JP2012531469A - 固形腫瘍に治療剤を送達するための脂質製剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、一つまたは複数の活性剤または治療剤を含む新規な血清安定脂質粒子、該脂質粒子の製造方法、ならびに該脂質粒子を送達および/または投与する方法を提供する。さらに詳細には、本発明は、核酸（例えば一つまたは複数の干渉RNA分子）を含む血清安定核酸-脂質粒子（SNALP）、SNALPを製造する方法、ならびに（例えば癌の治療のために）SNALPを送達および/または投与する方法を提供する。特定の態様では、本発明は、固形腫瘍を優先的に標的とする腫瘍指向性脂質粒子を提供する。本発明の腫瘍指向性製剤は、核酸などの搭載物（payload）を、非癌性細胞と比べて優先的に固形腫瘍の細胞に送達することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2009年7月1日に出願された米国仮特許出願第61/222,469号および2010年1月14日に出願された米国仮特許出願第61/295,134号の優先権を主張し、それらの開示は、全ての目的のため全体として本明細書に参照により組み入れられる。
発明の背景
細胞増殖およびプログラム細胞死は、生物の成長および発生に重要な役割を果たす。癌などの増殖性疾患では、細胞増殖および/またはプログラム細胞死の過程がしばしば撹乱される。例えば、癌細胞は、恐らくは突然変異による、細胞周期の正の調節因子の過剰発現または細胞周期の負の調節因子の欠損のいずれかによって、制御不能の細胞分裂を行うおそれがある。または癌細胞は、アポトーシスの負の調節因子の過剰発現によって、プログラム細胞死を受ける能力を欠損しているおそれがある。したがって、癌細胞に対するチェックポイント制御およびプログラム細胞死の過程を回復させる新しい治療剤を開発する必要がある。
RNA干渉（RNAi）は、二本鎖RNA（dsRNA）の認識が最終的に遺伝子発現の転写後抑制につながる、進化上保存された過程である。特にRNAiは、dsRNAと標的mRNAとの間の相補的塩基対形成を経てmRNAの特異的分解を誘導する。いくつかのモデルシステムにおいて、この自然反応は、遺伝子機能の研究のための強力なツールに発展した（例えば、Elbashir et al., Genes Dev., 15:188-200 (2001)（非特許文献1）; Hammond et al., Nat. Rev. Genet., 2:110-119 (2001)（非特許文献2）を参照）。
RNAiは、一般に21〜23ヌクレオチド長の低分子干渉RNA（siRNA）二重鎖などの短鎖dsRNAまたはそれよりも長い25〜30ヌクレオチド長のダイサー基質dsRNAによって仲介される。siRNAとは異なり、ダイサー基質dsRNAは、RNase IIIファミリーのメンバーであるダイサーエンドヌクレアーゼによって切断され、より小さな機能的21塩基長siRNA二重鎖を生成する。21塩基長siRNA（合成されたものでもダイサーによってプロセシングされたものでも）は、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）を動員し、標的配列の配列特異的切断を介して効果的な遺伝子サイレンシングを可能にする。
正確なメカニズムはまだ不明であるが、RNAiは、関心対象の遺伝子の転写および翻訳を下方制御またはサイレンシングするための強力なアプローチを提供する。特に、癌などの腫瘍性障害の治療のために、RNAiを利用して、ある種の遺伝子、例えば抗アポトーシス分子、成長因子、成長因子受容体、紡錘体タンパク質、細胞周期タンパク質、血管新生因子、癌遺伝子、細胞内シグナル伝達因子、分子シャペロンおよびそれらの組み合わせの発現を調整（例えば低減）することができる。
しかしながら、RNAiが治療的に有用であるためには、安全で有効な核酸送達系が必要である。ウイルスベクターは、比較的効率的な遺伝子送達系であるが、野生型への復帰変異の可能性および免疫反応の懸念などの様々な制限に悩む。さらに、ウイルスシステムは、循環から迅速に浄化され、肺、肝臓、および脾臓などの「初回通過」器官へのトランスフェクションが制限される。加えて、これらのシステムは、その後の注射を用いた送達を損なう免疫反応を誘導する。結果として、非ウイルス性遺伝子送達系が、ますます注目を浴びている（Worgall et al., Human Gene Therapy, 8:37 (1997)（非特許文献3）; Peeters et al., Human Gene Therapy, 7:1693 (1996)（非特許文献4）; Yei et al., Gene Therapy, 1:192 (1994)（非特許文献5）; Hope et al., Molecular Membrane Biology, 15:1 (1998)（非特許文献6））。
核酸と陽イオン性リポソームとの複合体（すなわちリポプレックス）は、一般に用いられている非ウイルス性遺伝子送達ビヒクルである。例えば、昆虫細胞をトランスフェクトするための両親媒性化合物、中性脂質、および界面活性剤から製造されたリポプレックスが、米国特許第6,458,382号（特許文献1）に開示されている。リポプレックスは、米国特許出願公開第20030073640号（特許文献2）にも開示されている。しかしリポプレックスは、全身適用に適さず、かなりの有毒副作用を誘起するおそれのある、定義が不明確な大型のシステムである（Harrison et al., Biotechniques, 19:816 (1995)（非特許文献7）; Li et al., The Gene, 4:891 (1997)（非特許文献8）; Tam et al., Gene Ther., 7:1867 (2000)（非特許文献9））。大型で正電荷を帯びた凝集物であるリポプレックスは、インビボ投与されると迅速に浄化され、最高の発現レベルは、初回通過器官、特に肺で観察される（Huang et al., Nature Biotechnology, 15:620 (1997)（非特許文献10）; Templeton et al., Nature Biotechnology, 15:647 (1997)（非特許文献11）; Hofland et al., Pharmaceutical Research, 14:742 (1997)（非特許文献12））。
他のリポソーム送達系には、例えば、逆ミセル、陰イオン性リポソーム、およびポリマーリポソームの使用が含まれる。逆ミセルは、米国特許第6,429,200号（特許文献3）に開示されている。陰イオン性リポソームは、米国特許出願公開第20030026831号（特許文献4）に開示されている。デキストリンまたはグリセロール-ホスホコリンポリマーを組み込んだポリマーリポソームは、それぞれ米国特許出願公開第20020081736号（特許文献5）および同第20030082103号（特許文献6）に開示されている。しかし、そのようなリポソーム送達系は、所望の大きさ（すなわち直径約150nm未満）であるわけでもなく、腫瘍部位に優先的に送達されるわけでもなく、腫瘍部位への送達を達成するために長期間循環中に無傷のまま残るわけでもないので、腫瘍に干渉RNAなどの核酸を送達するには適さない。むしろ、腫瘍に干渉RNAなどの核酸を効果的に細胞内送達するには、固形腫瘍などの腫瘍を優先的に標的とし、細胞および血管区画の他の構成要素と相互作用しない、高度に安定で血清耐性の核酸含有粒子が必要である。
したがって、当技術分野において、腫瘍細胞に干渉RNAなどの核酸を優先的に導入するための新規な組成物および方法に対する大きな需要が、依然として存在する。加えて、当技術分野において、癌を治療または予防するために、腫瘍形成または細胞形質転換に関連する遺伝子の発現を下方制御する方法が必要である。本発明は、これらおよび他の必要性に取り組むものである。
米国特許第6,458,382号 米国特許出願公開第20030073640号 米国特許第6,429,200号 米国特許出願公開第20030026831号 米国特許出願公開第20020081736号 米国特許出願公開第20030082103号
Elbashir et al., Genes Dev., 15:188-200 (2001) Hammond et al., Nat. Rev. Genet., 2:110-119 (2001) Worgall et al., Human Gene Therapy, 8:37 (1997) Peeters et al., Human Gene Therapy, 7:1693 (1996) Yei et al., Gene Therapy, 1:192 (1994) Hope et al., Molecular Membrane Biology, 15:1 (1998) Harrison et al., Biotechniques, 19:816 (1995) Li et al., The Gene, 4:891 (1997) Tam et al., Gene Ther., 7:1867 (2000) Huang et al., Nature Biotechnology, 15:620 (1997) Templeton et al., Nature Biotechnology, 15:647 (1997) Hofland et al., Pharmaceutical Research, 14:742 (1997)
発明の簡単な概要
本発明は、一つまたは複数の活性剤または治療剤を含む、新規の血清安定脂質粒子、その脂質粒子の製造方法、ならびに（例えば疾患または障害の治療のために）その脂質粒子を送達および/または投与する方法を提供する。さらに具体的には、本発明は、核酸（例えば、一つまたは複数の干渉RNA）を含む血清安定核酸-脂質粒子（SNALP）、SNALPの製造方法、ならびに（例えば癌の治療のために）SNALPを送達および/または投与する方法を提供する。
ある好ましい態様では、本発明は、固形腫瘍を優先的に標的とする腫瘍指向性脂質粒子（例えば腫瘍指向性SNALP）を提供する。有利なことに、本発明の腫瘍指向性SNALP製剤は、非癌性細胞に比べて固形腫瘍の細胞に核酸搭載物（payload）を優先的に送達することができる。加えて、腫瘍細胞においてPLK-1などの関心対象の遺伝子を標的とする場合に、本明細書記載の少なくとも一つの干渉RNAを含む本発明の腫瘍指向性SNALP製剤が、以前に記載された他の核酸-脂質粒子組成物に比べて強度の増大（すなわちサイレンシング活性の増大）および/または耐容性の増大（例えばより有利な毒性プロファイル）をはっきりと示すことが予想外に見出された。好ましい態様では、本発明は、本明細書記載の１種または複数種（例えばカクテル）のPLK-1 siRNA分子および陽イオン性脂質DLinDMAを含む核酸-脂質粒子（例えばSNALP）、ならびにその使用方法を提供し、該核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は予想外に、インビボで固形腫瘍細胞におけるPLK-1発現をサイレンシングした場合に、以前に記載された他の核酸-脂質粒子組成物に比べて強度の増大および耐容性の増大を有する。
いくつかの局面では、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は：（a）一つまたは複数の核酸（例えば干渉RNA）；（b）粒子中に存在する総脂質の約50mol%〜約65mol%を構成する一つまたは複数の陽イオン性脂質；（c）粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約45mol%を構成する一つまたは複数の非陽イオン性脂質；および（d）粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%を構成する、粒子の凝集を阻害する一つまたは複数の結合脂質を含む。
いくつかの態様では、核酸-脂質粒子は：（a）核酸（例えば干渉RNA）；（b）粒子中に存在する総脂質の約50mol%〜約60mol%を構成する陽イオン性脂質；（c）粒子中に存在する総脂質の約35mol%〜約45mol%を構成する、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物；および（d）粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%を構成するPEG-脂質コンジュゲートを含む。核酸-脂質粒子のこの態様は、本明細書全般において「7：54」製剤と呼ばれる。場合によっては、7：54製剤中の非陽イオン性脂質混合物は：（i）粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%のリン脂質；および（ii）粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約35mol%のコレステロールまたはその誘導体を含む。特定の一態様では、7：54製剤は、約7mol%のPEG-脂質コンジュゲート（例えば、PEG750-C-DMAのような約550ダルトン〜約1000ダルトンの平均分子量を有するPEG-脂質コンジュゲート）、約54mol%の陽イオン性脂質またはその塩（例えば、DLinDMAおよび/または本明細書記載の任意の他の陽イオン性脂質）、約7mol%のDPPC（またはDSPC）、および約32mol%のコレステロール（またはその誘導体）を含む、4成分系である。好ましい態様では、7：54製剤中に存在する核酸は、siRNAなどの干渉RNAである。
他の態様では、核酸-脂質粒子は：（a）核酸（例えば干渉RNA）；（b）粒子中に存在する総脂質の約55mol%〜約65mol%を構成する陽イオン性脂質；（c）粒子中に存在する総脂質の約30mol%〜約40mol%を構成するコレステロールまたはその誘導体；および（d）粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%を構成するPEG-脂質コンジュゲートを含む。核酸-脂質粒子のこの態様は、本明細書全般において「7：58」製剤と呼ばれる。特定の一態様では、7：58製剤は、リン脂質を含まず、約7mol%のPEG-脂質コンジュゲート（例えばPEG750-C-DMAなどの約550ダルトン〜約1000ダルトンの平均分子量を有するPEG-脂質コンジュゲート）、約58mol%の陽イオン性脂質またはその塩（例えばDLinDMAおよび/または本明細書記載の任意の他の陽イオン性脂質）、および約35mol%コレステロール（またはその誘導体）を含む、3成分系である。好ましくは、7：58製剤中に存在する核酸は、siRNAなどの干渉RNAである。
ある好ましい態様では、核酸（例えば干渉RNA）が水溶液中でヌクレアーゼ分解に耐性であるように、該核酸は核酸-脂質粒子の脂質成分内に完全に封入されている。干渉RNAの非限定的な例には、siRNA、aiRNA、miRNA、ダイサー-基質dsRNA、shRNA、およびそれらの混合物が含まれる。ある他の好ましい態様では、核酸-脂質粒子は、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に無毒である。
本発明はまた、本明細書記載の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）および薬学的に許容されうる担体を含む薬学的組成物を提供する。
別の局面では、本発明は、細胞に一つまたは複数の核酸（例えば干渉RNA）を導入するための方法であって、細胞を本明細書記載の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）と接触させる工程を含む方法を提供する。一態様では、細胞（例えば固形腫瘍細胞などの癌細胞）は、哺乳動物中にあり、哺乳動物はヒトである。
さらに別の局面では、本発明は、固形腫瘍に一つまたは複数の核酸（例えば干渉RNA）をインビボ送達するための方法であって、哺乳動物に本明細書記載の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を投与する工程を含む方法を提供する。有利なことに、本発明の核酸-脂質粒子は、他の組織に比べて固形腫瘍に核酸を優先的に送達する。いくつかの態様では、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、以下の投与経路の一つによって投与される：経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、および皮内。特定の態様では、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、例えば経腸または非経口投与経路を介して、全身投与される。好ましい態様では、哺乳動物はヒトである。
さらなる局面では、本発明は、それを必要とする哺乳動物において癌などの細胞増殖性障害を治療するための方法であって、一つまたは複数の核酸（例えば干渉RNA）を含む治療的有効量の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。ある態様では、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、化学療法薬と併用投与することができる。核酸-脂質粒子は追加的または代替的に、従来のホルモン剤、免疫療法剤、および/または放射線療法剤と同時投与することができる。ある他の態様では、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、例えばデキサメタゾンなどのグルココルチコイドの1回量と組み合わせて投与することができ、ここで、該グルココルチコイドは、核酸-脂質粒子を投与する前（すなわちグルココルチコイドを用いた前処置）、間、および/または後に投与される。適切なグルココルチコイド投与様式の非限定的な例は、米国特許出願公開第20070054873号に記載されており、その開示は、全ての目的のため全体として参照により本明細書に組み入れられる。
特定の一局面では、本発明は、哺乳動物（例えばヒト）の腫瘍細胞中に、腫瘍形成または細胞形質転換に関連する遺伝子の発現をサイレンシングする干渉RNA（例えばsiRNA分子）を導入するための方法であって、本明細書記載の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供し、ここで、該干渉RNA（例えばsiRNA分子）は、他の細胞（例えば正常または非腫瘍細胞）に比べて腫瘍細胞に優先的に導入される。
本発明の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、循環中で安定であり、血管外部位へのアクセスをもたらす薬力学的挙動に必要な大きさであり、かつ標的細胞群（例えば固形腫瘍細胞）に到達できることから、対象（例えばヒトなどの哺乳動物）への干渉RNAなどの核酸の投与に使用するために有利および適切である。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および添付の図面から当業者に明らかになろう。
比較的高いmol%のPEG750-脂質コンジュゲートがSNALP製剤に使用された場合に、より優れた封入率が達成されたことを示す。 例示的な1：57および7：54 DLinDMA SNALP製剤の血中クリアランスプロファイルの比較を示す。 正常肝臓組織および肝臓腫瘍における例示的な1：57および7：54 DLinDMA SNALP製剤のサイレンシング活性の比較を示す。 皮下腫瘍における例示的な1：57および7：54 DLinDMA SNALP製剤のサイレンシング活性の比較を示す。 肝臓腫瘍における例示的な7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤のサイレンシング活性の比較を示す。 肝臓腫瘍における例示的な7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤の二つの異なる用量でのサイレンシング活性の比較を示す。 皮下腫瘍における例示的な1：57および7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤の二つの異なる用量でのサイレンシング活性の比較を示す。 皮下腫瘍における例示的な1：57および7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤のサイレンシング活性の別の比較を示す。 皮下腫瘍における異なるバッチの7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤の強度の比較を示す。 皮下腫瘍体積の減少における例示的な1：57および7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤の抗腫瘍有効性の比較を示す。 例示的な7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤の投与が肝臓酵素レベルに及ぼす作用を示す。 例示的な1：57または7：54 DLinDMA SNALP製剤を投与する免疫原性作用を示す。 本明細書記載の様々な陽イオン性脂質を含有する例示的な7：54 SNALP製剤の腫瘍PLK-1 mRNAのノックダウン活性の比較を示す。
発明の詳細な説明
I. 序論
本発明は、比較的短いPEG鎖長を有するPEG-脂質コンジュゲートを比較的高いmol%で含有する脂質粒子（例えばSNALP）が、高い搭載物封入率を保持する一方で、粒子に有益な腫瘍ターゲティング特性を付与するという驚くべき発見に一部基づいている。有利なことに本発明の腫瘍指向性脂質粒子が、インビボ投与後にPEG-脂質コンジュゲートによってより効果的に防護されることが発見された。これは、存在するPEG-脂質コンジュゲートの濃度が高いほど粒子表面全体により均一に分布するためである。結果として、本発明の脂質粒子は、遠位の腫瘍部位を標的とすることができ、血中循環時間の延長、腫瘍送達の強化、および非腫瘍組織への送達低下などの望ましい腫瘍ターゲティング特性を提供する。ある態様では、本明細書記載の脂質粒子の腫瘍ターゲティング特性は、より効果的に粒子中に組み込まれ、より長い血中循環時間を提供する、より長いアルキル鎖長を有するPEG-脂質コンジュゲートを使用することによってさらに高まる。
例示的な腫瘍指向性脂質粒子製剤として7：54 DLinDMA SNALP製剤を使用する、本明細書に示した実施例は、約7mol%のPEG750-脂質コンジュゲートを含有する脂質粒子が、より長いPEG鎖長を有する、より低いmol%のPEG-脂質コンジュゲートを含有する脂質粒子に比べた場合に、核酸封入率の改善、血中循環時間の延長、腫瘍送達の強化、および非腫瘍組織への送達低下を有利に提供することを実証している。例えば、実施例2は、PEG750-C-DMAなどの比較的高いmol%のPEG750-脂質コンジュゲートが使用された場合に比較的優れた封入率が達成されたことを例示している。実施例3は、腫瘍指向性7：54 DLinDMA SNALP製剤について血中循環時間の延長が観察され、それによって遠位腫瘍部位でのそのような粒子の蓄積および活性の増大が可能になったことを例示している。実施例4は、腫瘍指向性7：54 DLinDMA SNALP製剤が正常な肝臓組織に比べて肝臓腫瘍においてサイレンシング活性の強化を示したことを例示している。実施例5は、腫瘍指向性7：54 DLinDMA SNALP製剤が遠位腫瘍部位で強度の増大を示したことから、肝臓外部の固形腫瘍を優先的に標的とするためにも使用することができることを例示している。実施例8は、腫瘍指向性7：54 DLinDMA SNALP製剤が、安全で非免疫原性の核酸送達系であることを例示している。実施例9は、本明細書記載の式II〜XVIの例示的な陽イオン性脂質を含む腫瘍指向性7：54 SNALP製剤が、PLK-1発現のサイレンシングにおいてDLinDMAと類似の強度を示したことを例示している。
このように、本発明の腫瘍指向性SNALP製剤は、非癌性細胞に比べて固形腫瘍細胞に核酸搭載物を安全で、効果的に、および優先的に送達することができる。
II. 定義
本明細書で使用される以下の用語は特に規定しない限りそれらに属するとされる意味を有する。
本明細書で使用される「干渉RNA」または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語には、干渉RNAが標的遺伝子または配列と同じ細胞の中にある場合に、（例えば干渉RNA配列に相補的なmRNAの分解を仲介することによりまたは翻訳を阻害することにより）標的遺伝子または配列の発現を低減または阻害することができる、一本鎖RNA（例えば成熟miRNA、ssRNAiオリゴヌクレオチド、ssDNAiオリゴヌクレオチド）、二本鎖RNA（すなわち、siRNA、ダイサー基質dsRNA、shRNA、aiRNA、またはプレmiRNAなどの二重鎖RNA）、DNA-RNAハイブリッド（例えば国際公開公報第2004/078941号を参照）、またはDNA-DNAハイブリッド（例えば国際公開公報第2004/104199号を参照）が含まれる。したがって、干渉RNAは、標的mRNA配列に相補的な一本鎖RNA、または2本の相補鎖によりもしくは1本の自己相補鎖により形成した二本鎖RNAを指す。干渉RNAは、標的遺伝子もしくは配列に実質的もしくは完全な同一性を有してもよく、またはミスマッチ領域（すなわちミスマッチモチーフ）を含んでもよい。干渉RNAの配列は、完全長標的遺伝子またはその部分配列に対応しうる。好ましくは、干渉RNA分子は化学合成される。上記特許文書のそれぞれの開示は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
干渉RNAには、「低分子干渉RNA」または「siRNA」、例えば約15〜60、15〜50、または15〜40（二重鎖）ヌクレオチド長、さらに典型的には約15〜30、15〜25、または19〜25（二重鎖）ヌクレオチド長の干渉RNAが含まれ、干渉RNAは、好ましくは約20〜24、21〜22、または21〜23（二重鎖）ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖siRNAの各相補配列は、15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド長、好ましくは約20〜24、21〜22、または21〜23ヌクレオチド長であり、二本鎖siRNAは、約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25塩基対長、好ましくは約18〜22、19〜20、または19〜21塩基対長である）。siRNA二重鎖は、約1〜約4個のヌクレオチドまたは約2〜約3個のヌクレオチドの3'オーバーハングおよび5'リン酸末端を含みうる。siRNAの例には、非限定的に、二つの別々の鎖分子から集合した二本鎖ポリヌクレオチド分子（ここで、一方の鎖はセンス鎖であって、他方は相補的アンチセンス鎖である）；一本鎖分子から集合した二本鎖ポリヌクレオチド分子（ここで、該センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーにより連結している）；自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン型二次構造を有する、二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに二つまたはそれ以上のループ構造ならびに自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有するステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子（ここで、該環状ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロでプロセシングされて活性二本鎖siRNA分子を産生することができる）が含まれる。本明細書で使用される「siRNA」という用語には、RNA-RNA二重鎖およびDNA-RNAハイブリッド（例えば国際公開公報第2004/078941号を参照）が含まれる。
好ましくは、siRNAは化学合成される。siRNAはまた、より長いdsRNA（例えば、約25ヌクレオチド長を超えるdsRNA）を大腸菌（E. coli）由来のRNase IIIまたはダイサーにより切断することによって産生させることができる。これらの酵素は、dsRNAをプロセシングして生物学的に活性なsiRNAにする（例えば、Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:9942-9947 (2002); Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:14236 (2002); Byrom et al., Ambion TechNotes, 10(1):4-6 (2003); Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003); Knight et al., Science, 293:2269-2271 (2001)；およびRobertson et al., J. Biol. Chem., 243:82 (1968)を参照）。好ましくは、dsRNAは、少なくとも50ヌクレオチド長〜約100、200、300、400、または500ヌクレオチド長である。dsRNAは、1000、1500、2000、5000ヌクレオチド長またはそれ以上でありうる。dsRNAは、遺伝子転写物全体または遺伝子転写物の部分をコードしうる。場合によっては、siRNAは、プラスミドによってコードされてもよい（例えば、ヘアピンループを有する二重鎖に自動的に折り畳まれる配列として転写される）。
本明細書で使用される「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、干渉RNA（例えばsiRNA）配列の、その標的配列に対して100%の相補性を有さない部分を指す。干渉RNAは、少なくとも1、2、3、4、5、6個またはそれ以上のミスマッチ領域を有しうる。ミスマッチ領域は、連続的であっても、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個もしくはそれ以上のヌクレオチドで分離されていてもよい。ミスマッチモチーフまたはミスマッチ領域は、1個のヌクレオチドを含んでもよく、2、3、4、5個もしくはそれ以上のヌクレオチドを含んでもよい。
「標的遺伝子の発現を阻害する」という語句は、干渉RNA（例えばsiRNA）が標的遺伝子（例えばPLK-1）の発現をサイレンシングする、低減する、または阻害する能力を指す。遺伝子サイレンシングの程度を検査するために、試験試料（例えば標的遺伝子を発現している培養細胞の試料）または試験哺乳動物（例えばヒトなどの哺乳動物またはげっ歯類（例えばマウス）もしくは非ヒト霊長類（例えばサル）モデルなどの動物モデル）を、標的遺伝子の発現をサイレンシングする、低減する、または阻害する干渉RNA（例えばsiRNA）と接触させる。試験試料または試験動物における標的遺伝子の発現を、干渉RNA（例えばsiRNA）との接触にも投与にも供されていない対照試料（例えば標的遺伝子を発現している培養細胞試料）または対照哺乳動物（例えばヒトなどの哺乳動物またはげっ歯類（例えばマウス）もしくは非ヒト霊長類（例えばサル）モデルなどの動物モデル）における標的遺伝子の発現と比較する。対照試料または対照哺乳動物における標的遺伝子の発現に100%の値を割り当てることができる。特定の態様では、試験試料または試験哺乳動物における標的遺伝子の発現レベルが、対照試料または対照哺乳動物における標的遺伝子の発現レベルの約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、または0%である場合に、標的遺伝子の発現のサイレンシング、阻害、または低減が達成される。言い換えると、本発明の干渉RNA（例えばsiRNA）は、干渉RNAと接触も投与もされていない対照試料または対照哺乳動物における標的遺伝子の発現レベルに比べて、試験試料または試験哺乳動物において標的遺伝子（例えばPLK-1）の発現を、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%サイレンシングする、低減する、または阻害することができる。標的遺伝子の発現レベルを測定するのに適したアッセイには、非限定的に、例えば当業者に公知の技法、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、ELISA、免疫沈降、酵素機能、および当業者に公知の表現型アッセイなどを使用する、タンパク質またはmRNAレベルの検査が含まれる。
干渉RNAなどの活性剤または治療剤の「有効量」または「治療的有効量」とは、所望の効果（例えば、干渉RNAの非存在下で検出された正常発現レベルと比較した標的配列の発現の阻害）を生じるために十分な量である。標的遺伝子または標的配列の発現阻害は、干渉RNAを用いて得られた値が対照の約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、または0%となる場合に達成される。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するのに適したアッセイには、例えば、当業者に公知の技法、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、ELISA、免疫沈降、酵素機能、および当業者に公知の表現型アッセイなどを使用する、タンパク質またはRNAレベルの検査が含まれる。
干渉RNAによって免疫反応を「低下させる」、「低下させること」、「低減する」、または「低減させること」とは、所与の干渉RNA（例えば修飾された干渉RNA）に対する免疫反応の検出可能な低下を意味することが意図される。修飾された干渉RNAによる免疫反応の低下量は、未修飾干渉RNA存在下での免疫反応のレベルと比べて測定することができる。検出可能な低下は、未修飾干渉RNAの存在下で検出された免疫反応よりも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、またはそれ以上に低くてもよい。干渉RNAに対する免疫反応の低下は、典型的にはレスポンダー細胞によるサイトカイン（例えば、IFNγ、IFNα、TNFα、IL-6、IL-8、またはIL-12）のインビトロ生成の低下、または干渉RNA投与後の哺乳動物対象の血清中サイトカインの生成の低下により測定される。
本明細書で使用される「レスポンダー細胞」という用語は、未修飾siRNAなどの免疫刺激性干渉RNAと接触した場合に、検出可能な免疫反応を生成する細胞、好ましくは哺乳動物細胞を指す。レスポンダー細胞の例には、例えば、樹状細胞、マクロファージ、末梢血単核細胞（PBMC）、脾臓細胞などが含まれる。検出可能な免疫反応には、例えば、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、TGF、およびそれらの組み合わせなどの、サイトカインまたは成長因子の生成が含まれる。検出可能な免疫反応にはまた、例えばテトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質1（IFIT1）mRNAの誘導が含まれる。
「実質的な同一性」とは、ストリンジェントな条件下で参照配列にハイブリダイズする配列、または参照配列の特定領域にわたり特定百分率の同一性を有する配列を指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、核酸が、典型的には核酸の複合混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、様々な状況で異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳しい手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度のpHで特定配列についての熱融解点（Tm）よりも約5〜10℃低く選択される。Tmは、平衡状態で標的に相補的なプローブの50%が（所定のイオン強度、pH、および核酸濃度の下で）標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在することから、Tmでは、プローブの50%が平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加して達成することができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドの10倍である。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、以下であり得る：50%ホルムアルデヒド、5×SSC、および1% SDS、42℃でインキュベーションするか、または、5×SSC、1% SDS、65℃でインキュベーションし、0.2×SSCおよび0.1% SDS中で65℃で洗浄する。PCRについて、約36℃の温度が低ストリンジェンシーの増幅に典型的であるが、アニーリング温度は、プライマー長に応じて約32℃から48℃の間で変動してもよい。高ストリンジェンシーのPCR増幅について、約62℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマー長および特異性に応じて約50℃から約65℃まで変動してもよい。高および低ストリンジェンシーの増幅の両方に典型的なサイクル条件には、90℃〜95℃で30秒〜2分間の変性期、30秒〜2分間継続するアニーリング期、および約72℃で1〜2分間の伸長期が含まれる。低および高ストリンジェンシーの増幅反応についてのプロトコールおよび手引きは、例えば、Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)に提供されている。
ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸であっても、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。例えば、遺伝コードにより許される最大のコドン縮重を用いて核酸のコピーを作製する場合に、このことが起こる。そのような場合に、核酸は、典型的には中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例には、37℃で40%ホルムアミド、1M NaCl、1% SDSの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および45℃で1×SSC中での洗浄が含まれる。ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、類似のストリンジェンシー条件を提供するために、代替的なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用できることを容易に認識しているであろう。ハイブリダイゼーションのパラメーターを決定するための追加的な手引きは、多数の参考文献、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds.に提供されている。
二つまたはそれ以上の核酸に関連して「実質的に同一」または「実質的な同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、または手動アライメントおよび目視検査により測定したときに、比較ウインドウまたは指定領域にわたって最大一致になるように比較およびアライメントした場合に、同じであるか、または同じであるヌクレオチドを特定パーセンテージで有する（すなわち、特定領域にわたって少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性）、二つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。この定義は、文脈が示す場合には、配列の相補体も同じように指す。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
配列比較について、典型的には一つの配列を、試験配列と比較される参照配列とする。配列比較アルゴリズムを使用する場合に、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよく、代替的なパラメーターを指定してもよい。次に、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一率を計算する。
本明細書で使用される「比較ウインドウ」は、約5〜約60個、通常は約10〜約45個、さらに通常は約15〜約30個からなる群より選択されるいくつかの連続する位置の任意の一つのセグメントの参照であって、ある配列を同数の連続位置の参照配列と、それら二つの配列を最適にアライメントした後で比較することのできるセグメントの参照を含む。比較のために配列をアライメントする方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータインプリメンテーション（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）により、または手動アライメントおよび目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (1995 supplement)を参照）により行うことができる。
配列同一率および配列類似率の決定に適したアルゴリズムの非限定的な例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al., Nuc Acids Res., 25-3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)に記載されている。BLASTおよびBLAST 2.0は、本明細書に記載のパラメーターを用いて本発明の核酸について配列同一率を決定するために用いられる。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公的に入手可能である。別の例は、タンパク質またはヌクレオチド（例えばRNA）配列をアライメントするための、Needleman- Wunschアルゴリズムなどの配列同一率を決定するためのグローバルアライメントアルゴリズムである。
BLASTアルゴリズムはまた、二つの配列の間の類似性の統計解析を行う（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)を参照）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の一尺度は、最小合計確率（P(N)）であり、これは、二つのヌクレオチド配列の一致が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸の比較における最小合計確率が、約0.2未満、さらに好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満ならば、核酸は、参照配列に類似すると見なされる。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、少なくとも2個のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有するポリマーを指し、DNA、RNA、およびそれらのハイブリッドを含む。DNAは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドDNA、DNA-DNA二重鎖、凝縮前のDNA、PCR産物、ベクター（P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体DNA、またはこれらの群の誘導体および組み合わせの形態でありうる。RNAは、低分子干渉RNA（siRNA）、ダイサー基質dsRNA、低分子ヘアピンRNA（shRNA）、非対称干渉RNA（aiRNA）、マイクロRNA（miRNA）、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、ウイルスRNA（vRNA）、およびそれらの組み合わせの形態でありうる。核酸には、合成、天然、および非天然でありかつ参照核酸と類似した結合特性を有する、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾された主鎖残基または連結を含有する、核酸が含まれる。そのようなアナログの例には、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホン酸メチル、キラル-ホスホン酸メチル、2'-O-メチルリボヌクレオチド、およびペプチド-核酸（PNA）が含まれる。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有する、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。特に示さない限り、特定の核酸配列はまた、明示された配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば縮重コドン置換）、アレル、オーソログ、SNP、および相補的配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、一つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を産生させることによって達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)）。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（DNA）またはリボース（RNA）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介して一緒に連結している。「塩基」には、プリンおよびピリミジンが含まれ、それにはさらに、天然化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然アナログ、ならびにプリンおよびピリミジンの合成誘導体が含まれ、合成誘導体には、これらに限定されるわけではないがアミン、アルコール、チオール、カルボン酸エステル、およびハロゲン化アルキルなどの新しい反応性基を配置する修飾が非限定的に含まれる。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆ポリペプチド（例えばPLK-1）の生成に必要な、部分長または完全長のコード配列を含む核酸（例えばDNAまたはRNA）配列を指す。
本明細書で使用される「遺伝子産物」とは、RNA転写物またはポリペプチドなどの遺伝子産物を指す。
「脂質」という用語は、非限定的に脂肪酸エステルを含み、水に不溶であるがしかし多数の有機溶媒に可溶であることを特徴とする有機化合物の群を指す。それらは、普通は以下の少なくとも三つのクラスに分類される：（1）脂肪、油およびロウが含まれる「単純脂質」；（2）リン脂質および糖脂質が含まれる「結合脂質（compound lipid)」；ならびに（3）ステロイドなどの「誘導脂質」。
「脂質粒子」という用語には、関心対象の標的部位（例えば細胞、組織、器官等）に核酸（例えば干渉RNA）などの活性剤または治療剤を送達するために使用できる脂質製剤が含まれる。好ましい態様では、本発明の脂質粒子は、典型的には陽イオン性脂質と、非陽イオン性脂質と、粒子の凝集を防止する任意の結合脂質とから形成される核酸-脂質粒子である。他の好ましい態様では、核酸などの活性剤または治療剤を粒子の脂質成分に封入することにより、それを酵素的分解から保護することができる。
本明細書で使用される「SNALP」という用語は、安定な核酸-脂質粒子を指す。SNALPは、脂質（例えば陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、および粒子の凝集を防止する任意の結合脂質）から製造される粒子であり、核酸（例えば干渉RNA）は脂質内に完全に封入されている。場合によっては、SNALPは、静脈内（i.v.）注射後に循環寿命の延長を示すことができ、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に隔離された部位）に蓄積することができ、これらの遠位部位での標的遺伝子の発現のサイレンシングを仲介できることから、全身適用に極めて有用である。国際公開公報第00/03683号に示されるように、核酸は、凝縮剤と複合体を形成し、SNALP内に封入することができ、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、典型的には約30nm〜約150nm、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、約70nm〜約100nm、約80nm〜約100nm、約90nm〜約100nm、約70〜約90nm、約80nm〜約90nm、約70nm〜約80nm、または約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、もしくは150nmの平均直径を有し、実質的に無毒である。加えて核酸は、本発明の脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸-脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許出願公開第20040142025号および同第20070042031号に開示されており、それらの開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
本明細書で使用される「封入された脂質」とは、完全に封入された、部分封入された、またはその両方の、核酸（例えばPLK-1を標的とする干渉RNA）などの活性剤または治療剤を提供する脂質粒子を指すことができる。好ましい態様では、核酸は、（例えば、SNALPまたは他の核酸-脂質粒子を形成するために）脂質粒子に完全に封入される。
「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子の凝集を阻害する結合脂質を指す。そのような脂質コンジュゲートには、非限定的に、例えばジアルキルオキシプロピルとカップリングしたPEG（例えばPEG-DAAコンジュゲート）、ジアシルグリセロールとカップリングしたPEG（例えばPEG-DAGコンジュゲート）、コレステロールとカップリングしたPEG、ホスファチジルエタノールアミンとカップリングしたPEG、およびセラミドと結合したPEG（例えば米国特許第5,885,613号を参照）などのPEG-脂質コンジュゲート、陽イオン性PEG脂質、ポリオキサゾリン（POZ)-脂質コンジュゲート（例えばPOZ-DAAコンジュゲート；例えば2010年1月13日に出願された米国仮特許出願第61/294,828号および2010年1月14日に出願された米国仮特許出願第61/295,140号を参照）、ポリアミドオリゴマー（例えばATTA-脂質コンジュゲート）、およびそれらの混合物が含まれる。POZ-脂質コンジュゲートの追加的な例は、国際公開公報第2010/006282号に記載されている。PEGまたはPOZは、脂質に直接結合させても、またはリンカー成分を介して脂質に連結させてもよい。例えば非エステル含有リンカー成分およびエステル含有リンカー成分を含めた、PEGまたはPOZを脂質にカップリングさせるのに適した任意のリンカー成分を使用することができる。ある好ましい態様では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー成分が使用される。上記特許文書のそれぞれの開示は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
「両親媒性脂質」という用語は、部分的に、脂質物質の疎水性部分が疎水性相に配向し、一方で親水性部分が水相に配向する、任意の適切な物質を指す。親水性の特徴は、炭水化物、リン酸、カルボキシル、スルファート、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシルおよび他の同等の基などの極性基または荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに一つまたは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環式基により置換されたそのような基を非限定的に含む、無極性基の包含により付与することができる。両親媒性化合物の例には、非限定的に、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が含まれる。
リン脂質の代表例には、非限定的に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチド酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれる。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ-アシルオキシ酸などのリンを欠如する他の化合物もまた、両親媒性脂質として指定された群の中に含まれる。追加的に、上記両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含めた他の脂質と混合することができる。
「中性脂質」という用語は、選択されたpHで非荷電形態または中性双性イオン形態のいずれかで存在する、いくつかの脂質種のいずれかを指す。生理的pHで、そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールが含まれる。
「非陽イオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質および任意の他の中性脂質または陰イオン性脂質を指す。
「陰イオン性脂質」という用語は、生理的pHで負電荷を有する任意の脂質を指す。これらの脂質には、非限定的に、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N-ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイル(palmitoyloleyol)ホスファチジルグリセロール（POPG）、および他の陰イオン性修飾基が中性脂質と結合したものが含まれる。
「疎水性脂質」という用語は非限定的に、長鎖の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基が含まれる無極性基を有する化合物を指し、そのような基は、任意で、一つまたは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環式基により置換される。適切な例には、非限定的に、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパン、および1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが含まれる。
「膜融合性」という用語は、SNALPなどの脂質粒子が細胞の膜と融合する能力を指す。膜は、原形質膜またはオルガネラ、例えばエンドソーム、核等を囲む膜のいずれかでありうる。
本明細書で使用される「水溶液」という用語は、水を全体的または部分的に含む組成物を指す。
本明細書で使用される「有機脂質溶液」という用語は、脂質を有する有機溶媒を全体的または部分的に含む組成物を指す。
本明細書で使用される「遠位部位」とは、隣接する毛細血管床に限らない、生体全体に広く分布する部位を含む、物理的に隔離された部位を指す。
SNALPなどの核酸-脂質粒子に関係する「血清安定」とは、遊離DNAまたはRNAを著しく分解しうる血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に、粒子が有意に分解されないことを意味する。適切なアッセイには、例えば、標準的な血清アッセイ、DNAseアッセイ、またはRNAseアッセイが含まれる。
本明細書で使用される「全身送達」とは、生体内での干渉RNA（例えばsiRNA）などの活性剤の広範な生体内分布をもたらす、脂質粒子の送達を指す。ある剤の全身送達につながりうる投与技法もあれば、つながらない投与技法もある。全身送達は、有用な、好ましくは治療的な量の剤が身体の大部分に曝露されることを意味する。広い生体内分布を得るために、剤は、一般に、投与部位から遠位の疾患部位に到達する前に（初回通過器官（肝臓、肺等）または迅速な非特異的細胞結合などにより）迅速な分解および浄化を受けないような血中寿命を必要とする。脂質粒子の全身送達は、例えば静脈内、皮下、および腹腔内を含めた、当技術分野で公知の任意の手段により行われ得る。好ましい態様では、脂質粒子の全身送達は、静脈内送達による。
本明細書で使用される「局所送達」とは、生体内の標的部位に干渉RNA（例えばsiRNA）などの活性剤を直接的に送達することを指す。例えば、剤は、腫瘍などの疾患部位または炎症部位などの他の標的部位または肝臓、心臓、膵臓、腎臓等などの標的器官に直接注射により局所送達することができる。
「哺乳動物」という用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜等などの任意の哺乳動物種を指す。
「癌」という用語は、異常細胞の制御不能な増殖を特徴とする疾患クラスの任意のメンバーを指す。この用語には、悪性、良性、軟組織または固形のいずれに特徴決定されるかに関わらず、全ての公知の癌および腫瘍状態、ならびに転移前の癌および転移後の癌を含めた全ての病期および悪性度の癌が含まれる。異なる種類の癌の例には、非限定的に、肝臓癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、胃癌、食道癌、胆嚢癌、膵臓癌、虫垂癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌（例えば腎細胞癌）、中枢神経系の癌、神経膠芽腫、皮膚癌、リンパ腫、絨毛癌、頭頸部癌、骨原性肉腫、および血液癌が含まれる。特定種類の肝臓癌の非限定的な例には、肝細胞癌（HCC）、二次肝臓癌（例えば、いくつかの他の種類の非肝臓性癌細胞の転移により起こるもの）、および肝芽腫が含まれる。本明細書で使用される「腫瘍」は、一つまたは複数の癌細胞を含む。
「ポロ様キナーゼ1」、「PLK-1」、「ポロ様キナーゼ」、または「PLK」という用語は、2個の機能性ドメイン：（1）キナーゼドメイン；および（2）ポロ-ボックスドメインを含有するセリン/トレオニンキナーゼを指す（例えばBarr et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5:429-440 (2004)を参照）。PLK-1の活性および細胞濃度は、細胞分裂の正確な調節のために重要である。PLK-1の発現および活性は、細胞周期のG0、G1、およびS期にわたって低いが、G2で上昇し始め、M期の間にピークに達する。PLK-1は、有糸分裂および細胞分裂に不可欠であって、以下の過程の一因となる：中心体の成熟ならびにCdc25CおよびサイクリンB1のリン酸化による成熟促進因子の活性化；双極紡錘体の形成；およびDNA損傷チェックポイントの適応（DNA損傷はG2および有糸分裂においてPLK-1を阻害する）。PLK-1はまた、有糸分裂終了および細胞質分裂に関する分裂後期促進複合体の構成要素の活性化に関与する。PLK-1は、肝癌および大腸癌を含めた多種の癌で過剰発現しており、PLK-1の発現は、多くの場合に患者の予後不良と相関する。PLK-1（野生型またはキナーゼ不活性型）の過剰発現は、多核化（遺伝的不安定性）を招く。過活性PLK-1は、DNA損傷のチェックポイントを無効にする。PLK-1の構成性発現は、NIH 3T3細胞の形質転換を引き起こす。PLK-1はp53腫瘍抑制因子をリン酸化することにより、p53のアポトーシス促進作用を阻害する。ヒトPLK-1 mRNA配列は、Genbankアクセッション番号NM_005030、X73458、BC014846、BC003002、HSU01038、およびL19559に示される。マウスPLK-1 mRNA配列は、Genbankアクセッション番号NM_011121に示される。PLK-1はまた、セリン/トレオニンプロテインキナーゼ13（STPK13）として知られている。
III. 態様の説明
本発明は、一つまたは複数の活性剤または治療剤を含む新規な血清安定脂質粒子、脂質粒子を製造する方法、ならびに（例えば疾患または障害の治療のために）脂質粒子を送達するおよび/または投与する方法を提供する。
ある態様では、活性剤または治療剤は、核酸を含む。いくつかの場合には、核酸は、例えばsiRNA、ダイサー基質dsRNA、shRNA、aiRNA、miRNA、またはそれらの混合物などの干渉RNA分子を含む。他の場合には、核酸は、一本鎖または二本鎖のDNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、またはそれらの混合物を含む。
一局面では、本発明は、以下を含む脂質粒子を提供する：（a）一つまたは複数の活性剤または治療剤；（b）粒子中に存在する総脂質の約50mol%〜約65mol%を構成する一つまたは複数の陽イオン性脂質；（c）粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約45mol%を構成する一つまたは複数の非陽イオン性脂質；および（d）粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%を構成する、粒子の凝集を阻害する一つまたは複数の結合脂質。
さらに具体的には、本発明は、核酸（例えば一つまたは複数の干渉RNA）を含む血清安定核酸-脂質粒子（SNALP）、SNALPを製造する方法、ならびに（例えば癌の治療のために）SNALPを送達するおよび/または投与する方法を提供する。ある好ましい態様では、本発明は、固形腫瘍を優先的に標的とする腫瘍指向性脂質粒子（例えば腫瘍指向性SNALP）を提供する。有利なことに、本明細書記載の腫瘍指向性SNALP製剤は、腫瘍形成または細胞形質転換に関連する遺伝子の発現をサイレンシングする干渉RNAなどの核酸搭載物を、非癌性細胞に比べて固形腫瘍細胞に優先的に送達することができる。
いくつかの局面では、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、以下を含む：（a）核酸（例えば干渉RNA）；（b）粒子中に存在する総脂質の約50mol%〜約65mol%を構成する陽イオン性脂質；（c）粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約45mol%を構成する非陽イオン性脂質；および（d）粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%を構成する、粒子の凝集を阻害する結合脂質。
ある態様では、核酸-脂質粒子は、以下を含む：（a）核酸（例えば干渉RNA）；（b）粒子中に存在する総脂質の約50mol%〜約60mol%を構成する陽イオン性脂質；（c）粒子中に存在する総脂質の約35mol%〜約45mol%を構成する、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物；および（d）粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%を構成するPEG-脂質コンジュゲート。核酸-脂質粒子のこの態様は、本明細書全般において「7：54」製剤と呼ばれる。
ある他の態様では、核酸-脂質粒子は、以下を含む：（a）核酸（例えば干渉RNA）；（b）粒子中に存在する総脂質の約55mol%〜約65mol%を構成する陽イオン性脂質；（c）粒子中に存在する総脂質の約30mol%〜約40mol%を構成するコレステロールまたはその誘導体；および（d）粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%を構成するPEG-脂質コンジュゲート。核酸-脂質粒子のこの態様は、本明細書全般において「7：58」製剤と呼ばれる。
特定の態様では、干渉RNA（例えばsiRNA）は、腫瘍細胞中の関心対象のPLK-1などの遺伝子を標的とする。いくつかの場合には、干渉RNAは、センス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、干渉RNAは、約15〜約60ヌクレオチド長（例えば約15〜60、15〜30、15〜25、19〜30、19〜25、20〜60、20〜55、20〜50、20〜45、20〜40、20〜35、20〜30、20〜25、21〜30、21〜29、22〜30、22〜29、22〜28、23〜30、23〜28、24〜30、24〜28、25〜60、25〜55、25〜50、25〜45、25〜40、25〜35、もしくは25〜30ヌクレオチド長、または約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、もしくは35ヌクレオチド長）の二本鎖領域を含む。他の場合には、干渉RNAは化学合成される。本発明の干渉RNA分子は、インビトロおよび/またはインビボでPLK-1などの標的配列の発現をサイレンシングすることができる。
ある態様では、本発明の干渉RNA（例えばsiRNA）は、例えば干渉RNAの二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖に、2'OMeヌクレオチドなどの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含みうる。好ましくは、干渉RNA中のウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドで修飾されている。場合によっては、干渉RNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方に2'OMeヌクレオチドを含有し、二本鎖領域に少なくとも1個の2'OMe-ウリジンヌクレオチドおよび少なくとも1個の2'OMe-グアノシンヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、干渉RNAのセンスおよび/またはアンチセンス鎖はさらに、例えば干渉RNAの二本鎖領域に、修飾（例えば2'OMe修飾）アデノシンおよび/または修飾（例えば2'OMe修飾）シトシンヌクレオチドを含みうる。
いくつかの態様では、センスおよび/またはアンチセンス鎖配列は、2'OMeヌクレオチドなどの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含みうる。ある態様では、センスおよび/またはアンチセンス鎖配列は、それぞれ独立して1、2、3、もしくは4個のヌクレオチドの（例えば2'OMe）修飾および/または未修飾3'オーバーハングを含むかまたはそれから成ってもよく、あるいは、二本鎖分子の一方または両方の末端が平滑末端であってもよい。
当業者は、干渉RNA分子に導入された化学的修飾の程度が、干渉RNAの免疫刺激特性の低減または抑制とRNAi活性の保持との間の均衡をとるように、未修飾のセンスおよび/またはアンチセンス鎖配列を本明細書記載の選択的修飾パターンに従って（例えばRNA二重鎖内の選択的ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドで、ならびに任意でアデノシンおよび/またはシトシンヌクレオチドで）修飾でき、かつRNAi活性および免疫刺激についてスクリーニングできることを、理解しているであろう。
特定の態様では、本発明の干渉RNA（例えばsiRNA）分子は、一方または両方の鎖に1、2、3、または4個のヌクレオチドの3'オーバーハングを含む。場合によっては、干渉RNAは、少なくとも一つの平滑末端を含有しうる。特定の態様では、干渉RNAの一方または両方の鎖の3'オーバーハングは、それぞれ独立して、標的配列またはその相補鎖に対する相補性を有する1、2、3、もしくは4個の修飾および/もしくは未修飾デオキシチミジン（「t」または「dT」）ヌクレオチド、1、2、3、もしくは4個の（例えば2'OMe）修飾および/もしくは未修飾ウリジン（「U」）リボヌクレオチド、または1、2、3、もしくは4個の（例えば2'OMe）修飾および/もしくは未修飾リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドを含みうる。
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞中のPLK-1などの一つまたは複数の関心対象の遺伝子を標的とする未修飾および/または修飾干渉RNA（例えばsiRNA）配列のカクテル（例えば少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20種、またはそれ以上）を含む組成物を提供する。干渉RNA（例えばsiRNA）のカクテルは、一つもしくは複数の標的遺伝子の同じ領域もしくはドメイン（例えば「ホットスポット」）および/または異なる領域もしくはドメインに対する配列を含みうる。特定の態様では、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20種、またはそれ以上（例えば全ての）のこれらの配列が、本明細書記載のように化学的に修飾（例えば2'OMe修飾）される。
ある態様では、センス鎖は、標的配列またはその部分に少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一な配列を含むか、またはそれから成る。ある他の態様では、センス鎖は、標的配列またはその部分と同一の配列の少なくとも約15個の連続ヌクレオチド（例えば少なくとも約15、16、17、18、または19個の連続ヌクレオチド）を含むか、またはそれから成る。好ましい態様では、そのようなセンス鎖配列を含む干渉RNA（例えばsiRNA）は、標的特異的なRNAiを仲介することができる。
いくつかの態様では、アンチセンス鎖は、標的配列またはその部分に対して少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%相補的な配列を含むか、またはそれから成る。他の態様では、アンチセンス鎖は、標的配列またはその部分に相補的な配列の少なくとも約15個の連続ヌクレオチド（例えば少なくとも約15、16、17、18、または19個の連続ヌクレオチド）を含むか、またはそれから成る。さらなる態様では、アンチセンス鎖は、標的配列またはその部分に特異的にハイブリダイズする配列を含むか、またはそれから成る。好ましい態様では、そのようなアンチセンス鎖配列を含む干渉RNA（例えばsiRNA）は、標的特異的なRNAiを仲介することができる。
好ましい一態様では、PLK-1 siRNAは、以下の配列：
Figure 2012531469
を含むアンチセンス鎖を含む。別の好ましい態様では、PLK-1 siRNAは、以下の配列：
Figure 2012531469
を含むセンス鎖をさらに含む。いくつかの態様では、PLK-1 siRNAは、少なくとも1個の2'OMeヌクレオチド、例えば少なくとも1個の2'OMe-グアノシンおよび/または2'OMe-ウリジンヌクレオチドを含む。場合によっては、PLK-1 siRNAは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7個、またはそれ以上の2'OMeヌクレオチド、例えば2'OMe-グアノシンおよび/または2'OMe-ウリジンヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。ある他の場合には、PLK-1 siRNAは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7個、またはそれ以上の2'OMeヌクレオチド、例えば2'OMe-グアノシンおよび/または2'OMe-ウリジンヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。
特定の態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約20%〜40%、25%〜40%、30%〜40%、20%〜35%、25%〜35%、20%〜30%、25%〜30%、26%〜34%、27%〜33%、28%〜32%、または約25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、もしくは40%は、例えば2'OMeヌクレオチド（例えば2'OMe-グアノシンおよび/または2'OMe-ウリジンヌクレオチド）などの修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様では、本発明のPLK-1 siRNAは、siRNAの一方または両方の鎖に3'オーバーハングを含む。特定の一態様では、アンチセンス鎖は5'-UC-3'オーバーハングを含み、センス鎖は5'-UU-3'オーバーハングを含む。場合によっては、siRNAの一方または両方の鎖の3'オーバーハングは、少なくとも1個の2'OMeヌクレオチド、例えば少なくとも1個の2'OMe-グアノシンおよび/または2'OMe-ウリジンヌクレオチドを含む。他の態様では、siRNA分子の一方または両方の鎖の3'オーバーハングは、1〜4個のデオキシチミジン（dT）ヌクレオチド、1〜4個の修飾および/もしくは未修飾ウリジン（U）リボヌクレオチド、または標的配列もしくはその相補鎖に対して相補性を有する1〜2個の追加的なリボヌクレオチドを含む。
いくつかの態様では、PLK-1 siRNAは、表1に示される以下のセンス鎖配列のうち一つを含むが、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
Figure 2012531469
他の態様では、PLK-1 siRNAは、表2に示される以下のアンチセンス鎖配列のうち一つを含むが、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
Figure 2012531469
Figure 2012531469
好ましい一態様では、PLK-1 siRNAは以下を含む：配列
Figure 2012531469
と、少なくとも1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上の2'OMeヌクレオチド、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上の2'OMe-グアノシンおよび/または2'OMe-ウリジンヌクレオチドとを含む、アンチセンス鎖；ならびに配列
Figure 2012531469
と、少なくとも1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上の2'OMeヌクレオチド、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上の2'OMe-グアノシンおよび/または2'OMe-ウリジンヌクレオチドとを含む、センス鎖。別の好ましい態様では、本発明のPLK-1 siRNAは以下を含む：S-1〜S-10のいずれか一つのヌクレオチド1〜19を含む、センス鎖；およびAS-A〜AS-HまたはAS-1〜AS-127のいずれか一つのヌクレオチド1〜19を含む、アンチセンス鎖。特に好ましい態様では、PLK-1 siRNAは以下から成る：S-1〜S-10のいずれか一つから選択されるセンス鎖；およびAS-A〜AS-HまたはAS-1〜AS-127のいずれか一つから選択されるアンチセンス鎖。
特定の一態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-F」、「PLK1424 S3/ASF」、または「PLK1424 2/6」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-1」または「PLK1424 S3/AS1」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-2」または「PLK1424 S3/AS2）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-3」または「PLK1424 S3/AS3」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-4」または「PLK1424 S3/AS4」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-5」または「PLK1424 S3/AS5」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-6」または「PLK1424 S3/AS6」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-7」または「PLK1424 S3/AS7」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-8」または「PLK1424 S3/AS8」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-9」または「PLK1424 S3/AS9」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-10」または「PLK1424 S3/AS10」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-11」または「PLK1424 S3/AS11」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-12」または「PLK1424 S3/AS12」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-13」または「PLK1424 S3/AS13」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-14」または「PLK1424 S3/AS14」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-3+AS-15」または「PLK1424 S3/AS15」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-F」または「PLK1424 S4/ASF」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-1」または「PLK1424 S4/AS1」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-2」または「PLK1424 S4/AS2」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-3」または「PLK1424 S4/AS3」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-4」または「PLK1424 S4/AS4」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-5」または「PLK1424 S4/AS5」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-6」または「PLK1424 S4/AS6」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-7」または「PLK1424 S4/AS7」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-8」または「PLK1424 S4/AS8」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-9」または「PLK1424 S4/AS9」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-10」または「PLK1424 S4/AS10」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-11」または「PLK1424 S4/AS11」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-12」または「PLK1424 S4/AS12」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-13」または「PLK1424 S4/AS13」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-14」または「PLK1424 S4/AS14」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-4+AS-15」または「PLK1424 S4/AS15」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-F」または「PLK1424 S9/ASF」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-1」または「PLK1424 S9/AS1」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-2」または「PLK1424 S9/AS2」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-3」または「PLK1424 S9/AS3」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-4」または「PLK1424 S9/AS4」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-5」または「PLK1424 S9/AS5」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-6」または「PLK1424 S9/AS6」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-7」または「PLK1424 S9/AS7」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-8」または「PLK1424 S9/AS8」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-9」または「PLK1424 S9/AS9」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-10」または「PLK1424 S9/AS10」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-11」または「PLK1424 S9/AS11」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-12」または「PLK1424 S9/AS12」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-13」または「PLK1424 S9/AS13」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-14」または「PLK1424 S9/AS14」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-9+AS-15」または「PLK1424 S9/AS15」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-F」または「PLK1424 S10/ASF」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-1」または「PLK1424 S10/AS1」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-2」または「PLK1424 S10/AS2」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-3」または「PLK1424 S10/AS3"）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-4」または「PLK1424 S10/AS4」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-5」または「PLK1424 S10/AS5"）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-6」または「PLK1424 S10/AS6"）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-7」または「PLK1424 S10/AS7」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-8」または「PLK1424 S10/AS8」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-9」または「PLK1424 S10/AS9」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-10」または「PLK1424 S10/AS10」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-11」または「PLK1424 S10/AS11」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-12」または「PLK1424 S10/AS12」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-13」または「PLK1424 S10/AS13」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-14」または「PLK1424 S10/AS14」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
なおさらに別の特定の態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
（「S-10+AS-15」または「PLK1424 S10/AS15」）、ここで、太字で下線付きのヌクレオチドは、2'OMeヌクレオチドである。
さらなる一態様では、PLK-1 siRNAは、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列から成る：
Figure 2012531469
。所望であれば、前述のPLK-1 siRNAを化学的に修飾して、その免疫刺激特性を低減する一方でそのサイレンシング活性を維持することもできることは、当業者に容易に明らかとなろう。
核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、典型的には、本明細書記載の一つまたは複数（例えばカクテル）の干渉RNA、陽イオン性脂質、および非陽イオン性脂質を含む。場合によっては、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、粒子の凝集を阻害する結合脂質をさらに含む。好ましくは、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、本明細書記載の一つまたは複数（例えばカクテル）の干渉RNA、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、および粒子の凝集を阻害する結合脂質を含む。特定の態様では、本発明の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、癌などの細胞増殖性障害に関連する1、2、3、4、5、6、7、8種、またはそれ以上の異なる遺伝子をサイレンシングする1、2、3、4、5、6、7、8種、またはそれ以上の未修飾および/または修飾干渉RNA、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、および粒子の凝集を阻害する結合脂質を含む。
いくつかの態様では、干渉RNA（例えばsiRNA）は、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）に完全に封入されている。干渉RNAカクテルを含む製剤に関して、カクテル中に存在する異なる種類の干渉RNA種（例えば異なる配列を有する干渉RNA化合物）は、同じ粒子中に共封入してもよく、カクテル中に存在する各種類の干渉RNA種を別々の粒子中に封入してもよい。二つまたはそれ以上の個別の干渉RNA（それぞれ固有の配列を有する）の混合物を同一の、類似の、または異なる濃度またはモル比で使用して、干渉RNAカクテルを製剤化し、本明細書記載の粒子とすることができる。一態様では、干渉RNAのカクテル（異なる配列を有する複数の干渉RNAに対応する）は、同一の、類似の、または異なる濃度またはモル比の各干渉RNA種を使用して製剤化され、異なる種類の干渉RNAが、同じ粒子中に共封入される。別の態様では、カクテル中に存在する各種類の干渉RNA種は、干渉RNAの同一の、類似の、または異なる濃度またはモル比で異なる粒子中に封入され、そのように形成された粒子（それぞれ異なる干渉RNA搭載物を含有する）は、別々に（例えば治療方式に応じた異なる時点で）投与されるか、または1回単位投与として一緒に組み合わせて（例えば薬学的に許容されうる担体と共に）投与される。本明細書記載の脂質粒子は、血清安定であり、ヌクレアーゼ分解に耐性であり、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に無毒である。
本発明の脂質粒子（例えばSNALP）中の陽イオン性脂質は、例えば、本明細書記載の式I〜XVIで示される一つもしくは複数の陽イオン性脂質または任意の他の陽イオン性脂質種を含みうる。特定の一態様では、陽イオン性脂質は、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、1,2-ジ-γ-リノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（γ-DLenDMA）、2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-C2-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-DMA）、またはそれらの混合物を含む。
本発明の脂質粒子（例えばSNALP）中の非陽イオン性脂質は、例えば一つまたは複数の陰イオン性脂質および/または中性脂質を含みうる。いくつかの態様では、非陽イオン性脂質は、以下の中性脂質構成要素の一つを含む：（1）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物；（2）コレステロールまたはその誘導体；あるいは（3）リン脂質。ある好ましい態様では、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、またはそれらの混合物を含む。特に好ましい態様では、非陽イオン性脂質は、DPPCとコレステロールとの混合物である。
特定の一態様では、脂質粒子製剤の非陽イオン性脂質構成要素は、リン脂質とコレステロール（またはその誘導体）との混合物を含む。場合によっては、混合物は：（i）粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%のリン脂質；および（ii）粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約35mol%のコレステロールまたはその誘導体を含む。別の特定の態様では、非陽イオン性脂質構成要素は、コレステロール、その誘導体、またはそれらの混合物である。
本発明の脂質粒子（例えばSNALP）中の脂質コンジュゲートは、粒子の凝集を阻害し、例えば本明細書記載の一つまたは複数の脂質コンジュゲートを含みうる。特定の一態様では、脂質コンジュゲートは、PEG-脂質コンジュゲートを含む。PEG-脂質コンジュゲートの例には、非限定的にPEG-DAGコンジュゲート、PEG-DAAコンジュゲート、およびそれらの混合物が含まれる。ある態様では、脂質粒子中のPEG-DAAコンジュゲートは、PEG-ジデシルオキシプロピル(C10)コンジュゲート、PEG-ジラウリルオキシプロピル(C12)コンジュゲート、PEG-ジミリスチルオキシプロピル(C14)コンジュゲート、PEG-ジパルミチルオキシプロピル(C16)コンジュゲート、PEG-ジステアリルオキシプロピル(C18)コンジュゲート、またはそれらの混合物を含みうる。別の態様では、脂質コンジュゲートは、POZ-DAAコンジュゲートなどのPOZ-脂質コンジュゲートを含む。特定の態様では、脂質コンジュゲート（例えばPEG-脂質コンジュゲート）は、粒子中に存在する総脂質の約6mol%〜約8mol%を含む。
本明細書記載のPEG-脂質コンジュゲートのPEG成分は、約550ダルトン〜約10,000ダルトンの範囲の平均分子量を含みうる。場合によっては、PEG成分は、約550ダルトン〜約1000ダルトンの平均分子量を有する。他の場合には、PEG成分は、約250ダルトン〜約1000ダルトン、約400ダルトン〜約1000ダルトン、約600ダルトン〜約900ダルトン、約700ダルトン〜約800ダルトン、または約200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは1000ダルトンの平均分子量を有する。特定の一態様では、PEG成分は、約750ダルトンの平均分子量を有する。いくつかの態様では、PEG成分の末端ヒドロキシル基は、メチル基で置換されている。好ましい態様では、PEG-脂質コンジュゲートはPEG750-C-DMAを含み、ここで「750」は、PEGの平均分子量を意味し、ここで「C」は、カルバメートリンカー成分を意味し、ここで「DMA」は、ジミリスチルオキシプロピルを意味する。
特定の一態様では、本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、4成分系を備え、ここで：
陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約50mol%〜約60mol%（例えば約54mol%）を構成し、
非陽イオン性脂質は、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、ここでリン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%（例えば約7mol%）を構成し、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約35mol%（例えば約32mol%）を構成し、
粒子の凝集を阻害する結合脂質（すなわち脂質コンジュゲート）は、粒子中に存在する総脂質の約6mol%〜約8mol%（例えば約7mol%）を構成する。
本態様の例示的な局面では、陽イオン性脂質は、DLinDMAまたはDLin-K-C2-DMA（「C2K」）であって、非陽イオン性脂質は、DPPCとコレステロールとの混合物を含み、脂質コンジュゲートは、PEG750-DMAコンジュゲート（例えばPEG750-C-DMA）などのPEG-脂質コンジュゲートである。
別の特定の態様では、本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、リン脂質不含の3成分系を備え、ここで：
陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約55mol%〜約65mol%（例えば約58mol%）を構成し、
非陽イオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体を含み、ここで、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の約30mol%〜約40mol%（例えば約35mol%）を構成し、
粒子の凝集を阻害する結合脂質（すなわち脂質コンジュゲート）は、粒子中に存在する総脂質の約6mol%〜約8mol%（例えば約7mol%）を構成する。
本態様の例示的な局面では、陽イオン性脂質はDLinDMAまたはDLin-K-C2-DMA（「C2K」）であり、非陽イオン性脂質はコレステロールであり、脂質コンジュゲートは、PEG750-DMAコンジュゲート（例えばPEG750-C-DMA）などのPEG-脂質コンジュゲートである。
好ましい一局面では、本発明は、以下を含む核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を提供する：
（a）干渉RNA（例えばsiRNAなどのdsRNA）；
（b）粒子中に存在する総脂質の約54mol%を構成する陽イオン性脂質；
（c）粒子中に存在する総脂質の約7mol%を構成するリン脂質；
（d）粒子中に存在する総脂質の約32mol%を構成するコレステロールまたはその誘導体；および
（e）粒子中に存在する総脂質の約7mol%を構成するPEG-脂質コンジュゲート。
別の好ましい局面では、本発明は、以下を含む核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を提供する：
（a）干渉RNA（例えばsiRNAなどのdsRNA）；
（b）粒子中に存在する総脂質の約58mol%を構成する陽イオン性脂質；
（c）粒子中に存在する総脂質の約35mol%を構成するコレステロールまたはその誘導体；および
（d）粒子中に存在する総脂質の約7mol%を構成するPEG-脂質コンジュゲート。
本発明はまた、本明細書記載の脂質粒子（例えば核酸-脂質粒子）および薬学的に許容されうる担体を含む薬学的組成物を提供する。
別の局面では、本発明は、核酸（例えば干渉RNA）などの一つまたは複数の活性剤を細胞に導入するための方法であって、細胞を本明細書記載の脂質粒子（例えば核酸-脂質粒子）と接触させる工程を含む方法を提供する。特定の一態様では、細胞は、例えば哺乳動物（例えばヒト）の固形腫瘍中に存在する細胞などの腫瘍細胞である。いくつかの場合には、固形腫瘍は肝臓腫瘍である。他の場合には、固形腫瘍は、肝臓外部に位置する。ある態様では、細胞は、細胞増殖、腫瘍形成、または細胞形質転換に関連する一つまたは複数の血管新生因子および/または成長因子を生成する、哺乳動物中に存在する非腫瘍細胞である。
さらに別の局面では、本発明は、核酸（例えば干渉RNA）などの一つまたは複数の活性剤を固形腫瘍にインビボ送達するための方法であって、哺乳動物（例えばヒト）に本明細書記載の脂質粒子（例えばSNALP）を投与する工程を含む方法を提供する。
関連する局面では、本発明は、それを必要とする哺乳動物（例えばヒト）において癌を治療するための方法であって、哺乳動物に核酸（例えば干渉RNA）などの一つまたは複数の活性剤を含む脂質粒子（例えばSNALP）の治療的有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
下記実施例に記載するように、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）などの脂質粒子は、例えば癌の治療のために、干渉RNAなどの搭載物を他の組織に比べて固形腫瘍に優先的に送達することができる。特定の一態様では、固形腫瘍は肝臓腫瘍である。別の特定の態様では、固形腫瘍は肝臓外部に位置する。
いくつかの態様では、本明細書記載の脂質粒子（例えばSNALP）は、以下の投与経路の一つによって投与される：経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、および皮内。特定の態様では、核酸-脂質粒子は、例えば経腸または非経口投与経路を介して全身投与される。
特定の一局面では、本発明は、哺乳動物の腫瘍細胞に、細胞増殖、腫瘍形成、または細胞形質転換に関連する遺伝子の発現をサイレンシングするsiRNAなどの干渉RNAを導入するための方法であって、哺乳動物に本明細書記載の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を投与する工程を含む方法を提供し、ここでsiRNAは、他の細胞に比べて腫瘍細胞に優先的に導入される。ある態様では、腫瘍細胞は、ヒトなどの哺乳動物の固形腫瘍中に存在する。いくつかの場合には、固形腫瘍は肝臓腫瘍である。他の場合には、固形腫瘍は、肝臓外部に位置する。ある他の態様では、siRNAはまた、細胞増殖、腫瘍形成、または細胞形質転換に関連する一つまたは複数の血管新生因子および/または成長因子を生成する、哺乳動物中に存在する非腫瘍細胞に（例えば優先的に）導入することができる。
いくつかの態様では、本発明は、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）中の干渉RNA（例えばsiRNA）などの核酸を単独で、または化学療法薬と組み合わせて投与することによって、癌などの細胞増殖性障害を治療するための方法を提供する。方法は、標準的な組織培養技法を使用してインビトロで、または当技術分野で公知の任意の手段を使用して干渉RNA（例えばsiRNA）を投与することによってインビボで実施することができる。好ましい態様では、干渉RNA（例えばsiRNA）は、単独でまたは化学療法薬と組み合わせて、ヒトなどの哺乳動物中の癌細胞に送達される。核酸-脂質粒子および/または化学療法薬はまた、従来のホルモン剤、免疫療法剤、および/または放射線療法剤と同時投与することができる。
特定の態様では、干渉RNA分子（例えばsiRNA）は、細胞増殖、腫瘍形成、または細胞形質転換に関連する遺伝子の発現をサイレンシングする。適切な腫瘍学的標的遺伝子の非限定的な例が、本明細書に提供される。例示的な好ましい態様では、siRNAは、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）遺伝子発現をサイレンシングする。PLK-1遺伝子を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、本明細書記載の例および米国特許出願公開第20050107316号および同第20070265438号、ならびに国際公開公報第09/082817号が含まれ、それらの開示は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。脂質粒子を使用して細胞増殖性障害を治療することに関する追加的な態様は、例えば米国特許出願公開第20090149403号、国際公開公報第09/129319号、および2009年9月23日に出願された米国仮特許出願第61/245,143号に記載されており、それらの開示は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、細胞増殖、腫瘍形成、または細胞形質転換（例えばPLK-1）に関連する一つまたは複数の遺伝子の発現をサイレンシングする干渉RNA（例えばsiRNA）分子の治療的送達に有用である。いくつかの態様では、腫瘍細胞中で発現した一つまたは複数の遺伝子を標的とするsiRNAのカクテルを製剤化して同一のまたは異なる核酸-脂質粒子（例えばSNALP）とし、該粒子を、そのような治療を必要とする哺乳動物（例えばヒト）に投与する。場合によっては、例えば固形腫瘍を優先的に標的とすることによって、例えば癌を治療、予防するために、発症リスクを低減するために、または癌の発症を遅延させるために、治療的有効量の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を哺乳動物に投与することができる。
下記実施例に記載するように、式I〜XVIで示される少なくとも一つの陽イオン性脂質（単独でまたは他の陽イオン性脂質と組み合わせて）と、本明細書記載の少なくとも一つの干渉RNAとを含有する本発明のSNALP製剤が、PLK-1などの腫瘍細胞において関心対象の遺伝子を標的とする場合に、他のSNALP製剤に比べて、強度の増大（すなわちサイレンシング活性の増大）および/または耐容性の増大（例えばより有利な毒性プロファイル）を示すことが見出されたのは驚くべきことである。したがってある態様では、本発明は、それを必要とする哺乳動物（例えばヒト）においてPLK-1の過剰発現に関連する疾患または障害を治療するための方法であって、哺乳動物に、PLK-1の発現をサイレンシングする一つまたは複数の干渉RNA分子を含む脂質粒子（例えばSNALP）の治療的有効量を投与する工程を含む方法を提供する。PLK-1の過剰発現に関連する疾患および障害は本明細書に記載され、それには、非限定的に、癌などの細胞増殖性障害が含まれる。
いくつかの態様では、本明細書記載の干渉RNA（例えばsiRNA）分子は、例えば腫瘍細胞などの細胞において、PLK-1遺伝子の発現をサイレンシングするための方法に使用される。特に、PLK-1遺伝子の転写および/または翻訳を下方制御またはサイレンシングすることによって、哺乳動物における細胞増殖性障害を治療、予防するための、該障害のリスクを低減するための、または該障害の発症を遅延させるための方法を提供することが、本発明の目的である。ある態様では、本発明は、細胞を本明細書記載の核酸-脂質粒子（例えばSNALP製剤）と接触させることによって、本明細書記載の一つまたは複数の干渉RNA（例えばsiRNA）分子を細胞に導入するための方法を提供する。特定の一態様では、細胞は、例えば哺乳動物（例えばヒト）の固形腫瘍組織中に存在する細胞などの腫瘍細胞である。別の態様では、本発明は、哺乳動物（例えばヒト）に本明細書記載の核酸-脂質粒子（例えばSNALP製剤）を投与することによって、腫瘍細胞に本明細書記載の一つまたは複数の干渉RNA（例えばsiRNA）分子をインビボ送達するための方法を提供する。
いくつかの態様では、本明細書記載の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）は、以下の投与経路の一つによって投与される：経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、および皮内。特定の態様では、核酸-脂質粒子は、例えば経腸または非経口投与経路を介して、全身投与される。
ある局面では、本発明は、それを必要とする哺乳動物（例えばヒト）においてPLK-1遺伝子の発現をサイレンシングするための方法であって、哺乳動物に、本明細書記載の一つまたは複数の干渉RNA（例えばsiRNA）（例えばPLK-1遺伝子を標的とする一つまたは複数のsiRNA）を含む核酸-脂質粒子（例えばSNALP製剤）の治療的有効量を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様では、本明細書記載の一つまたは複数のsiRNAを含む核酸-脂質粒子の投与は、siRNAの非存在下で（例えば緩衝液対照または無関係のsiRNA対照を用いて）検出された標的遺伝子のmRNAレベルに比べて、標的遺伝子のmRNAレベル（例えばヒトにおいてまたはマウスモデルもしくはサルモデルなどの動物モデルにおいて）を少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%（またはその中の任意の範囲で）低減する。他の態様では、本明細書記載の一つまたは複数のsiRNAを含む核酸-脂質粒子の投与は、例えば緩衝液対照または無関係のsiRNA対照などの陰性対照に比べて標的遺伝子のmRNAレベル（例えばヒトにおいてまたはマウスモデルもしくはサルモデルなどの動物モデルにおいて）を少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100日間またはそれ以上（またはその中の任意の範囲で）低減する。
ある他の局面では、本発明は、それを必要とする哺乳動物（例えばヒト）において細胞増殖性障害に関連する一つまたは複数の症状を治療するため、予防するため、該症状の発症のリスクもしくは見込みを低減（例えば感受性を低減）するため、開始を遅延するため、および/または該症状を改善するための方法であって、哺乳動物に、本明細書記載の一つまたは複数の干渉RNA分子（例えばsiRNA）（例えばPLK-1遺伝子を標的とする一つまたは複数のsiRNA）を含む核酸-脂質粒子（例えばSNALP製剤）の治療的有効量を投与する方法を提供する。
関連する局面では、本発明は、それを必要とする哺乳動物（例えばヒト）において癌などの細胞増殖性障害に関連する一つまたは複数の症状を治療および/または改善するための方法であって、哺乳動物に、本明細書記載の一つまたは複数の干渉RNA（例えばsiRNA）（例えばPLK-1遺伝子を標的とする一つまたは複数のsiRNA）を含む核酸-脂質粒子（例えばSNALP製剤）の治療的有効量を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様では、本明細書記載の一つまたは複数のsiRNA分子を含む核酸-脂質粒子の投与は、siRNAの非存在下で（例えば緩衝液対照または無関係なsiRNA対照を用いて）検出された腫瘍の大きさおよび/または体積に比べて腫瘍の大きさおよび/または体積を（例えばヒトにおいてまたはマウスモデルもしくはサルモデルなどの動物モデルにおいて）少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%（またはその中の任意の範囲で）低減する。
別の関連する局面では、本発明は、細胞増殖性障害のリスクを有する哺乳動物（例えばヒト）において、癌などの細胞増殖性障害のリスクまたは見込みを低減（例えばそれに対する感受性を低減）するための方法であって、哺乳動物に、本明細書記載の一つまたは複数の干渉RNA（例えばsiRNA）（例えばPLK-1遺伝子を標的とする一つまたは複数のsiRNA）を含む核酸-脂質粒子（例えばSNALP製剤）の治療的有効量を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様では、本明細書記載の一つまたは複数のsiRNA分子を含む核酸-脂質粒子の投与は、siRNAの非存在下で（例えば緩衝液対照または無関係なsiRNA対照を用いて）細胞増殖性障害のリスクまたは見込みに比べて細胞増殖性障害のリスクまたは見込み（例えばヒトにおいてまたはマウスモデルもしくはサルモデルなどの動物モデルにおいて）を少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%（またはその中の任意の範囲で）低減する。
さらに別の関連する局面では、本発明は、細胞増殖性障害のリスクを有する哺乳動物（例えばヒト）において、癌などの細胞増殖性障害の発症を予防または遅延するための方法であって、哺乳動物に、本明細書記載の一つまたは複数の干渉RNA（例えばsiRNA）（例えばPLK-1遺伝子を標的とする一つまたは複数のsiRNA）を含む核酸-脂質粒子（例えばSNALP製剤）の治療的有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
IV. 脂質粒子
本発明の脂質粒子は、典型的には、活性剤または治療剤、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、および粒子の凝集を阻害する結合脂質を含む。いくつかの態様では、活性剤または治療剤は、脂質粒子中の活性剤または治療剤が水溶液中で例えばヌクレアーゼまたはプロテアーゼによる酵素的分解に耐性であるように、脂質粒子の脂質成分内に完全に封入される。他の態様では、本明細書記載の脂質粒子は、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に無毒である。本発明の脂質粒子は、典型的には、約30nm〜約150nm、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70〜約90nmの平均直径を有する。本発明の脂質粒子は、また典型的には、約1：1〜約100：1、約1：1〜約50：1、約2：1〜約25：1、約3：1〜約20：1、約5：1〜約15：1、または約5：1〜約10：1の脂質：治療剤（例えば脂質：核酸）比（質量/質量比）を有する。
脂質粒子には、非限定的に、リポソームなどの脂質小胞が含まれる。本明細書で使用される脂質小胞には、水性の内部を密閉する脂質含有膜を有する構造が含まれる。特定の態様では、本明細書記載の一つまたは複数の陽イオン性脂質を含む脂質小胞は、脂質小胞内に核酸を封入するために使用される。他の態様では、本明細書記載の一つまたは複数の陽イオン性脂質を含む脂質小胞は、核酸と複合体を形成してリポプレックスを形成する。
好ましい態様では、本発明の脂質粒子は、干渉RNA（例えば、siRNAなどのdsRNA、ダイサー基質dsRNA、shRNA、aiRNA、および/またはmiRNA）、陽イオン性脂質（例えば、本明細書に示される式I〜XVIで示される一つまたは複数の陽イオン性脂質またはその塩）、非陽イオン性脂質（例えば一つまたは複数のリン脂質とコレステロールとの混合物）、および粒子の凝集を阻害する結合脂質（例えば一つまたは複数のPEG-脂質コンジュゲート）を含む、血清安定核酸-脂質粒子（SNALP）である。SNALPは、本明細書記載の一つまたは複数の遺伝子を標的とする、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の未修飾および/または修飾干渉RNA（例えばsiRNA）を含みうる。核酸-脂質粒子およびその調製方法は、例えば米国特許第5,753,613号；同第5,785,992号；同第5,705,385号；同第5,976,567号；同第5,981,501号；同第6,110,745号；および同第6,320,017号；ならびに国際公開公報第96/40964号に記載されており、それらの開示は、それぞれ全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の核酸-脂質粒子において、核酸は粒子の脂質成分内に完全に封入されており、このことによって、核酸をヌクレアーゼ分解から保護することができる。好ましい態様では、干渉RNAなどの核酸を含むSNALPは粒子の脂質成分内に完全に封入されており、このことによって、核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。場合によっては、SNALP中の核酸は、37℃で少なくとも約20、30、45、または60分間粒子をヌクレアーゼに曝露した後に、実質的に分解されない。ある他の場合には、SNALP中の核酸は、粒子を血清中で37℃で少なくとも約30、45、もしくは60分間または少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、もしくは36時間インキュベーションした後に実質的に分解されない。他の態様では、核酸は、粒子の脂質成分と複合体を形成している。本発明の製剤の利点の一つは、核酸-脂質粒子組成物が、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に無毒なことである。
「完全に封入された」という用語は、核酸-脂質粒子中の核酸が、遊離のDNAまたはRNAを著しく分解しうる血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露の後に有意には分解されないことを示す。完全に封入されたシステムでは、通常は、遊離核酸の100%が分解されうる処理において、粒子中の核酸の好ましくは約25%未満が分解され、さらに好ましくは粒子中の核酸の約10%未満、最も好ましくは約5%未満が分解される。「完全に封入された」とはまた、核酸-脂質粒子が血清安定であること、すなわち、インビボ投与直後に迅速に分解されてその構成成分になることがないことも示す。
核酸の文脈において、完全な封入は、核酸と結合した場合に強化蛍光を発する色素を使用する膜不透過性蛍光色素排除アッセイを行うことによって判定することができる。OliGreen（登録商標）およびRiboGreen（登録商標）（Invitrogen Corp.；Carlsbad, CA）のような特異的色素が、プラスミドDNA、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、および/または一本鎖もしくは二本鎖のリボヌクレオチドの定量のために利用可能である。封入は、リポソーム製剤に色素を添加する工程、得られた蛍光を測定する工程、およびそれを、少量の非イオン性界面活性剤を添加したときに観察される蛍光と比較する工程によって判定される。リポソーム二重層の界面活性剤介在性破壊によって、封入された核酸が放出され、それにより、膜不透過性色素との相互作用が可能になる。核酸封入は、E=(I0-I)/I0として計算することができ、式中、IおよびI0は、界面活性剤添加前後の蛍光強度を表す（Wheeler et al., Gene Ther., 6:271-281 (1999)を参照されたい）。
他の態様では、本発明は、複数の核酸-脂質粒子を含む核酸-脂質粒子（例えばSNALP）組成物を提供する。
いくつかの場合には、SNALP組成物は、粒子の約30%〜約100%、約40%〜約100%、約50%〜約100%、約60%〜約100%、約70%〜約100%、約80%〜約100%、約90%〜約100%、約30%〜約95%、約40%〜約95%、約50%〜約95%、約60%〜約95%、約70%〜約95%、約80%〜約95%、約85%〜約95%、約90%〜約95%、約30%〜約90%、約40%〜約90%、約50%〜約90%、約60%〜約90%、約70%〜約90%、約80%〜約90%、または少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）の内部に核酸が封入されるように、粒子の脂質成分内に完全に封入された核酸を含む。
他の場合では、SNALP組成物は、投入核酸の約30%〜約100%、約40%〜約100%、約50%〜約100%、約60%〜約100%、約70%〜約100%、約80%〜約100%、約90%〜約100%、約30%〜約95%、約40%〜約95%、約50%〜約95%、約60%〜約95%、約70%〜約95%、約80%〜約95%、約85%〜約95%、約90%〜約95%、約30%〜約90%、約40%〜約90%、約50%〜約90%、約60%〜約90%、約70%〜約90%、約80%〜約90%、または少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）が粒子中に封入されるように、粒子の脂質成分内に完全に封入された核酸を含む。
本発明の脂質粒子の意図される使用に応じて、構成要素の比率を変動させることができ、特定の製剤の送達効率は、例えば、エンドソーム放出パラメーター（ERP）アッセイを用いて測定することができる。
特定の態様では、本発明は、本明細書記載の複数の脂質粒子および酸化防止剤を含む脂質粒子（例えばSNALP）組成物を提供する。場合によっては、脂質粒子組成物中の酸化防止剤は、脂質粒子中に存在する陽イオン性脂質の分解を低減、防止、および/または阻害する。活性剤が干渉RNA（例えばsiRNA）などの治療用核酸である場合に、脂質粒子組成物中の酸化防止剤は、例えば核酸と陽イオン性脂質との間の付加物形成を低減、防止、および/または阻害することによって核酸搭載物の分解を低減、防止、および/または阻害する。酸化防止剤の非限定的な例には、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、クエン酸塩等の金属キレート剤）、親油性酸化防止剤（例えばビタミンE異性体、ポリフェノール等）、その塩などの親水性酸化防止剤；およびそれらの混合物が含まれる。必要ならば酸化防止剤は典型的に、粒子中に存在する陽イオン性脂質および/または活性剤の分解を防止、阻害、および/または低減するために十分な量で存在し、例えば少なくとも約20mMのEDTAもしくはその塩、または少なくとも約100mMのクエン酸塩もしくはその塩である。EDTAおよび/またはクエン酸塩などの酸化防止剤は、第V節に記載された脂質粒子形成プロセスにおける任意の段階または複数の段階において（例えば脂質粒子形成の前、途中、および/または後に）添加してもよい。
脂質粒子中に存在する陽イオン性脂質および/または活性剤（例えば治療用核酸）の分解を防止する方法、これらの方法によって安定化された脂質粒子を含む組成物、これらの脂質粒子を製造する方法、ならびにこれらの脂質粒子を送達および/または投与する方法に関する追加的な態様は、2009年12月1日に出願された「SNALP Formulations Containing Antioxidants」という名称の米国仮特許出願第61/265,671号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
A. 活性剤
活性剤（例えば治療剤）には、細胞、組織、器官、または対象に所望の作用を発揮することができる任意の分子または化合物が含まれる。そのような作用は、例えば生物学的、心理学的、および/または化粧料的でありうる。活性剤は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、小分子、およびそれらの混合物を非限定的に含む任意の種類の分子または化合物でありうる。核酸の非限定的な例には、干渉RNA分子（例えばsiRNAなどのdsRNA、ダイサー基質dsRNA、shRNA、aiRNA、および/またはmiRNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、リボザイム、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびそれらの混合物が含まれる。ペプチドまたはポリペプチドの例には、非限定的に、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、および／またはPrimatized（商標）抗体）、サイトカイン、成長因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体およびそれらのリガンド、ホルモン、ならびにそれらの混合物が含まれる。小分子の例には、非限定的に、当業者に公知の、任意の従来の剤または薬物などの有機小分子または化合物が含まれる。
いくつかの態様では、活性剤は、治療剤またはその塩もしくは誘導体である。治療剤の誘導体は、それ自体が治療的に活性であってもよく、またはさらなる修飾により活性になるプロドラッグであってもよい。したがって、一態様では、治療剤の誘導体は、未修飾の剤に比べて一部または全ての治療活性を保持するが、別の態様では、治療剤の誘導体は、治療活性を欠如するがさらに修飾されると活性になるプロドラッグである。
1. 核酸
ある態様では、本発明の脂質粒子は、核酸に結合し、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を生じる。いくつかの態様では、核酸は、脂質粒子中に完全に封入されている。本明細書で使用される「核酸」という用語には、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれ、最大60個のヌクレオチドを含有する断片が、一般にオリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片は、ポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、約15〜約60ヌクレオチド長である。核酸は、本発明の脂質粒子内で単独で、または、ペプチド、ポリペプチド、もしくは従来の薬物などの小分子を含む本発明の脂質粒子と組み合わせて（例えば同時投与）、投与することができる。同じように、癌などの細胞増殖性障害の治療に使用される場合、干渉RNA分子（例えばsiRNA）などの核酸は、単独投与、または例えば癌などの細胞増殖性障害を治療するために使用される従来の剤と同時投与（すなわち同時発生的または連続的）することができる。そのような剤には、化学療法薬ならびに従来のホルモン剤、免疫療法剤、および/または放射線療法剤が含まれる。
本発明の文脈で、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然塩基、糖および糖間（主鎖）結合から成るヌクレオチドモノマーまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語にはまた、同様に機能する、非天然モノマーまたはその部分を含むポリマーまたはオリゴマーが含まれる。そのような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取込み増強、免疫原性の低減、およびヌクレアーゼ存在下での安定性増大などの性質のために多くの場合で天然型よりも好ましい。
オリゴヌクレオチドは、一般に、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドとして分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、デオキシリボースと呼ばれる五炭糖が、該糖の5'および3'の炭素においてリン酸に共有結合して、一つおきに非分岐ポリマーを形成したものから成る。リボオリゴヌクレオチドは、五炭糖がリボースである類似の繰り返し構造から成る。
本発明の核酸-脂質粒子に存在する核酸には、公知の任意の形態の核酸が含まれる。本明細書に使用される核酸は、一本鎖DNAもしくはRNA、または二本鎖DNAもしくはRNA、またはDNA-RNAハイブリッドでありうる。好ましい態様では、核酸は二本鎖RNAである。二本鎖RNAの例は、本明細書に記載されており、それには、例えばsiRNAならびにダイサー基質dsRNA、shRNA、aiRNA、およびプレ-miRNAなどの他のRNAi剤が含まれる。他の好ましい態様では、核酸は一本鎖核酸である。一本鎖核酸には、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、成熟miRNA、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。さらなる態様では、核酸は二本鎖DNAである。二本鎖DNAの例には、例えば、その開示が全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第2004/104199号に記載されたDNAセンス鎖およびDNAアンチセンス鎖を含むDNA-DNAハイブリッドが含まれる。
本発明の核酸は、一般に核酸の特定の形態に応じて様々な長さでありうる。例えば、特定の態様では、プラスミドまたは遺伝子は、約1,000〜約100,000ヌクレオチド残基長でありうる。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、約10〜約100ヌクレオチド長の範囲でありうる。様々な関連する態様では、一本鎖、二本鎖、および三本鎖のいずれのオリゴヌクレオチドも、約10〜約60ヌクレオチド長、約15〜約60ヌクレオチド長、約20〜約50ヌクレオチド長、約15〜約30ヌクレオチド長、または約20〜約30ヌクレオチド長の範囲でありうる。
特定の態様では、本発明のオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするか、または相補的である。本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的」という用語は、DNAまたはRNA標的とオリゴヌクレオチドとの間に安定で特異的な結合が起きるのに十分な程度の相補性を示す。特異的にハイブリダイズ可能であるために、オリゴヌクレオチドがその標的核酸配列に対して100%相補的である必要はないことが理解されている。好ましい態様では、特異的結合が望まれる条件下で、すなわちインビボアッセイもしくは治療的処置の場合には生理的条件下で、またはインビトロアッセイの場合にはアッセイが行われる条件下で、標的配列へのオリゴヌクレオチドの結合が該標的配列の正常な機能を妨害してその有用性または発現の欠如をもたらし、かつ非標的配列への該オリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるために十分な程度の相補性がある場合に、該オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。したがって、オリゴヌクレオチドは、それが標的とするか特異的にハイブリダイズする遺伝子またはmRNA配列の領域に比べて、1、2、3、またはそれ以上の塩基置換を含みうる。
a）siRNA
本発明の核酸-脂質粒子のsiRNA構成要素は、PLK-1などの関心対象の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。siRNA二重鎖の各鎖は、典型的には約15〜約60ヌクレオチド長、好ましくは約15〜約30ヌクレオチド長である。ある態様では、siRNAは、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾siRNAは、一般に、対応する未修飾siRNA配列よりも免疫刺激性が低く、関心対象の標的遺伝子に対するRNAi活性を保持する。いくつかの態様では、修飾siRNAは、2'OMe-グアノシン、2'OMe-ウリジン、2'OMe-アデノシン、および/または2'OMe-シトシンヌクレオチドなどの、少なくとも1個の2'OMeプリンまたは2'OMeピリミジンヌクレオチドを含有する。修飾ヌクレオチドは、siRNAの一方の鎖（すなわちセンスまたはアンチセンス）または両方の鎖に存在しうる。いくつかの好ましい態様では、一つまたは複数のウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドが、siRNAの一方の鎖（すなわちセンスまたはアンチセンス）または両方の鎖で修飾（例えば2'OMe修飾）されている。これらの態様では、修飾siRNAは、さらに、一つまたは複数の修飾（例えば2'OMe修飾）アデノシンおよび/または修飾（例えば2'OMe修飾）シトシンヌクレオチドを含みうる。他の好ましい態様では、ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドだけが、siRNAの一方の鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス）または両方の鎖で修飾（例えば2'OMe修飾）されている。siRNA配列は、オーバーハング（例えば、Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 （2001)またはNykanen et al., Cell, 107:309 (2001)に記載されているような3'または5'オーバーハング）を有してもよく、オーバーハングを欠如していてもよい（すなわち平滑末端を有する）。
特定の態様では、siRNAの一方または両方の鎖の二本鎖領域への2'OMeウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドの選択的組み込みは、siRNA分子に対する免疫反応を低減するかまたは完全に抑制する。場合によっては、特異的siRNA配列の免疫刺激特性および遺伝子発現をサイレンシングする能力は、siRNA二重鎖の二本鎖領域内への最小かつ選択的な2'OMe修飾の導入により均衡をとることができ、または最適化することができる。これは、未修飾siRNAの使用に付随するサイトカイン誘導、毒性、およびオフターゲット効果を伴うことなく、治療的に実行可能なsiRNA用量で達成することができる。
修飾siRNAは、一般に、siRNA二重鎖の二本鎖領域に約1%〜約100%（例えば約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%）の修飾ヌクレオチドを含む。ある態様では、siRNAの二本鎖領域中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含む。ある他の態様では、siRNAの二本鎖領域中の一部または全ての修飾ヌクレオチドは、互いに1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ヌクレオチド、またはそれ以上離れている。好ましい一態様では、siRNAの二本鎖領域中の修飾ヌクレオチドのどれも互いに隣接しない（例えば、各修飾ヌクレオチドの間に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の未修飾ヌクレオチドのギャップがある）。別の好ましい態様では、siRNAの二本鎖領域中の少なくとも2個の修飾ヌクレオチドが、互いに隣接する（例えば、2個またはそれ以上の修飾ヌクレオチドの間に未修飾ヌクレオチドが存在しない）。他の好ましい態様では、siRNAの二本鎖領域中の少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5個の修飾ヌクレオチドが、互いに隣接する。
いくつかの態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満（例えば約49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、または36%未満、好ましくは約35%、34%、33%、32%、31%、または30%未満）が、（例えば2'OMe)修飾ヌクレオチドを含む。これらの態様の一局面では、siRNAの一方または両方の鎖の二本鎖領域中のウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドの約50%未満が、選択的に（例えば唯一）修飾されている。これらの態様の別の局面では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満が2'OMeヌクレオチドを含むが、ここで、siRNAはsiRNAの両方の鎖に2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは少なくとも1個の2'OMe-グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも1個の2'OMe-ウリジンヌクレオチドを含み、ここで、2'OMe-グアノシンヌクレオチドおよび2'OMe-ウリジンヌクレオチドだけが、二本鎖領域に存在する2'OMeヌクレオチドである。これらの態様のさらに別の局面では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満が2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは修飾siRNAの両方の鎖に2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは二本鎖領域に2'OMe-シトシンヌクレオチドを含まない。これらの態様のさらなる局面では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満が2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、siRNAはsiRNAの両方の鎖に2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは少なくとも1個の2'OMe-グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも1個の2'OMe-ウリジンヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは二本鎖領域に2'OMe-シトシンヌクレオチドを含まない。これらの態様の別の局面では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満が、2'OMeヌクレオチドを含み、ここでsiRNAは修飾siRNAの両方の鎖に2'0Meヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、二本鎖領域中の2'0Meヌクレオチドは互いに隣接しない。
他の態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%（例えば、約5%〜50%、10%〜50%、15%〜50%、20%〜50%、25%〜50%、30%〜50%、35%〜50%、40%〜50%、45%〜50%、5%〜45%、10%〜45%、15%〜45%、20%〜45%、25%〜45%、30%〜45%、35%〜45%、40%〜45%、5%〜40%、10%〜40%、15%〜40%、20%〜40%、25%〜40%、25%〜39%、25%〜38%、25%〜37%、25%〜36%、26%〜39%、26%〜38%、26%〜37%、26%〜36%、27%〜39%、27%〜38%、27%〜37%、27%〜36%、28%〜39%、28%〜38%、28%〜37%、28%〜36%、29%〜39%、29%〜38%、29%〜37%、29%〜36%、30%〜40%、30%〜39%、30%〜38%、30%〜37%、30%〜36%、31%〜39%、31%〜38%、31%〜37%、31%〜36%、32%〜39%、32%〜38%、32%〜37%、32%〜36%、33%〜39%、33%〜38%、33%〜37%、33%〜36%、34%〜39%、34%〜38%、34%〜37%、34%〜36%、35%〜40%、5%〜35%、10%〜35%、15%〜35%、20%〜35%、21%〜35%、22%〜35%、23%〜35%、24%〜35%、25%〜35%、26%〜35%、27%〜35%、28%〜35%、29%〜35%、30%〜35%、31%〜35%、32%〜35%、33%〜35%、34%〜35%、30%〜34%、31%〜34%、32%〜34%、33%〜34%、30%〜33%、31%〜33%、32%〜33%、30%〜32%、31%〜32%、25%〜34%、25%〜33%、25%〜32%、25%〜31%、26%〜34%、26%〜33%、26%〜32%、26%〜31%、27%〜34%、27%〜33%、27%〜32%、27%〜31%、28%〜34%、28%〜33%、28%〜32%、28%〜31%、29%〜34%、29%〜33%、29%〜32%、29%〜31%、5%〜30%、10%〜30%、15%〜30%、20%〜34%、20%〜33%、20%〜32%、20%〜31%、20%〜30%、21%〜30%、22%〜30%、23%〜30%、24%〜30%、25%〜30%、25%〜29%、25%〜28%、25%〜27%、25%〜26%、26%〜30%、26%〜29%、26%〜28%、26%〜27%、27%〜30%、27%〜29%、27%〜28%、28%〜30%、28%〜29%、29%〜30%、5%〜25%、10%〜25%、15%〜25%、20%〜29%、20%〜28%、20%〜27%、20%〜26%、20%〜25%、5%〜20%、10%〜20%、15%〜20%、5%〜15%、10%〜15%、または5%〜10%）が、修飾ヌクレオチドを含む。これらの態様の一局面では、siRNAの一方または両方の鎖の二本鎖領域中のウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドの約1%〜約50%は、選択的に（例えば唯一）修飾されている。これらの態様の別の局面では、siRNAの二本鎖領域中の約1%〜約50%のヌクレオチドが、2'0Meヌクレオチドを含み、ここで、siRNAはsiRNAの両方の鎖に2'0Meヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは少なくとも1個の2'OMe-グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも1個の2'OMe-ウリジンヌクレオチドを含み、ここで、2'OMe-グアノシンヌクレオチドおよび2'OMe-ウリジンヌクレオチドだけが、二本鎖領域中に存在する2'0Meヌクレオチドである。これらの態様のさらに別の局面では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%が2'0Meヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは修飾siRNAの両方の鎖に2'0Meヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは二本鎖領域中に2'OMe-シトシンヌクレオチドを含まない。これらの態様のさらなる局面では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%が2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、siRNAはsiRNAの両方の鎖に2'OMeヌクレオチドを含み、siRNAは少なくとも1個の2'OMe-グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも1個の2'OMe-ウリジンヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは二本鎖領域中に2'OMe-シトシンヌクレオチドを含まない。これらの態様の別の局面では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%が2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、siRNAは修飾siRNAの両方の鎖に2'OMeヌクレオチドを含み、ここでsiRNAは、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される2'OMeヌクレオチドを含み、ここで、二本鎖領域中の2'OMeヌクレオチドは、互いに隣接しない。
ある態様では、本発明の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）のsiRNA構成要素は、国際公開公報第2004/078941号に記載されているような、DNAセンス鎖およびRNAアンチセンス鎖から成る二本鎖領域（例えばDNA-RNAハイブリッド）を含む非対称siRNA二重鎖であって、siRNA二重鎖上にブロッキング剤が位置する非対称siRNA二重鎖を含む。いくつかの場合には、非対称siRNA二重鎖は、本明細書記載のように化学的に修飾することができる。非対称siRNA二重鎖の他の非限定的な例は、国際公開公報第2006/074108号に記載されており、それは、1、2、3個、またはそれ以上の同一のまたは異なる標的mRNA配列に相補的な配列を有する領域（例えば多価siRNA）と、一つまたは複数の自己相補的領域とを含む自己保護性オリゴヌクレオチドを開示している。非対称siRNA二重鎖のさらに他の非限定的な例は、国際公開公報第2009/076321号に記載されており、それは、1、2、3個、またはそれ以上の同一のまたは異なる標的mRNA配列の領域に相補的なポリヌクレオチド配列を含むターゲティング領域（例えば多価siRNA）；第1自己相補的領域；および第2自己相補的領域を含む自己形成性非対称前駆ポリヌクレオチドを開示しており、ここで、第1および第2自己相補的領域は、ターゲティング領域の両端の一方に位置し、両方の自己相補的領域は、ステム-ループ構造を形成し、ここで、第1自己相補的領域は、クラスIV DICERエンドリボヌクレアーゼではないRNase IIIエンドリボヌクレアーゼによって切断されることができ、ここで、両方の自己相補的領域は、標的遺伝子配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むが、ここで、ターゲティング領域中に存在する標的配列の一部は、どちらの自己相補的領域にも相補的配列を有さない。上記特許文書のそれぞれの開示は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
siRNAに導入できる修飾の追加的な範囲、パーセンテージ、およびパターンは、米国特許出願公開第20070135372号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
（1）siRNA配列の選択
適切なsiRNA配列は、当技術分野で公知の任意の手段を用いて同定することができる。典型的には、Elbashir et al., Nature, 411:494-498 (2001)およびElbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001)に記載された方法が、Reynolds et al., Nature Biotech., 22(3):326-330 (2004)に示された合理的設計基準と組み合わされる。
非限定的な例として、関心対象の標的遺伝子からの転写物のAUG開始コドンの3'側のヌクレオチド配列をジヌクレオチド配列（例えばAA、NA、CC、GG、またはUU、ここでN=C、G、またはU）について詳しく調べることができる（例えばElbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001)を参照）。ジヌクレオチド配列の3'側に隣接するヌクレオチドが、潜在的siRNA配列（すなわち標的配列またはセンス鎖配列）として同定される。典型的には、ジヌクレオチド配列の3'側に隣接する19、21、23、25、27、29、31、33、35個、またはそれ以上のヌクレオチドが、潜在的siRNA配列として同定される。いくつかの態様では、ジヌクレオチド配列はAAまたはNA配列であり、AAまたはNAジヌクレオチドの3'側に隣接する19個のヌクレオチドが潜在的siRNA配列として同定される。siRNA配列は、通常は、標的遺伝子の全長に沿った異なる位置に間隔を置いて配置されている。siRNA配列のサイレンシング効率をさらに高めるために、潜在的siRNA配列を分析して、例えば標的細胞または生物における他のコード配列と相同な領域を含有しない部位を同定することができる。例えば、約21塩基対の適切なsiRNA配列は、典型的には、標的細胞または生物におけるコード配列に対して相同性を有する16〜17個超の連続塩基対を有さない。siRNA配列をRNA Pol IIIプロモーターから発現させる場合、4個を超える連続するAまたはTが欠如したsiRNA配列が選択される。
潜在的siRNA配列が同定されたら、相補的配列（すなわち、アンチセンス鎖配列）を設計することができる。潜在的siRNA配列はまた、当技術分野で公知の様々な基準を用いて分析することができる。例えば、それらのサイレンシング効率を高めるために、合理的設計アルゴリズムによりsiRNA配列を分析して、一つまたは複数の以下の特徴を有する配列を同定することができる：（1）約25%〜約60% G/CのG/C含量；（2）センス鎖の15〜19位に少なくとも3個のA/U；（3）内部繰り返し配列なし；（4）センス鎖の19位にA；（5）センス鎖の3位にA；（6）センス鎖の10位にU；（7）センス鎖の19位にG/Cなし；および（8）センス鎖の13位にGなし。これら各特徴の適切な値を割り当て、siRNAの選択に有用なアルゴリズムを組み込んでいるsiRNA設計ツールは、例えば、http://ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.htmlに見出すことができる。当業者は、一つまたは複数の前述の特性を有する配列を、潜在的siRNA配列としてさらなる分析および検査のために選択することができることを認識しているであろう。
追加的に、以下の基準の一つまたは複数を満たす潜在的siRNA配列は、多くの場合にsiRNAとしては排除することができる：（1）連続する4個またはそれ以上の同一塩基ストレッチを含む配列；（2）Gのホモポリマーを含む配列（すなわち、これらのポリマーの構造的特性による、潜在的な非特異的効果を低減するため）；（3）3塩基モチーフ（例えば、GGG、CCC、AAA、またはTTT）を含む配列；（4）連続する7個またはそれ以上のG/Cストレッチを含む配列；および（5）内部折り返し構造を生じる、候補内に4個またはそれ以上の塩基の直列リピートを含む配列。しかし、当業者は、さらなる分析および検査のために、前述の特徴の一つまたは複数を有する配列もなお潜在的siRNA配列として選択できることを認識しているであろう。
いくつかの態様では、潜在的siRNA配列は、さらに、例えばKhvorova et al., Cell, 115:209-216 (2003)；およびSchwarz et al., Cell, 115:199-208 (2003)に記載されているように、siRNA二重鎖の非対称性に基づき分析することができる。他の態様では、潜在的siRNA配列は、さらに、例えばLuo et al., Biophys. Res. Commun., 318:303-310 (2004)に記載されているように、標的部位での二次構造に基づき分析することができる。例えば、Mfoldアルゴリズム（http://mfold.burnet.edu.au/rna_formから入手可能）を使用して標的部位での二次構造をモデル化することで、塩基対およびステム-ループの形態の二次構造の存在量がより少ない標的部位でのアクセス可能性に有利なsiRNA配列を選択することができる。
潜在的siRNA配列が同定されたら、例えばインビトロサイトカインアッセイまたはインビボ動物モデルを使用して、何らかの免疫刺激特性の存在について配列を分析することができる。GUに富むモチーフ（例えば、5'-GU-3'、5'-UGU-3'、5'-GUGU-3'、5'-UGUGU-3'等）などの、siRNA配列のセンスおよび/またはアンチセンス鎖のモチーフもまた、配列が免疫刺激性でありうるかどうかの指標を提供することができる。いったんsiRNA分子が免疫刺激性であると見い出されたならば、本明細書に記載するようにそれを修飾してその免疫刺激特性を低下させることができる。非限定的な例として、哺乳動物レスポンダー細胞が検出可能な免疫反応を生成するような条件下でsiRNA配列と該細胞とを接触させて、siRNAが免疫刺激性siRNAであるか、非免疫刺激性siRNAであるかを判定することができる。哺乳動物レスポンダー細胞は、天然の哺乳動物（すなわち以前にsiRNA配列の遺伝子産物と接触したことがない哺乳動物）由来でありうる。哺乳動物レスポンダー細胞は、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）、マクロファージなどであってもよい。検出可能な免疫反応は、例えばTNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-12、またはそれらの組み合わせなどのサイトカインまたは成長因子の生成を含みうる。次に、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の少なくとも1個のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドと置換することにより、免疫刺激性であると同定されたsiRNAを修飾してその免疫刺激特性を低下させることができる。例えば、siRNA二重鎖の二本鎖領域中のヌクレオチドの約30%未満（例えば、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満）を、2'OMeヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドと置換することができる。次に、上記のように修飾siRNAを哺乳動物レスポンダー細胞と接触させて、その免疫刺激特性が低減したことまたは抑制されたことを確認することができる。
免疫反応を検出するのに適したインビトロアッセイには、非限定的に、Davidらの二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ技法（米国特許第4,376,110号）；モノクローナル-ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Wide et al., Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E and S Livingstone, Edinburgh (1970)）；Gordonらの「ウエスタンブロット」法（米国特許第4,452,901号）；標識リガンドの免疫沈降（Brown et al., J. Biol Chem., 255:4980-4983 (1980)）；例えばRaines et al., J. Biol Chem., 257:5154-5160 (1982)により記載されたような酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；蛍光色素の使用を含めた免疫細胞化学技法（Brooks et al., Clin. Exp. Immunol., 39.477 (1980)）；および活性の中和（Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2396-2400 (1984)）が含まれる。上記イムノアッセイに加えて、米国特許第3,817,827号；同第3,850,752号；同第3,901,654号；同第3,935,074号；同第3,984,533号；同第3,996,345号；同第4,034,074号；および同第4,098,876号に記載されたものを含めた、いくつかの他のイムノアッセイを利用することができる。これらの参考文献の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
免疫反応を検出するためのインビボモデルの非限定的な例には、例えば、Judge et al., Mol. Ther., 13:494-505 (2006)に記載されたようなインビボマウスサイトカイン誘導アッセイが含まれる。ある態様では、アッセイは、以下のように行うことができる：（1）siRNAを、外側尾静脈への標準的な静脈内注射により投与し、（2）血液を、投与の約6時間後に心臓穿刺により採取し、サイトカイン分析用に血漿として処理して；（3）サイトカインを、製造業者の説明書に従ってサンドイッチELISAキットを使用して定量することができる（例えば、マウスおよびヒトIFN-α（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）：ヒトIL-6およびTNF-α（eBioscience, San Diego, CA）；ならびにマウスIL-6、TNF-α、およびIFN-γ（BD Biosciences； San Diego, CA)）。
サイトカインおよび成長因子と特異的に結合するモノクローナル抗体は、複数の販売元から市販されているし、当技術分野で公知の方法を用いて産生することができる（例えばKohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975)およびHarlow and Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1999)を参照）。モノクローナル抗体の産生は、以前に記載されており、当技術分野で公知の任意の手段により達成することができる（Buhring et al., Hybridoma, Vol.10, No.1, pp.77-78 (1991)）。いくつかの方法では、モノクローナル抗体は、検出を容易にするために（例えば分光学的、光化学的、生化学的、電気的、光学的、または化学的手段により検出可能な任意の組成物で）標識される。
（2）siRNA分子の産生
siRNAは、例えば一つまたは複数の単離された低分子干渉RNA（siRNA）二重鎖として、より長鎖の二本鎖RNA（dsRNA）として、またはDNAプラスミド中の転写カセットから転写されたsiRNAもしくはdsRNAとしてなどのいくつかの形態で提供することができる。いくつかの態様では、siRNAは、酵素的にまたは部分的/全有機合成により生成することができ、修飾リボヌクレオチドは、インビトロ酵素合成または有機合成により導入することができる。場合によっては、各鎖は化学的に調製される。RNA分子の合成方法は、当技術分野において公知であり、例えばVerma and Eckstein (1998）に記載されたような化学合成法または本明細書記載の合成法である。
長鎖前駆RNAを提供するためにRNA群を使用してもよく、選択された標的配列に実質的もしくは完全な同一性を有する長鎖前駆RNAを使用してsiRNAを製造してもよい。当業者に周知の方法に従って、RNAを細胞もしくは組織から単離、合成、および/またはクローニングすることができる。RNAは、混合群（細胞または組織から得られた、cDNAから転写された、サブトラクションされた、選択された等）であってもよく、単一の標的配列を表してもよい。RNAは、天然（例えば、組織または細胞試料から単離された）であってもよく、（例えば、T7またはSP6ポリメラーゼおよびPCR産物またはクローニングされたcDNAを使用して）インビトロ合成または化学合成されてもよい。
合成RNAに関して、長鎖dsRNAを形成させるために、相補体もまたインビトロで転写され、ハイブリダイズされて、dsRNAが形成される。天然RNA群を使用する場合、例えば、RNA群に対応するcDNAを転写させることによって、またはRNAポリメラーゼを使用することによって、RNA相補体もまた提供される（例えば大腸菌由来RNAse IIIまたはダイサーによる消化のためのdsRNAが形成される）。次に、前駆RNAをハイブリダイズさせて、消化するための二本鎖RNAを形成させる。dsRNAは、対象に直接投与してもよく、投与前にインビトロ消化させてもよい。
RNAの単離、RNAの合成、核酸のハイブリダイズ、cDNAライブラリーの作製およびスクリーニング、ならびにPCRの実施のための方法は、当技術分野で周知であり（例えば、Gubler and Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); Sambrook et al., 上記; Ausubel et al.、上記参照）、PCR法も同様である（米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)を参照）。発現ライブラリーもまた当業者に周知である。本発明に有用な一般法を開示している追加的な基礎テキストには、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994）が含まれる。これらの参考文献の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
好ましくは、siRNAは化学合成される。本発明のsiRNA分子を含むオリゴヌクレオチドは、Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987); Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995)；およびWincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997)に記載されたものなどの、当技術分野で公知の任意の様々な技法を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドの合成は、5'末端のジメトキシトリチルおよび3'末端のホスホルアミダイトなどの通常の核酸保護基およびカップリング基を利用する。非限定的な例として、Applied Biosystemsの合成装置で0.2μmol規模のプロトコールを使用して小規模合成を行うことができる。または、0.2μmol規模の合成は、Protogene（Palo Alto, CA）からの96ウェルプレート合成装置で行うことができる。しかし、大規模または小規模合成もまた、本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチドの合成に適した試薬、RNAの脱保護法、およびRNAの精製法は、当業者に公知である。
siRNA分子はまた、タンデム合成技法により合成することができ、タンデム合成技法では、両方の鎖は、切断可能なリンカーで隔離された、単一の連続するオリゴヌクレオチド断片または鎖として合成され、続いてそのリンカーが切断されて別々の断片または鎖を提供し、それらがハイブリダイズしてsiRNA二重鎖を形成する。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーでありうる。siRNAのタンデム合成は、マルチウェル/マルチプレート合成プラットフォーム、およびバッチリアクター、合成カラム等を用いる大規模合成プラットフォームの両方に容易に適応させることができる。または、siRNA分子は、一方のオリゴヌクレオチドがsiRNAのセンス鎖を含み、もう一方がsiRNAのアンチセンス鎖を含む、二つの異なるオリゴヌクレオチドから集合させることができる。例えば、各鎖を別々に合成して、合成および/または脱保護の後にハイブリダイゼーションまたはライゲーションにより一緒にすることができる。ある他の場合には、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域がハイブリダイズして、ヘアピン型二次構造を有するsiRNA二重鎖を形成する、単一の連続オリゴヌクレオチド断片としてsiRNA分子を合成することができる。
（3）siRNA配列の修飾
ある局面では、siRNA分子は、2本の鎖と、二本鎖領域に少なくとも一つの修飾ヌクレオチドとを有する二重鎖を含み、ここで、各鎖は、約15〜約60ヌクレオチド長である。有利なことに、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列よりも免疫刺激性が低いが、標的配列の発現をサイレンシングする能力を保持する。好ましい態様では、siRNAに導入される化学的修飾の程度は、siRNAの免疫刺激特性の低減または抑制とRNAi活性の保持の間の均衡をとる。非限定的な例として、関心対象の遺伝子を標的とするsiRNA分子は、siRNAにより発生する免疫反応を排除する一方で標的遺伝子の発現をサイレンシングする能力を保持するように、siRNA二重鎖内の選択的なウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドで最低限に修飾することができる（例えば、約30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の修飾）。
本発明に使用するのに適した修飾ヌクレオチドの例には、非限定的に、2'-O-メチル(2'OMe)、2'-デオキシ-2'-フルオロ(2'F)、2'-デオキシ、5-C-メチル、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）、4'-チオ、2'-アミノ、または2'-C-アリル基を有するリボヌクレオチドが含まれる。例えば、Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag Ed. (1984)に記載されたもののような、ノーザンコンフォメーションを有する修飾ヌクレオチドもまた、siRNA分子への使用に適する。そのような修飾ヌクレオチドには、非限定的に、ロックド核酸(LNA)ヌクレオチド（例えば、2'-O、4'-C-メチレン-(D-リボフラノシル)ヌクレオチド）、2'-O-(2-メトキシエチル)(MOE)ヌクレオチド、2'-メチル-チオ-エチルヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ(2'F)ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-クロロ（2'Cl)ヌクレオチド、および2'-アジドヌクレオチドが含まれる。場合によっては、本明細書に記載されるsiRNA分子には、一つまたは複数のG-クランプヌクレオチドが含まれる。G-クランプヌクレオチドは、修飾シトシンアナログを指し、ここで、該修飾は、二重鎖内の相補的グアニンヌクレオチドのWatson-Crick面とHoogsteen面の両方に水素結合する能力を付与する（例えば、Lin et al., J. Am. Chem. Soc, 120:8531-8532 (1998)を参照）。加えて、例えばC-フェニル、C-ナフチル、他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに3-ニトロピロール、4-ニトロインドール、5-ニトロインドール、および6-ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体などの、ヌクレオチド塩基アナログを有するヌクレオチド（例えば、Loakes, Nucl. Acids Res., 29:2437-2447 (2001)を参照）をsiRNA分子に組み込むことができる。
ある態様では、siRNA分子は、さらに末端キャップ部分、リン酸主鎖修飾等の一つまたは複数の化学的修飾を含みうる。末端キャップ部分の例には、非限定的に、逆位デオキシ脱塩基残基、グリセリル修飾、4',5'-メチレンヌクレオチド、1-(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4'-チオヌクレオチド、環状炭素ヌクレオチド、1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L-ヌクレオチド、α-ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ-ペントフラノシルヌクレオチド、非環式3',4'-セコヌクレオチド、非環式3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、3'-3'-逆位ヌクレオチド部分、3'-3'-逆位脱塩基部分、3'-2'-逆位ヌクレオチド部分、3'-2'-逆位脱塩基部分、5'-5'-逆位ヌクレオチド部分、5'-5'-逆位脱塩基部分、3'-5'-逆位デオキシ脱塩基部分、5'-アミノ-アルキルホスフェート、1,3-ジアミノ-2-プロピルホスフェート、3-アミノプロピルホスフェート、6-アミノヘキシルホスフェート、1,2-アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、1,4-ブタンジオールホスフェート、3'-ホスホロアミデート、5'-ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、3'-リン酸、5'-アミノ、3'-ホスホロチオエート、5'-ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および架橋または非架橋メチルホスホネートまたは5'-メルカプト部分（例えば、米国特許第5,998,203号、Beaucage et al., Tetrahedron 49:1925 (1993)を参照）が含まれる。ホスフェート主鎖修飾（すなわち修飾ヌクレオチド間結合を生じる）の非限定的な例には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、およびアルキルシリル置換基が含まれる（例えば、Hunziker et al., Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties、出典：Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995); Mesmaeker et al., Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides、出典：Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994)を参照）。そのような化学的修飾は、siRNAのセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の5'末端および/または3'末端に起こりうる。これらの参照の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
いくつかの態様では、siRNA分子のセンスおよび/またはアンチセンス鎖は、さらに、約1〜約4個（例えば、1、2、3、または4個）の2'-デオキシリボヌクレオチド、修飾（例えば2'OMe）および/もしくは未修飾ウリジンヌクレオチド、ならびに/または修飾（例えば2'OMe）および未修飾ヌクレオチドの任意の他の組み合わせを有する3'末端オーバーハングを含みうる。
siRNA分子に導入できる修飾ヌクレオチドおよび化学的修飾の種類の追加的な例は、例えば、英国特許第GB2,397,818 B号および米国特許出願公開第20040192626号、同第20050282188号、および同第20070135372号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
本明細書に記載されるsiRNA分子は、場合により、siRNAの一方または両方の鎖に一つまたは複数の非ヌクレオチドを含んでもよい。本明細書で使用される「非ヌクレオチド」という用語は、糖および/またはリン酸置換などのように、一つまたは複数のヌクレオチドユニットの代わりに核酸鎖に組み込むことができる任意の基または化合物であって、残りの塩基がそれ自体の活性を示すことが可能な、基または化合物を指す。該基または化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミンなどの一般に認められたヌクレオチド塩基を含有しないことから脱塩基性であり、したがって、1'位の塩基を欠如する。
他の態様では、siRNAの化学的修飾は、siRNA分子にコンジュゲートを結合させることを含む。例えば生分解性リンカーなどの共有結合を介して、siRNAのセンスおよび/またはアンチセンス鎖の5'および/または3'末端にコンジュゲートを結合させることができる。例えば、カルバメート基または他の連結基により、siRNAにコンジュゲートを結合させることもできる（例えば、米国特許出願公開第20050074771号、同第20050043219号、および同第20050158727号を参照）。場合によっては、コンジュゲートは、siRNAの細胞への送達を容易にする分子である。siRNAとの結合に適したコンジュゲート分子の例には、非限定的に、コレステロールなどのステロイド、ポリエチレングリコール(PEG)などのグリコール、ヒト血清アルブミン（HSA)、脂肪酸、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、葉酸類（例えば、葉酸、葉酸アナログおよびその誘導体)、糖（例えばガラクトース、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、グルコース、マンノース、フルクトース、フコース等）、リン脂質、ペプチド、細胞の取込みを仲介することができる細胞性受容体のリガンド、およびそれらの組み合わせが含まれる（例えば、米国特許出願公開第20030130186号、同第20040110296号、および同第20040249178号、米国特許第6,753,423号を参照）。他の例には、米国特許出願公開第20050119470号および同第20050107325号に記載された親油性部分、ビタミン、ポリマー、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子、オリゴ糖、炭水化物クラスター、インターカレーター、副溝結合剤、切断剤、および架橋剤コンジュゲート分子が含まれる。さらに他の例には、米国特許出願公開第20050153337号に記載された2'-O-アルキルアミン、2'-O-アルコキシアルキルアミン、ポリアミン、C5-陽イオン性修飾ピリミジン、陽イオン性ペプチド、グアニジウム基、アミジニウム基、陽イオン性アミノ酸コンジュゲート分子が含まれる。追加的な例には、米国特許出願公開第20040167090号に記載された疎水性基、膜活性化合物、細胞透過性化合物、細胞ターゲティングシグナル、相互作用修飾因子、および立体安定剤コンジュゲート分子が含まれる。さらなる例には、米国特許出願公開第20050239739号に記載されたコンジュゲート分子が含まれる。RNAi活性を保持しながらのsiRNAの薬物動態プロファイル、バイオアベイラビリティー、および/または安定性の改善に関して、使用されるコンジュゲートの種類およびsiRNA分子への結合の程度を評価することができる。このように、当業者は、様々な周知のインビトロ細胞培養物またはインビボ動物モデルのいずれかを用いて様々なコンジュゲートが結合したsiRNA分子をスクリーニングして、改善された性質および完全なRNAi活性を有するsiRNA分子を同定することができる。上記特許文書の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
（4）標的遺伝子
関心対象の遺伝子の翻訳（すなわち発現）を下方制御またはサイレンシングするために、本発明の核酸-脂質粒子（例えばSNALP）のsiRNA構成要素を使用することができる。以前に指摘されたように、本明細書開示の少なくとも一つのsiRNAを含有する本発明の核酸-脂質粒子（例えばSNALP製剤）が腫瘍細胞中の関心対象の遺伝子を標的とする場合に、以前に記載された他の核酸-脂質粒子組成物に比べて強度の増大（すなわちサイレンシングの増大）および/または耐容性の増大（例えば毒性の低下）を示すことが、予想外に見出された。好ましい態様では、siRNAは、細胞増殖、腫瘍形成、および/または細胞形質転換（例えば癌などの細胞増殖性障害）に関連する遺伝子の発現をサイレンシングする。他の関心対象の遺伝子には、非限定的に、血管新生遺伝子、受容体リガンド遺伝子、免疫調節因子遺伝子（例えば炎症反応および自己免疫反応に関連するもの）、代謝性疾患および障害に関連する遺伝子（例えば肝疾患および肝障害）、ウイルス感染および生存に関連する遺伝子、ならびに神経変性障害に関連する遺伝子が含まれる。
腫瘍形成または細胞形質転換（例えば癌または他の腫瘍）に関連する遺伝子には、例えばp53ユビキチン化、c-Junユビキチン化、ヒストンの脱アセチル化、細胞周期の調節、転写調節、およびその組み合わせに関与する遺伝子が含まれる。腫瘍形成または細胞形質転換に関連する遺伝子配列の非限定的な例には、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）（Genbankアクセッション番号NM_005030; Barr et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5:429-440 (2004)）およびサイクリン依存性キナーゼ4（CDK4）（Genbankアクセッション番号NM_000075）などのセリン/トレオニンキナーゼ；COP1（RFWD2；Genbankアクセッション番号NM_022457およびNM_001001740）およびring-box 1（RBX1）（ROC1；Genbankアクセッション番号NM_014248）などのユビキチンリガーゼ；WEE1（Genbankアクセッション番号NM_003390およびNM_001143976）などのチロシンキナーゼ；Eg5（KSP、KIF11；Genbankアクセッション番号NM_004523）などの有糸分裂キネシン；フォークヘッドボックスM1（FOXM1）（Genbankアクセッション番号NM_202002、NM_021953、およびNM_202003）およびRAM2（R1またはCDCA7L；Genbankアクセッション番号NM_018719、NM_001127370、およびNM_001127371）などの転写因子；XIAP（Genbankアクセッション番号NM_001167）などのアポトーシス阻害因子；CSN1、CSN2、CSN3、CSN4、CSN5（JAB1； Genbankアクセッション番号NM_006837）；CSN6、CSN7A、CSN7B、およびCSN8などのCOP9シグナロソームサブユニット；ならびにHDAC1、HDAC2（Genbankアクセッション番号NM_001527）、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9等のようなヒストンデアセチラーゼが含まれる。
PLK-1遺伝子を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、本明細書および、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる米国特許出願公開第20050107316号および同第20070265438号、ならびに国際公開公報第09/082817号に記載されたsiRNA分子が含まれる。Eg5およびXIAP遺伝子を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる米国特許出願公開第20090149403号に記載されたsiRNA分子が含まれる。CSN5遺伝子を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる国際公開公報第09/129319号に記載されたsiRNA分子が含まれる。COP1、CSN5、RBX1、HDAC2、CDK4、WEE1、FOXM1、およびRAM2遺伝子を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、2009年9月23日に出願された米国仮特許出願第61/245,143号に記載されたsiRNA分子が含まれる。
腫瘍形成または細胞形質転換に関連する遺伝子配列の追加的な例には、MLL融合遺伝子、BCR-ABL（Wilda et al., Oncogene, 21 :5716 (2002); Scherr et al., Blood, 101 :1566 (2003)）、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、BCL-2、AML1-ETO、およびAML1-MTG8などの転座配列（Heidenreich et al., Blood, 101:3157 (2003)）；多剤耐性遺伝子（Nieth et al., FEBS Lett., 545:144 (2003); Wu et al., Cancer Res. 63:1515 (2003)）、サイクリン（Li et al., Cancer Res., 63:3593 (2003); Zou et al., Genes Dev., 16:2923 (2002)）、β-カテニン（Verma et al., Clin Cancer Res., 9:1291 (2003)）、テロメラーゼ遺伝子（Kosciolek et al., Mol Cancer Ther., 2:209 (2003)）、c-MYC、N-MYC、BCL-2、成長因子受容体（例えばEGFR/ErbB1（Genbankアクセッション番号NM_005228、NM_201282、NM_201283、およびNM_201284；Nagy et al Exp. Cell Res., 285:39-49 (2003)も参照されたい）、ErbB2/HER-2（Genbankアクセッション番号NM_004448およびNM_001005862）、ErbB3（Genbankアクセッション番号NM_001982およびNM_001005915）、およびErbB4（Genbankアクセッション番号NM_005235およびNM_001042599)）などの過剰発現された配列、ならびにRAS（Tuschl and Borkhardt, Mol. Interventions, 2:158 (2002)）などの突然変異した配列が含まれる。EGFR遺伝子を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、米国特許出願公開第20090149403号に記載されたsiRNA分子が含まれる。VEGFR遺伝子を標的とするsiRNA分子は、例えばGB 2396864；米国特許出願公開第20040142895号；およびCA 2456444に示され、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
DNA修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法剤の投与との併用において有用である（Collis et al., Cancer Res , 63:1550 (2003)）。腫瘍転移に関連するタンパク質をコードする遺伝子はまた、関心対象の標的配列、例えばインテグリン、セレクチン、およびメタロプロテイナーゼである。前述の例は、排他的ではない。当業者は、腫瘍形成もしくは細胞形質転換、腫瘍の増殖、または腫瘍転移を助長または促進する任意の全体的または部分的な遺伝子配列が、テンプレート配列として含まれうることを理解しているであろう。
血管新生遺伝子は、新しい血管の形成を促進することができる。特に関心対象の血管新生遺伝子には、非限定的に、血管内皮成長因子（VEGF）（Reich et al., Mol. Vis., 9:210 (2003)）、胎盤成長因子（PGF）、VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）等が含まれる。VEGFR遺伝子を標的とするsiRNA分子は、例えばGB 2396864；米国特許出願公開第20040142895号；およびCA 2456444に示され、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
免疫調節因子遺伝子は、一つまたは複数の免疫反応を調節する遺伝子である。免疫調節因子遺伝子の例には、非限定的に、成長因子（例えば、TGF-α、TGF-β、EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、CGF、GM-CSF、SCF等）、インターロイキン（例えば、IL-2、IL-4、IL-12（Hill et al., J. Immunol, 171:691 (2003)）、IL-15、IL-18、IL-20等）、インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γ等）およびTNFが含まれる。FasおよびFasリガンド遺伝子もまた、関心対象の免疫調節因子標的配列である（Song et al., Nat. Med., 9:347 (2003)）。造血細胞およびリンパ細胞における二次シグナル伝達分子、例えば、Bruton型チロシンキナーゼ（Btk）などのTecファミリーキナーゼをコードする遺伝子もまた、本発明に含まれる（Heinonen et al., FEBS Lett., 527:274 (2002)）。
細胞受容体リガンド遺伝子には、細胞表面受容体（例えば、サイトカイン受容体、成長因子受容体、チロシンキナーゼ活性を有する受容体、Gタンパク質共役受容体、インスリン受容体、EPO受容体等）に結合して、受容体が関与する生理学的経路（例えば細胞増殖、腫瘍形成、細胞形質転換、有糸分裂誘発等）を調整（例えば阻害）することのできるリガンドが含まれる。細胞受容体リガンド遺伝子の非限定的な例には、サイトカイン（例えばTNF-α、IFN-α、IFN-β、およびIFN-γなどのインターフェロン、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27などのインターロイキン、ケモカイン等）、成長因子（例えばEGF、HB-EGF、VEGF、PEDF、SDGF、bFGF、HGF、TGF-α、TGF-β、BMP1〜BMP15、PDGF、IGF、NGF、β-NGF、BDNF、NT3、NT4、GDF-9、CGF、G-CSF、GM-CSF、GDF-8、EPO、TPO等）、インスリン、グルカゴン、Gタンパク質共役受容体リガンド等が含まれる。
ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子には、結合、進入、および細胞内での複製のために宿主（例えば組織因子（TF）などの宿主因子）またはウイルスによって発現されるものが含まれる。特に関心対象なのは、慢性ウイルス疾患に関連するウイルス配列である。特に関心対象のウイルス配列には、エボラ（Ebola）ウイルスおよびマールブルグ（Marburg）ウイルスなどのフィロウイルス（Filoviruses）（例えばGeisbert et al., J. Infect. Dis., 193:1650-1657 (2006)を参照）；ラッサ（Lassa）ウイルス、フニン（Junin）ウイルス、マチュポ（Machupo）ウイルス、グアナリト（Guanarito）ウイルス、およびサビア（Sabia）ウイルスなどのアレナウイルス（Arenaviruses）（Buchmeier et al., Arenaviridae: the viruses and their replication、出典：FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, (2001)）；A、B、およびC型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルス（例えばSteinhauer et al., Annu Rev Genet., 36:305-332 (2002)；およびNeumann et at, J Gen Virol, 83:2635-2662 (2002)を参照）；肝炎ウイルス（例えば、Hamasaki et al., FEBS Lett., 543:51 (2003); Yokota et al., EMB0 Rep., 4:602 (2003); Schlomai et al., Hepatology, 37:764 (2003); Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2783 (2003); Kapadia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2014 (2003);およびFIELDS VIROLOGY, Knipe et al.(eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (2001)を参照）；ヒト免疫不全ウイルス（HIV)(Banerjea et al., Mol. Ther., 8:62 (2003); Song et al., J. Virol., 77:7174 (2003); Stephenson, JAMA, 289:1494 (2003); Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:183 (2003)）；ヘルペス（Herpes）ウイルス（Jia et al., J. Virol., 77:3301 (2003)）；およびヒトパピローマ（Human Papilloma）ウイルス（HPV）（Hall et al., J. Virol., 77:6066 (2003); Jiang et al., Oncogene, 21:6041 (2002)）の配列が含まれる。
サイレンシング可能な例示的なフィロウイルス核酸配列には、非限定的に、構造タンパク質（例えば、VP30、VP35、核タンパク質（NP）、ポリメラーゼタンパク質（L-pol)）をコードする核酸配列および膜関連タンパク質（例えば、VP40、糖タンパク質（GP）、VP24）をコードする核酸配列が含まれる。エボラウイルスの完全ゲノム配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_002549；AY769362；NC_006432；NC_004161；AY729654；AY354458；AY142960；AB050936；AF522874；AF499101；AF272001；およびAF086833に示される。エボラウイルスVP24の配列は、例えば、Genbankアクセッション番号U77385およびAY058897に示される。エボラウイルスL-polの配列は、例えば、Genbankアクセッション番号X67110に示される。エボラウイルスVP40の配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY058896に示される。エボラウイルスNPの配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY058895に示される。エボラウイルスGPの配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY058898； Sanchez et al., Virus Res., 29:215-240 (1993); Will et al., J. Virol, 67 1203-1210 (1993); Volchkov et al., FEBS Lett., 305:181-184 (1992)；および米国特許第6,713,069号に示される。追加的なエボラウイルスの配列は、例えば、Genbankアクセッション番号L11365およびX61274に示される。マールブルグウイルスの完全ゲノム配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_001608；AY430365；AY430366；およびAY358025に示される。マールブルグウイルスGPの配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AF005734；AF005733；およびAF005732に示される。マールブルグウイルスVP35の配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AF005731およびAF005730に示される。追加的なマールブルグウイルスの配列は、例えば、Genbankアクセッション番号X64406；Z29337；AF005735；およびZ12132に示される。エボラウイルスおよびマールブルグウイルスの核酸配列を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、米国特許出願公開第20070135370号および2009年12月15日に出願された米国仮特許出願第61/286,741号に記載されたsiRNA分子が含まれる。
サイレンシング可能な例示的なアレナウイルス核酸配列には、非限定的に、核タンパク質（NP）、糖タンパク質（GP）、L-ポリメラーゼ（L）、およびZタンパク質（Z）をコードする核酸配列が含まれる。ラッサウイルスの完全ゲノム配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_004296（LASVセグメントS）およびNC_004297（LASVセグメントL）に示される。ラッサウイルス核酸配列を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、2010年3月31日に出願された米国仮特許出願第61/319,855号に記載されたsiRNA分子が含まれる。
サイレンシング可能な例示的な宿主核酸配列には、非限定的に、出血熱ウイルスの病原性に役割を果たすことが知られている組織因子（TF）などの宿主因子をコードする核酸配列が含まれる。TFのmRNA配列は、Genbankアクセッション番号NM_001993に示される。当業者は、TFがF3、凝固第III因子、トロンボプラスチン、およびCD142としても知られていることを認識しているであろう。TFの核酸配列を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、2010年3月31日に出願された米国仮特許出願第61/319,855号に記載されたsiRNA分子が含まれる。
サイレンシング可能な例示的なインフルエンザウイルス核酸配列には、非限定的に、核タンパク質（NP）、マトリックスタンパク質（M1およびM2）、非構造タンパク質（NS1およびNS2）、RNAポリメラーゼ（PA、PB1、PB2）、ノイラミニダーゼ（NA）、およびヘマグルチニン（HA）をコードする核酸配列が含まれる。A型インフルエンザNPの配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_004522；AY818138；AB166863；AB188817；AB189046；AB189054；AB189062；AY646169；AY646177；AY651486；AY651493；AY651494；AY651495；AY651496；AY651497；AY651498；AY651499；AY651500；AY651501；AY651502；AY651503；AY651504；AY651505；AY651506；AY651507；AY651509；AY651528；AY770996；AY790308；AY818138；およびAY818140に示される。A型インフルエンザPAの配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY818132；AY790280；AY646171；AY818132；AY818133；AY646179；AY818134；AY551934；AY651613；AY651610；AY651620；AY651617；AY651600；AY651611；AY651606；AY651618；AY651608；AY651607；AY651605；AY651609；AY651615；AY651616；AY651640；AY651614；AY651612；AY651621；AY651619；AY770995；およびAY724786に示される。インフルエンザウイルスの核酸配列を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、米国特許出願公開第20070218122号に記載されたsiRNA分子が含まれる。
サイレンシング可能な例示的な肝炎ウイルス核酸配列には、非限定的に、転写および翻訳に関与する核酸配列（例えば、En1、En2、X、P）ならびに構造タンパク質（例えば、Cタンパク質およびC関連タンパク質を含めたコアタンパク質、キャプシドならびにS、M、および/もしくはLタンパク質を含めたエンベロープタンパク質、またはそれらの断片）をコードする核酸配列（例えば、FIELDS VIROLOGY、上記参照）が含まれる。サイレンシング可能な例示的なC型肝炎ウイルス（HCV）の核酸配列には、非限定的に、5'非翻訳領域（5'-UTR）、3'非翻訳領域（3'-UTR）、ポリタンパク質翻訳開始コドン領域、配列内リボソーム進入部位（IRES）配列、ならびに/またはコアタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、p7タンパク質、NS2タンパク質、NS3プロテアーゼ/ヘリカーゼ、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、および/もしくはNS5B RNA依存性RNAポリメラーゼをコードする核酸配列が含まれる。HCVゲノム配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_004102（HCV遺伝子型1a）、AJ238799（HCV遺伝子型1b）、NC_009823（HCV遺伝子型2）、NC_009824（HCV遺伝子型3）、NC_009825（HCV遺伝子型4）、NC_009826（HCV遺伝子型5）、およびNC_009827（HCV遺伝子型6）に示される。A型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001489に示され；B型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_003977に示され；D型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001653に示され；E型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001434に示され；G型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001710に示される。ウイルス感染および生存に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、好都合には、ウイルス状態を治療するために使用される従来剤の投与と併用することができる。肝炎ウイルスの核酸配列を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、米国特許出願公開第20060281175号、同第20050058982号、および同第20070149470号；米国特許第7,348,314号；および代理人整理番号020801-008910PCを有する、2010年3月19日に出願された「Compositions and Methods for Silencing Hepatitis C Virus Expression」という名称のPCT出願PCT/CA2010/000444に記載されたsiRNA分子が含まれる。
代謝性疾患および障害（例えば、肝臓が標的である障害ならびに肝疾患および肝障害）に関連する遺伝子には、非限定的に、例えばアポリポタンパク質B（APOB）（Genbankアクセッション番号NM_000384）、アポリポタンパク質CIII（APOC3）（Genbankアクセッション番号NM_000040およびNG_008949 REGION: 5001..8164）、アポリポタンパク質E（APOE）（Genbankアクセッション番号NM_000041およびNG_007084 領域：5001..8612）、プロタンパク質コンバターゼサブチリシン/ケキシン9型（PCSK9）（Genbankアクセッション番号NM_174936）、ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1型（DGAT1）（Genbankアクセッション番号NM_012079）、ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ2型（DGAT2）（Genbankアクセッション番号NM_032564）、LXRαおよびLXRβなどの肝臓X受容体（Genbackアクセッション番号NM_007121）、ファルネソイドX受容体（FXR）（Genbankアクセッション番号NM_005123）、ステロール調節エレメント結合タンパク質（SREBP）、サイト-1プロテアーゼ（S1P）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイム-Aレダクターゼ（HMGコエンザイム-Aレダクターゼ）などの脂質異常症で発現する遺伝子；ならびに例えばグルコース6-ホスファターゼなどの糖尿病で発現する遺伝子（例えばForman et al., Cell, 81:687 (1995); Seol et al., Mol. Endocrinol., 9:72 (1995)、Zavacki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:7909 (1997); Sakai et al., Cell, 85:1037-1046 (1996); Duncan et al., J. Biol. Chem., 272:12778-12785 (1997); Willy et al., Genes Dev., 9:1033-1045 (1995); Lehmann et al., J. Biol. Chem., 272:3137-3140 (1997); Janowski et al., Nature, 383:728-731 (1996)；およびPeet et al., Cell, 93:693-704 (1998)を参照）が含まれる。
当業者は、代謝性疾患および障害（例えば、肝臓が標的である疾患および障害ならびに肝疾患および肝障害）に関連する遺伝子に、肝臓自体に発現する遺伝子ならびに他の器官および組織に発現する遺伝子が含まれることを認識しているであろう。代謝性疾患および障害に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、好都合に、その疾患または障害を治療するために使用される従来剤の投与と併用することができる。ApoB遺伝子を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、米国特許出願公開第20060134189号、同第20060105976号、および同第20070135372号、ならびに国際公開公報第04/091515号に記載されたsiRNA分子が含まれる。APOC3遺伝子を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、2010年1月26日に出願されたPCT出願PCT/CA2010/000120に記載されたsiRNA分子が含まれる。PCSK9遺伝子を標的とするsiRNA分子の非限定的な例には、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、米国特許出願公開第20070173473号、同第20080113930号、および同第20080306015号に記載されたsiRNA分子が含まれる。DGAT1遺伝子を標的とする例示的なsiRNA分子は、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、米国特許出願公開第20040185559号に記載されたアンチセンス化合物を使用して設計することができる。DGAT2遺伝子を標的とする例示的なsiRNA分子は、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、米国特許出願公開第20050043524号に記載されたアンチセンス化合物を使用して設計することができる。
トリヌクレオチドリピート（例えばCAGリピート）の伸張をコードするテンプレートは、球脊髄性筋萎縮症およびハンチントン病などの、トリヌクレオチドリピートの伸張により起きる神経変性障害での病原性配列のサイレンシングに有用である（Caplen et al., Hum. Mol. Genet., 11:175 (2002)）。
本明細書に記載されたsiRNAは、上記遺伝子のいずれかの発現を治療目的でサイレンシングすることにおけるその有用性に加えて、研究開発応用ならびに診断、予防、予後、臨床、および他の医療応用にも有用である。非限定的な例として、siRNAは、関心対象の遺伝子が治療用標的となる可能性を有するかどうかを検査することに向けた標的検証研究に使用することができる。siRNAはまた、潜在的治療標的としての遺伝子を発見することを目標とする、標的同定研究に使用することができる。
（5）例示的なsiRNAの態様
いくつかの態様では、siRNA分子の各鎖は、約15〜約60ヌクレオチド長（例えば約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、もしくは19〜25ヌクレオチド長、または15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチド長）を含む。特定の一態様では、siRNAは化学合成される。本発明のsiRNA分子は、インビトロおよび/またはインビボで標的配列の発現をサイレンシングすることができる。
他の態様では、siRNAは、少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む。ある態様では、siRNAは、二本鎖領域中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満（例えば約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満）が、修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%（例えば約5%〜50%、10%〜50%、15%〜50%、20%〜50%、25%〜50%、30%〜50%、35%〜50%、40%〜50%、45%〜50%、5%〜45%、10%〜45%、15%〜45%、20%〜45%、25%〜45%、30%〜45%、35%〜45%、40%〜45%、5%〜40%、10%〜40%、15%〜40%、20%〜40%、25%〜40%、30%〜40%、35%〜40%、5%〜35%、10%〜35%、15%〜35%、20%〜35%、25%〜35%、30%〜35%、5%〜30%、10%〜30%、15%〜30%、20%〜30%、25%〜30%、5%〜25%、10%〜25%、15%〜25%、20%〜25%、5%〜20%、10%〜20%、15%〜20%、5%〜15%、10%〜15%、または5%〜10%）が、修飾ヌクレオチドを含む。
さらなる態様では、siRNAは、非限定的に、2'-O-メチル(2'OMe)ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ(2'F)ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)(MOE)ヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、およびそれらの混合物を含めた修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様では、siRNAは、例えば、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、2'OMe-シトシンヌクレオチド、またはそれらの混合物などの2'OMeヌクレオチド（例えば、2'OMeプリンおよび/またはピリミジンヌクレオチド）を含む。特定の一態様では、siRNAは、少なくとも1個の2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、またはそれらの混合物を含む。場合によっては、siRNAは、2'OMe-シトシンヌクレオチドを含まない。他の態様では、siRNAは、ヘアピンループ構造を含む。
ある態様では、siRNAは、siRNA分子の二本鎖領域の一方の鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス）または両方の鎖に修飾ヌクレオチドを含む。好ましくは、ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドは、siRNA二重鎖の二本鎖領域中の選択的位置で修飾されている。ウリジンヌクレオチド修飾に関して、センスおよび/またはアンチセンス鎖中の少なくとも1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上のウリジンヌクレオチドが、2'OMe-ウリジンヌクレオチドなどの修飾ウリジンヌクレオチドでありうる。いくつかの態様では、センスおよび/またはアンチセンス鎖中の各ウリジンヌクレオチドは、2'OMe-ウリジンヌクレオチドである。グアノシンヌクレオチド修飾に関して、センスおよび/またはアンチセンス鎖中の少なくとも1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上のグアノシンヌクレオチドが、2'OMe-グアノシンヌクレオチドなどの修飾グアノシンヌクレオチドでありうる。いくつかの態様では、センスおよび/またはアンチセンス鎖中のあらゆるグアノシンヌクレオチドが、2'OMe-グアノシンヌクレオチドである。
ある態様では、siRNA配列中の少なくとも1、2、3、4、5、6、7個、またはそれ以上の5'-GU-3'モチーフは、例えば、ミスマッチを導入して5'-GU-3'モチーフを除去することにより、および/または2'OMeヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを導入することにより、修飾されうる。5'-GU-3'モチーフは、siRNA配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の中にありうる。5'-GU-3'モチーフは、互いに隣接していてもよく、その代わりに、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、またはそれ以上のヌクレオチドにより分離されていてもよい。
いくつかの態様では、修飾されたsiRNA分子は、対応する未修飾siRNA配列よりも免疫刺激性が低い。そのような態様では、免疫刺激特性が低減した修飾siRNA分子は、有利にも、標的配列に対するRNAi活性を保持する。別の態様では、修飾siRNA分子の免疫刺激特性および標的遺伝子発現をサイレンシングするその能力は、例えばsiRNA二重鎖の二本鎖領域内などのsiRNA配列内の最小かつ選択的な2'OMe修飾の導入により、均衡をとるか、または最適化することができる。場合によっては、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAよりも免疫刺激性が少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%低い。例えば、哺乳動物における全身投与または適切な脂質ベースの送達系（本明細書に開示されたSNALP送達系など）を使用した哺乳動物レスポンダー細胞のトランスフェクションの約2〜約12時間後にINF-αおよび/またはIL-6レベルを測定することにより、修飾siRNA分子および対応する未修飾siRNA分子の免疫刺激特性を決定できることは、当業者に容易に明らかであろう。
他の態様では、修飾siRNA分子は、対応する未修飾siRNAの10倍未満または等しいIC50（すなわち最大半値阻害濃度）を有する（すなわち、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の10倍未満または等しいIC50を有する）。他の態様では、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列の3倍未満または等しいIC50を有する。さらに他の態様では、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAの2倍未満または等しいIC50を有する。用量反応曲線を作成することができ、修飾siRNAおよび対応する未修飾siRNAについてのIC50値が、当業者に公知の方法を使用して容易に決定できることは、当業者に容易に明らかであろう。
別の態様では、未修飾または修飾siRNA分子は、陰性対照（例えば緩衝液のみ、異なる遺伝子を標的とするsiRNA配列、スクランブルsiRNA配列等）に比べて、標的配列の発現を少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%サイレンシングすることができる。
さらに別の態様では、修飾siRNA分子は、対応する未修飾siRNA配列に比べて、標的配列の発現を少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%サイレンシングすることができる。
いくつかの態様では、siRNA分子は、例えば二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖にリン酸主鎖の修飾を含まない。他の態様では、siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖に1、2、3、4個、またはそれ以上のリン酸主鎖の修飾を含む。好ましい態様では、siRNAは、リン酸主鎖の修飾を含まない。
さらなる態様では、siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖に2'-デオキシヌクレオチドを含まない。なおさらなる態様では、siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖に1、2、3、4個、またはそれ以上の2'-デオキシヌクレオチドを含む。好ましい態様では、siRNAは、2'-デオキシヌクレオチドを含まない。
場合によっては、センスおよび/またはアンチセンス鎖中の二本鎖領域の3'末端のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。ある他の場合には、センスおよび/またはアンチセンス鎖中の二本鎖領域の3'末端近傍の（例えば、3'末端から1、2、3、または4個のヌクレオチド内の）ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。
本明細書に記載するsiRNA分子は、二本鎖領域の片側または両側に1、2、3、4個、またはそれ以上のヌクレオチドの3'オーバーハングを有してもよく、二本鎖領域の片側または両側でオーバーハングを欠如していてもよい（すなわち、平滑末端を有する）。ある態様では、センスおよび/またはアンチセンス鎖の3'オーバーハングは独立して、2'OMeヌクレオチドおよび/または本明細書記載もしくは当技術分野において公知の任意の他の修飾ヌクレオチドなどの、1、2、3、4個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。
特定の態様では、siRNAは、核酸-脂質粒子などの担体システムを用いて投与される。好ましい態様では、核酸-脂質粒子は：（a）細胞増殖、腫瘍形成、および/または細胞形質転換に関連する一つまたは複数の遺伝子（例えばPLK-1）を標的とする一つまたは複数のsiRNA分子；（b）一つまたは複数の陽イオン性脂質（例えば、本明細書に示されるような式I〜XVIで示される一つまたは複数の陽イオン性脂質またはその塩）；（c）一つまたは複数の非陽イオン性脂質（例えばDPPC、DSPC、DSPE、および/またはコレステロール）；ならびに（d）粒子の凝集を阻害する一つまたは複数の結合脂質（例えばPEG750-C-DMAなどの、約550ダルトン〜約1000ダルトンの平均分子量を有する一つまたは複数のPEG-脂質コンジュゲート）を含む。
b）ダイサー基質dsRNA
本明細書で使用される「ダイサー基質dsRNA」または「前駆RNAi分子」という用語は、ダイサーによってインビボプロセシングされて、活性siRNAを生成し、該活性がPLK-1などの標的遺伝子のRNA干渉のためにRISC複合体に組み込まれる、任意の前駆分子を含むことが意図される。
一態様では、ダイサー基質dsRNAは、ダイサーによってプロセシングされてsiRNAを生成するために十分な長さを有する。この態様によると、ダイサー基質dsRNAは、（i）約25から約60の間のヌクレオチド長（例えば約25〜60、25〜55、25〜50、25〜45、25〜40、25〜35、または25〜30ヌクレオチド長）、好ましくは約25から約30の間のヌクレオチド長（例えば25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長）である第1オリゴヌクレオチド配列（センス鎖とも呼ばれる）、および（ii）細胞の細胞質で見られる条件などの生物学的条件下で第1配列とアニーリングする第2オリゴヌクレオチド配列（アンチセンス鎖とも呼ばれる）を含む。第2オリゴヌクレオチド配列は、約25から約60の間のヌクレオチド長（例えば約25〜60、25〜55、25〜50、25〜45、25〜40、25〜35、または25〜30ヌクレオチド長）、好ましくは約25から約30の間のヌクレオチド長（例えば25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長）でありうる。加えて、ダイサー基質dsRNAの配列の一方、特にアンチセンス鎖の領域は、標的遺伝子から生成されたRNAのヌクレオチド配列に十分に相補的な配列長であって、RNAi反応をトリガーする、少なくとも約19個のヌクレオチド、例えば、約19〜約60個のヌクレオチド（例えば約19〜60、19〜55、19〜50、19〜45、19〜40、19〜35、19〜30、または19〜25個のヌクレオチド）、好ましくは約19〜約23個のヌクレオチド（例えば19、20、21、22、または23個のヌクレオチド）の配列長を有する。
第二の態様では、ダイサー基質dsRNAは、ダイサーによるそのプロセシングを高めるいくつかの性質を有する。この態様によると、dsRNAは、それがダイサーによってプロセシングされてsiRNAを生成するために十分な長さを有し、以下の性質の少なくとも一つを有する：（i）dsRNAは非対称であり、例えばアンチセンス鎖に3'-オーバーハングを有し；かつ/または（ii）dsRNAは、センス鎖に修飾3'末端を有し、ダイサー結合の配向およびdsRNAから活性siRNAへのプロセシングを指令する。この後者の態様によると、センス鎖は、約22〜約28個のヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は約24〜約30個のヌクレオチドを含む。
一態様では、ダイサー基質dsRNAは、アンチセンス鎖の3'末端にオーバーハングを有する。別の態様では、センス鎖は、ダイサーの結合およびプロセシングのために、センス鎖の3'末端に位置する適切な修飾因子により修飾される。適切な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、非環式ヌクレオチド等などのヌクレオチド、および蛍光分子等などの立体障害分子が含まれる。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、それらは、dsRNA長が変化しないようにdsRNA中のリボヌクレオチドを置換する。別の態様では、ダイサー基質dsRNAは、アンチセンス鎖の3'末端にオーバーハングを有し、センス鎖は、ダイサープロセシングのために修飾される。別の態様では、センス鎖の5'末端はリン酸を有する。別の態様では、アンチセンス鎖の5'末端はリン酸を有する。別の態様では、アンチセンス鎖またはセンス鎖または両方の鎖は、一つまたは複数の2'-O-メチル(2'OMe)修飾ヌクレオチドを有する。別の態様では、アンチセンス鎖は、2'OMe修飾ヌクレオチドを含有する。別の態様では、アンチセンス鎖は、2'OMe修飾ヌクレオチドから構成される3'-オーバーハングを含有する。アンチセンス鎖はまた、追加的な2'OMe修飾ヌクレオチドも含みうる。センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質に見られる条件などの生物学的条件下でアニーリングする。加えて、ダイサー基質dsRNAの配列の一方、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも約19ヌクレオチドの配列長を有し、ここで、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3'末端に隣接する21個のヌクレオチド領域中にあり、PLK-1などの標的遺伝子から生成されるRNAのヌクレオチド配列に十分に相補的である。さらに、この態様によると、ダイサー基質dsRNAはまた、以下の一つまたは複数の追加的な性質を有しうる：（a）アンチセンス鎖は、典型的な21塩基長からの右側シフトを有する（すなわちアンチセンス鎖は、典型的な21塩基長と比べた場合に分子の右側にヌクレオチドを含む）；（b）鎖は完全に相補的でなくてもよく、すなわち鎖は、単純なミスマッチ対形成を含有してもよく；かつ（c）ロックド核酸のような塩基修飾が、センス鎖の5'末端に含まれうる。
第三の態様では、センス鎖は、約25〜約28個のヌクレオチド（例えば25、26、27、または28個のヌクレオチド）を含み、ここで、センス鎖の3'末端の2個のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。センス鎖は、5'末端にリン酸を含有する。アンチセンス鎖は、約26〜約30個のヌクレオチド（例えば26、27、28、29、または30個のヌクレオチド）を含み、1〜4個のヌクレオチドの3'-オーバーハングを含有する。3'-オーバーハングを構成するヌクレオチドは、2'OMe修飾リボヌクレオチドで修飾されている。アンチセンス鎖は、3'-オーバーハングに隣接したアンチセンス鎖の1番目のモノマーから始まり、3'-オーバーハングに隣接する該1番目のモノマーから15〜19個のヌクレオチドまで延びる、一つおきの2'OMe修飾ヌクレオチドを含有する。例えば、27個のヌクレオチドのアンチセンス鎖についてそのアンチセンス鎖の5'末端の1番目の塩基を位置番号1と数えると、2'OMe修飾は、9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、および27番塩基に配置されよう。一態様では、ダイサー基質dsRNAは、以下の構造を有する：
Figure 2012531469
式中、「X」=RNA、「p」=リン酸基、「X」=2'OMe RNA、「Y」は、任意で2'OMe RNAモノマーであり得る1、2、3、または4個のRNAモノマーから構成される、オーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。
第四の態様では、ダイサー基質dsRNAは、ダイサーによるそのプロセシングを高めるいくつかの性質を有する。この態様によると、dsRNAは、ダイサーによってプロセシングされてsiRNAを生じるために十分な長さと、以下の性質の少なくとも一つとを有する：（i）dsRNAは非対称であって、例えばセンス鎖に3'-オーバーハングを有し；（ii）dsRNAは、ダイサー結合の配向およびdsRNAから活性siRNAへのプロセシングを指令するための修飾3'末端をアンチセンス鎖に有する。この態様によると、センス鎖は、約24〜約30個のヌクレオチド（例えば24、25、26、27、28、29、または30個のヌクレオチド）を含み、アンチセンス鎖は、約22〜約28個のヌクレオチド（例えば22、23、24、25、26、27、または28個のヌクレオチド）を含む。一態様では、ダイサー基質dsRNAは、センス鎖の3'末端にオーバーハングを有する。別の態様では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3'末端に位置する適切な修飾因子によってダイサーの結合およびプロセシングのために修飾されている。適切な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、非環式ヌクレオチド等などのヌクレオチド、および蛍光分子等などの立体障害分子が含まれる。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、それらは、dsRNAの長さが変化しないようにdsRNA中のリボヌクレオチドと置き換わる。別の態様では、dsRNAは、センス鎖の3'末端にオーバーハングを有し、アンチセンス鎖はダイサープロセシングのために修飾されている。一態様では、アンチセンス鎖は5'-リン酸を有する。センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質で見られる条件などの生物学的条件下でアニーリングする。加えて、dsRNAの配列の一方、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも19ヌクレオチドの配列長を有し、ここで、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3'末端に隣接し、PLK-1などの標的遺伝子から生成されるRNAのヌクレオチド配列に十分に相補的である。さらに、この態様によると、ダイサー基質dsRNAはまた、以下の追加的な性質の一つまたは複数を有しうる：（a）アンチセンス鎖は、典型的な21塩基長からの左側シフトを有する（すなわちアンチセンス鎖には、典型的な21塩基長と比べた場合に分子の左側にヌクレオチドを含む）；かつ（b）鎖は完全に相補的でなくてもよく、すなわち鎖は、単純なミスマッチ対形成を含有してもよい。
好ましい態様では、ダイサー基質dsRNAは非対称構造を有し、センス鎖は25塩基対長を有し、アンチセンス鎖は2塩基の3'-オーバーハングを有する27塩基対長を有する。場合によっては、非対称構造を有するこのdsRNAは、さらに、センス鎖の3'末端に2個のリボヌクレオチドの代わりに2個のデオキシヌクレオチドを含有する。ある他の場合には、非対称構造を有するこのdsRNAは、さらに、アンチセンス鎖の9、11、13、15、17、19、21、23、および25位に2'OMe修飾を含有する（ここで、アンチセンス鎖の5'末端の1番目の塩基が1位である）。ある追加的な場合には、非対称構造を有するこのdsRNAは、さらに、1、2、3、または4個の2'OMeヌクレオチドを含むアンチセンス鎖に3'-オーバーハング（例えば、アンチセンス鎖の26および27位に2'OMeヌクレオチドの3'-オーバーハング）を含有する。
別の態様では、ダイサー基質dsRNAは、少なくとも19ヌクレオチド長を有するアンチセンス鎖siRNA配列を最初に選択することによって設計することができる。いくつかの場合には、アンチセンスsiRNAは、5'末端に約5〜約11個のリボヌクレオチドを含むように修飾されて、約24〜約30ヌクレオチド長を提供する。アンチセンス鎖が21ヌクレオチド長を有する場合、3〜9、好ましくは4〜7、またはより好ましくは6個のヌクレオチドが5'末端に付加されていてもよい。付加されたリボヌクレオチドは、標的遺伝子配列に相補的であってもよいが、標的配列とアンチセンスsiRNAとの間の完全な相補性は必要ない。すなわち、得られたアンチセンスsiRNAは、標的配列と十分に相補的である。次に、約22〜約28個のヌクレオチドを有するセンス鎖が生成される。センス鎖は、アンチセンス鎖と実質的に相補的であって、生物学的条件下でアンチセンス鎖とアニーリングする。一態様では、アンチセンス鎖のダイサープロセシングを指令するために、修飾3'末端を含有するセンス鎖が合成される。別の態様では、dsRNAのアンチセンス鎖は、3'-オーバーハングを有する。さらなる態様では、ダイサーの結合およびプロセシングのために修飾3'末端を含有するセンス鎖が合成され、dsRNAのアンチセンス鎖は、3'-オーバーハングを有する。
関連する態様では、アンチセンスsiRNAは、約22〜約28ヌクレオチド長を提供するように5'末端に約1〜約9個のリボヌクレオチドを含むように修飾されてもよい。アンチセンス鎖は、21ヌクレオチド長を有し、1〜7個、好ましくは2〜5個、またはより好ましくは4個のリボヌクレオチドを3'末端に付加することができる。付加されたリボヌクレオチドは、任意の配列を有しうる。付加されたリボヌクレオチドは、標的遺伝子配列に相補的でありうるが、標的配列とアンチセンスsiRNAとの間の完全な相補性は、必要ない。すなわち、得られたアンチセンスsiRNAは、標的配列と十分に相補的である。次に、約24〜約30個のヌクレオチドを有するセンス鎖が生成される。センス鎖は、アンチセンス鎖と実質的に相補的であって、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニーリングする。一態様では、アンチセンス鎖は、ダイサープロセシングを指令するために修飾3'末端を含有するように合成される。別の態様では、dsRNAのセンス鎖は3'-オーバーハングを有する。さらなる一態様では、アンチセンス鎖は、ダイサーの結合およびプロセシングのために修飾3'末端を含有するように合成され、dsRNAのセンス鎖は3'-オーバーハングを有する。
適切なダイサー基質dsRNA配列は、siRNA配列を設計、合成、および修飾するための、当技術分野で公知の任意の手段を用いて同定、合成、および修飾することができる。特定の態様では、ダイサー基質dsRNAは、核酸-脂質粒子などの担体システムを用いて投与される。好ましい態様では、核酸-脂質粒子は：（a）細胞増殖、腫瘍形成、および/または細胞形質転換に関連する一つまたは複数の遺伝子（例えばPLK-1）を標的とする一つまたは複数のダイサー基質dsRNA分子；（b）一つまたは複数の陽イオン性脂質（例えば、本明細書に示されるような式I〜XVIで示される一つまたは複数の陽イオン性脂質またはその塩）；（c）一つまたは複数の非陽イオン性脂質（例えばDPPC、DSPC、DSPE、および/またはコレステロール）；ならびに（d）粒子の凝集を阻害する一つまたは複数の結合脂質（例えばPEG750-C-DMAなどの、約550ダルトン〜約1000ダルトンの平均分子量を有する一つまたは複数のPEG-脂質コンジュゲート）を含む。
本発明のダイサー基質dsRNAならびにそのようなdsRNAを設計および合成する方法に関する追加的な態様は、米国特許出願公開第20050244858号、同第20050277610号、および同第20070265220号、ならびに2010年6月4日に出願された米国特許出願第12/794,701号に記載されており、それらの開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
c）低分子ヘアピンRNA（shRNA）
「低分子ヘアピンRNA」または「短鎖ヘアピンRNA」または「shRNA」には、RNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用できる、密接したヘアピンターンを作成する短鎖RNA配列が含まれる。本発明のshRNAは、化学合成またはDNAプラスミド中の転写カセットから転写することができる。shRNAヘアピン構造は、細胞機構によって切断されsiRNAとなり、これは次にRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に結合される。
本発明のshRNAは、典型的には約15〜60、15〜50、または15〜40（二重鎖）ヌクレオチド長、さらに典型的には約15〜30、15〜25、または19〜25（二重鎖）ヌクレオチド長、好ましくは約20〜24、21〜22、または21〜23（二重鎖）ヌクレオチド長（例えば二本鎖shRNAの各相補的配列は、15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド長、好ましくは約20〜24、21〜22、または21〜23ヌクレオチド長であり、二本鎖shRNAは、約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25塩基対長、好ましくは約18〜22、19〜20、または19〜21塩基対長である）。shRNA二重鎖は、アンチセンス鎖上に約1〜約4個のヌクレオチドまたは約2〜約3個のヌクレオチドの3'オーバーハングおよび/またはセンス鎖上に5'リン酸末端を含みうる。いくつかの態様では、shRNAは、約15〜約60ヌクレオチド長（例えば約15〜60、15〜55、15〜50、15〜45、15〜40、15〜35、15〜30、または15〜25ヌクレオチド長）、好ましくは約19〜約40ヌクレオチド長（例えば約19〜40、19〜35、19〜30、または19〜25ヌクレオチド長）、さらに好ましくは約19〜約23ヌクレオチド長（例えば19、20、21、22、または23ヌクレオチド長）のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖配列を含む。
shRNAの非限定的な例には、一本鎖分子から集合した二本鎖ポリヌクレオチド分子（ここでセンスおよびアンチセンス領域は核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーにより連結している）；ならびに自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン型二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子が含まれる。好ましい態様では、shRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は、約1〜約25ヌクレオチド、約2〜約20ヌクレオチド、約4〜約15ヌクレオチド、約5〜約12ヌクレオチド、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含むループ構造によって連結している。
追加的なshRNA配列には非限定的に、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、国際公開公報第2006/074108号および同第2009/076321号に記載されたもののような非対称shRNA前駆ポリヌクレオチドが含まれる。例えば、国際公開公報第2006/074108号は、1、2、3、またはそれ以上の同一のまたは異なる標的mRNA配列に相補的な配列（例えば多価shRNA）を有する領域と、一つまたは複数の自己相補的領域とを含む自己保護性オリゴヌクレオチドを開示している。同じように、国際公開公報第2009/076321号は、1、2、3個、またはそれ以上の、同一のまたは異なる標的mRNA配列の領域に相補的なポリヌクレオチド配列を含むターゲティング領域（例えば多価shRNA）；第一の自己相補的領域；および第二の自己相補的領域を含む自己形成性非対称前駆ポリヌクレオチドを開示し、ここで、第一および第二自己相補的領域は、ターゲティング領域の両端の一方に位置し、両方の自己相補的領域はステム-ループ構造を形成し、ここで、第一の自己相補的領域は、クラスIV DICERエンドリボヌクレアーゼではないRNase IIIエンドリボヌクレアーゼによって切断される能力があり、ここで、両方の自己相補的領域は、標的遺伝子配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むが、ここで、ターゲティング領域に存在する標的配列の一部は、どちらの自己相補的領域にも相補的配列を有さない。
適切なshRNA配列は、siRNA配列を設計、合成、および修飾するための、当技術分野で公知の任意の手段を用いて同定、合成、および修飾することができる。特定の態様では、shRNAは、核酸-脂質粒子などの担体システムを用いて投与される。好ましい態様では、核酸-脂質粒子は：（a）細胞増殖、腫瘍形成、および/または細胞形質転換に関連する一つまたは複数の遺伝子（例えばPLK-1）を標的とする一つまたは複数のshRNA分子；（b）一つまたは複数の陽イオン性脂質（例えば、本明細書に示されるような式I〜XVIで示される一つまたは複数の陽イオン性脂質またはその塩）；（c）一つまたは複数の非陽イオン性脂質（例えばDPPC、DSPC、DSPE、および/またはコレステロール）；ならびに（d）粒子の凝集を阻害する一つまたは複数の結合脂質（例えばPEG750-C-DMAなどの、約550ダルトン〜約1000ダルトンの平均分子量を有する一つまたは複数のPEG-脂質コンジュゲート）を含む。
本発明のshRNAならびにそのようなshRNAを設計および合成する方法に関する追加的な態様は、2010年6月4日に出願された米国特許出願第12/794,701号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
d）aiRNA
siRNAと同様に、非対称干渉RNA（aiRNA）は、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）を動員でき、かつ、アンチセンス鎖の5'末端から10番目と11番目のヌクレオチドの間で標的配列の配列特異的切断を仲介することにより、哺乳動物細胞における多様な遺伝子の効果的なサイレンシングを導くことができる（Sun et al., Nat. Biotech., 26:1379-1382 (2008)）。典型的には、aiRNA分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する短鎖RNA二重鎖を含み、ここで、二重鎖は、アンチセンス鎖の3'および5'末端にオーバーハングを含有する。相補的アンチセンス鎖に比べた場合にセンス鎖は両端が短いことから、aiRNAは、一般に非対称である。いくつかの局面では、aiRNA分子は、siRNA分子のために用いられる条件に類似した条件下で設計、合成、およびアニーリングすることができる。非限定的な例として、aiRNA配列は、siRNA配列を選択するための上記の方法を用いて選択および産生することができる。
別の態様では、様々な長さ（例えば、約10〜25、12〜20、12〜19、12〜18、13〜17、または14〜17塩基対、さらに典型的には12、13、14、15、16、17、18、19、または20塩基対）のaiRNA二重鎖は、関心対象のmRNAを標的とするためにアンチセンス鎖の3'および5'末端にオーバーハングを付けて設計することができる。場合によっては、aiRNA分子のセンス鎖は、約10〜25、12〜20、12〜19、12〜18、13〜17、または14〜17ヌクレオチド長、さらに典型的には12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド長である。ある他の場合には、aiRNA分子のアンチセンス鎖は、約15〜60、15〜50、または15〜40ヌクレオチド長、さらに典型的には約15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド長であり、好ましくは、約20〜24、21〜22、または21〜23ヌクレオチド長である。
いくつかの態様では、5'アンチセンスオーバーハングは、1、2、3、4、またはそれ以上の非ターゲティングヌクレオチド（例えば、「AA」、「UU」、「dTdT」等）を含有する。他の態様では、3'アンチセンスオーバーハングは、1、2、3、4、またはそれ以上の非ターゲティングヌクレオチド（例えば、「AA」、「UU」、「dTdT」等）を含有する。ある局面では、本明細書に記載されたaiRNA分子は、例えば、二本鎖（二重鎖）領域および/またはアンチセンスオーバーハングに一つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含みうる。非限定的な例として、aiRNA配列は、siRNA配列について上に記載された一つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含みうる。好ましい態様では、aiRNA分子は、例えば、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、またはそれらの混合物などの2'OMeヌクレオチドを含む。
ある態様では、aiRNA分子は、siRNA分子、例えば、本明細書に記載されたsiRNA分子のうち一つのアンチセンス鎖に対応するアンチセンス鎖を含みうる。特定の態様では、aiRNAは、核酸-脂質粒子などの担体システムを用いて投与される。好ましい態様では、核酸-脂質粒子は：（a）細胞増殖、腫瘍形成、および/または細胞形質転換に関連する一つまたは複数の遺伝子（例えばPLK-1）を標的とする一つまたは複数のaiRNA分子；（b）一つまたは複数の陽イオン性脂質（例えば、本明細書に示されるような式I〜XVIで示される一つまたは複数の陽イオン性脂質またはその塩）；（c）一つまたは複数の非陽イオン性脂質（例えばDPPC、DSPC、DSPE、および/またはコレステロール）；ならびに（d）粒子の凝集を阻害する一つまたは複数の結合脂質（例えばPEG750-C-DMAなどの、約550ダルトン〜約1000ダルトンの平均分子量を有する一つまたは複数のPEG-脂質コンジュゲート）を含む。
適切なaiRNA配列は、siRNA配列を設計、合成、および修飾するための、当技術分野で公知の任意の手段を用いて同定、合成、および修飾することができる。本発明のaiRNA分子に関する追加的な態様は、米国特許出願公開第20090291131号および国際公開公報第09/127060号に記載されており、それらの開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
e）miRNA
一般に、マイクロRNA（miRNA）は、遺伝子発現を調節する約21〜23ヌクレオチド長の一本鎖RNA分子である。miRNAは、それが転写されるDNAが由来する遺伝子によってコードされるが、miRNAは、タンパク質には翻訳されず（非コードRNA）；その代わりに、各一次転写物（プリ-miRNA）がプロセシングされ、プレ-miRNAと呼ばれる短いステム-ループ構造、最終的には機能性成熟miRNAとなる。成熟miRNA分子は、一つまたは複数のメッセンジャーRNA（mRNA）分子に部分的または完全に相補的であり、それらの主な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。miRNA分子の同定は、例えば、Lagos-Quintana et al., Science, 294:853-858; Lau et al., Science, 294:858-862；およびLee et al., Science, 294:862-864に記載されている。
miRNAをコードする遺伝子は、プロセシングされた成熟miRNA分子よりもずっと長い。miRNAは、まずキャップおよびポリ-A尾部を有する一次転写物またはプリ-miRNAとして転写され、プロセシングされて、細胞核中でプレ-miRNAとして知られる短い約70ヌクレオチドのステム-ループ構造となる。このプロセシングは、動物において、ヌクレアーゼDroshaおよび二本鎖RNA結合タンパク質Pashaから成るマイクロプロセッサー複合体として知られるタンパク質複合体により行われる（Denli et al., Nature, 432:231-235 (2004)）。次に、これらのプレ-miRNAは、細胞質中でエンドヌクレアーゼダイサーとの相互作用によりプロセシングされて成熟miRNAとなり、これは、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）の形成もまた開始する（Bernstein et al., Nature, 409:363-366 (2001）。DNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが、テンプレートとして機能し、miRNAを生成することができる。
ダイサーがプレ-miRNAのステム-ループを切断するときに、二つの相補的短鎖RNA分子が形成されるが、一方だけがRISC複合体に組み込まれる。この鎖は、ガイド鎖として知られており、RISC複合体中の触媒活性RNaseであるアルゴノートタンパク質により5'末端の安定性に基づき選択される（Preall et al., Curr. Biol., 16:530-535 (2006)）。抗ガイド鎖またはパッセンジャー鎖として知られている残りの鎖は、RISC複合体の基質として分解される（Gregory et al., Cell, 123:631-640 (2005)）。活性RISC複合体への組み込み後に、miRNAはその相補的mRNA分子と塩基対を形成し、標的mRNAの分解および/または翻訳サイレンシングを誘導する。
哺乳動物miRNA分子は、通常は、標的mRNA配列の3'UTRにある部位に相補的である。場合によっては、標的mRNAへのmiRNAのアニーリングは、タンパク質翻訳機構を遮断することによってタンパク質の翻訳を阻害する。ある他の場合には、標的mRNAへのmiRNAのアニーリングは、RNA干渉（RNAi）に類似した過程により標的mRNAの切断および分解を容易にする。miRNAはまた、標的となるmRNAに対応するゲノム部位のメチル化を標的とすることができる。一般に、miRNAは、miRNPと総称されるタンパク質の補体と結合して機能する。
ある局面では、本明細書に記載されるmiRNA分子は、約15〜100、15〜90、15〜80、15〜75、15〜70、15〜60、15〜50、または15〜40ヌクレオチド長、さらに典型的には約15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド長であり、好ましくは約20〜24、21〜22、または21〜23ヌクレオチド長である。ある他の局面では、miRNA分子は、一つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含みうる。非限定的な例として、miRNA配列は、siRNA配列について上記の一つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含みうる。好ましい態様では、miRNA分子は、例えば、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、またはそれらの混合物などの2'OMeヌクレオチドを含む。
いくつかの態様では、miRNA分子は、siRNA配列に対する上記標的遺伝子のいずれかの発現をサイレンシングするために、好ましくは細胞増殖、腫瘍形成、および/または細胞形質転換に関連する遺伝子をサイレンシングするために使用することができる。特定の態様では、miRNAは、核酸-脂質粒子などの担体システムを使用して投与される。好ましい態様では、核酸-脂質粒子は：（a）細胞増殖、腫瘍形成、および/または細胞形質転換に関連する一つまたは複数の遺伝子（例えばPLK-1）を標的とする一つまたは複数のmiRNA分子；（b）一つまたは複数の陽イオン性脂質（例えば、本明細書に示されるような式I〜XVIで示される一つまたは複数の陽イオン性脂質またはその塩）；（c）一つまたは複数の非陽イオン性脂質（例えばDPPC、DSPC、DSPE、および/またはコレステロール）；ならびに（d）粒子の凝集を阻害する一つまたは複数の結合脂質（例えばPEG750-C-DMAなどの、約550ダルトン〜約1000ダルトンの平均分子量を有する一つまたは複数のPEG-脂質コンジュゲート）を含む。
他の態様では、関心対象のmRNA（例えばPLK-1 mRNA）を標的とするmiRNAの活性を遮断する一つまたは複数の剤は、本発明の脂質粒子（例えばSNALPなどの核酸-脂質粒子）を使用して投与される。遮断剤の例には、非限定的に、立体的遮断型オリゴヌクレオチド、ロックド核酸オリゴヌクレオチド、およびモルホリノオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような遮断剤は、miRNAに直接、または標的mRNA上のmiRNA結合部位に結合しうる。
本発明のmiRNA分子に関する追加的な態様は、米国特許出願公開第20090291131号および国際公開公報第09/127060号に記載されており、それらの開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
f）アンチセンスオリゴヌクレオチド
一態様では、核酸は、標的遺伝子または関心対象の配列に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」という用語には、標的とされたポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に相補的なDNAまたはRNAの一本鎖である。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、RNAに結合することによって相補的RNA鎖の翻訳を妨害する。アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドは、特異的な相補的（コードまたは非コード）RNAを標的とするために使用することができる。結合が起こったならば、このDNA/RNAハイブリッドを酵素RNase Hにより分解することができる。特定の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10〜約60個のヌクレオチド、さらに好ましくは約15〜約30個のヌクレオチドを含む。この用語はまた、所望の標的遺伝子に厳密に相補的とは限らないアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、標的特異的でない活性がアンチセンスにより見出された場合に、または標的配列との一つもしくは複数のミスマッチを含有するアンチセンス配列が特定用途に最も好ましい場合に、本発明を利用することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成を標的とする有効な阻害剤であることが実証され、かつ結果として、ターゲティングされた遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害するために使用することができる。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼ（polygalactauronase）およびムスカリン2型アセチルコリン受容体の合成は、それぞれのmRNA配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第5,739,119号および同第5,759,829号を参照）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（MDR1）、ICAM-1、E-セレクチン、STK-1、線条体GABAA受容体、およびヒトEGFで実証された（Jaskulski et al., Science, 240:1544-6 (1988); Vasanthakumar et al., Cancer Commun., 1:225-32 (1989); Peris et al., Brain Res Mol Brain Res., 15;57:310-20 (1998)；ならびに米国特許第5,801,154号；同第5,789,573号；同第5,718,709号および同第5,610,288号を参照）。さらに、様々な異常細胞増殖、例えば癌を阻害し、治療するために使用できるアンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第5,747,470号；同第5,591,317号；および同第5,783,683号を参照）。これらの参照の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法は、当技術分野において公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの製造に容易に適応させることができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択された標的配列の分析、ならびに二次構造、Tm、結合エネルギー、および相対安定性の決定に基づく。宿主細胞における標的mRNAへの特異的結合を低減または妨害しうる二量体、ヘアピン、または他の二次構造の形成が相対的に不可能であることに基づき、アンチセンスオリゴヌクレオチドを選択することができる。mRNAの高度に好ましい標的領域には、AUG翻訳開始コドンの領域またはその近くの領域、およびmRNAの5'領域に実質的に相補的な配列が含まれる。これらの二次構造分析および標的部位の選択の考察は、例えば、OLIGOプライマー解析ソフトウェアv.4（Molecular Biology Insights）および/またはBLASTN 2.0.5アルゴリズムソフトウェア（Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997)）を使用して行うことができる。
g）リボザイム
本発明の別の態様によると、核酸-脂質粒子は、リボザイムと結合する。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有するRNA-タンパク質複合体である（Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:8788-92 (1987)；およびForster et al., Cell, 49:211-20 (1987)を参照）。例えば、多数のリボザイムは、高い特異性により、リン酸エステル転移反応を加速させ、多くの場合にオリゴヌクレオチド基質中の数種のリン酸エステルのうち一つだけを切断する（Cech et al., Cell, 27:487-96 (1981); Michel et al., J. Mol. Biol., 216:585-610 (1990); Reinhold-Hurek et al., Nature, 357:173-6 (1992)を参照）。この特異性は、化学反応の前に、基質が特異的塩基対形成相互作用によりリボザイムの内部ガイド配列（internal guide sequence）(「IGS」）に結合する必要があることが原因とされている。
少なくとも6個の基本的種類の天然酵素性RNA分子が、現在のところ知られている。それぞれは、生理的条件下でRNAホスホジエステル結合の加水分解をトランスで触媒することができる（したがって、他のRNA分子を切断することができる）。一般に、酵素的核酸は、最初に標的RNAに結合することにより作用する。そのような結合は、標的RNAを切断するように作用する分子の酵素部分に近接して保持された酵素的核酸の標的結合部分を介して起こる。したがって、酵素的核酸は、最初に標的RNAを認識し、次に相補的塩基対形成により標的RNAと結合し、いったん正確な部位に結合したならば、酵素的に作用して標的RNAを切断する。そのような標的RNAの戦略的切断により、コードされたタンパク質の合成を指令する能力が損われ得る。酵素的核酸がそのRNA標的に結合してそれを切断した後、該RNAから放出されて別の標的を探し、新しい標的への結合および切断を繰り返すことができる。
酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、グループIイントロンモチーフもしくはRNaseP RNAモチーフ（RNAガイド配列と結合）、またはニューロスポラVS RNAモチーフで形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの具体例は、例えば、Rossi et al., Nucleic Acids Res., 20:4559-65 (1992)に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、例えば、EP 0360257、Hampel et al., Biochemistry, 28:4929-33 (1989); Hampel et al., Nucleic Acids Res., 18:299-304 (1990)；および米国特許第5,631,359号に記載されている。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、例えば、Perrotta et al., Biochemistry, 31:11843-52 (1992)に記載されている。RNasePモチーフの例は、例えば、Guerrier-Takada et al., Cell, 35:849-57 (1983)に記載されている。ニューロスポラVS RNAリボザイムモチーフの例は、例えば、Saville et al., Cell, 61:685-96 (1990); Saville et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8826-30 (1991); Collins et al., Biochemistry, 32:2795-9 (1993)に記載されている。グループIイントロンの例は、例えば、米国特許第4,987,071号に記載されている。本発明により使用される酵素的核酸分子の重要な特徴とは、それらが、標的遺伝子のDNA領域またはRNA領域の一つまたは複数に相補的な特異的基質結合部位を有すること、およびそれらが、該分子にRNA切断活性を付与するヌクレオチド配列を基質結合部位の内部または周辺に有することである。したがって、リボザイム構築物は、本明細書に言及された特異的モチーフに限定されなくてもよい。これらの参照の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
任意のポリヌクレオチド配列を標的とするリボザイムの製造方法は、当技術分野において公知である。リボザイムは、例えば、国際公開公報第93/23569号および同第94/02595号に記載されているように設計し、そこに記載されているように合成してインビトロおよび/またはインビボで検査することができる。これらのPCT公開の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変化させること、または、血清リボヌクレアーゼによるリボザイムの分解を防止する修飾（例えば、酵素的RNA分子の糖部分に対して行うことのできる様々な化学的修飾を記載している国際公開公報第92/07065号、同第93/15187号、同第91/03162号、および同第94/13688号；EP 92110298.4；ならびに米国特許第5,334,711号を参照されたく、その開示は、それぞれ全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる）、細胞におけるそれらの有効性を高める修飾、およびRNA合成時間を短縮し化学的要件を軽減するためのステムIIの塩基の除去を行ったリボザイムを化学合成することによって最適化することができる。
h）免疫刺激性オリゴヌクレオチド
本発明の脂質粒子に結合する核酸は免疫刺激性であってよく、例えば、ヒトなどの哺乳動物でありうる対象に投与した場合に免疫反応を誘導することができる、免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ISS；一本鎖または二本鎖）を含む。ISSには、例えば、ヘアピン二次構造へと導く、ある種のパリンドローム（Yamamoto et al., J. Immunol., 148:4072-6 (1992)を参照）またはCpG モチーフ、および他の公知のISSの特徴（多重Gドメインなど；国際公開公報第96/11266号を参照されたく、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる）が含まれる。
免疫反応を誘起するために免疫刺激性核酸が標的配列に特異的に結合してその発現を低下させる必要がない場合には、免疫刺激性核酸は、配列非特異的であると見なされる。したがって、ある種の免疫刺激性核酸が、天然の遺伝子またはmRNAの領域に対応する配列を含んでいるとしてもなお、配列非特異的免疫刺激性核酸と見なされうる。
一態様では、免疫刺激性核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも1個のCpGジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたはCpGジヌクレオチドは、非メチル化またはメチル化されていてもよい。別の態様では、免疫刺激性核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも1個のCpGジヌクレオチドを含む。一態様では、核酸は、CpG中のシトシンがメチル化されている1個のCpGジヌクレオチドを含む。代替の態様では、核酸は、CpGジヌクレオチドの中の少なくとも1個のシトシンがメチル化されている、少なくとも2個のCpGジヌクレオチドを含む。さらなる一態様では、配列中に存在するCpGジヌクレオチド中の各シトシンが、メチル化されている。別の態様では、核酸は、少なくとも1個のCpGジヌクレオチドがメチル化シトシンを含む、複数のCpGジヌクレオチドを含む。本発明の組成物および方法に使用するのに適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドの例は、国際公開公報第02/069369号、同第01/15726号、および同第09/086558号；米国特許第6,406,705号；ならびにRaney et al., J. Pharm. Exper. Ther., 298:1185-92 (2001)に記載されており、それらの開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。ある態様では、本発明の組成物および方法に使用されるオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（「PO」）主鎖もしくはホスホロチオエート（「PS」）主鎖、および/またはCpGモチーフ中に少なくとも1個のメチル化シトシン残基を有する。
2.他の活性剤
ある態様では、本発明の脂質粒子に結合する活性剤は、一つまたは複数の治療用タンパク質、ポリペプチド、または小型有機分子もしくは小型有機化合物を含みうる。そのような治療的に有効な剤または薬物の非限定的な例には、腫瘍薬（例えば、化学療法薬、ホルモン療法剤、免疫療法剤、放射線療法剤等）、脂質低下剤、抗ウイルス薬、抗炎症性化合物、抗うつ薬、刺激薬、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱薬、血管拡張薬、血管新生阻害薬、細胞血管剤、シグナル伝達阻害薬、抗不整脈剤などの心臓血管薬、ホルモン、血管収縮薬、およびステロイドが含まれる。これらの活性剤は、本発明の脂質粒子内で単独で、または干渉RNAなどの核酸を含む本発明の脂質粒子と組み合わせて（例えば同時投与）、投与することができる。
化学療法薬の非限定的な例には、白金ベースの薬物（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、サトラプラチン等）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソ尿素等）、代謝拮抗薬（例えば、5-フルオロウラシル(5-FU)、アザチオプリン、メトトレキサート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド等）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル等）、トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、イリノテカン(CPT-11、カンプトサール(Camptosar)）、トポテカン、アムサクリン、エトポシド(VP16)、エトポシドホスフェート、テニポシド等）、抗腫瘍性抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン等）、チロシンキナーゼ阻害薬（例えば、ゲフィチニブ(Iressa（登録商標））、スニチニブ（Sutent（登録商標）、SU11248）、エルロチニブ（Tarceva（登録商標）、OSI-1774）、ラパチニブ（GW572016、GW2016）、カネルチニブ（CI 1033）、セマキシニブ（SU5416）、バタラニブ（PTK787/ZK222584）、ソラフェニブ（BAY 43-9006）、イマチニブ（Gleevec（登録商標）、STI571）、ダサチニブ（BMS-354825）、レフルノミド（SU101）、バンデタニブ（Zactima（商標）、ZD6474）等）、それらの薬学的に許容されうる塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、およびそれらの組み合わせが含まれる。
従来のホルモン治療剤の例には、非限定的に、ステロイド（例えばデキサメタゾン）、フィナステリド、アロマターゼ阻害薬、タモキシフェン、およびゴセレリン、ならびに他の性腺刺激ホルモン放出ホルモン作動薬（GnRH）が含まれる。
従来の免疫療法剤の例には、非限定的に、免疫刺激物質（例えば、Bacillus Calmette-Guerin(BCG）、レバミゾール、インターロイキン-2、α-インターフェロン等）、モノクローナル抗体（例えば、抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗HLA-DR、および抗VEGFモノクローナル抗体）、免疫毒素（例えば、抗CD33モノクローナル抗体-カリチアマイシンコンジュゲート、抗CD22モノクローナル抗体-シュードモナス外毒素コンジュゲート等）、および放射免疫療法（例えば、111In、90Y、または131Iに結合した抗CD20モノクローナル抗体等）が含まれる。
従来の放射線療法剤の例には、非限定的に、腫瘍抗原に対する抗体に結合させてもよい、47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、および212Biなどの放射性核種が含まれる。
本発明により使用できる追加的な腫瘍薬には、非限定的に、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、araC、三酸化ヒ素、ベキサロテン、biCNU、カルムスチン、CCNU、セレコキシブ、クラドリビン、シクロスポリンA、シトシンアラビノシド、シトキサン、デクスラゾキサン、DTIC、エストラムスチン、エキセメスタン、FK506、ゲムツズマブ-オゾガマイシン、ハイドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、インターフェロン、レトロゾール、ロイスタチン、ロイプロリド、リトレチノイン（litretinoin）、メガストロール（megastrol）、L-PAM、メスナ、メトキサレン、ミトラマイシン、ナイトロジェンマスタード、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポリフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、STI-571、タキソテール、テモゾラミド（temozolamide）、VM-26、トレミフェン、トレチノイン、ATRA、バルルビシン、およびベルバンが含まれる。本発明により使用できる腫瘍薬の他の例は、エリプチシンおよびエリプチシンのアナログまたは誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害薬、ならびにカンプトテシンである。
トリグリセリド、コレステロール、および/またはグルコースの上昇に関連する脂質疾患または障害を治療するための脂質低下剤の非限定的な例には、スタチン、フィブラート、エゼチミブ、チアゾリジンジオン、ナイアシン、β遮断薬、ニトログリセリン、カルシウム拮抗薬、魚油、およびそれらの混合物が含まれる。
抗ウイルス薬の例には、非限定的に、アバカビル、アシクロビル（aciclovir）、アシクロビル（acyclovir）、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、シドホビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、侵入阻害薬、ファムシクロビル、固定用量配合剤、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、融合阻害薬、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害薬、インターフェロンIII型（例えば、IFN-λ1、IFN-λ2、およびIFN-λ3などのIFN-λ分子）、インターフェロンII型（例えばIFN-γ）、インターフェロンI型（例えば、PEG化IFN-αなどのIFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、およびIFN-ζ）、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、MK-0518、マラビロク、モロキシジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル（nexavir）、ヌクレオシドアナログ、オセルタミビル、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害薬、逆転写酵素阻害薬、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、相乗的増強剤、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、ジドブジン、それらの薬学的に許容されうる塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、およびそれらの混合物が含まれる。
B. 陽イオン性脂質
本明細書に示されるような式I〜XVIで示される任意の陽イオン性脂質またはそれらの塩を、単独で、または一つもしくは複数の他の陽イオン性脂質種もしくは非陽イオン性脂質種と組み合わせて、本発明の脂質粒子（例えばSNALP）内で使用することができる。陽イオン性脂質には、その(R)および/または(S)鏡像異性体が含まれる。
いくつかの態様では、陽イオン性脂質はラセミ混合物を含む。他の態様では、陽イオン性脂質は、一つまたは複数のジアステレオマーの混合物を含む。ある態様では、陽イオン性脂質が少なくとも約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の鏡像異性体過剰率を含むように、陽イオン性脂質に一つの鏡像異性体が豊富に存在する。ある他の態様では、陽イオン性脂質が少なくとも約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%のジアステレオマー過剰率（diastereomeric excess）を含むように、陽イオン性脂質に一つのジアステレオマーが豊富に存在する。ある追加的な態様では、陽イオン性脂質は、キラル的に純粋である（例えば、単一の光学異性体を含む）。さらなる態様では、陽イオン性脂質が少なくとも約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の異性体過剰率（isomeric excess）を含むように、陽イオン性脂質に一つの光学異性体（例えば光学的に活性な異性体）が豊富に存在する。本発明は、ラセミ混合物としてまたは光学的に純粋な形態の式I〜XVIで示される陽イオン性脂質の合成を提供する。
「陽イオン性脂質」および「アミノ脂質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、この用語には、1、2、3種、またはそれ以上の種類の脂肪酸または脂肪族アルキル鎖と、pH滴定可能なアミノ頭基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭基）とを有する脂質およびそれらの塩が含まれる。陽イオン性脂質は、典型的には陽イオン性脂質のpKaを下回るpHでプロトン化（すなわち正に荷電）され、pKaを上回るpHで実質的に中性である。本発明の陽イオン性脂質はまた、滴定可能な陽イオン性脂質と名付けることができる。
「塩」という用語には、本明細書に開示された陽イオン性脂質と一つまたは複数の陰イオンとの間に形成された複合体などの任意の陰イオン性および陽イオン性の複合体が含まれる。陰イオンの非限定的な例には、無機および有機陰イオン、例えば水素化物、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸（例えばヘミシュウ酸）、リン酸、ホスホン酸、リン酸水素、リン酸二水素、酸化物、炭酸、重炭酸、硝酸、亜硝酸、窒化物、重亜硫酸、硫化物、亜硫酸、重硫酸、硫酸、チオ硫酸、硫酸水素、ホウ酸、ギ酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、アクリル酸、ポリアクリル酸、フマル酸、マレイン酸、イタコン酸、グリコール酸、グルコン酸、リンゴ酸、マンデル酸、チグリン酸、アスコルビン酸、サリチル酸、ポリメタクリル酸、過塩素酸、塩素酸、亜塩素酸、次亜塩素酸、臭素酸、次亜臭素酸、ヨウ素酸、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、ヒ酸、亜ヒ酸、クロム酸、二クロム酸、シアン化物、シアン酸、チオシアン酸、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸イオン、およびそれらの混合物が含まれる。特定の態様では、本明細書に開示された陽イオン性脂質の塩は、結晶性の塩である。
「アルキル」という用語には、1〜24個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐の非環状または環状の飽和脂肪族炭化水素が含まれる。代表的な飽和直鎖アルキルには、非限定的に、メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル等が含まれ、一方で飽和分岐アルキルには、非限定的に、イソプロピル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、イソペンチル等が含まれる。代表的な飽和環状アルキルには、非限定的に、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が含まれ、一方で不飽和環状アルキルには、非限定的に、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等が含まれる。
「アルケニル」という用語には、隣接する炭素原子の間に少なくとも一つの二重結合を含有する上記と同義のアルキルが含まれる。アルケニルには、シスおよびトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分岐アルケニルには、非限定的に、エチレニル、プロピレニル、1-ブテニル、2-ブテニル、イソブチレニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-メチル-1-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル、2,3-ジメチル-2-ブテニル等が含まれる。
「アルキニル」という用語には、隣接する炭素の間に追加的に少なくとも一つの三重結合を含有する、上記と同義の任意のアルキルまたはアルケニルが含まれる。代表的な直鎖および分岐アルキニルには、非限定的に、アセチレニル、プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、3-メチル-1-ブチニル等が含まれる。
「アシル」という用語には、結合点の炭素が下記と同義のオキソ基で置換されている任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルが含まれる。以下がアシル基の非限定的な例である：-C(=O)アルキル、-C(=O)アルケニル、および-C(=O)アルキニル。
「複素環」という用語には、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであって、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される1または2個のヘテロ原子を含有する5〜7員単環式、または7〜10員二環式の複素環式環が含まれ（ここで、窒素および硫黄ヘテロ原子は酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよい）、該二環式複素環式環には、上記複素環のいずれかがベンゼン環に縮合された二環式環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合していてもよい。複素環には、非限定的に、下記と同義のヘテロアリール、およびモルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（piperidinyl）、ピペリジニル（piperizynyl）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル等が含まれる。
「置換されていてもよいアルキル」、「置換されていてもよいアルケニル」、「置換されていてもよいアルキニル」、「置換されていてもよいアシル」、および「置換されていてもよい複素環」という用語は、置換される場合に、少なくとも1個の水素原子が置換基で置換えられることを意味する。オキソ置換基(=O)の場合に、2個の水素原子が置き換えられる。この点に関して置換基には、非限定的に、オキソ、ハロゲン、複素環、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx、および-SOnNRxRyが含まれ、ここで、nは0、1、または2であり、RxおよびRyは、同じであるかまたは異なり、独立して水素、アルキル、または複素環であり、アルキルおよび複素環の各置換基は、さらに、一つまたは複数のオキソ、ハロゲン、-OH、-CN、アルキル、-ORx、複素環、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx、および-SOnNRxRyで置換されていてもよい。置換基の羅列の前に使用される場合の「置換されていてもよい」という用語は、一覧中の各置換基が本明細書記載のように任意で置換されていてもよいことを意味する。
「ハロゲン」という用語には、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードが含まれる。
一局面では、以下の構造を有する式Iで示される陽イオン性脂質（またはその塩）が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中、R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立してHまたは置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、あるいはR1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素および酸素から選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R3およびR4は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり；R3およびR4の少なくとも一方は、少なくとも二つの不飽和部位を含む。
いくつかの態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R1およびR2はどちらもメチル基である。
他の態様では、R3およびR4は独立して、置換されていてもよいC12-C24、C12-C22、C12-C20、C14-C24、C14-C22、C14-C20、C16-C24、C16-C22、またはC16-C20のアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル基（すなわち、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、またはC24のアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル基）である。ある態様では、R3およびR4の少なくとも一方または両方は独立して、少なくとも2、3、4、5、または6個の不飽和部位（例えば2、3、4、5、6、2〜3、2〜4、2〜5、または2〜6個の不飽和部位）を含む。場合によっては、R3およびR4は独立して、ドデカジエニル成分、テトラデカジエニル成分、ヘキサデカジエニル成分、オクタデカジエニル成分、イコサジエニル成分、ドデカトリエニル成分、テトラデカトリエニル（tetradectrienyl）成分、ヘキサデカトリエニル成分、オクタデカトリエニル成分、イコサトリエニル成分、またはそれらのアシル誘導体（例えばリノレオイル、リノレノイル、γ-リノレノイル等）を含みうる。いくつかの場合には、オクタデカジエニル成分はリノレイル成分である。特定の態様では、R3およびR4はどちらもリノレイル成分である。他の場合には、オクタデカトリエニル成分は、リノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。特定の態様では、R3およびR4は、どちらもリノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。場合によっては、R3およびR4は異なり、例えばR3はテトラデカトリエニル(C14)であり、R4はリノレイル(C18)である。好ましい態様では、式Iで示される陽イオン性脂質は対称であり、すなわちR3およびR4はどちらも同じである。さらなる態様では、R3およびR4の一方または両方に存在する二重結合は、シスおよび/またはトランス立体配置でありうる。
式Iで示される陽イオン性脂質へのいくつかの群の態様では、R3およびR4は、同一であるかまたは異なり、独立して：
Figure 2012531469
からなる群より選択される。
特定の態様では、式Iで示される陽イオン性脂質は、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、またはそれらの混合物を含む。
いくつかの態様では、式Iで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩)を形成する。特定の一態様では、式Iで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは好ましくは結晶性の塩である。
別の局面では、以下の構造を有する式IIで示される陽イオン性脂質（またはその塩）が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中、R1およびR2は独立して選択され、HまたはC1-C3アルキルであり、R3およびR4は独立して選択され、約10〜約20個の炭素原子を有するアルキル基であり、少なくともR3およびR4の一方は、少なくとも2個の不飽和部位を含む。場合によっては、R3およびR4はどちらも同じであり、すなわちR3およびR4はどちらもリノレイル(C18)等である。ある他の場合には、R3およびR4は異なり、すなわちR3はテトラデカトリエニル(C14)であり、R4はリノレイル(C18)である。好ましい態様では、式IIで示される陽イオン性脂質は対称であり、すなわちR3およびR4はどちらも同じである。別の好ましい態様では、R3およびR4の両方は、少なくとも2個の不飽和部位を含む。いくつかの態様では、R3およびR4は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、およびイコサジエニルからなる群より独立して選択される。好ましい態様では、R3およびR4はどちらもリノレイルである。いくつかの態様では、R3およびR4は、少なくとも3個の不飽和部位を含み、例えばドデカトリエニル、テトラデカトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、およびイコサトリエニルから独立して選択される。
いくつかの態様では、式IIで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式IIで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは好ましくは結晶性の塩である。
DLinDMAおよびDLenDMAなどの陽イオン性脂質、ならびに式IおよびIIの範囲内に入る追加的な陽イオン性脂質の合成は、米国特許出願公開第20060083780号に記載され、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
さらに別の局面では、以下の構造を有する式IIIで示される陽イオン性脂質（またはその塩）が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中、R1およびR2は同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、もしくはC12-C24アシルであり；R3およびR4は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、またはR3およびR4は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素および酸素から選択される1もしくは2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R5は、存在しないか、または水素（H）であるか、またはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；m、n、およびpは、同一であるかまたは異なり、独立して0、1、または2のいずれかであるが、但し、m、n、およびpは同時に0であることはなく；qは0、1、2、3、または4であり；YおよびZは、同一であるかまたは異なり、独立してO、S、またはNHである。
いくつかの態様では、R3およびR4、独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R3およびR4はどちらもメチル基である。一態様では、qは1または2である。別の態様では、qは1〜2、1〜3、1〜4、2〜3、または2〜4である。さらなる態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR5は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR5は水素である。代替の態様では、R5は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。追加的な態様では、YおよびZはどちらもOである。
他の態様ではR1およびR2は独立して、置換されていてもよいC12-C24、C12-C22、C12-C20、C14-C24、C14-C22、C14-C20、C16-C24、C16-C22、またはC16-C20のアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル基（すなわち、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、またはC24のアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル基）である。ある態様では、R1およびR2の少なくとも一方または両方は独立して、少なくとも1、2、3、4、5、または6個の不飽和部位（例えば1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、2〜3、2〜4、2〜5、または2〜6個の不飽和部位）または置換されているアルキルもしくはアシル基を含む。場合によっては、不飽和側鎖は、ミリストレイル成分、パルミトレイル成分、オレイル成分、ドデカジエニル成分、テトラデカジエニル成分、ヘキサデカジエニル成分、オクタデカジエニル成分、イコサジエニル成分、ドデカトリエニル成分、テトラデカトリエニル成分、ヘキサデカトリエニル成分、オクタデカトリエニル成分、イコサトリエニル成分、またはそれらのアシル誘導体（例えばリノレオイル、リノレノイル、γ-リノレノイル等）を含みうる。いくつかの場合には、オクタデカジエニル成分はリノレイル成分である。特定の態様では、R1およびR2はどちらもリノレイル成分である。他の場合には、オクタデカトリエニル成分は、リノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。特定の態様では、R1およびR2はどちらもリノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。
R1およびR2の一方または両方が少なくとも1、2、3、4、5、または6個の不飽和部位を独立して含む態様では、R1およびR2の一方または両方に存在する二重結合は、シスおよび/またはトランス立体配置でありうる。場合によっては、R1およびR2はどちらも同じであり、例えばR1およびR2はどちらもリノレニル(C18)成分等である。ある他の場合には、R1およびR2は異なり、例えばR1はテトラデカトリエニル(C14)成分であり、R2はリノレイル(C18)成分である。好ましい態様では、式IIIで示される陽イオン性脂質は対称であり、すなわち、R1およびR2はどちらも同じである。別の好ましい態様では、R1およびR2の少なくとも一方または両方は、少なくとも2個の不飽和部位（例えば2、3、4、5、6、2〜3、2〜4、2〜5、または2〜6個の不飽和部位）を含む。
R1およびR2の一方または両方が分岐したアルキルまたはアシル基（例えば置換されているアルキルまたはアシル基）を独立して含む態様では、分岐したアルキルまたはアシル基は、少なくとも1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上）のC1-C6アルキル置換基を有するC12-C24アルキルまたはアシルを含みうる。特定の態様では、分岐したアルキルまたはアシル基は、1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個）のC1-C4アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、またはブチル）置換基を有する、C12-C20またはC14-C22のアルキルまたはアシルを含む。いくつかの態様では、分岐アルキル基はフィタニル(3,7,11,15-テトラメチル-ヘキサデカニル)成分を含み、分岐アシル基はフィタノイル(3,7,11,15-テトラメチル-ヘキサデカノイル)成分を含む。特定の態様では、R1およびR2はどちらもフィタニル成分である。
式IIIの陽イオン性脂質に対するいくつかの群の態様では、R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、
Figure 2012531469
からなる群より独立して選択される。
ある態様では、式IIIの範囲内に入る陽イオン性脂質には、非限定的に以下が含まれる：2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-C2-DMA；「XTC2」または「C2K」）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-(3-ジメチルアミノプロピル)-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-C3-DMA；「C3K」）、2,2-ジリノレイル-4-(4-ジメチルアミノブチル)-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-C4-DMA；「C4K」)、2,2-ジリノレイル-5-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキサン（DLin-K6-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-N-メチルペピアジノ(pepiazino)-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-MPZ）、2,2-ジオレオイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン（DO-K-DMA）、2,2-ジステアロイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン（DS-K-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-N-モルホリノ-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-MA）、2,2-ジリノレイル-4-トリメチルアミノ-[1,3]-ジオキソラン塩化物（DLin-K-TMA.Cl）、2,2-ジリノレイル-4,5-ビス(ジメチルアミノメチル)-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K2-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-メチルピペルジン(piperzine)-[1,3]-ジオキソラン（D-Lin-K-N-メチルピペルジン）、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA、DPan-C2K-DMA、DPan-C3K-DMA、またはそれらの混合物。好ましい態様では、式IIIで示される陽イオン性脂質は、DLin-K-C2-DMAおよび/またはDLin-K-DMAを含む。
いくつかの態様では、式IIIで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式IIIで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは好ましくは結晶性の塩である。
DLin-K-C2-DMA、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLin-K6-DMA、DLin-K-MPZ、DO-K-DMA、DS-K-DMA、DLin-K-MA、DLin-K-TMA.Cl、DLin-K2-DMA、D-Lin-K-N-メチルピペルジンなどの陽イオン性脂質、および追加的な陽イオン性脂質の合成は、国際公開公報第2010/042877号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
DLin-K-DMAなどの陽イオン性脂質、および追加的な陽イオン性脂質の合成は、国際公開公報第09/086558号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
好ましい態様では、以下の構造を有する、式IVで示される陽イオン性脂質（またはその塩）が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中、R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり；R3およびR4は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、またはC2-C6アルキニルであるか、あるいはR3およびR4は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素および酸素から選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R5は、存在しないか、または水素（H）であるか、またはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；m、n、およびpは、同一であるかまたは異なり、独立して0、1、または2であるが、但し、m、n、およびpは同時に0であることはなく、YおよびZは、同一であるかまたは異なり、独立してO、S、またはNHである。
いくつかの態様では、R3およびR4は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R3およびR4はどちらもメチル基である。さらなる態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR5は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR5は水素である。代替の態様では、R5は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。追加的な態様では、YおよびZはどちらもOである。
他の態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC12-C24、C12-C22、C12-C20、C14-C24、C14-C22、C14-C20、C16-C24、C16-C22、またはC16-C20のアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル基（すなわち、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、またはC24のアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル基）である。ある態様では、R1およびR2の少なくとも一方または両方は独立して、少なくとも1、2、3、4、5、もしくは6個の不飽和部位（例えば1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、2〜3、2〜4、2〜5、または2〜6個の不飽和部位）または置換されているアルキルもしくはアシル基を含む。場合によっては、不飽和側鎖は、ミリストレイル成分、パルミトレイル成分、オレイル成分、ドデカジエニル成分、テトラデカジエニル成分、ヘキサデカジエニル成分、オクタデカジエニル成分、イコサジエニル成分、ドデカトリエニル成分、テトラデカトリエニル成分、ヘキサデカトリエニル成分、オクタデカトリエニル成分、イコサトリエニル成分、またはそれらのアシル誘導体（例えばリノレオイル、リノレノイル、γ-リノレノイル等）を含みうる。いくつかの場合には、オクタデカジエニル成分はリノレイル成分である。特定の態様では、R1およびR2はどちらもリノレイル成分である。他の場合には、オクタデカトリエニル成分は、リノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。特定の態様では、R1およびR2はどちらもリノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。
R1およびR2の一方または両方が少なくとも1、2、3、4、5、または6個の不飽和部位を独立して含む態様では、R1およびR2の一方または両方に存在する二重結合は、シスおよび/またはトランス立体配置でありうる。場合によっては、R1およびR2はどちらも同じであり、例えばR1およびR2はどちらもリノレイル(C18)成分等である。ある他の場合には、R1およびR2は異なり、例えばR1はテトラデカトリエニル(C14)成分であり、R2はリノレイル(C18)成分である。好ましい態様では、式IVで示される陽イオン性脂質は対称であり、すなわちR1およびR2はどちらも同じである。別の好ましい態様では、R1およびR2の少なくとも一方または両方は、少なくとも2個の不飽和部位（例えば2、3、4、5、6、2〜3、2〜4、2〜5、または2〜6個の不飽和部位）を含む。
R1およびR2の一方または両方が、分岐したアルキルまたはアシル基（例えば置換されているアルキルまたはアシル基）を独立して含む態様では、分岐したアルキルまたはアシル基は、少なくとも1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上）のC1-C6アルキル置換基を有する、C12-C24アルキルまたはアシルを含みうる。特定の態様では、分岐したアルキルまたはアシル基は、1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個）のC1-C4アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、またはブチル）置換基を有するC12-C20またはC14-C22のアルキルまたはアシルを含む。いくつかの態様では、分岐アルキル基は、フィタニル(3,7,11,15-テトラメチル-ヘキサデカニル)成分を含み、分岐アシル基は、フィタノイル(3,7,11,15-テトラメチル-ヘキサデカノイル)成分を含む。特定の態様では、R1およびR2はどちらもフィタニル成分である。
式IVで示される陽イオン性脂質へのいくつかの群の態様では、R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、以下からなる群から独立して選択される：
Figure 2012531469
。
ある態様では、式IVの範囲内に入る陽イオン性脂質には、非限定的に以下が含まれる：2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-C2-DMA；「XTC2」または「C2K」）、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA、DPan-C2K-DMA、またはそれらの混合物。好ましい態様では、式IVで示される陽イオン性脂質はDLin-K-C2-DMAを含む。
いくつかの態様では、式IVで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式IVで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
DLin-K-C2-DMA（C2K）の合成は、国際公開公報第2010/042877号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
さらなる局面では、以下の構造を有する式Vで示される陽イオン性脂質またはその塩が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中：R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、またはR1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R3は、存在しないか、または水素（H）、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4およびR5は、存在しないかまたは存在し、存在する場合は同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C10アルキルまたはC2-C10アルケニルであり；nは、0、1、2、3、または4である。
いくつかの態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R1およびR2はどちらもメチル基である。別の好ましい態様では、R4およびR5はどちらもブチル基である。さらに別の好ましい態様では、nは1である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。さらなる態様では、R4およびR5は独立して、置換されていてもよいC2-C6もしくはC2-C4アルキルまたはC2-C6もしくはC2-C4アルケニルである。
代替の態様では、式Vで示される陽イオン性脂質は、アミノ頭基とアルキル鎖の一方または両方との間にエステル結合を含む。いくつかの態様では、式Vで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式Vで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸)塩であり、それは好ましくは結晶性の塩である。
式Vにおけるアルキル鎖のそれぞれが、6、9、および12位にシス二重結合を含有するものの（すなわち、cis,cis,cis-Δ6,Δ9,Δ12）、代替の態様では、アルキル鎖の一方または両方におけるこれらの二重結合の1、2、または3個は、トランス立体配置でありうる。
特に好ましい態様では、式Vで示される陽イオン性脂質は、以下の構造を有する：
Figure 2012531469
。
別の局面では、以下の構造を有する式VIで示される陽イオン性脂質またはその塩が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中：R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、またはR1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R3は、存在しないか、または水素（H）、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4およびR5は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり、ここで、R4およびR5の少なくとも一方は、少なくとも3個の不飽和部位または置換C12-C24アルキルを含み；m、n、およびpは、同一であるかまたは異なり、独立して0、1、または2のいずれかであるが、但し、m、n、およびpは同時に0であることはなく；qは0、1、2、3、または4であり；YおよびZは、同一であるかまたは異なり、独立してO、S、またはNHである。
いくつかの態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R1およびR2はどちらもメチル基である。別の好ましい態様では、qは2である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。さらなる態様では、R4およびR5は独立して、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルである。
R4およびR5の少なくとも一方が分岐アルキル基（例えば置換C12-C24アルキル基）を含む態様では、分岐アルキル基は、少なくとも1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上）のC1-C6アルキル置換基を有するC12-C24アルキルを含みうる。特定の態様では、分岐アルキル基は、1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個）のC1-C4アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、またはブチル）置換基を有するC12-C20またはC14-C22アルキルを含む。好ましくは、分岐アルキル基は、フィタニル(3,7,11,15-テトラメチル-ヘキサデカニル)成分を含む。他の好ましい態様では、R4およびR5はどちらもフィタニル成分である。
代替の態様では、R4およびR5の少なくとも一方は、分岐アシル基（例えば置換C12-C24アシル基）を含む。場合によっては、分岐アシル基は、少なくとも1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上）のC1-C6アルキル置換基を有するC12-C24アシルを含みうる。特定の態様では、分岐アシル基は、1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個）のC1-C4アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、またはブチル）置換基を有する、C12-C20またはC14-C22アシルを含む。好ましくは、分岐アシル基はフィタノイル(3,7,11,15-テトラメチル-ヘキサデカノイル)成分を含む。
R4およびR5の少なくとも一方が少なくとも3個の不飽和部位を含む態様では、アルキル鎖の一方または両方に存在する二重結合は、シスおよび/またはトランス立体配置でありうる。いくつかの態様では、R4およびR5は、ドデカトリエニル成分、テトラデカトリエニル成分、ヘキサデカトリエニル成分、オクタデカトリエニル成分、イコサトリエニル成分、およびフィタニル成分、ならびにそれらのアシル誘導体（例えばリノレノイル、γ-リノレノイル、フィタノイル等）からなる群より独立して選択される。場合によっては、オクタデカトリエニル成分は、リノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。好ましい態様では、R4およびR5はどちらもリノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。特定の態様では、R4およびR5は独立して、約16〜約22個の炭素原子の主鎖を含み、R4およびR5の一方または両方は、少なくとも3、4、5、または6個の不飽和部位を独立して含む。
いくつかの態様では、式VIで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式VIで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式VIで示される陽イオン性脂質は、以下からなる群から選択される構造を有する：
Figure 2012531469
。
さらに別の局面では、以下の構造を有する式VIIで示される陽イオン性脂質またはその塩が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中：R1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成し；R3は、存在しないか、または水素（H）、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4およびR5は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり；nは、0、1、2、3、または4である。
いくつかの態様では、R1およびR2は一緒になって、5個の炭素原子と1個の窒素原子とをもつ複素環式環を形成する。場合によっては、複素環式環は、オルト、メタ、および/またはパラ位でヒドロキシル基などの置換基で置換されている。好ましい態様では、nは1である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。さらなる態様では、R4およびR5は独立して、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルである。
ある態様では、R4およびR5は、ドデカジエニル成分、テトラデカジエニル成分、ヘキサデカジエニル成分、オクタデカジエニル成分、イコサジエニル成分、ドデカトリエニル成分、テトラデカトリエニル成分、ヘキサデカトリエニル成分、オクタデカトリエニル成分、イコサトリエニル成分、および上記の分岐アルキル基（例えばフィタニル成分）、ならびにそれらのアシル誘導体（例えばリノレオイル、リノレノイル、γ-リノレノイル、フィタノイル等）からなる群より独立して選択される。いくつかの場合には、オクタデカジエニル成分はリノレイル成分である。他の場合には、オクタデカトリエニル成分は、リノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。特定の態様では、R4およびR5はどちらもリノレイル成分、リノレニル成分、γ-リノレニル成分、またはフィタニル成分である。
いくつかの態様では、式VIIで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式VIIで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式VIIで示される陽イオン性脂質は、以下からなる群から選択される構造を有する：
Figure 2012531469
。
なおさらに別の局面では、以下の構造を有する式VIIIで示される陽イオン性脂質またはその塩が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中：R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、またはR1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成し；R3は、存在しないか、または水素（H）、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4およびR5は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり；nは、2、3、または4である。
いくつかの態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R1およびR2はどちらもメチル基である。別の好ましい態様では、nは2である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。さらなる態様では、R4およびR5は独立して、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルである。
ある態様では、R4およびR5は、ドデカジエニル成分、テトラデカジエニル成分、ヘキサデカジエニル成分、オクタデカジエニル成分、イコサジエニル成分、ドデカトリエニル成分、テトラデカトリエニル成分、ヘキサデカトリエニル成分、オクタデカトリエニル成分、イコサトリエニル成分、および上記の分岐アルキル基（例えばフィタニル成分）、ならびにそれらのアシル誘導体（例えばリノレオイル、リノレノイル、γ-リノレノイル、フィタノイル等）からなる群より独立して選択される。いくつかの場合には、オクタデカジエニル成分はリノレイル成分である。他の場合には、オクタデカトリエニル成分はリノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。特定の態様では、R4およびR5はどちらもリノレイル成分、リノレニル成分、γ-リノレニル成分、またはフィタニル成分である。
いくつかの態様では、式VIIIで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式VIIIで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式VIIIで示される陽イオン性脂質は、以下からなる群から選択される構造を有する：
Figure 2012531469
。
別の局面では、以下の構造を有する、式IXで示される陽イオン性脂質またはその塩が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中：R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、またはR1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R3は、存在しないか、または水素(H)、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4およびR5は異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C24アルキル、C2-C24アルケニル、C2-C24アルキニル、またはC1-C24アシルであり；nは、0、1、2、3、または4である。
いくつかの態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R1およびR2はどちらもメチル基である。別の好ましい態様では、nは1である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。さらなる態様では、R4およびR5は異なり、独立して、置換されていてもよいC4-C20アルキル、C4-C20アルケニル、C4-C20アルキニル、またはC4-C20アシルである。
いくつかの態様では、R4は、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり、R5は、置換されていてもよいC4-C10アルキル、C4-C10アルケニル、C4-C10アルキニル、またはC4-C10アシルである。場合によっては、R4は、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルであり、R5は、置換されていてもよいC4-C8もしくはC6アルキル、C4-C8もしくはC6アルケニル、C4-C8もしくはC6アルキニル、またはC4-C8もしくはC6アシルである。
他の態様では、R4は、置換されていてもよいC4-C10アルキル、C4-C10アルケニル、C4-C10アルキニル、またはC4-C10アシルであり、R5は、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルである。場合によっては、R4は、置換されていてもよいC4-C8もしくはC6アルキル、C4-C8もしくはC6アルケニル、C4-C8もしくはC6アルキニル、またはC4-C8もしくはC6アシルであり、R5は、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルである。
特定の態様では、R4はリノレイル成分であり、R5は、C6アルキル成分、C6アルケニル成分、オクタデシル成分、オレイル成分、リノレニル成分、γ-リノレニル成分、またはフィタニル成分である。他の態様では、R4またはR5の一方はフィタニル成分である。
いくつかの態様では、式IXで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式IXで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸)塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式IXで示される陽イオン性脂質は、以下からなる群から選択される構造を有する非対称脂質である：
Figure 2012531469
。
さらに別の局面では、以下の構造を有する式Xで示される陽イオン性脂質またはその塩が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中：R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、またはR1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R3は、存在しないか、または水素(H)、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4およびR5は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり、ここで、R4およびR5の少なくとも一方は、少なくとも4個の不飽和部位または置換されているC12-C24アルキルを含み；nは、0、1、2、3、または4である。
いくつかの態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R1およびR2はどちらもメチル基である。別の好ましい態様では、nは1である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。さらなる態様では、R4およびR5は独立して、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルである。
R4およびR5の少なくとも一方が分岐アルキル基（例えば置換C12-C24アルキル基)を含む態様では、分岐アルキル基は、少なくとも1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上）のC1-C6アルキル置換基を有するC12-C24アルキルを含みうる。特定の態様では、分岐アルキル基は、1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個）のC1-C4アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、またはブチル）置換基を有するC12-C20またはC14-C22アルキルを含む。好ましくは、分岐アルキル基は、フィタニル(3,7,11,15-テトラメチル-ヘキサデカニル)成分を含む。
代替の態様では、R4およびR5の少なくとも一方は、分岐アシル基（例えば置換C12-C24アシル基)を含む。場合によっては、分岐アシル基は、少なくとも1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上）のC1-C6アルキル置換基を有するC12-C24アシルを含みうる。特定の態様では、分岐アシル基は、1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個）のC1-C4アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、またはブチル）置換基を有するC12-C20またはC14-C22アシルを含む。好ましくは、分岐アシル基は、フィタノイル(3,7,11,15-テトラメチル-ヘキサデカノイル)成分を含む。
R4およびR5の少なくとも一方が少なくとも4個の不飽和部位を含む態様では、アルキル鎖の一方または両方に存在する二重結合は、シスおよび/またはトランス立体配置でありうる。特定の態様では、R4およびR5は独立して、4、5、または6個の不飽和部位を含む。いくつかの場合には、R4は、4、5、または6個の不飽和部位を含み、R5は、0、1、2、3、4、5、または6個の不飽和部位を含む。他の場合には、R4は、0、1、2、3、4、5、または6個の不飽和部位を含み、R5は、4、5、または6個の不飽和部位を含む。好ましい態様では、R4およびR5の両方は、4、5、または6個の不飽和部位を含む。特定の態様では、R4およびR5は独立して、約18〜約24個の炭素原子の主鎖を含み、R4およびR5の一方または両方は独立して、少なくとも4、5、または6個の不飽和部位を含む。
いくつかの態様では、式Xで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式Xで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式Xで示される陽イオン性脂質は、以下からなる群から選択される構造を有する：
Figure 2012531469
。
なおさらに別の局面では、以下の構造を有する式XIで示される陽イオン性脂質またはその塩が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中：R1は、水素（H）または-(CH2)q-NR6R7R8であり、ここで：R6およびR7は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、またはR6およびR7は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R8は、存在しないか、または水素(H)であるか、またはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；qは、0、1、2、3、または4であり；R2は、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、またはC2-C6アルキニルであり；R3は、存在しないか、または水素(H)、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4およびR5は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり；nは、0、1、2、3、または4である。
いくつかの態様では、R2は、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。ある態様では、R4およびR5は独立して、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルである。
さらなる態様では、R6およびR7は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR8は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR8は水素である。代替の態様では、R8は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。
好ましい態様では、R1は水素であり、R2はエチル基である。別の好ましい態様では、R6およびR7はどちらもメチル基である。場合によっては、nは1である。ある他の場合には、qは1である。
ある態様では、R4およびR5は、ドデカジエニル成分、テトラデカジエニル成分、ヘキサデカジエニル成分、オクタデカジエニル成分、イコサジエニル成分、ドデカトリエニル成分、テトラデカトリエニル成分、ヘキサデカトリエニル成分、オクタデカトリエニル成分、イコサトリエニル成分、および上記の分岐アルキル基（例えばフィタニル成分）、ならびにそれらのアシル誘導体（例えばリノレオイル、リノレノイル、γ-リノレノイル、フィタノイル等)からなる群より独立して選択される。いくつかの場合には、オクタデカジエニル成分はリノレイル成分である。他の場合には、オクタデカトリエニル成分は、リノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。特定の態様では、R4およびR5はどちらもリノレイル成分、リノレニル成分、γ-リノレニル成分、またはフィタニル成分である。
いくつかの態様では、式XIで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式XIで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式XIで示される陽イオン性脂質は、以下からなる群から選択される構造を有する：
Figure 2012531469
。
別の局面では、以下の構造を有する式XIIで示される陽イオン性脂質またはその塩が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中：R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、またはR1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R3は、存在しないか、または水素（H）、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4、R5、およびR6は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり；nは、0、1、2、3、または4である。
いくつかの態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R1およびR2はどちらもメチル基である。別の好ましい態様では、nは1である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。さらなる態様では、R4、R5、およびR6は独立して、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルである。
ある態様では、R4、R5、およびR6は独立して、ドデカジエニル成分、テトラデカジエニル成分、ヘキサデカジエニル成分、オクタデカジエニル成分、イコサジエニル成分、ドデカトリエニル成分、テトラデカトリエニル成分、ヘキサデカトリエニル成分、オクタデカトリエニル成分、イコサトリエニル成分、および上記の分岐アルキル基（例えばフィタニル成分）、ならびにそれらのアシル誘導体（例えばリノレオイル、リノレノイル、γ-リノレノイル、フィタノイル等）からなる群より選択される。いくつかの場合には、オクタデカジエニル成分はリノレイル成分である。他の場合には、オクタデカトリエニル成分は、リノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。特定の態様では、R4、R5、およびR6は、全てリノレイル成分、リノレニル成分、γ-リノレニル成分、またはフィタニル成分である。
いくつかの態様では、式XIIで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式XIIで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式XIIで示される陽イオン性脂質は、以下からなる群から選択される構造を有する：
Figure 2012531469
。
さらに別の局面では、以下の構造を有する式XIIIで示される陽イオン性脂質またはその塩が、本発明に有用である：
Figure 2012531469
式中：R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであり、またはR1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R3は、存在しないか、または水素（H）、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4およびR5は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり；qは、0、1、2、3、または4であり；YおよびZは、同一であるかまたは異なり、独立してO、S、またはNHであり、ここで、qが1であり、R1およびR2はどちらもメチル基であり、R4およびR5がどちらもリノレイル成分であり、YおよびZがどちらも0である場合、アルキルアミノ基は、YまたはZに隣接する2個の炭素の一方（すなわち、6員環の「4」または「6」位に）に結合している。
いくつかの態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R1およびR2はどちらもメチル基である。別の好ましい態様では、qは2である。特定の態様では、YおよびZはどちらも酸素（O）である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。さらなる態様では、R4およびR5は独立して、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルである。
他の態様では、R4およびR5は、ドデカジエニル成分、テトラデカジエニル成分、ヘキサデカジエニル成分、オクタデカジエニル成分、イコサジエニル成分、ドデカトリエニル成分、テトラデカトリエニル成分、ヘキサデカトリエニル成分、オクタデカトリエニル成分、イコサトリエニル成分、および上記の分岐アルキル基（例えばフィタニル成分）、ならびにそれらのアシル誘導体（例えばリノレオイル、リノレノイル、γ-リノレノイル、フィタノイル等）からなる群より独立して選択される。いくつかの場合には、オクタデカジエニル成分はリノレイル成分である。他の場合には、オクタデカトリエニル成分は、リノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。特定の態様では、R4およびR5はどちらもリノレイル成分、リノレニル成分、γ-リノレニル成分、またはフィタニル成分である。
式XIIIで示されるアルキルアミノ頭基は、R1およびR2がどちらもメチル基である例示的な態様における下記6員環の「4」または「5」位に結合していてもよい：
Figure 2012531469
。
さらなる態様では、式XIIIの6員環は、1、2、3、4、または5個の独立して選択されたC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、C1-C6アルコキシル、またはヒドロキシル置換基で置換されていてもよい。特定の一態様では、6員環は、1、2、3、4、または5個の独立して選択されたC1-C4アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、またはブチル）置換基で置換されている。置換6員環(「4」位に結合したメチル基）を有し、R1およびR2がどちらもメチル基である、式XIIIで示される陽イオン性脂質の例示的な態様を下に示す：
Figure 2012531469
。
特定の態様では、式XIIIで示される陽イオン性脂質は、出発物質として2-ヒドロキシメチル-1,4-ブタンジオールおよび1,3,5-ペンタントリオール（または3-メチル-1,3,5-ペンタントリオール）を使用して合成することができる。
いくつかの態様では、式XIIIで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩)を形成する。特定の一態様では、式XIIIで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式XIIIで示される陽イオン性脂質は、以下の構造を有する：
Figure 2012531469
。
なおさらに別の局面では、本発明は、以下の構造を有する式XIVで示される陽イオン性脂質またはその塩を提供する：
Figure 2012531469
式中：R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、またはR1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1もしくは2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；R3は、存在しないか、または水素（H）、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4およびR5は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり、ここで、R4およびR5の少なくとも一方は、少なくとも1個の不飽和部位をトランス（E）立体配置で含み；m、n、およびpは、同一であるかまたは異なり、独立して0、1、または2のいずれかであるが、但し、m、n、およびpは同時に0であることはなく；qは、0、1、2、3、または4であり；YおよびZは、同一であるかまたは異なり、独立してO、S、またはNHである。
いくつかの態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R1およびR2はどちらもメチル基である。別の好ましい態様では、qは2である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。さらなる態様では、R4およびR5は独立して、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルである。
ある態様では、R4およびR5の少なくとも一方は、さらに、1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上の不飽和部位をシスおよび/またはトランス立体配置で含む。いくつかの場合には、R4およびR5は、本明細書記載の置換または非置換のアルキルまたはアシル基のいずれかから独立して選択され、ここで、R4およびR5の少なくとも一方または両方は、少なくとも1、2、3、4、5、または6個の不飽和部位をトランス立体配置で含む。特定の一態様では、R4およびR5は、約12〜約22個の炭素原子（例えば12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個の炭素原子）の主鎖を独立して含み、R4およびR5の一方または両方は、少なくとも1、2、3、4、5、または6個の不飽和部位をトランス立体配置で独立して含む。いくつかの好ましい態様では、R4およびR5の少なくとも一方は、(E)-ヘプタデセイル(heptadeceyl)成分を含む。他の好ましい態様では、R4およびR5はどちらも(E)-8-ヘプタデセイル成分である。
いくつかの態様では、式XIVで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式XIVで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式XIVで示される陽イオン性脂質は、以下の構造を有する：
Figure 2012531469
。
別の局面では、本発明は、以下の構造を有する式XVで示される陽イオン性脂質またはその塩を提供する：
Figure 2012531469
式中：R1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O）、およびそれらの混合物からなる群より選択される1または2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成し；R3は、存在しないか、または水素(H)、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；R4およびR5は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、C12-C24アルキニル、またはC12-C24アシルであり；m、n、およびpは、同一であるかまたは異なり、独立して0、1、または2のいずれかであるが、但し、m、n、およびpは同時に0であることはなく；qは、0、1、2、3、または4であり；YおよびZは、同一であるかまたは異なり、独立してO、S、またはNHである。
いくつかの態様では、R1およびR2は一緒になって、5個の炭素原子と1個の窒素原子とをもつ複素環式環を形成する。場合によっては、複素環式環は、オルト、メタ、および/またはパラ位でヒドロキシル基などの置換基で置換されている。好ましい態様では、qは2である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。さらなる態様では、R4およびR5は独立して、置換されていてもよいC12-C20もしくはC14-C22アルキル、C12-C20もしくはC14-C22アルケニル、C12-C20もしくはC14-C22アルキニル、またはC12-C20もしくはC14-C22アシルである。
ある態様では、R4およびR5は、ドデカジエニル成分、テトラデカジエニル成分、ヘキサデカジエニル成分、オクタデカジエニル成分、イコサジエニル成分、ドデカトリエニル成分、テトラデカトリエニル成分、ヘキサデカトリエニル成分、オクタデカトリエニル成分、イコサトリエニル成分、および上記の分岐アルキル基（例えばフィタニル成分）、ならびにそれらのアシル誘導体（例えばリノレオイル、リノレノイル、γ-リノレノイル、フィタノイル等）からなる群より独立して選択される。いくつかの場合には、オクタデカジエニル成分はリノレイル成分である。他の場合には、オクタデカトリエニル成分は、リノレニル成分またはγ-リノレニル成分である。特定の態様では、R4およびR5はどちらもリノレイル成分、リノレニル成分、γ-リノレニル成分、またはフィタニル成分である。
いくつかの態様では、式XVで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式XVで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式XVで示される陽イオン性脂質は、以下の構造を有する：
Figure 2012531469
。
さらに別の局面では、本発明は、以下の構造を有する式XVIで示される陽イオン性脂質またはその塩を提供する：
Figure 2012531469
式中：
R1およびR2は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、もしくはC2-C6アルキニルであるか、またはR1およびR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子と窒素（N）、酸素（O)、およびそれらの混合物からなる群より選択される1もしくは2個のヘテロ原子とをもつ置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；
R3は、存在しないか、または水素(H)、もしくはC1-C6アルキルであって第四級アミンを提供するかのいずれかであり；
R4およびR5は、同一であるかまたは異なり、独立して、置換C12-C24アルキルであり；
nは、0、1、2、3、または4である。
いくつかの態様では、R1およびR2は独立して、置換されていてもよいC1-C4アルキル、C2-C4アルケニル、またはC2-C4アルキニルである。好ましい態様では、R1およびR2はどちらもメチル基である。特定の一態様では、nは1である。別の特定の態様では、nは2である。他の態様では、pHが陽イオン性脂質のpKaを上回る場合にR3は存在せず、アミノ頭基がプロトン化されるようにpHが陽イオン性脂質のpKaを下回る場合にR3は水素である。代替の態様では、R3は、置換されていてもよいC1-C4アルキルであって第四級アミンを提供する。
R4およびR5の少なくとも一方が分岐アルキル基（例えば置換C12-C24アルキル基)を含む態様では、分岐アルキル基は、少なくとも1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上)のC1-C6アルキル置換基を有するC12-C24アルキルを含みうる。特定の態様では、分岐アルキル基は、1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個）のC1-C4アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、またはブチル）置換基を有するC12-C20またはC14-C22アルキルを含む。好ましくは、分岐アルキル基は、フィタニル(3,7,11,15-テトラメチル-ヘキサデカニル)成分を含む。特定の態様では、R4およびR5はどちらもフィタニル成分である。
代替の態様では、R4およびR5の少なくとも一方は、分岐アシル基（例えば置換C12-C24アシル基）を含む。場合によっては、分岐アシル基は、少なくとも1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上）のC1-C6アルキル置換基を有するC12-C24アシルを含みうる。特定の態様では、分岐アシル基は、1〜6個（例えば1、2、3、4、5、6個）のC1-C4アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、またはブチル）置換基を有するC12-C20またはC14-C22アシルを含む。好ましくは、分岐アシル基は、フィタノイル(3,7,11,15-テトラメチル-ヘキサデカノイル)成分を含む。特定の態様では、R4およびR5はどちらもフィタノイル成分である。
いくつかの態様では、式XVIで示される陽イオン性脂質は、一つまたは複数の陰イオンと共に塩（好ましくは結晶性の塩）を形成する。特定の一態様では、式XVIで示される陽イオン性脂質は、そのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、それは、好ましくは結晶性の塩である。
特に好ましい態様では、式XVIで示される陽イオン性脂質は、以下からなる群から選択される構造を有する：
Figure 2012531469
。
式V〜XVIで示される陽イオン性脂質の合成は、本明細書および代理人整理番号020801-009420PCを有する、2010年6月30日に出願された「Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Therapeutic Agents」という名称のPCT公開第PCT/CA2010/＿＿号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
本発明の脂質粒子に含まれうる他の陽イオン性脂質またはその塩には、非限定的に、1,2-ジオエイル(dioeyl)カルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DO-C-DAP）、1,2-ジミリストレオイル-3-ジメチルアミノプロパン（DMDAP）、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアミノプロパンクロリド（DOTAP.Cl）、ジリノレイルメチル-3-ジメチルアミノプロピオネート（DLin-M-K-DMA；DLin-M-DMAとしても知られている）、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DODMA）、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DSDMA）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール（DC-Chol）、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、3-ジメチルアミノ-2-(コレスタ-5-エン-3-β-オキシブタン-4-オキシ)-1-(cis,cis-9,12-オクタデカジエノキシ)プロパン（CLinDMA）、2-[5'-(コレスタ-5-エン-3-β-オキシ)-3'-オキサペントキシ)-3-ジメチ(dimethy)-1-(cis,cis-9',1-2'-オクタデカジエノキシ)プロパン（CpLinDMA）、N,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン（DMOBA）、1,2-N,N'-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DOcarbDAP）、1,2-N,N'-ジリノレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLincarbDAP）、1,2-ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-C-DAP）、1,2-ジリノレイオキシ(dilinoleyoxy)-3-(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン（DLin-DAC）、1,2-ジリノレイオキシ-3-モルホリノプロパン（DLin-MA）、1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパン（DLinDAP）、1,2-ジリノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-S-DMA）、1-リノレオイル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-2-DMAP）、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩（DLin-TMA.Cl）、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩（DLin-TAP.Cl）、1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N-メチルピペラジノ)プロパン（DLin-MPZ）、3-(N,N-ジリノレイルアミノ)-1,2-プロパンジオール（DLinAP）、3-(N,N-ジオレイルアミノ)-1,2-プロパンジオ(propanedio)（DOAP）、1,2-ジリノレイルオキソ-3-(2-N,N-ジメチルアミノ)エトキシプロパン（DLin-EG-DMA）、およびそれらの混合物が含まれる。
本明細書記載の一つまたは複数の陽イオン性脂質との併用に適した追加的な陽イオン性脂質には非限定的に、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、2010年5月12日に出願された「Novel Cationic Lipids and Methods of Use Thereof」という名称の米国仮特許出願第61/334,104号、ならびに国際公開公報第2010/054401号、同第2010/054405号、同第2010/054406号、および同第2010/054384号に記載されているような(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート（DLin-M-C3-DMAまたは「MC3」）およびそのある種のアナログなどの陽イオン性脂質が含まれる。
DO-C-DAP、DMDAP、DOTAP.Cl、DLin-M-K-DMAなどの陽イオン性脂質および追加的な陽イオン性脂質の合成は、国際公開公報第2010/042877号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
DLin-C-DAP、DLinDAC、DLinMA、DLinDAP、DLin-S-DMA、DLin-2-DMAP、DLinTMA.Cl、DLinTAP.Cl、DLinMPZ、DLinAP、DOAP、およびDLin-EG-DMAなどの陽イオン性脂質、および追加的な陽イオン性脂質の合成は、国際公開公報第09/086558号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
CLinDMAなどの陽イオン性脂質および追加的な陽イオン性脂質の合成は、米国特許出願公開第20060240554号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
いくつかの他の陽イオン性脂質および関係するアナログの合成は、米国特許第5,208,036号；同第5,264,618号；同第5,279,833号；同第5,283,185号；同第5,753,613号；および同第5,785,992号；ならびに国際公開公報第96/10390号に記載されており、それらの開示は、それぞれ全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。追加的に、例えばLIPOFECTIN（登録商標）（DOTMAおよびDOPEを含む、GIBCO/BRLから入手可能）；LIPOFECTAMINE（登録商標）（DOSPAおよびDOPEを含む、GIBCO/BRLから入手可能）；およびTRANSFECTAM（登録商標）（DOGSを含む、Promega Corp.から入手可能）などの陽イオン性脂質のいくつかの市販調製物を使用することができる。
いくつかの態様では、陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約45mol%〜約90mol%、約45mol%〜約85mol%、約45mol%〜約80mol%、約45mol%〜約75mol%、約45mol%〜約70mol%、約45mol%〜約65mol%、約45mol%〜約60mol%、約45mol%〜約55mol%、約50mol%〜約90mol%、約50mol%〜約85mol%、約50mol%〜約80mol%、約50mol%〜約75mol%、約50mol%〜約70mol%、約50mol%〜約65mol%、約50mol%〜約60mol%、約55mol%〜約65mol%または約55mol%〜約70mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。
ある好ましい態様では、陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約50mol%〜約58mol%、約51mol%〜約59mol%、約51mol%〜約58mol%、約51mol%〜約57mol%、約52mol%〜約58mol%、約52mol%〜約57mol%、約52mol%〜約56mol%、または約53mol%〜約55mol%（またはまたはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。
ある他の好ましい態様では、陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約54mol%〜約62mol%、約55mol%〜約61mol%、約55mol%〜約60mol%、約55mol%〜約59mol%、約56mol%〜約62mol%、約56mol%〜約61mol%、約56mol%〜約60mol%、または約57mol%〜約59mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。
特定の態様では、陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約50mol%、51mol%、52mol%、53mol%、54mol%、55mol%、56mol%、57mol%、58mol%、59mol%、60mol%、61mol%、62mol%、63mol%、64mol%、または65mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。ある他の態様では、陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の（少なくとも）約66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、または90mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。
本発明の脂質粒子中に存在する陽イオン性脂質のパーセンテージは目標量であり、製剤中に存在する陽イオン性脂質の実際量は、例えば±5mol%だけ変動しうることを理解されたい。典型的には、7：54脂質粒子（例えばSNALP）製剤において、陽イオン性脂質の目標量は54.06mol%であるが、陽イオン性脂質の実際量は、目標量の±5mol%、±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%、または±0.1mol%であってよく、製剤の差分は他の脂質構成要素から構成されている（合計すると粒子中に存在する総脂質の100mol%になる）。
C. 非陽イオン性脂質
本発明の脂質粒子（例えばSNALP）に使用される非陽イオン性脂質は、安定な複合体を生成することができる任意の様々な中性非荷電性、双性イオン性、または陰イオン性脂質でありうる。
非陽イオン性脂質の非限定的な例には、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ESM）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルグリセロール（POPG）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート（DOPE-mal）、ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイル-ホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-ホスファチジルエタノールアミン（DEPE）、ステアロイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（SOPE）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、およびそれらの混合物などのリン脂質が含まれる。他のリン脂質であるジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミンもまた使用することができる。これらの脂質のアシル基は、好ましくは、C10-C24炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。
非陽イオン性脂質の追加的な例には、コレステロールなどのステロールおよびその誘導体が含まれる。コレステロール誘導体の非限定的な例には、5α-コレスタノール、5β-コプロスタノール、コレステリル-(2'-ヒドロキシ)-エチルエーテル、コレステリル-(4'-ヒドロキシ)-ブチルエーテル、および6-ケトコレスタノールなどの極性アナログ；5α-コレスタン、コレステノン、5α-コレスタノン、5β-コレスタノン、およびコレステリルデカノエートなどの非極性アナログ；ならびにそれらの混合物が含まれる。好ましい態様では、コレステロール誘導体は、コレステリル-(4'-ヒドロキシ)-ブチルエーテルなどの極性アナログである。コレステリル-(2'-ヒドロキシ)-エチルエーテルの合成は、国際公開公報第09/127060号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
いくつかの態様では、脂質粒子（例えばSNALP）中に存在する非陽イオン性脂質は、一つまたは複数のリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含むか、またはそれから成る。他の態様では、脂質粒子（例えばSNALP）中、例えばコレステロール不含の脂質粒子製剤中に存在する非陽イオン性脂質は、一つまたは複数のリン脂質を含むか、またはそれから成る。さらに他の態様では、脂質粒子（例えばSNALP）中、例えばリン脂質不含の脂質粒子製剤中に存在する非陽イオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体を含むか、またはそれから成る。
本発明における使用に適する非陽イオン性脂質の他の例には、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシンオレエート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン-ラウリルスルフェート、アルキル-アリールスルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリンなどのリン不含の脂質が含まれる。
いくつかの態様では、非陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約10mol%〜約60mol%、約20mol%〜約55mol%、約20mol%〜約45mol%、約20mol%〜約40mol%、約25mol%〜約50mol%、約25mol%〜約45mol%、約30mol%〜約50mol%、約30mol%〜約45mol%、約30mol%〜約40mol%、約35mol%〜約45mol%、約37mol%〜約42mol%、または約30mol%、31mol%、32mol%、33mol%、34mol%、35mol%、36mol%、37mol%、38mol%、39mol%、40mol%、41mol%、42mol%、43mol%、44mol%、もしくは45mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。
脂質粒子がリン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物を含有する態様では、混合物は、粒子中に存在する総脂質の最大約40mol%、45mol%、50mol%、55mol%、または60mol%を構成しうる。
いくつかの態様では、混合物中のリン脂質構成要素は、粒子中に存在する総脂質の約2mol%〜約20mol%、約2mol%〜約15mol%、約2mol%〜約12mol%、約4mol%〜約15mol%、または約4mol%〜約10mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成しうる。ある好ましい態様では、混合物中のリン脂質構成要素は、粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%、約5mol%〜約9mol%、約5mol%〜約8mol%、約6mol%〜約9mol%、約6mol%〜約8mol%、または約5mol%、6mol%、7mol%、8mol%、9mol%、もしくは10mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む7：54脂質粒子製剤は、例えば粒子中に存在する総脂質の約32mol%（またはその任意の割合）のコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物中に、約7mol%（またはその任意の割合）のDPPCまたはDSPCなどのリン脂質を含みうる。
他の態様では、混合物中のコレステロール構成要素は、粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約45mol%、約25mol%〜約40mol%、約30mol%〜約45mol%、約30mol%〜約40mol%、約27mol%〜約37mol%、約25mol%〜約30mol%、または約35mol%〜約40mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成しうる。ある好ましい態様では、混合物中のコレステロール構成要素は、粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約35mol%、約27mol%〜約35mol%、約29mol%〜約35mol%、約30mol%〜約35mol%、約30mol%〜約34mol%、約31mol%〜約33mol%、または約30mol%、31mol%、32mol%、33mol%、34mol%、もしくは35mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。他の態様では、混合物中のコレステロール構成要素は、粒子中に存在する総脂質の約36、37、38、39、40、41、42、43、44、または45mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。典型的には、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む7：54脂質粒子製剤は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約7mol%（またはその任意の割合）のDPPCまたはDSPCなどのリン脂質との混合物中に、約32mol%（またはその任意の割合）のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含みうる。
脂質粒子がリン脂質を含まない態様では、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の最大約25mol%、30mol%、35mol%、40mol%、45mol%、50mol%、55mol%、または60mol%を構成しうる。
いくつかの態様では、リン脂質不含の脂質粒子製剤中のコレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約45mol%、約25mol%〜約40mol%、約30mol%〜約45mol%、約30mol%〜約40mol%、約31mol%〜約39mol%、約32mol%〜約38mol%、約33mol%〜約37mol%、約35mol%〜約45mol%、約30mol%〜約35mol%、約35mol%〜約40mol%、または約30mol%、31mol%、32mol%、33mol%、34mol%、35mol%、36mol%、37mol%、38mol%、39mol%、40mol%、41mol%、42mol%、43mol%、44mol%、もしくは45mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成しうる。非限定的な例として、7：58脂質粒子製剤は、粒子中に存在する総脂質の約35mol%（またはその任意の割合）のコレステロールを含みうる。
本発明の脂質粒子中に存在する非陽イオン性脂質のパーセンテージは目標量であり、製剤中に存在する非陽イオン性脂質の実際量は、例えば±5mol%だけ変動しうることを理解されたい。例えば、7：54脂質粒子（例えばSNALP）製剤において、リン脂質の目標量は6.75mol%であり、コレステロールの目標量は32.43mol%であるが、リン脂質の実際量は、目標量の±2mol%、±1.5mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%、または±0.1mol%であってよく、コレステロールの実際量は、目標量の±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%、または±0.1mol%であってよく、製剤の差分は他の脂質構成要素から構成されている（合計すると粒子中に存在する総脂質の100mol%になる）。
D. 脂質コンジュゲート
陽イオン性および非陽イオン性脂質に加えて、本発明の脂質粒子（例えばSNALP)は、さらに脂質コンジュゲートを含みうる。結合脂質は、粒子の凝集を防止する点で有用である。適切な結合脂質には、非限定的に、PEG-脂質コンジュゲート、POZ-脂質コンジュゲート、ATTA-脂質コンジュゲート、陽イオン性ポリマー-脂質コンジュゲート（CPL）、およびそれらの混合物が含まれる。ある態様では、粒子は、CPLと一緒にPEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートを含む。
好ましい態様では、脂質コンジュゲートはPEG-脂質である。PEG-脂質の例には、非限定的に、例えば国際公開公報第05/026372号に記載されたようなジアルキルオキシプロピルにカップリングしたPEG(PEG-DAA)、例えば米国特許出願公開第20030077829号および同第2005008689号に記載されたようなジアシルグリセロールにカップリングしたPEG（PEG-DAG）、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質にカップリングしたPEG（PEG-PE）、例えば米国特許第5,885,613号に記載されたようなセラミドに結合したPEG、コレステロールまたはその誘導体に結合したPEG、およびそれらの混合物が含まれる。これらの特許文書の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
本発明における使用に適する追加的なPEG-脂質には、非限定的に、mPEG2000-1,2-ジ-O-アルキル-sn3-カルボモイル(carbomoyl)グリセリド（PEG-C-DOMG）が含まれる。PEG-C-DOMGの合成は、国際公開公報第09/086558号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。さらに追加的な、適切なPEG-脂質コンジュゲートには、非限定的に、1-[8'-(1,2-ジミリストイル-3-プロパンオキシ)-カルボキサミド-3',6'-ジオキサオクタニル]カルバモイル-ω-メチル-ポリ(エチレングリコール)（2KPEG-DMG）が含まれる。2KPEG-DMGの合成は、米国特許第7,404,969号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
PEGは、2個の末端ヒドロキシル基を有するエチレンPEG繰り返しユニットの直鎖水溶性ポリマーである。PEGは、その分子量によって分類され；例えば、PEG2000は約2,000ダルトンの平均分子量を有し、PEG5000は約5,000ダルトンの平均分子量を有する。PEGは、Sigma Chemical Co.および他の会社から市販されており、それには、非限定的に以下のものが含まれる：モノメトキシポリエチレングリコール（MePEG-OH）、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシネート（MePEG-S）、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシンイミジルスクシネート（MePEG-S-NHS）、モノメトキシポリエチレングリコール-アミン（MePEG-NH2）、モノメトキシポリエチレングリコール-トレシレート(tresylate)（MePEG-TRES）、モノメトキシポリエチレングリコール-イミダゾリル-カルボニル（MePEG-IM）、ならびに末端メトキシ基の代わりに末端ヒドロキシル基を含有するそのような化合物（例えば、HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO-PEG-NH2等）。米国特許第6,774,180号および同第7,053,150号に記載されたPEGのような他のPEG（例えばmPEG（20KDa）アミン）もまた、本発明のPEG-脂質コンジュゲートを調製するために有用である。これらの特許の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。加えて、モノメトキシポリエチレングリコール-酢酸（MePEG-CH2COOH）は、例えばPEG-DAAコンジュゲートを含めたPEG-脂質コンジュゲートを調製するために特に有用である。
本明細書に記載されたPEG-脂質コンジュゲートのPEG成分は、約550ダルトン〜約10,000ダルトンの範囲の平均分子量を含みうる。場合によっては、PEG成分は、約750ダルトン〜約5,000ダルトン（例えば、約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、約1,500ダルトン〜約3,000ダルトン、約750ダルトン〜約3,000ダルトン、約750ダルトン〜約2,000ダルトン等)の平均分子量を有する。他の場合には、PEG成分は、約550ダルトン〜約1000ダルトン、約250ダルトン〜約1000ダルトン、約400ダルトン〜約1000ダルトン、約600ダルトン〜約900ダルトン、約700ダルトン〜約800ダルトン、または約200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは1000ダルトンの平均分子量を有する。好ましい態様では、PEG成分は、約2,000ダルトンまたは約750ダルトンの平均分子量を有する。
場合によっては、PEGは、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基により置換されていてもよい。PEGは、脂質に直接結合されても、または、リンカー成分を介して脂質に連結していてもよい。例えば、エステル不含のリンカー成分およびエステル含有リンカー成分を含めた、脂質にPEGをカップリングするのに適した任意のリンカー成分を使用することができる。好ましい態様では、リンカー成分は、エステル不含のリンカー成分である。本明細書で使用される「エステル不含のリンカー成分」という用語は、カルボン酸エステル結合(-OC(O)-)を含有しないリンカー成分を指す。適切なエステル不含のリンカー成分には、非限定的に、アミド(-C(O)NH-)、アミノ(-NR-)、カルボニル(-C(O)-)、カルバメート(-NHC(O)O-)、尿素(-NHC(O)NH-)、ジスルフィド(-S-S-)、エーテル(-O-)、スクシニル(-(O)CCH2CH2C(O)-)、スクシンアミジル(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、エーテル、ジスルフィド、およびそれらの組み合わせ（カルバメートリンカー成分とアミドリンカー成分の両方を含有するリンカー等）が含まれる。好ましい態様では、カルバメートリンカーは、脂質にPEGをカップリングするために使用される。
他の態様では、エステル含有リンカー成分は、脂質にPEGをカップリングするために使用される。適切なエステル含有リンカー成分には、例えば、カーボネート(-OC(O)O-)、スクシノイル、リン酸エステル(-O-(O)POH-O-)、スルホン酸エステル、およびそれらの組み合わせが含まれる。
様々な鎖長および飽和度をもつ様々なアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンを、PEGに結合させて、脂質コンジュゲートを形成させることができる。そのようなホスファチジルエタノールアミンは、市販されているか、または、当業者に公知の従来技法を用いて単離もしくは合成することができる。C10〜C20の範囲の炭素鎖長を有する飽和または不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンが好ましい。モノまたはジ不飽和脂肪酸、および飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との混合物を有するホスファチジルエタノールアミンもまた、使用することができる。適切なホスファチジルエタノールアミンには、非限定的に、ジミリストイル-ホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、およびジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン（DSPE）が含まれる。
「ATTA」または「ポリアミド」という用語には非限定的に、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、米国特許第6,320,017号および同第6,586,559号に記載された化合物が含まれる。これらの化合物には、以下の式を有する化合物が含まれる：
Figure 2012531469
式中、Rは、水素、アルキルおよびアシルからなる群より選択されるメンバーであり；R1は、水素およびアルキルからなる群より選択されるメンバーであるか；または、RおよびR1およびそれらが結合している窒素は、アジド成分を形成してもよく；R2は、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリールおよびアミノ酸側鎖から選択される基のメンバーであり；R3は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノおよびNR4R5（ここで、R4およびR5は独立して、水素またはアルキルである）からなる群より選択されるメンバーであり；nは4〜80であり；mは2〜6であり；pは1〜4であり；qは0または1である。本発明の化合物に他のポリアミドを使用できることは、当業者に明らかであろう。
「ジアシルグリセロール」または「DAG」という用語には、エステル結合によりグリセロールの1位および2位に結合している、どちらも独立して2〜30個の炭素を有する2本の脂肪族アシル鎖R1およびR2を有する化合物が含まれる。アシル基は、飽和していてもよく、様々な不飽和度を有してもよい。適切なアシル基には、非限定的に、ラウロイル(C12)、ミリストイル(C14)、パルミトイル(C16)、ステアロイル(C18)、およびイコソイル(C20)が含まれる。好ましい態様では、R1およびR2は同一であり、すなわちR1およびR2はどちらもミリストイル（すなわちジミリストイル）であり、R1およびR2は、両方ともステアロイル（すなわちジステアロイル）等である。ジアシルグリセロールは、次の一般式を有する：
Figure 2012531469
。
「ジアルキルオキシプロピル」または「DAA」という用語には、どちらも独立して2〜30個の炭素を有する2本のアルキル鎖R1およびR2を有する化合物が含まれる。アルキル基は、飽和であるか、または様々な不飽和度を有しうる。ジアルキルオキシプロピルは、次の一般式を有する：
Figure 2012531469
。
好ましい態様では、PEG-脂質は、次式を有するPEG-DAAコンジュゲートである：
Figure 2012531469
式中、R1およびR2は独立して選択され、約10〜約22個の炭素原子を有する長鎖アルキル基であり；PEGは、ポリエチレングリコールであり；Lは、上記のエステル不含のリンカー成分またはエステル含有リンカー成分である。長鎖アルキル基は、飽和または不飽和でありうる。適切なアルキル基には、非限定的に、デシル(C10)、ラウリル(C12)、ミリスチル(C14)、パルミチル(C16)、ステアリル(C18)、およびイコシル(C20)が含まれる。好ましい態様では、R1およびR2は同じであり、すなわちR1およびR2はどちらもミリスチル（すなわちジミリスチル）であり、R1およびR2はどちらもステアリル（すなわちジステアリル）等である。
上記式XXにおいて、PEGは、約550ダルトン〜約10,000ダルトンの範囲の平均分子量を有する。場合によっては、PEGは、約750ダルトン〜約5,000ダルトン（例えば、約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、約1,500ダルトン〜約3,000ダルトン、約750ダルトン〜約3,000ダルトン、約750ダルトン〜約2,000ダルトン等）の平均分子量を有する。他の場合には、PEG成分は、約550ダルトン〜約1000ダルトン、約250ダルトン〜約1000ダルトン、約400ダルトン〜約1000ダルトン、約600ダルトン〜約900ダルトン、約700ダルトン〜約800ダルトン、または約200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは1000ダルトンの平均分子量を有する。好ましい態様では、PEGは、約2,000ダルトンまたは約750ダルトンの平均分子量を有する。PEGは、任意でアルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基で置換されていてもよい。ある態様では、末端ヒドロキシル基は、メトキシまたはメチル基で置換されている。
好ましい態様では、「L」は、エステル不含のリンカー成分である。適切なエステル不含のリンカーには、非限定的に、アミドリンカー成分、アミノリンカー成分、カルボニルリンカー成分、カルバメートリンカー成分、尿素リンカー成分、エーテルリンカー成分、ジスルフィドリンカー成分、スクシンアミジルリンカー成分、およびそれらの組み合わせが含まれる。好ましい態様では、エステル不含のリンカー成分は、カルバメートリンカー成分である（すなわち、PEG-C-DAAコンジュゲート)。別の好ましい態様では、エステル不含のリンカー成分は、アミドリンカー成分である（すなわち、PEG-A-DAAコンジュゲート）。さらに別の好ましい態様では、エステル不含のリンカー成分は、スクシンアミジルリンカー成分である（すなわちPEG-S-DAAコンジュゲート）。
特定の態様では、PEG-脂質コンジュゲートは、以下から選択される：
Figure 2012531469
。
PEG-DAAコンジュゲートは、当業者に公知の標準技法および試薬を用いて合成される。PEG-DAAコンジュゲートは、様々なアミド結合、アミン結合、エーテル結合、硫黄結合、カルバメート結合、および尿素結合を含有することが認識されているであろう。当業者は、これらの結合を形成するための方法および試薬が周知であり、容易に入手可能であることを認識しているであろう。例えば、March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992)； Larock、COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989)；およびFurniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY、5th ed. (Longman 1989)を参照されたい。存在する任意の官能基はPEG-DAAコンジュゲートの合成の異なる時点で保護および脱保護を必要としうることも、認められているであろう。当業者は、そのような技法が周知であることを認識しているであろう。例えば、Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991)を参照されたい。
好ましくは、PEG-DAAコンジュゲートは、PEG-ジデシルオキシプロピル(C10)コンジュゲート、PEG-ジラウリルオキシプロピル(C12)コンジュゲート、PEG-ジミリスチルオキシプロピル(C14)コンジュゲート、PEG-ジパルミチルオキシプロピル(C16)コンジュゲート、またはPEG-ジステアリルオキシプロピル(C18)コンジュゲートである。これらの態様では、PEGは、好ましくは約750ダルトンの平均分子量を有する。特に好ましい態様では、PEG-脂質コンジュゲートはPEG750-C-DMAを含み、ここで「750」は、PEGの平均分子量を意味し、「C」は、カルバメートリンカー成分を意味し、「DMA」は、ジミリスチルオキシプロピルを意味する。特定の態様では、PEGの末端ヒドロキシル基は、メチル基で置換されている。当業者は、本発明のPEG-DAAコンジュゲートに他のジアルキルオキシプロピルを使用することができることを容易に認識しているであろう。
前記に加えて、PEGの代わりに他の親水性ポリマーを使用できることは、当業者に容易に明らかになろう。PEGの代わりに使用できる適切なポリマーの例には、非限定的に、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが含まれる。
前記構成要素に加えて、本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、さらに、陽イオン性ポリ(エチレングリコール)(PEG)脂質またはCPLを含みうる（例えば、Chen et al., Bioconj. Chem., 11:433-437 (2000)；米国特許第6,852,334号；国際公開公報第00/62813号を参照されたく、それらの開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる）。
適切なCPLには、式XXI：
A-W-Y (XXI)
[式中、A、W、およびYは、下記のとおりである]で示される化合物が含まれる。
式XXIに関して、「A」は、脂質アンカーとして作用する両親媒性脂質、中性脂質、または疎水性脂質などの脂質成分である。適切な脂質の例には、非限定的に、ジアシルグリセロリル(diacylglycerolyl)、ジアルキルグリセロリル(dialkylglycerolyl)、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパン、および1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが含まれる。
「W」は、親水性ポリマーまたはオリゴマーなどのポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは、親水性ポリマーは、非免疫原性であるか、または低い固有免疫原性をもつ生体適合性ポリマーである。または、親水性ポリマーは、適切なアジュバントと共に使用すした場合に弱抗原性でありうる。適切な非免疫原性ポリマーには、非限定的に、PEG、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸/ポリグリコール酸コポリマー、およびその組み合わせが含まれる。好ましい態様では、ポリマーは、約250〜約7,000ダルトンの分子量を有する。
「Y」は、ポリ陽イオン性成分である。ポリ陽イオン性成分という用語は、選択されたpHで、好ましくは生理的pHで、正電荷、好ましくは少なくとも+2の電荷を有する化合物、誘導体、または官能基を指す。適切なポリ陽イオン性成分には、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、およびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸およびそれらの誘導体；スペルミン；スペルミジン；陽イオン性デンドリマー；ポリアミン；ポリアミン糖；およびアミノ多糖が含まれる。ポリ陽イオン性成分は、構造が直鎖テトラリシンのような直鎖、分岐またはデンドリマー性でありうる。ポリ陽イオン性成分は、選択されたpH値で約+2から約+15の間の正電荷、好ましくは約+2から約+12の間の正電荷、さらに好ましくは約+2から約+8の間の正電荷を有する。用いるべきポリ陽イオン性成分の選択は、所望の粒子適用の種類により決定することができる。
ポリ陽イオン性成分の電荷は、粒子成分全体の周囲に分布しても、その代わりに粒子成分の特定の一領域における別個の濃度の電荷密度、例えば電荷スパイクであってもよい。電荷密度が粒子上に分布している場合、電荷密度は等分布または非等分布してもよい。ポリ陽イオン性成分の電荷分布の全ての変形が、本発明により包含される。
脂質「A」および非免疫原性ポリマー「W」は、様々な方法で、好ましくは共有結合により結合させることができる。「A」と「W」を共有結合させるために、当業者に公知の方法を使用することができる。適切な結合には、非限定的に、アミド結合、アミン結合、カルボキシル結合、カーボネート結合、カルバメート結合、エステル結合、およびヒドラゾン結合が含まれる。「A」および「W」は、結合を達成するために相補的官能基を有さなければならないことは、当業者に明らかであろう。一方が脂質上に、もう一方がポリマー上にあるこれらの二つの基の反応は、所望の結合を提供しうる。例えば、脂質がジアシルグリセロールであり、末端ヒドロキシルを例えばNHSおよびDCCで活性化して活性エステルを形成させ、次に、アミノ基を含有するポリマー、例えばポリアミドと反応させる場合（例えば、米国特許第6,320,017号および同第6,586,559号を参照されたく、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる）、これら二つの基の間にアミド結合が形成されうる。
場合によっては、ポリ陽イオン成分に、ターゲティングリガンドまたはカルシウムと錯体化するためのキレート化成分などのリガンドを結合させることができる。好ましくは、リガンドが結合した後に陽イオン成分は正の電荷を維持する。場合によっては、結合されるリガンドは、正電荷を有する。適切なリガンドには、非限定的に、反応性官能基を有する化合物または装置が含まれ、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生体親和性化合物、生体材料、生体高分子、生物医用装置、分析的に検出可能な化合物、治療活性化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激剤、放射標識、蛍光発生素、ビオチン、薬物、ハプテン、DNA、RNA、多糖、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、他のターゲティング成分または毒素が含まれる。
いくつかの態様では、脂質コンジュゲート（例えばPEG-脂質）は、粒子中に存在する総脂質の約2mol%〜約15mol%、約2mol%〜約12mol%、約5mol%〜約12mol%、約4mol%〜約15mol%、または約4mol%〜約10mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成しうる。ある好ましい態様では、脂質コンジュゲート（例えばPEG-脂質）は、粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%、約5mol%〜約9mol%、約5mol%〜約8mol%、約6mol%〜約9mol%、約6mol%〜約8mol%、または約5mol%、6mol%、7mol%、8mol%、9mol%、もしくは10mol%（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）を構成する。
本発明の脂質粒子中に存在する脂質コンジュゲート（例えばPEG-脂質）のパーセンテージは目標量であり、製剤中に存在する脂質コンジュゲートの実際量は、例えば±2mol%だけ変動しうることを理解されたい。典型的には、7：54脂質粒子（例えばSNALP）製剤において、脂質コンジュゲートの目標量は6.76mol%であるが、脂質コンジュゲートの実際量は、目標量の±2mol%、±1.5mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%、または±0.1mol%であってよく、製剤の差分は他の脂質構成要素から構成されている(合計すると粒子中に存在する総脂質の100mol%になる）。
当業者は、用いられる脂質コンジュゲートに応じて、かつ脂質粒子が膜融合性となる比率に応じて、脂質コンジュゲートの濃度が変動しうることを認識しているであろう。
脂質コンジュゲートの組成および濃度を制御することによって、脂質粒子からの脂質コンジュゲートの交換比率、次に脂質粒子が膜融合性となる比率を制御することができる。例えば、PEG-DAAコンジュゲートを脂質コンジュゲートとして使用する場合、例えば、脂質コンジュゲートの濃度を変動させることにより、PEGの分子量を変動させることにより、またはPEG-DAAコンジュゲート上のアルキル基の鎖長および飽和度を変動させることにより、脂質粒子が膜融合性となる比率を変動させることができる。加えて、例えばpH、温度、イオン強度等を含めた他の変動要因を用いて、脂質粒子が膜融合性となる比率を変動および/または制御することができる。脂質粒子が膜融合性となる比率を制御するために用いることができる他の方法は、本開示を解釈するときに当業者に明らかになるであろう。また、脂質コンジュゲートの組成および濃度を制御することによって、脂質粒子（例えばSNALP）の大きさを制御することができる。
V. 脂質粒子の調製
干渉RNA（例えばsiRNA）などの活性剤または治療剤が粒子の脂質成分内に封入されて分解から保護される、本発明の脂質粒子、例えばSNALPは、連続混合法、直接希釈プロセス、およびインライン希釈プロセスを非限定的に含む、当技術分野で公知の任意の方法により形成させることができる。
特定の態様では、陽イオン性脂質は、本明細書記載の一つまたは複数の陽イオン性脂質またはその塩を、単独でまたは他の陽イオン性脂質と組み合わせて含みうる。他の態様では、非陽イオン性脂質は、卵スフィンゴミエリン（ESM）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、1-パルミトイル-2-オレオイル-ホスファチジルコリン（POPC）、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン（DPPC）、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、14：0 PE（1,2-ジミリストイル-ホスファチジルエタノールアミン（DMPE））、16：0 PE（1,2-ジパルミトイル- ホスファチジルエタノールアミン（DPPE））、18：0 PE（1,2-ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン（DSPE））、18：1 PE（1,2-ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（DOPE））、18：1 トランスPE（1,2-ジエライドイル-ホスファチジルエタノールアミン（DEPE））、18：0〜18：1 PE（1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(SOPE））、16：0〜18：1 PE（1-パルミトイル-2-オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（POPE））、ポリエチレングリコールベースのポリマー（例えば、PEG2000、PEG5000、PEG修飾ジアシルグリセロール、またはPEG修飾ジアルキルオキシプロピル）、コレステロール、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせである。
ある態様では、本発明は、連続混合法により、例えば核酸（例えば干渉RNA)を含む水溶液を第1リザーバー中に供給する工程、有機脂質溶液を第2リザーバー中に供給する工程（ここで、有機脂質溶液中に存在する脂質は、有機溶媒中、例えばエタノールなどの低級アルカノール中に可溶化される）、および、有機脂質溶液が水溶液と混合されて核酸を内部に封入している脂質小胞（例えばリポソーム）を実質的に瞬時に生成するように、有機脂質溶液と水溶液を混合する工程を含むプロセスにより生成された、核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を提供する。このプロセスおよびこのプロセスを実施するための装置は、米国特許出願公開第20040142025号に詳細に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
脂質および緩衝溶液を混合チャンバー内のような混合環境に連続的に導入する操作により、緩衝溶液による脂質溶液の連続希釈が行われ、これによって、混合の際実質的に瞬時に脂質小胞が生成される。本明細書で使用される「脂質溶液を緩衝溶液で連続的に希釈する」という語句(および変形)は、一般に、脂質溶液が水和プロセスにおいて小胞産生を達成するために十分な力で十分に迅速に希釈されることを意味する。核酸を含む水溶液を有機脂質溶液と混合することにより、有機脂質溶液は、緩衝溶液（すなわち水溶液）の存在下で連続的な段階希釈を受けて、核酸-脂質粒子を生成する。
連続混合法を用いて形成された核酸-脂質粒子は、典型的には、約30nm〜約150nm、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、約70nm〜約100nm、約80nm〜約100nm、約90nm〜約100nm、約70〜約90nm、約80nm〜約90nm、約70nm〜約80nm、約120nm未満、110nm未満、100nm未満、90nm未満、もしくは80nm未満、または約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、もしくは150nm（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）の大きさを有する。そのように形成した粒子は凝集せず、所望により均一な粒子径に到達するように整粒される。
別の態様では、本発明は、脂質小胞（例えばリポソーム）溶液を形成させる工程、ならびに制御された量の希釈緩衝液を含む収集容器に該脂質小胞溶液を直ちに直接導入する工程を含む、直接希釈プロセスを介して生成した核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を提供する。好ましい局面では、収集容器は、希釈を容易にするように収集容器の内容物を撹拌するように設計された一つまたは複数の要素を含む。一局面では、収集容器中に存在する希釈緩衝液の量は、それに導入された脂質小胞溶液の体積に実質的に等しい。非限定的な例として、脂質小胞の45%エタノール溶液は、等体積の希釈緩衝液が入った収集容器中に導入された場合に、有利なことに、より小さな粒子をもたらしうる。
さらに別の態様では、本発明は、希釈緩衝液が入った第3のリザーバーを第2の混合領域と流体連通するインライン希釈プロセスを介して生成した核酸-脂質粒子（例えばSNALP）を提供する。この態様では、第1混合領域中で形成した脂質小胞（例えばリポソーム）溶液が、第2混合領域中で希釈緩衝液と直ちに直接混合される。好ましい局面では、第2混合領域は、脂質小胞溶液および希釈緩衝液の流れが、180°対向する流れとして合流するように配置されたT-連結基を含むが、例えば約27°〜約180°（例えば約90°）のより浅い角度を提供する連結器を使用することもできる。ポンプ機構は、第2混合領域に制御可能な緩衝液流を送達する。一局面では、第2混合領域に提供される希釈緩衝液の流速は、第1混合領域からそこに導入される脂質小胞溶液の流速と実質的に等しいように制御される。この態様は、有利なことに、第2混合領域中で脂質小胞溶液と混合している希釈緩衝液の流れをと、したがって、第2混合プロセス全体にわたる緩衝液中の脂質小胞溶液の濃度のさらなる制御を可能にする。そのような希釈緩衝液の流速の制御により、有利なことに、低濃度でより小さな粒子径の形成が可能になる。
これらの直接希釈プロセスおよびインライン希釈プロセスを実施するためのこれらのプロセスおよび装置は、米国特許出願公開第20070042031号に詳細に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
直接希釈プロセスおよびインライン希釈プロセスを用いて形成した核酸-脂質粒子は、典型的には約30nm〜約150nm、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、約70nm〜約100nm、約80nm〜約100nm、約90nm〜約100nm、約70〜約90nm、約80nm〜約90nm、約70nm〜約80nm、約120nm未満、110nm未満、100nm未満、90nm未満、もしくは80nm未満、または約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、もしくは150nm（またはその任意の割合もしくはその中の範囲）の大きさを有する。このように形成した粒子は凝集せず、任意で整粒されて、均一な粒子径を達成する。
必要であれば、本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、リポソームを整粒するために利用可能な任意の方法により整粒することができる。整粒は、所望の大きさの範囲および比較的狭い粒子径分布を達成するために行うことができる。
所望の大きさに粒子を整粒するためにいくつかの技法を利用することができる。リポソームのために使用され、本発明の粒子に等しく適用可能な一つの製粒方法は、米国特許第4,737,323号に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。槽内超音波処理またはプローブ超音波処理により粒子懸濁物を超音波処理することで、約50nm未満まで粒子径を漸減させる。ホモジナイゼーションは、より大きな粒子をより小さな粒子に断片化するための剪断エネルギーに依存する別の方法である。典型的なホモジナイゼーション手順では、典型的には約60から約80nmの間の選択された粒子径が観察されるまで標準的な乳剤ホモジナイザーにより粒子が再循環される。両方の方法において、従来のレーザー光粒子径判別またはQELSにより、粒子径分布をモニターすることができる。
細孔性ポリカーボネート膜または非対称なセラミック膜を通した粒子の押出もまた、粒子径を低減させ相対的に明確な径分布とするために有効な方法である。典型的には、所望の粒子径分布が達成されるまで、膜を1回または複数回通過させて懸濁液を循環させる。逐次より小さな孔の膜を通過させて粒子を押出し、径を徐々に縮小することができる。
いくつかの態様では、粒子中に存在する核酸は例えば、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、米国特許出願第09/744,103号に記載されているように予め濃縮される。
他の態様では、方法は、さらに、本発明の組成物を使用して細胞のリポフェクションを行うために有用な非脂質性ポリ陽イオンを添加することを含む。適切な非脂質性ポリ陽イオンの例には、臭化ヘキサジメトリン（POLYBRENE（登録商標）の商品名でAldrich Chemical Co.(Milwaukee, Wisconsin, USA)から販売）または他のヘキサジメトリン塩が含まれる。他の適切なポリ陽イオンには、例えば、ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リシン、ポリ-D-リシン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミンの塩が含まれる。これらの塩が添加されるのは、好ましくは粒子が形成した後である。
いくつかの態様では、形成した核酸-脂質粒子（例えばSNALP）中の核酸/脂質比（質量/質量比）は、約0.01〜約0.2、約0.05〜約0.2、約0.02〜約0.1、約0.03〜約0.1、または約0.01〜約0.08の範囲であり得る。出発物質(投入量)の比もまた、この範囲内に入る。他の態様では、粒子調製物は、総脂質10mgあたり約400μgの核酸を使用するか、または約0.01〜約0.08の、さらに好ましくは核酸50μgあたり1.25mgの総脂質に対応する約0.04の核酸対脂質質量比を用いる。他の好ましい態様では、粒子は、約0.08の核酸：脂質質量比を有する。
他の態様では、形成した核酸-脂質粒子（例えばSNALP）中の脂質対核酸比（質量/質量比）は、約1（1：1）〜約100（100：1）、約5（5：1）〜約100（100：1）、約1（1：1）〜約50（50：1）、約2（2：1）〜約50（50：1）、約3（3：1）〜約50（50：1）、約4（4：1）〜約50（50：1）、約5（5：1）〜約50（50：1）、約1（1：1）〜約25（25：1）、約2（2：1）〜約25（25：1）、約3（3：1）〜約25（25：1）、約4（4：1）〜約25（25：1）、約5（5：1）〜約25（25：1）、約5（5：1）〜約20（20：1)、約5（5：1）〜約15（15：1）、約5（5：1）〜約10（10：1）の範囲、または約5（5：1）、6（6：1）、7（7：1）、8（8：1）、9（9：1）、10（10：1）、11（11：1）、12（12：1）、13（13：1）、14（14：1）、15（15：1）、16（16：1）、17（17：1）、18（18：1）、19（19：1）、20（20：1）、21（21：1）、22（22：1）、23（23：1）、24（24：1）、もしくは25（25：1）、またはその任意の割合もしくはその中の範囲である。出発物質(投入量)の比もまた、この範囲内に入る。
前述のように、結合脂質には、さらにCPLが含まれてもよい。SNALP-CPL（CPL含有SNALP）を製造するための様々な一般法を本明細書に述べる。二つの一般的な技法には、「挿入後」技法、すなわち例えば予め形成したSNALPへのCPLの挿入、および例えばSNALP形成段階の間に、CPLを脂質混合物中に含ませる「標準」技法が含まれる。挿入後技法は、主にSNALP二重層膜の外面にCPLを有するSNALPを生じ、一方で、標準技法は、内面および外面の両方にCPLを有するSNALPを提供する。この方法は、特に、リン脂質（コレステロールを含有しうる）から作られた小胞およびPEG-脂質（PEG-DAAおよびPEG-DAGなど）を含有する小胞にも有用である。SNALP-CPLの製造方法は、例えば、米国特許第5,705,385号；同第6,586,410号；同第5,981,501号；同第6,534,484号；および同第6,852,334号；米国特許出願公開第20020072121号；ならびに国際公開公報第00/62813号に教示されており、それらの開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
VI. キット
本発明はまた、キット形式の脂質粒子（例えばSNALP）を提供する。いくつかの態様では、キットは、脂質粒子の様々な要素（例えば、核酸などの活性剤または治療剤、および粒子の個別の脂質構成要素）が入るように区画化されている容器を備える。好ましくは、キットは、本発明の脂質粒子（例えばSNALP）が入る容器（例えばバイアルまたはアンプル）を備え、ここで粒子は、本明細書に示されるプロセスの一つにより生成される。ある態様では、キットは、エンドソーム膜不安定化剤（例えばカルシウムイオン）をさらに含んでもよい。キットは、典型的には本発明の粒子組成物を、薬学的に許容されうる担体中の懸濁物としてまたは脱水された形態のいずれかで、それらの再水和（凍結乾燥されている場合）および投与のための説明書と共に含む。
本明細書に説明するように、本発明の脂質粒子は、関心対象の特定の組織、器官、または腫瘍を優先的に標的とするように調整することができる。例えば、下記実施例に示すように、肝臓腫瘍および肝臓外部の腫瘍などの固形腫瘍を優先的に標的とするために、7：54脂質粒子（例えば7：54 DLinDMA SNALP）製剤を使用できることが見出されたのは驚くべきことである。好ましい態様では、本発明のキットは、懸濁物としてまたは脱水された形態で容器中に存在する、腫瘍指向性脂質粒子（例えば7：54 DLinDMA SNALP）を備える。
ある他の場合には、粒子のターゲティングをさらに増強するために、ターゲティング成分を脂質粒子の表面に結合させることが理想的でありうる。脂質(本発明の粒子に使用されるものなど）にターゲティング成分（例えば抗体、タンパク質等）を結合させる方法は、当業者に公知である。
VII. 脂質粒子の投与
本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、一度形成すれば、細胞への活性剤または治療剤（例えば、干渉RNAなどの核酸）の導入に有用である。したがって本発明はまた、核酸（例えば干渉RNA）などの活性剤または治療剤を細胞に導入するための方法を提供する。好ましくは、細胞は、例えば固形腫瘍に存在する細胞などの腫瘍細胞である。ある態様では、細胞は、腫瘍形成または細胞形質転換に関連する一つまたは複数の血管新生因子および/または成長因子を生成する非腫瘍細胞でありうる。この方法は、上記の粒子をまず形成させる工程、次に、細胞への活性剤または治療剤の送達が起こるために十分な時間、粒子を細胞（例えば固形腫瘍細胞）と接触させる工程により、インビトロまたはインビボで実施される。
本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、それらが混合または接触するほぼ全ての細胞型に吸着することができる。それらの粒子は、一度吸着すると細胞の一部によりエンドサイトーシスされるか、脂質を細胞膜と交換するか、または細胞と融合するかのいずれかでありうる。粒子の活性剤または治療剤（例えば核酸）成分の輸送または組込みは、これらの経路のいずれか一つにより実施することができる。特に、融合が起こると、粒子の膜は細胞膜に組込まれ、粒子の内容物は細胞内液と混和する。
本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、単独で、または投与経路および標準的な薬学的診療により選択される薬学的に許容されうる担体（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）と混合して、投与することができる。一般に、生理緩衝食塩水（例えば135〜150mM NaCl）が薬学的に許容されうる担体として用いられよう。他の適切な担体には、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の糖タンパク質を安定性強化のために含む、例えば、水、緩衝水、0.4%食塩水、0.3%グリシン等が含まれる。追加的に適切な担体は、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)に記載されている。本明細書で使用される「担体」には、任意および全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁物、コロイド等が含まれる。「薬学的に許容されうる」という語句は、ヒトに投与したときにアレルギー性または類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。
薬学的に許容されうる担体は、一般に、脂質粒子の形成の後に添加される。したがって、脂質粒子（例えばSNALP）が形成した後に、生理緩衝食塩水などの薬学的に許容されうる担体中で粒子を希釈することができる。
薬学的製剤中の粒子の濃度は広く変動してよく、すなわち、約0.05重量%未満から、通常は約2〜5重量%であるかまたは少なくとも約2〜5重量%で、約10〜90重量%程度まで変動してもよく、選択された特定の投与様式に従って、主として流体体積、粘度等により選択されよう。例えば、治療に付随する流体負荷量を低下させるために、濃度を増大させることができる。これは、アテローム性動脈硬化症に関連するうっ血性心不全または重症高血圧症を有する患者に特に望ましいことがある。または、投与部位の炎症を和らげるために、刺激性脂質から構成される粒子を低濃度に希釈することもできる。
本発明の薬学的組成物は、従来の周知の滅菌技法により滅菌することができる。水溶液は、使用のために包装してもよく、無菌条件下で濾過して凍結乾燥し、その凍結乾燥調製物を投与前に無菌水溶液と混合してもよい。組成物は、適切な生理的条件に必要とされるような、薬学的に許容されうる補助物質、例えばpH調整緩衝剤、浸透圧調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムを含有してもよい。追加的に、粒子懸濁液は、保存時のフリーラジカル障害および脂質過酸化障害から脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。α-トコフェロールなどの親油性フリーラジカルクエンチャーおよびフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異的キレート剤が適切である。
いくつかの態様では、本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、特に、干渉RNA配列（例えばsiRNA）を含む一つまたは複数の核酸を治療的に送達するための方法に有用である。特に、一つまたは複数の標的核酸配列または関心対象の遺伝子の転写および/または翻訳を下方制御またはサイレンシングすることによって、哺乳動物（例えばマウスなどのげっ歯類またはヒト、チンパンジー、もしくはサルなどの霊長類）における疾患または障害を治療するためのインビトロおよびインビボ方法を提供することが、本発明の目的である。非限定的な例として、本発明の方法は、哺乳動物対象の腫瘍または他の新生物に干渉RNA（例えばsiRNA）をインビボ送達するために有用である。ある態様では、疾患または障害は、遺伝子の発現および/または過剰発現と関連し、遺伝子の発現または過剰発現は、干渉RNA（例えばsiRNA）によって低減される。ある他の態様では、治療的有効量の脂質粒子は、哺乳動物に投与することができる。いくつかの場合には、干渉RNA（例えばsiRNA）を製剤化してSNALPとし、該粒子を、そのような治療を必要とする患者に投与する。他の場合には、細胞が患者から取り出され、干渉RNAがインビトロ送達され（例えば、本明細書記載のSNALPを使用して）、その細胞が患者に再注入される。
A. インビボ投与
インビボ療法のための全身送達、例えば、循環などの身体システムを介した遠位標的細胞への治療用核酸の送達は、その開示が全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる、国際公開公報第05/007196号、同第05/121348、同第05/120152号、および同第04/002453号に記載されたものなどの核酸-脂質粒子を使用して達成される。本発明はまた、血清中でヌクレアーゼ分解から核酸を保護し、非免疫原性で、サイズが小さく、反復投薬に適した、完全に封入された脂質粒子を提供する。
インビボ投与に関して、投与は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、注射、経口投与、吸入（例えば、鼻腔内または気管内）、経皮適用、または直腸投与によって行われうる。投与は、単回または分割投与により達成することができる。薬学的組成物は、非経口的、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内に投与することができる。いくつかの態様では、薬学的組成物は、ボーラス注射により静脈内または腹腔内投与される（例えば、米国特許第5,286,634号を参照）。細胞内核酸送達はまた、Straubringer et al., Methods Enzymol., 101:512 (1983); Mannino et al., Biotechniques, 6:682 (1988); Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6:239 (1989)；およびBehr, Acc. Chem. Res., 26:274 (1993)に述べられている。脂質ベースの治療薬を投与するなお他の方法は、例えば、米国特許第3,993,754号；同第4,145,410号；同第4,235,871号；同第4,224,179号；同第4,522,803号；および同第4,588,578号に記載されている。脂質粒子は、疾患部位での直接注射により、または疾患部位から遠位での部位での注射により投与することができる（例えば、Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71(1994)を参照）。上記参照の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
本発明の脂質粒子（例えばSNALP）が静脈内投与される態様では、粒子の総注射用量の少なくとも約5%、10%、15%、20%、または25%が、注射の約8、12、24、36、または48時間後の血漿中に存在する。他の態様では、脂質粒子の総注射用量の約20%、30%、40%より多く、および約60%、70%または80%程度が、注射の約8、12、24、36、または48時間後に血漿中に存在する。場合によっては、複数の粒子の約10%より多くが、投与の約1時間後に哺乳動物の血漿中に存在する。ある他の場合には、脂質粒子の存在は、粒子の投与の少なくとも約1時間後に検出可能である。ある態様では、核酸などの治療剤の存在は、投与の約8、12、24、36、48、60、72または96時間後に固形腫瘍などの腫瘍細胞から検出可能である。他の態様では、干渉RNA（例えばsiRNA）による標的配列の発現の下方制御は、投与の約8、12、24、36、48、60、72または96時間後に検出可能である。さらに他の態様では、干渉RNA（例えばsiRNA）による標的配列の発現の下方制御は、腫瘍細胞において優先的に起こる。さらなる態様では、投与部位から近位もしくは遠位の細胞中または腫瘍細胞中の干渉RNA（例えばsiRNA）の存在または作用は、投与の約12、24、48、72、もしくは96時間後、または約6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26、もしくは28日後に検出可能である。追加的な態様では、本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、非経口または腹腔内投与される。
本発明の組成物は、吸入（例えば鼻腔内または気管内）により投与するために、単独で、または他の適切な構成要素と組み合わせて、エアロゾル製剤へと作製することができる（すなわち、その製剤は「噴霧する」ことができる）（Brigham et al., Am. J Sci., 298:278 (1989)を参照）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容されうる噴射剤内に配置することができる。
ある態様では、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および/または他のエアロゾル送達用ビヒクルにより送達することができる。核酸組成物を鼻エアロゾルスプレーにより肺に直接送達するための方法は、例えば米国特許第5,756,353号および同第5,804,212号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂およびリゾホスファチジル-グリセロール化合物を用いた薬物の送達（米国特許第5,725,871号）もまた、薬学的分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluoroetheylene）支持マトリックスの形態における経粘膜薬物送達は、米国特許第5,780,045号に記載されている。上記特許の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路などによる非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および意図されたレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有しうる水性および非水性の等張無菌注射剤、ならびに懸濁化剤、溶解補助剤、粘稠化剤、安定化剤、および保存料を含みうる水性および非水性無菌懸濁剤が含まれる。本発明の実施において、組成物は、好ましくは例えば静脈内注入により、経口的、局所的、腹腔内、膀胱内、または髄腔内に投与される。
一般に脂質粒子製剤は、静脈内投与する場合に、適切な薬学的担体を用いて製剤化される。本発明の組成物および方法に、多数の薬学的に許容されうる担体を用いることができる。本発明に使用するのに適した製剤は、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed.(1985)に見出される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、0.4%食塩水、0.3%グリシンなどを使用することができ、それらの担体は、安定性を高めるためにアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の糖タンパク質を含んでもよい。一般に、薬学的に許容されうる担体として、生理緩衝食塩水（135〜150mM NaCl）が用いられるが、他の適切な担体でも十分であり得る。これらの組成物は、濾過などの従来のリポソーム滅菌技法により滅菌することができる。これらの組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされるような、pH調整緩衝剤、浸透圧調整剤、加湿薬等の薬学的に許容されうる補助物質、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含有してもよい。これらの組成物は、上に言及した技法を使用して滅菌してもよく、その代わりに、滅菌条件下で製造してもよい。結果として得られた水溶液は、使用のために包装してもよく、無菌条件下での濾過および凍結乾燥を行い、投与前に凍結乾燥した調製物を無菌水溶液と混合してもよい。
ある適用では、本明細書に開示された脂質粒子は、個体に経口投与することにより送達することができる。粒子に賦形剤を混ぜ込んで、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、ロゼンジ、エリキシル剤、洗口剤、懸濁剤、口腔スプレー剤、シロップ剤、ウエハース等の形態で使用することができる（例えば、米国特許第5,641,515号、同第5,580,579号、および同第5,792,451を参照されたく、それらの開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる）。これらの経口剤形はまた、以下を含有しうる：結合剤、ゼラチン；賦形剤、滑沢剤、および/または着香料。単位剤形がカプセルの場合、それは、上記物質に加えて液体担体を含有してもよい。様々な他の物質を、コーティング剤として、またはその他の方法で投薬単位の物理的形態を修飾するために、存在させてもよい。当然ながら、任意の単位剤形を調製する際に使用される任意の物質は、薬学的に純粋で、用いられる量で実質的に無毒であるべきである。
典型的には、これらの経口製剤は、少なくとも約0.1%またはそれ以上の脂質粒子を含有しうるが、粒子のパーセンテージは、当然ながら変動してもよく、好都合には製剤の合計重量または体積の約1%または2%から、約60%または70%またはそれ以上の間でありうる。当然、治療的に有用な各組成物中の粒子の量は、適切な投薬量が得られるような様式で任意の所定単位用量の化合物中に調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間、および他の薬理学的考察などの要因が、そのような薬学的製剤を調製する当業者によって考慮され、そのように、様々な投薬量および治療方式が望ましいことがある。
経口投与に適した製剤は以下からなってよい：（a）液剤、例えば水、食塩水、またはPEG400などの希釈剤中に懸濁した、核酸（例えば干渉RNA）などのパッケージされた治療剤の有効量、（b）それぞれ核酸（例えば干渉RNA）などの治療剤の所定量を液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして含有するカプセル剤、サシェ（sachet）、または錠剤；（c）適切な液体中の懸濁剤；および（d）適切な乳剤。錠剤の剤形は、一つまたは複数の乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色料、増量剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存料、矯味剤、色素、崩壊剤、および薬学的に適合されうる担体を含みうる。ロゼンジの剤形は、矯味剤、例えばスクロース中に核酸（例えば干渉RNA）などの治療剤を含み得、同様に、パステル剤は、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤中に治療剤を含み、乳剤、ゲル剤等は、治療剤に加えて、当技術分野で公知の担体を含有し得る。
それらの別の使用例では、脂質粒子は、幅広い局所剤形に混ぜ込むことができる。例えば、SNALPなどの核酸-脂質粒子を含有する懸濁物は、ゲル剤、油剤、乳剤、局所クリーム剤、パスタ剤、軟膏、ローション剤、フォーム、ムース等として製剤化および投与することができる。
本発明の脂質粒子の医薬製剤を調製する場合、空の粒子または核酸などの治療剤が外面に結合した粒子を低減または除去するために精製された大量の粒子を用いることが好ましい。
本発明の方法は、様々な宿主で実施することができる。好ましい宿主には、霊長類（例えばヒトおよびチンパンジーならびに他の非ヒト霊長類）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類（例えばラットおよびマウス）、ウサギ、およびブタなどの哺乳動物種が含まれる。
投与される粒子の量は、治療剤（例えば核酸）と脂質の比、使用される特定の治療剤（例えば核酸）、治療される疾患または障害、患者の年齢、体重、および状態、ならびに実施者の判断に左右されうるが、一般に約0.01から約50mg/kg体重の間、好ましくは約0.1から約5mg/kg体重の間、または投与（例えば注射）1回あたり粒子約108〜1010個であり得る。
B. インビトロ投与
インビトロ適用に関して、核酸（例えば干渉RNA）などの治療剤の送達は、植物起源であっても動物起源であっても、脊椎動物であっても無脊椎動物であっても、いずれの組織または種類であっても、培養されている任意の細胞に対して行われうる。好ましい態様では、細胞は、動物細胞、さらに好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞（例えば腫瘍細胞）である。
インビトロで実施される場合に、細胞と脂質粒子との間の接触は、生物学的に適合されうる培地中で行われる。粒子の濃度は、特定の適用に応じて広く変動するが、一般に約1μmolから約10mmolの間である。脂質粒子を用いた細胞の治療は、一般に、生理的温度(約37℃）で、約1〜48時間、好ましくは約2〜4時間の期間だけ実施される。
好ましい態様の一群では、脂質粒子懸濁物は、約103〜約105個/ml、さらに好ましくは約2×104個/mlの細胞密度を有する、60〜80%集密の平板培養された細胞に添加される。細胞に添加される懸濁物の濃度は、好ましくは約0.01〜0.2μg/ml、さらに好ましくは約0.1μg/mlである。
必要とされうる範囲の細胞の組織培養は、当技術分野において周知である。例えば、Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3rd Ed., Wiley-Liss, New York (1994), Kuchler et al., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977)、およびそこに引用された参考文献は、細胞培養への一般的な手引きを提供する。培養される細胞系は、多くの場合に単層細胞の形態であるが、細胞懸濁物も使用される。
エンドソーム放出パラメーター（ERP）アッセイを用いて、SNALPまたは本発明の他の脂質粒子の送達効率を最適化することができる。ERPアッセイは、米国特許出願公開第20030077829号に詳細に記載されており、その開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。さらに詳細には、ERPアッセイの目的は、SNALPまたは他の脂質粒子の様々な陽イオン性脂質およびヘルパー脂質構成要素の作用を、結合/取込みまたはエンドソーム膜との融合/その不安定化にそれらが及ぼす相対作用に基づき判別することである。このアッセイにより、SNALPまたは他の脂質粒子の各構成要素が送達効率にどのように影響するかを定量的に決定するが可能になり、それによって、SNALPまたは他の脂質粒子が最適化される。通常は、ERPアッセイは、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）等）の発現を測定することから、場合によっては、発現プラスミドについて最適化されたSNALP製剤はまた、干渉RNAを封入するためにも適している。他の場合には、ERPアッセイは、干渉RNA（例えばsiRNA）の存在下または非存在下で標的配列の転写または翻訳の下方制御を測定するために適合させることができる。様々なSNALPまたは他の脂質粒子のそれぞれについてのERPを比較することにより、最適化されたシステムを、例えば、細胞中に最も多く取込まれるSNALPまたは他の脂質粒子を容易に決定することができる。
C. 脂質粒子を送達するための細胞
本発明の組成物および方法は、多種多様な種類の細胞をインビボおよびインビトロで治療するために使用される。好ましい態様では、核酸（例えば干渉RNA）などの活性剤または治療剤は、肝臓癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肛門癌細胞、胆管癌細胞、小腸癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、胆嚢癌細胞、膵臓癌細胞、虫垂癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、腎癌細胞、中枢神経系の癌細胞、神経膠芽腫細胞、皮膚癌細胞、リンパ腫細胞、絨毛癌腫瘍細胞、頭頸部癌細胞、骨原性肉腫細胞、および血液癌細胞を非限定的に含む癌細胞（例えば固形腫瘍の細胞）に優先的に送達される。
他の態様では、核酸（例えば干渉RNA）などの活性剤または治療剤は、肝細胞、造血前駆（幹）細胞、線維芽細胞、角化細胞、内皮細胞、骨格筋および平滑筋細胞、骨芽細胞、神経細胞、静止状態リンパ球、終末分化細胞、周期が遅いまたは停止した一次細胞、実質細胞、リンパ細胞、上皮細胞、骨細胞等に送達される。
核酸（例えば干渉RNA）を封入しているSNALPなどの脂質粒子のインビボ送達は、任意の細胞型の腫瘍細胞をターゲティングするのに適している。方法および組成物は、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類（例えばマウス、ラット、およびモルモット）、ウサギ、ブタ、および霊長類（例えばサル、チンパンジー、およびヒト）などの哺乳動物を含めた、多種多様な脊椎動物の腫瘍細胞に関して用いることができる。
D. 脂質粒子の検出
いくつかの態様では、本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、約1、2、3、4、5、6、7、8時間時点で、またはそれ以上の時点で、対象から検出可能である。他の態様では、本発明の脂質粒子（例えばSNALP）は、粒子の投与から約8、12、24、48、60、72、もしくは96時間後、または約6、8、10、12、14、16、18、19、22、24、25、もしくは28日後に対象から検出可能である。粒子の存在は、対象由来の細胞、組織、または他の生物学的試料から検出することができる。粒子は、例えば、粒子の直接検出により、干渉RNA（例えばsiRNA）配列などの治療用核酸の検出により、関心対象の標的配列の検出により（すなわち関心対象の配列の発現または発現低下を検出することにより）、またはその組み合わせにより、検出することができる。
1. 粒子の検出
SNALPなどの本発明の脂質粒子は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて検出することができる。例えば、当技術分野で周知の方法を用いて、脂質粒子の構成要素に標識を直接または間接的にカップリングさせることができる。必要な感度、脂質粒子構成要素との結合の容易さ、安定性の要件、ならびに利用可能な計測および廃棄の規定に応じて標識を選択して、多種多様な標識を使用することができる。適切な標識には、非限定的に、蛍光色素（例えば、フルオレセインならびにフルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびOregon Green（商標）などの誘導体；ロダミンおよびテキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の誘導体、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDye（商標）等のような分光標識；3H、125I、35S、14C、32P、33P等の放射標識；西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素；コロイド状金または色ガラスまたはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等のプラスチックビーズなどの分光比色測定用標識が含まれる。標識は、当技術分野で公知の任意の手段を用いて検出することができる。
2. 核酸の検出
核酸（例えば干渉RNA）は、本明細書において当業者に周知の任意のいくつかの手段により検出および定量される。核酸の検出は、サザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動、PCR、放射標識、シンチレーション計数、およびアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の方法により行うことができる。分光測定、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、および高拡散（hyperdiffusion）クロマトグラフィーなどの追加的な生化学分析法もまた、用いることができる。
核酸ハイブリダイゼーション形式の選択は、重要ではない。様々な核酸ハイブリダイゼーション形式が、当業者に公知である。例えば、よく見られる形式には、サンドイッチアッセイおよび競合または置換アッセイが含まれる。ハイブリダイゼーション技法は、一般に、例えば、"Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach," Eds. Hames and Higgins, IRL Press (1985)に記載されている。
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出途中の標的核酸を増大させる核酸増幅システムの使用により高めることができる。分子プローブとして使用するための配列の増幅に適した、またはその後のサブクローニングのための核酸断片の産生に適したインビトロ増幅技法は、公知である。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、Qβ-レプリカーゼ増幅、および他のRNAポリメラーゼ介在技法（例えばNASBA（商標））を含めた、そのようなインビトロ増幅法を介して当事者を十分に案内する技法の例は、Sambrook et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)；およびAusubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (2002)；ならびに米国特許第4,683,202号；PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990); Arnheim & Levinson (October 1, 1990), C&EN 36; The Journal Of NIH Research, 3:81 (1991); Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173 (1989); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874 (1990); Lomell et al., J. Clin. Chem., 35:1826 (1989); Landegren et al., Science, 241:1077 (1988); Van Brunt, Biotechnology, 8:291 (1990); Wu and Wallace, Gene, 4:560 (1989); Barringer et al., Gene, 89: 117 (1990);およびSooknanan and Malek, Biotechnology, 13:563 (1995)に見出される。インビトロ増幅した核酸をクローニングする改良法は、米国特許第5,426,039号に記載されている。当技術分野で記載されている他の方法は、核酸配列に基づく増幅（NASBA（商標）、Cangene, Mississauga, Ontario）およびQβ-レプリカーゼシステムである。選択された配列が存在する場合にのみ伸長または連結するようにPCRまたはLCRプライマーが設計されているこれらのシステムは、突然変異体を直接同定するために使用することができる。または、選択された配列は、一般に例えば非特異的PCRプライマーを用いて増幅することができ、その後、突然変異を示す特異的配列を求めて、増幅された標的領域を探索することができる。上記参照の開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。
例えばインビトロ増幅法におけるプローブとしての使用のための、遺伝子プローブとしての使用のための、または阻害剤構成要素としての核酸は、典型的には、Beaucage et al., Tetrahedron Letts., 22:1859 1862 (1981)により記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法により、例えば、Needham VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984)に記載されたような自動合成装置を使用して化学合成される。必要ならば、ポリヌクレオチドの精製は典型的に、未変性アクリルアミドゲル電気泳動により、またはPearson et al., J. Chrom., 255:137 149 (1983)に記載されたような陰イオン交換HPLCにより、行われる。合成ポリヌクレオチドの配列は、Maxam and Gilbert (1980) in Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499の化学分解法を用いて検証することができる。
転写レベルを測定するための代替手段は、インサイチューハイブリダイゼーションである。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、一般に、Angerer et al., Methods Enzymol., 152:649 (1987)に記載されている。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイにおいて、細胞を固体支持体、典型的にはガラススライドに固定する。DNAを探索する場合、細胞を、熱またはアルカリで変性されせる。次に、細胞を中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させ、標識された特異的プローブのアニーリングを行う。プローブは、好ましくは放射性同位体または蛍光レポーターで標識される。
VIII. 実施例
本発明を具体例によりさらに詳細に説明する。以下の実施例を例示目的で提供するが、本発明は該実施例によりいかなる様式にも限定されるものではない。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすように変更または修飾することができる、様々な重大でないパラメーターを容易に認識するであろう。
実施例1. 材料および方法
siRNA：これらの研究に使用される全てのsiRNA分子は、標準的な手順を用いて化学合成およびアニーリングした。
siRNAの脂質封入：いくつかの態様では、それぞれモル比6.76：54.06：6.75：32.43の以下の脂質：（1）脂質コンジュゲートPEG750-C-DMA（3-N-[(-メトキシポリ(エチレングリコール)750)カルバモイル]-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン）；（2）陽イオン性脂質DLinDMA（1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N,N-ジメチル)アミノプロパン)またはDLin-K-C2-DMA（2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン；「C2K」）；（3）リン脂質DPPC（1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン；Avanti Polar Lipids; Alabaster, AL）；および（4）合成コレステロール（Sigma-Aldrich Corp.; St. Louis, MO）から構成される安定な核酸-脂質粒子（SNALP)にsiRNA分子を封入した。言い換えると、以下の「7：54」製剤：6.76mol%のPEG750-C-DMA；54.06mol%のDLinDMAまたはC2K；6.75mol%のDPPC；および32.43mol%のコレステロールのSNALPにsiRNAを封入した。
他の態様では、それぞれモル比1.4：57.1：7.1：34.3の以下の脂質：（1）脂質コンジュゲートPEG2000-C-DMA（3-N-[(-メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル]-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン）；（2）陽イオン性脂質DLinDMAまたはC2K；（3）リン脂質DPPC；および（4）合成コレステロールから構成されるSNALPにsiRNAを封入した。言い換えると、以下の「1：57」製剤：1.4mol%のPEG2000-C-DMA；57.1mol%のDLinDMAまたはC2K；7.1mol%のDPPC；および34.3mol%のコレステロールのSNALPにsiRNAを封入した。
7：54製剤および1：57製剤が標的製剤であること、ならびに製剤中に存在する脂質（陽イオン性および非陽イオン性の両方）の量および脂質コンジュゲートの量が変動しうることを理解すべきである。典型的には7：54製剤において、陽イオン性脂質の量は54.06mol%±5mol%であり、脂質コンジュゲートの量は6.76mol%±1mol%であり、7：54製剤の差分は非陽イオン性脂質（例えばリン脂質、コレステロール、またはこれら二つの混合物）から構成されている。1：57製剤において、陽イオン性脂質の量は、典型的には57.1mol%±5mol%であり、脂質コンジュゲートの量は1.4mol%±0.5mol%であり、1：57製剤の差分は非陽イオン性脂質（例えばリン脂質、コレステロール、またはこれら二つの混合物）から構成されている。
ビヒクル対照について、同一の脂質組成を有する空の粒子をsiRNAの非存在下で形成させることができる。
実施例2. PEG-脂質のアルキル鎖長およびPEGポリマー長が封入率に及ぼす作用の特徴決定
一定濃度のDLinDMAおよびコレステロールを含有する溶液にPEG-脂質コンジュゲートの用量を設定した。ルシフェラーゼ（Luc）を標的とするsiRNA分子を含有するSNALP製剤は、1mm T連結器を用いてシリンジプレス法（0.2mg規模）を使用して核酸と脂質溶液とを混合し、PBS中に直接希釈することによって生成した。
図1に、SNALP製剤中により高いmol%のPEG750-C-DMAまたはPEG750-C-DSAなどのPEG750-脂質コンジュゲートを使用した場合に、siRNA搭載物のより優れた封入率が達成されたことを示す。特に、両方のPEG750-脂質コンジュゲートが7mol%のPEG-脂質で高いsiRNA封入率（約90%またはそれ以上）を保持したが、PEG2000-脂質コンジュゲートは、より高いmol%のPEG-脂質で約40%の封入率しか示さなかった。
実施例3. 7：54 DLinDMA SNALP製剤の特徴決定
核酸構成要素としてポロ様キナーゼ1（PLK-1）（Genbankアクセッション番号NM_005030）を標的とするsiRNAを用いて7：54 DLinDMA SNALP製剤を調製した。この研究に使用されたPLK-1 siRNA配列を表3に提供する。
Figure 2012531469
 カラム1：「PLK」の後の数は、ヒトPLK-1 mRNA配列NM_005030の開始コドン（ATG）に対するセンス鎖の5'塩基のヌクレオチド位置を指す。カラム2：2'OMeヌクレオチドを太字で下線を付けて示す。siRNA分子の一方または両方の鎖の3'-オーバーハングは、標的配列またはその相補鎖に対して相補性を有する1〜4個のデオキシチミジン（dT）ヌクレオチド、1〜4個の修飾および/または未修飾ウリジン（U）リボヌクレオチド、または1〜2個の追加的なリボヌクレオチドのうちどれか一つを含みうる。カラム3：siRNA分子中の2'OMe修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージが提供される。カラム4：siRNA分子の二本鎖（DS）領域中の修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージが提供される。
表4に、代表的なバッチの7：54 DLinDMA SNALP製剤の脂質モル比および物理特性を示す。7：54 DLinDMA SNALP製剤についての脂質：核酸の投入質量比は、約6.5：1（mg総脂質：mg siRNA）であり、約7：1〜約7.5：1の脂質：核酸質量比を有する典型的な最終SNALP産物が生成した。
Figure 2012531469
 「Zavg」=粒子直径の中央値；「Poly」=多分散性；「Encaps」=封入率。
図2に、マウス（それぞれn=4匹）におけるPEG750-C-DMAを含有するPLK-1 7：54 DLinDMA SNALPと、PEG2000-C-DMAを含有するPLK-1 1：57 DLinDMA SNALPとの血中クリアランスプロファイルの比較を示す。7：54 DLinDMA SNALP製剤について観察された血液循環時間の延長は、遠位腫瘍部位でのそのような粒子の蓄積および活性の増大を可能にする。3H標識SNALPのボーラス静脈内（IV）注射（2mg/kg）をこの研究に使用した。
実施例4. 正常な肝臓に対する肝臓腫瘍における7：54 DLinDMA SNALP製剤の活性
核酸構成要素としてPLK-1（表3）またはApoB siRNAを用いて7：54または1：57 DLinDMA SNALP製剤を調製した。正常な肝臓を有するマウスに、リン酸緩衝食塩水（PBS）、ApoB 1：57 DLinDMA SNALP、またはApoB 7：54 DLinDMA SNALPのいずれかを、外側尾静脈を介した静脈内（IV）注射により投与した。樹立したHep3B肝臓内腫瘍を有するマウスに、PBS、PLK-1 1：57 DLinDMA SNALP、またはPLK-1 7：54 DLinDMA SNALPのいずれかを、外側尾静脈を介したIV注射により投与した。
図3に、1：57 DLinDMA SNALP製剤が正常肝臓組織におけるApoB発現およびHep3B肝臓腫瘍におけるPLK-1発現をサイレンシングできたが、一方で7：54 DLinDMA SNALP製剤が正常な肝臓組織に比べて肝臓腫瘍の方が高いサイレンシング活性を表したことを示す。このように、この実施例は、7：54 DLinDMA SNALP製剤が正常な肝臓よりも腫瘍細胞を優先的に標的とするが、一方で1：57 DLinDMA SNALP製剤が固形腫瘍よりも正常な肝細胞を優先的に標的とすることを実証している。
この実施例は、さらに、7：54 DLinDMA SNALP製剤が増殖中の肝細胞（例えば肝臓の罹患状態）においてPLK-1のサイレンシングの制限を助けうることを実証している。健康な肝臓中の肝細胞は、典型的には非分裂性であることから、PLK-1を発現しない。しかし、罹患状態では（例えば癌性肝臓では）、正常な肝細胞の方が増殖性であることから（肝細胞が損傷を修復しようとするので）、PLK-1を発現する。PLK-1 7：54 DLinDMA SNALP製剤の使用によって、正常な増殖性肝細胞の望ましくないターゲティングが回避され、これにより、これらの細胞におけるPLK-1のサイレンシングを制限する。結果として、これらの健康な肝細胞の死滅は低下または抑止されるが、一方で腫瘍細胞においてPLK-1の発現は効果的にサイレンシングされる。
実施例5. 肝臓外部の腫瘍における7：54 DLinDMA SNALP製剤の活性
核酸構成要素としてPLK-1 siRNAを用いて7：54または1：57 DLinDMA SNALP製剤を調製した（表3）。樹立したHep3B皮下（SC）腫瘍を有するマウスに、PBS（対照）、PLK-1 1：57 DLinDMA SNALP、またはPLK-1 7：54 DLinDMA SNALPのいずれかを、外側尾静脈を介してIV注射により6×3mg/kg SNALPの用量で1週間に2回、3週間にわたり（17、20、24、27、31、34日目に）投与した。図4に、PLK-1 1：57 DLinDMA SNALPの多回投与が対照マウスに比べて樹立したSC Hep3B腫瘍の退縮誘導に有効であったが、PLK-1 7：54 DLinDMA SNALPの多回投与がPLK-1 1：57 DLinDMA SNALP製剤よりもこれらのSC固形腫瘍の退縮誘導に有効であったことを示す。
したがって、この研究は、7：54 DLinDMA SNALP製剤がSC腫瘍に強度増大を表し、肝臓外部の腫瘍を優先的に標的とするために使用できることを示す。
実施例6. 肝臓腫瘍における7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤の活性の比較
核酸構成要素としてPLK-1 siRNAを用いて、DLinDMAまたはDLin-K-C2-DMA （「C2K」）のいずれかを含む7：54または1：57 SNALP製剤を調製した（表3）。樹立したHep3B肝臓内腫瘍を有するマウスに、PBS（「対照」）、PLK-1 7：54 C2K SNALP、PLK-1 7：54 DLinDMA SNALP、PLK-1 1：57 C2K SNALP、またはPLK-1 1：57 DLinDMA SNALPのいずれかを外側尾静脈を介したIV注射により投与した。各SNALP製剤を0.25mg/kgまたは1mg/kg siRNAで体重に応じて投与した。注射の24時間後に肝臓腫瘍中のPLK-1 mRNAレベルを測定した。
図5に、1：57 DLinDMA SNALP製剤が1mg/kg siRNA用量でHep3B肝臓腫瘍におけるPLK-1の発現をサイレンシングできたが、一方で7：54 DLinDMA SNALP製剤が同じ用量でHep3B肝臓腫瘍において高まったサイレンシング活性を表したことを示す。図5にまた、1：57および7：54 C2K SNALP製剤がHep3B肝臓腫瘍において類似のPLK-1サイレンシング活性を表したことを示す。図6に、7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤がHep3B肝臓腫瘍において異なる2用量（すなわち0.25mg/kgおよび1mg/kg siRNA）で類似の強度を有したことを示す。
したがって、この実施例は、7：54 DLinDMA SNALP製剤が、対応する1：57製剤よりも優先的に腫瘍細胞を標的とすることを実証している。この実施例はまた、1：57および7：54 C2K SNALP製剤がHep3B肝臓腫瘍においてPLK-1 mRNAをサイレンシングする強度において7：54 DLinDMA SNALP製剤に匹敵することを実証している。
実施例7. 肝臓外部の腫瘍における7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤の活性の比較
一つの実験セットでは、核酸構成要素としてPLK-1 siRNAを用いてDLinDMAまたはDLin-K-C2-DMA（「C2K」）のいずれかを含む7：54または1：57 SNALP製剤を調製した（表3）。樹立したHep3B皮下腫瘍を有するマウスに、PBS、PLK-1 7：54 DLinDMA SNALP、PLK-1 1：57 C2K SNALP、またはPLK-1 1：57 DLinDMA SNALPのいずれかを、外側尾静脈を介したIV注射により投与した。各SNALP製剤を1mg/kgまたは3mg/kg siRNAで体重に応じて投与した。注射の24時間後に腫瘍中のPLK-1 mRNAのレベルを測定した。
図7は、7：54 DLinDMA SNALP製剤が、異なる2用量（すなわち1mg/kgおよび3mg/kg siRNA）でHep3B皮下腫瘍におけるPLK-1発現のサイレンシングに1：57 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤よりも大きな強度であったことを示す。7：54 DLinDMA SNALP製剤の強度は、腫瘍組織像によって裏付けられた。特に、両方の用量の7：54 DLinDMA SNALPで強い組織学的作用が観察された。
別の実験セットでは、核酸構成要素としてPLK-1 siRNAを用いてDLinDMAまたはDLin-K-C2-DMA（「C2K」）のいずれかを含む7：54または1：57 SNALP製剤を調製した（表3）。樹立したHep3B皮下腫瘍（SC）を有するマウスに、PBS、PLK-1 7：54 C2K SNALP、PLK-1 7：54 DLinDMA SNALP、PLK-1 1：57 C2K SNALP、またはPLK-1 1：57 DLinDMA SNALPのいずれかを、外側尾静脈を介したIV注射により投与した。各SNALP製剤を3mg/kg siRNAで体重に応じて1回投与または6回投与（17、20、24、27、31、および34日目）として投与した。1回投与の研究について、注射の24時間後に腫瘍中のPLK-1 mRNAレベルを測定した。多回投与の研究について、研究途中にある時点で腫瘍体積を測定した。
図8に、1：57 DLinDMA SNALP製剤、1：57 C2K SNALP製剤、および7：54 C2K SNALP製剤がSC腫瘍におけるPLK-1の発現をサイレンシングできるが、一方で7：54 DLinDMA SNALP製剤が同じ用量でSC腫瘍におけるサイレンシング活性の増強を表したことを示す。図9に、SC腫瘍における異なるバッチの7：54 DLinDMA SNALP製剤および7：54 C2K SNALP製剤の強度の比較として示す。図10に、1：57 DLinDMA SNALP製剤、1：57 C2K SNALP製剤、および7：54 C2K SNALP製剤が多回投与研究において平均SC腫瘍体積を減少できたが、一方で7：54 DLinDMA SNALP製剤の方がSC平均腫瘍体積の減少により有効であったことを示す。多回投与研究で観察された抗腫瘍有効性は、PLK-1 mRNAの相対サイレンシング活性と相関した。
したがって、この実施例は、7：54 DLinDMA SNALP製剤がSC腫瘍において強度増大を表し、肝臓外部の腫瘍を優先的に標的とするために使用できることを実証している。この実施例はまた、1：57および7：54 C2K SNALP製剤がSC腫瘍において類似の強度を有したことを実証している。
実施例8. 7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤の耐容性
マウスにおいてSNALPを20mg/kgで単回IV投与して、7：54 DLinDMA SNALP製剤およびC2K SNALP製剤の耐容性を評価した。注射の48時間後に肝臓酵素レベルを測定した。図11に、両方の7：54 SNALP製剤がPBS対照に比べて肝臓酵素レベルを有意には上昇させなかったことを示す。
SNALPのPEG-脂質構成要素に対する抗体反応の誘導について検査することにより、7：54 DLinDMA SNALP製剤の耐容性をさらに評価した。ICRマウスに、1：57または7：54 DLinDMA PLK-1 SNALPを2×3mg/kgの1週間用量で投与した。血漿中の抗PEG-脂質IgM抗体およびIgG抗体のレベルをELISAによって測定した。図12に、PLK-1 1：57または7：54 DLinDMA SNALP投与後に有意な免疫原性の証拠がなかったことを示す。このように、1：57および7：54 SNALP製剤の両方は、PEG-脂質構成要素に対するIgMおよびIgG抗体反応を有意には誘導しない。
実施例9. 様々な陽イオン性脂質を含有する腫瘍指向性SNALP製剤の特徴決定
この実施例に、マウス遠位腫瘍モデルにおいてポロ様キナーゼ1（PLK-1）を標的とするsiRNAを有する、本明細書記載の様々な新規な陽イオン性脂質を含有する腫瘍指向性SNALP製剤の有効性を実証する。この研究に使用されたPLK-1 siRNA配列を上記表3に提供する。
以下の陽イオン性脂質を用いて、封入されたPLK-1 siRNAを含有する7：54 SNALP製剤を調製した：（1）DLinDMA；（2）TLinDMA；（3）DLin-C1K-DMA（「DLin-K-DMA」）；（4）DPanDMA；（5）DPan-C2-DMA（「C2-DPanDMA」）；（6）DPan-C2K-DMA；（7）DPan-C3K-DMA；および（8）DPan-C1K6-DMA。
Hep3B腫瘍を含むScidマウス（1群あたりn=4）に3mg/kgで各SNALP製剤を静脈内（IV）注射によって投与した。SNALP投与の24時間後に腫瘍組織を収集し、PLK-1/GAPDH QGアッセイを行うことによって腫瘍のPLK-1 mRNAレベルを評価した。表5に、このインビボ研究に使用されたSNALP製剤の特徴を提供する。
Figure 2012531469
図13に、腫瘍指向性7：54 SNALP製剤中の試験陽イオン性脂質の全てがPLK-1発現のサイレンシングに類似の強度を表したことを図解する。
実施例10. ヒト全血中の腫瘍指向性SNALP製剤に対する炎症反応の特徴決定
PLK-1などの関心対象の遺伝子を標的とするsiRNAを含有する腫瘍指向性SNALPに対する炎症反応は、ヒト対象から採取した全血試料中のサイトカインのエクスビボ誘導を測定することによって評価することができる。場合によっては、SNALPは、siRNA搭載物を含有しないか（「空」）またはsiRNA搭載物を含有する。試験siRNAには、例えば本明細書記載の任意のPLK-1 siRNA分子が含まれうる。簡潔には、新鮮血液を単離し、0.9%食塩水溶液で直ちに1：1希釈し、0.45mL/ウェルを48ウェルの組織培養処理済みプレート中に蒔く。SNALPを製剤PBS中で希釈し、プレート内の血液試料に300nMまたは1200nMのいずれかの濃度で添加する。24時間後に、プレートを1200rpmで20分間遠心分離し、上清（血漿）を収集する。サイトカイン誘導（例えばTNFα、IL-8等）は、ELISAおよび/またはCytometric Bead Arrayによって測定することができる。
特定の態様では、siRNA配列への2'OMe選択的修飾（例えば、siRNA配列の二本鎖および/または3'オーバーハング領域におけるGおよび/またはUでの2'OMe修飾）の数を増大させると、siRNAに対する免疫刺激反応を低下させることができる。
実施例11. 腫瘍指向性SNALP製剤における修飾PLK-1 siRNAのインビトロおよびインビボ活性の選別
同じヌクレオチド配列のPLK-1 siRNAを修飾して、漸増する数および交互パターンの2'OMeヌクレオチドを組み込んだ。10本の異なるセンス鎖（S-1〜S-10）および135本の異なるアンチセンス鎖（AS-A〜AS-HおよびAS-1〜AS-127）を設計した。センス鎖およびアンチセンス鎖の全ての可能な組み合わせの混合およびマッチアニーリングによってPLK-1二本鎖siRNAを産生させた。二本鎖PLK-1 siRNAについての修飾数は、二本鎖領域中に7〜11個の範囲の2'OMeヌクレオチドであった。追加的に、修飾パターンのいくつかは、siRNAの一方または両方の鎖の3'オーバーハングに2'OMe修飾ヌクレオチドを含む結果として、siRNA分子全体における修飾数が約9〜約14個にさらに増大している。表6に、センス鎖S-1〜S-10とアンチセンス鎖AS-A〜AS-HおよびAS-1〜AS-127との混合およびマッチアニーリングから生じた例示的な修飾二本鎖PLK-1 siRNAを示す。
Figure 2012531469
Figure 2012531469
Figure 2012531469
Figure 2012531469
表6に記載されたような封入PLK-1二重鎖を含有する腫瘍指向性SNALP製剤（例えば7：54および/または7：58 SNALP）は、本明細書記載のように調製することができる。インビトロsiRNA活性アッセイに関して、Hep3B、HepG2、HT29、LS174T、およびNeuro2a細胞などの細胞系を、SNALPへと製剤化されたsiRNAの存在下で96ウェルプレート中で培養することができる。細胞生存率は、72時間後にレサズリン色素CellTiter Blue（Promega Corp）を使用して評価することができる。対応するPLK-1 mRNAサイレンシング活性は、繰返したプレートで24時間目にbDNAアッセイ（Panomics Inc.）によって評価することができる。siRNA治療細胞におけるカスパーゼ3および7酵素活性のレベルは、蛍光カスパーゼ3/7基質（Z-DEVD）2-ローダミン110試薬Apo-ONE （Promega Corp.）を使用して評価することができる。
インビボsiRNA活性アッセイについて、肝臓内腫瘍モデルを利用することができる。Hep3BまたはNeuro2a腫瘍細胞の肝臓内直接注射によって、マウスに肝臓腫瘍を樹立する。雌性scid/beigeマウス（Charles River Laboratories）および/または雄性A/Jマウス（Jackson Laboratories）を、Hep3BまたはNeuro2a腫瘍についての宿主として使用する。手術の直前にSC注射により動物にAnafenを注入することができる。イソフロウラン（isoflourane）ガス吸入によって個別のマウスを麻酔し、過度の眼乾燥を予防するために眼科用粘稠剤（eye lube）を適用することができる。ガス麻酔を維持しながら、胸骨下側に正中を横断する1.5cmの単一切開を行い、肝左外側葉を露出させることができる。25μLのPBSに懸濁した1×106個のHep3B細胞または1×105個のNeuro2a細胞をHamiltonシリンジおよび30G針を用いて肝葉に浅い角度でゆっくりと注射することができる。次に、縫合する前に、穿刺傷に綿棒を当ててあらゆる出血を止める。無菌ケージに入れてマウスを麻酔から覚まし、2〜4時間密接にモニターしてから通常の飼育箱に戻す。腫瘍の移植から8〜11日後にマウスを複数の治療群に無作為化することができる。表6に記載されたような封入されたPLK-1二重鎖を含有する腫瘍指向性SNALP製剤（例えば7：54および/または7：58 SNALP）またはPBSビヒクル対照を、個別の動物の体重に応じてmg siRNA/kgベースで計算して（10mL/kgの注射体積）、標準的な静脈内注射により外側尾静脈を介して投与する。次に、増大中の腫瘍量および治療の耐容性の指標として、研究期間にわたり体重をモニターする。有効性の研究について、所定の人道的評価項目を生存率の代用として決定する。資格のある獣医学技師が臨床徴候、体重減少、および腹部膨満の組み合わせに基づいて判断して、腫瘍量を理由とする安楽死の日を定める。
皮下腫瘍モデルはまた、インビボsiRNA活性アッセイのために利用することができる。Hep3B腫瘍は、雌性scid/beigeマウスにおいて50μL PBS中の3×106個の細胞を左側後腹部に皮下注射することによって樹立することができる。接種の10〜17日後に腫瘍が触知可能になったときにマウスを複数の治療群に無作為化する。表6に記載されているように封入PLK-1二重鎖を含有する腫瘍指向性SNALP製剤（例えば7：54および/または7：58 SNALP）を上記のように投与する。デジタルノギスを使用して腫瘍を2次元（横×縦）で測定して、腫瘍の増殖を評価することができる。腫瘍体積は、式：a×b×b/2［式中、aおよびb＝それぞれ最大直径および最小直径であり、群平均±SDで表現する］を用いて計算することができる。
インビボsiRNA活性アッセイに関して、ヒトのPLK-1 mRNAおよびGAPDH mRNAは、製造業者の説明書（Quantigene 1.0マニュアル）に従ってQuantiGene bDNAアッセイ（Panomics）により腫瘍溶解物から測定することができる。ヒト特異的PLK-1（NM_005030）およびGAPDH（NM_002046）プローブセットは、マウス対応物mRNAに最小の交差反応性を有するように設計することができる。データは、個別の動物の平均PLK-1：GAPDH比±SDとして表現することができる。
特定の態様では、siRNA配列への選択的2'OMe修飾（例えば、siRNA配列の二本鎖および/または3'オーバーハング領域におけるGおよび/またはUでの2'OMe修飾）数の増大は、活性を低下させず、場合によってはサイレンシング活性を増大させる。
実施例12. 1,2-ジ-γ-リノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（γ-DLenDMA）の合成
下に示す構造を有するγ-DLenDMAを下記のように合成した。
Figure 2012531469
250mL丸底フラスコに3-(ジメチルアミノ)-1,2-プロパンジオール（0.8g、6.7mmol）、テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（1g）、γ-リノレニルメシレート(cis-6,9,12-オクタデカトリエンスルホン酸）（5g、14.6mmol）、およびトルエン30mLを装入した。15分間撹拌した後に、反応物を0〜5℃に冷却した。40%水酸化ナトリウム溶液（15mL）をゆっくりと加えた。反応物を約48時間撹拌したまま放置した。次に、追加的なトルエン15mLを40%水酸化ナトリウム（15mL）と一緒に反応容器に加えた。反応物を追加的に12時間撹拌した後に、水（50mL）および酢酸イソプロピル（50mL）を加え、15分間撹拌した。次に、混合物を500mL分液ロートに移し、分離させた。下の水相を流し去り、有機相を飽和塩化ナトリウムで洗浄した（2×50mL）。飽和塩化ナトリウム洗浄から生じた水相と有機相が20分後に完全には分離できなかったので、下の水相（わずかに黄色）を流し取り、クロロホルム（約45mL）で逆抽出した。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。
粗生成物である橙色液体を、シリカゲル（60g）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、ジクロロメタン中に0〜3%メタノールの勾配をかけて精製し、3.19gを回収した。シリカゲル（50g）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、ヘキサン中に10〜30%の酢酸エチル勾配をかけて生成物をさらに精製し、1.26gの純粋な生成物を回収した。
実施例13. 1,2-ジフィタニルオキシ-3-(N,N-ジメチル)-プロピルアミン（DPanDMA）の合成
下に示す構造を有するDPanDMAを下記のように合成した。
Figure 2012531469
段階1：フィタノールの合成：
Figure 2012531469
フィトール（21.0g、70.8mmol）、エタノール（180mL）および撹拌子を500mL丸底フラスコに入れた。ラネーニッケル2800（購入したそのまま、購入したそのままで使用する場合は50重量%水溶液、金属の＞89%のニッケルが存在）（6.8g、51.5mmol）を加え、フラスコを密封し、水素を流した。12"針を使用して溶液を通して水素の泡を10分間吹入れた。水素リザーバーとして風船を使用して反応物を5日間撹拌した。24時間および48時間目にも反応混合物を通してそれぞれ5分間水素の泡を吹入れた。次にセライト（Celite）を通して濾過することによって金属触媒を除去した。エタノール性溶液を濃縮し、得られた油状物にDCM 200mLを加えた。溶液を水（2×100mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。TLCはフィタノール生成物が形成したことを示した。収量20.0g。
段階2：フィタニルメシレートの合成：
Figure 2012531469
フィタノール（20.0g、66.7mmol）、トリエチルアミン（18.6mL、133mmol）、および撹拌子を1000mL丸底フラスコに加えた。フラスコを密封し、窒素を流した。無水DCM（250mL）を加え、混合物を-15℃に冷却した（氷およびNaCl）。シリンジを介して塩化メシル（10.4mL、133mmol）を30分間かけてゆっくりと加え、反応物を-15℃でさらに1.5時間撹拌した。この時点でTLCは出発物質が使い果たされたことを示した。溶液をDCM（250mL）で希釈し、飽和NaHCO3（2×200mL）で洗浄した。次に、有機相を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、濃縮した（ロータリーエバポレーター（rotovap））。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量：21.5g、85.7%。
段階3：DPanDMAの合成：
水素化ナトリウム（2.5g、100mmol）をベンゼン（40mL）および撹拌子と一緒に250mL丸底フラスコに入れた。50mLビーカー中で、N,N-ジメチル-3-アミノプロパン-1,2-ジオール（1.42g、12mmol）およびベンゼン（60mL）から溶液を作った。これを反応容器に加え、反応物を10分間撹拌（発泡）した。フィタニルメシレート（10.52g、28mmol）を加え、フラスコに冷却器を取付け、窒素を流し、加熱還流した。18時間後にフラスコを熱から外し、放冷した。ベンゼンで体積を200mLに調整した。EtOHをゆっくりと加え、未反応の水素化ナトリウムをクエンチングした。一度クエンチングが完了したならば、反応混合物をEtOH/H2Oで2回、ベンゼンとの比がベンゼン：水：エタノール1：1：0.6で洗浄した。水相を合わせ、CHCl3（2×100mL）で抽出した。最後に、有機層を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、濃縮（ロータリーエバポレーター）した。カラムクロマトグラフィーによる精製から、淡黄色油状物としてDPanDMAが回収（6.1g、8.97mmol、74.7%）された。
実施例14. TLinDMAファミリーの陽イオン性脂質の合成
次の図に、C(n)-TLinDMAファミリーの陽イオン性脂質のメンバーを合成するための全般スキームを提供する。
Figure 2012531469
TLinDMA（1-(2,3-リノレイルオキシプロポキシ)-2-(リノレイルオキシ)-(N,N-ジメチル)-プロピル-3-アミン)（化合物III）を以下のように合成した：
化合物Iの合成：
1000mL丸底フラスコにエピブロモヒドリン（5g、37mmol）、グリセロール（10g、110mmol）、撹拌子を装入し、次に窒素を流した。液体移送管を介して無水クロロホルム（350mL）に続いてBF3・Et2O（0.5mL、3.7mmol）を加え、窒素下で3時間還流した。反応混合物を冷却し、続いて室温で一晩撹拌した。反応が完了した時点で、反応混合物を濃縮し、シリカゲル（150g）を用いたカラムクロマトグラフィーによって粗生成物（15g）を精製した。
化合物IIの合成：
500mL丸底フラスコに化合物I（3.8g、17mmol）および撹拌子を装入した。窒素を流した後に、液体移送管を介して2.0Mジメチルアミン-メチルアルコール溶液（170mL）を加えた。得られた混合物を室温で48時間撹拌した。反応の進行はTLCを使用してモニターした。さらに精製せずに粗生成物を使用した。
TLinDMA（化合物III）の合成：
100mL丸底フラスコに撹拌子、NaH（0.6g、24mmol）、およびベンゼン25mLを装入した。続いて、化合物II（0.4g、2mmol）を加え、その後直ちにリノレイルメタンスルホネート（2.8g、8mmol）を加えた。反応物に窒素を流し、一晩還流した。反応の進行はTLCによりモニターした。反応混合物を250mL分液ロートに移し、ベンゼンで希釈して終体積50mLとした。反応物をエタノール（30mL）でクエンチングし、次に水（50mL）で洗浄した。下の水相を流し去り、反応混合物をエタノール（30mL）および水（50mL）で再度洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。シリカゲル（60g）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、ジクロロメタン中に0〜3%メタノールの勾配をかけて粗生成物（2.3g）を精製した。
C2-TLinDMA（化合物VII）は、以下のように合成した。
化合物IVの合成：
Figure 2012531469
窒素下、1000mL RBF（丸底フラスコ）中で磁気スターラーを用いて4-ブロモ-1-ブテン（11.5g、85mmol）のCH2Cl2溶液（無水、120mL）を調製した。別のフラスコに、3-クロロ過安息香酸（77%、MW 173、44.05g、196mmol）のCH2Cl2（無水、250mL）溶液を調製し、液体移送管を介して反応混合物に加えた。反応物を3日間撹拌し、次に濃縮した。生成物（油状物/白色固体混合物）をTHF（300mL）に再溶解し、4%亜ジチオン酸ナトリウム溶液（180mL）を加えて過剰の過酸を除去した。混合物（この時点で混濁している）を20分間撹拌し、次にEtOAc（750mL）を加えた。混合物を分液ロートに移し、有機相を水（100mL）、飽和NaHCO3（2×300mL、発泡）、再び水（300mL）およびブライン（300mL）で洗浄した。溶液を濃縮し、生成物をクロマトグラフィーにより精製した。
化合物Vの合成：
Figure 2012531469
250mL丸底フラスコに化合物IV（1.3g、9mmol）、グリセロール（2.5g、27mmol）、撹拌子を装入し、次に窒素を流した。液体移送管を介して無水クロロホルム（100mL）に続いてBF3・Et2O（0.15mL、1.1mmol）を加え、窒素下で3時間還流した。続いて反応混合物を室温で一晩撹拌した。
化合物VIの合成：
Figure 2012531469
50mL丸底フラスコに化合物V（0.3g、1.2mmol）および撹拌子を装入した。窒素を通した後に、シリンジを介して2.0Mジメチルアミン-メチルアルコール溶液（25mL）を加えた。得られた混合物を室温で48時間撹拌した。t.l.c.を使用して反応の進行をモニターした。反応混合物を濃縮し、粗生成物をそれ以上精製せずに使用した。
C2-TLinDMAの合成（化合物VII）：
Figure 2012531469
100mL丸底フラスコに撹拌子、NaH（0.6g、24mmol）、および25mLベンゼンを装入した。化合物VI（0.37g、1.8mmol）を加え、その後直ちにリノレイルメタンスルホネート（2.8g、8mmol）を加えた。反応物を一晩還流し、反応の進行をt.l.c.によりモニターした。反応混合物を250mL分液ロートに移し、ベンゼンで希釈して終体積50mLとした。反応をエタノール（30mL）でクエンチングし、次に水（50mL）で洗浄した。下の水相を流し去り、反応混合物をエタノール（30mL）および水（50mL）で再び洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。シリカゲル（60g）を用いたカラムクロマトグラフィーを使用して、DCM中に0〜3%メタノール勾配をかけて溶出して粗生成物2.5gを精製した。
C3-TLinDMA（化合物XI）は、以下のように合成した。
化合物VIIIの合成：
Figure 2012531469
窒素下、1000mL RBF中で磁気スターラーを用いて5-ブロモ-1-ペンテン（85mmol）のCH2Cl2溶液（無水、120mL）を調製する。別のフラスコに、3-クロロ過安息香酸（77%、MW 173、44.05g、196mmol）のCH2Cl2溶液（無水、250mL）を調製し、液体移送管により反応混合物に加える。反応物を3日間撹拌し、次に濃縮する。生成物（油状物/白色固体混合物）をTHFに再溶解させ（300mL）、4%亜ジチオン酸ナトリウム溶液（180mL）を加えて過剰の過酸を除去する。混合物（この時点で混濁している）を20分間撹拌し、次にEtOAc（750mL）を加える。混合物を分液ロートに移し、有機相を水（100mL）、飽和NaHCO3（2×300mL、発泡）、再び水（300mL）およびブライン（300mL）で洗浄する。溶液を濃縮し、生成物をクロマトグラフィーにより精製する。
化合物IXの合成：
Figure 2012531469
250mL丸底フラスコに化合物VIII（1.3g、9mmol）、グリセロール（2.5g、27mmol）、撹拌子を装入し、次に窒素を流す、液体移送管を介して無水クロロホルム（100mL）に続いてBF3・Et2O（0.15mL、1.1mmol）を加え、窒素下で3時間還流する。続いて反応混合物を室温で一晩撹拌する。
化合物Xの合成：
Figure 2012531469
50mL丸底フラスコに化合物IX（0.3g、1.2mmol）および撹拌子を装入する。窒素を流した後に、シリンジを介して2.0Mメチルアルコール溶液（25mL）中のジメチルアミンを加える。得られた混合物を室温で48時間撹拌する。t.l.cを用いて反応の進行をモニターする。反応混合物を濃縮し、粗生成物をそれ以上精製せずに使用する。
C3-TLinDMA（化合物XI）の合成：
Figure 2012531469
100mL丸底フラスコに撹拌子、NaH（0.6g、24mmol）、および25mLベンゼンを装入する。化合物X（0.37g、1.8mmol）を加え、その後直ちにリノレイルメタンスルホネート（2.8g、8mmol）を加える。反応物を一晩還流し、t.l.c.により反応の進行をモニターする。反応混合物を250mL分液ロートに移し、ベンゼンで希釈して終体積50mLとする。反応をエタノール（30mL）でクエンチングし、次に水（50mL）で洗浄する。下の水相を流し去り、反応混合物をエタノール（30mL）および水（50mL）で再び洗浄する。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去する。シリカゲル（60g）を用いたカラムクロマトグラフィーを使用して、DCM中に0〜3%メタノールの勾配をかけて溶出して粗生成物2.5gを精製する。
実施例15. 新規C2脂質の合成
下に示す構造を有する新規C2脂質（化合物V〜VII）を、以下の模式図に示すように合成した。
Figure 2012531469
段階1： 4-(2-メタンスルホニルエチル)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン（化合物I）の合成：
Figure 2012531469
4-(2-ヒドロキシルエチル)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン（25g、170mmol）、トリエチルアミン（55.9mL、400mmol）、および撹拌子を1000mL丸底フラスコに加えた。フラスコを密封し、窒素を流した。無水DCM（600mL）を加え、混合物を約-5℃に冷却した（氷およびNaCl）。シリンジを介して60分間かけて塩化メシル（19.9mL、255mmol、1.5当量）をゆっくりと加え、反応物を-5℃でさらに1.5時間撹拌した。この時点でTLCは、出発物質が消費されたことを示した。溶液をDCM（350mL）で希釈し、二つの部分に分け（約500mL）、各部分を以下のように処理した：溶液を1000mL分液ロートに移し、飽和NaHCO3で洗浄した（2×200mL）。次に、有機相を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、濃縮した（ロータリーエバポレーター）。カラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。最終収量：32.0g、84.1%。
段階2： 4-(2-ブロモエチル)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン（化合物II）の合成：
Figure 2012531469
臭化マグネシウムエーテル錯塩（40g、130mmol）および撹拌子を2000mL丸底フラスコに入れ、窒素を流した。液体移送管を介して4-(2-メタンスルホニルエチル)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン(I)（17.5g、78mmol）の無水ジエチルエーテル溶液（900mL）を加え、懸濁物を一晩撹拌した。最初にエーテルをビーカーの中にデカンテーションした。水（200mL）およびエーテル（300mL）を沈殿物に加え、5分間撹拌した。沈殿物を溶解させ、次にエーテル相を収集し、反応物からのエーテル溶液に加えた。次に、有機相を洗浄し、約500mLに濃縮し、水で洗浄し、無水Mg2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して黄色油状物（16.0g）を回収した。これをフラッシュクロマトグラフィーにより精製して生成物10.6gを回収した（50.7mmol、65%）。
段階3： 4-ブロモブタン-1,2-ジオール（化合物III）の合成：
Figure 2012531469
撹拌子の入った500mL RBFに4-(2-ブロモエチル)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン(II)（9g、43mmol）を加えた。（60：20：5）の比のMeOH：H2O：HCl 100mLを加えた。30分後に、溶液が塩基性であるとpH紙が示すまでNaHCO3（約75mL）を加えた（発泡）。この時点で混合物はわずかに混濁していた。エーテル（300mL）を（撹拌しながら）加え、混濁は消失した。反応混合物を1000mL分液ロートに移し、2相を分離した。水相の抽出をさらに2回繰返した（2×300mLエーテル）。有機相を合わせ、MgSO4で乾燥させ、濃縮して無色の油状物を回収し（7.0g）、それをカラムクロマトグラフィーによって精製した。
段階4： 4-(ジメチルアミノ)-1,2-ブタンジオール（化合物IV）の合成：
Figure 2012531469
撹拌子の入った50mL RBFに4-ブロモブタン-1,2-ジオール(III)（1g、6.0mmol）を加え、密封し、窒素を流した。液体移送管により30mLのジメチルアミン（2.0M MeOH溶液）を送液し、反応物を一晩撹拌した。TLCは、全ての出発物質が消失したことを示した。蒸発により溶媒（およびDMA）を除去し、粗生成物をそれ以上精製せずに使用した。
1,2-ジリノレイルオキシ-(N,N-ジメチル)-ブチル-4-アミン（C2-DLinDMA）（化合物V）の合成：
Figure 2012531469
4-(ジメチルアミノ)-1,2-ブタンジオール(IV)（1.3g、3.4mmol）、リノレイルメシレート（2.0g、5.8mmol）、テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（0.5g、1.5mmol）、トルエン（30mL）、および撹拌子を100mL RBFに加えた。30mLの40% NaOHを作り、反応混合物に加えた。得られた混合物を室温にて、窒素下で60時間撹拌した。脱イオン水（50mL）および酢酸イソプロピル（50mL）を加え、混合物をさらに10〜15分間激しく撹拌した。混合物を250mL分液ロートに移し、分離させ、水相を除去した。分離を助けるためにMeOHを使用して、有機相を水で2回洗浄し（2×30mL）、乾燥させ（MgSO4）、濾過し、濃縮して暗黄色油状物を得た。油状物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。
1,2-ジフィタニルオキシ-(N,N-ジメチル)-ブチル-4-アミン(C2-DPanDMA)（化合物VI）の合成
Figure 2012531469
水素化ナトリウム（360mg、15mmol）、ベンゼン（40mL）、および撹拌子を50mL丸底フラスコに入れた。4-(ジメチルアミノ)-1,2-ブタンジオール(IV)（200mg、1.5mmol）を加え、反応物を10分間撹拌した（発泡）。次に、フィタニルメシレート（1.07g、2.92mmol）を加え、フラスコに冷却器を取付け、窒素を流し、加熱還流した。18時間後にフラスコを室温まで放冷した。ベンゼンで体積を40mLに調整した。EtOHをゆっくりと加え、未反応の水素化ナトリウムをクエンチングした。一度クエンチングが完了したならば、反応混合物をEtOH/H2Oで2回、ベンゼンとの比がベンゼン：水：エタノール1：1：0.6で洗浄した。水性すすぎ液を合わせ、CHCl3で抽出した（2×20mL）。最後に、有機層を合わせ、乾燥させ（MgSO4）、濾過し、濃縮した（ロータリーエバポレーター）。カラムクロマトグラフィーによる精製から、淡黄色の油状物（250mg、0.145mmol、25%）が回収された。
1,2-ジリノレオイルオキシ-(N,N-ジメチル)-ブチル-4-アミン(C2-DLinDAP)（化合物VII）の合成：
Figure 2012531469
4-(ジメチルアミノ)-1,2-ブタンジオール(IV)（粗製、266mg、2mmol（最大））、TEA（0.84mL、6mmol）、およびDMAP（24mg、0.2mmol）が入ったフラスコに窒素を流した後、無水CH2Cl2（50mL）を加えた。リノレオイルクロリド（1.2g、4mmol）を加え、溶液を一晩撹拌した。DCM（約70mL）を用いて溶液を250mL分液ロートにすすぎ入れ、水で洗浄した（2×50mL）。有機相を乾燥させ（MgSO4）、濃縮し、クロマトグラフィーにより精製した。
実施例16. 新規なフィタニル陽イオン性脂質の合成
下に示す構造を有するDPan-C2K-DMA、DPan-C1K6-DMA、およびDPan-C3K-DMAを以下の模式図に示すように合成した。
フィタノールの合成：
Figure 2012531469
フィトール（21.0g、70.8mmol）、エタノール（180mL）および撹拌子を500mL丸底フラスコに入れた。ラネーニッケル2800（購入したそのまま、購入したそのままで使用する場合は50重量%水溶液、金属の＞89%のニッケルが存在）（6.8g、51.5mmol）を加え、フラスコを密封し、水素を流した。12"針を使用して溶液に通して10分間水素の泡を吹入れた。水素リザーバーとして風船を使用して反応物を5日間撹拌した。24時間および48時間目にも反応混合物を通してそれぞれ5分間水素の泡を吹入れた。次にセライトを通して濾過することによって金属触媒を除去した。エタノール性溶液を濃縮し、得られた油状物にDCM 200mLを加えた。溶液を水（2×100mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。TLCによってフィタノール生成物が形成したことが示された。収量20.0g。
フィタニルメシレートの合成：
Figure 2012531469
フィタノール（20.0g、66.7mmol）、トリエチルアミン（18.6mL、133mmol）および撹拌子を1000mL丸底フラスコに入れた。フラスコを密封し、窒素を流した。無水DCM（250mL）を加え、その混合物を-15℃に冷却した（氷およびNaCl）。シリンジを介して塩化メシル（10.4mL、133mmol）を30分間かけてゆっくりと加え、反応物を-15℃でさらに1.5時間撹拌した。この時点でTLCは出発物質が使い果たされたことを示した。溶液をDCM（250mL）で希釈し、飽和NaHCO3（2×200mL）で洗浄した。次に有機相を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、濃縮した（ロータリーエバポレーター）。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量21.5g、85.7%。
フィタニルブロミドの合成：
Figure 2012531469
臭化マグネシウムエーテル錯塩（17g、55mmol）および撹拌子を500mL丸底フラスコに入れた。フラスコを密封し、窒素を流し、液体移送管を介して無水ジエチルエーテル（200mL）を加えた。フィタニルメシレート（10.9g、28.9mmol（FW=377））の無水エーテル溶液（50mL）もまた液体移送管を介して加え、懸濁物を一晩撹拌した。次の朝にフラスコ側面に沈殿物が形成していた。冷水（200mL）を加え（沈殿物を溶解）、混合物を1000mL分液ロートに移した。振盪後に、有機相を分離した。次に、水相をエーテル（2×150mL）で抽出し、全てのエーテル相を合わせた。エーテル相を水（2×150mL）、ブライン（150mL）で洗浄し、無水Mg2SO4で乾燥させた。溶液を濾過し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。最終収量9.5g（26.3mmol、91.1%）。
化合物Aの合成：
Figure 2012531469
屑状マグネシウム（720mg、30mmol）、ヨウ素結晶、および撹拌子を500mL丸底フラスコに入れた。フラスコに窒素を流し、液体移送管を介して無水ジエチルエーテル（200mL）を加えた。フィタニルブロミド（9.5g、26.3mmol）の無水エーテル溶液（20mL）を加え、得られた混濁混合物を一晩還流した。混合物を室温に冷まし、シュバシールも冷却器も取外さずに、シリンジおよび12"針を介してギ酸エチル（2.2g、2.41mL、30mmol）を加えた。添加は、反応混合物に直接滴下して行い、混濁した懸濁物を再び一晩撹拌した。R.M.（結果として得られた混合物）をエーテル（50mL）と共に500mL分液ロートに移し、10% H2SO4（100mL - 得られた混濁混合物は、今度は振盪されると透明になった）、水（2×100mL）およびブラインで洗浄した。有機相を無水Mg2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。収量（粗製）は8gであった。TLCは、大部分の生成物がギ酸ジフィタニルメチルであったことを示し、それをクロマトグラフィー（ヘキサン中に0〜6%エーテル）によって精製した。
化合物Bの合成：
Figure 2012531469
次に、撹拌子が入った1000mL丸底フラスコに、精製されたギ酸エステル（A）（5.5g、8.86mmol）を移し、90% EtOH（500mL）およびKOH（2.0g、35.7mmol）を加えた。反応混合物は透明であり、それを一晩撹拌した。翌日に混合物をロータリーエバポレーターによってその体積の50%まで濃縮し、次に5% HCl 200mL中に注いだ。水相をエーテル（3×100mL）で抽出した。合わせたエーテル抽出物を水（3×200mL）で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、濃縮した。TLC（DCM）から、反応が見事に完了したことが明らかとなり、生成物（5.5g、100%）をそれ以上精製せずに使用した。
化合物Cの合成：
Figure 2012531469
化合物B（5.5g、9.3mmol）の混合物に、DCM中のピリジニウムクロロクロメート（PCC）（5.5g、25.5mmol）および無水炭酸ナトリウム（0.6g、5.66mmol）を加えた。得られた懸濁物を1時間撹拌したが、TLCはまだ一部の出発物質（SM）が残っていることを示した。懸濁物をもう1時間撹拌すると、わずかに進行したように見えたが完了には至らなかった。さらなるPCC（1.0g）および炭酸ナトリウム（0.2g）を添加し、反応物を一晩撹拌した。今度は反応は完了していた。次に、エーテル（300mL）を混合物に加え、得られた褐色懸濁物はシリカのパッド（300mL）を通過させて濾過し、パッドをエーテル（3×100mL）で洗浄した。エーテル相を合わせ、濃縮し、精製して5.0g（90%）のケトンを回収した。
化合物Dの合成：
Figure 2012531469
100mL丸底フラスコに化合物C（1.4g、2.4mmol）、1,2,4-ブタントリオール（0.51g、4.8mmol）、ピリジニウムp-トルエンスルホネート（0.06g、0.24mmol）、および撹拌子を装入した。反応容器に窒素を流し、液体移送管を介して無水トルエン（30mL）を加えた。フラスコにディーン-スターク（Dean-Stark）管および冷却器を取付け、窒素を流した。反応物を窒素下で一晩還流し、反応の進行をTLCによりモニターした。3時間還流後に、ディーン-スターク管に溜まった反応溶液をシリンジ（20mL）で取り出し、反応容器に直ちに新鮮トルエン（20mL）を補充した。これを1時間毎に合計3回繰り返し、次に一晩穏やかに還流しているままにした。室温に冷ました後、反応混合物をトルエン（2×5mL）で250mL分液ロートに移し、5%水性Na2CO3（2×50mL）、水（50mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させた。溶媒の蒸発により、1.67gの粗生成物が得られ、それをシリカゲル（50g）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、溶離液としてジクロロメタンを使用して精製した。収量：1.4g、2.06mmol、86%。
化合物Eの合成：
Figure 2012531469
100mL丸底フラスコに化合物D（1.4g、2.06mmol）および撹拌子を装入した。容器に窒素を流し、DCM（25mL）を加えた。続いて、シリンジでトリエチルアミン（0.72g、7.1mmol、0.99mL）を加え、得られた溶液を-15℃に冷却した（NaCl、氷）。別の50mL丸底フラスコに、無水メタンスルホン酸（0.74g、4.1mmol）とDCM（20mL）との溶液を調製した。この溶液を上記溶液に30分間かけて滴下して加えた。反応容器を-15℃に保った。反応混合物を室温で一晩撹拌し、TLCによりモニターした。次に、反応混合物をDCM（25mL）で希釈し、NaHCO3（2×30mL）で洗浄し、次に無水MgSO4で乾燥させた。次の段階で粗生成物（1.7g）をそれ以上精製せずに使用した。
DPan-C2K-DMAの合成：
Figure 2012531469
500mL丸底フラスコに粗製化合物E（1.7g、2.5mmol）および撹拌子を装入した。反応容器に窒素を流し、続いてTHF中のジメチルアミン（2.0M、65mL）をシリンジで加えた。得られた混合物を室温で3日間撹拌した。反応物を濃縮し、シリカゲル（40g）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、ジクロロメタン中に0〜5%メタノールの勾配をかけて粗生成物を精製した。
化合物Fの合成：
Figure 2012531469
100mL丸底フラスコに化合物C（1.2g、2.1mmol）、2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール（0.45g、4.2mmol）、ピリジニウムp-トルエンスルホネート（0.05g、0.21mmol）、および撹拌子を装入した。反応容器に窒素を流し、続いて液体移送管を介して無水トルエン（45mL）を加えた。フラスコにディーン-スターク管および冷却器を取付け、窒素を流した。反応物を窒素下で一晩還流し、反応の進行をTLCによりモニターした。3時間還流後に、ディーン-スターク管に溜まった反応溶液をシリンジ（20mL）で取り出し、反応容器に直ちに新鮮トルエン（20mL）を補充した。これを1時間毎に合計3回繰り返し、次に一晩穏やかに還流しているままにした。室温に冷ました後、反応混合物をトルエン（2×5mL）で250mL分液ロートに移し、5%水性Na2CO3（2×50mL）、水（50mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させた。溶媒の蒸発により、1.44gの粗生成物が得られ、次にそれをシリカゲル（35g）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、ジクロロメタン中に0〜3%メタノールの勾配をかけて精製した。
化合物Gの合成：
Figure 2012531469
250mL丸底フラスコに化合物F（1.2g、1.8mmol）および撹拌子を装入した。その容器に窒素を流し、DCM（25mL）を加えた。続いて、トリエチルアミン（0.62g、6.1mmol、0.85mL）をシリンジで加え、得られた溶液を-15℃に冷却した（NaCl、氷）。別の50mL丸底フラスコに、無水メタンスルホン酸（0.67g、3.7mmol）とDCM（20mL）との溶液を調製した。この溶液を30分間かけて上記溶液に滴下して加えた。添加の間に反応容器を-15℃に保った。反応混合物を室温で一晩撹拌し、TLCによりモニターした。次に、反応混合物をDCM（25mL）で希釈し、NaHCO3（2×30mL）で洗浄し、次に無水MgSO4で乾燥させた。次の段階で粗生成物（1.6g）をそれ以上精製せずに使用した。
DPan-C1K6-DMAの合成：
Figure 2012531469
250mL丸底フラスコに粗化合物G（1.6g、2.1mmol）および撹拌子を装入した。反応容器に窒素を流し、続いて、THF中のジメチルアミン（2.0M、60mL）をシリンジで加えた。得られた混合物を室温で6日間撹拌した。溶媒の蒸発後に、シリカゲル（30g）を用いたカラムクロマトグラフィーを使用して、ヘキサン中に0〜30%酢酸エチルの勾配をかけて粗生成物を精製した。
化合物Hの合成：
Figure 2012531469
50mL丸底フラスコに(R)-γ-ヒドロキシメチル-γ-ブチロラクトン（1.0g、8.6mmol）を装入し、窒素を流し、ラバーセプタムで密封した。続いて、無水THF（40mL）をシリンジで加えた。次に、LiAlH4（3.5g、92mmol）を含有する調製済み無水THF溶液160mLに(R)-γ-ヒドロキシメチル-γ-ブチロラクトン溶液を窒素下で滴下して加えた。添加の間に反応容器を0℃に保った。得られた懸濁物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を0℃に冷却し、パスツールピペットを使用してブライン（10〜22mL）を非常にゆっくりと加えた。混合物を窒素下で、室温で一晩撹拌した。白色固体を濾過し、THF（3×25mL）で洗浄した。有機相を合わせ、濃縮した。溶媒が除去された後で、粗生成物は油性残渣と一緒に水を含有するように見えたことから、その粗生成物をエタノール（100mL）中で共沸させ、黄色油状物を得た。粗生成物（0.45g）をそれ以上精製せずに次の段階に使用した。
化合物Iの合成：
Figure 2012531469
100mL丸底フラスコに化合物C（1.0g、1.8mmol）、化合物H（粗製、0.450g、3.6mmol）、ピリジニウムp-トルエンスルホネート（0.05g、0.24mmol）、および撹拌子を装入した。反応容器に窒素を流し、続いて液体移送管を介して無水トルエン（45mL）を加えた。フラスコにディーン-スターク管および冷却器を取付け、窒素を流した。反応物を窒素下で一晩還流し、反応の進行をTLCによりモニターした。3時間還流後に、ディーン-スターク管に溜まった反応溶液をシリンジ（20mL）で取り出し、反応容器に直ちに新鮮トルエン（20mL）を補充した。これを1時間毎に合計5回繰り返し、次に一晩穏やかに還流しているままにした。室温に冷ました後、反応混合物をトルエン（2×5mL）で250mL分液ロートに移し、5%水性Na2CO3（2×50mL）、水（50mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させた。溶媒の蒸発により、1.13gの粗生成物が得られ、次にそれをシリカゲル（30g）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、溶離液としてジクロロメタンを使用して精製した。収量、1.0g。
化合物Jの合成：
Figure 2012531469
250mL丸底フラスコに化合物I（1.0g、1.44mmol）および撹拌子を装入した。その容器に窒素を流し、DCM（25mL）を加えた。続いて、トリエチルアミン（0.51g、5mmol、および0.7mL）をシリンジで加え、得られた溶液を-15℃に冷却した（NaCl、氷）。別の50mL丸底フラスコに、無水メタンスルホン酸（0.54g、3.0mmol）と無水DCM（20mL）との混合物を調製した。この溶液を上記溶液に30分間かけて滴下して加えた。反応容器を-15℃に保った。反応混合物を室温で一晩撹拌し、TLCによりモニターした。次に、反応混合物をDCM（25mL）で希釈し、NaHCO3（2×30mL）で洗浄し、次に無水MgSO4で乾燥させた。粗生成物（1.2g）をそれ以上精製せずに次の段階に使用した。
DPan-C3K-DMAの合成：
Figure 2012531469
100mL丸底フラスコに粗化合物J（1.2g、1.6mmol）および撹拌子を装入した。反応容器に窒素を流し、続いて、THF中のジメチルアミン（2.0M、45mL）をシリンジで加えた。得られた混合物を室温で4日間撹拌した。溶媒が蒸発した後に、シリカゲル（30g）を用いたカラムクロマトグラフィーを使用して、ヘキサン中に0〜30%酢酸エチルの勾配をかけて粗生成物を精製した。
実施例17. DLen-C2K-DMAの合成：
下に示す構造を有するDLen-C2K-DMAを以下の模式図に示すように合成した。
Figure 2012531469
ジリノレニルケトンの合成：
Figure 2012531469
ジリノレニルメタノール（6.0g、11.4mmol）の無水DCM溶液（200mL）が入った1000mL RBFにピリジニウムクロロクロメート（7.39g、34.2mmol）、無水炭酸ナトリウム（1.0g、5.66mmol）および撹拌子を加えた。得られた懸濁物を窒素下で、室温で3時間撹拌し、その後TLCは全てのSMが消費されたことを示した。次に、エーテル（300mL）を混合物に加え、得られた褐色懸濁物を、シリカのパッド（300mL）を通過させて濾過し、パッドをエーテル（3×100mL）で洗浄した。エーテル相を合わせ、濃縮し、精製して4.2g（8.0mmol、70%）のケトンを回収した。
リノレニルケタールの合成：
Figure 2012531469
100mL RBFにジリノレニルケトン（4.2g、8.2mmol）、1,2,4-ブタントリオール（3.4g、32mmol）、PPTS（200mg、0.8mmol）および撹拌子を装入した。フラスコに窒素を流し、無水トルエン（60mL）を加えた。反応容器にディーン-スターク管および冷却器を取付け、還流させ、反応物を一晩放置した。室温に冷ました後、反応混合物をトルエン（50mL）で希釈し、5%水性Na2CO3（2×50mL）、水（50mL）で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィーにより精製して、3.0g（4.9mmol、59%）のケタールを回収した。
メシレートの形成：
Figure 2012531469
250mL RBFにリノレニルケタール（3.0g、4.9mmol）、TEA（2.2mL、15.6mmol）および撹拌子を装入した。フラスコに窒素を流し、無水DCM（20mL）を加え、その溶液を-15℃に冷却した。別の50mLフラスコ中に、MsCl（9.7mmol、2当量）の無水DCM溶液（30mL）を調製し、次にシリンジで20分間かけて反応容器に移した。反応物を-15℃で90分間撹拌し、この時点で出発物質が消費されていた。さらにDCM 50mLで反応混合物を希釈し、NaHCO3（2×50mL）で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィーにより精製した。最終収量3.1g、4.5mmol、92%。
DLen-C2K-DMAの合成：
Figure 2012531469
250mL RBFにメシレート（3.0g、4.35mmol）、イソプロパノール（25mL）および撹拌子を装入した。フラスコに窒素を流し、密封し、液体移送管を介して2.0Mジメチルアミン-メタノール溶液（120mL）を加えた。反応物を室温で3日間撹拌した。その溶液を濃縮し、クロマトグラフィーにより精製した。最終収量2.49g、3.9mmol、90%。
実施例18. γ-DLen-C2K-DMAの合成：
下に示す構造を有するγ-DLen-C2K-DMAを以下の模式図に示すように合成した。
Figure 2012531469
ジ-γ-リノレニルケトンの合成：
Figure 2012531469
ジ-γ-リノレニルメタノール（6.0g、11.4mmol）の無水DCM（200mL）溶液が入った1000mL RBFに、ピリジニウムクロロクロメート（7.39g、34.2mmol）、無水炭酸ナトリウム（1.0g、5.66mmol）および撹拌子を加えた。得られた懸濁物を窒素下で、室温で3時間撹拌し、その後TLCは全てのSMが消費されていたことを示した。次に混合物にエーテル（300mL）を加え、得られた褐色懸濁物はシリカのパッド（300mL）を通過させて濾過し、パッドをエーテル（3×100mL）で洗浄した。エーテル相を合わせ、濃縮し、精製して5.5g（10.5mmol、92%）のケトンを回収した。
γ-リノレニルケタールの合成：
Figure 2012531469
100mL RBFにジ-γ-リノレニルケトン（2.14g、4.1mmol）、1,2,4-ブタントリオール（1.7g、16.0mmol）、PPTS（100mg、0.4mmol）および撹拌子を装入した。フラスコに窒素を流し、無水トルエン（30mL）を加えた。反応容器にディーン-スターク管および冷却器を取付け、還流させ、反応物を一晩放置した。室温に冷ました後、反応混合物を5%水性Na2CO3（2×50mL）、水（50mL）で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィーにより精製して、1.34g（2.2mmol、53%）のケタールを回収した。
メシレートの形成：
Figure 2012531469
250mL RBFにγ-リノレニルケタール（1.34g、2.19mmol）、TEA（1mL、7.1mmol）および撹拌子を装入した。フラスコに窒素を流し、無水DCM（10mL）を加え、溶液を-15℃に冷却した。別の50mLフラスコに、MsCl（342μL、4.4mmol、2当量）の無水DCM溶液（15mL）を調製し、次にシリンジで20分間かけて反応容器に移した。反応物を-15℃で90分間撹拌し、その時点で出発物質は消費されていた。反応混合物をさらにDCM 50mLで希釈し、NaHCO3（2×50mL）で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、クロマトグラフィーにより精製した。最終収量1.31g、1.90mmol、87%。
γ-DLen-C2K-DMAの合成：
Figure 2012531469
250mL RBFに前記メシレート（1.31g、1.9mmol）、イソプロパノール（10mL）および撹拌子を装入した。フラスコに窒素を流し、密封し、液体移送管を介して2.0Mジメチルアミン-メタノール溶液（60mL）を加えた。反応物を室温で3日間撹拌した。溶液を濃縮し、クロマトグラフィーにより精製した。最終収量1.1g、1.72mmol、91%。
上記説明は、例示的であり、限定的ではないと意図されることを理解されたい。上記説明を解釈するとき、当業者に多数の態様が明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、上記説明を参照して決定すべきではなく、その代わりに、添付の特許請求の範囲と共にそのような特許請求の範囲に値する等価物の全範囲を参照して決定すべきである。特許出願、特許、PCT公開、およびGenbankアクセッション番号を含めた、全ての論文および参照の開示は、全ての目的のために本明細書に参照により組み入れられる。

Claims (64)

  1. 以下を含む、核酸-脂質粒子：
    （a）核酸；
    （b）該粒子中に存在する総脂質の約50mol%〜約65mol%を構成する陽イオン性脂質；
    （c）該粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約45mol%を構成する非陽イオン性脂質；および
    （d）粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%を構成する、粒子の凝集を阻害する結合脂質。
  2. 前記核酸が、干渉RNAを含む、請求項1記載の核酸-脂質粒子。
  3. 前記干渉RNAが、siRNAを含む、請求項2記載の核酸-脂質粒子。
  4. 前記siRNAが、約19〜約25ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む、請求項3記載の核酸-脂質粒子。
  5. 前記siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの一つまたは複数が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項3記載の核酸-脂質粒子。
  6. 前記修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル(2'OMe)ヌクレオチドを含む、請求項5記載の核酸-脂質粒子。
  7. 前記二本鎖領域中の前記ヌクレオチドの約50%未満が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項5記載の核酸-脂質粒子。
  8. 前記siRNAが、該siRNAの一方または両方の鎖に3'オーバーハングを含む、請求項3〜7のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  9. 前記一方または両方の鎖の前記3'オーバーハング中のヌクレオチドの一つまたは複数が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項8記載の核酸-脂質粒子。
  10. 前記修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル(2'OMe)ヌクレオチドを含む、請求項9記載の核酸-脂質粒子。
  11. 前記siRNAが、細胞増殖性障害に関連する遺伝子の発現をサイレンシングする、請求項3〜10のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  12. 前記siRNAが、ポロ様キナーゼ1（PLK-1)遺伝子の発現をサイレンシングする、請求項11記載の核酸-脂質粒子。
  13. 前記siRNAが、配列5'-UAUUUAAGGAGGGUGAUCU-3'を含むアンチセンス鎖を含む、請求項12記載の核酸-脂質粒子。
  14. 配列5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUA-3'を含むセンス鎖をさらに含む、請求項13記載の核酸-脂質粒子。
  15. 前記siRNAが、少なくとも一つの2'-O-メチル(2OMe)ヌクレオチドを含む、請求項13または14記載の核酸-脂質粒子。
  16. 前記siRNAが、該siRNAの一方または両方の鎖に3'オーバーハングを含む、請求項13〜15のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  17. 前記アンチセンス鎖が、5'-UC-3'オーバーハングを含み、前記センス鎖が、5'-UU-3'オーバーハングを含む、請求項16記載の核酸-脂質粒子。
  18. 一方または両方の鎖の3'オーバーハング中のヌクレオチドの一つまたは複数が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項16または17記載の核酸-脂質粒子。
  19. 前記修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル(2'OMe)ヌクレオチドを含む、請求項18記載の核酸-脂質粒子。
  20. 前記siRNAが、表2に示されるアンチセンス鎖配列のうち一つを含むアンチセンス鎖を含む、請求項12記載の核酸-脂質粒子。
  21. 前記siRNAが、表2に示されるアンチセンス鎖配列のうち一つの少なくとも15個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、請求項12記載の核酸-脂質粒子。
  22. 前記siRNAが、表2に示されるアンチセンス鎖配列のうち一つのヌクレオチド1〜19を含むアンチセンス鎖を含む、請求項12記載の核酸-脂質粒子。
  23. 表1に示されるセンス鎖配列のうち一つを含むセンス鎖をさらに含む、請求項20〜22のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  24. 表1に示されるセンス鎖配列のうち一つの少なくとも15個の連続ヌクレオチドを含むセンス鎖をさらに含む、請求項20〜22のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  25. 表1に示されるセンス鎖配列のうち一つのヌクレオチド1〜19を含むセンス鎖をさらに含む、請求項20〜22のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  26. siRNAが、表6に示されるsiRNA配列のうち一つから成る、請求項12記載の核酸-脂質粒子。
  27. 前記陽イオン性脂質が、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、1,2-ジ-γ-リノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（γ-DLenDMA）、2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-C2-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン（DLin-K-DMA）、またはそれらの混合物を含む、請求項1〜26のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  28. 前記陽イオン性脂質が、粒子中に存在する総脂質の約50mol%〜約60mol%を構成する、請求項1〜27のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  29. 前記非陽イオン性脂質が、リン脂質である、請求項1〜27のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  30. 前記非陽イオン性脂質が、リン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物を含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  31. 前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項29または30記載の核酸-脂質粒子。
  32. 前記リン脂質が、前記粒子中に存在する総脂質の約5mol%〜約10mol%を構成する、請求項30記載の核酸-脂質粒子。
  33. 前記コレステロールが、前記粒子中に存在する総脂質の約25mol%〜約35mol%を構成する、請求項30記載の核酸-脂質粒子。
  34. 前記非陽イオン性脂質が、DPPCとコレステロールとの混合物である、請求項1〜27のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  35. 前記非陽イオン性脂質が、コレステロールまたはコレステロール誘導体である、請求項1〜27のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  36. 前記コレステロールが、前記粒子中に存在する総脂質の約30mol%〜約40mol%を構成する、請求項35記載の核酸-脂質粒子。
  37. 粒子の凝集を阻害する前記結合脂質が、ポリエチレングリコール(PEG)-脂質コンジュゲートを含む、請求項1〜36のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  38. 前記PEGが、約550ダルトン〜約1000ダルトンの平均分子量を有する、請求項37記載の核酸-脂質粒子。
  39. 前記PEGが、約750ダルトンの平均分子量を有する、請求項37記載の核酸-脂質粒子。
  40. 前記PEG-脂質コンジュゲートが、PEG-ジアシルグリセロール(PEG-DAG)コンジュゲート、PEGジアルキルオキシプロピル(PEG-DAA)コンジュゲート、PEG-リン脂質コンジュゲート、PEG-セラミド(PEG-Cer)コンジュゲート、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項37記載の核酸-脂質粒子。
  41. 前記PEG-脂質コンジュゲートが、PEG-DAAコンジュゲートを含む、請求項40記載の核酸-脂質粒子。
  42. 前記PEG-DAAコンジュゲートが、PEG-ジミリスチルオキシプロピル(PEG-DMA)コンジュゲートを含む、請求項41記載の核酸-脂質粒子。
  43. 粒子の凝集を阻害する前記結合脂質が、前記粒子中に存在する総脂質の約6mol%〜約8mol%を構成する、請求項1〜42のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子。
  44. 約54mol%の陽イオン性脂質、約7mol%のリン脂質、約32mol%のコレステロールまたはその誘導体、および約7mol%のPEG-脂質コンジュゲートを含む、請求項37記載の核酸-脂質粒子。
  45. 約58mol%の陽イオン性脂質、約35mol%のコレステロールまたはその誘導体、および約7mol%のPEG-脂質コンジュゲートを含む、請求項37記載の核酸-脂質粒子。
  46. 前記核酸が、前記核酸-脂質粒子に完全に封入されている、請求項1記載の核酸-脂質粒子。
  47. 請求項1記載の核酸-脂質粒子および薬学的に許容されうる担体を含む、薬学的組成物。
  48. 細胞を請求項1〜46のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子と接触させる工程を含む、該細胞に核酸を導入するための方法。
  49. 前記細胞が固形腫瘍中にある、請求項48記載の方法。
  50. 前記固形腫瘍が哺乳動物中にある、請求項49記載の方法。
  51. 前記哺乳動物がヒトである、請求項50記載の方法。
  52. 哺乳動物に請求項1〜46のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子を投与する工程を含む、固形腫瘍への核酸のインビボ送達のための方法。
  53. 前記粒子が全身経路を介して投与される、請求項52記載の方法。
  54. 前記核酸が、他の組織に比べて前記固形腫瘍に優先的に送達される、請求項52記載の方法。
  55. 前記固形腫瘍が、肝臓腫瘍または肝臓外部に位置する腫瘍である、請求項52記載の方法。
  56. 前記粒子が、前記固形腫瘍の大きさおよび/または体積を減少させる、請求項52記載の方法。
  57. 前記哺乳動物がヒトである、請求項52記載の方法。
  58. 前記核酸が、細胞増殖性障害に関連する遺伝子の発現をサイレンシングする干渉RNAである、請求項52記載の方法。
  59. 前記干渉RNAが、ポロ様キナーゼ1（PLK-1）遺伝子の発現をサイレンシングする、請求項58記載の方法。
  60. 前記干渉RNAが、該干渉RNAを投与されていない対照哺乳動物におけるPLK-1の発現レベルに比べて、試験哺乳動物におけるPLK-1の発現を少なくとも50%、60%、70%、80%、または90%サイレンシングする、請求項59記載の方法。
  61. 前記試験哺乳動物および前記対照哺乳動物がどちらもマウスである、請求項60記載の方法。
  62. それを必要とする哺乳動物において細胞増殖性障害を治療するための方法であって、該哺乳動物に請求項1〜46のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子の治療的有効量を投与する工程を含む、方法。
  63. 前記細胞増殖性障害が癌である、請求項62記載の方法。
  64. 前記哺乳動物がヒトである、請求項62記載の方法。
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