CN1498276A - 通过三螺旋相互作用纯化与检测双链dna靶序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的双链DNA靶序列，该序列能够与第三链相互作用，生成稳定的三螺旋。本发明还涉及纯化双链DNA分子的方法，根据该方法，让含有所述DNA分子的溶液与第三链DNA接触，该第三链能够通过杂交与所述DNA分子所带的双链DNA靶序列生成三螺旋结构。

Description

通过三螺旋相互作用纯化与检测双链DNA靶序列的方法
本发明涉及能够形成三螺旋类型结构的新DNA靶序列，以及新的DNA纯化方法。更具体地，本发明的纯化方法在DNA靶序列与寡核苷酸之间实施杂交。本发明的方法显得特别有效，因为该方法能够纯化具有药物性能的双链DNA，并且产率很高。
本发明还有一个目的是含有所述特定靶序列的DNA分子的新的检测、定量分析、分离或筛选方法。
本发明的纯化方法基本上基于特定DNA靶序列与由天然或修饰碱基组成的寡核苷酸之间的三螺旋相互作用。
曾证明，同嘧啶(homopyrimidine)寡核苷酸能够特异地在DNA双螺旋大沟中进行相互作用，局部地形成三链结构，该结构称为三螺旋(Moser等人，科学，238(1987)645；Povsiz等人，J.Am.Chem.111(1989)3059)。这些寡核苷酸可选择性地在寡嘌呤-寡嘧啶序列处识别DNA双链，即在一条链具有寡嘌呤序列，而另一条互补链具有寡嘧啶序列的区域，并且它们在此处局部形成三螺旋。第三链同嘧啶寡核苷酸的碱基与Watson-Crick碱基对的嘌呤形成氢键(Hoogsteen型键)。
同样地，可能在同嘌呤寡核苷酸与同嘌呤-同嘧啶双链DNA之间形成三螺旋类型结构。在这类结构中，这些寡核苷酸的嘌呤碱基与双链DNA的嘌呤碱基生成反Hoogsteen型键。
Looney等人(科学，241(1988)456)为了控制某些基因表达以及Hélène等人(BBA 1049(1990)99；WO95/18223)，都曾特别地运用过这些位点特异性三螺旋的相互作用，Hélène等人描述了在启动子或编码区内存在的寡核苷酸与靶序列之间生成三螺旋结构，因此描述了实际上通过在起始和/或延长时聚合酶RNA的抑制作用，有可能调节这些基因表达状况。
在有关纯化质粒DNA的国际申请WO96/18744中，曾描述过使用这类三螺旋相互作用从含有与其它成分混合的DNA分子的复杂混合物中纯化质粒DNA。更特别地，该申请描述了一种双链DNA的纯化方法，该方法在于让这种复杂混合物与载体接触，在该载体上以共价方式偶合了能够通过杂交与DNA特定靶序列形成三螺旋的寡核苷酸。
在用于纯化的这种特异的三螺旋类相互作用中，该特异性是由于，在由寡核苷酸构成的第三链的胸腺嘧啶(T)碱基与双链DNA的AT碱基对之间，Hoogsteen类氢键起配对作用，生成三联体T*AT。同样地，位于第三链中的质子化胞嘧啶与双链DNA的GC碱基对配对以形成三联体+C*GC(Sun等人，Curr.Opin Struc.Biol.3(1993)345)。直到现在仍确定，这些三联体T*AT和+C*GC(称之典范三联体)保证了三螺旋的最大稳定性。但是，在三螺旋稳定作用中还涉及许多其它的因素，例如胞嘧啶百分数、pH、三螺旋的介质或环境的盐浓度。还曾充分地描述过加入所谓的非典范三联体(即与三联体T*AT和+C*GC不同的三联体)可引起在三螺旋处或多或少的结构变形，系统地导致三螺旋显著去稳作用。还曾在对比研究范围内研究过加入不同的非典范三联体(Roberts等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，9397；Fossella等人(1993)，核酸研究(Nucleic Acid Research)，21，4511；Govers等人，核酸研究，(1997)25，3787)，表明三螺旋随加入的非典范三联体性质的变化而产生变化的去稳作用。
如果这个方法允许快速有效的纯化具有药理性质的靶DNA，则仍然需要足够长的序列，优选地完全同嘌呤的序列，这种序列处在待纯化DNA两链中的一链上，并与第三链DNA互补。这种序列可以天然地存在于或人工插入所希望纯化的双链DNA靶序列中。
本申请人现在令人惊奇地、意外地发现在一条链上带一种不完全由嘌呤碱基组成的DNA靶序列的DNA分子也能够与DNA第三链形成稳定的三螺旋结构，尽管存在与导致生成非典范三联体的寡核苷酸碱基非互补的碱基。
更确切地，本申请人新确定的双链DNA靶序列，在一条链上有一个被确定数目的嘧啶碱基间隔的同嘌呤序列。本申请人还发现这些部分同嘌呤-部分同嘧啶DNA序列，可以用于通过三螺旋相互作用有效纯化含有它们的DNA分子。
这些新确定的序列对于检测、定量分析、分离或筛选含有它们的DNA分子还是特别有效的。
因此，本发明的目的是新的DNA靶序列，在一条链上含有具有下述通式的序列：
5′-(R)n-(N)t-(R′)m-3′
式中R和R′代表只是由嘌呤碱基组成的核苷酸；
n和m是小于9的整数，n+m之和大于5；
N是同时含有嘌呤碱基和嘧啶碱基的核苷酸序列；
t是小于8的整数；
所述的DNA序列能够与DNA第三链相互作用，因此导致生成三螺旋的结构。
分别位于DNA靶序列5′和3′部分的同嘌呤序列R和R′因此具有总长度高于或等于6。它们含有能够与第三链相互作用的腺嘌呤和鸟嘌呤碱基，以导致生成由典范三联体T*AT和+C*GC构成的三螺旋结构。优选地，同嘌呤序列R和R′总共含有至少2个鸟嘌呤和至少2个腺嘌呤。更优选地，这些嘌呤序列含有(AAG)类结构单元。
中心序列N的长度t小于8个嘌呤和嘧啶碱基对，并且根据本发明能够与DNA第三条链相互作用，以便导致生成非典范的三联体。优选地，中心序列N的长度大于或等于1，而小于8。更优选地，中心序列N的长度大于或等于2，而小于8。
术语“典范三联体”，它应当理解成，由双链DNA的双联体AT和GC分别与T和+C相互作用得到的三联体T*AT和+C*GC这两个核苷酸三联体。这两个三联体属于现有的16个三联体，它们具有最强的稳定性。
术语“非典范的三联体”，它应当理解是所有14个其它的核苷酸三联体。它们由双链DNA与DNA第三链非特异性地相互作用得到，与典范三联体T*AT和+C*GC相比，它们的稳定性较小。特别地可以列举非典范的三联体T*CG和T*GC，它们是分别通过靶序列的双联体CG或GC与第三链的胸腺嘧啶(T)相互作用生成的，非典范的三联体G*CG是由靶序列的双联体CG与第三链的鸟嘌呤(G)相互作用得到的，非典范的三联体C*AT和C*TA是分别由靶序列的双联体AT和TA与位于第三链上的胞嘧啶(C)相互作用得到的，非典范的三联体G*CG是通过双联体CG与第三链的鸟嘌呤(G)相互作用得到的，或三联体T*TA是由双联体TA与第三链的胸腺嘧啶(T)相互作用得到的。
应当充分理解，类似于在5′和3′处的嘌呤末端，中心序列N也可以生成典范三联体T*AT和+C*GC，它们分别是由双联体AT和GC与位于DNA第三链上的胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)碱基相互作用得到的。
优选地，中心序列N含有导致生成至多6个非典范三联体的嘌呤和嘧啶碱基。更优选地，由中心部分与寡核苷酸相互作用得到的这些非典范三联体选自非典范三联体T*CG、T*GC、C*AT和C*TA。作为这些三联体优选分布实例，可以列举生成六个非典范三联体，其中包括一个C*AT、一个C*TA、两个T*CG和两个T*GC，生成五个非典范三联体，其中包括两个C*AT和三个T*GC，或生成三个非典范三联体，其中包括两个T*GC和一个C*AT。也可以有多个非典范三联体T*TA，但在这种情况下，它不是连续地存在于三螺旋中。
该中心序列优选地含有至多三个导致生成非典范三联体T*CG和C*TA或G*TA的嘧啶碱基C或T。优选地，三个嘧啶碱基不是连续的，而是用嘌呤碱基A或G间隔的，它们可以与DNA的第三链相互作用，生成非典范碱基T*GC和C*AT以及典范三联体T*AT和+C*GC。
根据本发明一种特别实施方式，双链DNA的靶序列是序列5′-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3′(SEQ ID No.1)。
DNA第三链能够与本发明双链DNA的序列相互作用，该DNA第三链例如可以是寡核苷酸，或是局部未配对的另一个双链DNA的链，并且可以含有下述碱基：
-胸腺嘧啶(T)，它能够与双链DNA靶序列的双联体AT生成典范三联体T*AT，以及分别与DNA靶序列的双联体CG和GC生成非典范三联体T*CG和T*GC(Soyfer等人，三螺旋核酸(Triple HelicalNucleic Acids)(1996)Springer，纽约，第151-193页)；
-鸟嘌呤(G)，它能够与双螺旋DNA的双联体TA生成三联体G*TA(Soyfer等人，三螺旋核酸(1996)Springer，纽约，第151-193页)；
-胞嘧啶(C)，它能够分别与靶双螺旋DNA双联体GC、AT和TA生成典范三联体+C*GC(质子化胞嘧啶C+)或非典范三联体C*AT和C*TA；以及
-尿嘧啶，它与靶序列的碱基对AU或AT生成三联体(Bates等人，核酸研究，23(1995)3627)。
优选地，所使用DNA的第三链含有富含胞嘧啶的同嘧啶序列，它们在酸性pH以质子化状态存在，并且使三螺旋稳定。这样一些寡核苷酸例如可以含有序列(CCT)n、序列(CT)n或序列(CTT)n，其中n是1-20的整数。使用(CT)n、(CTT)n类序列，或组合了结构单元(CCT)、(CT)或(CTT)的序列是特别有利的。
DNA的第三链呈寡核苷酸形式时，该链可以是天然的链，即由未修饰天然碱基组成的链，或也可以是化学修饰的。特别地，该寡核苷酸可以有利地有某些化学修饰，这些修饰能够增加对核酶的抗性或保护，或增加其对特异序列的亲合性。
根据本发明，关于寡核苷酸，它应当理解是进行了骨架修饰的所有核苷酸链，其修饰目的在于可使其变得对核酶有更强的抗性。在可能的修饰之中，可以列举硫代磷酸酯寡核苷酸，它们能够与DNA生成三螺旋(Xodo等人，核酸研究，22(1994)3322)，以及具有膦酸甲酯或膦酸甲乙酯(formacetal phosphonate)骨架的寡核苷酸(Matteucci等人，J.Am.Chem.Soc.，113(1991)7767)。还可以使用用核苷酸α-异头物合成的寡核苷酸，它们也与DNA生成三螺旋(Le Doan等人，核酸研究，15(1987)7749)。另外一种骨架修饰是磷酰胺键。例如可以列举Gryaznov等人(J.Am.Chem.Soc.，116(1994)3143)描述的N3′-P5′磷酰胺核苷酸间键，它们提供的寡核苷酸与DNA生成特别稳定的三螺旋。在其它的骨架修饰中，还可以列举使用核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖或磷酸二酯(Sun等人，Curr.Opinion in Struct.Biol.，3(1993)3143)。最后，含磷骨架可以用聚酰胺骨架替换，如在PNA(肽核酸)中，它们也可以形成三螺旋(Nielsen等人，科学，254(1991)1497；Kim等人，J.Am.Chem.Soc.，115(1993)6477-6481)。
第三链的胸腺嘧啶也可以用5-溴尿嘧啶置换，这样增加了寡核苷酸对DNA的亲合性(Povsic等人，J.Am.Chem.Soc.，111(1989)3059)。第三链还可以含有非天然碱基，其中可以列举7-脱氮-2′-脱氧黄嘌呤核苷(Milligan等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，21(1993)327)、1-(2-脱氧-α-D-呋喃核糖基(ribofuranosyl))-3-甲基-5-氨基-1H-吡唑[4，3-d]嘧啶-7-酮(Koh等人，J.Am.Chem.Soc.，114(1992)1470)、8-氧代腺嘌呤、2-氨基嘌呤、2′-O-甲基-假异胞苷，或本技术领域的技术人员已知的任何其它修饰(Sun等人，Curr.Opinion in Struct.Biol.，3(1993)345)。
第三链其它类型的修饰更特别地涉及改善第三链与特异序列之间的相互作用和/或亲合力。尤其，根据本发明十分有利的修饰在于使寡核苷酸的胞嘧啶的5位甲基化。如此甲基化的寡核苷酸在比较接近中性的pH范围(≥5；Xoda等人，核酸研究，19(1991)5625)，具有与特异序列形成稳定的三螺旋的显著性能。因此，有可能在比现有技术的寡核苷酸更高pH下操作，即在质粒DNA降解危险性相当低的pH下操作。
本技术领域的技术人员可以根据所研究相互作用的选择性与稳定性逐个调整其长度。
本发明的DNA第三链可以采用任何已知技术进行合成。特别地，它们可以采用核酸合成器进行制备。本技术领域的技术人员已知的任何其它方法显然都可以使用。
这些DNA的第三链或这些寡核苷酸能够与如前面所描述的双链DNA的特异序列生成三螺旋，该序列包括长度小于8个核苷酸的混合(嘧啶-嘌呤)内区N，内区两侧有两个同嘌呤区R和R′。后者如可以包括GAA类型的结构单元。
作为实例，可以列举双链DNA靶序列，它相应于序列：5′-AA GAAGCA TGC AGA GAA GAA-3′(SEQ ID No.1)，它能够与含有选自下述序列的序列的寡核苷酸生成三螺旋：
5′-TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3′(SEQ ID No.2)
5′-TT CTT CTT GCT TCT CTT CTT-3′(SEQ ID No.3)
5′-TT CTT CTT GTT TCT CTT CTT-3′(SEQ ID No.4)，和
5′-TT CTT CTT CCT TCT CTT CTT-3′(SEQ ID No.5)。
在Mg2+存在下可以生成三螺旋，Mg2+可能有利于稳定这种结构(Vasquez等人，生物化学(Biochemistry)，34(1995)7243；Beal等人，科学，251(1991)1360)。
根据一种优选实施方式，本发明DNA靶序列可以天然地存在于双链DNA上，这时，特别有意义的是使用能够与例如在目的基因序列中存在的这样一种序列生成三螺旋的寡核苷酸，该目的基因例如是有治疗或实验意义的基因或标记基因。为此，本申请人分析了不同目的基因的核苷酸序列，并且试验了三螺旋与(CTT)n类寡核苷酸相互作用的稳定性，其表明，这些基因的某些区导致生成稳定的三螺旋，尽管存在非典范三联体，例如T*CG、T*GC、C*AT、C*TA和T*TA。
在双链DNA上自然存在的序列中，可以列举序列5′-AA GAAGCA TGC AGA GAA GAA-3′(表示ID1)(SEQ ID No.1)，它存在于人基因FGF1序列中(Jaye等人，科学，233(1986)541)；序列5′-GAA GAAGCA CGA GAA G-3′(SEQ ID No.6)，它存在于编码参与凝血的因子IIX的人基因序列(Kurachi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)，6461)；5′-AAA GAA AGC AGG GAA G-3′(SEQ ID No.7)和5′-GAAGAG GAA GAA G-3′(SEQ ID No.8)，它们存在于分泌性碱性磷酸酶SeAP基因序列(Millan等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，261(1986)3112)；序列5′-AAG GAG AAG AAG AA-3′(SEQ ID No.9)，它是α-胎儿蛋白hαFP的人基因序列(Gibbs等人，生物化学(Biochemistry)，26(1987)1332)；序列5′-AA GAT GAG GAA GAAG-3′(SEQ ID No.10)，它是能够控制再狭窄的人基因GAX序列(Gorski等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，13(1993)3722)；以及序列5′-GGC AAC GGA GGA A-3′(SEQ ID No.13)，它是人的基因VEGFB-167序列(Olofsson等人，生物化学杂志，271(1986)19310)。与在有治疗或实验意义的基因中存在的序列生成三螺旋是特别有利的，只要该靶序列自然存在于双链DNA分子上，并且不需要为往其中加入特异人工序列而修饰靶双链DNA或带这个基因的质粒。选择性地，靶序列还可以以人工方式加到双链DNA中。
本发明的第二个方面在于纯化双链DNA的方法，根据这种方法，让含有与其它组分混合的DNA的溶液同例如前面描述的DNA第三链接触，该第三链这时优选地是寡核苷酸，它能够通过杂交与在例如前面描述的双链DNA上存在的特异序列生成三螺旋。优选地，双链DNA在溶液中与固定在载体上的寡核苷酸进行接触。更优选地，该寡核苷酸以共价或非共价方式稳定地与所述载体偶合。因此，与含有双链DNA溶液进行接触的步骤可以有利地进行如下，即让与其它组分混合的DNA溶液通过已偶合寡核苷酸的载体，以便快速有效地得到希望纯化的双链DNA。
这样一些载体是本技术领域的技术人员熟知的，包括例如由像胶乳颗粒的珠或微颗粒，或任何其它悬浮液状载体构成的载体。该寡核苷酸还可以接枝在天然或合成的聚合物类分子上。优选地，固定该寡核苷酸的聚合物具有的性质，使得它在与双链DNA生成三螺旋后很容易与溶液分离。在天然聚合物中，可以列举蛋白质、脂类、糖或多元醇。在合成聚合物中，可以列举聚丙烯酰胺、聚乙二醇、苯乙烯衍生物或热敏性聚合物，例如像聚(N-异丙基丙烯酰胺)类化合物，它们在低温下是可溶的，在高于它们的相变温度时则变得不可溶(T.Mori等人，生物工艺学与生物工程学(Biotechnology and Bioengineering)，72(2001)261)。
本发明的纯化方法是特别有效的，因为它有可能纯化i)不含有足够长度(足以与同嘧啶寡核苷酸形成稳定三螺旋结构的长度)同嘌呤序列的DNA分子，但还可能纯化ii)其同嘌呤序列被几个嘧啶碱基间隔开的DNA分子。除了纯化各种各样DNA分子外，这种方法也是很快速的，并且达到特别高的产率和纯度。
另外，可以从含有其它核酸、蛋白质、内毒素(例如脂多糖)、核酸酶等的复杂混合物纯化DNA分子，并且得到具有药理性能的纯化DNA。
为了能使其共价偶合在载体上，寡核苷酸一般进行官能化。于是，可以用硫醇、胺或羧基末端基团在5′或3′位进行修饰。特别地，添加硫醇、胺或羧基基团有可能例如能够将寡核苷酸偶合在带二硫化物、马来酰亚胺、胺、羧基、酯、环氧化物、溴化氰或醛官能的载体上。通过在寡核苷酸与载体之间建立二硫化物、硫醚、酯、酰胺或胺键形成这些偶合。可以使用本技术领域的技术人员已知的任何方法，例如像双官能偶合剂。
另外，为了改善偶合寡核苷酸的杂交，可能有利的是，该寡核苷酸含有“臂”和“间隔区”碱基序列。使用臂事实上能够以所选择的距离在载体上固定寡核苷酸，因此能够改善与DNA的相互作用条件。该臂有利地由含有1-18个，优选地6-12个CH2类基团的直链碳链和能与该链连接的胺构成。该臂与寡核苷酸或由不参与杂交作用的碱基组成的“间隔区”的磷酸连接。因此，“间隔区”可以含有嘌呤碱基。作为实例，“间隔区”可以含有GAGG序列。
与纯化载体偶合的寡核苷酸例如可以有序列5′-GAGG CTT CTTCTT CTT CTT CTT CTT-3′(GAGG(CTT)7；SEQ ID No.11)，其中碱基GAGG不参与三螺旋结构，但这些碱基能够在寡核苷酸与偶合臂之间形成间隔。
为了实施本发明，可以使用不同类型的载体。可以是散装或预先填在柱中的官能化色谱载体、官能化塑料表面或磁性或非磁性的官能化胶乳珠。优选地，可以是凝胶渗透色谱载体。作为实例，这些可以使用的色谱载体例如是琼脂糖、丙烯酰胺或葡聚糖以及它们的衍生物(例如Sephadex，Sepharose，Superose等)，聚合物，例如聚(苯乙烯二乙烯苯)，或接枝或未接枝的二氧化硅。这些色谱柱可以扩散或灌注方式运行，或在所谓的“流化床”或“膨胀”系统中运行，同时使用其密度与这种特别实施方式相适应的色谱载体。
本发明的方法可以用于纯化任何类型的双链DNA，例如环状DNA，像小环(Darquet等人，基因治疗(Gene Therapy)，6(1999)209)，线性片段，一般带一个或多个有治疗或实验意义基因的质粒。这种质粒还可以带复制起点，例如调节型的(例如质粒pCOR，Soubrier等人在基因治疗，6(1999)1482中描述过这些质粒)，标记基因等。本发明的方法可以直接地应用于细胞溶胞产物。在这种实施方式中，采用先转化然后细胞培养方法扩增的质粒在细胞溶胞后直接进行纯化。本发明的方法还可以应用于清澈透明的溶胞产物，即应用于在中和与离心细胞溶胞产物后得到的上清液。当然还可以应用于采用已知方法预纯化的溶液。这种方法还能够由含有不同序列的DNA混合物纯化带目的序列的线性或环状DNA。本发明的方法还可以应用于纯化双链RNA。
细胞的溶胞产物可以是原核生物或真核生物细胞的溶胞产物。关于原核生物细胞，例如可以列举细菌E.Coli、B.Subtilis、S.Typhimurium、S.aureus或Streptomyces。关于真核生物细胞，可以列举动物细胞、酵母、真菌等，更特别地，克鲁维氏酵母属或糖酵母属酵母或COS、CHO、CI27、NIH3T3、MRC5、293等细胞。
本发明的方法是特别有利的，因为它能够简单快速地得到非常高纯度的质粒DNA。特别地，正如在实施例中所说明的，这种方法能够有效地从污染组分中分离出质粒DNA，污染组分为例如片段化的染色体DNA、RNA、内毒素、蛋白质或核酸酶。
本发明的方法对纯化与富集DNA分子，特别是有治疗意义基因(例如基因FGF1)的DNA分子也是有效的，它们可以工业规模生产与纯化，其纯度应该与药学应用相适应的。
根据第三个方面，本发明涉及一种检测、定量分析和筛选双链DNA分子的方法，该分子含有至少一种如前面描述的靶序列，该方法包括：a)让被怀疑含有所述分子的溶液与DNA的第三链，例如标记寡核苷酸进行接触，以便生成稳定的三螺旋；b)检测在双链DNA与DNA的第三链之间可能生成的配合物。
这种方法特别在分析基因组的范围内是有效的，例如有可能检测在基因组中特异DNA的序列或筛选特异序列。
根据本发明的这个方面，可以采用能被光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学的方法检测的标记物标记DNA的第三链或寡核苷酸。
例如，这样一些标记物可以由放射性同位素(32P、33P、3H、35S)或荧光分子(5-溴代脱氧尿苷、荧光素、乙酰基氨基芴、洋地黄毒苷)组成。
优选地，通过引物延伸将标记分子加入多核苷酸中，或通过在5′或3′端添加进行标记。
非放射性标记实例具体在法国专利FR 78 109 75或在Urdea等人(1988，核酸研究，11：4937-4957)或Sanchez-pescador等人(1988，J.Clin.Microbiol.，26(10)：1934-1938)文章中描述过。
根据本发明这个特别的方面，DNA的第三链或寡核苷酸还可以固定在例如前面描述的载体上。
本发明的第四个方面涉及用于纯化和/或检测在复杂混合物中存在的本发明双链DNA的箱或试剂盒，所述的箱有一种或多种如前面描述的寡核苷酸，这些寡核苷酸可能固定在载体上，和/或含有一个可检测的标记物。
根据本发明的这个方面，上面描述的检测盒，可以含有多种本发明的寡核苷酸，它们能够用于检测目的双链DNA靶序列。
于是，固定在载体上的寡核苷酸在基体中可以是有序的，例如“DNA芯片”。这样一些有序的基体具体地在US 5 143 854、专利申请PCT WO 90/150 70和92/10092中描述过。
高密度固定寡核苷酸的载体基体例如在US 5 412 087和专利申请PCT WO95/11995中描述过。
通过下述实施例将更详细地描述本发明，这些实施例应认为是说明性的，也是非限制性的。
图例：
图1：示意性表示质粒pXL3179；
图2：示意性表示质粒pXL3296；
图3：示意性表示质粒pXL3426；
图4：示意性表示质粒pXL3402；
图5：示意性表示质粒pXL3678；
图6：示意性表示质粒pXL3207；
图7：示意性表示质粒pXL3388；
图8：示意性表示质粒pXL3579；
图9：示意性表示质粒pXL3601和pXL3977。
克隆与分子生物学的一般技术
在文献(Maniatis等人，(1989)，分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York；Ausubel等人(1987)，分子生物学中的现有方案，John Willey and Sons，New York)中描述过分子生物学的经典技术，例如采用限制酶消化、凝胶电泳、DNA片段连接、在大肠杆菌中转化、核酸沉淀、测序等。这些限制酶由New-England Biolabs，Beverly，MA(Biolabs)提供。
使用Applied Biosystem公司的394DNA自动合成器，采用生产者的建议，运用用氰基乙基在α位保护的亚磷酰胺(Sinha等人，核酸研究，12(1984)4539；Giles(1985))，合成这些寡核苷酸。
合成具有亲合性凝胶所使用的寡核苷酸是从AmershamPharmacia Biotech公司(Uppsala，瑞典)或Eurogentec(Seraing，比利时)得到的，并且可以不经过修饰而使用。
允许复制质粒pCOR的菌株、这些质粒的生长与选择条件已经描述过(Soubrier等人，基因治疗，6(1999)1482)。
实施例1：质粒的构建
1.1质粒pXL 3179(pCOR-FGF1)
图1表示了质粒pXL3179，该质粒是一种由质粒pXL2774得到的载体(WO97/10343；Soubrier等人，基因治疗，6(1999)1482)，其中在来自人细胞巨化病毒(hcmv IE E/P)早期区的启动子和病毒SV40晚期区(SV40 late polyA；GenbankSC4CG)的聚腺苷化信号的控制下，引入人成纤维细胞干扰素的信号肽与FGF1(成纤维细胞生长因子1)cDNA的融合编码基因(sp-FGF1，Jouanneau等人，PNAS 88(1991)，2893)。
1.2质粒pXL 3296(pCOR)
质粒pXL3296由质粒pXL3179得到，该质粒pXL3179中用质粒pUC28的多克降位点替换了基因sp-FGF1的序列(Benes等人，基因，130(1993)151)。质粒pXL3296示于图2中。
1.3质粒pXL 3426(pCOR-ID1)
质粒pXL3426由质粒pXL3296得到，其质粒pXL3296中在BglII与XhoI之间插入了序列5′-GATCCAAGAAGCATGCAGAGAAGAATTC-3′。质粒pXL3426示于图3中。
实施例2：构建有靶序列的其它质粒
质粒pXL3675由质粒pXL3296得到，其质粒pXL3296中在HpaI与XbaI之间插入了序列5′-GAAGAAGGGAAAGAAGATCTG-3′；质粒pXL3676也由质粒pXL3296得到，其质粒pXL3296中在HpaI与XbaI之间插入了序列5′-GAAGAAAGGAGAGAAGATCTG-3′；最后质粒pXL3713，它含有在质粒pXL3296的位点HpaI与XbaI之间插入的DNA序列5′-GAAGAA GTT TAAGAA GATCTG-3′。如此构建的质粒采用CsCl氯化物梯度纯化，插入的序列采用测序法证实。这些制备物用于下面描述的实施例中。
实施例3：在构成稳定三螺旋的基因FGF1中20-mer内序列的鉴定
在下面实施例中描述的不同质粒可以在标准化条件下采用三螺旋相互作用的亲合色谱法进行色谱分离。使用SephacrylS-1000SF(Amersham Pharmacia Biotech)色谱载体，按照下述方式合成出亲合载体。第一步，SephacrylS-1000凝胶分散在0.2M醋酸钠缓冲液中，该凝胶用偏高碘酸钠活化(3mM，20℃，1小时)，然后第二步，通过在抗坏血酸(5mM)存在下的还原性氨基化反应，寡核苷酸借助其5′-NH2末端部分，与活化基体的醛基团进行偶合，其遵循与所描述的蛋白质偶合相类似的程序(Hornsey等人，J.Immunol.Methods，93(1986)83)。对于在本发明中涉及的所有实验，这些寡核苷酸都按照这个一般程序进行偶合，所有这些寡核苷酸都具有位于寡核苷酸5′末端的官能化臂NH2-(CH2)6-。
全都在下述条件下进行了旨在证明寡核苷酸与双链DNA之间生成三螺旋结构与测量其稳定性的实验。进行每个实验时，300微克纯化质粒用6毫升50mM醋酸钠(pH4.5)制成溶液，其中含有2M氯化钠，以流量30厘米/小时注入柱HR5/5(Amersham Pharmacia Biotech)上，该柱装有1毫升用本发明寡核苷酸官能化的亲合凝胶。在用5毫升同样缓冲液洗涤柱后，用3毫升含有0.5mM EDTA的100mMTris/HCl(pH9.0)柱缓冲液洗脱质粒，用pH 9.0缓冲液洗脱质粒的量，可采用i)测量该溶液在260nm处的吸收，与ii)采用MilliporeGenPak-Fax柱的阴离子交换色谱法(Marquet等人，BioPharm，8(1995)26)进行定量分析。
使用用5′-NH2-(CH2)6-TT(CTT)6-3′(SEQ ID No.2)官能化的柱，列在下表1的这些纯化结果证明了，与不含有任何人基因FGF1序列的、并且没有保留在上述柱上的对照质粒(pXL3296)相反，使用含有整个基因FGF1(pXL3179)或者人基因FGF1(pXL3426)的内序列ID 1的质粒，生成了稳定的三螺旋。
表1
    质粒     寡核苷酸序列质粒中靶序列 容量(每毫升凝胶固定的微克质粒)
  pXL3179(pCOR-FGF1)   TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-     175
  pXL3426(pCOR-ID1)   TT CTT CTT CTT CTT CTT CTTAA GAA GCA TGC AGA GAA GAA     130
  pXL3296(pCOR)   TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-     ＜1
采用亚克隆基因FGF1的尺寸越来越小的不同片段，鉴定了质粒pXL3426的序列。基因FGF1的表示为ID1 5′-AA GAA GCA TGCAGA GAA GAA-3′(SEQ ID No.1)的内序列因此与序列SEQ ID No.2的寡核苷酸生成三螺旋结构。得到的三螺旋结构含有两个嘧啶-嘌呤-嘧啶类型区(Py*PuPy)，构成了长度为6个单位(R，5′侧)和7个单位(R′，3′侧)的典范三联体T*AT和+C*GC，它们被7个三联体的内区(T)分开，其中6个三联体是非典范的三联体，并且更确切地含有两个三联体T*GC、两个三联体T*CG、一个三联体C*AT和一个三联体C*TA。
实施例4：在基因FGF1的20-mer内序列ID1中对三螺旋结构稳 定性所必需的碱基的鉴定
基于内序列ID1，制备出4种寡核苷酸。对于其中两种，在ID1的5′侧缺少了7或13个核苷酸，其它的在3′侧缺少了2、7或14个核苷酸。用寡核苷酸5′-TT(CTT)6-3′(SEQ ID No.2)或寡核苷酸FRB36、FRB38、FRB39或FRB40官能化的三螺旋相互作用柱进行色谱分离质粒pXL3426。然后，通过测定每种质粒在柱上保留量，试验了与多种截短的内序列ID1生成的三螺旋结构的稳定性。
表2
寡核苷酸     在质粒pXL3426中的靶序列 容量(每毫升凝胶固定的微克质粒)
  (CTT)7     AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA     130
  FRB36     -- --- --- --- --A GAA GAA     ＜1
  FRB38     AA GAA G-- --- --- --- ---     ＜1
  FRB39     AA GAA GCA TGC AG- --- ---     22
  FRB40     -- --- --A TGC AGA GAA GAA     33
上述表2列出的结果表明，质粒pXL3426的所有序列ID1(20-mer)对于与5′-TT(CTT)6-3′类寡核苷酸生成稳定的三螺旋结构是必不可少的。特别地，位于5′和3′末端的两个P*yPuPy部分以及中心部分对最后结构的稳定性起作非常大的协同作用。
实施例5：典范三联体与非典范三联体数对三螺旋稳定性的影响
修饰了寡核苷酸5′-TT(CTT)6-3′(SEQ ID No.2)的序列，并且试验了这些不同寡核苷酸(FRB15、FRB16与FRB17)与质粒pXL3426的内序列ID1(5′-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3′；SEQ ID No.1)生成稳定三螺旋的能力。
表3
 寡核苷酸     寡核苷酸的序列质粒中靶序列ID1 非典范三联体的数 容量(每毫升凝胶固定的微克质粒)
  (CTT)7   TT CTT CTT CTT CTT CTT CTTAA GAA GCA TGC AGA GAA GAA     6     130
  FRB15   TT CTT CTT GCT TCT CTT CTTAA GAA GCA TGC AGA GAA GAA     3     189
  FRB16   TT CTT CTT GTT TCT CTT CTTAA GAA GCA TGC AGA GAA GAA     4     171
  FRB17   TT CTT CTT CCT TCT CTT CTTAA GAA GCA TGC AGA GAA GAA     3     183
下表3中列出的结果表明，修饰寡核苷酸序列以增加典范三联体T*AT和+C*GC的数，从而有可能增加三螺旋结构的稳定性，增加T*AT和+C*GC的数量同时减少在三螺旋结构的中间内区N中非典范三联体数。
实施例6：非典范三联体对三螺旋结构稳定性的影响
修饰了含有基因FGF1内序列ID1(SEQ ID No.1)的质粒pXL3426序列，其中它能够与寡核苷酸5′-TT(CTT)6-3′(SEQ ID No.2)生成稳定的三螺旋，以便在中心区N加入两个T*GC类型的连续的相同非典范三联体，接着在其5′位加入一个C*AT非典范三联体(pXL3675)。在另一个实验中，加入了五个相继的非典范三联体C*AT、T*GC、T*GC、C*AT和T*GC(pXL3676)。最后，修饰质粒pXL3426序列，以便在中间区加入两个T*TA类型的连续非典范三联体，接着在其5′位加入一个C*TA非典范三联体(pXL3713)。
表4
    质粒     寡核苷酸序列质粒中靶序列 容量(每毫升凝胶固定的微克质粒)
    pXL3426     TT CTT CTT CTT CTT CTT CTTAA GAA GCA TGC AGA GAA GAA     112
    pXL3675     CTT CTT CTT CTT CTT CTGAA GAA GGG AAA GAA GA     99
    pXL3676     CTT CTT CTT CTT CTT CTGAA GAA AGG AGA GAA GA     78
    pXL3713     CTT CTT CTT CTT CTT CTGAA GAA GTT TAA GAA GA     ＜1
上表4列出的不同质粒纯化结果表明，当非典范中心区形成T*CG、T*GC、C*AT和C*TA类型的三联体时，形成了稳定的三螺旋结构。如由质粒pXL3675和pXL3676在亲合凝胶上固定产率所表明的，加入两个连续的非典范三联体T*GC时，也形成稳定的三螺旋结构，而不论其环境如何，即这些周围的三联体是典范或非典范性质的都如此。相反地，加入一对连续的T*TA类型三联体和三联体C*TA导致三螺旋结构完全去稳定。
实施例7：构建包括编码SeAP、hαFP、FIX和GAX基因的盒 的质粒
在这些证明本发明组合物活性实验中使用的基因例如是编码因子F IX的人基因(Kurachi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79(1982)6461)，编码分泌性碱性磷酸酶SeAP的人基因(Millan等人，生物化学杂志，261(1986)3112)，编码α-胎儿蛋白hαFP的人基因(Gibbs等人，生物化学，26(1987)1332)，和编码GAX的人基因(Gorski等人，分子细胞生物学，13(1993)3722)。这些基因用质粒或cDNA库(clontech)采用PCR进行扩增，然后在由pXL3296得到的质粒pCOR中，在真核细胞启动子CMv E/P下游与在SV40 late polyA信号序列上游进行克隆。分泌性碱性磷酸酶编码基因(SeAP)加到由pXL3296得到的质粒pCOR中，产生了质粒pXL3402(图4)。α-胎儿蛋白编码基因(hαFP)加到由pXL3296得到的质粒pCOR中，产生了质粒pXL3678(图5)。GAX编码基因加到由pXL3296得到的质粒pCOR中，产生了质粒pXL3207(图6)。因子FIX编码基因加到由pXL3296得到的质粒pCOR中，产生了质粒pXL3388(图7)。
实施例8：5′-(CTT)7-3′类型寡核苷酸与不同的目的基因形成稳定三螺旋结构的应用
通过测定带不同基因的质粒所达到的容量，研究过不同序列与用寡核苷酸5′-TT(CTT)6-3′(SEQ ID No.2)官能化的三螺旋相互作用凝胶的相互作用。研究的基因是i)编码因子IX的人基因，ii)分泌性碱性磷酸酶基因SeAP，iii)人α-胎儿蛋白基因(αFP)和iv)人GAX基因。
表5
  基因     基因中靶序列 容量(每毫升凝胶固定的微克质粒)
因子IX     GAA GAA GCA CGA GAA G     71
  SEAP     AA GAA AGC AGG GAA GGAA GAG GAA GAA G     100
  hαFP     AAG GAG AAG AAG AA     146
  hGAX     AA GAT GAG GAA GAA G     118
上表5列出的结果表明，使用(CTT)n类型的寡核苷酸与目的基因生成稳定三螺旋结构是可能的，尽管这种基因不含有与该寡核苷酸互补的5′-(GAA)n-3′类型的靶序列。在靶序列中心部分中存在一种参与T*CG、C*CG、T*GC和C*AT类型三联体的碱基是三螺旋结构所允许的，这与存在分离的三联体T*TA(基因GAX)一样。
实施例9：用5′-(CTT)7-3′类型寡核苷酸官能化的柱在纯化含有内序列ID1(5′-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3′：SEQ ID No.1)的 质粒中的应用
基于实施例8开始研究了使用三螺旋相互作用亲合色谱载体(被5′-(CTT)7-3′类型的寡核苷酸官能化)纯化如前面所描述的带5′-(R)n-(N)t-(R′)m-3′类型序列的质粒的可能性。
使用被寡核苷酸5′-NH2-(CH2)6-(CTT)7-3′官能化的SephacrylS-1000相互作用柱进行色谱分离质粒pXL3179(含有人基因FGF1，该人基因带序列5′-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3′)。为此，如实施例3中所描述的，以流量30厘米/小时将9.40毫克质粒pXL3179在60毫升50mM醋酸钠，2M氯化钠(pH4.5)缓冲液中的溶液注入10毫升亲合柱，该柱装有以共价方式与Sephacryl S-100 SF偶合的寡核苷酸5′-NH2-(CH2)6-(CTT)7-3′。在用5倍体积的同样缓冲液洗涤柱后，用2个柱体积的100mM Tris/HCl，0.5mM EDTA缓冲液洗脱，通过UV(260nm)吸收测量和GenPak-Fax柱离子交换色谱(Waters)进行定量分析。如在WO 96/18744中所描述的，采用PCR测量了在起始制剂和在纯化部分中大肠杆菌基因组的DNA含量。在洗脱部分中测得7.94毫克质粒pXL3179(洗脱产率，84％)，采用所述的亲合色谱，可将大肠杆菌基因组DNA的污染水平从7.8％降低到0.2％。同样地，RNA的污染水平从起始质粒中的43％降低到纯化质粒中的0.2％。
在用寡核苷酸5′-NH2-(CH2)6-(CTT)7-3′官能化的SephacrylS-1000亲合柱上色谱分离不同的质粒pXL3179制剂，从而进行的不同的色谱实验中，基因组的DNA含量从0.2％降低到0.007％，从0.7％降低到0.01％，从7.1％降低到0.2％或从7.8％降低到0.1％。
实施例10：5′-CCT TTT CCT CCT T-3′(SEQ ID No.1)类型寡核 苷酸在与有治疗意义人基因VEGFB-167生成稳定的三螺旋结构中的 应用
通过测量用带有人基因VEGFB-167的质粒pXL3579(图8)(Olofsson等人，生物化学杂志，271(1986)19310)所达到的容量，研究了有治疗意义基因(人基因VEGFB-167)的内序列与用寡核苷酸5′-CCT TTT CCT CCT T-3′(SEQ ID No.12)官能化的三螺旋相互作用载体的相互作用。在图9中列出的质粒pXL3579含有基因VEGFB-167，该基因由人心cDNA库(Clontech)采用PCR扩增，然后克隆在真核细胞启动子CMV E/P下游(-522/+74)和SV40 late polyA信号上游，并且位于pXL3296多克隆位点的位点NsiI与XbaI之间。
表6
    寡核苷酸 在基因(VEGFB-167或对照)中靶序列 容量(每毫升凝胶固定的微克质粒)
  CCT TTT CCT CCT T     GGC AAC GGA GGA A     87
    无(对照载体)     ＜0.5
    CCT CCT T     GGA GGA A     ＜0.5
    无(对照载体)     ＜0.5
  TTT TTT TTC CT     AAA AAA AAG GA     15
    无(对照载体)     ＜0.5
在上表6列出的结果表明，使用一种寡核苷酸，例如像寡核苷酸5′-CCT TTT CCT CCT T-3′(SEQ ID No.12)，其以5′-(R)n-(N)t-(R′)m-3′类型序列为靶标，(这里以人基因VEGFB-167的区5′-GGC AAC GGAGGA A-3′(SEQ ID No.13)为靶标)，与一种目的基因的区生成稳定的三螺旋结构，这是可能的。另外尽管人基因VEGFB-167含有寡核苷酸5′-TTT TTT TTC CT-3′(表6)的靶标同嘌呤序列5′-AAA AAA AAGGA-3′，用寡核苷酸5′-CCT TTT CCT CCT T-3′达到的相互作用大大高于用同嘧啶寡核苷酸达到的相互作用。同样地，同嘌呤内序列5′-GGA GGA A-3′的长度还不足以与寡核苷酸5′-CCT CCT T-3′生成稳定的三螺旋结构。
这个实施例因此还清楚地表明，5′-(R)n-(N)t-(R′)m-3′类型序列对于生成稳定的三螺旋结构所具有的优势，甚至在所研究的双链DNA还具有至少一种很长长度的同嘌呤结构的情况下也是如此。
实施例11：在修饰的VEGFB-186的cDNA中通过与靶序列生成 稳定的三螺旋结构，5′-T CCT CTC CCT C-3′(SEQ ID No.14)类型寡 核苷酸在分离未缺失VEGFB-186的cDNA中的应用
在人基因VEGFB-186发酵器的生产步骤过程中，观察到该基因特别是位于外显子6A处重排与遗传缺失的位点。与转译点+1相比，在核苷酸510(A/C)、513(C/T)、516(A/T)、519(C/T)和522(C/T)处，通过测序与诱变的PCR引入沉默的点突变。蛋白质VEGFB-186的氨基酸序列在氨基酸170-174之间保持不变。相反地，如此修饰的基因VEGFB-186(VEGFB-186m)具有本发明DNA靶序列5′-A GGA GCGGGA G-3′(SEQ ID No.15)，它能够与序列5′-T CCT CTC CCTC-3′(SEQ ID No.14)的寡核苷酸形成稳定的三螺旋相互作用。这种稳定的三螺旋相互作用可有利地用于实施本发明的方法，用于在发酵器中生成后分离未进行重排与缺失的修饰基因VEGFB-186。
为了说明通过修饰基因VEGFB-186三螺旋相互作用完成的纯化方法，曾使用如图9所表示的两种质粒pXL3601和pXL3977。基因VEGFB-186首先由人心cDNA库(Clontech)采用PCR扩增，然后在质粒pXL3296多克隆位点(实施例1.2)的位点 Nsil与 Xbal之间，在真核细胞启动子CMV E/P(-522/+74)下游与在病毒SV40晚期区的聚腺苷酰基化信号下游进行克隆，以产生质粒pXL3601。这后一质粒采用测序与诱变的PCR修饰，以产生质粒pXL3977，其中如前面所描述的在外显子6A处修饰基因VEGFB-186。
通过测量带有修饰人基因VEGFB-186的质粒pXL3977所达到的容量，研究了在基因VEGFB-186m中靶序列5′-A GGA GCG GGAG-3′(SEQ ID No.15)，与用寡核苷酸5′-T CCT CTC CCT C-3′(SEQ IDNo.14)官能化的三螺旋相互作用载体的相互作用(图9)。在VEGFB-186m的序列中含有序列VEGFB-187，例如在实施例10中描述的质粒pXL3579含有基因VEGFB-167，因此质粒pXL3579可用作负对照。
表7
寡核苷酸 pCOR-VEGFB-186m(pXL3977)(每毫升凝胶固定的微克质粒)  PCOR-VEGFB-167(pXL3579)(每毫升凝胶固定的微克质粒) 空pCOR(pXL3296)(每毫升凝胶固定的微克质粒)
 ID No.14  234  32 ＜1.0
 ID No.16  224  0.5-1.0 ＜1.0
上表7所列结果表明，使用一种寡核苷酸，例如像寡核苷酸(SEQID No.14)，以5′-(R)n-(N)t-(R′)m-3′类型序列为靶，这里以修饰人基因VEGFB-186的区5′-A GGA GCG GGA G-3′(SEQ ID No.15)为靶，与一种目的基因的区生成稳定的三螺旋结构，并且有效地进行纯化，这是可能的。寡核苷酸5′-TTT CCTCTC CCT C-3′(SEQ ID No.16)也可以用于纯化修饰人基因VEGFB-186。
                            序列表
<110>AVENTIS PHARMA SA
<120>通过三螺旋相互作用纯化与检测双链DNA靶序列的方法
<130>ST01011
<140>ST01011
<141>2001-03-21
<160>16
<170>PatentIn version 2.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>智人
<400>1
aagaagcatg cagagaagaa                                                20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸
<400>2
ttcttcttct tcttcttctt                                               20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸
<400>3
ttcttcttgc ttctcttctt                                               20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸
<400>4
ttcttcttgt ttctcttctt                                               20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸
<400>5
ttcttcttcc ttctcttctt                                                20
<210>6
<211>16
<212>DNA
<213>智人
<400>6
gaagaagcac gagaag                                                    16
<210>7
<211>16
<212> DNA
<213>智人
<400>7
aaagaaagca gggaag                                                    16
<210>8
<211>13
<212>DNA
<213>智人
<400>8
gaagaggaag aag                                                     13
<210>9
<211>14
<212>DNA
<213>智人
<400>9
aaggagaaga agaa                                                    14
<210>10
<211>15
<212>DNA
<213>智人
<400>10
aagatgagga agaag                                                   15
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸
<400>11
gaggcttctt cttcttcttc ttctt                                         25
<210>12
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸
<400>12
ccttttcctc ctt                                                      13
<210>13
<211>13
<212>DNA
<213>智人
<400>13
ggcaacggag gaa                                                     13
<210>14
<211>11
<212>DNA
<213>人1序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸
<400>14
tcctctccct c                                                       11
<210>15
<211>11
<212>DNA
<213>智人
<400>15
aggagcggga g                                                       11
<210>16
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸
<400>16
tttcctctcc ctc                                                       13

Claims (36)

1、双链DNA分子的纯化方法，其特征在于让所述的双链DNA分子与第三链DNA进行接触，所述的双链DNA分子含有至少一种下述通式的靶序列：
5′-(R)n-(N)t-(R′)m-3′
式中：
R′和R′代表只是由嘌呤碱基组成的核苷酸序列；
n和m是小于9的整数，且n+m之和大于5；
N是同时含有嘌呤碱基和嘧啶碱基的核苷酸序列；
t是小于8的整数；
所述的DNA序列能够与第三链DNA相互作用，生成三螺旋的结构。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于N区与第三链DNA之间的相互作用导致生成至多6个非典范三联体。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于如此生成的非典范三联体选自三联体T*CG、T*GC、C*AT和C*TA。
4、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于区R和R′含有总共至少两个鸟嘌呤(G)。
5、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于区R和R′含有至少两个腺嘌呤。
6、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于区R和R′与第三链DNA生成选自T*AT和+C*GC的典范三联体。
7、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于第三链DNA是同嘧啶类型的。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于第三链DNA含有聚-CTT序列。
9、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于第三链DNA是寡核苷酸。
10、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于在所述双链DNA分子上存在的靶序列含有序列SEQ ID No.1，所述的寡核苷酸选自序列SEQ ID No.2-5的寡核苷酸。
11、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于靶序列是在双链DNA分子上天然存在的，或是以人工方式加入到该双链DNA分子中的靶序列。
12、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于DNA分子上天然存在的靶序列是存在于具有治疗或实验意义基因的编码序列中的。
13、根据权利要求12所述的方法，其特征在于DNA靶序列含有在人基因FGF1中含有的全部或部分序列SEQ ID No.1。
14、根据权利要求12所述的方法，其特征在于DNA靶序列含有在编码因子IX的人基因中含有的序列SEQ ID No.6。
15、根据权利要求12所述的方法，其特征在于DNA靶序列含有在分泌性碱性磷酸酶的人基因中含有的序列SEQ ID No.7或No.8。
16、根据权利要求12所述的方法，其特征在于DNA靶序列含有在α胎儿-蛋白质的人基因中含有的序列SEQ ID No.9。
17、根据权利要求12所述的方法，其特征在于DNA靶序列含有在GAX人基因中含有的序列SEQ ID No.10。
18、根据权利要求12所述的方法，其特征在于DNA靶序列含有在人基因VEGFB167中含有的序列SEQ ID No.13。
19、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于双链DNA分子是环状DNA，例如质粒、小环或线性片段。
20、根据上述权利要求中任一权利要求所述的纯化方法，其特征在于寡核苷酸以共价或非共价方式稳定地偶合在载体上。
21、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于寡核苷酸接枝在天然或合成的聚合物上。
22、根据权利要求20所述的方法，其特征在于该载体选自官能化的胶乳珠、塑料表面和色谱载体。
23、根据权利要求22所述的方法，其特征在于该色谱载体是凝胶渗透载体。
24、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于含有所述双链DNA分子的溶液是一种细胞溶胞产物。
25、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于细胞溶胞产物是清澈的溶胞产物。
26、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于该双链DNA分子是预纯化的。
27、根据权利要求20-26中任一权利要求所述的方法，其特征在于该寡核苷酸具有序列GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(SEQID No.11)。
28、根据权利要求20-27中任一权利要求所述的方法，其特征在于该寡核苷酸通过二硫化物、硫醚、酯、酰胺或胺键与载体偶合。
29、根据权利要求20-28中任一权利要求所述的方法，其特征在于该寡核苷酸通过由碳链(CH2)n组成的臂固定在载体上，其式中n是1-18的整数，其中包括1和18，所述的臂通过磷酸与该寡核苷酸连接，并且通过胺键与载体连接。
30、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于该寡核苷酸有至少一个化学修饰，这样使其抗核酸酶或防止核酸酶作用，或增加其对特异序列的亲合性。
31、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于该寡核苷酸含有这样一种序列，即其中至少一个胞嘧啶在5′位被甲基化。
32、根据上述权利要求中任一权利要求所述的纯化方法，其特征在于它包括至少一个步骤，其中让含有与其它组分混合的所述双链DNA的溶液与被所述寡核苷酸以共价方式偶合的载体进行接触。
33、根据上述权利要求中任一权利要求所述的纯化方法，其特征在于让含有与其它组分混合的所述双链DNA的溶液通过被所述寡核苷酸以共价方式偶合的色谱载体。
34、根据上述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述的第三链DNA或所述的寡核苷酸被标记。
35、能够采用根据上述权利要求中任一权利要求所述方法得到的纯化的双链DNA。
36、双链DNA的检测方法，其特征在于让被怀疑含有所述双链DNA分子的溶液与标记的第三链DNA进行接触，这第三链能够通过杂交与所述双链DNA的靶序列生成三螺旋，所述的靶序列具有下述通式：
5′-(R)n-(N)t-(R′)m-3′
式中：
R′和R′代表只是由嘌呤碱基组成的核苷酸序列；
n和m是小于9的整数，n+m之和大于5；
N是同时含有嘌呤碱基和嘧啶碱基的核苷酸序列；
t是小于8的整数。
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