CN1651450A - 有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子（SiRNA）、其混合物及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)。它为双链RNA分子并且其核苷酸序列与具有以下特征的核苷酸序列(I)至少70％的同源度：正义链和反义链的长度均为21个核苷酸，正义链和反义链各自的3′端为两个连续的脱氧胸苷酸(TT)，两条链除去3′端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补形成双链，正义链自5′端开始的19个核苷酸序列和序列表第1号序列中连续两个碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，每条链中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3′端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为大于25％小于75％(即G/C比例)。
Description
技术领域
本发明涉及核酸技术领域，具体地说是涉及有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它们的用途。
背景技术
恶性肿瘤是一种危害人类生命健康的主要疾病，但迄今为止对此仍然没有有效的治疗手段。长期以来科学家们一直在试图研制可以有效治疗恶性肿瘤的新药。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能作为抗肿瘤药物的活性成分的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)。为此，本发明采用以下技术方案：它为双链RNA分子并且其核苷酸序列与具有以下特征的核苷酸序列(I)至少70％的同源度：正义链和反义链的长度均为21个核苷酸，正义链和反义链各自的3’端为两个连续的脱氧胸苷酸(TT)，两条链除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补形成双链，正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和序列表第1号序列中连续两个碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，每条链中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为大于25％小于75％(即G/C比例)。
上述小干扰RNA分子(SiRNA)为人工合成，正义链和反义链各自的3’末端有两个脱氧胸甘酸(TT)，其它19个核苷酸的碱基可以是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)；两条链除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补(A和U，C和G)形成双链，但它们3’端的两个TT却以单链的形式存在。
当序列表中第1号核苷酸序列出现两个以上连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸时，上述“正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和序列表中第1号核苷酸序列的连续两个碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致”可以被理解为“正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和序列表中第1号核苷酸序列的任意两个连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致。”
人类PLK1(polo-like kinase 1)是一种新型的丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶并且和细胞周期密切相关。研究表明PLK1对于细胞周期尤其是肿瘤细胞的迅速分离和增殖是至关重要的，PLK1与细胞周期中的许多过程密切相关，例如Cdc2的激活、染色体的分离、中心粒的成熟、双急纺锤体的形成等过程；研究也表明PLK在许多的人类恶性肿瘤(例如肺癌、乳腺癌、结肠癌等)的表达明显增加，提示它在许多人类恶性肿瘤的发生发展中起重要作用。
本发明所提供的针对PLK1 mRNA分子的小干扰RNA(SiRNA)，可以有效的剔除肿瘤细胞的PLK1 mRNA分子，进而使肿瘤细胞停止生长并发生凋亡，从而为治疗恶性肿瘤找到了新型的分子。它的最大抑制浓度在几个到几十个纳摩尔(nM)，这比抗反译核酸的有效浓度要低10-100倍。
本发明提供的SiRNA分子以同时具有以下特征为更佳：
1)、核苷酸序列(I)的正义链自5’端开始的第一个核苷酸是碱基为鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)的核苷酸中的一种；也就是说当序列表第1号序列中出现两个以上连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸时，正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和该两个以上连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸中的最后两个核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，”。
2)、上述SiRNA序列和已知的人类其他基因和表达片段无100％的同源性。下表列出了符合这些条件的部分核苷酸序列(I)
SiRNA 序
编号 列
号 正义链序列 反义链序列 MW* 攻击范围#
P1 GAUUGUGCCU CAGAGACUUA
2 AAGUCUCUGTT GGCACAAUCTT 14179.4 306-326
P2 AGCCCUGACU CUCAGGCUCA
3 GAGCCUGAGTT GUCAGGGCUTT 14224.7 499-519
P3 AUUGUGCUUG ACUGGCAGCC
4 GCUGCCAGUTT AAGCACAAUTT 14194.5 539-559
P4 UGAAGAUCUG UUUCACCUCC
5 GAGGUGAAATT AGAUCUUCATT 14164.3 617-637
P5 AGAGCACAGU CACCUCGAAA
6 UUCGAGGUGTT CUGUGCUCUTT 14194.5 739-759
P6 AAGAGACCUA AUCCGGAGGU
7 CCUCCGGAUTT AGGUCUCUUTT 14194.5 830-850
P7 GGUUUUCGAU CUGGGAGCAA
8 UGCUCCCAGTT UCGAAAACCTT 14194.5 1031-1051
P8 GAGGAGGCUG CAGGAUCCUC
9 AGGAUCCUGTT AGCCUCCUCTT 14224.7 1253-1273
P9 GAUCACCCUC AUAUUUAAGG
10 CUUAAAUAUTT AGGGUGAUCTT 14149.2 1506-1526
P10 CGGCAGCGUG GUUGAUCUGC
11 CAGAUCAACTT ACGCUGCCGTT 14224.7 1642-1662
#：攻击范围是指该核苷酸序列(I)在序列表第1号序列中的相对应位置。
对于以上所说的同源度的数值，以80％以上为更佳。本发明所说之同源度是指任何SiRNA，其核苷酸序列和本发明所说的核苷酸序列(I)的正义链或负义链序列，在相应位置上的核苷酸相同率。
本发明所提供的SiRNA还包括针对以上所提到的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)的序列的任何部份或全部经化学修饰后所形成的的小干扰RNA分子。
所述化学修饰包括主要包括以下三类：第一、对连接相邻两个核苷酸的磷酸二酯键的部份修饰或用其它任何化学键取代。典型的磷酸二酯键的部份修饰是将磷酸双键上的氧置换成硫(硫化)或其它元素，或将磷酸单键上的氧变成氮(氮化)或其它元素和化学基团；对磷酸二酯键本身的全部取代，也包括对其本身或其部份以及和它相连的两个核糖的部份或全部改变，典型的例证是将磷酸二酯键和两个相邻的核糖变成肽键，使得核酸变成肽核酸(peptide nucleicacid，PNA)；第二、对核甘中核糖的五元环进行改变或其侧链上的化学基团作修饰。改变核糖环的典型例证如将五元的核糖环变成六环的Morpholino环；对核糖侧链上的修饰主要是指将核糖2’位上OH变成其它元素(如卤素元素)，或用其它化学基团替代OH中的H(例如烷基)。第三、将核苷酸上的碱基环作整体的改变或侧链的修饰。
本发明所提供的小干扰RNA(SiRNA)可以应用于制备治疗人类恶性肿瘤、恶性肿瘤相关的疾病以及与PLK1表达增加相关的任何疾病的药物中。
本发明还提供了一种较单独使用上表所列小干扰RNA(SiRNA)效果更好的混合物。它为与上表所列的P1号小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子、与上表所列的P4号小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子、与上表所列的P9号小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子中任意两种以上任意配比的混合物。
就上述技术方案，它以以下进一步的技术方案为更佳：它为与P1号小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子、与P4号小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子、与P9号小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子的任意比例的混合物，其中摩尔比为(20-80)∶(20-80)∶(20-80)时更好。
上述同源度以80％以上为佳。
附图说明
图1、上表所列的10种SiRNA对PLK1 mRNA水平的的作用。图示50nM的10种SiRNA作用于SW480细胞72小时后对细胞中PLK1 mRNA水平的影响。对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。纵坐标表示PLK1 mRNA的相对表达量。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图2、不同的SiRNA对SW480细胞PLK1 mRNA水平作用的浓度效应。图示不同浓度的P1、P4、P9以及三种SiRNA的混合物(每个SiRNA在混合SiRNA中的浓度均为总浓度的1/3)。图中纵坐标表示PLK1 mRNA表达的抑制率(和对照组相比)，对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图3、不同SiRNA作用于肿瘤细胞72小时后对细胞数的影响。图示为不同浓度的P1、P4、P9以及三种SiRNA的混合物(每个SiRNA在混合SiRNA中的浓度均为总浓度的1/3)。纵坐标代表细胞减少的相对百分数((1-处理组细胞数/对照组细胞数)×100％)。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图4、不同浓度的三种SiRNA作用于肿瘤细胞后对细胞存活率的影响。图示不同浓度的P1、P4、P9以及三种SiRNA的混合物(每个SiRNA在混合SiRNA中的浓度均为总浓度的1/3)作用于SW480细胞72小时后细胞上存活率的影响。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图5、不同的SiRNA对不同的肿瘤细胞株PLK1 mRNA水平的敲除作用。图示50nM的P1、P4、P9以及三种SiRNA的混合物(P1、P4、P9的摩尔浓度比为40∶20∶40)作用于人类乳腺癌细胞Bcap-37，人类胃癌细胞D6和人类肝癌细胞SMMU-7721 72小时后对这些细胞PLK1 mRNA表达的抑制效应。图中纵坐标表示PLK1 mRNA表达的抑制率(和对照组相比)，对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图6、不同SiRNA作用于不同的肿瘤细胞株72小时后对细胞数的影响。图示为50nM的P1、P4、P9以及三种SiRNA的混合物(P1、P4、P9的摩尔浓度比为40∶20∶40)作用于人类乳腺癌细胞Bcap-37，人类胃癌细胞D6和人类肝癌细胞SMMU-7721 72小时后对这些细胞细胞数减少的作用。纵坐标代表细胞减少的相对百分数((1-处理组细胞数/对照组细胞数)×100％)。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
具体实施方式
实施例1 SiRNA的合成
SiRNA的合成可委托公开对外开展合成业务的商业公司，比如美国Dharmacon公司，具体可通过
www.dharmacon.com获知，所有的SiRNA分子都经过2位上脱保护、脱盐、纯化、和退火形成双链处理，然后溶于DEPC处理的蒸馏水中。
本发明提供的小干扰RNA分子(SiRNA)的制备方法也可采用现有的固相化学合成法。该方法可参见：Wincott F，DiRenzo A，Shaffer C，Grimm S，TraczD，Workman C，Sweedler D，Gonzalez C，Scaringe S and Usman N.Synthesis，deprotection，analysis and purification of RNA and ribozymes.NucleicAcids Res.1995，23：2677-84。
以前表序号2的小干扰RNA分子(SiRNA)为例：整个化学合成可大致分成四个的过程(1)寡聚核糖核酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐退火无菌消毒。
具体制备操作如下：
(1)、寡聚核糖核酸的合成：SiRNA的合成是在自动DNA/RNA合成仪(例如：Applied Biosystems EXPEDITE 8909)上进行，根据P1号的小干扰RNA分子的核酸序列(正义链5’-GAUUGUGCCUAAGUCUCUGTT，反义链5’-CAGAGACUUAGGCACAAUCTT)的次序将对应的核苷酸逐个连接起来。由于SiRNA是由一段19聚的寡聚核糖核酸和一个2聚的脱氧胸苷酸组成.因此起始物为固相(CPG)连接的5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷(1-2umol).具体每一个循环合成可分为四步来完成(图1)。第一步是将与固相连接的胸苷上5’位的保护基在3％三氯乙酸的作用下洗脱；第二步在活性催化剂S-乙基四唑的作用下，将5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷亚磷酰胺偶联到已脱去保护的上一个胸苷上，形成二胸苷亚磷酸三酯。偶合时间和偶合循环的次数均按仪器厂家提供程序来完成；第三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在0.05M碘水的作用下氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙酰化，将固相上的少量未反应的活性基团(例如：羟基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺。从而达到封闭作用，用以减少整体副产物的产生。重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
(1)脱保护：将合成好的固相SiRNA放入一个可以密封的小瓶，并与加入1毫升的甲胺水溶液(10M，50％乙醇)，静置在室温。两小时后，取出溶液，并将固相CPG再次用乙醇；水和乙腈的混合液淋洗，并将淋洗液和前面取出的溶液合并一处，将其溶剂抽干。在小瓶中继续加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)。将溶液在室温静置12个小时。脱去所有寡聚核糖核酸上的保护基(包括碱基，核苷磷酸和核苷2’位的硅烷化保护基)。再经过乙醇沉淀，产生SiRNA的粗产物。
(2)纯化分离：将SiRNA的粗产物溶解在2毫升的乙酸铵的水溶液中，然后经过反相C18高压液相色谱的分离。运用梯度淋洗的方法，收集SiRNA的主产物(淋洗液A：0.1M的乙酸铵；淋洗液b：20％的0.1M的乙酸铵和80％的乙腈)。将SiRNA的主产物的溶剂除去，并加入5毫升80％乙酸水溶液，在室温静置15分钟。然后将此溶液进行阴离子交换的分离(DEAE-5PW，阴离子交换柱)，即可得到纯度在90％以上的SiRNA(梯度淋洗，淋洗液A：0.025M的Tris-HCl，0.025M NaClpH＝8，5％乙腈；淋洗液b：0.025M的Tris-HCl，2.0M NaCl，pH＝8，5％乙腈)。
(3)脱盐退火无菌消毒：纯化的SiRNA经过透析，除去盐份，SiRNA的溶液进行过滤消毒和干燥结晶。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸进行退火处理形成稳定的双股交链的SiRNA。其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲溶液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)。将此溶液加热到95℃，然后缓缓将此溶液冷却致室温(此过程应不少于一个小时)。最后将此溶液存放在4℃冰箱中保存，以便随时可以使用。
经过纯化后的SiRNA的纯度和鉴定有两种比较常用的办法。其一用毛细管凝胶电泳法来鉴定SiRNA的纯度，该方法可参见Paulus A，Ohms JI.Analysisof oligonucleotides by capillary gelelectrophoresis.J Chromatogr1990，507：113-123。
其二是用MALDI-TOF质谱来准确测量其分子量，从而确定SiRNA的化学结构组成。
本发明所说的所有SiRNA都可以根据其序列采用上述方法制备，鉴定方法同上。
实施例2 细胞培养和SiRNA的转染
1、细胞培养。SW480是从结肠癌组织中分离出来的一种结肠癌细胞系(Leibovitz A，Stinson JC，McCombs WB 3rd，McCoy CE，Mazur KC，Mabry ND.Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines.Cancer Res.1976；36(12)：4562-9.)。该细胞在体外用含10％胎牛血清的DMEM培养剂基来培养。Bcap-37、D6和SMMU-7721是国内建株的肿瘤细胞，它们的培养条件是含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基。
2、SiRNA的转染：SiRNA转入肿瘤细胞借助于Invitrogen(www.invitrogen.com)公司的Oligofectamine来进行，具体步骤按照说明书来进行。简述如下，5×104的肿瘤细胞接种于24孔培养板上过夜，第二天被转入SiRNA，然后继续培养72小时后检测细胞中PLK1 mRNA的水平。
3、SW480细胞PLK1 mRNA表达水平的检测：肿瘤细胞PLK1 mRNA表达水平的检测用实时PCR的技术来进行。具体可以分为以下三步：第一，细胞中RNA的提取，该方法可以参照现有的标准方法学来进行(见第四章，Currentprotocols in Molecular Biology，John & Wiley，2003)。第二步，cDNA的合成，合成方法也可参照标准的方法学来进行(见第五章，Current protocols inMolecular Biology，John & Wiley，2003)。第三步，实时PCR的进行，实时PCR是在ABI7700序列检测仪上进行，具体方法参照ABI公司的标准程序来进行。在本专利中用于检测PLK1的5’端引物的序列是5’-CAAGCTCATCTTGTGCCCACT-3’，对应于PLK1 cDNA序列中的1680到1700位，3’端引物的序列是5’-AGGCGGTATGTGCGGAAGT-3’，对应于PLK1 cDNA序列中的1754到1736位，实时PCR探针的序列是5’-CCGCTTCTCGTCGATGTAGGTCACG-3’，对应于PLK1 cDNA序列中的1710到1734位。
4、Bcap-37、D6和SMMU-7721细胞PLK1 mRNA表达水平的检测均与SW480细胞PLK1 mRNA表达水平的检测相同。
实施例3 SiRNA对肿瘤细胞PLK1 mRNA的抑制作用
1、SiRNA的选择：本发明选择了针对PLK1 mRNA编码区的SiRNA分子共10个，即上表所列的10个SiRNA分子。攻击位点从起始密码的243-1599之间，每条SiRNA分子中19个互补成双链的核苷酸序列中的G/C在37％-63％之间。
2、10种SiRNA对SW480细胞PLK1 mRNA表达的作用：
A、浓度为50nM的10个SiRNA对SW480细胞PLK1 mRNA的作用：
用50nM的这10种SiRNA作用于SW480细胞72小时后，观察它们对PLK1 mRNA水平的作用时发现第1、4、9号SiRNA分子对PLK1的抑制作用最为明显，分别达到91％、94％和89％。另外，第2、3、5、7、8对PLK1 mRNA的抑制作用也大于50％，而第6、10 A对PLK1 mRNA的也有相当的抑制作用(图1)。
B、第1、4、9号SiRNA以及它们混合物对SW480细胞PLK1 mRNA抑制作用的浓度效应：
为了观察以上对PLK1 mRNA具有最佳抑制效果的1、4、9号SiRNA对PLK1作用的浓度效应，我们选择了浓度从0.1到50nM SiRNA以及3种SiRNA的混合物(总浓度与上述浓度相等，每种SiRNA在其中占的比率各为1/3)。结果发现三种SiRNA对PLK1 mRNA抑制作用具有明显的浓度效应，当浓度达到12.5nM时抑制作用已经达到最大，三种SiRNA的IC50分别为2.85nM、3.80nM和4.42nM。结果还发现，相同浓度三种SiRNA的混合物对PLK1的抑制作用比单独使用一种SiRNA的抑制作用更强，其最大抑制浓度为6.25nM，IC50为1.38nM(图2)。
3、第1、4、9号SiRNA以及它们混合SiRNA对SW480细胞数的影响：
由于在实验中发现用1、4、9号SiRNA和三种SiRNA的混合物作用于细胞后观察到SW480细胞数发生明显减少。因此，我们观察了这三种SiRNA及其混合物对SW480细胞作用后细胞数目的改变。结果发现，三种SiRNA以及它们的混合物作用于SW480后可导致细胞数目明显减少。三种单独使用的SiRNA对SW480细胞数减少最大的作用浓度在12.5nM左右，1、4、9号SiRNA对细胞数减少作用的IC50值分别为4.44nM、3.83nM和4.34nM。相比较而言，三种SiRNA的混合物对细胞数减少的作用比单独使用一种SiRNA效果要更强，其最大作用效应浓度在3nM左右，IC50浓度为1.23nM(图3)。
4、第1、4、9号SiRNA分子和它们的混合物作用于SW480细胞系统，对其存活率的影响：
用不同浓度的三种SiRNA以及它们的混合物作用于SW480细胞后，观察细胞存活率的改变时发现单独使用一种SiRNA对细胞的存活率无明显的降低作用，只有当它们各自的浓度大于6.6nM时才会使细胞的存活率略有下降，当浓度达到50nM时细胞的存活率仍在80％左右。但是，三种SiRNA混合物对细胞存活率的影响要大于单独使用一种SiRNA。其抑制作用在1nM时已出现，到50nM时细胞的存活率为75％(图4)。
5、第1、4、9号SiRNA分子和它们的混合物对乳腺癌细胞、胃癌细胞和肝癌细胞PLK1 mRNA表达的作用。
用50nM的三种SiRNA以及它们的混合物(总浓度与上述浓度相等，P1、P4、P9的摩尔浓度比为40∶20∶40)作用于乳腺癌Bcap-37、胃癌细胞D6，肝癌细胞SMMU-7721后72小时发现这三种SiRNA以及它们的混合物对上述三种肿瘤细胞PLK1 mRNA表达都有明显的抑制效应。其中，对Bcap-37细胞的抑制率在70％-75％；对D6细胞的抑制率在67％-73％；对SMMU-7721细胞的抑制率在74％-80％(图5)。
7、第1、4、9号SiRNA分子和它们的混合物对乳腺癌细胞、胃癌细胞和肝癌细胞细胞数的作用。
用50nM的三种SiRNA以及它们的混合物(总浓度与上述浓度相等，P1、P4、P9的摩尔浓度比为40∶20∶40)作用于乳腺癌Bcap-37、胃癌细胞D6，肝癌细胞SMMU-7721后72小时发现这三种SiRNA以及它们的混合物可以使上述三种肿瘤细胞的细胞数明显减少。其中，它们可使Bcap-37的细胞数减少80％-87％；可使D6细胞的细胞数减少76％-81％；可使SMMU-7721的细胞数减少80％-86％(图6)结果还表明，三种SiRNA的混合物对细胞数减少的效应要好于单独使用一种SiRNA。
实施例4 SiRNA的修饰
如上所述，修饰的种类可分三大类并且每一类中有许多变化，因此它们各自的合成方法不尽一样。这里列举两种最为常见的SiRNA修饰方法。并且，下述的方法并不限制本发明所述的有关对SiRNA修饰的保护范围。
1、硫化
硫化是指将核苷磷酸二酯键上的一个氧原子转变成硫原子形成核苷硫代磷酸二酯。由于整个SiRNA的其它组成结构没有变化，因此它的合成和实施例1的SiRNA合成过程基本一样。只需将合成过程中的氧化反应变成硫化反应，在此反应中加入适当的硫化试剂，例如3H-1，2-benzodithiol-3-one 1，1-dioxide(又称Beaucage试剂)。
2、核苷2’位羟基的修饰
核苷2’位羟基的修饰是指用各种饱和烷氧基或不饱和烷氧来取代核苷五员糖环上的2’位羟基。其中最常见的是用甲氧基来取代核苷2’位的羟基。SiRNA的核苷2’位甲氧基化的合成和实施例1的SiRNA的合成步骤基本一致，只需要在偶合反应中用2’-甲氧基核苷亚磷酰胺来取代2’-叔丁基二甲基硅氧基核苷亚磷酰胺即可。
序列表
<110>杭州新瑞佳生物医药技术开发有限公司
<120>有效抑制肿瘤细胞PLK1 mRNA的SiRNA分子
<160>11
<210>1
<211>2204
<212>DNA
<213>human polo-like kinase 1(PLK1)
<220>
<221>misc_feature
<222>1...2204
<223>cDNA序列
<400>1
GAGCGGTGCG GAGGCTCTGC TCGGATCGAG GTCTGCAGCG CAGCTTCGGG AGCATGAGTG 60
CTGCAGTGAC TGCAGGGAAG CTGGCACGGG CACCGGCCGA CCCTGGGAAA GCCGGGGTCC 120
CCGGAGTTGC AGCTCCCGGA GCTCCGGCGG CGGCTCCACC GGCGAAAGAG ATCCCGGAGG 180
TCCTAGTGGA CCCACGCAGC CGGCGGCGCT ATGTGCGGGG CCGCTTTTTG GGCAAGGGCG 240
GCTTTGCCAA GTGCTTCGAG ATCTCGGACG CGGACACCAA GGAGGTGTTC GCGGGCAAGA 300
TTGTGCCTAA GTCTCTGCTG CTCAAGCCGC ACCAGAGGGA GAAGATGTCC ATGGAAATAT 360
CCATTCACCG CAGCCTCGCC CACCAGCACG TCGTAGGATT CCACGGCTTT TTCGAGGACA 420
ACGACTTCGT GTTCGTGGTG TTGGAGCTCT GCCGCCGGAG GTCTCTCCTG GAGCTGCACA 480
AGAGGAGGAA AGCCCTGACT GAGCCTGAGG CCCGATACTA CCTACGGCAA ATTGTGCTTG 540
GCTGCCAGTA CCTGCACCGA AACCGAGTTA TTCATCGAGA CCTCAAGCTG GGCAACCTTT 600
TCCTGAATGA AGATCTGGAG GTGAAAATAG GGGATTTTGG ACTGGCAACC AAAGTCGAAT 660
ATGACGGGGA GAGGAAGAAG ACCCTGTGTG GGACTCCTAA TTACATAGCT CCCGAGGTGC 720
TGAGCAAGAA AGGGCACAGT TTCGAGGTGG ATGTGTGGTC CATTGGGTGT ATCATGTATA 780
CCTTGTTAGT GGGCAAACCA CCTTTTGAGA CTTCTTGCCT AAAAGAGACC TACCTCCGGA 840
TCAAGAAGAA TGAATACAGT ATTCCCAAGC ACATCAACCC CGTGGCCGCC TCCCTCATCC 900
AGAAGATGCT TCAGACAGAT CCCACTGCCC GCCCAACCAT TAACGAGCTG CTTAATGACG 960
AGTTCTTTAC TTCTGGCTAT ATCCCTGCCC GTCTCCCCAT CACCTGCCTG ACCATTCCAC 1020
CAAGGTTTTC GATTGCTCCC AGCAGCCTGG ACCCCAGCAA CCGGAAGCCC CTCACAGTCC 1080
TCAATAAAGG CTTGGAGAAC CCCCTGCCTG AGCGTCCCCG GGAAAAAGAA GAACCAGTGG 1140
TTCGAGAGAC AGGTGAGGTG GTCGACTGCC ACCTCAGTGA CATGCTGCAG CAGCTGCACA 1200
GTGTCAATGC CTCCAAGCCC TCGGAGCGTG GGCTGGTCAG GCAAGAGGAG GCTGAGGATC 1260
CTGCCTGCAT CCCCATCTTC TGGGTCAGCA AGTGGGTGGA CTATTCGGAC AAGTACGGCC 1320
TTGGGTATCA GCTCTGTGAT AACAGCGTGG GGGTGCTCTT CAATGACTCA ACACGCCTCA 1380
TCCTCTACAA TGATGGTGAC AGCCTGCAGT ACATAGAGCG TGACGGCACT GAGTCCTACC 1440
TCACCGTGAG TTCCCATCCC AACTCCTTGA TGAAGAAGAT CACCCTCCTT AAATATTTCC 1500
GCAATTACAT GAGCGAGCAC TTGCTGAAGG CAGGTGCCAA CATCACGCCG CGCGAAGGTG 1560
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TGCACCTCAG CAACGGCAGC GTGCAGATCA ACTTCTTCCA GGATCACACC AAGCTCATCT 1680
TGTGCCCACT GATGGCAGCC GTGACCTACA TCGACGAGAA GCGGGACTTC CGCACATACC 1740
GCCTGAGTCT CCTGGAGGAG TACGGCTGCT GCAAGGAGCT GGCCAGCCGG CTCCGCTACG 1800
CCCGCACTAT GGTGGACAAG CTGCTGAGCT CACGCTCGGC CAGCAACCGT CTCAAGGCCT 1860
CCTAATAGCT GCCCTCCCCT CCGGACTGGT GCCCTCCTCA CTCCCACCTG CATCTGGGGC 1920
CCATACTGGT TGGCTCCCGC GGTGCCATGT CTGCAGTGTG CCCCCCAGCC CCGGTGGCTG 1980
GGCAGAGCTG CATCATCCTT GCAGGTGGGG GTTGCTGTGT AAGTTATTTT TGTACATGTT 2040
CGGGTGTGGG TTCTACAGCC TTGTCCCCCT CCCCCTCAAC CCCACCATAT GAATTGTACA 2100
GAATATTTCT ATTGAATTCG GAACTGTCCT TTCCTTGGCT TTATGCACAT TAAACAGATG 2160
TGAATATTCA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 2204
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CGGCAGCGUG CAGAUCAACT T 21
Claims (22)
1、有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，它为双链RNA分子并且其核苷酸序列与具有以下特征的核苷酸序列(I)至少70％的同源度：正义链和反义链的长度均为21个核苷酸，正义链和反义链各自的3’端为两个连续的脱氧胸苷酸(TT)，两条链除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补形成双链，正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和序列表第1号序列中连续两个碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，每条链中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为大于25％小于75％(即G/C比例)。
2、如权利要求1所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)为：
正义链：GAUUGUGCCUAAGUCUCUGTT，反义链：CAGAGACUUAGGCACAAUCTT。
3、如权利要求1所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)为：
正义链：AGCCCUGACUGAGCCUGAGTT，反义链：CUCAGGCUCAGUCAGGGCUTT。
4、如权利要求2所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)为：
正义链：AUUGUGCUUGGCUGCCAGUTT，反义链：ACUGGCAGCCAAGCACAAUTT。
5、如权利要求2所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)为：
正义链：UGAAGAUCUGGAGGUGAAATT，反义链：UUUCACCUCCAGAUCUUCATT。
6、如权利要求2所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)为：
正义链：AGAGCACAGUUUCGAGGUGTT，反义链：CACCUCGAAACUGUGCUCUTT。
7、如权利要求2所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)为：
正义链：GGUUUUCGAUUGCUCCCAGTT，反义链：CUGGGAGCAAUCGAAAACCTT。
8、如权利要求2所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)为：
正义链：GAGGAGGCUGAGGAUCCUGTT，反义链：CAGGAUCCUCAGCCUCCUCTT。
9、如权利要求2所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)为：
正义链：GAUCACCCUCCUUAAAUAUTT，反义链：AUAUUUAAGGAGGGUGAUCTT。
10、权利要求1至9中的任一所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，所述同源度以80％以上为佳。
11、权利要求1至9中的任一所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)的任何部份或全部经化学修饰后所形成的的小干扰核糖核酸分子。
12、如权利要求11中所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，所述化学修饰包括对连接核苷酸的磷酸二酯键的部份修饰或用其它任何化学键取代。
13如权利要求11中所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，所述化学修饰包括对这些SiRNA分子侧链上核糖的2位上的OH作任何化学的修饰和改变，和碱基上任何位置作化学修饰或改变。
14、权利要求1至9中的任一所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)在制备治疗抗肿瘤与肿瘤相关的任何疾病的药物中的应用。
15、如权利要求10所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)在制备治疗抗肿瘤、肿瘤相关的任何疾病、与PLK1表达增加相关的任何疾病的药物中的应用。
16、如权利要求11所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)在制备治疗抗肿瘤、与肿瘤相关的任何疾病、与PLK1表达增加相关的任何疾病的药物中的应用。
17、如权利要求12所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)在制备治疗抗肿瘤、与肿瘤相关的任何疾病、与PLK1表达增加相关的任何疾病的药物中的应用。
18、如权利要求13所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)在制备治疗抗肿瘤、与肿瘤相关的任何疾病、与PLK1表达增加相关的任何疾病的药物中的应用。
19、一种有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)的混合物，其特征在于它为与权利要求2所述的小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子、与权利要求5所述的小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子、与权利要求9所述的小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子中任意两种以上任意配比的混合物。
20、如权利要求19所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)的混合物，其特征在于它为与权利要求2所述的小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子、与权利要求5所述的小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子、与权利要求9所述的小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子以任意配比混合而成的混合物。
21、如权利要求20所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)的混合物，其特征在于与权利要求2所述的小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子、与权利要求5所述的小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子、与权利要求9所述的小干扰核糖核酸分子同源度70％以上的小干扰核糖核酸分子，它们之间以以下的摩尔比为佳：(20-80)∶(20-80)∶(20-80)。
22、如权利要求19所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对PLK1 mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)的混合物，其特征在于所述同源度以80％以上为佳。
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