTAGCT-3'-アミノヘキシル-6-FAMを得た。
本発明は一定の好適な変更例を参照して詳細に記述したが、他の変更例も可能である。化学分野での当業者は上記支持体試薬、および上記支持体試薬の合成方法の多くの変更例が可能であること、このような変更は本発明の範囲内にあることを理解するであろう。
Claims (24)
- 3’末端で窒素基を含むポリヌクレオチドの合成のための固体支持体試薬であって、次式:
Qは窒素および酸素を結合するリンカーであり;
R1は低級アルキル、水素、アルコキシカルボニル、またはカルバモイルであり;
R2からR4までは別々に水素または低級アルキル基であり;
Yは酸素または硫黄であり;
X1はスルホニル、カルボニル、スルホキシド、パーフルオロ低級アルキレン、またはニトロ置換フェニレン、シアノ置換フェニレン、もしくはパーフルオロ低級アルキル置換フェニレンであり;
Zは結合またはスペーサーアームであり;そして
Wは固体支持体である)
の化合物を含有する、固体支持体試薬。 - Tが4,4’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチル、またはトリ(p−メトキシフェニル)メチルである、請求項1記載の固体支持体試薬。
- Tが4,4’-ジメトキシトリチルである、請求項1記載の固体支持体試薬。
- Qが低級アルキレン;または隣接する酸素と一緒になって低級アルキレンオキシド;または前記固体支持体試薬の窒素と一緒になって、アミド、カルバメート、スルホンアミド、もしくは尿素;あるいはそのいずれかの組み合わせである、請求項1記載の固体支持体試薬。
- Qが低級アルキレンもしくは低級アルキレンオキシドである、請求項1記載の固体支持体試薬。
- R2からR4までが水素である、請求項1記載の固体支持体試薬。
- Yが酸素である、請求項1記載の固体支持体試薬。
- X1がスルホニル、カルボニル、スルホキシドである、請求項1記載の固体支持体試薬。
- Wがアミノ終端リンカーで誘導化されたCPGである、請求項1記載の固体支持体試薬。
- Wがアミノ終端リンカーで誘導化された有孔ポリスチレンである、請求項1記載の固体支持体試薬。
- Tが4,4’ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチル、またはトリ(p−メトキシフェニル)メチルである、請求項12記載の固体支持体試薬。
- Tが4,4’ジメトキシトリチルである、請求項12記載の固体支持体試薬。
- Qが低級アルキレン;または隣接する酸素と一緒になって低級アルキレンオキシド;または前記固体支持体試薬の窒素と一緒になって、アミド、カルバメート、スルホンアミド、もしくは尿素;あるいはそのいずれかの組み合わせである、請求項12記載の固体支持体試薬。
- Qが低級アルキレンもしくは低級アルキレンオキシドである、請求項12記載の固体支持体試薬。
- R2およびR3が水素である、請求項12記載の固体支持体試薬。
- Yが酸素である、請求項12記載の固体支持体試薬。
- X2がシアノである、請求項12記載の固体支持体試薬。
- Wがアミノ終端リンカーで誘導化されたCPGである、請求項12記載の固体支持体試薬。
- Wがアミノ終端リンカーで誘導化された有孔ポリスチレンである、請求項12記載の固体支持体試薬。
- (a)次式:
Qは窒素および酸素を結合するリンカーであり;
R1は低級アルキル、水素、アルコキシカルボニル、またはカルバモイルであり;
R2からR4までは別々に水素または低級アルキル基であり;
Yは酸素または硫黄であり;
X1はスルホニル、カルボニル、スルホキシド、パーフルオロ低級アルキレン、またはニトロ置換フェニレン、シアノ置換フェニレン、もしくはパーフルオロ低級アルキル置換フェニレンであり;
Zは結合またはスペーサーアームであり;そして
Wは固体支持体である)
の化合物を含む固体支持体試薬を用意し;
(b)固体支持体を酸で処理して酸開裂性ヒドロキシル保護基を除去し;
(c)保護ヌクレオシド単量体と弱酸を添加し、結合体を形成し;
(d)固体支持体上の未反応部分をキャッピングし;
(e)酸化試薬を添加し;
(f)ポリヌクレオチド鎖伸長が完了するまで工程(b)-(e)を繰り返し;
(g)ポリヌクレオチドを固体支持体から開裂し;そして
(f)ポリヌクレオチドを脱保護する
各工程からなる3’末端に窒素原子を有するポリヌクレオチドを合成する方法。 - (a)次式:
Qは窒素および酸素を結合するリンカーであり;
R1は低級アルキル、水素、アルコキシカルボニル、またはカルバモイルであり;
R2とR3は別々に水素または低級アルキル基であり;
Yは酸素または硫黄であり;
X2はシアノ、パーフルオロ低級アルキル、またはニトロ置換フェニル、シアノ置換フェニル、もしくはパーフルオロ低級アルキル置換フェニルであり;
Zは結合またはスペーサーアームであり;そして
Wは固体支持体である)
の化合物を含む固体支持体試薬を用意し;
(b)固体支持体を酸で処理して酸開裂性ヒドロキシル保護基を除去し;
(c)保護ヌクレオシド単量体と弱酸を添加し、結合体を形成し;
(d)固体支持体上の未反応部位をキャッピングし;
(e)酸化試薬を添加し;
(f)ポリヌクレオチド鎖伸長が完了するまで工程(b)-(e)を繰り返し;
(g)ポリヌクレオチドを固体支持体から開裂し;そして
(f)ポリヌクレオチドを脱保護する
各工程からなる3’末端に窒素原子を有するポリヌクレオチドを合成する方法。
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US6184347B1 (en) | 1998-11-19 | 2001-02-06 | Agilent Technologies Inc. | Minimization of blooming in high-density arrays by using reactive wash reagents |
US6432642B1 (en) * | 1999-01-15 | 2002-08-13 | Pe Corporation (Ny) | Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection |
US6476191B1 (en) * | 1999-02-05 | 2002-11-05 | Mixture Sciences, Inc. | Volatilizable solid phase supports for compound synthesis |
US6255476B1 (en) | 1999-02-22 | 2001-07-03 | Pe Corporation (Ny) | Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports |
US7211654B2 (en) * | 2001-03-14 | 2007-05-01 | Regents Of The University Of Michigan | Linkers and co-coupling agents for optimization of oligonucleotide synthesis and purification on solid supports |
US6855501B2 (en) * | 2001-03-26 | 2005-02-15 | Linden Technologies, Inc. | Transfer of arrayed chemical compositions |
US20020136772A1 (en) * | 2001-03-26 | 2002-09-26 | Tai-Nang Huang | Polymer synthesis |
DE10324063A1 (de) * | 2003-05-27 | 2004-12-23 | Robert Heinrich | Verfahren zur Herstellung von auf porösem Glas gebundenen Nucleotiden |
WO2013024694A1 (ja) * | 2011-08-12 | 2013-02-21 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | アミノ化オリゴヌクレオチド用固相担体 |
EP3919070A1 (en) | 2013-03-14 | 2021-12-08 | Children's Medical Center, Corp. | Use of cd36 to identify cancer subjects for treatment |
CA2943802A1 (en) | 2014-03-26 | 2015-10-01 | Children's Medical Center Corporation | Cyclic prosaposin peptides and uses thereof |
CN109880247B (zh) * | 2019-02-18 | 2022-08-19 | 邹晗 | 一种含超分散碳纳米管的聚苯乙烯电子载带材料及其制备方法 |
Family Cites Families (7)
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US4458066A (en) * | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4415732A (en) * | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
US5118605A (en) * | 1984-10-16 | 1992-06-02 | Chiron Corporation | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites |
DE3500180A1 (de) * | 1985-01-04 | 1986-07-10 | Ernst Prof. Dr. 7400 Tübingen Bayer | Pfropfcopolymerisate aus vernetzten polymeren und polyoxyethylen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
DE3650699T2 (de) * | 1985-03-15 | 1999-04-15 | Antivirals Inc | Immunotestmittel für Polynukleotid und Verfahren |
US5141813A (en) * | 1989-08-28 | 1992-08-25 | Clontech Laboratories, Inc. | Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis |
US5552471A (en) * | 1994-08-17 | 1996-09-03 | The Perkin-Elmer Corporation | Solid support reagents for the synthesis of 3'-Nitrogen containing polynucleotides |
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