KR20090094870A - 2본쇄 ｄｎａ 표적 서열을 3중 나선 상호작용에 의해 정제 및 검출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제3 가닥과 상호작용하여 안정된 3중 나선을 형성할 수 있는 신규한 2본쇄 DNA 표적 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 DNA 분자를 함유하는 용액을, 이 DNA 분자에 의해 수득되어지는, 2본쇄 DNA 표적 서열과 하이브리드화에 의해 3중 나선 구조를 형성할 수 있는, 제3 DNA 가닥과 접촉시키는 것으로 구성되어, 2본쇄 DNA 분자를 정제하는 방법에 관한 것이다.
2본쇄 DNA, 3중 나선, 하이브리드화

Description

2본쇄 ＤＮＡ 표적 서열을 3중 나선 상호작용에 의해 정제 및 검출하는 방법{METHODS FOR PURIFYING AND DETECTING DOUBLE STRANDED DNA TARGET SEQUENCES BY TRIPLE HELIX INTERACTION}
본 발명은 3중 나선 형태의 구조를 형성할 수 있는 신규한 표적 DNA 서열, 및 DNA를 정제하는 신규 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명에 따른 정제 방법은 표적 DNA 서열과 올리고뉴클레오타이드 사이에 하이브리드화를 일으킨다. 본 발명에 따른 방법은 약학적 성질의 2본쇄 DNA를 고수율로 정제할 수 있기 때문에 특히 유용한 것으로 나타난다.
또한, 본 발명은 상기 특정 표적 서열을 함유하는 DNA 분자를 검출하거나 정량하거나 분리하거나 또는 분류하는 신규 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 정제 방법은 실질적으로 특정 표적 DNA 서열과, 천연 염기 또는 변형 염기로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 사이의 3중 나선 상호작용에 기초를 둔 것이다.
호모피리미딘 올리고뉴클레오타이드는 3중 나선이라는 3본쇄 구조를 국소적으로 형성하기 위해서 DNA 2중 나선의 주 홈에서 특이적으로 상호작용할 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다[Moser et al., Science 238(1987) 645; Povsiz et al., J.Am.Chem. 111(1989) 3059]. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 올리고퓨린-올리고피리미딘 서열, 즉 한 가닥에는 올리고퓨린 서열을, 그 상보적 가닥에는 올리고피리미딘 서열을 가진 영역에 있는 DNA 2중 나선을 선택적으로 인식하여, 그 곳에서 국소적인 3중 나선을 형성한다. 호모피리미딘 올리고뉴클레오타이드 제3 가닥의 염기들은 왓슨 크리크 염기쌍의 퓨린들과 수소 결합[후그스틴(Hoogsteen)형 결합]을 형성한다.
이와 유사하게, 3중 나선형의 구조는 호모퓨린 올리고뉴클레오타이드와 호모퓨린-호모피리미딘 2본쇄 DNA 사이에 형성될 수 있다. 이러한 형태의 구조에서 상기 올리고뉴클레오타이드의 퓨린 염기는 2본쇄 DNA의 퓨린 염기와 역 후그스틴형 결합을 형성한다.
이와 같은 부위 특이적 3중 나선 상호작용은 구체적으로 루니 등[Looney et al., Science 241(1988) 456]에 의해 특정 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용된 바 있으며, 프로모터 또는 암호 영역에 존재하는 표적 서열과 올리고뉴클레오타이드 사이에 3중 나선 구조를 형성시켜, 개시 및/또는 신장 단계에서의 RNA 폴리머라제의 억제 작용을 통해 일어날 것으로 예상되는 상기 유전자들의 발현 프로필의 조절 가능성을 예시한 헬렌 등[Helene et al., BBA 1049(1990) 99; WO 95/18223]에 의해 이용된 바 있다.
이러한 유형의 3중 나선 상호작용은 또한 플라스미드 DNA 정제에 관한 국제 출원 WO 96/18744에서, 다른 성분과 상기 DNA 분자가 혼합된 복합 혼합물로부터 플 라스미드 DNA를 정제하기 위한 목적에 대하여 설명된 바 있다. 보다 구체적으로, 상기 출원은 표적 DNA의 특정 서열과 하이브리드화에 의해 3중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드가 공유 결합된 지지체와 상기 복합 혼합물을 접촉시키는 것으로 구성되는 2본쇄 DNA 정제 방법에 관한 것이다.
이러한 정제 목적의 3중 나선 형태의 특이적 상호작용에서, 특이성은 첫째 올리고뉴클레오타이드를 구성하는 제3 가닥의 티민(T) 염기와, 둘째 2본쇄 DNA의 AT 염기쌍 사이에 형성된 후그스틴 형의 수소 결합으로 T*AT 3인조(triad)를 형성하는 쌍형성에 의해 일어난다. 이와 유사하게, 제3 가닥 쌍에 위치한 양성자화된 시토신과 2본쇄 DNA의 GC 염기쌍 사이에 형성되는 +C*GC 3인조에 의해서도 일어난다[Sun et al., Curr. Opin Struc Biol. 3(1993) 345]. 지금까지 이와 같은 T*AT와 +C*GC 3인조(규범적 3인조로 불림)가 3중 나선의 최대 안정성을 보장하는 것으로 인정되고 있다. 하지만, 3중 나선의 안정성에는 또한 다른 많은 요인, 예컨대 시토신의 비율, pH, 배지의 염도 또는 3중 나선의 환경 등이 괸련되기도 한다. 또한, 비규범적(즉, T*AT와 +C*GC 3인조와 다른)이라고 하는 3인조의 도입은 3중 나선에 다소 상당한 구조적 변형을 일으켜, 유의적인 불안정화를 의도적으로 유도한다는 것이 널리 알려져 있다. 더욱이, 다양한 비규범적 3인조의 도입은, 도입된 비규범적 3인조 성질의 함수로서 3중 나선의 다양한 불안정화를 입증하기 위한 비교 연구의 차원에서 연구된 바 있다[Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9397; Fossella et al.,(1993) Nucleic Acids Research 21, 4511; Govers et al., Nucleic Acids Research (1997) 25, 3787].
이 방법은 약학적 품질의 표적 DNA를 신속하고 효과적으로 정제할 수 있지만 정제될 DNA의 두 가닥 중 한 가닥에, 제3 DNA 가닥에 상보적이고 충분히 긴 서열, 바람직하게는 완전한 호모퓨린 서열을 필요로 한다. 이러한 서열은 정제가 요구되는 표적 2본쇄 DNA 서열에 천연적으로 존재하거나 인위적으로 삽입할 수 있다.
본 출원인은 현재 놀랍고도 예기치 않게, 본질적으로 퓨린 염기로만 이루어지지 않은 표적 DNA 서열을 한 가닥 상에 보유하는 DNA 분자가, 올리고뉴클레오타이드의 염기에 상보적이지 않아서 비규범적 3인조를 형성시키는 염기의 존재에도 불구하고, 제3 DNA 가닥과 안정된 3중 나선 구조를 형성할 수도 있음을 발견하게 되었다.
보다 구체적으로, 본 출원인에 의해 새로 확인된 표적 2본쇄 DNA 서열은 제시된 수의 피리미딘 염기가 중재해 있는 호모퓨린 서열을 한 가닥 상에 포함한다. 또한, 본 출원인은 이러한 부분 호모퓨린-부분 호모피리미딘 DNA 서열이 이러한 서열을 함유하는 DNA 분자를 3중 나선 상호작용에 의해 효과적으로 정제하는데 사용할 수 있음을 발견하였다.
이와 같이 새로 확인된 서열은 또한 이러한 서열을 함유하는 DNA 분자를 검출하거나, 정량하거나, 분리하거나 분류하는데 특히 유용하다.
따라서, 본 발명의 목적은 하기 화학식으로 표시되는 서열을 한 가닥 상에 포함하고, 제3 DNA 가닥과 상호작용할 수 있어서 3중 나선 구조를 형성할 수 있는 신규한 표적 DNA 서열을 제공하는 것이다:
5'-(R)n-(N)t-(R')m-3'
이 식에서,
R 및 R'는 퓨린 염기로만 이루어진 뉴클레오타이드를 나타내고;
n 및 m은 9 미만의 정수이고 n+m의 합은 5 보다 크며;
N은 퓨린 염기와 피리미딘 염기를 모두 포함하는 뉴클레오타이드 서열이고;
t는 8 미만의 정수이다.
따라서, 표적 DNA 서열의 5' 부와 3' 부에 각각 위치한 호모퓨린 서열 R 및 R'는 총 길이가 6 이상이다. 이 서열들은 T*AT와 +C*GC 규범적 3인조로 이루어진 3중 나선 구조를 형성하기 위해서 제3 가닥과 상호작용할 수 있는 아데닌 및 구아닌 염기를 포함한다. 호모퓨린 서열 R 및 R'는 총 2개 이상의 구아닌과 2개 이상의 아데닌을 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 이 퓨린 서열이 (AAG)형의 모티프를 포함하는 것이다.
중심 서열 N은 t 길이에서 퓨린 및 피리미딘 염기 쌍이 8개 미만인 것으로서, 본 발명에 따라 비규범적 3인조를 형성하기 위해 제3 DNA 가닥과 상호작용할 수 있다. 바람직하게는, 중심 서열 N의 길이가 1개 이상 내지 8개 미만인 것이다. 보다 바람직하게는, 중심 서열 N의 길이가 2개 이상 내지 8개 미만인 것이다.
"규범적 3인조"라는 용어는 각각 T*AT와 +C*GC 3인조를 형성하기 위해 2본쇄 DNA의 AT 및 GC 2중쇄가 T 및 *C 염기와 상호작용하여 만들어내는 2가지 뉴클레오타이드 3인조를 의미하는 것이다. 이와 같은 2가지 3인조는 현존하는 16가지 3인조 중에서 안정성이 최대인 것이다.
"비규범적 3인조"라는 용어는 나머지 14가지 뉴클레오타이드 3인조 세트를 의미하는 것이다. 이것은 비특이적 방식인 2본쇄 DNA와 제3 DNA 가닥의 상호작용에 의해 만들어지는 것으로서, 상기 T*AT와 +C*GC 규범적 3인조에 비해 감소된 안정성을 나타낸다. 그 예를 들면, 특히 표적 서열의 CG 또는 GC 2중쇄와 제3 가닥의 티민(T) 사이의 상호작용에 의해 각각 형성되는 T*CG와 T*GC 비규범적 3인조, 표적 서열의 CG 2중쇄와 제3 가닥의 구아닌(G) 사이의 상호작용에 의해 형성되는 G*CG 비규범적 3인조, 표적 서열의 AT 및 TA 2중쇄와 제3 가닥에 위치한 시토신(C)의 상호작용에 의해 각각 형성되는 C*AT 및 C*TA 비규범적 3인조, 제3 가닥의 구아닌(G)과 CG 2중쇄 사이의 상호작용에 의해 형성되는 G*CG 비규범적 3인조 또는 제3 가닥의 티민(T)과 TA 2중쇄의 상호작용에 의해 형성되는 T*TA 3인조가 있다.
5' 및 3'에 존재하는 퓨린 말단과 같이, 중심 서열 N 역시 제3 DNA 가닥 상에 위치한 티민(T) 및 시토신(C) 염기와 AT 및 GC 2중쇄 각각의 상호작용에 의해 얻어지는 T*AT와 +C*GC 규범적 3인조를 형성할 수 있다는 것은 자명한 것이다.
중심 서열 N은 최고 6가지 비규범적 3인조를 형성시키는 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드와 중심 부분의 상호작용에 의해 형성되는 비규범적 3인조가 T*CG, T*GC, C*AT 및 C*TA 비규범적 3인조 중에서 선택되는 것이다. 이러한 3인조의 바람직한 분포를 예로 들 면, C*AT, C*TA, 2개의 T*CG 및 2개의 T*GC를 포함하는 6개의 비규범적 3인조를 형성하는 것, 2개의 C*AT와 3개의 T*GC를 포함하는 5개의 비규범적 3인조를 형성하는 것 또는 2개의 T*GC와 하나의 C*AT를 포함하는 3개의 비규범적 3인조를 형성하는 것이다. 몇 개의 T*TA 비규범적 3인조도 존재할 수 있으나, 이 경우에 이 3인조들은 3중 나선에서 연속적으로 위치하지 못한다.
중심 서열은 T*CG 및 C*TA 또는 G*TA 비규범적 3인조를 형성하는 최대 3개의 C 또는 T 피리미딘 염기를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 3개의 피리미딘 염기는 연속된 것이 아니고 A 또는 G 퓨린 염기에 의해 분리된 것으로서, 제3 DNA 가닥과 상호작용하여 T*GC 및 C*AT 비규범적 염기는 물론 T*AT 및 +C*GC 규범적 3인조를 형성할 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 구체예에 따르면, 표적 2본쇄 DNA 서열은 서열 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3' (서열번호 1)이다.
본 발명에 따라 2본쇄 DNA 서열과 상호작용할 수 있는 제3 DNA 가닥은 아마도 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 또는 국소적으로 쌍을 이루지 않은 상태에 있는 다른 2본쇄 DNA의 가닥으로서, 다음과 같은 염기를 포함할 수 있다:
- 티민(T), 이것은 표적 2본쇄 DNA 서열의 AT 2중쇄와 T*AT 규범적 3인조를 형성하는 것은 물론 표적 DNA 서열의 각 CG 및 GC 2중쇄와 T*CG 및 T*GC 비규범적 3 인조를 형성할 수 있다(Soyfer et al., in Triple Helical Nucleic Acids(1996) Springer, New York, pp. 151-193);
- 구아닌(G), 이것은 2본쇄 DNA의 TA 2중쇄와 G*TA 3인조를 형성할 수 있다(Soyfer et al., in Triple Helical Nucleic Acids(1996) Springer, New York, pp. 151-193);
- 시토신(C), 이것은 표적 2본쇄 DNA의 GC, AT 및 TA 2중쇄와 각각 규범적 +C*GC(양성자화된 시토신 C+) 3인조 또는 비규범적 C*AT 및 C*TA 3인조를 형성할 수 있다;
- 우라실, 이것은 표적 서열의 AU 또는 AT 염기쌍과 3중쇄를 형성할 수 있다(Bates et al., Nucleic Acids Research 23 (1995) 3627).
사용되는 제3 DNA 가닥은 시토신이 풍부한 호모피리미딘 서열을 포함하는 것이 바람직한데, 이 시토신은 산성 pH에서 양성자화된 상태로 존재하여 안정된 3중 나선을 형성시킨다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 (CCT)n 서열, (CT)n 서열 또는 (CTT)n 서열을 포함할 수 있으며, 여기에서 n은 1 내지 20 사이의 정수이다. 특히, (CT)n 또는 (CTT)n 형의 서열이나, 또는 (CCT), (CT) 또는 (CTT) 모티프가 조합된 서열을 사용하는 것이 유리하다.
제3 DNA 가닥이 올리고뉴클레오타이드 형으로 존재하는 경우, 이 올리고뉴클레오타이드는 천연물, 즉 천연의 비변형 염기로 구성된 것이거나 또는 화학적 변형물일 수 있다. 특히, 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제에 대한 내성이나 보호성 을 증가시키거나 특정 서열에 대한 친화성을 증가시킬 수 있는 특정의 화학적 변형을 가진 것이 유리할 수 있다.
본 발명에 따른, "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 뉴클레아제에 대한 저항성을 증가시키기 위한 목적으로 백본을 변형시킨 임의의 뉴클레오사이드 사슬을 의미하는 것이다. 가능한 변형 중에는, DNA와 3중 나선을 형성할 수 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드(Xodo et al., Nucleic Acids Research, 22(1994) 3322)는 물론 포름아세탈 또는 메틸 포스포네이트 백본을 가진 올리고뉴클레오타이드(Matteucci et al., J.Am.Chem.Soc., 113(1991) 7767)를 예로 들 수 있다. 또한, 뉴클레오타이드의 α-아노머(anomer)로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것도 가능하며, 이것 역시 DNA와 3중 나선을 형성한다(Le Doan et al., Nucleic Acids Research, 15(1987) 7749). 백본의 또 다른 변형은 포스포아미데이트 결합이다. 그 예로는, 그리아즈노브 등(Gryaznov et al., J.Am.Chem.Soc., 116(1994) 3143)에 의해 기술된 포스포아미데이트 N3'-P5' 뉴클레오타이드간 결합이 있으며, 이것은 DNA와 특히 안정된 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 다른 백본 변형 가운데, 리보뉴클레오타이드, 2'-O-메틸리보스 또는 포스포디에스테르의 사용도 예로 들 수 있다(Sun et al., Curr. Opinion in Struct. Biol., 3(1993) 3143). 마지막으로, 포스포러스 백본을 PNA(펩타이드 핵산)에 존재하는 것과 같은 폴리아미드 백본으로 치환시킬 수 있으며, 이것 역시 3중 나선을 형성할 수 있다(Nielsen et al., Science, 254(1991), 1497; Kim et al., J.Am.Chem.Soc., 115(1993) 6477-6481).
또한, 제3 가닥의 티민은 DNA에 대한 올리고뉴클레오타이드의 친화성을 증가시키는 5-브로모우라실로 치환시킬 수 있다(Povsic et al., J.Am.Chem.Soc., 111(1989) 3059). 제3 가닥은 또한 비천연 염기를 포함할 수 있으며, 그 예로는 7-데아자-2'-데옥시크산토신(Milligan et al., Nucleic Acids Res., 21(1993) 327), 1-(2-데옥시-알파-D-리보푸라노실)-3-메틸-5-아미노-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(Koh et al., J.Am.Chem.Soc., 114(1992) 1470), 8-옥소아데닌, 2-아미노퓨린, 2'-O-메틸슈도이소시티딘 또는 당해 기술분야에 숙련된 자(이하, 당업자라 지칭함)에게 공지된 다른 변형을 포함할 수 있다(Sun et al., Curr. Opinion in Struct. Biol., 3(1993) 345).
제3 가닥의 다른 변형 형태의 목적은 특히 제3 가닥과 특정 서열 사이의 상호작용 및/또는 친화성을 증가시키기 위한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 전적으로 유리한 변형은 올리고뉴클레오타이드의 시토신을 5번 위치에서 메틸화하는 것이다. 이와 같이 메틸화된 올리고뉴클레오타이드는 중성에 보다 가까운 pH 범위(≥5; Xoda et al., Nucleic Acids Research 19(1991) 5625)에서 특정 서열과 안정된 3중 나선을 형성하는 현저한 성질을 갖고 있다. 이와 같은 올리고뉴클레오타이드로 인해, 종래 기술의 올리고뉴클레오타이드 보다 높은 pH, 즉 플라스미드 DNA의 분해 위험율이 상당히 적은 pH에서의 작업이 가능해진다.
길이는 상호작용의 필요한 선택성과 안정성의 함수로서, 당업자에 의해 경에 따라 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 제3 DNA 가닥은 임의의 공지 기법으로 합성할 수 있다. 구체 적으로, 이 가닥은 핵산 합성기를 사용하여 제조할 수 있다. 물론, 당업자에게 공지된 다른 임의의 방법을 사용할 수도 있다.
이러한 제3 DNA 가닥 또는 올리고뉴클레오타이드는, 뉴클레오타이드 길이가 8개 미만인 복합 (피리미딘-퓨린) 내부 영역 N과 이에 인접한 2개의 호모퓨린 영역 R 및 R'를 포함하는, 전술한 바와 같은 특정 2본쇄의 DNA 서열과 3중 나선을 형성할 수 있다. 상기 호모퓨린 영역은 예를 들어 GAA 형의 모티프를 포함할 수 있다.
예를 들면, 서열: 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3' (서열번호 1)에 상응하는 표적 2본쇄 DNA 서열이 있으며, 이 서열은 다음과 같은 서열 중에서 선택되는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 3중 나선을 형성할 수 있다:
5'-TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3' (서열번호 2),
5'-TT CTT CTT GCT TCT CTT CTT-3' (서열번호 3),
5'-TT CTT CTT GTT TCT CTT CTT-3' (서열번호 4), 및
5'-TT CTT CTT CCT TCT CTT CTT-3' (서열번호 5).
3중 나선의 형성은 이 구조의 안정성을 경우에 따라 촉진시킬 수 있는 Mg2+ 이온의 존재하에 수득될 수 있다(Vasquez et al., Biochemistry 34(1995) 7243; Beal et al., Science 251(1991) 1360).
바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 표적 DNA 서열은 천연적으로 2본쇄 DNA에 존재하는 것일 수 있으며, 특히 예컨대 당해의 유전자 서열, 예컨대 치료적 또는 실험적 대상인 유전자 또는 마커 유전자 서열에 존재하는 상기와 같은 서열과 3중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 것이 매우 유리하다. 이와 같은 관점에서, 본 출원인은 당해의 각종 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 분석하고, (CTT)n 형의 올리고뉴클레오타이드와 형성된 3중 나선 상호작용의 안정성을 시험한 결과, 상기 유전자의 특정 영역이 T*CG, T*GC, C*AT, C*TA 및 T*TA와 같은 비규범적 3인조의 존재에도 불구하고 안정된 3중 나선을 형성한다는 것을 확인할 수 있었다.
2본쇄 DNA에 천연적으로 존재하는 서열 가운데, 예를 들면 인간 FGF1 유전자 서열(Jaye et al., Science 233(1986) 541)에 존재하는 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3' 서열(ID1 로 표기)(서열번호 1), 응혈에 관여하는 제IX 인자를 암호하는 인간 유전자(Kurachi et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 79(1982) 6461)의 5'-GAA GAA GCA CGA GAA G-3' 서열(서열번호 6), SeAP 분비형 알칼리 포스파타제 유전자(Millan et al., J.Biol.Chem., 261(1986) 3112)의 5'-GAA GAG GAA GAA G-3' 서열(서열번호 8), 인간 알파 페토단백질 hαFP 유전자(Gibbs et al., Biochemistry 26(1987) 1332)의 5'-AAG GAG AAG AAG AA-3' 서열(서열번호 9), 재협착증을 제어하는 인간 GAX 유전자(Gorski et al., Mol.Cell.Biol., 13(1993) 3722)의 5'-AA GAT GAG GAA GAA G-3' 서열(서열번호 10) 및 마지막으로 인간 VEGFB-167 유전자(Olofsson et al., J.Biol.Chem., 271(1986) 19310)의 5'-GGC AAC GGA GGA A-3' 서열(서열번호 13)이 있다. 치료적 또는 실험적 목적의 유전자에 존재하는 서열과 3중 나선을 형성하는 것은 표적 서열이 2본쇄 DNA 분자에 천연적으로 존재하여, 인위적인 특정 서열을 병입시키기 위해 표적 2본쇄 DNA 또는 이 유전자를 보유하는 플라스미드를 변형시킬 필요가 없기 때문에 특히 유리하다. 또는, 표적 서열은 2본쇄 DNA에 인위적으로 도입시킬 수도 있다.
본 발명의 제2 관점은 다른 성분과 혼합된, DNA를 함유하는 용액을 전술한 바와 같은 제3 DNA 가닥, 바람직하게는 하이브리드화에 의해 전술한 바와 같은 2본쇄 DNA에 존재하는 특정 서열과 3중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드와 접촉시킴에 따라 2본쇄 DNA를 정제하는 방법에 근거한 것이다. 바람직하게는, 2본쇄 DNA를, 지지체에 고정시킨 올리고뉴클레오타이드와 용액 상태에서 접촉시키는 것이 좋다. 보다 더 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드를 상기 지지체에 안정된 방식으로 공유 또는 비공유 결합시키는 것이 좋다. 따라서, 2본쇄 DNA를 함유하는 용액을 접촉시키는 단계는 다른 성분과 혼합된 DNA 용액을, 올리고뉴클레오타이드가 결합된 지지체 상으로 통과시키는 단계로 유리하게 이루어질 수 있으며, 이로써 정제하고자 한 2본쇄 DNA를 효율적이고 신속한 방식으로 수득할 수 있다.
이와 같은 지지체는 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예로는 비드 또는 라텍스 입자와 같은 미세입자, 또는 임의의 다른 지지체가 현탁 상태로 이루어진 것을 포함한다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는 천연이나 합성 기원의 중합체 형의 분자 상에 융합시킬 수도 있다. 이와 같이 올리고뉴클레오타이드가 부착된 중합체는 2본쇄 DNA와 3중 나선을 형성한 후 용액에서 용이하게 분리될 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다. 천연 중합체 가운데, 예를 들면 단백질, 지질, 당 및 폴리올이 있 다. 합성 중합체 중에서는 폴리아크릴아마이드, 폴리에틸렌 글리콜, 스티렌 유도체 및 감열성 중합체, 예컨대 저온에서 용해성이고 상전이 온도 이상의 범위에서 불용성이 되는 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드) 형의 화합물을 예로 들 수 있다(T.Mori et al., Biotechnology and Bioengineering, 72(2001) 261).
본 발명에 따른 정제 방법은 i) 호모피리미딘 올리고뉴클레오타이드와 안정된 3중 나선 구조를 형성하기에 충분히 큰 길이의 호모퓨린 서열을 함유하지 않는 DNA 분자는 물론, ii) 호모퓨린 서열 사이에 수개의 피리미딘 염기가 끼여있는 DNA 분자의 정제를 가능케 하기 때문에 특히 유용하다. 이와 같이 더욱 다양한 DNA 분자를 정제할 수 있도록 하는 것 외에도, 이 방법은 또한 신속하며 특히 높은 수율과 정제도를 산출한다.
더욱이, 이 방법을 통해, 다른 핵산, 단백질, 내독소(예, 리포폴리사카라이드), 뉴클레아제 등을 함유하는 복합 혼합물로부터 DNA 분자를 정제하고, 약학적 품질의 정제된 DNA를 수득할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 지지체에 공유 결합시키기 위하여 작용기화된 것이 일반적이다. 따라서, 5' 또는 3' 위치를 말단 티올, 아민 또는 카르복실 기로 변형시킬 수 있다. 구체적으로, 티올, 아민 또는 카르복실기를 첨가하면, 예컨대 디설파이드, 말레이미드, 아민, 카르복실, 에스테르, 에폭사이드, 시아노겐 브로마이드 또는 알데하이드 작용기를 보유하는 지지체에 올리고뉴클레오타이드를 결합시킬 수 있다. 이와 같은 결합은 올리고뉴클레오타이드와 지지체 사이에 디설파이드, 티오에테르, 에스테르, 아미드 또는 아민 부착의 형성을 통해 이루어진다. 또한, 당업 자에게 공지된 임의의 다른 방법, 예컨대 이중작용성 결합 시약을 사용하여 형성시킬 수도 있다.
더욱이, 결합된 올리고뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 향상시키기 위하여, 올리고뉴클레오타이드는 "아암(arm)" 및 "스페이서(spacer)" 서열의 염기를 포함하는 것이 유리할 수 있다. 여기에서, 아암은 사실상 지지체로부터 소정 거리를 두고 올리고뉴클레오타이드를 부착시킴으로써 DNA와의 상호작용의 조건을 향상시킬 수 있도록 하는 역할을 한다. 따라서, 아암은 유리하게는 1 내지 18개, 바람직하게는 6 내지 12개의 CH2 형의 기를 포함하는 선형 탄소계 사슬과, 컬럼에 부착될 수 있도록 하는 아민으로 구성되는 것이 좋다. 이 아암은 하이브리드화에 관여하지 않는 염기로 구성된 "스페이서" 또는 상기 올리고뉴클레오타이드의 인산염에 연결된다. 따라서, "스페이서"는 퓨린 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, "스페이서"는 서열 GAGG를 포함할 수 있다.
정제용 지지체에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 서열 5'-GAGG CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3'(GAGG(CTT)7; 서열번호 11)을 가질 수 있으며, 여기에서 GAGG 염기는 3중 나선 구조에는 관여하지 않으나, 올리고뉴클레오타이드와 결합성 아암 사이에 공간을 형성시킬 수 있다.
본 발명의 실시에는 다양한 종류의 지지체가 사용될 수 있다. 그 예로는, 컬럼에 예비충전되거나 소성(loose)의 작용기화된 크로마토그래피 지지체, 작용기화된 플라스틱 표면 또는 작용기화된 라텍스 비드(이는 자기성이거나 비자기성일 수 있다)가 있다. 특히, 겔 투과 크로마토그래피 지지체가 바람직하다. 사용될 수 있는 크로마토그래피 지지체로는 아가로스, 아크릴아마이드 또는 덱스트란 및 이의 유도체(예, Sephadex®, Sepharose®, Superose® 등), 폴리(스티렌디비닐벤젠)과 같은 중합체, 또는 융합성 또는 비융합성 실리카 등을 예로 들 수 있다. 크로마토그래피 컬럼은 특정 구체예에 적합한 밀도의 크로마토그래피 지지체를 사용하여 "유동화 베드" 또는 "팽창" 시스템 형태로 또는 확산 또는 관류 방식으로 작용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 임의의 유형의 2본쇄 DNA를 정제하는데 사용할 수 있다. 그 예로는, 원형 DNA, 예컨대 미니서클(Darquet et al., Gene Theraphy 6(1999) 209), 선형 단편 또는 일반적으로 치료나 실험 목적의 1 또는 그 이상의 유전자를 보유하는 플라스미드가 있다. 이 플라스미드는 또한 예컨대 조건적 유형의 복제 원점(예컨대, 문헌 [Soubrier et al., Gene Therapy 6(1999) 1482]에 기술되어 있는 pCOR 플라스미드), 마커 유전자 등을 보유할 수 있다. 본 발명의 방법은 세포 용해물에 직접 적용될 수 있다. 이 구체예에서, 형질전환과 잇따른 세포 배양에 의해 증폭된 플라스미드는 세포 용해 후 즉시 정제한다. 본 발명에 따른 방법은 또한 투명한 용해물, 즉 세포 용해물의 중화 및 원심분리 후 수득되는 상청액에 적용될 수 있다. 물론, 공지의 방법에 따라 예비정제된 용액에도 적용될 수 있다. 이 방법 역시 각종 서열의 DNA를 함유하는 혼합물로부터 당해의 서열을 보유하는 선형이나 원형의 DNA의 정제를 가능케한다. 본 발명에 따른 방법은 또한 2본쇄 RNA를 정제하는 데에도 사용할 수 있다.
*세포 용해물은 원핵 세포 또는 진핵 세포의 용해물일 수 있다. 원핵 세포의
예로는, 대장균(E.coli), B.서브틸리스(B.subtilis), S.티피뮤리엄(S.typhimurium), S.아우레우스(S.aureus) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 박테리아가 있다. 진핵 세포의 예로는 동물 세포, 효모, 곰팡이 등이 있고, 보다 구체적으로는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모 또는 COS, CHO, CI27, NIH3T3, MRC5, 293 세포 등이 있다.
본 발명의 방법은 매우 고순도의 플라스미드 DNA를 신속하고 간단하게 수득할 수 있는 방법이므로, 특히 유리하다. 특히, 하기 실시예에 예시된 바와 같이 이 방법을 통해, 단편화된 염색체 DNA, RNA, 내독소, 단백질 또는 뉴클레아제와 같은 오염 성분으로부터 플라스미드 DNA를 효과적으로 분리할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 DNA 분자, 특히 산업적 규모로 생산 및 정제되고 그 순도가 약학적 용도에 적합해야 하는 치료 목적의 유전자, 예컨대 FGF1 유전자를 정제하고 농축하는데 유용하다.
제3 관점에 따르면, 본 발명의 목적은 전술한 바와 같은 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 2본쇄 DNA 분자를 검출, 정량 및 분류하는 방법으로서, a) 상기 DNA 분자를 함유할 것으로 예상되는 용액을 제3 DNA 가닥, 예컨대 표지된 올리고뉴클레오타이드와 접촉시켜 안정된 3중 나선을 형성시키는 단계, 및 b) 상기 2본쇄 DNA와 제3 DNA 가닥 사이에 형성되었을 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다.
이 방법은 특히 예컨대 게놈내 존재하는 특정 DNA 서열을 검출하거나 특정 서열들을 분류함으로써 게놈을 분석한다는 점에서 유용하다.
이러한 관점의 본 발명에 따른 제3 DNA 가닥이나 올리고뉴클레오타이드는 분광기, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 라벨을 병입시킴으로써 라벨화할 수 있다.
예를 들어, 이러한 라벨로는 방사능 동위원소(32P, 33P, 3H, 35S) 또는 형광 분자(5-브로모데옥시우리딘, 플루오레세인, 아세틸아미노플루오렌, 디곡시제닌)를 포함할 수 있다.
라벨화는 라벨화된 분자를 프라이머 신장에 의해 폴리뉴클레오타이드 중으로 병입시키거나, 또는 5' 또는 3' 말단에 첨가함으로써 실시하는 것이 바람직하다.
비방사능성 라벨화의 예는 구체적으로 프랑스 특허 FR 78 109 75, 또는 문헌[Urdea et al.(1988, Nucleic Acids Research, 11:4937-4957) 또는 Sanchez-pescador et al.(1988, J.Clin.Microbiol., 26(10): 1934-1938)]에 기술되어 있다.
이와 같은 본 발명의 특정 관점에 따르면, 제3 DNA 가닥이나 올리고뉴클레오타이드는 또한 전술한 바와 같은 지지체 상에 고정시킬 수도 있다.
본 발명의 제4 관점은 복합 혼합물 중에서 본 발명에 따른 2본쇄 DNA의 존재를 정제 및/또는 검출하기 위한 팩 또는 키트로서, 이 팩은 전술한 바와 같은 1종 또는 그 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것이 특징인 팩 또는 키트에 관 한 것이다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 지지체 상에 고정될 수 있고(또는) 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다.
이와 같은 관점의 본 발명에 따르면, 전술한 검출 키트, 예컨대 키트는 당해의 표적 2본쇄 DNA 서열을 검출하는데 사용할 수 있는 본 발명에 따른 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
따라서, 지지체 상에 고정된 올리고뉴클레오타이드는 "DNA 칩"과 같은 기질에 편성될 수 있다. 이와 같이 편성된 기질에 대해서는 특히 미국 특허 제5,143,854호 및 PCT 출원번호 WO 90/15070 및 92/10092에 기술되어 있다.
올리고뉴클레오타이드를 고밀도로 고정시킨 지지체 기질에 대해서는 예컨대 미국 특허 제5,412,087호 및 PCT 출원번호 WO95/11995호에 기술되어 있다.
본 출원은 이하 실시예를 이용하여 보다 상세하게 설명되며, 이 실시예는 제한하는 것이 아닌 예시적인 설명으로 간주되어야 한다.
본원발명에 의해 부분 호모퓨린-부분 호모피리미딘 DNA 서열을 함유하는 표적 서열을 갖는 이본쇄 DNA 분자가 제3 DNA 가닥과 안정된 3중 나선 구조를 형성함으로써 상기 이본쇄 DNA 분자를 효율적으로 정제할 수 있다.
일반적인 클로닝 및 분자생물학 기법
통상적인 분자생물학 방법, 예컨대 제한효소에 의한 분해, 겔 전기영동, DNA 단편 결합, 대장균의 형질전환, 핵산 침전, 서열분석 등은 문헌[Maniatis et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel et al.,(1987), Current protocols in molecular biology, John Willey and Sons, New York]에 기술되어 있다. 제한 효소는 뉴잉글랜드 바이오랩스(매사츄세츠주 비벌리 소재(Biolabs)) 제품을 사용하였다.
올리고뉴클레오타이드는 어플라이드 바이오시스템 사의 394 자동 DNA 합성기와 함께 α 위치가 시아노에틸 기로 보호된 포스포아미다이트(phosphoramidite) 화학을 사용하여 제조자의 지시에 따라 합성하였다.
친화성 겔을 합성하는데 사용한 올리고뉴클레오타이드는 아머샴 파마시아 바이오테크(스웨덴 웁살라 소재) 사 또는 유로젠텍(벨기에 세라잉 소재) 사에서 입수하여 변형없이 사용하였다.
pCOR 플라스미드의 복제에 이용가능한 균주와 증식 및 그 플라스미드의 선발에 이용할 수 있는 조건은 이미 개시된 바 있다(Soubrier et al., Gene Therapy 6(1999) 1482).
실시예
실시예 1: 플라스미드의 작제
1.1 플라스미드 pXL3179(pCOR-FGF1)
도 1에 도시된 플라스미드 pXL3179는 플라스미드 pXL2774(WO 97/10343; Soubrier et al., Gene Therapy 6(1999) 1482) 유래의 벡터로서, 인간 섬유아세포 인터페론의 시그널 펩타이드와 FGF1(섬유아세포 성장인자 1) cDNA(sp-FGF1, Jouanneau et al., PNAS 88(1991) 2893) 사이의 융합체를 암호화하는 유전자를 인간 사이토메갈로바이러스의 초기 영역 유래의 프로모터(hCMV IE E/P) 및 SV40 바이러스 후기 영역의 폴리아데닐화 시그널(SV40 후기 폴리A; Genbank SC4CG)의 조절하에 도입시킨 것이다.
1.2 플라스미드 pXL3296(pCOR)
플라스미드 pXL3296은 플라스미드 pXL3179 유래의 벡터로서, sp-FGF1 유전자 서열을 플라스미드 pUC28(Benes et al., Gene 130(1993) 151)의 다중 클로닝 부위로 치환시킨 것이다. 플라스미드 pXL3296은 도 2에 도시하였다.
1.3 플라스미드 pXL3426(pCOR-ID1)
플라스미드 pXL3426은 플라스미드 pXL3296 유래의 벡터로서, 서열 5'-GATCCAAGAAGCATGCAGAGAAGAATTC-3'를 BglII와 XhoI 부위 사이에 삽입시킨 것이다. 플라스미드 pXL3426은 도 3에 도시하였다.
실시예 2: 표적 서열을 보유하는 다른 플라스미드의 작제
플라스미드 pXL3675는 플라스미드 pXL3296 유래의 벡터로서, 서열 5'-GAAGAAGGGAAAGAAGATCTG-3'을 HpaI과 XbaI 부위 사이에 삽입시킨 것이고; 플라스미드 pXL3676 역시 플라스미드 pXL3296 유래의 벡터로서, 서열 5'-GAAGAAAGGAGAGAAGATCTG-3'을 HpaI과 XbaI 사이에 삽입시킨 것이며; 마지막으로 플라스미드 pXL3713은 pXL3296의 HpaI과 XbaI 부위 사이에 삽입된 DNA 서열 5'-GAAGAAGTTTAAGAAGATCTG-3'을 포함한다. 이와 같이 작제된 플라스미드는 CsCl 구배 로 정제하고, 서열분석을 통해 삽입체의 서열을 확인하였다. 이와 같은 제조물을 이하 기술되는 실시예에서 사용하였다.
실시예 3: 안정된 3중 나선을 형성하는 FGF1 유전자 내재의 20량체 서열의 동정
하기 실시예에 기술된 바와 같은 각종 플라스미드를 표준화된 조건하에서 3중 나선 상호작용 친화성 크로마토그래피를 이용하여 크로마토그래프를 실시하였다. 친화성 지지체는 크로마토그래피 지지체 Sephacryl® S-1000 SF(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 다음과 같은 방식으로 합성하였다. 제1 단계로서, 0.2M 아세트산나트륨 완충액에 분산시킨 Sephacryl® S-1000 겔을 메타-과요오드산 나트륨(3mM, 20℃, 1h)으로 활성화시킨 다음, 제2 단계로서 이와 같이 활성화된 기질의 알데하이드 기에 올리고뉴클레오타이드를, 단백질 결합(Hornsey et al., J.Immunol.Methods 93(1986) 83)에 대하여 기술한 바와 유사한 절차에 따라, 아스코르브산(5mM)의 존재하에 환원적 아민화 반응을 이용하여 올리고뉴클레오타이드의 5'-NH2-말단부를 통해 결합시켰다. 본 발명에 기록된 모든 실험에서 올리고뉴클레오타이드는 이와 같은 일반적인 절차에 따라 결합시켰으며; 모든 올리고뉴클레오타이드는 이의 5' 말단에 위치한 NH2-(CH2)6- 작용기화된 아암을 갖고 있다.
올리고뉴클레오타이드와 2본쇄 DNA 사이의 3중 나선 구조 형성을 입증하는 실험 및 그 안정성을 측정하는 실험은 모두 다음과 같은 조건하에 실시하였다. 각 실험에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드로 작용기화된 친화성 겔 1ml을 함유하는 HR 5/5 컬럼(아머샴 파마시아 바이오테크) 상에, 2M NaCl을 함유하는 50mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5) 6ml에 용해시킨 정제 플라스미드 300㎍을 30cm/h의 유속으로 주입하였다. 상기와 같은 완충액 5ml로 컬럼을 세척한 후, 0.5mM EDTA를 함유하는 100mM Tris/HCl 컬럼 완충액(pH 9.0) 3ml로 플라스미드를 용출시키고, pH 9.0 완충액에 의해 용출된 플라스미드 양을, i) 용액의 260nm 흡광도를 측정하고, ii) 컬럼(Millipore GenPak-Fax 컬럼)을 통해 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하여 정량하였다(Marquet et al., BioPharm, 8(1995) 26).
올리고뉴클레오타이드 5'-NH2-(CH2)6-TT(CTT)6-3' (서열번호 2)로 작용기화된 컬럼을 사용하여 수득한 하기 표 1에 제시된 정제 결과는 인간 FGF1 유전자 서열을 함유하지 않아서 당해의 컬럼 상에 보유되지 않는 대조 플라스미드(pXL3296)와 대조적으로, 전체 FGF1 유전자(pXL3179) 또는 인간 FGF1 유전자의 내재성 ID1 서열(pXL3426)을 함유하는 플라스미드와 안정된 3중 나선을 형성함을 입증한다.
표 1
플라스미드 플라스미드에 존재하는 올리고뉴클레오타이드 표적 서열의 서열 능력(겔 1ml 당 부착된 플라스미드 ㎍)
pXL3179(pCOR-FGF1) TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT - 175
pXL3426(pCOR-ID1) TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 130
pXL3296(pCOR) TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT - <1
점차적으로 크기가 작아지는 FGF1 유전자의 각종 단편을 서브클로닝하여 플라스미드 pXL3426의 서열을 확인하였다. 그 결과, FGF1 유전자의 내재 서열 ID1 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3'(서열번호 1)은 서열번호 2인 사용된 올리고뉴클레오타이드와 안정된 3중 나선 구조를 형성하였다. 이와 같이 수득된 3중 나선 구조는 T*AT 및 +C*GC 규범적 3인조 6 유닛(R, 5'측)과 7 유닛(R', 3'측) 길이를 형성하는 피리미딘-퓨린-피리미딘(Py*PuPy) 형의 두 영역을 포함하며, 이 영역은 7개 3인조의 내재 영역(T)으로 이격되어 있는데, 이 중 6개는 비규범적 3인조로서, 보다 상세하게는 2개의 T*GC 3인조, 2개의 T*CG 3인조, 1개의 C*AT 3인조 및 1개의 C*TA 3인조를 포함한다.
실시예 4: FGF1 유전자에 내재하는 내재성 ID1 20량체 서열에서 3중 나선 구조의 안정성에 필요한 염기의 동정
내재성 ID1 서열에 근거하여 4개의 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다. 이 중 2개는 ID1의 5'측에서 7개 또는 13개의 뉴클레오타이드를 제거한 것이고, 나머지 2개는 3' 측에서 7개 또는 14개의 뉴클레오타이드를 제거한 것이다. 올리고뉴클레오타이드 5'-TT(CTT)6-3'(서열번호 2) 또는 올리고뉴클레오타이드 FRB36, FRB38, FRB39 또는 FRB40으로 작용기화시킨 3중 나선 상호작용 컬럼을 통해 플라스미드 pXL3426을 크로마토그래피하였다. 그 다음, 상기 다양하게 절두된 내재성 ID1 서열 과 형성된 3중 나선 구조의 안정성을, 컬럼 상에 보유된 각 플라스미드의 양을 측정함으로써 시험하였다.
표 2
올리고뉴클레오타이드 플라스미드 pXL3426에서 표적화된 서열 능력(겔 1ml 당 부착된 플라스미드 ㎍)
(CTT)7 AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 130
FRB36 -- --- --- --- --A GAA GAA <1
FRB38 AA GAA G-- --- --- --- --- <1
FRB39 AA GAA GCA TGC AG- --- --- 22
FRB40 -- --- --A TGC AGA GAA GAA 33
상기 표 2에 제시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 5'-TT(CTT)6-3' 형의 올리고뉴클레오타이드와 안정된 3중 나선 구조를 형성하는 데에는 pXL3426의 ID1 서열 전체(20량체)가 필요하였다. 구체적으로, 5' 및 3' 말단에 위치한 2개의 Py*PuPy 부분은 물론 중심 부분도 최종 구조의 안정성에 매우 상당히 협동적으로 기여하였다.
실시예 5: 3중 나선의 안정성에 미치는 규범적 3인조와 비규범적 3인조 수의 영향
올리고뉴클레오타이드 5'-TT(CTT)6-3'(서열번호 2)의 서열을 변형시키고, 이와 같이 변형된 각종 올리고뉴클레오타이드(FRB15, FRB16 및 FRB17)가 플라스미드 pXL3426의 내재성 ID1 서열(5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3'; 서열번호 1)과 안정된 3중 나선을 형성하는 능력을 시험하였다.
표 3
올리고뉴클레오타이드 플라스미드에 존재하는 올리고뉴클레오타이드 표적 ID1 서열의 서열 비규범적 3인조의 수 능력(겔 1ml당 부착된 플라스미드 ㎍)
(CTT)7 TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 6 130
FRB15 TT CTT CTT GCT TCT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 3 189
FRB16 TT CTT CTT GTT TCT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 4 171
FRB17 TT CTT CTT CCT TCT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 3 183
상기 표 3에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, 올리고뉴클레오타이드의 서열을 변형시켜 T*AT 및 +C*GC 규범적 3인조의 수를 증가시키고, 이와 동시에 3중 나선 구조의 중간 내재성 영역 N에 존재하는 비규범적 3인조의 수를 감소시킴으로써, 3중 나선 구조의 안정성을 증가시킬 수 있었다.
실시예 6: 3중 나선 구조의 안정성에 미치는 비규범적 3인조의 영향
올리고뉴클레오타이드 5'-TT(CTT)6-3'(서열번호 2)와 안정된 3중 나선을 형성할 수 있는 FGF1 유전자의 내재성 ID1 서열(서열번호 1)을 함유하는 플라스미드 pXL3426의 서열을 변형시켜, 그 중심 영역 N에 T*GC 형의 동일한 비규범적 3인조 2개를 연속하여 도입시키고, 그 다음 5'에 C*AT 비규범적 3인조를 도입시켰다(pXL3675). 또 다른 실험으로서, 5개의 비규범적 3인조 C*AT, T*GC, T*GC, C*AT 및 T*GC를 연속하여 도입시켰다(pXL3676). 마지막으로, 플라스미드 pXL3426의 서열을 변형시켜 그 중심 영역에 T*TA 형의 2개의 비규범적 3인조를 연속하여 도입시키고, 그 다음 5'에 C*TA 비규범적 3인조를 도입시켰다(pXL3713).
표 4
플라스미드 플라스미드에 존재하는 올리고뉴클레오타이드 표적 서열의 서열 능력(겔 1ml 당 부착된 플라스미드 ㎍)
pXL3426 TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 112
pXL3675 CTT CTT CTT CTT CTT CT GAA GAA GGG AAA GAA GA 99
pXK3676 CTT CTT CTT CTT CTT CT GAA GAA AGG AGA GAA GA 78
pXL3713 CTT CTT CTT CTT CTT CT GAA GAA GTT TAA GAA GA <1
상기 표 4에 제시된 각종 플라스미드의 정제 결과로부터 알 수 있듯이, 비규범적 중심 영역이 T*CG, T*GC, C*AT 및 C*TA 형의 3인조를 형성할 때 안정된 3중 나선 구조가 형성되었다. 플라스미드 pXL3675와 pXL3676의 친화성 겔에 대한 부착율로부터 알 수 있듯이, 전후 염기가 무엇이든지, 즉 주위 3인조가 본래 규범적이든지 비규범적이든지 간에, 비규범적 T*GC 3인조 2개를 연속하여 도입시켰을 때에도 안정된 3중 나선이 형성되었다. 한편, 한쌍의 T*TA 형 3인조와 C*TA 3인조를 인접에 도입시킨 경우에는 3중 나선 구조의 안정성이 완전하게 상실되었다.
실시예 7: SeAP, hαFP, FIX 및 GAX 유전자를 암호화하는 카세트를 함유하는 플라스미드의 작제
본 발명에 따른 조성물의 활성을 입증하기 위해 본 실험에 사용한 유전자는 예를 들어 제 IX 인자를 암호하는 인간 유전자(Kurachi et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 79(1982) 6461), 분비형 알칼리 포스파타제 SeAP를 암호하는 인간 유전자(Millan et al., J.Biol.Chem., 261(1986) 3112), 알파 페토단백질 hαFP를 암호하는 인간 유전자(Gibbs et al., Biochemistry 26(1987) 1332) 및 GAX를 암호하는 인간 유전자(Gorski et al., Mol.Cell.Biol., 13(1993) 3722)이다. 이 유전자들을 플라스미드 또는 cDNA 라이브러리(클론테크)를 사용하여 PCR로 증폭시킨 다음, pXL3296 유래의 pCOR 플라스미드에 진핵 CMV E/P 프로모터 하류와 SV40 후기 폴리A 시그널 서열의 상류 사이에 클로닝하였다. 분비형 알칼리 포스파타제(SeAP)를 암호하는 유전자는 pXL3296 유래의 pCOR 플라스미드로 도입시켜 플라스미드 pXL3402를 수득하였다(도 4). 알파 페토단백질(hαFP)을 암호하는 유전자는 pXL3296 유래의 pCOR 플라스미드로 도입시켜 플라스미드 pXL3678을 수득하였다(도 5). GAX를 암호하는 유전자는 pXL3296 유래의 pCOR 플라스미드로 도입시켜 플라스미드 pXL3207을 수득하였다(도 6). 제IX 인자를 암호하는 유전자는 pXL3296 유래의 pCOR 플라스미드로 도입시켜 플라스미드 pXL3388(도 7)을 수득하였다.
실시예 8: 각종 당해의 유전자와 안정된 3중 나선 구조를 형성시키기 위한 5'-(CTT)7-3' 형 올리고뉴클레오타이드의 용도
올리고뉴클레오타이드 5'-TT(CTT)6-3'(서열번호 2)로 작용기화시킨 3중 나선 상호작용 겔과 각종 서열의 상호작용은 각종 유전자를 보유하는 플라스미드들에 의해 수득되는 능력을 측정하여 연구하였다. 연구된 유전자는 i) 제IX인자를 암호하는 인간 유전자, ii) 분비형 알칼리 포스파타제 SeAP의 유전자, iii) 알파 페토단백질(αFP)의 인간 유전자 및 iv) 인간 GAX 유전자이다.
표 5
유전자 유전자내의 표적 서열 능력(겔 1ml당 부착된 플라스미드 ㎍)
제IX인자 GAA GAA GCA CGA GAA G 71
SEAP AAA GAA AGC AGG GAA G GAA GAG GAA GAA G 100
hαFP AAG GAG AAG AAG AA 146
hGAX AA GAT GAG GAA GAA G 118
상기 표 5에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, (CTT)n 형의 올리고뉴클레오타이드를 사용한 결과, 당해의 유전자가 상기 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 5'-(GAA)n-3' 형의 표적 서열을 함유하지 않더라도 당해의 유전자와 안정된 3중 나선 구조가 형성되었다. 표적 서열의 중심 부분에 T*CG, C*CG, T*GC 및 C*AT 형의 3인조에 관련된 염기의 존재는 분리된 T*TA 3인조(GAX 유전자)의 존재와 마찬가지로 3중 나선 구조에 영향을 미치지 않았다.
실시예 9: 내재성 ID1 서열(5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3'; 서열번호 1)을 함유하는 플라스미드를 정제하기 위한 5'-(CTT) 7 -3' 형의 올리고뉴클레오타이드로 작용기화된 컬럼의 용도
5'-(CTT)7-3' 형의 올리고뉴클레오타이드로 작용기화되어, 3중 나선 상호작용에 의한 친화성을 이용하는 크로마토그래피 지지체를 가지고, 전술한 바와 같은 5'-(R)n-(N)t-(R')m-3' 형의 서열을 보유하는 플라스미드를 정제할 수 있는 가능성을, 실시예 8에 근거하여 조사하였다.
플라스미드 pXL3179(서열 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3'을 보유하는 인간 FGF1 유전자 함유)를, 올리고뉴클레오타이드 5'-NH2-(CH2)6-(CTT)7-3'로 작용기화된 세파크릴 S-1000 상호작용 컬럼을 통해 크로마토그래피하였다. 이를 위해, 50mM 아세트산나트륨, 2M NaCl 완충액(pH 4.5) 60ml에 플라스미드 pXL3179 9.40mg을 용해시킨 용액을, 실시예 3에 기술된 바와 같이 세파크릴 S-100 SF에 올리고뉴클레오타이드 5'-NH2-(CH2)6-(CTT)7-3'를 공유 결합시킨 10ml 친화성 컬럼 상에 30cm/h의 유속으로 주입하였다. 컬럼을 동일한 완충액 5부피량으로 세척한 후, 부착된 플라스미드를 2 컬럼 부피량의 100mM Tris/HCl, 0.5mM EDTA 완충액으로 용출시키고, UV 흡광도(260nm)를 측정하여 정량하고 GenPak-Fax 컬럼(워터스 제품)을 통해 이온 교환 크로마토그래피를 실시하여 정제하였다. 최초 제조물에 함유된 대장균 게놈 DNA 함량과 정제된 분획에 함유된 대장균 게놈 DNA 함량을 WO96/18744에 기술된 바와 같이 PCR로 측정하였다. 용출된 분획에서 플라스미드 pXL3179 7.94mg이 관찰되었고(용출율 84%), 대장균 게놈 DNA의 오염율은 전술한 친화성 크로마토그래피에 의해 7.8%에서 0.2%로 감소되었다. 이와 마찬가지로, RNA에 의한 오염율은 최초 플라스미드에서 나타나는 43%에서, 정제된 플라스미드에서 나타나는 0.2%로 감소되었 다.
올리고뉴클레오타이드 5'-NH2-(CH2)6-(CTT)7-3'로 작용기화된 세파크릴 S-1000 친화성 컬럼을 통해 크로마토그래피된 각종 플라스미드 pXL 3179 제조물에 대해 실시한 여러 다른 크로마토그래피 실험에서 게놈 DNA 함량은 0.2%에서 0.007%로, 0.7%에서 0.01%로, 7.1%에서 0.2%로, 또는 7.8%에서 0.1%로 감소하였다.
실시예 10: 치료 목적의 유전자인 인간 VEGFB-167과 안정된 3중 나선 구조를 형성시키기 위한 5'-CCT TTT CCT CCT T-3'형(서열번호 12) 올리고뉴클레오타이드의 용도
인간 VEGFB-167 유전자와 같은 치료 목적의 유전자에 내재하는 서열과, 올리고뉴클레오타이드 5'-CCT TTT CCT CCT T-3'(서열번호 12)로 작용기화된 3중 나선 상호작용 지지체의 상호작용은, 인간 VEGFB-167 유전자를 보유하는 플라스미드 pXL3579(도 8)(Olofsson et al., J.Biol.Chem., 271(1986) 19310)에 의해 수득되는 능력을 측정하여 조사하였다. 도 8에 도시한 플라스미드 pXL3579는 인간 심장 cDNA 라이브러리(클론테크)로부터 PCR에 의해 증폭된 뒤, 진핵성 CMV E/P (-522/+74) 프로모터의 하류와 SV40 후기 폴리A 시그널 서열의 상류에, pXL3296의 다중 클로닝 부위 중 NsiI와 XbaI 부위 사이에 클로닝시킨 VEGF-B167 유전자를 함유한다.
표 6
올리고뉴클레오타이드 유전자(VEGFB-167 또는 대조군) 내의 표적 서열 능력(겔 1ml당 부착된 플라스미드 ㎍)
CCT TTT CCT CCT T GGC AAC GGA GGA A 87
없음(대조용 백터) <0.5
CCT CCT T GGA GGA A <0.5
없음(대조용 벡터) <0.5
TTT TTT TTC CT AAA AAA AAG GA 15
없음(대조용 벡터) <0.5
상기 표 6에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, 5'-(R)n-(N)t-(R')m-3'형의 서열, 여기서는 인간 VEGFB-167 유전자의 5'-GGC AAC GGA GGA A-3'(서열번호 13) 영역을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 올리고뉴클레오타이드 5'-CCT TTT CCT CCT T-3'(서열번호 12)를 사용하여, 당해 유전자의 영역과 안정된 3중 나선 구조를 형성시킬 수 있었다. 더욱이, 인간 VEGFB-167 유전자가 올리고뉴클레오타이드 5'-TTT TTT TTC CT-3'(표 6)의 표적이 되는 호모퓨린 서열 5'-AAA AAA AAG GA-3'을 함유할지라도, 올리고뉴클레오타이드 5'-CCT TTT CCT CCT T-3'에 의해 수득되는 상호작용은 호모피리미딘 올리고뉴클레오타이드에 의해 수득되는 상호작용에 비해 매우 현저하게 우수하였다. 이와 마찬가지로, 내재성 호모퓨린 서열 5'-GGA GGA A-3'가 올리고뉴클레오타이드 5'-CCT CCT T-3'와 안정된 3중 나선을 형성하기에는 길이가 충분하지 않았다.
따라서, 본 실시예를 통해 분명히 알 수 있듯이, 특히 조사된 2본쇄 DNA가 유의적인 길이의 적어도 하나의 호모퓨린 구조를 나타내는 상황에서도, 안정된 3중 나선 구조를 형성하는데 있어서 5'-(R)n-(N)t-(R')m-3'형의 서열이 유리함을 확인할 수 있었다.
실시예 11: 변형된 VEGFB-186 cDNA 내의 표적 서열과 안정된 3중 나선 구조의 형성을 통해 비결실성 VEGFB-186 cDNA를 분리하기 위한 5'-T CCT CTCCCT C-3'형의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 14)의 용도
발효조에서 인간 VEGFB-186 유전자를 생산하는 단계 중에, 이 유전자가 특히 엑손 6A 중에 유전자 재배열 및 결실이 이루어진 부위임을 관찰하였다. 따라서, 해독점 +1에 대해, 뉴클레오타이드 510(A/C), 513(C/T), 516(A/T), 519(C/T) 및 522(C/T) 위치에 연속적인 돌연변이 PCR로 침묵형 점 돌연변이를 도입시켰다. 아미노산 170과 174 사이에 도입시킨 VEGFB-186 단백질의 아미노산 서열은 변형되지 않은 채 유지시켰다. 한편, VEGFB-186 변형 유전자(VEGFB-186m)는 올리고뉴클레오타이드 5'-T CCT CTC CCT C-3'(서열번호 14) 서열과 안정된 3중 나선 상호작용을 형성할 수 있는, 본 발명에 따른 표적 DNA 서열, 5'-A GGA GCG GGA G-3'(서열번호 15)을 나타내었다. 이와 같은 안정된 3중 나선 상호작용은 본 발명에 따른 공정을 수행하고, 발효조에서 생산된 후 재배열과 결실이 이루어진 바 없는 VEGFB-186 변형 유전자를 분리하는데 유리하게 사용된다.
VEGFB-186 변형 유전자의 3중 나선 상호작용에 의한 정제 과정을 설명하기 위하여, 도 9에 도시한 바와 같은 2개의 플라스미드 pXL3601과 pXL3977을 사용하였다. 먼저, VEGFB-186 유전자를 인간 심장 cDNA 라이브러리(클론테크)로부터 PCR로 증폭시킨 다음, 진핵성 CMV E/P (-522/+74) 프로모터의 하류와 SV40 바이러스 후기 영역의 폴리아데닐화 시그널 상류에, pXL3296(실시예 1.2)의 다중 클로닝 부위 중 NsiI와 XbaI 부위 사이에 클로닝시켜, 플라스미드 pXL3601을 수득하였다. 이 플라스미드 pXL3601을 연속적인 돌연변이 PCR로 변형시켜, 전술한 바와 같이 엑손 6A에서 VEGFB-186 유전자가 변형된 플라스미드 pXL3977을 수득하였다.
올리고뉴클레오타이드 5'-T CCT CTC CCT C-3'(서열번호 14)로 작용기화된 3중 나선 상호작용 지지체와, VEGFB-186m 유전자 내에 존재하는 표적 서열 5'-A GGA GCG GGA G-3'(서열번호 15)의 상호작용은 VEGFB-186 변형 유전자를 보유하는 플라스미드 pXL3977(도 9)에 의해 수득되는 능력을 측정하여 조사하였다. VEGFB-186m 서열 내에는 VEGFB-167 서열이 포함되어 있기 때문에, 인간 VEGFB-167 유전자를 포함하고 실시예 10에 기술된 바와 같은 플라스미드 pXL3579를 음성 대조군으로 사용하였다.
표 7
올리고뉴클레오타이드 pCOR-VEGFB-186m(pXL3977)(겔 1ml당 부착된 플라스미드 ㎍) pCOR-VEGFB-167(pXL3579)(겔 1ml당 부착된 플라스미드 ㎍) pCOR(pXL3296)(겔 1ml당 부착된 플라스미드 ㎍)
ID No.14 234 32 <1.0
ID No.16 224 0.5 내지 1.0 <1.0
상기 표 7에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, 5'-(R)n-(N)t-(R')m-3'형의 서열, 여기서는 변형된 인간 VEGFB-186 유전자의 5'-A GGA GCG GGA G-3'(서열번호 15) 영역을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 올리고뉴클레오타이드 (서열번호 14)를 사용하여, 당해 유전자의 영역과 안정된 3중 나선 구조를 형성시킬 수 있었으며, 따라서 그 유전자를 효율적으로 정제할 수 있었다. 또한, 올리고뉴클레오타이드 5'-TTT CCT CTC CCT C-3'(서열번호 16) 역시 인간 VEGFB-186 변형 유전자를 정제하는데 사용할 수 있다.
도 1은 플라스미드 pXL3179의 모식도;
도 2는 플라스미드 pXL3296의 모식도;
도 3은 플라스미드 pXL3426의 모식도;
도 4는 플라스미드 pXL3402의 모식도;
도 5는 플라스미드 pXL3678의 모식도;
도 6은 플라스미드 pXL3207의 모식도;
도 7은 플라스미드 pXL3388의 모식도;
도 8은 플라스미드 pXL3579의 모식도;
도 9는 플라스미드 pXL3601 및 pXL3977의 모식도이다.
<110> AVENTIS PHARMA SA <120> METHODS FOR PURIFYING AND DETECTING DOUBLE STRANDED DNA TARGET SEQUENCES BY TRIPLE HELIX INTERACTION <130> ST01011 <140> ST01011 <141> 2001-03-21 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aagaagcatg cagagaagaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description for the artificial sequence: OLIGONUCLEOTIDE <400> 2 ttcttcttct tcttcttctt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description for the artificial sequence: OLIGONUCLEOTIDE <400> 3 ttcttcttgc ttctcttctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description for the artificial sequence: OLIGONUCLEOTIDE <400> 4 ttcttcttgt ttctcttctt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description for the artificial sequence: OLIGONUCLEOTIDE <400> 5 ttcttcttcc ttctcttctt 20 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gaagaagcac gagaag 16 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aaagaaagca gggaag 16 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gaagaggaag aag 13 <210> 9 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aaggagaaga agaa 14 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 aagatgagga agaag 15 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description for the artificial sequence: OLIGONUCLEOTIDE <400> 11 gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description for the artificial sequence: OLIGONUCLEOTIDE <400> 12 ccttttcctc ctt 13 <210> 13 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggcaacggag gaa 13 <210> 14 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description for the artificial sequence: OLIGONUCLEOTIDE <400> 14 tcctctccct c 11 <210> 15 <211> 11 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 aggagcggga g 11 <210> 16 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description for the artificial sequence: OLIGONUCLEOTIDE <400> 16 tttcctctcc ctc 13

Claims (30)

  1. 2본쇄 DNA 분자를 제3 DNA 가닥과 접촉시키는 단계를 포함하는, 2본쇄 DNA 분자의 정제 방법으로서,
    상기 2본쇄 DNA 분자는 하기 화학식
    5'-(R)n-(N)t-(R')m-3'
    (상기 식에서,
    R과 R'는 퓨린 염기로만 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
    n과 m은 9 미만의 정수이며; n+m의 합은 5보다 크고;
    N은 퓨린 염기와 피리미딘 염기를 모두 포함하는 뉴클레오타이드 서열이고;
    t는 8 미만의 정수이다)
    으로 표시되는 적어도 하나의 표적 서열을 포함하고, 인간 VEGFB-167 유전자에 함유된 서열번호 13번 서열을 포함하며, 제3 DNA 가닥과 상호작용하여 3중 나선 구조를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는,
    2본쇄 DNA 분자의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 영역 N과 제3 DNA 가닥 사이의 상호작용이 최대 6개의 비규범적 3인조(noncanonical triads)를 형성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 형성된 비규범적 3인조가 T*CG, T*GC, C*AT 및 C*TA 3인조 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 영역 R 및 R'가 전체적으로 2개 이상의 구아닌(G)을 포함하는 것이 특징인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 영역 R 및 R'가 2개 이상의 아데닌을 포함하는 것이 특징인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 영역 R 및 R'가 제3 DNA 가닥과 T*AT 및 +C*GC 중에서 선택되는 규범적 3인조를 형성하는 것이 특징인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 제3 DNA 가닥이 호모피리미딘형인 것이 특징인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 제3 DNA 가닥이 폴리-CTT 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 제3 DNA 가닥이 올리고뉴클레오타이드인 것이 특징인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 서열번호 2 내지 5의 올리고뉴클레오타이드 서열 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 표적 서열이 2본쇄 DNA 분자에 천연적으로 존재하는 것이거나 또는 2본쇄 DNA 분자 중으로 인위적으로 도입된 표적 서열인 것이 특징인 방법.
  12. 제1항에 있어서, DNA 분자에 천연적으로 존재하는 표적 서열이 치료 또는 실험 목적의 유전자 암호 서열에 존재하는 서열인 것이 특징인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 2본쇄 DNA 분자가 플라스미드 또는 미니서클과 같은 원형 DNA, 또는 선형 단편인 것이 특징인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 공유적 또는 비공유적으로 지지체에 안정하게 결합된 것이 특징인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 천연 또는 합성 기원의 중합체에 융합되어 있는 것이 특징인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 지지체가 크로마토그래피 지지체, 플라스틱 표면 및 작용 기화된 라텍스 비드 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 크로마토그래피 지지체가 겔 투과 지지체인 것이 특징인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 2본쇄 DNA 분자를 함유하는 용액이 세포 용해물인 것이 특징인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포 용해물이 투명한 용해물인 것이 특징인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 2본쇄 DNA 분자가 예비정제된 것이 특징인 방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 서열 GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(서열번호 11)을 갖는 것임이 특징인 방법.
  22. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 디설파이드, 티오에테르, 에스테르, 아미드 또는 아민 부착을 통해 지지체에 결합되는 것임이 특징인 방법.
  23. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 탄소 계 사슬 (CH2)n(여기에서 n은 1 내지 18 사이의 정수임)로 이루어진 아암을 통해 지지체에 부착되고, 상기 아암이 포스페이트를 통해 올리고뉴클레오타이드에 결합되고 아민 부착을 통해 지지체에 결합되는 것임이 특징인 방법.
  24. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 뉴클레아제에 대한 내성 또는 보호성을 부여하거나 또는 특정 서열에 대한 그 올리고뉴클레오타이드의 친화성을 증가시키는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 것이 특징인 방법.
  25. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 적어도 하나의 시토신이 5' 위치에 메틸기를 보유한 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
  26. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 성분과 혼합된, 2본쇄 DNA를 함유하는 용액을, 올리고뉴클레오타이드가 공유 결합된 지지체와 접촉시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 것이 특징인 방법.
  27. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 성분과 혼합된, 2본쇄 DNA를 함유하는 용액을, 올리고뉴클레오타이드가 공유 결합된 크로마토그래피 지지 체 상으로 통과시키는 것이 특징인 방법.
  28. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 DNA 가닥이 라벨된 것이 특징인 방법.
  29. 제1항에 기재된 방법을 사용하여 수득할 수 있는 정제된 2본쇄 DNA.
  30. 2본쇄 DNA 분자를 함유할 것으로 예상되는 용액을, 이 2본쇄 DNA의 표적 서열과 하이브리드화에 의해 3중 나선을 형성할 수 있는 라벨된 제3 DNA 가닥과 접촉시키는 단계를 포함하는, 2본쇄 DNA의 검출 방법으로서,
    상기 표적 서열은 하기와 같은 화학식으로 표시되고,
    5'-(R)n-(N)t-(R')m-3'
    (상기 식에서,
    R과 R'는 퓨린 염기로만 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
    n과 m은 9 미만의 정수이며; n+m의 합은 5보다 크고;
    N은 퓨린 염기와 피리미딘 염기를 모두 포함하는 뉴클레오타이드 서열이고;
    t는 8 미만의 정수이다),
    상기 표적 서열은 인간 VEGFB-167 유전자에 함유된 서열번호 13번 서열을 포함하는, 2본쇄 DNA의 검출 방법.
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