MXPA03008642A - Metodos de purificacion y de deteccion de secuencias objetivo de adn de doble hebra mediante interaccion de triple helice. - Google Patents

Abstract

La presente invencion tiene por objeto nuevas secuencias blanco de ADN de doble hebra susceptibles de interactuar con una tercera hebra y de formar una triple helice estable. La presente invencion es concerniente ademas con un metodo de purificacion de una molecula de ADN de doble hebra de acuerdo con el cual se pone en contacto una solucion que contiene la molecula de ADN con una tercera hebra de ADN capaz de formar mediante hibridacion una estructura de triple helice con una secuencia blanco de ADN de doble helice portada por la molecula de ADN.

Description

MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y DE DETECCIÓN DE SECUENCIAS OBJETIVO DE ADN DE DOBLE HEBRA MEDIANTE INTERACCIÓN DE TRIPLE HÉLICE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene por objeto nuevas secuencias de ADN objetivo capaces de formar estructuras tipo triple hélice así como un nuevo método para la purificación de ADN. Más en particular, el método de purificación de acuerdo con la invención aplica una hibridación entre una secuencia de ADN objetivo y un oligonucléotido . El método de acuerdo con la invención demuestra ser particularmente útil porque permite purificar ADN de doble hebra de calidad farmacéutica con rendimientos elevados. La presente invención tiene igualmente por objeto nuevos métodos de detección, de cuantificación, de aislamiento ó de clasificación de moléculas de ADN que contienen las secuencias específicas objetivo. Los métodos _de purificación de acuerdo con la invención se apoyan esencialmente en una interacción de triple hélice entre una secuencia de ADN objetivo particular y un oligonucléotido compuesto de bases naturales o modificadas . Se ha demostrado que los oligonucléotidos homopirimídicos son capaces de interactuar específicamente en el gran surco de la doble hélice de ADN para formar localmente estructuras de tres hebras denominadas triple Reí: 150200 hélices (Moser, et . al., Science238 (1987) 645; Povsiz, et . al., J- Am. Chem 111 (1989) 3059). Estos oligonucléotidos reconocen selectivamente la doble hélice de ADN al nivel de secuencias de oligopurina-oligopirimidina, es decir, al nivel de regiones que poseen una secuencia oligopúrica sobre una hebra y una secuencia oligopirimídica sobre la hebra complementaria y ya forman localmente una triple hélice. Las bases de la tercera hebra oligonucléotidica homopirimídica forman enlaces de hidrógeno (enlaces de tipo Hoogsteen) con las purinas de pares de bases Watson-Crick. De la misma manera, estas estructuras de tipo triple hélice se pueden formar sobre un oligonucléotido homopúrico y un ADN de doble hebra homopúrico-homopirimidico . En este tipo de suiura las bases puras de oligonucléotidos forman enlaces de tipo Hoogsteen inverso con las bases púricas del ADN de doble hebra. Estas interacciones de triple hélice especificas del sitio han sido en particular aplicadas por Looney et. al. (Science 241 (1988) 456) para el control de la expresión de ciertos genes y por Hélén et . al. (BBA 1049 (1990) 99; WO 95/18223) que describe la formación de estructuras de triple hélice entre oligonucléotidos y secuencias objetivo presentes al seno de promotores o de regiones codificantes y asi la posibilidad de modelar el perfil de expresión de estos genes, probablemente mediante una acción inhibidora de la ARN polimeraza al nivel de iniciación y/o de alargamiento. Este tipo de interacción triple hélice para la purificación de ADN plasmidico a partir de una mezcla compleja que contiene la molécula de ADN en mezcla con otros componentes ha sido igualmente descrita en la solicitud internacional WO 96/18744 p¾ra la purificación de ADN plasmidico. Más en particular, esta solicitud describe un método de purificación de ADN de doble hebra que consiste en poner en contacto la mezcla compleja y un soporte sobre el cual se encuentra acoplado de manera covalente un oligonucléotido capaz de formar mediante hibridación una triple hélice con una secuencia especifica del ADN objetivo. En esta interacción especifica de tipo triple hélice con fines de unificación, la especificidad es debida a los apareamientos que ponen en juego los enlaces de hidrógeno de tipo Hoogsteen entre bases de timina (T) de tercera hebra constituida por el oligonucléotido por una parte y pares de base AT del ADN de doble hebra por otra parte, para formar triadas T*AT. Asimismo, estas citosinas protonadas situadas en la tercera hebra se aparecen a pares de base GC del ADN de doble hebra para formar triadas +C*GC. (Sun et . al., Curr. Opin Struc Biol.. 3 (1993) 345). Ha sido al presente establecido que estas triadas T*AT y +C*GC (denominadas triadas canónicas) aseguran una estabilidad máxima de la triple hélice. No obstante, numerosos otros actores intervienen igualmente en la estabilización de la triple hélice, tales como por ejemplo el porcentaje de citosinas, el pH, la salinidad del medio o el medio ambiente de la triple hélice. Se ha descrito extensamente que la introducción de triadas denominadas no canónicas (es decir, diferentes de las triadas T*AT y +C*GC) provoca una deformación estructural más o menos importante al nivel de la triple hélice y ocasiona sistemáticamente una desestabilización significativa de la misma. La introducción de diferentes triadas no canónicas ha sido por otra parte estudiada en el marco de estudios comparativos (Roberts et. al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 9397; Fossella et. al., (1993) Nucleic Acids Research (1997) 25, 3787) que muestran una desestibilización variable de la triple hélice en función de la naturaleza de la triada no canónica introducida. Si este método permite una purificación rápida y eficaz de un ADN objetivo de calidad farmacéutica, necesita no obstante que una secuencia suficientemente larga, de preferencia homopúrica perfecta, esté presente sobre una de las dos hebras del ADN a purificar y que sea complementaria a la tercera hebra del ADN. Esta secuencia puede estar naturalmente presente o ser insertada artificialmente al seno de la secuencia objetivo del ADN de doble hebra que se desea purificar . Se ha descubierto ahora de manera sorprendente e inadvertida que una molécula de ADN que porta sobre una hebra una secuencia de ADN objetivo no esencialmente compuesta de bases púricas es igualmente susceptible de formar una estructura de triple hélice estable con una tercera hebra de ADN, a pesar de la presencia de bases no complementarias a aquellas del oligonucléotido que conducen a la formación de triadas no canónicas. Más precisamente, las nuevas secuencias de ADN de doble hebra objetivo identificadas comprenden en una hebra una secuencia homopúrica interrumpida por un número determinado de bases pirimidicas. Se ha descubierto igualmente que estas secuencias de ADN ó púricas homopirimidicas imperfectas pueden ser utilizadas para purificar eficazmente las moléculas de ADN que las contienen mediante interacción de triple hélice. Las secuencias nuevas identificadas son además particularmente útiles para la detección, la cuantificación, aislamiento o clasificación de moléculas de ADN que las contiene . La presente invención tiene asi por objeto nuevas secuencias de ADN objetivo que comprenden sobre una hebra una secuencia que tiene la fórmula general siguiente: 5'-{R)n-(N)t-(R' )m-3' en la cual: R y R' representan nucléotidos compuestos únicamente de bases púricas; n y m son números enteros menores de 9 y la suma de n + m es superior a 5; N es una secuencia de nucleotidos que comprende a la vez bases púricas y bases pirimídicas ; t es un número entero menor de 8; la secuencia de ADN es susceptible de interactuar con una tercera hebra de ADN y asi conducir a la formación de una estructura de triple hélice. Las secuencias homopúricas R y R' situadas respectivamente en las partes 5' y 3' de la secuencia de ADN objetivo tiene una longitud total superior o igual a 6. Comprenden bases de adenina y guanina susceptibles ' de interactuar con una tercera hebra con el fin de conducir a la formación de una estructura de triple hélice constituida de triadas canónicas T*AT y *C*GC. De preferencia, las secuencias homopúricas R y R' comprenden por lo menos 2 guaninas en total y por lo menos 2 adeninas. De manera aún más preferida, estas secuencias púricas comprenden una porción de tipo (AAG) . La secuencia central N tiene una longitud t menor de 8 pares de bases púricas y pirimídicas y es capaz de acuerdo con la invención de interactuar con una tercera hebra de ADN, con el fin de conducir a la formación de tríadas no canónicas. De preferencia, la secuencia central N tiene una longitud superior o igual a l e inferior a 8. De manera aún más preferida, la secuencia central N tiene una longitud superior o igual a 2 e inferior a 8. Se entiende por triada canónica, las dos triadas nucleotidicas resultantes de la interacción de los dobletes AT y GC del ADN de doble hebra de las bases T y +C para dar respectivamente las triadas T*AT y +C*GC. Estas dos triadas son de entre las 16 triadas existentes, aquellas que tienen la estabilidad más fuerte. Se entiende por triada no canónica, el conjunto de 14 otras triadas nucleotidicas. Resultan de la interacción de un ADN de doble hebra con una tercera hebra de ADN de manera no especifica y que presenta una estabilidad menor en relación con las triadas canónicas T*AT y +C*GC. Se pueden citar en particular las triadas no canónicas T*CG y T*GC que son formadas respectivamente por interacción entre un doblete CG ó GC de la secuencia objetivo y una timina (T) de la tercera hebra, la triada no canónicas G*CG resultante de la interacción un doblete CG de la secuencia objetivo y una guanina (G) de la tercera hebra, las triadas no canónicas C*AT y C*TA que resultan de la interacción respectivamente de los dobletes AT y TA de la secuencia cultivo y de citosinas (C) situadas en la tercera hebra, la triada no canónica G*CG que es formada mediante interacción de un doblete CG con una guanina (G) de la tercera hebra ó aún la triada T*TA que resulta de la interacción de un doblete TA con una timina (T) de la tercera hebra. Se comprende que, como los extremos púricos en el 5' y en 3' la secuencia central N puede también formar triadas canónicas T*AT y +C*GC resultantes de la interacción respectiva de los dobletes AT y GC con las bases de timina (T) y citosina (C) situadas sobre la tercera hebra del ADN. De preferencia, la secuencia central N comprende bases púricas y pirimidicas conducentes a la formación de a lo más 6 triadas no canónicas. De manera más preferida, las tríadas no canónicas resultantes de la interacción de la parte central con el oligonucleótido son escogidos de entre las triadas no canónicas T*CG, T*GC, C*AT y C*TA. Como ejemplos de reparticiones preferidas de estas triadas, se puede citar la formación de seis triadas no canónicas que comprenden una C*AT, una C*TA, dos T*CG y dos T*GC, la formación de cinco triadas no canónicas que comprenden dos C*AT y tres T*GC ó aún la formación de tres tríadas no canónicas que comprenden dos T*CG y una C*AT. Varias tríadas no canónicas T*TA pueden igualmente estar presentes, pero en este caso, no son colocadas consecutivamente al seno de la triple hélice. La secuencia central comprende de preferencia a lo más tres bases pirimidicas C ó T conducentes a la formación de tríadas no canónicas T*CG y C*TA ó G*TA. Preferiblemente, las tres bases pirimídicas no son consecutivas sino que están espaciadas por bases púricas A ó G, que pueden interactuar con la tercera hebra del ADN para formar las bases no canónicas T*GC y C*AT así como tríadas canónicas T*AT y +C*GC. De acuerdo con una modalidad particular de la invención, la secuencia objetivo de ADN de doble hebra es la secuencia 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3 ' (SEQ. ID. No. :1) . La tercera hebra de ADN que es susceptible de interactuar con las secuencias de ADN de doble hebra de acuerdo con la invención puede ser por ejemplo un oligonucléotido o la hebra de otro ADN de doble hebra en estado desaparecido localmente y puede contener las bases siguientes: timina (T) , que es capaz de formar tríadas canónicas T*AT con los dobletes AT de la secuencia objetivo de ADN de doble hebra, así como tríadas no canónicas T*CG y T*GC respectivamente con los dobletes CG y GC de la secuencia de ADN objetivo (Soyfer et. al., in Triple Helical Nucleic Acids (1996) Springer, New Yor, pp. 151-193) ; - guanina (G) que es capaz de formar tríadas G*TA con los dobletes TA del ADN de doble hebra (Soyfer et . al., in Triple Helical Nucleic Acids (1996) Springer, New Yor, pp. 151-193) ; citosina (C) que es capaz de formar triadas canónicas +C*GC (citosina protonada C+) ó no canónicas C*AT y C*TA, respectivamente con los dobletes GC, AT y TA del ADN de doble hebra objetivo y - uracilo que es capaz de formar tripletes con los pares de base AU ó AT de la secuencia objetivo (Bates et . al., Nucleic Acids Research 23 (1995) 3627) . De preferencia, la tercera hebra de ADN utilizada comprende una secuencia homopirimidica rica en citosinas, que están presentes en estado protonado en pH ácido y estabilizan la triple hélice. Tales oligonucléotidos pueden comprender por ejemplo la secuencia (CCT)n, la secuencia (CT)n ó la secuencia (CTT)n, en la cual n es un número entero comprendido entre 1 y 20 inclusive. Es particularmente ventajoso utilizar secuencias de tipo (CT)n, (CTT)n ó bien secuencias en donde son combinadas porciones (CCT) , (CT) ó (CTT) . Cuando la tercera hebra de ADN se presenta en forma de un oligonucléotido, el mismo puede ser natural, es decir, compuesto de bases naturales, no modificadas ó aún modificada químicamente. En particular, el oligonucléotido puede presentar ventajosamente ciertas modificaciones químicas que permiten aumentar su resistencia o protección frente a nucleasas o su afinidad frente a la secuencia específica. De acuerdo con la presente invención se entiende por oligonucléotido cualquier encadenamiento de nucléosidos que han sufrido una modificación del esqueleto con el objeto de volverlos más resistentes a las nucleasas. De entre las modificaciones posibles se pueden citar, los oligonucléotidos iosforotioatos que son capaces de formar triples hélices con el ADN (Xodo, et. al., Nucleic Acids Research, 22 (1994) 3322) , asimismo como oligonucléotidos que poseen esqueletos formacetal ó metilfosfonato (Matteucci, et . al., J. Am. Chem. Soc. , 113 (1991) 7767). Se pueden utilizar igualmente los oligonucléotidos sintetizados con a-anómeros de nucléotidos, que forman igualmente triples hélices con el ADN (Le Doan, et. al., Nucleic Acids Research, 15 (1987) 7749). Otra modificación del esqueleto es el enlace de fosforamidato . Se puede citar por ejemplo en enlace internucleotidico N3'-P5' fosforamidato descrito por Gryaznov et . al. (J. Am. Chem. Soc, 116 (1994) 3143), que da oligonucléotidos que forman con el ADN triples hélices particularmente estables. De entre las otras modificaciones del esqueleto se pueden citar igualmente la utilización de ribonucleótidos , de 2'-0-metilribosa ó fosfodiéster (Sun, et . al., Curr. Opinión in Struct, Biol-, 3 (1993) 3143). El esqueleto de fósforo puede finalmente ser reemplazado con un esqueleto de poliamida como en el ??? (Ácido Péptido Nucléico) que puede igualmente formar triples hélices (Nielsen, et . al., Science, 254 (1991)1497; Kim, et . al., J. Am. Chem. Soc, 115 (1993) 6477-6481) . La timina de la tercera hebra puede también ser reemplazada por un 5-bromouracilo, lo que aumenta la afinidad del oligonucléotido por el ADN (Povsic, et. al., J. Am. Chem. Soc, 111 (1989) 3059) . La tercera hebra puede igualmente contener bases no naturales, de entre las cuales se pueden citar la 7-deaza-2' -desoxisantocina (Milligan, et . al., Nucleic Acids Res., 21 (1993) 327), la 1- (2-desoxi-alfa-D-ribofuranosil ) -3-metil-5-amino-lH-pirazolo [ 4 , 3-d] irimidin-7-ona (Koh, et. al., J. Am. Chem. Soc, 114 (1992) 1470), la 8-oxoadenina, la 2-aminopurina, la 2' -O-irtetil-pseudoisocitidina ó cualquier otra modificación conocida por aquél de experiencia ordinaria en la técnica (Sun, et . al., Curr. Opinión in Struct . Biol., 3 (1993) 345) . Otro tipo de modificación de la tercera hebra tiene más en particular por objeto mejorar la interacción y/o afinidad entre la tercera hebra y la secuencia especifica. En particular, una modificación del todo ventajosa de acuerdo con la invención consiste en metilar las citosinas del oligonucléotido en posición 5. El oligonucléotido asi metilado presenta la propiedad notable de formar una triple hélice estable con la secuencia especifica en zonas de pH más próximas a la neutralidad (> 5; Xodo, et . al., Nucleic Acids Research 19 (1991) 5625) . Permite asi trabajar a pH más elevados que los oligonucléotidos de la técnica previa, es decir, a pH en donde los riesgos de degradación del ADN plasmidico son inferiores. La longitud puede ser adaptada al caso por aquél de experiencia ordinaria en la técnica en función de la selectividad y de la estabilidad de la interacción buscadas. Las terceras hebras de ADN de acuerdo con la invención pueden ser sintetizadas mediante cualquier técnica conocida. En particular, pueden ser preparadas por medio de sintetizadores de ácidos nucléicos. Cualquier otro método conocido para aquél de experiencia ordinaria en la técnica puede evidentemente ser utilizado. Estas terceras hebras de ADN ó estos oligonucléotidos son capaces de formar una triple hélice con una secuencia especifica de ADN de doble hebra tal como la descrita anteriormente, que comprende una región interna N mixta (pirimidica-púrica ) de una longitud menor de 8 nucléotidos flanqueada por dos regiones homopúricas R y R' . Estas últimas pueden por ejemplo comprender una porción de tipo GAA. Como ejemplo, se puede citar la secuencia de ADN de doble hebra objetivo correspondiente a la secuencia: 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA -3' (SEQ. ID. No.: 1), que es capaz de formar una triple hélice con un oligonucléotido que comprende una secuencia escogida de entre las secuencias siguientes-: 5'-TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT - 3' (SEQ . ID. No . : 2), 5'-TT CTT CTT GTT TCT CTT CTT - 3' (SEQ. ID. No.: 3), 5'-TT CTT CTT GTT TCT CTT CTT - 3' (SEQ . ID. No . : 4) y 5'-TT CTT CTT CCT TCT CTT CTT - 3' (SEQ. ID. No . : 5). La formación de la triple hélice podría ser obtenida en presencia de iones g2+ que pueden igualmente favorecer la estabilización de esta estructura (Vasquez, et . al., Biochemistry 34 (1995) 7423; Beal, et . al., Science 251 (1991) 1360) . De acuerdo con una modalidad preferida, las secuencias de ADN objetivo de acuerdo con la invención pueden estar presentes naturalmente sobre un ADN de doble hebra y es entonces particularmente interesante utilizar un oligonucléotido capaz de formar una triple hélice con una tal secuencia presente por ejemplo en la secuencia de genes de interés tales como genes de interés terapéutico o experimental ó genes marcadores. A este respecto, se han analizado las secuencias nucleotídicas de diferentes genes de interés y se ha probado la estabilidad de interacciones de triple hélice con un oligonucléotido de tipo (CTT)n y se ha podido demostrar que ciertas regiones de estos genes conducen a la formación de una triple hélice estable a pesar de la presencia de tríadas no canónicas tales como T*CG, T*GC, C*AT, C*TA y T*TA. De entre las secuencias que están naturalmente presentes sobre un ADN de doble hebra, se pueden citar la secuencia 5' -?? GAA GCA TGC AGA GAA GAA -3' (designada ID1) (SEA. ID. No. : 1) presente en la secuencia del gen humano FGF1 (Jaye, et . al., Science 233 (1986) 541), la secuencia 5' -GAA GAA CGA CGA GAA G -3' (SEA. ID. No.: 6) del gen humano que codifica para el factor IX implicado en la coagulación (Kurachi, et.al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 79 (1982) 6461), las secuencias 5'-AAA GAA AGC AGG GAA G -3' (SEA. ID. No.: 7) y 5'-GAA GAG GAA GAA G -3' (SEA. ID. No.: 8) del gen de la fosfatasa alcalina secretada SeAP (Millan, et . al., J. Biol.. Chem., 261 (1986) 3112), la secuencia 5' -AAG GAG AAG AAG AA G -3' (SEA. ID. No.: 9) del gen humano de la alfa feto-proteina haFp (Gibbs, et. al., Biochemistry 26 (1987) 1332) y la secuencia 5'-AA GAT GAG GAA GAA G -3' (SEA. ID. No.: 10) del gen humano GAX que permite controlar la restenosa (Gorski, et . al., Mol. Cell . Biol., 13 (1993) 3722), finalmente la secuencia 5'-GGC AAC GGA GGA A-3' (SEA. ID. No.: 13) del gen VEGFB-167 humano (Olofsson, et . al., J. Biol. Chem., 271 (1996) 19310). La formación de una triple hélice con una secuencia presente en un gen de interés terapéutico ó experimental es particularmente ventajosa en la medida que la secuencia o cultivo está naturalmente presente en la molécula de ADN de doble hebra y no es necesario modificar el ADN de doble hebra objetivo o el plásmido que porta este gen para incorporar una secuencia especifica artificial. Alternativamente, una secuencia objetivo puede igualmente ser introducida de manera artificial al seno del ADN de doble hebra. Un segundo aspecto de la presente invención reside en un método para la purificación del ADN de doble hebra, en el cual se pone en contacto una solución que contiene un ADN, en mezcla con otros componentes, con una tercera hebra de ADN tal como la descrita anteriormente, que es entonces de preferencia un oligonucléotido capaz de formar mediante hibridación una triple hélice con una secuencia especifica presente sobre el ADN de doble hebra tal como el descrito anteriormente. De preferencia, el ADN de doble hebra es puesto en contacto en solución con el oligonucléotido inmovilizado sobre un soporte. De manera aún más preferida, el oligonucléotido es acoplado de manera estable, covalente o no covalente a tal soporte. Asi, la etapa de puesta en contacto de una solución que contiene un ADN de doble hebra puede ventajosamente consistir en hacer pasar la solución de ADN en mezcla con otros componentes sobre el soporte al cual está acoplado del oligonucléotido, con el fin de obtener el ADN de doble hebra que se desea purificar de manera eficaz y rápida . Tales soportes son bien conocidos por aquel de experiencia ordinaria en la técnica y comprenden por ejemplo constituidas por bolas ó microparticulas tales como micropartículas de látex ó cualquier otro soporte en suspensión. El oligonucléotido puede igualmente ser injertado sobre una molécula de tipo polímero de origen natural ó sintético. De preferencia, el polímero sobre el cual se fija el oligonucléotido presenta una propiedad que le permite ser fácilmente separado de la solución después de la formación de la triple hélice con el ADN de doble hebra. De entre los polímeros naturales se pueden citar las proteínas, lípidos, azúcares o polioles. De entre los polímeros sintéticos se pueden citar las poliacrilamidas, polietilen glicol, derivados estirénicos ó polímeros termosensibles como por ejemplo, los compuestos de tipo poli (N-isopropilacrilamida) , que son solubles a baja temperatura y se vuelven insolubles por encima de su temperatura de transición de fase (T. ori, et. al., Biotechnology and Bioengineering, 72 (2001) 261). El método de purificación de acuerdo con la presente invención es particularmente útil porque permite (i) la purificación de moléculas de ADN que no contienen secuencia homopúrica de longitud suficientemente grande para permitir la formación de una estructura de triple hélice estable con un oligonucléotido horaopirimídico, pero igualmente (ii) las moléculas de ADN en donde la secuencia homopúrica es interrumpida por varias bases pirimídicas. Además de permitir la purificación de una más grande variedad de moléculas de ADN, este método es igualmente rápido y conducido a rendimientos y a grados de pureza particularmente elevados . Por otra parte, permite purificar moléculas de ADN a partir de mezclas complejas que comprenden otros ácidos nucléicos, proteínas, endotóxinas (tales como lipopolisacáridos ) , nucléasas, etc. y obtener un ADN purificado de calidad farmacéutica. Para permitir su acoplamiento covalente sobre el soporte, el oligonucléotido es en general vuelto funcional. Así, puede ser modificado por . un grupo terminal tiol, amina ó carboxilo, en posición 5' ó 3' . En particular, la adición de un grupo tiol, amina ó carboxilo permite por ejemplo acoplar el oligonucléotido sobre un soporte que porta funciones disulfuro, maleimida, amina, carboxilo, éster, epoxido, bromuro de cianógeno ó aldehido. Estos acoplamientos se pueden formar al establecer enlaces de disulfuro, tioéter, éster, amida ó amina entre el oligonucléotido y el soporte. Cualquier otro método conocido para aquél de experiencia ordinaria en la técnica puede ser utilizado, tales como reactivos de acoplamiento bifuncionales , por ejemplo. Por otra parte, para mejorar la hibridación con el oligonucléotido acoplado, puede ser ventajoso que el oligonucléotido contenga un "brazo" y una "secuencia de bases" separadoras. La utilización de un brazo permite en efecto fijar el oligonucléotido a una distancia escogida del soporte que permite mejorar las condiciones de interacción con el AD . El brazo está ventajosamente constituido por una cadena carbonada lineal, que comprende 1 a 18 y de preferencia 6 a 12 grupos de tipo C¾ y una amina que permite el enlace a la columna. El brazo es enlazado a un fosfato del oligonucléotido ó de un "separador" compuesto de bases que no interfieren con la hibridación. Asi, "separador" puede comprender bases púricas. Por ejemplo, el "separador" puede comprender la secuencia GAGG. El oligonucléotido acoplado al soporte de purificación puede tener por ejemplo la secuencia 5'- GAGG CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT -3' (GAGG (CTT)7; SEQ. ID. No.: 11) en la cual las bases GAGG no están implicadas en una estructura de triple hélice sino que permite formar un espacio entre el oligonucléotido y el brazo de acoplamiento. Para la aplicación de la presente invención, diferentes tipos de soportes pueden ser utilizados. Se pueden tratar de soportes de cromatografía vueltos funcionales, a granel o preacondicionados en columna, superficies plásticas vueltas funcionales ó bolas de látex vueltas funcionales, magnéticas ó no. Se trata preferiblemente de soportes de cromatografía para permeación de gel. Como ejemplo, los soportes de cromatografía que pueden ser utilizados son agarosa, acrilamida ó dextranes así como sus derivados (tales como Sephadex®, Sepharose®, Superóse®. . . ) , polímeros tales como poli (estirendivinilbenceno) o sílice injertada ó no injertada, por ejemplo. Las columnas de cromatografía pueden funcionar en modo de difusión o de perfusión ó aún en un sistema denominado de "lecho fluidizado" ó "expandido" utilizando un soporte de cromatografía en donde la densidad es adaptada a este modo particular de aplicación. El método de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado para purificar cualquier tipo de ADN de doble hebra. Se trata por ejemplo de ADN circular, tal como un minicírculo (Darguet, et. al., Gene Therapy 6 (1999) 209), un fragmento lineal, un plásmido que porta en general uno o varios genes de interés terapéutico o experimental. Este plásmido puede portar igualmente un origen de replicación, por ejemplo e tipo condicional (tales como los plásmidos pCOR que son descritos por Soubrier, et. al., Gene Therapy 6 (1999) 1482), un gen marcador, etc. El método de la invención puede ser aplicado directamente a un lisado celular. En este modo de realización, el , plásmido amplificado mediante transformación y luego cultivo celular, es purificado directamente después de la lisis de las células . El método de acuerdo con la invención puede igualmente ser aplicado a un lisado claro, es decir al sobrenadante obtenido después de la neutralización y centrifugación del lisado celular. Puede evidentemente ser aplicado igualmente a una solución pre-purificada mediante métodos conocidos. Este método permite también purificar el ADN, lineal o circular, que porta una secuencia de interés, a partir de una mezcla que comprende ADN de diferentes secuencias. El método de acuerdo con la invención puede igualmente ser utilizado para la purificación de ARN de doble hebra. El lisado celular puede ser un lisado de células procarióticas o eucarióticas . Se trata de células procarióticas, se pueden citar por ejemplo las bacterias E. coli, B. subtilis, S. typhimurium, S. aureus ó Streptomyces . Si se trata de células eucarióticas, se pueden citar las células animales, levaduras, hongos, etc. y más en particular, las levaduras Kluyveromyces ó Saccharomyces ó las células COS, CHO, CI27, NIH3T3, RC25, 293, etcétera. El método de la invención es particularmente ventajoso porque permite obtener de manera rápida y simple el ADN. plasmídico de muy alta pureza. En particular, como se ilustra en los ejemplos, este método permite separar eficazmente el ADN plasmídico de componentes contaminantes, tales como el ADN cromosómico fragmentado, los ARN, las endotóxinas, las proteínas o las nucleasas. El método de la invención puede además ser útil para la purificación y el enriquecimiento de moléculas de ADN y en particular de genes de interés terapéutico tales como el gen FGF1, que son producidos y purificados a una escala industrial y en donde la pureza debe ser compatible con un uso farmacéutico. De acuerdo con un tercer aspecto, la presente invención tiene por objeto un método de detección, cuantificación y clasificación de moléculas de ADN de doble hebra que comprende por lo menos una secuencia objetivo tal como se describe previamente, que consiste en (a) poner en contacto una solución que se sospecha contener moléculas con una tercera hebra de ADN por ejemplo un oligonuciéotido marcado, a manera de formar una triple hélice estable y '(b) detectar el complejo eventualmente formado entre, el ADN de doble hebra y la tercera hebra del ADN. Este método es útil en particular en el marco de análisis de genomas al permitir por ejemplo la detección de una secuencia de ADN particular en un genoma o la clasificación de secuencias especificas. La tercera hebra del ADN ó el oligonuciéotido, de acuerdo con este aspecto de la presente invención, puede ser marcado al incorporar un marcador detectable mediante medios espectroscópicos , fotoquimicos , bioquímicos, inmunoquimicos ó aún químicos. Por ejemplo, tales marcadores pueden consistir de isótopos radioactivos (32P, 33P, 3H, 35S) ó aún moléculas fluorescentes (5-bromodesoxiuridina, fluoresceína, acetilaminofluoreno, digoxigenina) . La marcación es realizada de preferencia mediante incorporación de moléculas marcadas al seno de los polinucléotidos mediante extensión de cebos o bien, mediante adición sobre los extremo 5' ó 3' . Ejemplos de marcaciones no radioactivas son descritas en particular en la patente francesa No. FR 78 109 75 ó aún en los artículos de Urdea, et. al., (1988, Nucleic Acids Research, 11: 4937-4957) ó Sánchez-pescador et. al., (1988; J. Clin. Microbiol., 26(10): 1934-1938). De acuerdo con este aspecto particular de la presente invención, la tercera hebra del ADN ó el oligonucléotido puede igualmente ser inmunizada sobre un soporte tal como se describe anteriormente. Un cuarto aspecto de la presente invención es concerniente con una necesidad ó un kit para la purificación y/o detección de la presencia de un ADN de doble hebra de acuerdo con la invención en una mezcla compleja necesaria que comprende uno o varios oligonucléotidos tales como se describen anteriormente. Aquellos pueden ser inmovilizados sobre un soporte y/o comprender un marcador detectable. De acuerdo con este aspecto de la presente invención, el kit de 'detección descrito anteriormente en la presente, tal kit comprenderá una pluralidad de oligonucléotidos conformes a la invención que podrían ser utilizados para detectar secuencia objetivo de ADN de doble hebra de interés.

Asi, los oligonucléotidos inmovilizados sobre un soporte pueden ser ordenados en matrices tales como los "chips de ADN". Tales matrices ordenadas han sido en particular descritas en la patente US No. 5,143,854, en las solicitudes PCT No. WO 90/ 150 70 y 92/10092. Las matrices de soporte sobre las cuales los oligonucléotidos han sido inmovilizados que tienen una alta densidad son por ejemplo descritas en la patente US No. 5,412,082 y la solicitud PCT No. WO 95/11995. La presente solicitud será descrita más en detalle con la ayuda de ejemplos que siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitantes.

LEYENDA DE LAS FIGURAS: La figura 1 es una representación esquemática del plásmido pXL 3179; La figura 2 es una representación esquemática del plásmido pXL 3296; La figura 3 es una representación esquemática del plásmido pXL 3426; La figura 4 es una representación esquemática del plásmido pXL 3402; La figura 5 es una representación esquemática del plásmido pXL 3678; La figura 6 es una representación esquemática del plásmido pXL 3207; La figura 7 es una representación esquemática del plásmido pXL 3388; La figura 8 es una representación esquemática del plásmido pXL 3579; La figura 9 es una representación esquemática de los plásmidos pXL 3601 y pXL 3977.

Técnicas generales de clonación y de biología molecular Los métodos clásicos de biología molecular tales como digestiones mediante enzimas de restricción, electroforesis sobre gel, ligación de fragmentos de ADN, transformación a E. coli, la precipitación de ácidos nucléicos, secuenciación, etc., · son descritos en la literatura (Maniatis, et. al.m (1989) Molecular cloning: a laboratoy manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel, et. al., (1987) Current protocols i-n molecular biology, John Willey and Sons, New York) . Las enzimas de restricción han sido provistas por New-England Biolabs Beverly, MA (Biolabs) . Los oligonucléotidos son sintetizados utilizando la química de fosforamidites protegidos en mediante un grupo cianoetilo (Sinha, et . al., Nucleic Acids Research, 12 (1984) 4539; Giles (1985) con el sintetizador automático de ADN de la compañía Applied Biosystem 394 utilizando las recomendaciones del fabricantes. Los oligonucléotidos utilizados para la síntesis de geles de afinidad son obtenidos de la compañía Amershan Pharmacia Biotech (Uppsala, Suede) ó de Eurogentec (Seraing, Belgique) y son utilizados como tales. Las cepas que permiten la replicación de plásmidos pCOR y las condiciones de crecimiento y de selección de estos plásmidos ya han sido descritos (Soubrier, et. al., Gene Therapy 6 (1999) 1482) .

E emplo 1 : Construcción de plásmidos 1.1. El plásmido pXL3179 (pCOR-FGFl) El plásmido pXL3179 que es mostrado en la figura 1, es un vector derivado del plásmido pXL2774 (WO 97/10343; Soubrier, et . al., Gene Therapy 6 (1999) 1482) en el cual, el gen que codifica para una fusión entre el péptido señal del interferón de fibroblastos humanos y el ADNc del FGF1 (factor de crecimiento de fibroblasto 1) (sp-FGFl, Jouanneau, et. al., PNAS 88 (1991), 2893) ha sido introducido bajo control del promotor procedente de la región ' precoz del citomegalovirus humano (hCMV IE E/P) y de la señal de poliadenación de la región tardía del virus SV40 (SV40 late polyA; Genbank SV4CG) . 1.2. El plásmido pXL 3296 (pCOR) El plásmido pXL 3296 derivado del plásmido pXL 3179 en el cual la secuencia del gen sp-FGFl ha sido reemplazada por el multisitio de clonación del plásmido pUC28 (Benes, et . al., Gene 130 (1993) 151). El plásmido pXL3296 es representado en la figura 2. 1.3. El plásmido pXL3426 (pCOR-IDl) El plásmido pXL3426 derivado del plásmido pXL3296 en el cual la secuencia 5' -GATCCAAGAAGCATGCAGAGAAGAATTC-3' ha sido insertada entre los sitios Bg/II y Xhol. El plásmido pXL 3426 es mostrado en la figura 3.

Ejemplo 2 : Construcción de otros plásmidos que soportan secuencias blanco El plásmido pXL3675 derivado del plásmido pXL3296 en el cual la secuencia 5' -GAAGAAGGGAAAGAAGATCTG-3' ha sido insertada entre los sitios Hpal y Xbal; el plásmido pXL3676 derivado igualmente del plásmido pXL3296 en el cual la secuencia 5' -GAAGAAAGGAGAGAAGATCTG-3' ha sido insertada entre Hpal y Xbal y finalmente el plásmido pXL3713 que contiene la secuencia del ADN 5' -GAAGAAGTTTAAGAAGATCTG-3' insertada en los sitios Hpal y Xbal del pXL3296. Los plásmidos asi construidos han sido purificados mediante gradiente de cloruro de CsCl y la secuencia de insertos ha sido confirmada mediante secuenciación . Estas preparaciones han sido utilizadas en los ejemplos descritos posteriormente en la presente .

Ejemplo 3: Identificación de una secuencia de 20-mer interna al gen FGF1 que forma una triple hélice estable Los diferentes plásmidos descritos en los ejemplos que siguen han sido sometidos a cromatografía mediante cromatografía de afinidad de interacción de triple hélice ' en condiciones estándar. El soporte de afinidad ha sido sintetizado de la manera siguiente a partir del soporte cromatográfico Sephacryl® S-1000 SF (Amershan Pharmacia Biotech) . En una primera etapa, el gel Sephacryl® S-1000 dispersado en una solución reguladora del pH de acetato de sodio 0.2 M ha sido activado con meta-peryodato de sodio (3 mM, 20°C, 1 h) , luego en una · segunda etapa, el oligonucléotido ha sido acoplado por medio de su parte 5'-NH2 terminal a grupos aldehidos de la matriz activa, mediante una reacción de aminación reductora en presencia de ácido ascórbico (5m ) unidades siguiendo un procedimiento similar a aquel descrito para el acoplamiento de proteínas (Homsey, et. al., J. Immunol. ethods 93 (1986) 83). Para todos los experimentos reportados en la presente invención, los oligonucléotidos han sido acoplados siguiendo este método general, todos los oligonucléotidos presentan un brazo funcionalizado NH2-(CH2)6- situado en el extremo 5' del oligonucléotido . Los experimentos buscan poner en evidencia la formación de una estructura de trile hélice entre un oligonucléotido y un ADN de doble hebra y al medir la estabilidad, todos han sido realizados en las condiciones siguientes. En cada experimento, 300 g de plásmido purificado puesto en solución en 6 mi de solución reguladora del pH de acetato de sodio 50 mM (pH 4.5) que contiene NaCl 2 M ha sido inyectado a un flujo de cm/h sobre una columna HR 5/5 (Amershan Pharmacia Biotech) que contiene 1 mi de gel de afinidad funcionalizado por un oligonucléotido de acuerdo con la invención . después del lavado de la columna con 5 mi de solución reguladora del pH, el plásmido ha sido eluido con 3 mi de columna de solución reguladora del pH Tris/HCl 100 mM (pH 9.0) que contiene EDTA 0.5 mM y la cantidad de plásmido eluido por el tampón del pH 9.0 ha sido cuantificada (i) mediante medición de la absorbancia a 260 nm de la solución y (ii) mediante cromatografiade intercambio de aniones sobre una columna Milipore Gen Pak-Fax (Marquet, et . al., BioPharm, 8 (1995) 26). A partir de una columna funcionalizada con el oligonucléotido 5' -NH2- (CH2) 6-TT (CTT) 6-3' (SEQ. ID. No. 2), los resultados de la purificación que son mostrados en la tabla 1 posteriormente en la presente, demuestran la formación de una triple hélice estable con los plásmidos que comprenden ya sea el gen FGF1 entero (pXL3179) , ya sea una secuencia interna ID1 del gen humano FGF1 (pXL3426) , mediante oposición a un plásmido controlado (pXL3296) que no comprende secuencia del gen humano FGF1 que no es retenido sobre la columna en cuestión.

Tabla 1 La secuencia del plásmido pXL3426 ha sido identificada mediante su clonación de diferentes fragmentos del gen FGF1 de tamaño más o menos - pequeño. La secuencia interna designada ID1 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA -3' (SEQ. ID. No. 1) del gen FGF1 forma asi una estructura de triple hélice estable con el oligonucléotido utilizado de secuencia SEQ. ID. No. 2. La estructura de triple hélice obtenida contiene dos zonas de tipo pirimidina-purina-pirimidina (Py*PuPy) que forma triadas canónicas T*AT y +C*GC de 6 unidades (R, lado 5' ) y de 7 unidades (R' , lado 3' ) separadas por una zona interna (T) de 7 triadas en donde seis de entre ellas son no canónicas y comprenden más precisamente dos triadas T*GC, dos triadas T*CG, una triada C*AT y una triada C*TA.

E emplo 4 : Identificación de las bases necesarias al seno de la secuencia 20-nter interna IDl al gen FGF1 a la estabilidad de la estructura de triple hélice ? partir de la secuencia interna IDl, 4 oligonucléotidos han sido preparados. Para dos de entre ellos, 7 ó 13 nucléotidos están ausentes del lado 5' de IDl y para los 2 otros, 7 ó 14 nucléotidos están ausentes del lado 3' . El plásmido pXL3426 ha sido sometido a cromatografía sobre una columna de interacción triple hélice funcional con la ayuda del oligonucléotido 5' -T (CTT) 6-3' (SEQ. ID. No.: 2) ó de los oligonucléotidos FRB36, FRB38, FRB39 ó FRB40. La estabilidad de la estructura de triple hélice formada con las diferentes secuencias internas IDl ramificadas ha sido enseguida probada mediante la medición de la cantidad de cada uno de los plásmidos retenidos sobre la columna.

Tabla 2 Los resultados presentados en la tabla 2 anteriormente en la presente muestran que el conjunto de la secuencia ID1 del secuencia del pXL 3426 (20- mer) es necesario para la formación de una estructura de triple hélice estable con un oligonucléotido de tipo 5' -TT (CTT) 6-3' . En particular, las dos partes Py*PuPy situadas en los extremos 5' y 3' asi como la parte central contribuyen muy extensamente de y de manera cooperante a la estabilidad de la estructura final.

Ejemplo 5 : Influencia de las triadas canónicas y del número de triadas no canónicas sobre la estabilidad de la triple hélice La secuencia del oligonucléotido 5' -T (CTT) e-3' (SEQ. ID. No. : 2) ha sido modificada y la capacidad de estos diferentes oligonucléotidos ( FRB15 , FRB16 y FRB17) para formar una triple hélice estable con la secuencia interna ID1 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA -3' (SEQ. ID. No. 1) del plásmido pXL 3426 ha sido probada.

Tabla 3 Los resultados presentados en la tabla 3 anteriormente en la presente demuestran que es posible acrecentar la estabilidad de la estructura de triple hélice al modificar la secuencia del oligonucléotido a manera de aumentar el' número de triadas canónicas T*AT y +C*GC, lo que al mismo tiempo reduce el número de triadas no canónicas en la zona interna media N de la estructura de triple hélice.

Ejemplo 6: Influencia de las triadas no canónicas sobre la estabilidad de la estructura de triple hélice La secuencia del plásmido pXL3426 que comprende la secuencia interna ID1 (SEQ. ID. No.: 1) del gen FGF1 que es susceptible de formar una triple hélice estable con el oligonucléotido 5' -TT (CTT) 6-3' ha sido modificada con el fin de introducir a la zona central N dos triadas no canónicas idénticas consecutivas del tipo T*GCseguidas en 5' de una triada no canónica C*AT (pXL 3675) . En otro experimento se han introducido 5 triadas no canónicas sucesivas C*AT, T*GC, T*GC, C*AT y T*GC (pXL3676) . Finalmente, la secuencia del plásmido pXL3426 ha sido modificada con el fin de introducir a la zona media dos triadas no canónicas consecutivas del tipo T*TA seguidas en 5' de una triada no canónica C*TA (pXL3713) .

Tabla 4 Los resultados de purificación de los diferentes plásmidos que son presentados en la tabla 4 anteriormente en la presente muestran que una estructura de triple ' hélice estable es formada cuando la zona central no canónica formada de las triadas de tipo T*CG, T*GC, C*AT, C*TA. Como lo muestra el rendimiento de fijación sobre el gel de afinidad de los plásmidos pXL3675 y pXL3676, una triple hélice estable es igualmente formada cuando dos tríadas no canónicas T*GC consecutivas son introducidas y tal que sea el contexto, es decir que las tríadas circundantes sean de naturaleza canónica o no canónica. Por el contrario, la introducción de un par de tríadas contiguas de tipo T*AT y de una tríada C*TA contiguas conducen a una desestabilización completa de la estructura de triple hélice.

E emplo 7 : Construcciones de plásmidos que comprenden un cásete que codifica para un gen SeAP, haFP, FIX y GAX Los genes utilizados en estos experimentos para poner en evidencia la actividad de las composiciones de la invención son por ejemplo el gen humano que codifica para el factor F IX (Kurachi, et . al., Proc. Nati. Acad. Sci. ü. S. A. 79 (1982) 6461), el gen humano que codifica para la fosfatasa alcalina secretada SeAP (Millan, et . al., J. Biol.. Chem 261 (1986) 3112) , el gen humano que codifica para la alfa-feto proteína haFP (Gibbs, et. al. Biochemistry 26 (1987) 1332), el gen humano que codifica para GAX (Gorski, et. al!, Mol. Cell. Biol., 13 (1993) 3722) . Estos genes han sido amplificados mediante PCR a partir de plásmidos o bancos de ADNc (Clontech) luego clonados río abajo del promotor eucariótico CM E/P y río arriba de la secuencia SV40 tardía polyA señal en un plásmido pCOR derivado del pXL3296. El gen que codifica para la fosfatasa alcalina secretada (SeAP) ha sido introducido a un plásmido pCOR derivado pXL3296 para generar el plásmido pXL3402 (figura 4) . El gen que codifica para la alfa-feto proteína (hocFP) ha sido introducido a un plásmido pCOR derivado pXL3296 para generar el plásmido pXL3678 (figura 5) . El gen que codifica para GAX ha sido introducido a un plásmido pCOR derivado del pXL3296 para generar el plásmido pXL3207 (figura 6) . El gen que codifica para el factor FIX ha sido introducido a un plásmido pCOR derivado del pXL3296 para generar el plásmido pXL3388 (figura 7) .

Ejemplo 8: Utilización de un oligon cléotido del tipo 5 ' - (CTT)7-3' para generar la formación de estructuras de triple hélice estables con diversos genes de interés La interacción de diferentes secuencias con el gel de interacción de triple hélice vuelto funcional por el oligonucléotido 5' -TT (CTT) 6-3' (SEQ. ID. No. 2) ha sido estudiada por la medición de la capacidad de plásmidos que portan diversos genes. Los genes estudiados son (i) el gen humano que codifica para el factor IX, (ii) el gen de la fosfatasa alcalina secretada SeAP, (iii) el gen humano de la alfa-feto proteína (h FP) y (iv) el gen humano GAX.

Tabla 5 Los resultados presentados en la tabla 5 anteriormente en la presente demuestran, que es posible utilizando un oligonucléotido de tipo (CTT)n formar estructura de triple hélice estables con un gen de interés aunque este gen no contiene la secuencia blanco tipo 5'-(GAA) n~3 ' complementaria del oligonucléotido. La existencia en la parte central de la secuencia blanco de bases acopladas en triadas de tipo T*CG, C*CG, T*GC y C*AT, es tolerada por la estructura de triple hélice, asimismo como la presencia de una tríada aislada T*TA (gen GAX) .

E emplo 9 : Utilización de una columna vuelta funcional por un oligonucléotido de tipo 5' (CTT)7-3' para la purificación de un plásmido que contiene la secuencia interna ID 1 (5' -AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA -3' : SEQ. ID. No. : 1) La posibilidad de purificar plásmidos que portan una secuencia de tipo 5' - (R) n- (N) t- (R' )m-3' , tal como se describe anteriormente, con la ayuda de un soporte cromatografico de afinidad mediante interacción de triple hélice vuelta funcional con un oligónucléotido de tipo 5' (CTT)7-3f ha sido estudiada a partir del ejemplo 8. El plásmidc pXL3179 (que comprenae r ei\ -JJ: i humano, portador de la secuencia 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA -3' ha sido sometido a cromatografía sobre una columna de interacción de Sepharyl S-1000 vuelta funcional con el oligónucléotido 5' -NH2- (CH2) e~ (CTT) ~-3r . Para esto, 9.40 mg de plásmido pXL3179 en 60 mi de solución reguladora del pH de acetato de sodio 50 m , NaCl 2 M (pH 4.5) han sido inyectados a un flujo de 30 cm/h sobre una columna de afinidad de 10 mi que contiene el oligónucléotido 5' -NH2- (CH2) e~ (CTT) 7-3' acopiado de manera covalente a Sepahryl S-100 SF como se describe en el ejemplo 3. Después del lavado de la columna con 5 volúmenes de la misma solución reguladora del pH, el plásmido fijo ha sido eluido con 2 volúmenes de columna de solución reguladora del pH Tris/HCl 100 mM, EDTA 0.5 .mM y cuantificado mediante medición de la absorbancia ÜV (260 nm) y mediante cromatografía de intercambio iónico sobre una columna GenPak-Fax (Waters) . El contenido de ADN genómico de E. coli eri la preparación inicial y en la fracción purificada ha sido medido mediante PCR como se describe en O 96/18744. 7.94 mg de plásmido pXL3179 han sido encontrados en la fracción eluída (rendimiento de alusión, 84%) y el nivel de contaminación por ADN genómico de E.. coli ha sido reducido de 7.8 a 0.2% mediante cromatografía de afinidad descrita.

Asimismo, el nivel de contaminación por ARN ha sido reducido de 43% en el plásmido de partida a 0.2% en el plásmido purificado . En diversos otros experimentos de cromatografía efectuados a partir de diversas preparaciones del plásmido pXL3179 sometidos a cromatografía sobre una columna de afinifad de Sepharyl S-1000 funcionalizada por el oligonucléotido 5' -NH2- (CH2) 6~ (CTT) ?-3 ' , el contenido de ADN genómico ha sido reducido de 0.2% a 0.007%, de 0.7% a 0.01%, de 7.1 a 0.2% ó de 7.8% a 0.1%.

Ejemplo 10: Utilización de un oligonucléotido de tipo 5' -CCT TTT CCT CCT T-3' (SEQ. ID. No.: 12) para la generar la formación de estructuras de triple hélice estables con un gen de interés terapéutico VEGFB-167 humano La interacción de una secuencia interna a un gen de interés terapéutico tal como el gen VEGFB-167 humano, con un soporte de interacción de triple hélice funcionalizada por el oligonucléotido 5' -CCT TTT CCT CCT T-3' (SEQ. ID. No.: 12) ha sido estudiada por la medición de la capacidad obtenida con el plásmido pXL3579 que porta el gen VEGFB-167 humano (figura 8) (Olofsson, et. al., J. Biol.. Chem. , 271 (1996) 19310). El plásmido pXL 3579 que es mostrado en la figura 8, contiene el gen VEGFB-167 amplificado mediante PCR a partir de un banco de ADNc de corazón humano (Clontech) luego clonado río abajo del promotor eucariótico CMV E/P ,(-522/+74) y río arriba la secuencia SV40 tardía polyA señal entre los sitios Nsil Xbal de multisitios de clonación del pXL 3296.

Tabla 6 Los resultados mostrados en la tabla 6 anteriormente en la presente demuestran que es posible utilizando un oligonucléotido, tal como por ejemplo el oligonucléotido 5' -CCT TTT CCT CCT T-3' (SEQ. ID. No.: 12), que apunta a una secuencia de tipo 5 ' - (R) n- (N) t- (R' ) m-3' , aquí la región %'- GGC AAC GGA GGA A-3' (SEQ. ID. No.: 13) del gen VEGFB-167 humano, formar una estructura de triple héliceestablacon una región de un gen de interés. Aunque por otra parte, el gen VEGFB-167 humano contiene una secuencia homopúrica 5'- AAA AAA AAG GA -3' apuntada por el oligonucléotido 5'- TTT TTT TTC CT -3' (tabla 6), la interacción obtenida con el oligonucléotido 5'- CCT TTT CCT CCT T-3' es bastante superior a la interacciónobtenida con el oligonucléotido homopirimídico . Asimismo, la secuencia interna homopúrica 5'- GGA GGA A -3' no es suficientemente larga para permitir la formación de una triple hélice estable con el oligonucléotido 5'- CCT CCT T-3'. Este ejemplo muestra asi claramente el interés de las secuencias del tipo 5' - (R) n- (N) t~ (R' )m-3' para la formación de estructuras de triple hélice estables, asimismo en un contexto en donde el ADN de doble hebra estudiado presenta por otra parte por lo menos una estructura homopúrica de longitud importante.

Ejemplo 11: Utilización de un oligonucléotido de tipo 5' -T CCT CTC CCT C-3' (SEQ. ID. No. 14) para la separación de ADNc del VEGFB-186 no borrado via la formación de estructuras de triple hélice estables con una secuencia blanco al seno de ADNc del VEGFB-186 modificado. Se ha observado el curso de etapas de producción en termentador del gen VEGFB-186 humano, que este último es el sitio de reacomodos y cancelaciones genéticas particularmente al nivel del exon 6A. Mutaciones puntuales silenciosas han sido asi introducidas mediante PCR secuencial y mutagenizante al nivel de los nucléotidos 510 (A/C) , 513 (C/T) , 516 (A/T) , 519 (C/T) y 522 (C/T) en relación al punto +1 de traducción. La secuencia de aminoácidos de la proteina VEGFB-186 comprendidos entre el aminoácido 170 y 174 permanece sin cambio. Por el contrario, el gen asi modificado (VEGFB-186m) presenta una secuencia de ADN blanco de acuerdo con la presente invención 5' -A GGA GCG GGA G-3' (SEQ. ID. No.: 15), que es capaz de formar una interacción de triple hélice estable con un oligonucléotido de secuencia 5'-T CCT CTC CCT C-3' (SEQ. ID. No.: 14). Esta interacción de triple hélice estable es particularmente ventajosa para aplicar el método de acuerdo con la invención y separar el VEGFB-186 modificado que no ha sufrido reacomodos y cancelaciones después de su producción en termentador . Con el fin de ilustrar el método de purificación mediante interacción de triple hélice del gen VEGFB-186 purificado, dos plásmidos pXL3601 y pXL3977, tales como los mostrados en la figura 9, han sido utilizados. El gen VEGFB-186 ha sido en principio amplificado mediante PCR a partir de un banco de ADNc de corazón humano (Clontech) luego clonado rio arriba del promotor eucariótico CMV E/P (-522/+74) y rio arriba de la señal de poliadenilación de la región tardia del virus SV40 entre los sitios Nsil y Xbal de multisitios de clonación del pXL3296 (ejemplo 1.2), con el fin de general el plásmido pXL3601. Este último ha sido modificado mediante PCR secuencial y mutagenizante, con el fin de general el plásmido pXL3977 en el cual el gen VEGFB-186 es modificado al nivel del exon 6A como se describe anteriormente en la pésente. La interacción de la secuencia blanco 5' -A GGA GCG GGA G-3' (SEQ. ID. No. : 15) al seno del gen VEGFB-186 con un soporte de interacción triple hélice funcional por el oligonucléotido 5'-T CCT CTC CCT C-3' (SEQ . ID. No.: 14) ha sido estudiada por la medición de la capacidad obtenida con el plásmido pXL3977 que porta el gen VEGFB-186 humano modificado (figura 9) . La secuencia del VEGFB-167 está contenida en la secuencia del gen VEGFB~186m, el plásmido pXL3579 tal como se describe en el ejemplo 10 y que comprende el gen VEGFB-167 humano es asi utilizado como control negativo .

Tabla 7 los resultados presentados en la tabla 7 anteriormente en la presente demuestran que es posible utilizando un oligonucléotido, tal como por ejemplo el oligonucléotido (SEQ. ID. No. 14), apuntar a una secuencia de tipo 5'-(R)n-(N)t~(R' )m~3' , en la presente, la región 5' -A GGA GCG GGA G-3' (SEQ. ID. No.: 15) del gen VEGFB-186 humano modificado, formar una estructura de tripe hélice estable con una región de un gen de interés y asi, purificarlo de manera eficaz. El oligonucléotido 5'-TTT CCT CTC CCT C-3' (SEQ. ID. No. 16) puede ser igualmente utilizado para la purificación del gen VEGFB-186 humano modificado.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> AVENTIS PHAEMA SA <120> METODOS DE PURIFICACION Y DE DETECCION DE SECUENCIAS OBJETIVO DE ADN DE DOBLE HEBRA MEDIANTE INTERACCIÓN DETRIPLE HÉLICE •cl3Q:> ST01011 <X40> ST01011 ¾16Qs< 20 <170 Patentln versión 3.0 <210> 1 «211? 20 <212* DNA. <213> Homo sapiens <430> 1 aagaagcatg cagagaagaa. 20 <210> 2 <211> 20 <212> DMA. <2i3> Arrifi <220> <223> OlÍgonucleo ido <400> 2 tfccttcrtct tectattett 20 <210> 3 <211> 20 c212> DNA. <213> Artificial e220 «223? Oligonucleotiio <400> 3 <2lO> 4 «211-. 20 <2l2> DNA <2I3> Artificial ¿220-· <2S3> Oligonucleo ido <4O0> 4 rtcttettgt fcccccccct <210¾ 5 <211-> 20 DKLfc. ArriSicial <220> <223> Oligonucleotido c400 5 ttcttctccc ttctcctcst «210=. € <-211s 16 c212> DNA. <213> Hamo sapiens gacige-agoí-c gagaag <210> 7 <211?> 16 <212> DUA ¿2l3> Homo sapiens ¾00> 7 asagaeagca gggaag <21Q> T <211> 13 <2i2> OKA <:213> Komo sapiens gaagagg&ag aag <210> 9 «.211> 14 <212> DHA «;213> Homo sapiens <400> 9 aagga.gas.ga ag¾a <210 3,0 <2XX> 15 <212 DHft. <: 13» Homo sapiens <400> 10 aagatgagga agaag <210> 11 <212> DNA <213 > Artificial «2203· v:223> Oligonucleoticio <400> 11 gaggcctctc ct-cctctfcc ctctt <2l0¾ 12 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <-220> <223 > Oligonucleoti io <400> 12 ecttttccte cct <21Q> 13 -.211-. 13 <212> =¡NA <213> Homc eapiens <400* 13 ggcaacggag gaa <21Ü> 14 <211» 11 <2_.2P DNA. <213> flixisicial «220» ¦c223> Oligonucleotido <4O0> 14 tcctctccct c <210 15 <211-> 11 < 12> DNA <2X3> Homo sapiens <400> 15 aggagcggga g 21Q> 16 <211> 13 <212¾ DNA c213> Arni£icial <22Q> 223> Oligonucleot do <400> 16 txtcarctcc ntc <210» 17 <2ll¾ 28 «;212=> DNA. <213? Artificial 01igonucleotido <400> 1? g5.rccaa.caa gcatgeagag aagaa tc 210¾ 18 •2l > 21 213 > Artificial <223> Oligon cleatldo <400> ia gaagaaggga aagaagatct g c2l0> 19 <211> 21 -:212> DNA <213> Artificial «220> ;223? Oligonucleotido gaagaaagga gagaagatct g <210> 20 <211> 21 <212> DHft. < 13J. Artificial <22Q> <222> Oligon cleotido <¿G0s 20 gaagaagttt aagaagatct g

Claims (13)

1. 45
2. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método de purificación de una molécula de ADN de doble hebra, caracterizada porque se pone en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una tercera hebra de ADN, la molécula de ADN de doble hebra comprende por lo menos una secuencia blanco de fórmula general: 5'-(R)n-(N)t-(R')m-3' en la cual: R y R' representan secuencias de nucléotidos compuestas únicamente de bases púricas; n y m son números enteros menores de 9 y la suma de n + m es mayor de 5; N es una secuencia de nucléotidos que comprende a la vez bases púricas y bases pirimidicas y t es un número entero menor de 8; la secuencia de ADN es susceptible de interactuar con una tercera hebra de ADN y para formar una estructura de triple hélice. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la interacción entre la región N y la tercera hebra de ADN conduce a la formación de a lo más 6 triadas no canónicas. 46
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las tríadas no canónicas asi formadas son escogidas de entre las triadas T*CG, T*GC, C*AT y C*TA.
4. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las regiones R y R' comprenden por lo menos dos guaninas (G) en total.
5. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las regiones R y Rf comprenden por lo menos dos adeninas.
6. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las regiones R y R' forman con la tercera hebra de ADN tríadas canónicas escogidas de entre T*AT y +C*G.
7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la tercera hebra de ADN es tipo homopirimídico .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la tercera hebra de ADN comprende una secuencia de poli-CTT.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la tercera hebra de ADN es un oligonucléotido .
10. 10. El método- de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la 47 secuencia blanco presente sobre la molécula de ADN de doble hebra comprende la secuencia SEQ. ID. No. 1 y el oligonucléotido es escogido de entre los oligonucléotidosde secuencia SEQ. ID. No. 2 a 5.
11. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la secuencia blanco está presente naturalmente sobre la molécula de ADN de doble hebra ó es una secuencia blanco introducida de manera artificial al seno de la molécula de ADN de doble hebra.
12. 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la secuencia blanco naturalmente presente sobre la molécula de ADN está presente en la secuencia codificante de genes de interés terapéutico o experimental.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de ADN blanco comprende todo o parte de la secuencia SEQ. ID. No. 1 comprendida en el gen humano FGF1. 1 . El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de ADN blanco comprende la secuencia SEQ. ID. No. 6 comprendida en el gen humano que codifica para el factor IX. 15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de ADN blanco comprende 48 la secuencia SEQ. ID. No. 7 ó No. 8 comprendida en el gen humano de la fosfatasa alcalina secretada. 16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de ADN blanco comprende la secuencia SEQ. ID. No. 9 comprendida en el gen humano de la alfa feto-proteína (ocFP) . 17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de ADN blanco comprende la secuencia SEQ. ID. No. 10 comprendida en el gen humano GAX. 18. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de ADN blanco comprende la secuencia SEQ. ID. No. 13 comprendida en el gen humano VEGFB167. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la molécula de ADN de doble hebra es una ADN circular, tal como un plásmido, un minicírculo, un fragmento lineal. 20. El método de purificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el oligonucléotido es arreglado de manera estable, covalente o no covalente sobre un soporte. 21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el oligonucléotido es injertado a un polímero de origen natural 49 ó sintético. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el soporte es escogido de entre los soportes de cromatografía, superficies plásticas y bolas de látex funcionales. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el soporte de cromatografía es un soporte para la permeacion de gel. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la solución que contiene la molécula de ADN de doble hebra es una lisado celular. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el lisado celular es un lisado claro. 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la molécula de ADN de doble hebra es pre-purificada . 27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, caracterizado porque el oligonucléotido posee la secuencia GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ. ID. No. 11) . 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, caracterizado porque el oligonucléotido es acoplado al soporte mediante enlace de 50 disulfuro, tioéter, éster, amida ó amina. 29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28, caracterizado porque el oligonucléotido se fija al soporte por medio de un brazo compuesto de una cadena carbonada (CH2) en la cual n es un número entero comprendido entre 1 y 18 inclusive, el brazo es unido al oligonucléotido mediante un fosfato y al soporte mediante un enlace de amina. 30. El méüodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el oligonucléotido presenta por lo menos una modificación química que lo vuelve resistente a los ó protege frente a nucleasas o aumenta su afinidad para la secuencia específica. 31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el oligonucléotido comprende una secuencia en la cual una de por lo menos citosinas es metilada en posición 5' . 32. El método para la purificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende por lo menos una etapa en donde se pone en contacto una solución que contiene el ADN de doble hebra, en mezcla con otros componentes, sobre el soporte al cual está acoplado de manera covalente en oligonucléotidos . 33. El método para la purificación de conformidad con 51 cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se hace pasar una solución que contiene el ADN de doble hebra, en mezcla con otros componentes, sobre el soporte de cromatografía al cual está acoplado de manera covalente el oligonucléotido. 34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho de que la tercera hebra del ADN ó el oligonucléotido es marcado. 35. ün ADN de doble hebra purificado caracterizado porque es susceptible de ser obtenido mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 36. Un método para la detección de un ADN de doble hebra, caracterizado porque se pone en contacto una solución que se sospecha de contener la molécula de ADN de doble hebra con una tercera hebra de ADN marcada apta de formar, mediante hibridación una triple hélice en una secuencia blanco del ADN de doble hebra, la secuencia blanco tiene la fórmula general: 5'-(R)n-(N)t- (R')m-3' en la cual: R y Rf representan secuencias de nucleotídicas compuestas únicamente de bases púricas; n y m son números enteros menores de 9 y la suma de n + m es mayor de 5; N es una secuencia de nucleotidos que comprende a la vez bases púricas y bases pirimídicas y t es un número entero menor de 8.