CN1112126A

CN1112126A - 聚酰胺-寡核苷酸衍生物、其制法和用途

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Publication number: CN1112126A
Application number: CN95102946A
Authority: CN
Inventors: E·乌尔曼; G·布尔帕尔
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1994-03-14
Filing date: 1995-03-13
Publication date: 1995-11-22
Anticipated expiration: 2015-03-13
Also published as: HK1038568A1; DE59511061D1; EP1113021A3; CN100379756C; AU698210B2; EP1113021A2; NO950955L; PT672677E; HK1012003A1; DK1113021T3; KR100416864B1; DE4408528A1; FI20051072A; EP0672677A2; EP0672677B1; AU1479895A; CA2144475C; FI951132A; ATE220070T1; ATE335760T1

Abstract

叙述了下式的聚酰胺—寡核苷酸—衍生物以及它们的药用盐，其中q、r、s、t各自独立地代表0或1，其中2个或多个相邻的q、r、s和t的总和≥2；x为1 ～20；DNA为核酸，如DNA或RNA或它们的已知衍生物；Li是DNA与PNA之间的共价连键，该共价连键可以是单键或含有至少一个C、N、O或S原子的有机基团；PNA为聚酰胺结构，其中至少含有一个核碱基，但胸腺嘧啶除外；F和F＇是端基，和(或) 经单键相互连接。本说明书还叙述了它们的制备方法以及作为药物、探针和引物的应用。F[(DNA-Li)_q(PNA-Li)_r(DNA-Li)_s(PNA)_t]_xF′

Description

本发明涉及具有有价值的物理学、生物学和药理学性质的新的聚酰胺-寡核苷酸衍生物。其用途是用作基因表达的抑制剂（反义寡核苷酸、核糖体、有义寡核苷酸和形成三式型的寡核苷酸）、作为确证核苷酸的探针和分子生物学的辅助试剂。

寡核苷酸作为基因表达的抑制剂的用途在不断增长（G.Zon，pharmaceutical Research 5，539（1988）;J.S.Cohen，Topics in Molecular and Structural Biology 12（1989）麦克米伦出版社;C.Helene and J.J.Toulme，Biochemica et Biophysica Acta 1049，99（1990）;E.Uhlmann and A.Payman，Chemical Reviews 90，543（1990）。反议寡核苷酸是核酸的片断，它的碱基顺序互补地与受抑制的mRNA相互补。这些目标-mRNA可以是细胞、病毒或其它病源体的起始源。作为细胞的目标-顺序，可考虑有例如受体、细胞粘附蛋白、酶、免疫调节剂、细胞素、生长因子、离子通道或癌基因。借助反义寡核苷酸而抑制病毒繁殖例如可以提及HBV（肝炎B病毒）、HSV-1和-2（Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒）、HIV（人免疫缺陷病毒）和流感病毒。为此加入与病毒核酸呈互补的寡核苷酸。而有义核苷酸的顺序是这样构建的，例如它们与核酸结合蛋白或核酸处理的酶相结合（“捕获”）从而抑制了它们的生物功能（C.Helene and J.J.Tonlme Biochemica et Biophysica Acta 1049，99（1990））。作为病毒目标，这里例如可提及逆转录酶、DNA-聚合酶和转激活因子-蛋白。形成三式型的寡核苷酸一般以DNA为目标，并与此键合后形成三股体。由于反义寡核苷酸的作用，mRNA的行进（剪切等）或它转译成蛋白通常受到抑制，形成三式型的寡核苷酸抑制了DNA的转录或复制（C.Helene和J.J.Toulme;Biochem.Biophys.Acta，1049（1990）99-125;E.Uhlman和A Peyman，Chemical Review 90，543（1990）。但也可能单股核酸与一反义寡核苷酸杂交形成双股核酸，后者又与形成三式型的寡核苷酸作第二次杂交，形成三式型结构。因而反义的和三式型的键合区域或者存留于两个分离的寡核苷酸中，或只在一个寡核苷酸中。合成寡核苷酸的另一用途是所谓的核糖体，由于核糖体有核糖核酸酶活性，它分解目的RNA（J.J.Rossi和N.Sarver，TIBTECH（1990）8，179;Castanetto等，Critical Rev. Eukar. Gene Expr. （1992）2，331）。

本发明化合物也以并贴物用于治疗。并贴物是寡核苷酸或它的类似物，它们与蛋白质有很高的结合亲和力。并贴物的发现是由偶然混合物中离体分离出的（Famulok和Szostak（1992）Angew.Chem.104，1001-1011）并成功地得到了与凝血酶结合的半贴物。（Bock等（1992）Nature 355，564-566）。为此可以这样处理，通过筛选寡核苷酸混合物来确定并贴物的碱基次序，然后该碱基顺序转换到聚酰胺-寡核苷酸类似物上。另一可能性是，并贴物的结合区域为了容易确定而用分子的分开的未结合部分来编码（Brenner和Lerner（1992）PNAS89，5381-5383）。

于DNA诊断中，具有适当标记的核酸片断作为所谓的DNA-探针，用于对拟鉴定的核酸进行特定的杂交。借助于最好不用放射活性的标记，形成新的双股核酸。用这种方法确证遗传性的、恶性的、病毒性的或其它病源体引起的疾病。

对于多数这些用途，天然存在的寡核苷酸不完全适宜或完全不适宜。因而必需作化学改造，以便使特异的排列是正确的。这样，生物系统的寡核苷酸，例如用于抑制病毒的繁殖时，必需满足如下的条件：

1.它们必须在体内条件下，无论是在血清中或在细胞内都有足够大的稳定性。

2.它们必须具有能够穿越细胞胞膜和核膜的能力。

3.它们必须在生理条件下，以碱基特异的方式结合在它的目的核酸上，以显示其抑制作用。

对于DNA探针，上述1-3点没有先决条件;但此寡核苷酸须这样衍生化，即能够确证，例如用萤光法、化学发光法、比色法或特异的颜色（Beck和Koester，Anal. Chem. 62，2258（1990）。寡核苷酸的化学变换至少按以下的方式变换：磷酸骨架、核糖单元或碱基（J.S.Cohen，Topics in Molecular and Chemical Biology 12（1989），MacMillan出版社;E.Uhlmann and A.Peyman，Chemical Reviews 90，543（1990））。另一个常用的方法是通过5’-羟基与相应的磷酰化试剂反应，制备寡核苷酸-5’-结合物。但是当核苷酸-磷酸残基间改变时，寡核苷酸性质常常发生剧烈的改变。例如甲基磷酸酯在水性界质中的溶解度大大地降低，而全-硫代膦酸-寡核苷酸常常是以顺序特异的方式起作用。

最近报导了聚酰胺-核酸衍生物（Michael Egholm，Peter E.Nielsen，Rolf H. Berg and Ole Bachardf， Science 1991，254，1497-1500;WO 92/20702;M.Egholm等Nature（1993）365，566-568;P. Nielsen，（1994）Bioconjugate Chem. 5，3-7），它们与天然的寡核苷酸以高亲和力结合于互补的目的顺序上（DNA或RNA）。这些所谓的肽或聚酰胺核酸（PNA）是DNA样化合物，化合物中的脱氧核糖-磷酸骨架被聚酰胺-低聚体替代。这类化合物比天然寡核苷酸有优点，即在血清中非常稳定。但另一方面有如下不利的性质：

（1）它们不被细胞吸收或只吸收难以检出的量。由于反义寡核苷酸或形成三式型寡核苷酸只在细胞内呈现其活性，PNA作为体内基因表达的抑制剂是不适宜的。

（2）PNA趋向于进入水溶液中，因而在生理条件下发生聚集。这样在缓冲水溶液中它们难以溶解，不能用来与互补的碱基顺序杂交。

（3）此外，PNA对各种物质如

Sephadex（Pharmacia出品）或

Bond Elut（Varian出品）有很高的亲合力，这些物质用于纯化低聚物时，常常使PNA的收率很差。

（4）PNA的另一个缺点是，它在与互补的核酸结合时不只是一种取向。因而对天然的寡核苷酸的顺序特异性减低了。由于天然核酸通常以反向平行与互补的核酸杂交，而PNA结合时既可反向平行也可正向方向进行。

（5）在WO 92/20702中叙述了一种寡核苷酸-PNA-结合物（T）₇（5’-L-N）（t）₆-Ala（图25;附页），其中（T）₇表示天然的七胸苷酸寡核苷酸，它通过其5’-O-磷酸和4-羟基丁酸（L）与PNA-六胸苷酸（t）₆的伯氨基（N）和丙氨酸（Ala）相连结。对此化合物的合成及任何性质均未见报导。

（6）PNA在细胞培养实验中于μmol浓度范围内有很强的细胞毒作用。

碱基对的核酸链方向按如下定义（见Egholm等：Nature 365（1993）566-568）。

A）

5'-3' DNA ap双倍体 ap=反向平行

3'-5' DNA

B)

5'-3' DNA p双倍体 p=正向平行

5'-3' DNA

C)

5'-3' DNA ap双倍体(DNA·PNA)

C-N PNA

D)

5'-3' DNA p双倍体(DNA·PNA)

N-C PNA

E)

C-N PNA

5'-3' DNA(Pu) ap·ap三式型(DNA·DNA·PNA)

3'-5' DNA Pu=富嘌呤链

F)

N-C PNA

5'-3' DNA(Pu) ap·p三式型(DNA·DNA·PNA)

3'-5' DNA

G)

N-C PNA

5'-3' DNA(Pu) ap·p三式型(PNA·DNA·PNA)

C-N PNA

H)

C-N PNA

5'-3' DNA(Pu) ap·ap三式型(PNA·DNA·PNA)

C-N' PNA

I)

N-C PNA

5'-3' DNA(Pu) p·p三式型(DNA·DNA·PNA)

N-C' PNA

K)

C-N PNA

5'-3' DNA(Pu) p·ap三式型(DNA·DNA·PNA)

N-C PNA

其中5’代表寡核苷酸的5’-端

3’代表寡核苷酸的3’-端

N代表PNA的氨基端，

C代表PNA的羧基端。

A）-D）项是反义低聚物原则上可能的定位样式的代表例。E）-F）项提示在单股或双股核酸上形成三式型的可能性。因此，PNA-或DNA单股的两个可互相连接。例如在E）中PNA的N端与DNA的5’-端连接或在F）中PNA的C-端与DNA的5’-端连接。

本发明内容是制备聚酰胺-寡核苷酸衍生物，这类化合物消除了上述的缺点。

本发明内容是式Ⅰ的聚酰胺-寡核苷酸衍生物及其药用盐，

其特征是，

q、r、s、t各自独立为0或1，其中两个或多个相邻的q、r、s和t的总和应≥2;

x为1～20，优选为1～5，尤其优选为1，

DNA为核酸DNA或RNA，或它们的已知衍生物，

Li为DNA和PNA之间的共价连接，该共价连接为一键或含有至少一个如下原子的有机基团：C、N、O或S;

PNA为聚酰胺结构，至少含一个核酸碱基，但不是胸腺嘧啶，F和F’为末端基团和（或）经共价键相互连接（环状化合物）。式Ⅰ的聚酰胺-寡核苷酸衍生物尤其指：

x为1，同时

q＝r＝1，和s＝t＝0，或

r＝s＝1，和q＝t＝0，或

q＝r＝s＝1，和t＝0，或

r＝s＝t＝1，和q＝0。

尤其优选为式Ⅰa和Ⅰb的化合物，

其中

x＝1～20，若x＞1，r＝s＝1，并且同时q＝t＝0，o＝n＝0～5;

q、r、s、t各自独立为0或1，其中两个或多个相邻的q、r、s和t的总和应≥2

R²为氢、羟基、C₁-C₁₈-烷氧基，尤其优选为C₁-C₆-烷氧基，卤素如下或Cl，尤其是F，叠氮基或氨基;

B各自独立地代表核苷酸化学中常规的碱，例如天然的碱如腺嘌呤，胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、次黄嘌呤，或非天然的碱如嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，7-去氮腺嘌呤，7-去氮鸟嘌呤，N⁴N⁴-桥亚乙基胞苷，N⁶N⁶-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤，伪异胞苷，5-甲基胞苷、5-氟尿嘧啶，5-（C₃-C₆）-炔基尿嘧啶，5-（C₃-C₆）-炔基胞苷或它们的前药型式，

或是“弯曲的夹子”，即R²及相邻的取代基处于2’及3’位，或也可逆向处于3’位及2’位;

Nu为式Ⅱa或Ⅱb的一个基团，

式中

R²和B含义同前

U为羟基、巯基、C₁-C₁₈-烷基，优选为C₁-C₈-烷基，C₁-C₁₈-烷氧基，优选为C₁-C₈-烷氧基，C₆-C₂₀-芳基，优选为C₆-C₁₂-芳基，C₆-C₁₄-芳基-C₁-C₈-烷基，优选为C₆-芳基-C₁-C₄-烷基，NHR³或NR³R⁴，

R³为C₁-C₁₈-烷基或C₁-C₄-烷氧-C₁-C₄-烷基，优选为C₁-C₈-烷基或C₁-C₄-烷氧-C₁-C₄-烷基，尤其优选为C₁-C₁₄-烷基或甲氧乙基，和

R⁴为C₁-C₁₈-烷基，优选为C₁-C₈-烷基，尤其优选为C₁-C₄-烷基，或

R³和R⁴与它们连接的氮原子共同构成5～6员杂环还可含有另外的杂原子O、S或N，例如吗啉基，

V为-O-、-S-或-NH-，

W为氧化或硫代;

Y为-O-、-S-、-CH₂-或-NH-;

m＝0～20;

o＝0～20;

D为式Ⅲ的一个基团，

式中B的含义同前;

D’为式Ⅳ的一个基团，

式中B的含义同前;

n＝0～20;

p＝0～20;

Li₁、Li₂、Li₃和Li₄各自独立为式Ⅴ的一个结构，

式中各自独立为

∈＝1～5，优选为1-2;

V′为氧、NH、单键或式Ⅵ的一个基团

式中U、V、W和Y的含义同前;

G为C₁-C₁₂-烷二基，优选为C₁-C₆-烷二基，烷二基可被如下基团任选取代：卤素（优选F或氯），氨基、羟基，C₁-C₁₈-烷基（优选为C₁-C₆-烷基），C₁-C₁₈-烷氧基（优选为C₁-C₆-烷氧基），C₆-C₁₄-芳基（优选为C₆-芳基），或C₆-C₁₄-芳基-C₁-C₁₈-烷基（优选为C₆-芳基-C₁-C₄-烷基）;G还可为C₆-C₁₄-芳基-二-C₁-C₁₂-烷二基，优选为C₆-芳基-二-C₁-C₄-烷二基，或为式（CH₂CH₂O）_δCH₂CH₂代表的基团，δ为1～11，优选为1～7;或是一单键，

G’为-O-，-S-，-NH-，-C（O）-，-C（O）NH-，单键或式Ⅵ代表的一个基团，式中U、V，W和Y的含义同前;F和F’经一单键相连接（成环状化合物）和（或）

F为R⁰-（A）_r-V-，

F’在式Ⅰa中为-（O）₁-R¹，在式Ⅰb中为V¹-（A）₁-R¹，其中

R⁰为氢、C₁-C₁₈-烷酰基，优选为C₈-C₁₈-烷酰基，C₁-C₁₈-烷氧羰基，C₃-C₈-环烷酰基，C₇-C₁₅-芳酰基，C₃-C₁₃-杂芳酰基，或代表一个可促进低聚物向细胞中吸收的基团，或作为DNA探针的标记物，或于低聚物在目标核酸上杂交时，在键合、交叉连接或裂解时起作用，或

若k＝0，则R⁰为氢或与V共同形成式Ⅶ所示的一个基团：

式中，

Z和Z’各自独立代表羟基、巯基、C₁-C₂₂-烷氧基，优选为C₁₂-C₁₈-烷氧基，C₁-C₁₈-烷基，优选为C₁₂-C₁₈-烷基，C₆-C₂₀-芳基，优选为C₆-C₁₆-芳基，C₆-C₁₄-芳基-C₁-C₁₈-烷基，优选为C₆-芳基-C₁-C₄-烷基，C₁-C₂₂-烷硫基，优选为C₁₂-C₁₈-烷硫基，NHR³，NR³R⁴，或代表一个可以促进低聚物向细胞中吸收的基团，或作为DNA探针的标记物，或在低聚物于目标核酸上杂交时，在键合、交叉连接或裂解时起作用，其中

R³、R⁴、V和W的定义同前;

R¹为氢或Q⁰，

其中当1＝0且在式Ⅰa中t＝0，s＝1以及Li₁为式Ⅴ的一个结构（V’＝单键，G＝单键，∈＝1，G’＝-O-，-S-，-NH-或U＝Z的式Ⅵ中一个基团），或

在式Ⅰb中q＝1或q＝r＝0和F’＝V’-（A）₁-R¹，其中V¹＝V时，R¹只永远是氢，

A和Q各自独立地代表天然或非天然氨基酸，优选自甘-、亮-、苯丙-、半胱-、赖-、精-、天冬-、谷-、脯-氨酸，四氢异喹啉-3-羧酸，八氢吲哚-2-羧酸、N-（2-氨乙基）甘氨酸，

Q⁰代表羟基、OR’，NH₂，NHR”，其中

R’＝C₁-C₁₈-烷基，优选为C₁₂-C₁₈-烷基，

R”＝C₁-C₁₈-烷基，优选为C₁₂-C₁₈-烷基，C₁-C₁₈-氨烷基，优选为C₁₂-C₁₈-氨烷基，C₁-C₁₈-羟烷基，优选为C₁₂-C₁₈-羟烷基，

V的含义同前，

V¹为一单键或是V，其中在F’为q＝0、r＝1的式Ⅰb时，V¹永远为单键;

k为0～10，

l为0～10、

其附带条件是：

a）若式Ⅰa化合物的t＝0，s＝1，Li₁＝（V’）-（G）-（G’）且其V’＝式Ⅵ的化合物，G＝C₂-C₁₂-亚烷基，G’＝CO，则在F’＝-（Q）₁-R¹中，1＝0～10，R¹＝Q⁰;

b）若式Ⅰa化合物的s＝t＝0，则Li₂为一单键;

c）若式Ⅰb化合物的t＝0，s＝1，则Li₃为一单键;

d）若式Ⅰb化合物的s＝t＝0，则Li₄为一单键;

其中每个核苷酸都可以D-或L-构型存在，碱基可处在α-或β-位置。

尤其优选的式Ⅰa和Ⅰb化合物是，其碱基处在糖基的β-位，其中

x＝1，

q＝r＝1，s＝t＝0，或

r＝s＝1，q＝t＝0，或

q＝r＝s＝1，t＝0，或

r＝s＝t＝1，q＝0。

式Ⅰa和Ⅰb的低聚物尤其优选为：V’、V、Y和W的含义为硫代、氧基、氧代或羟基;更为优选的是，再附加要求R²为氢。

∈＝1的式Ⅰa和Ⅰb低聚物尤其优选，其中：

Li₁，Li₄为a）一种式V的化合物，其中V’＝氧或式Ⅵ的一个化合物，G＝C₁-C₁₀-亚烷基，G’＝-CONH-，

b）式Ⅴ的化合物，其中G，V’为单键，G’为式Ⅵ的一个化合物，并优选为U＝V＝W＝Y＝氧，或U＝W＝Y＝氧且V＝亚胺基，

Li₂，Li₃为a）式Ⅴ的化合物，其中V’＝亚胺基，G＝C₁-C₁₀-亚烷基，G’＝式Ⅵ化合物，

b）式Ⅴ的化合物，其中V’＝亚胺基，G和G’为单键，

c）式Ⅴ的化合物，其中V’＝亚胺基，G＝C₁-C₁₀-亚烷基，G’＝V，并优选U＝V＝W＝Y＝氧。

更为优选的式Ⅰa和Ⅰb低聚物中，V’、V、Y和W的含义为硫代、氧基、氧代或羟基，R²＝H，Li₁含义为-V’-[CH₂]_nC（O）NH-，其中V’＝式Ⅵ中U＝V＝W＝Y＝氧或Li₂含义为-HN-[CH₂]_n（G’）-，其中n＝2～5，G’＝式Ⅵ（其中U、V、W和Y＝氧）的化合物。

此外，式Ⅰa和Ⅰb低聚物还优选为：V’、V、Y和W含义为硫代、氧基、氧代、或羟基，R²为氢，Li₁含义为-O-[CH₂]_nC（O）NH-或Li₂含义为-HN-[CH₂]_n（G）’-，其中n＝2～5，G’为U、V、W和Y＝氧的式Ⅵ，q＝0，r＝s＝t＝1。

式Ⅰa和Ⅰb低聚物还优选为“弯曲的夹子”，其中R²处于3’位（见式Ⅱb），碱基优选为腺嘌呤。

本发明并不局限于α-和β-D-或L-呋喃型核糖苷、α-和β-D-或L-呋喃型脱氧核糖苷以及类似的五员碳环类似物，而且还适用于寡核苷酸类似物，该寡核苷酸类似物由其它糖基构成，例如扩环或缩环糖，非环状的，桥环的或其它的糖衍生物。本发明也不只局限于式Ⅰ中所示例列出的磷酸基衍生物，而且还涉及已知的脱磷基衍生物。

寡核苷酸部分（式Ⅰ的DNA）可以多种方式变换其天然结构。该变换可按照已知的方法例如是：

a）变换磷酸桥连基;有代表性的有：硫代磷酸、二硫代磷酸，甲基磷酸、氨基磷酸、硼磷酸、磷酸甲酯、磷酸乙酯、苯基磷酸，磷酸桥连基优选变换为：硫代磷酸、二硫代磷酸和甲基磷酸。

b）替换磷酸基：有代表性的是用如下基团替换：甲醛缩醛基、3’-硫代甲醛缩醛基甲基羟胺基、肟基亚甲基二甲基联亚胺基、二亚甲砜基、甲硅烷基，优选的是甲醛缩醛基和3’-硫代甲醛缩醛基替换。

c）糖的变换：有代表性的是，α-端基异构糖，2’-O-甲基核糖，2’-O-丁基核糖，2’-O-烯丙基核糖，2’-氟代-2’-脱氧核糖，2’-氨基-2’-脱氧核糖，α-呋喃型阿拉伯糖，碳环糖类似物。优选的是用2’-O-甲基核糖和2’-O-正丁基核糖变换。

d）碱基变换，但不要改变Watson-Crick碱基对的特异性。有代表性的是，5-丙炔基-2’-脱氧尿苷、5-丙炔基-2’-脱氧胞基，5-己炔基-2’-脱氧尿苷，5-己炔基-2’-脱氧胞苷，5-氟-2’-脱氧胞苷，5-氟-2’-脱氧尿苷，5-羟甲基-2’-脱氧尿苷，5-甲基-2’-脱氧胞苷，5-溴-2’-脱氧胞苷。优选变换的是5-丙炔基-2’-脱氧尿苷，5-己炔基-2’-脱氧尿苷，5-己炔基-2’-脱氧胞苷，5-丙炔基-2’-脱氧胞苷。

e）3’-3’-和5’-5’-翻转（例如见M.Koga等J.Org.Chem.56（1991）3757）。

f）5’-和3’-磷酸及5’-和3’-硫代磷酸。

有代表性的那些可促进细胞内吸收的基团，是各种亲脂性基团如-O-[CH₂]_x-CH₃，其中x为6～18的整数，-O-（CH₂）_n-CH＝CH（CH₂）_m-CH₃，其中n和m各自独立地为整数6～12，-O（CH₂CH₂O）₄-（CH₂）₉-CH₃，-O-（CH₂CH₂O）₈-（CH₂）₁₃-CH₃和-O-（CH₂CH₂O）₇-（CH₂）₁₅CH₃，但也可以是甾类基团，如胆固醇基，或维生素基如维生素E、维生素A或维生素D和其它结合物，可利用天然载体系统如胆酸、叶酸、2-（N-烷基、N-烷氧基）-氨基蒽醌和有关受体的甘露糖和肽的结合物。这类结合物导致寡核苷酸促进受体胞饮作用如EGF（上皮细胞生长因子），血管舒缓激肽和PDGF（血小板来源的生长因子）。标记基团可为萤光基团，例如丹酰-（＝N-二甲基-1-氨基萘基-5-磺酰基-）、萤光素-或香豆素衍生物，或化学发光基团，例如吖啶衍生物，以及通过ELISA可检定的洋地黄毒甙系统，后者通过生物素-抗生物素蛋白系统可检出生物素基，或带有功能基的连接臂，后者又可以用可检测的显示基团进行衍生化，例如氨烷基连接基，它与吖啶鎓活化基反应成化学发光探针，有代表性的标记基团是：

荧光素衍生物

洋地黄毒甙结合物

与核酸结合或进行嵌入和/或裂解或交叉连接的寡核苷酸类似物可含有，例如吖啶-、补骨脂-、菲啶-、萘醌-、正定霉素-或氯乙胺基芳基-结合物，有代表性的嵌入和交叉连接的基团有：

三甲基补骨脂-结合物（＝补骨脂”时X＝0）

NR³R⁴基的例子-R³和R⁴与它们相连的氮原子共同形成5-到6-员杂环，且还可以含有其它杂原子-例如有吗啉基和咪唑啉基。

聚酰胺部分（式Ⅰ的PNA）由酰胺结构构成，它至少含有一个核碱基，但不是胸腺嘧啶，这些聚酰胺结构有代表性的是如下的结构单元a）到g），式中f为1～4，优选为1或2：

Hyrup et al.;J.Chem.Soc.Chem.Comm.1993，519

De Konig et al.（1971）Rec.Trav.Chim.91，1069

Huang et al.（1991）J.Org.Chem.56，6007

Almarsson et al.（1993）Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A.90，7518

Froehler et al.（1991）WO 93/10820

Lewis（1993）Tetrahedron Lett.34，5697.

PNA端基可见同时提交的发明名称为“应用在对弱酸敏感的氨基保护基进行PNA合成”（HOE 94/F060）和“应用对碱敏感的氨基保护基进行PNA合成（HOE 94/F059）两份申请中所述。

优选的聚酰胺结构是由a）项所述构成的，当f＝1时尤其优选后者。

制备式Ⅰ的聚酰胺-寡核苷酸衍生物的方法类似于液相中或优选于固相中合成寡核苷酸方法，任选地应用自动合成仪。可逐步制备式Ⅰ的低聚物，为此，顺序地将各自带有核碱基的PNA单元或DNA单元缩合到相应的衍生化了的载体上或增长中的低聚物键上。但合成时也可用片断法进行，此时首先把聚酰胺或寡核苷酸以片断结构而合成出来，然后偶联成式Ⅰ的聚酰胺-寡核苷酸。但也可以把由PNA和核苷酸得到的结构单元加入，最好是以二聚体加入，然后按照核酸化学或肽化学方法合成聚酰胺-寡核苷酸衍生物。

合成寡核苷酸的方法按照本领域专家熟知的方法进行，如三酯法，H-膦酸酯法或氨基磷酸酯法，优选方法是按照Caruthers（M.D.Matteucci 和 M.H.Caruthers， J. Am. Chem. Soc. 103，3185（1981））所述的标准氨基磷酸酯化学法进行。聚酰胺的合成按照本领域专家所熟悉的肽化学方法进行。若寡核苷酸部分和聚酰胺部分合成时未经分离即行连接，则在合成寡核苷酸结构和合成聚酰胺结构时所用的方法必须是相互兼容的，此时合成聚酰胺所优选的方法与在发明名称为“应用在对弱酸敏感的氨基保护基进行PNA合成”（HOE 94/F060）中所述的方法进行。

按照q、r、s和t是否为1或0的不同情况，在进行合成时可自寡核苷酸部分开始或自聚酰胺部分开始。在合成式Ⅰ化合物时对于寡核苷酸部分的3’-和（或）5’-端基进行变换时，该变换反应可按照EP-A 0552766（HOE92/F012）所述方法进行（参见DNA合成流程图）。对于式Ⅰ化合物的聚酰胺部分进行合成可按照在发明名称为“应用在对弱酸敏感的氨基保护基进行PNA合成”（HOE 94/F060）所述的方法进行（参见PNA合成流程图）。

DNA合成流程图

[锚基]-[聚合物]

1.↓偶联PG-（Nu’）-活性基

PG-（Nu’）-[锚基]-[聚合物]

2.↓裂解保护基PG

H-（Nu’）-[锚基]-[聚合物]

3.↓重复步骤1和2（n-1）次

H-（Nu’）_n-[锚基]-[聚合物]

4.↓偶联R⁰-V-活性基

R⁰-V-（Nu’）_n-[锚基]-[聚合物]

5.↓裂解聚合物和保护基

R⁰-V-（Nu’）_n

PNA合成流程图

[锚基]-[聚合物]

1.↓偶联PG-（Q’）-OH

PG-（Q’）-[锚基]-[聚合物]

2.↓裂解保护基PG

H-（Q’）-[锚基]-[聚合物]

3.↓重复步骤1和2（1-1）次

H（Q’）₁-[锚基]-[聚合物]

4.↓与PG-[B’/X]-OH偶联

PG-[B’/X]-[Q’]₁-[锚基]-[聚合物]

5.↓裂解保护基PG

H-[B’/X]-[Q’]₁-[锚基]-[聚合物]

6.↓重复步骤4和5（n-1）次

H-[B’/X]_n-[Q’]₁-[锚基]-[聚合物]

7.↓与PG-（A’）-OH偶联

PG-（A’）-[B’/X]_n-[Q’]₁-[锚基]-[聚合物]

8.↓裂解保护基PG

H-（A’）-[B’/X]_n-[Q’]₁-[锚基]-[聚合物]

9.↓重复步骤7和8（k-1）次

H-（A’）_k-[B’/X]_n-[Q’]₁-[锚基]-[聚合物]

10.↓与基团R⁰偶联

R⁰-（A’）_k-[B’/X]_n-[Q’]₁-[锚基]-[聚合物]

11.↓裂解聚合物和保护基

R⁰-（A’）_k-[B’/X]_n-[Q’]₁-Q⁰

其中

PG代表保护基，优选为对弱酸敏感的保护基;

Nu’为核苷酸单元，其环外的氨基用适当的保护基保护;

Nu’-活泼基：在核苷酸化学中常规的活化衍生物，例如氨基磷酸基，磷酸二酯基或H-磷酸基：

A’、B’和Q’代表A、B和Q的各自保护基。

式Ⅰ的PNA/DNA杂交物的合成流程图

F[（DNA-Li）_q（PNA-Li）_r（DNA-Li）_s（PNA）_t]_xF′

（Ⅰ）

式中q＝r＝s＝t＝1和x＝1时，适于用如下的合成步骤：

1.↓合成端基F’;任选地与聚合物结合。

PG-F’

2.↓裂解保护基PG

H-F’

3.↓与聚酰胺结构物结合

PNA-F’

4.↓与连结子偶联

Li-PNA-F’

5.↓与核苷酸结构物结合

DNA-Li-PNA-F’

6.↓与连结子偶联

Li-DNA-Li-PNA-F′

7.↓重复步骤3-5

DNA-Li-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F’

8.↓与端基F偶联

F-DNA-Li-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F’

若在PNA-和DNA结构单元中有相应的过渡态，就可以省掉连接子单元的偶联。

为清楚起见，现把有代表性的式Ⅰ的PNA/DNA杂交物的合成流程图加以说明，来说明q＝r＝s＝t＝1，x＝1的杂交物-低聚物。首先，按已知方法合成端基F，用固相法合成时，将其偶联在聚合物载体上（步骤1）。裂解掉保护基PG后（步骤2），最好是在弱酸性界质中进行，将聚酰胺单元偶联直到所希望的PNA部分的长度（步骤3）。为了引入DNA-部分，现可联结连接子单元（步骤4）。然后通过对核苷酸单元的相继缩合，进行核苷酸结构物的结合（步骤5），优选用已知的氨基磷酸方法。缩合一个连接子（步骤6）-它可以使DNA连到PNA上后，又再接入一个聚酰胺结构。可把PNA过渡到DNA而引入连接子、结合另外的DNA结构（步骤7）并最后连结端基F（步骤8）这一过程生成了杂交分子[F-DNA-Li-DNA-Li-PNA-Li-PNA-F’]。该连接子单元此处也可以是核碱基单元。为了合成杂交分子F-DNA-Li-PNA-Li-F’（q＝r＝1，s＝t＝0），例如首先实行步骤1-5，然后结束于步骤8。

为了合成杂交分子F-PNA-Li-DNA-F’（r＝s＝1，q＝t＝0）。例如先进行1-2步，然后是5-6步，进行第3步，最后以合成第8步结束。

为了合成杂交分子F-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F’（r＝s＝t＝1，q＝0），用步骤1-6开始合成，重复步骤3后于第8步结束合成。

若式Ⅰ中x＞1，则步骤2-7必须在必要时重复。构成聚合物链后，PNA/DNA杂交分子在固相合成情况下必须从载体上裂解掉，并必要时裂解掉碱基、氨基酸侧链和端基上的保护基。

但是PNA-和DNA-部分在按已知方法合成后也可分离，最后经相应的活化一个组分而相互偶联。PNA部分的活化优选经羧酸基进行。例如成为活性酯或异硫氰酸酯，然后与DNA-部分的活性基团、优选为氨基官能团进行反应。DNA-部分的活化例如用已知的溴氰缩合法进行，此时被活化的磷酸基与PNA-部分的活性基团、优选为氨基官能团进行反应。

令人意外地发现，式Ⅰa和Ⅰb的低聚物与纯PNA相比，具有强烈增大的吸收入细胞的能力。这种改善的细胞吸收性完全是决定性的，因为只有在反义低聚物或形成三式型的低聚物吸收入细胞后才能起作用。其杂交性质也比纯PNA的好，因为它优选地生成反向平行的双股体。与正常的寡核苷酸相比，它们具有改善的对核酸酯的稳定性，此外也显示出提高的生物活性，对互补的核酸的结合亲和力比其它的对核酸酶稳定的寡核苷酸例如硫代磷酸或甲基磷酸为好。本发明化合物的结合亲和力与天然寡核苷酸相比，至少是同样好的，多数情况会更好，因为天然寡核苷酸在血清中迅速分解。结合亲合力的提高程度取决于PNA部分的长度。在细胞培养试验中，纯PNA的浓度＞5μM时有强细胞毒作用，而本发明化合物对细胞无损伤。还发现式Ⅰ化合物在细胞培养中抑制特异基团例如酶、受体或生长因子的表达，并且在动物模型中的选择的实例中可抑制基团表达，这取决于PNA-和DNA-部分的碱基次序。

PNA/DNA-低聚物或PNA/RNA-低聚物的另一优点是能够刺激细胞的核酸内切酶，例如核酸酶H和核酸酶L。与PNA不同的是，本发明有一些脱氧核苷酸单元的PNA-DNA-化合物在与互补的目标RNA结合后，通过诱导细胞内核酸酶H以顺序特异的方式被裂解。本发明低聚物的一个特别的实施型式还有这些：它们是由PNA-和2’，5’-联结的寡腺苷酸。优选为四腺苷酸或它的或它们的虫草品类似物构成，且它们活化细胞核酸酶。

本发明一般地涉及了式Ⅰ化合物作为治疗上有效药物成份的用途。作为有治疗作用的聚酰胺-寡核苷酸衍生物，通常认为是反义寡核苷酸，形成三股螺旋的寡核苷酸并贴物或核糖体，尤其是反义寡核苷酸。

本发明化合物可以有代表性地用于治疗由病毒引起的疾病，例如HIV、HSV-1，HSV-2、流感病毒、VSV、肝炎病毒B或疱疹病毒。

本发明对这些目的病毒有效的反义聚酰胺-寡核苷酸衍生物例如有如下的碱基顺序。PNA-和DNA部分的长度和位置在该顺序中可以变换，以得到优化的性质。

a）对于HIV，例如

5′-A C A C C C A A T T C T G A A A A T G G-3′ 或

（Ⅰ）

5′-A G G T C C C T G T T C G G G C G C C A-3′ 或

（Ⅱ）

5′-G T C G A C A C C C A A T T C T G A A A A T G G A T A A-3′ 或

（Ⅲ）

5′-G C T A T G T C G A C A C C C A A T T C T G A A A-3′ 或

（Ⅳ）

5′-T C G T C G C T G T C T C C G C T T C T T C T T C C T G C C A 或

（Ⅵ）

b）对于HSV-1，例如

5′-G C G G G G C T C C A T G G G G G T C G-3′

（Ⅶ）

本发明的药物也适于治疗例如肿瘤。例如引入针对肿瘤发生或生长的目标的聚酰胺-寡核苷酸-顺序。这个目标例如是：

1）核内癌基团，例如c-myc，N-myc，c-myb，c-fos，c-fos/jun，PCNA，P120

2）与胞浆/膜有关的癌基团，例如EJ-ras，C-Ha-ras，N-ras，rrg，bcl-2，cdc-2，c-raf-1，c-mos，c-src，c-abl。

3）细胞受体，例如EGF-受体，c-erbA，维甲酸受体，蛋白激酶调节部分，c-fms。

4）细胞素，生长因子、细胞外基质，例如CSF-1，IL-6，IL-1a，IL-1b，IL-2，IL-4，bFGF，促骨髓细胞增生素，fibronectin。

本发明对这些的目标有效的式Ⅰ反义聚酰胺-寡核苷酸例如有如下的碱基次序：

a）对c-Ha-ras，例如

5′-C A G C T G C A A C C C A G C-3′

（Ⅷ）

b）bFGF，例如

5′-G G C T G C C A T G G T C C C-3′

（XXX）

c）c-myc，例如

5′-G G C T G C T G G A G C G G G G C A C A C-3′

（Ⅸ）

5′-A A C G T T G A G G G G C A T-3′

（Ⅹ）

d）c-myb，例如

5′-G T G C C G G G G T C T T C G G G C-3′

（Ⅺ）

e）c-fos，例如

5′-G G A G A A C A T C A T G G T C G A A A G-3′

（Ⅻ）

5′-C C C G A G A A C A T C A T G G T C G A A G-3′

（ⅩⅢ）

5′-G G G G A A A G C C C G G C A A G G G G-3′

（XIV）

f）p120，例如

5′-C A C C C G C C T T G G C C T C C C A C-3′

（XV）

g）EGF-Rezeptor，例如

5′-G G G A C T C C G G C G C A G C G C-3′

（XVI）

5′-G G C A A A C T T T C T T T T C C T C C-3′（XVII）

h）p53肿瘤抑制剂，例如

5′-G G G A A G G A G G A G G A T G A G G-3′

（XVIII）

5′-G G C A G T C A T C C A G C T T C G G A G-3′r

（XIX）

本发明药物还适于治疗由于整合或细胞-细胞粘合受体而受到影响所产生的疾病，例如由于VLA-4、VLA-2、ICAM，VCAM或ELAM引起的疾病。

本发明的对这些目标有效的反义聚酰胺-寡核苷酸衍生物例如有如下的碱基次序：

a）VLA-4，例如

5′-G C A G T A A G C A T C C A T A T C-3′ 或

（XX）

b）ICAM，例如

5′-C C C C C A C C A C T T C C C C T C T C-3′

（XXI）

5′-C T C C C C C A C C A C T T C C C C T C-3′

（XXII）

5′-G C T G G G A G C C A T A G C G A G G-3′

（XXIII）

c）ELAM-1，z.B.

5′-A C T G C T G C C T C T T G T C T C A G G-3′

（XXIV）

5′-C A A T C A A T G A C T T C A A G A G T T C-3′

（XXV）

本发明药物还适于例如抑制复发病症，例如可引入这样的聚酰胺-寡核苷酸顺序，它针对引起增生和转移的目标，这类目标例如是：

1）核转激活剂-蛋白和循环素（Cycline），如c-myc，c-myb，c-fos，c-fos/jun，循环素和cdc.2-激酶，

2）分裂素或生长因子，如PDGF，bFGF，EGF，HB-EGF和TGF-β，

3）细胞受体如bFGF-受体，EGF-受体和PDGF-受体。

本发明对这些目标有效的式Ⅰ反式聚酰胺-寡核苷酸例如有如下的碱基顺序：

a）c-myb

5′-G T G T C G G G G T C T C C G G G C-3′

（XXVI）

b）c-myc

5′-C A C G T T G A G G G G C A T-3′

（XXVII）

c）cdc2-激酶

5′-G T C T T C C A T A G T T A C T C A-3′

（XXVIII）

d）PCNA（大鼠增生细胞核抗原）

5′-G A T C A G G C G T G C C T C A A A-3′

（XXIX）

这类药物可以例如以药物制剂的形式使用，可口服例如片剂、包衣剂、硬-和软明胶胶囊，溶液，乳剂或悬浮剂。药物封入脂质体内也是一种应用剂型，脂质体中可任选含有其它成份如蛋白质。也可以直肠用药，例如检剂形式或肠胃道外给药，例如注射液。为了制备药物制剂，这些化合物可与治疗学上惰性的有机和无机载体加工制造。对于片剂、包衣剂和硬明胶胶囊用的载体例如是乳糖、玉米淀粉或它们的衍生物，滑石粉和硬脂酸或其盐。制备溶液适宜的载体是水，多元醇、蔗糖、转化糖和葡萄糖。用于注射液的适宜载体是水、醇、多元醇、甘油和植物油。用于栓剂的适宜载体是植物油和硬化油，蜡、脂肪和半流动多元醇。药物制剂中也可含有防腐剂、溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、甜味剂、色素、矫味剂、改变渗透压的盐，缓冲液，复盖剂、抗氧剂，以及任选地含有其它治疗剂。

局部应用是优选的给药形式，局部应用时例如借助于导管或注射。为了注射用，可将反义一聚酰胺-寡核苷酸衍生物制成液态溶液，优选为生理上可接受的缓冲液，例如汉克液或林格液。反义聚酰胺寡核苷酸也可制成固体剂型，在用前加以溶解或呈悬浮液。全身用药的优选剂量大约为每日0.01mg/kg～50mg/kg体重。

本发明还涉及式Ⅰ化合物作为DNA探针或引物用于DNA诊断，特别是作为在HOE92/F406（EP-AO 602524）中所谓的基因探针的应用，以及通常作为辅助剂用于分子生物学上。

在DNA诊断上，基因探针，又称DNA探针或杂交-探针对于某些基因的特异顺序的鉴定起重要作用。基因探针一般是由识别顺序和适当的标记基团所组成。在分析试验中，确定目标顺序的特异性是借助于与互补的基因探针进行杂交，通过识别顺序及其化学结构加以测定的。PNA与天然结构的寡核苷酸不同，它具有与目标顺序有较高亲和力的优点。然而杂交后降低了特异性，因为PNA与天然DNA不同，它既可以正向平行，也可以反向平行地与单股核酸相结合。本发明的PNA/DNA-低聚物也显示了提高的结合亲和性，而结合时优选于所希望的反向平行的方向。

此外，对基因探针的PNA或DNA部分作相应的选择，还可以有成效地影响分化能力，因为在PNA部分的错误碱基对导致杂交分子熔点的下降要比DNA部分的错误碱基对引起的熔点下降更剧烈，这对分化过程的点突变作用尤其重要，例如在由原癌基因转变成相应的癌基因（病原状态）所出现的那样。本发明PNA/DNA-低聚物的引物性质具有改善的分辨病原和非病原基因的优点而被利用，只要是在DNA部分的3’-位有羟基存在。PNA对于聚合酶没有这种引物功能。令人意外地发现，为了启动聚合酶反应，例如借助于DNA-聚合酶（Klenow片断），在PNA/DNA低聚物的末端有核苷单无就足够了。根据PNA/DNA引物的性质和引物以顺序特异的方式进行杂交的模板的性质，可以使用各种聚合酶。这些通常可以买到，例如Taq-聚合酶，Klenow-聚合酶或逆转录酶。

与应用天然寡核苷酸引物相比，另一个优点是，借助于PNA/DNA引物复制出在5’-末端含有PNA-部分的核酸链，它对5’-核酸外切酶是稳定的。因而在反应混合物中的所有天然DNA-或RNA顺序都被5’-核酸外切酶裂解掉，而不会损伤含有PNA的链。

PNA/DNA-低聚物的另一个优点是，用它在DNA部分也可进行生物化学反应，而PNA本身则是不可能的。这些反应的例子有：具有3’-末端转移酶的“3’-结尾”，DNA-双股范围内的限制酶切以及连接酶反应。例如有3’-位游离羟基的（PNA）-（DNA）-OH低聚物与在5’-末端含有核苷-5’-磷酸的第二个P-（DNA）-（PNA）低聚物在DNA-连接酶的存在下，于天然来源的互补DNA-辅助顺序上进行杂交后联结在一起。

此外，（DNA）-（PNA）-（DNA）低聚物结合于基因中，而用PNA是不可能的。

标记基团偶联到PNA/DNA-低聚物可按已知方法进行，如同在寡核苷酸或肽中所叙述，标记基团的种类可变换很宽，所采取的标记基团主要取决于所使用的检验方法。基因探针检测的已知形式是“杂交保护”检测，“能量转移”检测和“吻合探针”检测。因此，PNA/DNA低聚物特别适用于“股线置换（Strand Displacement）”检测。在许多情况下，将生成的杂交分子从过量的基因探针中分离出来，借助于磁颗粒方法是有利的。本发明的PNA/DNA基因探针的稳定性比常规的DNA-探针的为高。

“聚合酶链反应”（PCR）和“连接酶链反应”（LCR）是进行目标放大的技术，此时本发明的低聚物也可作为引物。PNA/DNA低聚物作为基因探针按照“圣诞树”原则加以应用特别有优点，因为此时用PNA/DNA探针可以比相应的DNA探针短。

实施例

使用的氨基酸缩写是按肽化学中常规的三字母编码表示，如在Europ.J.Biochem，138，9（1984）中所述。其它的缩写如下所述：

Aeg：N-（2-氨基乙基）甘氨酰，-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CO-

Aeg（a^MeOBz）：N-（2-氨基乙基）-N-（（q-（N⁶-4-甲氧基苯甲酰）-腺苷基）乙酰基）-甘氨酰基

Aeg（c^Bz）：N-（2-氨基乙基）-N-（（1-（N⁴-苯甲酰）-胞苷基）乙酰基）-甘氨酰基

Aeg（c^MeOBz）：N-（2-氨基乙基）-N-（（1-（N⁴-4-甲氧基苯甲酰）-胞苷基）乙酰基）-甘氨酰基

Aeg（c^tBuBz）：N-（2-氨基乙基）-N-（（1-（N⁴-4-叔丁基苯甲酰）胞苷基）乙酰基）-甘氨酰基

Aeg（g^iBu）：N-（2-氨基乙基）-N-（（9-（N²-异丁酰基鸟苷基）乙酰基）甘氨酰基

Aeg（g^2-Ac，4-DpC）：N-（2-氨基乙基）-N（（9-（N²-乙酰基-O⁴-二苯基氨甲酰基）乌苷基）甘氨酰基

Aeg（t）：N-（2-氨基乙基）-N-（（1-胸苷基）乙酰基）-甘氨酰基

Bnpeoc：2，2-[双（4-硝基苯基）]-乙氧羰基

Boc：叔丁氧羰基

BOI：2-（苯并三唑-1-基）氧-1，3-二甲基-咪唑啉鎓六氟磷酸盐

BOP：苯并三唑基-1-氧-三-（三甲胺基）鏻鎓六氟磷酸盐

BroP：溴化-三-（二甲胺基）鏻鎓-六氟磷酸盐

BSA：N，O-双-（三甲基甲硅烷基）-乙酰胺

But：叔丁基

Bz：苯甲酰基

Bzl：苄基

Cl-Z：4-氯-苄氧羰基

CPG：控孔玻璃

DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯（1，5-5）

DCM：二氯甲烷

Ddz：3，5-二甲氧苯基-2-丙基-2-氧羰基

DMF：二甲基甲酰胺

Dmt：二-（4-甲氧苯基）苯甲基

Dnpeoc：2-（2，4-二硝基苯基）-乙氧羰基

Dpc：二苯基胺甲酰基

FAM：荧光素基

Fm：9-芴甲基

Fmoc：9-芴基甲氧羰基

H-Aeg-OH：N-（2-氨基乙基）甘氨酸

HAPyU：O-（7-氮杂苯三唑-1-基）-1，1，3，3-双（四亚甲基）脲鎓-六氟磷酸盐

HATU：O-（7-氮杂苯并三唑-1-基）-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

HBTU：O-（苯并三唑-1-基）-1，1，3，3-四甲基脲翁六氟磷酸盐

HOBt 1-羟基苯并三唑

HONSu：N-羟基丁二酰亚胺

HOObt：3-羟基-4-氧代-3，4-二羟基苯并三嗪

iBu：异丁酰基

MeOBz：4-甲氧基苯甲酰基

Mmt：4-甲氧基三苯甲基;

Moz：4-甲氧基苄氧羰基，

MSNT：2，4，6-均三甲苯磺酰基-3-硝基-1，2，4-三唑

Mtt：4-（甲基苯基）二苯甲基

NBA：硝基苄醇

NMP：N-甲基吡咯烷

Obg：N-（4-氧丁基）甘氨酰;-O-（CH₂）₄-NH-CH₂-CO-

Obg（t）：N-（4-氧丁基）-N-（（1-胸苷基）乙酰基）-甘氨酰基，

Oeg：N-（2-氧乙基）甘氨酰，-O-（CH₂）₂-NH-CH₂-CO-

Oeg（t）：N-（2-氧乙基）-N-（（1-胸苷基）乙酰基）-甘氨酰基

Opeg：N-（5-氧戊基）-甘氨酰，-O-（CH₂）₅-NH-CH₂-CO-

Opeg（t）：N-（5-氧戊基）-N-（（1-胸苷基）乙酰基）-甘氨酰基

Oprg：N-（3-氧丙基）-甘氨酰，-O-（CH₂）₃-NH-CH₂-CO-

Oprg（t）：N-（3-氧丙基）-N-（（1-胸苷基）乙酰基）-甘氨酰基

P xyl：9-（9-苯基）呫吨基

PyBOP：苯并三唑基-1-氧-三吡咯烷基鏻鎓六氟磷酸盐

PyProP：溴-三吡咯烷基鏻鎓六氟磷酸盐

TAPipU：O-（7-氮杂苯并三唑-1-基）-1，1，3，3-双（五亚甲基）脲鎓-四氟硼酸盐

TBTU：O-（苯并三唑-1-基）-1，1，3，3-四甲基脲翁-四氟硼酸盐

tBu：叔本基

tBuBz：4-叔丁基苯甲酰基

TDBTU：O-（3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3-基）-1，1，3，3-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐

TDO：2，5-二苯基-2，3-二氢-3-氧代-4-羟基噻吩二氧化物

Teg：N-（2-硫乙基）甘氨酰基，-S-CH₂CH₂-NHCH₂-CO-

Teg（t）：N-（2-硫乙基）-N-（（1-胸苷基）乙酰基）-甘氨酰基，

TFA：三氟乙酸

THF：四氢呋喃

TNTU：O-[（5-降冰片烯-2，3-二碳亚胺基]-1，1，3，3-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐

TOTU：O-[（氰基（乙氧羰基）亚甲基）氨基]-1，1，3，3-四甲脲鎓-四氟硼酸盐

TPTU：O-（1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基）-1，1，3，3-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐

Trt：三苯甲基

TSTU：O-（N-丁二酰亚胺基）-1，1，3，3-四甲基脲翁-四氟硼酸盐

Z：苄氧羰基

MS（ES⁺）：电喷雾质谱（正离子）

MS（ES^-）：电喷雾质谱（负离子）

MS（DCI）：直接电离质谱

MS（FAB）：快原子轰击质谱

实施例1

1-羟基-6-（（4-甲氧苯基）-二苯甲胺基）-己烷

Mmt-hex

6-氨基己烷-1-醇（1g;8.55mmol）溶于无水吡啶7ml中，与0.2ml三乙胺混合。于45分钟内向此溶液中加入2.5g（4-甲氧基苯基）-二苯甲基氯化物（8.12mmol）于9ml无水吡啶中。反应溶液于22℃再搅拌30分钟，滴加入甲醇3ml。将溶液于旋转蒸发器上浓缩，得到的剩余物与甲苯共沸蒸馏以除去吡啶。得到的剩余物溶解于乙酸乙酯中，先后用饱和碳酸氢钠水溶液、水和饱和氯化钾溶液洗涤。有机相用Na₂SO₄干燥，过滤，真空浓缩，粗品经硅胶层析，庚烷∶乙酸乙酯∶三乙胺/49.5∶49.5∶1洗脱，纯化，得量：1.64g。

MS（FAB，NBA/Licl）396.3（M+Li）⁺，390.3（M+H）⁺，273.2（Mmt）⁺

R_f0.44（庚烷∶乙酸乙酯＝1∶1），

实施例2

丁二酸-6-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）-己-1-基半酯Mmt-hex-succ

1.00g 1-羟基-6-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）-己烷（2.57mmol）溶解在10ml无水吡啶中。向此溶液中加入0.257g琥珀酸酐（2.57mmol）和4，4-二甲胺基吡啶31.3mg（0.257mmol）。于22℃搅拌3小时，再加入25.7mg琥珀酸酐（0.257mmol）和62.6mg4，4-二甲胺基吡啶（0.56mmol），溶液于50℃搅拌6小时。于22℃再搅拌16小时后，浓缩，剩余物溶解于乙酸乙酯，将此溶液用冰冷的5%柠檬酸水溶液洗涤。有机层经Na₂SO₄干燥后，于旋转蒸发器中浓缩。硅胶层析纯化剩余物，先用50%CH₂Cl₂/10%三乙胺的乙酸乙酯液洗脱，然后用5%甲醇/1%三乙胺于二氯甲烷中的溶液洗脱，得到所需的化合物，为无色油状物。

MS（ES⁺）978.0（ZM-H）^-;488.3（M-H）^-

R_f0.30（CH₂Cl₂∶乙酸乙酯＝1∶1）

实施例3

6-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）-己-1-基琥珀酰胺基-Tentagel

（Mmt-hex-succ-Tentagel）

0.5g Tentagel

（Rapp聚合物）的氨基型式（0.11mmol氨基）于4-乙基吗啉（0.1ml）和5ml DMF中浸渍10分钟。然后加入97.4mg丁二酸6-（（4-甲氧基苯基）-二苯基甲胺基-己-1-基半酯（0.165mmol）、4-乙基吗啉（15.9mg，0.138mmol;17.4ml）和52.9mg TBTU（0.165mmol）于3mlDMF的溶液。悬浮物于22℃振摇16小时。滤除衍生化的Tentagel-载体，先后用DMF（3×3ml）、CH₂Cl₂（3×1ml）和乙醚（3×1ml）洗涤并干燥。未反应的氨基功能基用乙酸酐/二甲基吡啶/1-甲基咪唑于1ml THF的试剂处理1小时以阻断之。得到的载体用CH₂Cl₂（3×1ml）和乙醚（3×1ml）洗涤，真空中干燥。装载量以加入的单甲氧基三苯甲基功能基计有168mmol/g。

实施例4

6（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）-己-1-基-琥珀酰胺基丙基-控孔玻璃

（Mmt-hex-succ-CPG）

按实施例3所述的类似方法，由氨丙基-CPG（Fluka公司）（550

;1.0g）;丁二酸6-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）-己-1-基半酯（48.7mg，0.082mmol），4-乙基吗啉（7.6ml）和TBTU（26.4mg，0.082mmol）于DMF（3ml）中。Mmt-hex-succCPG的载量为91mmol/g。

实施例5

N-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）乙基-N-（（1-（N⁴-（4-叔丁基苯甲酰）-胞嘧啶基）乙酰基）甘氨酸

（Mmt-Aeg（c^tBuBz）-OH）

将1.63g N-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）乙基-N-（（1-（N⁴-（4-叔丁基苯甲酰基）胞嘧啶基）乙酰基）甘氨酸甲酯溶解于由10ml二噁烷和1ml水的混合物中，0℃搅拌下滴加4.56ml 1N NaOH混合。2小时后，滴加1N KHSO₄以使pH为5，滤除沉出的盐，少量二噁烷洗涤。合并滤液，真空浓缩，剩余物用甲醇和二氯甲烷共沸蒸馏各2次。得到的粗品用硅胶层析，梯度洗脱用2-10%甲醇和1%三乙胺于二氯甲烷的混合液以纯化。含有产物的组分合并后真空浓缩，先与吡啶共沸、再与甲苯共沸蒸馏以除去过量的三乙胺，得到0.831g产物，为自色泡沫状物。

电喷雾MS（负离子）700.7（M-H）^-，

R_f0.28（CH₂Cl₂∶MeOH/9∶1），0.63（CH₂Cl₂∶MeOH/7∶3）。

实施例6

N-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）乙基-N-（（1-胸腺嘧啶基）乙酰基）甘氨酸

（Mmt-Aeg（t））-OH

上面反应的产物溶解在由10ml二噁烷和2ml水组成的混合液中。将溶液冷却到0℃，滴加1N氢氧化钠，使pH为11。反应2小时后，停止反应，向此溶液中小心加入2N KHSO₄溶液，使pH为5，用乙酸乙酯萃取3次。合并有机层，硫酸钠干燥，真空浓缩。得到的粗产物硅胶层析，梯度洗脱，洗脱液为5-10%甲醇和1%三乙胺的二氯甲烷液。合并含有产物的组分，真空浓缩。与吡啶共沸，然后与甲苯共沸，以除去尚残留的过量的三乙胺。得到1.065g产物，为无色泡沫。

电喷雾MS（负离子）1112.0（2M-H）^-;555.3（M-H）^-

R_f0.28（CH₂Cl₂∶MeOH/8∶2）

实施例7

N-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）乙基-N-（9-（N²-（异丁酰基）-鸟嘌呤基）乙酰基）甘氨酸

（Mmt-Aeg（g^iBu）-OH

N-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）乙基-N-（9-（N²-（异丁酰基）鸟嘌呤基）乙酰基）甘氨酸甲酯（1.15g;1.72mmol）溶解于10ml二噁烷中，0℃下于2.5小时内分5次滴加入1M氢氧化钠（10.32ml）水溶液。室温下再反应2小时后，滴加入2M硫酸氢钾水溶液，使pH为5。滤除析出的盐，少量二噁烷洗涤。合并滤液，真空浓缩至干，剩余物用乙醇及二氯甲烷∶甲醇1∶1共沸蒸馏各2次。用硅胶柱层析纯化，梯度洗脱，洗脱液为10-20%甲醇的二氯甲烷液（含1%三乙胺）。得到的产物为白色泡沫。产量1.229g。

ESMS（负离子）：650.3（M-H）^-

R_f0.25（二氯甲烷∶甲醇/8∶2）

实施例8

N-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）乙基-N-（9-（N⁶-（4-甲氧基苯甲酰基）腺嘌呤基）乙酰基）甘氨酸

（Mmt-Aeg（a^MeOBz）-OH

N-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲胺基）乙基-N-（9-（N⁶-（4-甲氧基苯甲酰基）腺嘌呤基）乙酰基）甘氨酸甲酯（1.70g;2.38mmol）溶解于二噁烷（10ml），0℃下于2.5小时内分5次将10.312mk 1M氢氧化钠水溶液滴加入。室温下再反应2小时，滴加入2M硫酸氢钾水溶液使pH为5。滤除析出发的盐，少量二噁烷洗涤。合并滤液，真空浓缩至干，剩余物用乙醇和二氯甲烷∶甲醇1/1共沸蒸馏各二次。剩余物用硅胶柱层析纯化，梯度洗脱，10-20%甲醇的二氯甲烷液（含1%三乙胺）。得到的产物为白色泡沫。产量1.619g。

ESMS（负离子）：698.3（M-H）^-

R_f0.10（二氯甲烷∶甲醇/8∶2）

实例9

N-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲氧基）乙基-N-（（1-胸腺嘧啶基）乙酰基）甘氨酸

（Mmt-Oeg（t）-OH）

0.5g（1.28mmol）N-（（4-甲氧基苯基）-二苯甲氧基）乙基甘氨酸悬浮于10ml DMF中，向其中滴加入0.47ml（1.92mmol）BSA。依次加入0.7ml（5.1mmol）三乙胺和0.26g（1.28mmol）氯化羧甲基胸腺嘧啶。室温下搅拌反应混合物4小时，再加入65mg（0.32mmol）氯代羧甲基胸腺嘧啶，再搅拌16小时、然后真空蒸除溶剂，粗产品硅胶层析，梯度洗脱用5-15%甲醇和1%三乙胺的二氯甲烷液。含有产物的组分合并后真空蒸发，剩余的褐色油状物溶解于少量二氯甲烷，加入乙醚使产物析出。得到的产物为白色粉末，产量0.219g。

电喷雾MS（分离子）556.3（M-H）^-

R_f0.54（CH₂Cl₂∶甲醇/8∶2）

实施例10

4-硝基苯基-4-（4，4’-二甲氧基三苯甲氧基）丁酸酯

Dmt-but-NPE

1.26g（10mmol）4-羟基丁酸钠溶解于30ml无水吡啶中，与3.39g（3.05mmol）4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物混合。16小时后加入1.39g4-硝基酚（10mmol）和N，N’-二环己基碳二亚胺（2.06g，10mmol），22℃下再搅拌48小时。滤除析出的二环己基脲，二氯甲烷洗涤，滤液浓缩，剩余物与甲苯共沸蒸馏2次。剩余物经硅胶纯化（洗脱剂为10-50%乙酸乙酯和1%三乙胺的石油醚液），所需产物为浅黄色油状物，产量2.694g。

MS（FAB，MeOH/NBA/LiCl）534.2（M+Li）⁺;527.2M⁺

R_f0.34（石油醚∶乙酸乙酯＝75∶25）

实施例11

H-Oprg（t）-OH

3.68g胸腺嘧啶乙酸溶解于20ml干燥DMF中，加入6.65g TOTU和2.77ml三乙胺。室温下搅拌该混合物30分钟，慢慢滴加入由5.32g（3-羟丙基）甘氨酸、20ml水、20ml DMF和5.54ml三乙胺组成的溶液。室温搅拌1小时后，真空下于旋转蒸发器上浓缩。剩余物溶于水，用1N盐酸调节pH为5，乙酸乙酯萃取。水相用饱和碳酸氢钠溶液调节pH为1，旋转蒸发器上浓缩。剩余物中加入250ml乙醇，滤除析出的氯化钠，浓缩滤液，粗产物经硅胶层析，洗脱剂二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶4∶1中加入1%三乙胺，后用二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶4∶1中加入1%三乙胺洗脱。合并含有产物的组分。真空中旋转蒸发器上浓缩，得3.2g产物。

R_f0.15（二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶2∶1+1%三乙胺）

MS（ES⁺）：300.2（M+H）⁺。

实施例12

Dmt-Oprg（t）-OH

3.2gH-Oprg（t）-OH溶解于40ml DMF中，加入5.93ml三乙胺，0℃下于20分钟内滴加入7.25g Dmt-Cl于40ml二氯甲烷的溶液。室温再搅拌2小时，滤除析出的盐酸三乙胺，滤液于旋转蒸发器上真空蒸发。剩余物溶解于二氯甲烷，水萃取，有机相经硫酸钠干燥，旋转蒸发器中真空浓缩。粗产品经硅胶层析，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶2∶1中加入1%三乙胺。含有产物的组分合并后于旋转蒸发器中真空浓缩。产量3.46g。

R_f0.28（二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶2∶1+1%三乙胺）

MS（ES⁺）602.4（M+H）⁺

实施例13

H-Obg（t）-OH

2.76g胸腺嘧啶乙酸溶解于15ml干燥的DMF中，加入4.92gTOTU和2.08ml三乙胺。室温下搅拌该混合物30分钟。然后慢慢滴入由4.41g（4-羟丁基）甘氨酸、10ml水、10ml DMF和4.16ml三乙胺组成的溶液，室温下再搅拌3小时，旋转蒸发器中真空浓缩，剩余物溶于水，1N盐酸调节pH为1.5，乙酸乙酯萃取，水相用饱和碳酸氢钠溶液调节pH为5，旋转蒸发器中浓缩。粗产品经硅胶层析，二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶2∶1中加入1%三乙胺洗脱，合并含有产物的组分，旋转蒸发器中真空浓缩，产量3.7g。

R_f0.11（二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶2∶1+1%三乙胺）

MS（ES⁺）314.2（M+H）⁺

实施例14

Dmt-Obg（t）-OH

3.6g H-Obg（t）-OH溶解于40ml DMF中，加入9.5ml三乙胺。于0℃、15分钟内滴加入15.4g Dmt-Cl于40ml二氯甲烷的溶液，室温下再搅拌2小时，再加入二氯甲烷40ml。过滤掉析出的盐酸三乙胺。滤液于旋转蒸发器中真空浓缩。剩余物溶解于二氯甲烷，水萃取，硫酸钠干燥有机相，旋转蒸发器中真空浓缩，剩余物经硅胶层析，二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯15∶1∶1加入1%三乙胺洗脱，合并含有产物的组分，旋转蒸发器中真空浓缩，产量3.45g。

R_f0.29（二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶2∶1+1%三乙胺）

MS（ES⁺+LiCl）622.3（M+Li）⁺

实施例15

H-Opeg（t）-OH

2.76g胸腺嘧啶乙酸溶解于15ml干燥DMF中，加入4.92g TOTU和2.08ml三乙胺。室温下搅拌30分钟。然后慢慢滴加由4.83g（5-羟基戊基）甘氨酸、10ml水、10ml DMF和4.16ml三乙胺组成的溶液。室温下再搅拌3小时，旋转蒸发器中真空浓缩。剩余物溶于水，1N盐酸调节pH为1.5，乙酸乙酯萃取，水相用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至5，旋转蒸发器上浓缩。粗品经硅胶层析，二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶2∶1和1%三乙胺洗脱，合并含有产物的组分，旋转蒸发器中真空浓缩，收量：3.34g。

R_f0.19（二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶2∶1+1%三乙胺）

MS（DCl）328.2（M+H）⁺

实施例16

Dmt-Opeg（t）-OH

3.2g H-Opeg（t）-OH溶于40ml DMF中，加入6.77ml三乙胺，0℃、15分钟内滴加入9.94g Dmt-Cl于40ml二氯甲烷的溶液，室温再搅拌2小时，加入40ml二氯甲烷，滤除析出的盐酸三乙胺，滤液于旋转蒸发器中真空浓缩，剩余物溶于二氯甲烷，水萃取，有机相经硫酸钠干燥，旋转蒸发器中真空浓缩。粗产品经硅胶层析纯化，用二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯15∶1∶1加1%三乙胺洗脱，含有产品的组分合并后于旋转蒸发器中真空浓缩，产量3.6g。

R_f0.27（二氯甲烷/甲醇/乙酸乙酯10∶2∶1+1%三乙胺）

MS（ES⁺+LiCl）：636.4（M+Li）⁺。

实施例17

5’-ATC GTC GTA TT-（but）agtc-hex

DNA顺序用大写字母表示，PNA顺序用小写字母表示（流程图1的结构Xlla为一实例）。

PNA的合成有代表性地在Ecosyn D-300 DNA合成器（Eppendorf/Biotronik制造，Maintal）或ABI 380 B DNA合成器（Applied Biosystems制造，Weiterstadt）中进行。DNA部分的合成原则上按照标准的氨基磷酸化学法和市售的合成器中进行。PNA部分的合成按肽合成方法（如下所述）于DNA合成器中进行。

其中n＝1-8，优选为1-5

由实施例4制备的用Mmt-hex-succ载荷的3μmol CPG-载体（载量91μmol/g）依次用如下的试剂处理：

PNA-部分的合成（agtc-hex）：

1.二氯甲烷

2.3%三氯乙酸的二氯甲烷液

3.无水乙腈

4.3.5M4-乙基吗啉于乙腈的溶液（中和作用）

5.0.4M（Mmt-Aeg（c^t-BuBz）-OH）（于实施例5制备）于乙腈：DMF＝9.1混合液中的溶液/0.9M ByBOP于乙腈的溶液/3.5M 4-乙基吗啉于乙腈的溶液（10分钟偶联时间）。

6.步骤5重复4次。

7.乙腈

步骤1～7，下面称作PNA-反应循环，为构造PNA部分要重复3次，其中在步骤5每次都要按照次序把由实施例5～8得到的必需的单体单元加入。连接子的结合（agtc-hex--→（but）-agtc-hex）：

8.重复上面的步骤1～4

9.实施例10的4-硝基苯酚的4-（4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基）-丁酸酯（105mg）和羟基苯并三唑（27mg）于2m NEM的DMF溶液中，处理15小时。

10.用DMF洗涤

11.用乙腈洗涤

12.二氯甲烷

DNA-部分的合成

（（but-agtc-hex）-→5’-ATC GTC GTA TT-（but）-agtc-hex）

13.无水乙腈

14.3%三氯乙酸于二氯甲烷中的溶液

15.无水乙腈

16.10μmol5’-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-3’-磷酸-β-氰乙酯-酰二异丙胺（diisopropylamidit）和50μmol四唑于0.3ml无水乙腈的溶液。

17.乙腈

18.20%乙酸酐于THF的溶液并且含40%二甲基吡啶和10%二甲胺基吡啶

19.乙腈

20.碘（1.3g于THF/水/吡啶中;70∶20∶5＝V∶V∶V）

步骤13～20，下面称作DNA-反应循环，为构造核苷酸部分要重复10次，其中在第16步要按顺序加入相应的5’-O-二甲氧基三苯甲基（核苷碱基）-3’-磷酸-β-氰乙酯-酰二异丙胺。

在结束合成以后，要裂解掉二甲氧基三苯甲基，如同步骤1～3所述。用氨处理1.5小时，低聚物从载体上裂解掉，同时除掉了β-氰乙基。为了裂解掉环外的氨基保护基，将氨制溶液于55℃保持5小时。由得到的粗产物（325 OD₂₆₀）5’-ATC GTC GTA TT-（but）-agtc-hex经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化为180 OD₂₆₀。在Biogel^R柱（Biorad公司出品）去盐后得到50OD₂₆₀高纯低聚物。

实施例18

5’-ATC GTC GTA TT-（Oeg（t））-agtc-hex

（流程图2中结构Xa的实例;对Oeg（t）的解释参见实施例9）。

该合成法按实施例17所述的进行，但在步骤9不用Dmt-丁酸-对-硝基苯酯这一连接单元，而是按步骤5所述的条件用实施例9的Mmt-Oeg（t）-OH。由得到的粗产品（235 OD₂₆₀5’-ATC-GTC-GTA-TT-（Oeg（t））-agtc-hex经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化为135 OD₂₆₀，在Biogel^R柱上（Biorad公司出品）脱盐后，得到20OD₂₆₀高纯低聚物。

实施例19

N-ggg g（5’NH-C）T C_sC_sA_sTGG GG_sG_sT（对HSV-1的顺序）（流程图2中结构X1的实例，下标S表示硫代磷酸桥连基;（5’NH-C）代表5’-氨基胞苷酸基;N为氨基末端）。

该合成由CPG-载体开始，5’-Dmt-胸苷经其3’-端基相连。首先如实施例17所述合成DNA-部分（步骤13～20），此时若是硫代磷酸桥连（s）时，步骤20的氧化用四乙基二硫化秋兰姆（TET-D;Firma Applied Biosystems公司的用户手册No. 65）进行。作为连接单元加入Dmt-保护的5’-氨基-5’-脱氧-胞苷-3’-氨基磷酸-单元（式VIIIf）。然后按照步骤1～7（实施例17）缩合PNA单元。合成结束后用氨处理1.5小时，将低聚物从载体上裂掉，同时除去了β-氰乙基。为了裂解掉环外氨基保护基，用氨制溶液保温55℃5小时。再于22℃用80%乙酸处理2小时，裂解掉单甲氧基三苯甲基。产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，于Biogel^R（Biorad公司出品）柱上脱盐。

实施例20

5’-G_MeG_MeG GCT CCA（Oeg（t））gg ggg t-hex

流程图2中结构Xa的实例;下标Me表示甲基磷酸桥连基;对Oeg（t）的解释见实施例9）

本合成法按实施例18所述的进行。但为了构造甲基磷酸桥连Me，在DNA合成循环中加入式VIIIb的相应甲基磷酸单元。

实施例21

5”-C_s，_sA_s，_sC GT_s，_sT GAG（but）Ggg cat-hex（c-myc反义）

（流程图1的结构XIIa的实例，下标s，s表示二硫代磷酸桥连基）

本合成法按照实施例17所述的进行，但为了构造二硫酯桥连，加入式VIIId的单元，此时氧化作用（步骤20）用TETD进行。

实施例22

N-Cga g（5’NH-A）A CAT CA（Oeg（t）ggt cg-hex（c-fos反义）

（5’NH-A代表5’-氨基-5’-脱氧腺苷酸;对Oeg（t）的解释见实施例9）

本合成法按照实施例18所述进行，在结束了DNA合成后，按照实施例13所述，缩合上5’-氨基核苷酸，从而得以结合上第二个PNA一部份。为此，首先进行六轮PNA合成循环，然后偶联上实施9的连接单元。再进行七轮DNA-合成循环，在最后一轮时，采用式VⅢf的单元。再后进行四轮的PNA合成循环，再按实施例19所述，从载体上裂掉并进一步处理。

实施例23

F-cga g（5’NH-A）A CAT CAT GGT_sC_sG-O-CH₂CH（OH）CH₂-O-C₁₆H₃₃

5’NH-A代表5’-氨基-5’-脱氧腺苷酸;F为PNA末端氨基上的荧光基团，下标s代表硫代磷酸桥连基）

本合成按照实施例19所述进行，但从CPG-载体出发，它与甘油-十六烷醚连接。进行12轮DNA合成循环后，缩合上连接单元VIIIf。进行四轮PNA合成循环后，裂解掉末端的Mmt-基，游离氨基与30倍过量的荧光素异硫氰酸酯（FITC）定量地反应。

实施例24

3’-CCC TCT T-5’-（PEG）（PEG）-（Oeg（t）tg tgg g-hex（PEG代表四乙二醇磷酸基）

本合成关于PNA一部分是按照实施例17所述方法进行的。进行六个PNA单元缩合后，偶联上实施例9的（Mmt-Oeg（t）-OH）。然后如在DNA-合成循环中所述，先缩合式XV的四乙二醇衍生物两次，以作为连接子，然后通过逆向定位（由5’到3’）合成DNA部分。为此，在DNA合成循环时不用第16步的核苷-3’-氨基磷酸，而用式XIV的相应的核苷-5’-氨基磷酸，后者是可以买到的。再进一步去保护基和处理，如实施例17所述。

实施例25

N-CCC tct t-（C6-连接）（PEG）-3’-AAG AGG G-5’

（PEG代表四乙二醇磷酸基;C6-连接是6-氨基己醇磷酸基）

本合成按照实施例17（DNA-合成循环）所述方法进行，但从CPG-载体开始，它经过5’-O-丁二酸基与3’-O-Dmt-脱氧鸟苷相结合。借助于式XIV的单元，缩合了六个DNA-单元后，先缩合作为连接子的式XV的四乙二醇衍生物一次，然后偶联上式XVI的氨基磷酸以引入C6-连接。然后再合成PNA-部分，如在实施例17的PNA合成循环中所述。进一部除保护基和处理方法如实施例19所述。

实施例26

5’-TTT TTT TTT（but）ttt ttt-hex

本合成按照实施例17所述进行。在产物从载体上裂解掉以前和去保护前，取出一半载体结合的DNA/PNA杂交分子，以进行荧光标记（实施例27）。另一半如实施例17所述进行脱保护基和处理。

实施例27

5’-FAM-TTT TTT TTT（but）ttt ttt-hex

（FAM是荧光素基）

实施例26得到的、与载体结合的DNA/PNA杂交分子进行荧光标记，为此按实施例17的步骤13～20所述进行，在第16步加入的是Applied Biosystems公司出品的荧光素-氨基磷酸。

实施例28

5’-GGG GGGG GGG（but）ttt ttt-hex

本合成按照实施例17所述进行。在产物从载体上裂解掉和脱保护之前，取出半量的载体结合的DNA/PNA-杂交分子以进行荧光标记（实施例29）。另一半的去保护和处理如实施例17所述。本标题化合物作为形成三式型寡核苷酸，对DNA-双股链有较高亲和性，它含有高嘌呤因素的5’-AAA AAA GGG GGG GGG-3’。

实施例29

5’-FAM-GGG GGG GGG（but）ttt ttt-hex

（FAM是荧光素基）

实施例28得到的、载体结合的DNA/PNA-杂交分子进行荧光标记，为此，按实施例17所述的步骤13～20进行，第16步加入Applied Biosystems出品的荧光素-氨基磷酸。

实施例30

生物素-C_pheG_pheA GAA cat cat（5’NH-G）G（Ome）U（Ome）C（Ome）G（Ome）-维生素E

（c-fos反义）

（N（Ome）代表具有2’-O-甲氧基的核苷酸单元N;下标phe代表苯基磷酸桥连基;5’-NH-G代表5’-氨基-5’-脱氧鸟苷酸）

本合成按实施例17所述进行，由CPG开始，装载上维生素E（Mackellar等（1992）Nucleic Acids Res，20（13），3411-17），按照DNA合成循环进行四次式VIIIe单元的偶联。偶联上式VIIIf的5’-氨基核苷酸单元之后，按照PNA合成循环，缩合上六个PNA单元。中和后按已知方法将氨基磷酸偶联到氨基功能基上，并重复DNA-合成循环以构造DNA-部分，此时对苯基磷酸桥连基的情况，第16步加入式VIIIc的单元。最后将端基与Glen Research出品的生物素-氨基磷酸偶联。合成结束后，低聚物的脱保护基如实施例19所述进行，为此，于22℃用80%乙酸处理2小时，裂解掉二甲氧三苯甲基。

实施例31

A CAT CA（Oeg（t））ggt cg-hex（c-fos反义）

（Oeg（t）的解释见实施例9）

本合成按实施例18所述进行。首先进行五轮PNA合成循环，后偶联上实施例9的连接单元Oeg（t）。再进行六轮DNA合成循环。最后按实施例18所述自载体上裂解掉并进一步处理。

实施例32

A TAA TG（Oeg（t））tct cg-hex（c-fos的对比低聚物）

本合成按实施例18所述进行，首先进行五轮PNA合成循环，然后偶联上实施例9的连接单元Oeg（t），再进行六轮的DNA合循环。最后按实施例18所述，自载体上裂解掉并进一步处理。

实施例33

a cat cat ggt cg-hex（c-fos反义）

该纯净的PNA-低聚物作为对照物按实施例18所述制备，但例外的是，进行12轮的PNA-循环。除掉环外氨基保护基是在氨制溶液中（5小时，55℃）进行的。然后用80%乙酸22℃处理2小时，以除去单甲氧基三苯甲基。

实施例34

A（5-hexy-c）A（5-hexy-U）（5-hexy-C）A（Oeg（t））ggt cg-hex（c-fos反义）

（Oeg（t）的解释见实施例9;5-hexy-C代表5-己炔基-胞苷，5-Hexy-U-代表5-己炔基尿苷）

本合成按照实施例31所述进行，但在缩合反应中不用正常的嘧啶核苷-氨基磷酸，而是用5-己炔基-嘧啶核苷-氨基磷酸。

实施例35

5’-FAM-TT（but）ttt ttt-hex

（FAM是荧光素基）

PNA/DNA-低聚物类似于实施例27所述进行合成，在此显然只缩合二个胸苷酸单元。

实施例36

taa tac gac tca cta（5’HN-T）

（5’HN-T代表5’-氨基-5’-脱氧胸苷）

该PNA/DNA-低聚物是由15个PNA单元和1个核苷单元构成，它们为引物被合成，用于DNA-聚合酶反应。为此，从固相载体（氨烷基-CPG）开始，5’-单甲氧三苯甲氨基-5’-去氧胸苷通过它的3’-羟基与丁二酸相连。用含3%TCA的二氯甲烷裂解掉单甲氧基三苯甲基后，按实施例17所述进行15轮PNA循环。环外氨基保护基的脱保护作用是在氨制溶液（55℃，5小时）进行的。然后于22℃用80%乙酸处理2小时，裂解掉单甲氧基三苯甲基。得到具有游离3’-羟基的PNA/DNA-低聚物，它用作DNA-聚合酶（Klenow）的引物。

实施例37

P_s-rA（2’5’）rA（2’5’）rA（2’5’）rA-间隔基-（Oeg（t））tc ctc cgg-hex

（P_s代表5’-硫代磷酸，间隔基代表三乙二醇磷酸，rA是核糖腺苷酸;（2’5’）代表核苷酸间结合键，走向是核糖2’到5’）。

本化合物的合成按照类似于实施例18所述方法进行，首先缩合14个PNA-单元，然后按步骤与所述的条件引入实施例9制备的连接单元Mmt-Oeg（t）-OH，用3%TCA裂解掉Mmt基，再借助可以买到的Dmt-O-（CH₂CH₂O）₃-OP（-OCH₂CH₂CN）N（i-C₃H₇）₃-间隔基-氨基磷酸（Eurogentech公司出品，布鲁塞尔）引入间隔基。按实施例17所述方法，借助可买到的N6-苯甲酰-5’-O-Dmt-3′-O-叔丁基二甲硅烷基-腺苷-2’-O-氰乙基-二异丙胺基-氨基磷酸（Milligen公司出品，Bedford，美国）合成（2’5’）-连接的四腺苷酸，缩合时间为2×5分钟。在此缩合反应中，不用四唑而加入强活化剂5-乙硫基四唑。裂解掉后者的Dmt-基后，低聚物用双（β-氰乙氧基）-二异丙胺基膦在5’-羟基上亚磷酰化。用TETD氧化和用氨去保护基后，并用氟化物去硅烷化后，得到本标题化合物，它可刺激RNaseL.

实施例38

P_s-Co（2’5’）Co（2’5’）Co（2’5’）Co-间隔基-（Oeg（t））tc ctc ctg cgg-hex

（P_s代表5’硫代磷酸;间隔基代表三乙二醇磷酸，Co是虫草品（3’-脱氧腺基）;（2’5’）代表核苷酸间连接键的2’到5’的走向）

本合成类似于实施例37所述，但不用N⁶-苯甲酰-5’-O-Dmt-3’-O-叔丁基-二甲基甲硅烷基-腺苷-2’-O-氰乙基-二-异丙胺基-氨基磷酸，而是加入相应的N⁶-苯甲酰基-5’-O-Dmt-虫草品-2’-O-氰乙基-二-异丙胺基-氨基磷酸（Chemogen公司出品，Konstanz），并省去了氟化物处理。

实施例39

5’-GG GGG GGG（Oeg）（t））ttt ttt ttt-hex

本合成类似于实施例18所述的方法，为此，在新的PNA偶联后，按步骤5所述的条件缩合上实施例9制备的连接单元Mmt-Oeg（t）-OH，下一步是缩合八个鸟苷酸基。得到的PNA/DNA低聚物作为形成三式型的寡核苷酸以反向平行的方向高亲和力地与双股DNA结合，后者的顺序为5’..AAAAAAAAAAGGGGGGGG 3’。

实施例40

PNA/DNA杂交分子的鉴定

鉴定方法用HPLC、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和负离子电喷雾质谱法（ES-MS）。产物如上所述纯化后，于PAGE（20%丙烯酰胺，2%双丙烯酰胺和7M尿素）得单一色带。HPLC在反向柱RP-18（Merck公司出品）（洗脱剂A：含0.1.TFA的水;B：水/乙腈＝1∶4;线性梯度）或用Dionex公司出品的PA-100柱上进行（洗脱剂A：20mMNaOH和20mMNaCl;B：20mMNaOH和1.5M NaCl，线性梯度）。为测定ES-MS，将PNA/DNA杂交分子经乙酸铵沉淀法或其它成盐法，转变成铵盐。实验是用具有5 OD₂₆₀/ml低聚物的乙腈/水（1∶1）的溶液进行，方法的精确度为大约±1.5道尔顿。

实施例41

测定放射活性标记后的细胞的吸收和稳定性

放射活性标记

用通常使用的³⁵S标记，是在合成DNA一部分时，在DNA合成循环中（实施例17中步骤20）的至少一次氧化作用用元素35硫进行。含有5’-游离羟基的PNA/DNA杂交分子可按已知方法、借助聚核苷酸-激酶用³²P或³⁵S进行标记。带有3’-游离羟基的PNA/DNA杂交分子可按已知方法用3’-端位转移酶进行标记。这里举出DNA一部分的5’-标记作为例子：将实施例17、18或26得到的具有5’-游离羟基（500pmol）的PNA/DNA杂交分子溶解于425μl水中，加热此溶液到90℃，迅速冷却。然后加入50μl 10×激酶-缓冲液和50μl³²P·γ-ATP（6000ci/mmol）或^35s-γ-ATP，37℃温育1小时。加入0.5M EDTA溶液中止反应。用Pharmacia公司出品的NAP^R-柱除盐。

细胞吸收的测定：

Vero细胞于96孔微量滴板上于DMEM、5%FCS（胎牛血清）37℃温育24小时。之后除去培养基，用无血清的DMEM洗涤细胞二次。有放射活性标记的低聚物（10⁶cpm）用未标记的低聚物稀释到使在血清中的浓度为10μm，37℃温育。于1、7和24小时各取出150μl（标以“保存样1”）。在微量滴板的孔中的细胞用300μl新鲜培养基洗涤下次，合并洗涤液（标以“保存样2”）于闪烁计数器上测定。然后加入100μl胰蛋白酶溶液，放置30秒钟，撤出保存样。从滴板上分离出细胞，37℃温育3分钟。将分出的细胞转移到1.5ml的Eppendorf小管中，于200rpm离心6分钟（“保存样3”）。将保存样1（5μ）、2和3（0.5ml）分别在闪烁计数器上测定。由此计算每100000个细胞中吸收低聚物的pmol量。在保存样3中的是与细胞结合的低聚物，而保存样1和2之和是未与细胞结合的低聚物部分。

结果:温育时间细胞吸收量pmol低物量 /10⁵个细胞

(小时) pmol低聚物量/10⁵个细胞

PNA/DNA-杂交分子 DNA

1 0.25 0.36

7 0.54 0.57

24 0.75 0.78

低聚物在含有细胞的培养基中稳定性研究：

保存样1（10μl）与5μl80%甲酰氨（含有Xc和BB）混合，95℃加热5分钟，装载到聚丙烯酰胺凝胶（20%丙烯酰胺，7M尿素）上。在电场中凝胶展开后，用放射自显影技术将凝胶上的色带的“稳定的低聚物”或“分解的低聚物”误带加以指定。

实施例26的PNA/DNA低聚物保温24小时后有69%是稳定的，DNA-低聚物3%稳定。

实施例31得到的PNA/DNA低聚物在此条件下的半衰期为32小时，而相应的DNA-寡核苷酸的半衰期大约为2小时。

实施例42

标记荧光素后测定细胞的吸收

将COS-细胞在补充了10%胎牛血清（FCS）的Dulbecco MEM中于5cm培地皿中生长直到细胞融合。用无血清的DMEM洗涤细胞2次。用一无菌针头将培地皿的表面刺破大约1cm²，在此表面上加入受试的PNA/DNA-低聚物溶液（0.1mM）。于CO₂气氛中37℃温育。在第2、4和16小时取出细胞，在荧光显微镜下测定。为此，用无血清的DMEM洗涤细胞4次，放于载波片上，于荧光显微镜下或用位相显微技术测定。研究作为该PNA/DNA一杂交分子的对照物即用荧光标记的PNA（无DNA部分的）F-（but）-ttt ttt-hex温育2小时后，具有该PNA的细胞呈现有＞90%的细胞形态学上有很大变化和细胞死亡。大多数细胞形成明显的空泡。胞浆膜、胞液和胞核都没有吸收PNA。与此纯净的PNA再温育2小时，全部细胞死亡。而用本发明的DNA/PNA低聚物则情况不同了。用DNA/PNA低聚物与细胞温育2小时。该DNA/PNA-低聚物在细胞内呈点状分布。长时间温育也无细胞死亡。

实施例43

测定熔点

熔点的测定是借助HP 8452A Diodenarray分光光度计、Hp89090A Peltier-装置和HP温度控制软件Rev.B5.1（惠普公司制造）来完成的。测定时步长为0.50℃/min，缓冲液为10mM HEPES和140mM NaCl（pH7.5）。低聚物浓度为0.5～1OD₂₆₀/ml。

实施例17或18的产物测定结果为

对DNA的TM

5'-ATC GTC GTA T(Oeg(t)a gtc-hex T_M=51.5℃

3'-TAG CAG CAT A A T CAG-5' 反向平行

5'-ATC GTC GTA T(Oeg(t)a gtc-hex T_M<20℃

5'-TAG CAG CAT A A T CAG-3' 正向平行

5'-ATC GTC GTA TT(but)a gtc-hex T_M=51.0℃

3'-TAG CAG CAT AA T CAG-5' 反向平行

5'-ATC GTC GTA TTA GTC-3' T_M=50.5℃

3'-TAG CAG CAT AAT CAG-5' DNA·DNA反向平行

5'-ATC GTC GTA TT(but)a gtc-hex T_M<20℃

5'-TAG CAG CAT AA T CAG-3' 正向平行

顺序 T_MT_M

对DNA 对RNA

(T=U)

5'-ACA TCA TGG TCG-3' DNA ap 50.7℃ 48.6℃

3'-TGT AGT ACC AGC-5'

5'-ACA TCA tgg tcg-3' (PNA-DNA) ap 54.5℃ 54.7℃

3'-TGT AGT ACC AGC-5'

5'-ACA TCA tgg tcg-3' (PNA-DNA) p 20℃ <20℃

5'-TGT AGT ACC AGC-3'

5'-aca tca tgg tcg-3' PNA ap 58.8℃ 66.6℃

3'-TGT AGT ACC AGC-5'

5'-aca tca tgg tcg-3' PNA p 46.3℃ 44.8℃

5'-TGT AGT ACC AGC-3'

5'-ACA TCA TGG TCG-3' S-DNA ap 46.7℃ 43.8℃

3'-TGT AGT ACC AGC-5'

TGG TCG代表一个DNA部分，其所有的核苷酸间的键合都是硫代磷酸，P和ap的定义见5页。

实施例44

抗病毒活性试验

受试物质对各种致人体病原的疮疹病毒的抗病毒作用是在细胞培养系统中进行的。该实验是将猴肾细胞（Vero，2×10⁵/ml）于含血清的Dulbecco MEM（5%胎牛血清FCS）于96孔微量滴板中，在5%CO₂37℃温育24小时。然后抽掉含血清的其质，细胞用无血清的Dulbecco MEM冲洗2次。受试物质用水稀释剂浓度为600μm，-18℃贮存。为进行试验，再用Dulbecco MEM（无机成分基质）进行稀释。按每100μl单个受试物质的稀释液与100μl无血清的Dulbecco MEM一起共同加到冲洗后的细胞中。于5%CO₂、37℃温育3小时后，用1型单纯疱疹病毒（ATCC VR733 HSV-1，F-株）或用乙型单纯疱疹病毒（ATCC VR734，HSV-2，G-株）感染细胞，所用的浓度是使细胞在3日完全破坏。HSV-1每孔中感染强度500个空泡形成单位（PFU），HSV-2为350PFU/孔。试验物料中含受试物质在MEM的浓度为80μM到0.04μM，并补加青霉素G 100U/ml、链霉素100mg/l。全部试验进行双次测定，但对照组例外，每块板测定8次。试验物质于5%CO₂、37℃温育17小时。总温育时间20小时后用显微镜鉴定细胞培养液，以确定受试物质的细胞毒作用。最大耐受剂量（DTM）是在上述试验条件下，不会引起细胞在显微镜下观察到形态学损伤的药物最高浓度。为此，加入FCS使终浓度为4%，再于5%CO₂、37℃温育55小时。未经处理的感染对照组揭示了完全细胞病作用（CPE）。细胞培养液经显微镜检后，按照Finter（1966）法用中性红按活体染色法将其染色。受试物质的抗病毒作用用最低抑制浓度（MHK）表示，即为了保护30～60%细胞免于病毒引起的细胞病作用所必需的浓度。PNA/DNA化合物比相应的DNA-低聚物或PNA-低聚物均好。

实施例45

体内活性测定：抑制大鼠原c-fos蛋白的表达：

本测定法按Sandkubler等91991，第6届世界疼痛大会文集，Charlton和woolf编，Elsevier，阿姆斯特丹，313，318页）所述，用脊髓过冷法。按照椎板切除术法处理用以巴比妥麻醉的Sprague-Dawley大鼠后，为进行反义低聚物的吸收试验，用硅形成二室空间。一个室用反义PNA/DNA衍生物充满，另一室用对照的低聚物充满（浓度各为75μM），一小时后，使过冷物交换。过冷6小时后，c-fos表达通过热处理后腿（52℃）进行刺激。对c-fos表达的抑制作用可用免疫组织化学法对相应的组织切片样品进行检查。由实施例31得到的c-fos反义寡核苷酸对c-fos表达的抑制作用强于相应的DNA-寡核苷酸和相应的实施例33得到的PNA-低聚物。

实施例46

核糖核酸酶-H的测定

为了测定核糖核酸酶H活性，将1.3OD的待测PNA/DNA低聚物与0.5OD的互补RNA顺序（目的顺序）溶解于50μl高压灭菌了的用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水，于80℃加热5分钟，然后于15分钟内冷却到37℃。经此，二个低聚物首先变性，冷却后，两者以顺序特异的方式形成双股核酸。

为进行测定，将RNA-PNA/DNA-双股体与10μl RNase H（核糖核酸酶H）10×缓冲液、1μl二硫苏糖醇（DTT）和2μl（相当于10u）核糖核酸酶H（USB公司出品）温育。培养物与高压灭菌的、DE-PC处理过的水混合，使总体积达到100μl。样品在37℃温育。为了动态研究，在0，2，10分钟和1小时时分别取出溶液20μl，95℃加热5分钟，-70℃冷冻直到分析时。通过凝胶电泳来研究核糖核酸酶H裂解RNA。结果表明，含有脱氧核苷酸结构单元的PNA/DNA一杂交分子活化了核糖核酸酶H，后者裂解于互补的RNA-链，而PNA/DNA-低聚物反应中未受损害。用PNA/DNA-低聚物进行裂解反应比用相同长度和顺序的相应寡脱氧核苷酸进行的裂解反应稍慢。

实施例47

制备具有核糖核酸酶L活性的HeLa细胞提取液

为了用2’，5’-四腺苷酸-PNA/DNA结合物刺激细胞的核糖核酸内切酶L的活性，制备HeLa细胞提取液。为此，于35个容器中各加入20ml由Dulbecco MEM（无机成分培养基）和10%胎牛血清（FCS）组成的培养基。用胰蛋白酶处理后收获细胞，于1000rpm离心，得4ml细胞。首先向其中加入4ml水，3分钟后，加入4ml 2缓冲液A（5.48g Hepes，15.5g KCl;2.488g乙酸镁;1232μl 2-巯基乙醇，混合加水到11），以使细胞流解。然后于0℃、30000rpm（大约100，000g）对此溶液进行超速离心30分钟。取出8ml细胞提取液，贮存于-20℃进行下一步研究。

实施例48

核糖核酸酯L活化的研究

为了研究该提取液中的核酸内切酶L，首先把0.3OD的RNA-目标顺序与该PNA/DNA-低聚物加热80℃5分钟，然后冷却到37℃使杂交。双股体与20μl提取液、1.2μl甘油和核糖核酸酯L-缓冲液混合，37℃温育。最后的总体积为70μl。为了动态研究，于0.20、60分钟取样，加热95℃5分钟使酶变性。样品于快速真空冻干，凝胶电泳分析。PNA-2’，5’-四腺苷酸-结合物及四虫草品-类似物可活化细胞的核糖核酸酶L，而没有四腺苷酸部分的相应化合物则不能激活该核糖核酸酶。

实施例49

DNA-聚合酶-反应

为进行DNA-聚合酶-反应的模板，用如下的81 81单体（81-mer）寡脱氧核苷酸：

5′-GCC CCA GGG AGA AGG CAA CTG GAC CGA AGG CGC TTG TGG AGA AGG AGT TCA TAG CTG GGC TCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA-3′

PNA/DNA-引物的次序是：H-taa tac gac tca cta（5NH-T）-OH 3’。

加入顺序为5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3的相应寡脱氧核苷酸作为对照引物。

引物（0.15nmol）和模板（0.15nmol）于5μl10×PCR缓冲液（500mM KCl，100mM Tris-HCl，pH9，1%三硝基甲苯×-100，15mMMgCl₂）用35μl水稀释，95℃加热，然后冷却使之杂交。再加入10μl 2mM dNTP混合物（核苷-5’-三磷酸）和3μl DNA-聚合酶（Klenow片断），并在22℃和37℃分别温育0.5小时。该反应液于10%聚丙烯酰胺-凝胶（含1%Bis）上进行分析。加入PBR 322/Haelll-消化液（verdau）作为标记物。用对照-引物的反应提示：相对于标记物，双股DNA片断具有所预料的大小，而由PNA/DNA引物得到的产物移动得略快。在这两种情况下，双股体在凝胶电泳中明显地比模板-单股体快。

Claims

1、式Ⅰ的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物及其药用盐：

其特征是

q、r、s、t各自独立地代表0或1，其中2个或多个相邻的q、r、s、和t的总和应≥2；

X为1～20；

DNA：为核酸DNA或RNA，或它们已知的衍生物；

Li为DNA和PNA之间的共价连接，该共价连接为一单键或含有至少一个如下原子的有机基团：C、N、O或S，

PNA为聚酰胺结构，至少含1个核酸碱基，但不是胸腺嘧啶，F和F’为末端基团，和(或)经共价键相互连接。

2、权利要求1的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物，其特征是，X为1～5。

3、权利要求1的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物，其特征是，x为1。

4、权利要求1的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物，其特征是，x为1，

q＝r＝1，和s＝t＝0或

r＝s＝1，和q＝t＝0或

q＝r＝s＝1，和t＝0 或

r＝s＝t＝1，和q＝0。

5、权利要求1～4的式Ia和Ib的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物，

其特征是，x为1～20，其中x＞1，r＝s＝1并且同时q＝t＝0和o＝n＝0～5

q、r、s、t各自独立代表0或1，其中两个或多个相邻的q、r、s和t的总和应≥2，

R²为氢、羟基、C₁-C₁₈-烷氧基，卤素、叠氮基或氨基，

B各自独立地代表核苷酸化学中常规的碱，例如天然的碱如腺嘌呤，或非天然的碱如嘌呤，胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、次黄嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，7-去氮腺嘌呤，7-去氮鸟嘌呤，N⁴N⁴-桥亚乙基胞苷，N⁶N⁶-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤，伪异胞苷，5-甲基胞苷、5-氟尿嘧啶，5-（C₃-C₆）-炔基尿嘧啶，5-（C₃-C₆）-炔基胞苷或它们的前药型式，

或是“弯曲的夹子”，即R²及相邻的取代基处于2’及3’位，或也可逆向处于3’位极2’位;

Nu为式Ⅱa或Ⅱb的一个基团，

式中

R²和B含义同前

U为羟基、巯基、、C₁-C₁₈-烷基，C₁-C₁₈-烷氧基，C₆-C₂₀-芳基，C₆-C₁₄-芳基-C₁-C₈-烷基，NHR³或NR³R⁴，

R³为C₁-C₁₈-烷基或C₁-C₄-烷氧基-C₁-C₄-烷基，

R⁴为C₁-C₈-烷基，或

R⁴和R⁴共同与它们所带的氮原子形成5-6员杂环，还可含有选自O、SN的其它杂原子;

V为-O-，-S-，或-NH-;

W为氧代或硫代;

Y为-O-、-S-、-CH₂-或-NH-;

m＝0～20

o＝0～20;

D为式Ⅲ的一个基团，

式中B的含义同前;

D’为式Ⅳ的一个基团，

式是B的含义同前;

n＝0～20;

p＝0～20;

Li₁、Li₂、Li₃和Li₄各自独立为式Ⅴ的一个结构，

式中各自独立为

∈＝1～5，优选为1-2;

V′为氧、NH、单键或式Ⅵ的一个基团

式中U、V、W和Y的含义同前;

G为C₁-C₁₂-烷二基，烷二基上可任选地被卤素、氨基、羟基、C₁-C₈-烷基、C₁-C₁₈-烷氧基、C₆-C₁₄-芳基或C₆-C₁₄-芳基-C₁-C₁₈-烷基取代;C₆-C₁₄-芳基-二-C₁-C₁₂-烷二基，或式（CH₂CH₂O）_δCH₂CH₂所示的一个基团，δ可为1～11，或者G是个单键，

G’为-O-，-S-（sulfanidye），-NH-，-C（O）-，-C-（O）NH-，单键或式Ⅵ的一个基团，其中U、V、W和Y的定义同上;

F和F’经一键相连，和（或）

F为R⁰-（A）_K-V-，和

F’在式Ⅰa中为-（O）_e-R¹，在式Ⅰb中为V¹-（A）_l-R¹，其中

R⁰为氢、C₁-C₁₈-烷酰基，C₁-C₁₈-烷氧羰基，C₃-C₈-环烷酰基，C₇-C₁₅-芳酰基，C₃-C₁₃-杂芳酰基或代表一个可促进低聚物向细胞中参入（Aufnahme）的基团，或作为DNA探针的标记物或于低于低聚物在目标核酸上杂交时，在键合、交叉连接或裂解进起作用，

或若k＝0，R⁰为氢或与V共同形成式Ⅶ的一个基团;

式中

Z为Z’各自独立代表羟基、巯基、C₁-C₂₂-烷氧基，C₁-C₁₈-烷基，C₆-C₂₀-芳基，C₆-C₁₄-芳基-C₁-C₁₈-烷基，C₁-C₂₂-烷硫基，NHR³，NR³R⁴，或代表一个可以促进低聚物向细胞中参入的基团，或作为DNA探针的标记物，或在低聚物于目标核酸上杂交时，在键合、交叉连接或裂解时起作用，其中R³、R⁴、V和W的定义同前，R¹为氢或Q⁰，

其中当I＝0且

在式Ⅰa中t＝0和S＝1以及Li₁为式V的一个结构V’＝单键，G＝单键，∈＝1，G′＝-O-，-S-，-NH-，或式U＝Z的一个Ⅵ中的基团，或

在式Ⅰb中q＝1或q＝r＝0，和F’＝V′-（A）_e＝R¹，其中V’＝V时，

R¹永远只为氢，

A和Q各自独立地代表一种天然的或非天然的氨基酸，优选自甘-，亮-，苯丙、半胱-、赖-、精-、天冬-、谷-、脯-氨酸，四氢异喹啉-3-羧酸，八氢吲哚-2-羧酸，N-（2-氨乙基）甘氨酸，

Q⁰为羟基、OR’，NH₂，NHR”，其中，

R’＝C₁-C₁₈-烷基，

R”＝C₁-C₁₈-烷基，C₁-C₁₈-氨烷基，C₁-C₁₈-羟烷基;

V的定义同上

k为0～10，

l为0～10、

其附带条件是：

a）若式Ⅰa化合物的t＝0，s＝1，Li₁（V’）-（G）-（G’）且其V’＝式Ⅵ的化合物，G＝C₂-C₁₂-亚烷基，G’＝CO，则在F’＝-（Q）₁-R¹中，l＝0～10，R¹＝Q⁰;

b）若式Ⅰa化合物的s＝t＝0，则Li₂为一单键;

c）若式Ⅰb化合物的t＝0，s＝1，则Li₃为一单键;

d）若式Ⅰb化合物的s＝t＝0，则Li₄为一单键;

其中每个核苷酸都可以D-或-构型存在，碱基可处在α-或β-位置。

6、权利要求5的式Ⅰa和Ⅰb的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物，其特征是，碱基处于β-位。

7、权利要求1～6的聚酰胺寡核苷酸-衍生物的制备方法，其特征是，将带有各自碱基的PNA单元或DNA单元，依次缩合到相应的衍生化的载体上或增长中的低聚物链上。

8、作为治疗剂应用的权利要求1～6的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物。

9、作为治疗疾病的药物的权利要求1～6的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物，疾病是由病毒引起的，或由于整合性或细胞-细胞粘着受体受到影响而引起的疾病，以及作为治疗肿瘤或抑制（心瓣）再狭症的权利要求1～6的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物。

10、含有权利要求1～6的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物的药物。

11、作为基团探针的权利要求1～6的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物。

12、和为引物的权利要求1～6的聚酰胺-寡核苷酸-衍生物，在核苷单元的至少一个端点该核苷单元有一个3’-羟基。

13、用于测定寡-或聚核苷酸目标（RNA或DNA）的基因探针检查法，其特征是，将权利要求11的基团探针用于同源基因或异源基因的检查。

14、用于测定寡-或聚核苷酸目标（RNA或DNA）的基团探针检查法，其特征是，加入权利要求12的引物。

15、权利要求11-14的基团探针检查法，其特征是，目标物是在目标物放大作用后经杂交被测定的。