CN1555385A - 增强细胞摄取生物分子的配体 - Google Patents

增强细胞摄取生物分子的配体 Download PDF

Info

Publication number
CN1555385A
CN1555385A CNA028163656A CN02816365A CN1555385A CN 1555385 A CN1555385 A CN 1555385A CN A028163656 A CNA028163656 A CN A028163656A CN 02816365 A CN02816365 A CN 02816365A CN 1555385 A CN1555385 A CN 1555385A
Authority
CN
China
Prior art keywords
binding substances
oligomer
cell
oligonucleotide
liver
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA028163656A
Other languages
English (en)
Inventor
Pop
P·O·P·特索
R·德夫
�����ɵ�
Y·周
S·迪蒙德
C·罗比
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Johns Hopkins University
Cell Works Inc
Original Assignee
Johns Hopkins University
Cell Works Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Johns Hopkins University, Cell Works Inc filed Critical Johns Hopkins University
Publication of CN1555385A publication Critical patent/CN1555385A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及均一A－L－P构建物的设计和合成，此构建物包含肝配体以引导寡聚物或“有效载荷”通过受体介导的、定向配体的途径胞内到达肝细胞。

Description

增强细胞摄取生物分子的配体
                         发明的技术领域
本发明涉及将生物降解-抗性、均一寡核苷酸结合物以组织特异方式通过定向配体的、受体介导的、内吞途径传递给细胞。
                            发明背景
肝脏是活体器官且产生许多生物功能。它的一些最重要功能包括去毒和排出其它方式会有毒的物质、加工来自消化管道的营养物和药物以更容易吸收、产生胆汁以协助消化食物、将食物转变成化学物用于维持生命的生长和保持。至少已知100种不同类型的肝脏疾病。最重要的肝脏疾病是病毒性肝炎、硬化和癌症。
当前，有五种已知类型的病毒性肝炎：甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、丁肝病毒(HDV)和戊肝病毒(HEV)。然而在猖獗研究基础上，由于肝炎A-E病毒不能说明所有已知的情况，似乎存在其它肝向性(hepatropic)病毒。
HAV和HEV在污染的食物和水中扩散，但不引起慢性肝脏疾病。相反，HBV、HDV和HCV是可引起慢性感染和慢性肝炎的血液携带病毒。两种最重要的肝脏病毒是HBV和HCV。HBV估计每年感染320,000个人(疾病控制中心，数据未发表)，约有1百万到125万个患慢性感染的HBV病人(来自第三次全国健康和营养检验调查的血清阳性率数据(NHANES III，1996)。世界范围的评估表明有2亿人感染HBV。HDV是缺损性病毒且需要共转染HBV或预先存在(重复感染)HBV感染(Smedile等，(1981)，Gastroenterology，81：992-997)，它们都引起比单独HBV感染更严重的症状。感染HBV个体中的慢性HDV感染与高肝脏衰竭相连。HCV感染估计影响350万个携带者，每年有150,000个新感染者。HCV感染伴随着温和症状且直到慢性疾病发展才被诊断。约80％HCV感染变成慢性并导致肝脏疾病。药物治疗如干扰素治疗旨在减少炎症、症状和传染性，但病毒很少在感染个体中去除。
根据全国癌症学会，在1998年肝细胞癌(HCC)的新案例在美国导致13,900起死亡。每年全球由于HCC死亡的人从500,000到1百万。HCC在东南亚分布广泛，具体是香港。患乙肝、丙肝、丁肝或肝硬化的个体有更大的风险发展出HCC。慢性病毒性肝炎可引起肝硬化、肝细胞衰竭和HCC。目前，没有已知有效治疗抗HCC。
疟疾是由一些来自疟原虫(Plasmodium)属的原生动物寄生虫引起的疾病并通过疟蚊(Anopheles)属的雌性蚊子传播。引起疟疾的四种疟原虫是间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(P.malariae)和恶性疟原虫(P.falciparum)。疾病最常发生在热带和亚热带如中美洲、南美洲、东南亚、加勒比、南太平洋群岛和亚撒哈拉非洲。症状在蚊子咬后一周到一个月在任何地方出现，包括高烧、寒颤、出汗、肌肉疼痛、疲劳、贫血以及有时呕吐和咳嗽。最严重的疟疾形式特征为发烧、混乱、脾放大、恶心和贫血，可以是致命的。如果不治疗疾病，感染会发展成肺中流体、肝脏衰竭、肾衰竭、脑膨胀、昏迷和死亡。引起疟疾的寄生虫生命周期开始于雌性蚊子叮咬吸收一些配子细胞的感染个人，配子细胞在蚊子胃中减数分裂和成熟。结果，雄和雌配子融合形成合子，合子在蚊子中移动并在蚊子唾液腺中发展产生孢子体。这些孢子体感染下一个人类宿主血液，最终到达宿主肝脏。最后，一些寄生虫离开肝脏并开始在宿主血细胞中复制，导致疟疾的常见症状。
治疗病毒和原生动物感染以及癌症的一种方法是利用反义治疗的力量。通过特异寡核苷酸结合关键mRNA靶序列来选择性抑制基因表达是应用反义技术调节DNA和蛋白质的主要目标。通过特异寡核苷酸结合关键mRNA靶序列来选择性抑制基因表达是应用反义技术调节遗传因子如RNA、DNA和蛋白质的主要目标。用于药物设计的反义(反密码子或反基因)策略是在序列-特异抑制蛋白质合成基础上，这是通过传递合成寡脱氧核苷酸(oligo-dN)和它们能结合及遮蔽靶mRNA或基因组DNA的类似物(Mirabelli等，(1993)，反义研究和应用(Antisense Research andApplications)，(Crooke和LeBleu编辑)，CRC出版社，Boca Raton，第7-35页)。此策略中隐含的是寡脱氧核苷酸穿越细胞膜的能力，从而能到达含它们目标靶的细胞区室且有足够量用于结合那些靶。
外源DNA传递到胞内介质是通过偶联其吸收到受体介导的内吞作用大为提高。Wu和Wu(1987)，J.Biol.Chem.，262：4429-4432的开创性工作显示外源基因(Wu(1987)，同上；Wu(1988)，J.Biol.Chem.，263：14621-14624；Wu(1988)，Biochemistry.，27：887-892)或寡脱氧核苷酸((1992)，J.Biol.Chem.，267：12436-12439)静电联合到连接脱唾液酸血清类粘蛋白的聚-L-赖氨酸，通过直接接触脱唾液酸糖蛋白来有效和特异地吸收入人肝细胞癌(Hep G2)细胞。由于此最初的研究，其它受体介导的DNA传递的例子出现在文献中，包括四-触角半乳糖新糖肽聚-L-赖氨酸结合物(Plank等，(1992)，Bioconjugate Chem.，3：533-539)；三半乳糖苷化双吖啶结合物(Haensler等，(1993)，Bioconjugate Chem.，4：85-93)；叶酸结合物(Kamen等，(1988)，J.Biol.Chem.，263：13601-13609)；抗体结合物(Trubetskoy等，(1992)，Bioconjugate Chem.，3：323-327)；运铁蛋白结合物(Wanger等，(1990)，Proc.Natl.Acad Sci.USA，87：3410-3414)；和通过二硫键连接到反义寡脱氧核苷酸的6-磷酸甘露糖化的蛋白(Bonfils等，(1992)，Nucleic Acids Res.，20：4621-4629)。近来，三-触角N-乙酰半乳糖胺新糖肽、YEE(ahGalNAc)3(Lee和Lee(1987)，Glycoconjugate J，4：317-328)结合到人血清-清蛋白并随后连接到聚-L-赖氨酸，显示传递DNA到Hep G2细胞(Merwein等，(1994)，Bioconjugate Chem.，5：612-620)。
描述了一些产物用于传递寡脱氧核苷酸，寡脱氧核苷酸是异源结合物混合物。例如Bonfils等描述6-磷酸甘露糖化的蛋白和寡核苷酸间结合物形成，因为蛋白修饰和二硫键形成不是化学区(regiochemically)控制或位点-特异，产生结构不同分子的异源混合物(Bonfils，同上)。
一些研究描述胞内传递寡脱氧核苷酸或DNA，它们包含可生物降解的磷酸二酯核苷酸间键合。由于磷酸二酯对水解的固有敏感性，含可生物降解磷酸二酯核苷酸间键合的有效载荷构建物在细胞内可有相对短的半衰期且功效因此降低(Wickstrom(1986)，J.Biochem.Biophys.Meth.13：97-102)。例如，在细胞中几分钟后所有磷酸二酯16聚体广泛降解(Shaw等，(1991)，Nucleic Acids Research.19：747-750)。此寡脱氧核苷酸和DNA的劣势在反义领域中充分意识到。
Merwin等描述了用新糖肽YEE(ahGalNAc)3合成结合物。它们的传递系统不同且包含使DNA静电结合到结合物的聚-L-赖氨酸。此传递策略的劣势是：它的结构异源性；由于其聚阳离子电荷的潜在毒性；由于需要根据经验确定阳离子载体与寡脱氧核苷酸或DNA比例带来的制成困难。
使用反义寡核苷酸和它们的类似物作为治疗剂由于缺乏特异传递和导致低胞内浓度的有限细胞吸收而变得复杂(Loke等，(1989)，Proc.Natl.Acad Sci.USA，86：3474-3478；Levis等，(1995)，Antisense Res. & Dev.，5：251-259。提高这些分子的细胞吸收通过偶联它们的传递和受体调节内吞作用来获得，用多种结构异源的复合体(Plank等，(1992)，Bioconj.Chem.，3：533-539；Kamen等，(1988)，J.Biol.Chem.，263：13602-13609；Wagner等，(1990)，Proc.Natl.Acad Sci.USA，87：3410-3414)。一些这种复合体显示通过肝脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)以提高的速度体外特异传递小分子到肝脏细胞(Wu和Wu(1997)，J.Biol.Chem.，262：4429-4432；Findeis等，(1994)，Mtds.Enzymol.，247：341-351。这些复合体包括那些用三触角、N-乙酰半乳糖胺新糖肽、YEE(ahGalNAc)3制成的，表现出对哺乳动物ASGP-R的高亲和性(Lee和Lee，(1987)，Glycoconj.J.，4：317-328；Merwin等，(1994)，Bioconj.Chem.，5：612-620。我们前面证明通过结构确定和异双功能接头使甲基膦酸酯共价结合此新糖肽导致肝细胞瘤细胞体外细胞吸收提高和特异(Hangeland等，(1995)，Bioconj.Chem.，6：695-701，以及体内特异传递给小鼠肝脏(Hangeland等，(1997)，Antisense & Nuc.Acid DrugDev.，7：141-149。
广泛研究了许多作为反义、非离子的寡核苷酸甲基膦酸酯(oligo-MPs)应用的寡脱氧核苷酸类似物(Ts’o等，(1992)，Ann.NY Acad.Sci.，600：159-177)。寡核苷酸甲基膦酸酯完全抗核酸酶降解(Miller等，(1981)，Biochemistry.，20：1874-1880)且是有效的反义剂，证明体外有活性抗单纯疱疹病毒1型(Smith等，(1986)，Proc.Natl.AcadSci.USA，83：2787-2791)、水泡性口炎病毒(Agris等，(1986)，Biochemistry，25：6268-6275)和人免疫缺陷病毒(Sarin等，(1988)，Proc.Natl.Acad Sci.USA，85：7448-7451)，能抑制表达ras p21(Brown等，(1989)，Oncogene Res.，4：243-252)。然而对于表现出反义活性的寡核苷酸甲基膦酸酯，它们必须以至100μM的浓度存在于细胞外介质(Brown，同上；Sarin，同上；Ts’o，同上；Agris，同上)。达到和维持这些浓度用于治疗目的有一些困难，包括花费、由于非特异结合寡核苷酸甲基膦酸酯和免疫原性产生的潜在副作用。这些困难可通过增加运输寡核苷酸甲基膦酸酯穿过靶细胞类型的膜来克服，从而获得局部高浓度的寡核苷酸甲基膦酸酯，可通过仅特异传递给靶细胞类型来克服，从而防止对其它组织的毒性副作用。这些策略都用于大量降低产生反义效果和防止组织特异毒性副作用所需的寡核苷酸甲基膦酸酯。
本发明通过传递均一和非生物降解的A-L-P构建物来克服这些不足，它们用于胞内传递有效治疗给靶细胞以提高有效和/或非毒性效果。
                          发明概述
本发明的一个目的是设计和合成含肝配体的均一A-L-P构建物以引导寡聚物或“有效载荷”通过受体介导的、定向配体的途径胞内到达肝细胞。
发明的另一个目的是通过A-L-P构建物传递定向肝脏病原体的稳定有效载荷或寡聚物给肝细胞。肝脏病原体可以是病毒、寄生虫或癌。
发明的又一个目的是提供结构确定和化学统一的传递集合体，由配体-接头-前体药物构建物组成，通过定向配体的、受体介导的的内吞途径定向于肝细胞。
发明的进一步目的是提供均一构建物给细胞内分子靶，包括传递含生物非降解“P”或水解酶抗性前体药物的A-L-P构建物，其中所述前体药物含可有效穿越肝细胞膜并进入细胞质的寡脱氧核苷酸和/或寡脱氧核苷酸类似物。
发明的另外目的是传递有效载荷的DNA和RNA类型分类，如有效载荷含DNA的甲基膦酸酯、磷酸二酯和硫代磷酸酯联接以及RNA的甲基膦酸酯-2’-O-甲基核糖、磷酸二酯-2’-O-甲基核糖和硫代磷酸酯-2’-O-甲基核糖部分。
发明的另一目的涉及胞内传递有效载荷给靶细胞，可包含不同程度生物降解核苷酸间键合组合进入细胞靶，如联接包括用于DNA的甲基膦酸酯/磷酸二酯(mp/po)联接、磷酸二酯/硫代磷酸酯(po/ps)联接和甲基膦酸酯/硫代磷酸酯(mp/ps)联接；用于RNA的甲基膦酸酯/磷酸二酯-2’-O-甲基核糖(mp/po-OMe)联接、磷酸二酯/硫代磷酸酯-2’-O-甲基核糖(po/ps-OMe)联接和甲基膦酸酯/硫代磷酸酯-2’-O-甲基核糖(mp/ps-OMe)联接。发明的优选目的是将含酶抗性硫代磷酸酯核苷酸间键合的寡脱氧核苷硫代磷酸酯(phosphothioroate)结合物传递给肝细胞。发明的又一优选目的是将含非生物降解甲基膦酸酯核苷酸间键合的寡脱氧核苷甲基膦酸酯结合物传递给肝细胞。将生物稳定寡聚物如非离子寡脱氧核苷和寡脱氧核苷类似物胞内传递给含肝病毒和/或癌的肝细胞是一种治疗肝脏病原体的方法。具体是，发明的进一步目标是提供寡脱氧核苷嵌合体的合成结合物，嵌合体含所有2’-O-甲基核糖核苷和甲基膦酸酯与磷酸二酯或其它生物稳定寡聚物间交替的核苷酸间键合。这些生物稳定寡聚物包括但不限于寡脱氧核苷酸类似物，包含：所有2’-脱氧核糖核苷和硫代磷酸酯与甲基膦酸酯间交替的核苷酸间键合；所有2’-脱氧核糖核苷和硫代磷酸酯核苷酸间键合；所有2’-O-甲基核糖和硫代磷酸酯核苷酸间键合。
发明的又一目的涉及合成A-L-P结合物的方法。一种合成结合物的具体方法，结合物包括三-成分结合方法1用于合成A-L-P结合物，其中
a)2’-O-Me-核苷磷酸二酯键被掺入寡核苷酸或寡核苷酸类似物的5’-末端；
b)用PNK和ATP，通过酶的作用将寡核苷酸或寡核苷酸类似物的5’-末端磷酸化；
c)修饰寡核苷酸或寡核苷酸类似物的5’-磷酸基团以引入二硫键形成5’-二硫键-修饰的寡核苷酸或寡核苷酸类似物；
d)将5’-二硫键-修饰的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的5’-二硫基还原成硫醇基团以形成硫醇-修饰的寡核苷酸；
e)将异双功能接头的一个反应基团共价结合到配体上，并将异双功能接头的第二个基团共价结合到所述硫醇-修饰的寡核苷酸或寡核苷酸类似物，以形成A-L-P结合物。
另一种方法涉及合成结合物，包括结合方法2用于合成A-L-P结合物，其中
a)用双功能接头修饰的配体以形成A-L构建物；
b)将所述A-L构建物纯化到大于95％的均一性并去除未反应的接头；
c)修饰寡核苷酸或寡核苷酸类似物以形成硫醇-修饰的寡聚物；
d)所述硫醇-修饰的寡聚物在脱气条件下纯化；
e)在两种-成分结合反应时用纯化A-L构建物和纯化硫醇-寡聚物的结合反应在脱气条件下进行以去除未反应试剂和其它低分子量的硫醇-包含杂质；其中所述结合可用过量所述配体支架或所述硫醇-修饰寡聚物形成纯化的A-L-P结合物；
f)纯化A-L-P结合物，例如通过层析或电泳。
又一种方法涉及放射性同位素标记寡核苷酸-包含结合物，包括放射性同位素标记A-L-P结合物，其中
a)在固相合成中将三核苷示踪物单元5’-T-3’-ps-3’-T-ps-T-5’加入寡核苷酸或寡核苷酸类似物的3’末端；
b)采用多核苷酸激酶(PNK)和含放射性标记的磷酸的2-氨基巯基乙醇(ATP)，通过酶的作用将示踪物单元磷酸化以将放射性标记的磷酸掺入A-L-P结合物；
c)化学修饰现在存在于带有氨基的A-L-P结合物中的放射性磷酸以防止它被细胞酶降解。
另外一种方法涉及合成寡核苷酸-包含结合物，其中
a)在固相合成中将带有末端二硫化物部分的双功能接头L加入寡核苷酸或寡核苷酸类似物以形成二硫化物修饰的寡聚物；
b)纯化二硫化物修饰的寡聚物；
c)将二硫化物修饰寡聚物的二硫化物部分还原成硫醇基团以形成硫醇-修饰的寡聚物；
d)在脱气条件下纯化硫醇-修饰的寡聚物；
e)在脱气条件下使配体A与纯化的硫醇-寡聚物反应以形成A-L-P结合物；
f)纯化A-L-P结合物，例如通过层析。
另一种方法涉及合成放射性同位素标记结合物，包括含寡核苷酸或寡核苷酸类似物的放射性同位素标记A-L-P结合物，其中
a)用固相合成法将二硫化物-末端接头加入寡核苷酸类似物的5’-末端并将三核苷酸示踪物单元5’-T-3’-ps-3’-T-ps-T-5’加入寡核苷酸类似物的3’末端；
b)纯化二硫化物-和包含示踪物的寡聚物；
c)将二硫化物功能基团还原成硫醇基团以形成硫醇-修饰的P；
d)例如用大小排阻色谱法在脱气条件下纯化硫醇-修饰的P以去除未反应试剂和杂质；
e)在脱气条件下将A-L构建物结合到纯化的硫醇-修饰的P上以形成A-L-P结合物；
f)用PNK和含放射性标记磷酸的ATP，通过酶的作用将示踪物单元磷酸化以将放射性标记的磷酸掺入A-L-P结合物；
g)用胺化学修饰ATP结合物的放射性磷酸基团以防止它被细胞酶降解。
                           附图简述
图1显示用于化学统一结合物的附着基团。n的值在0和10之间，包含(化合物1-4)。
图2显示新糖肽YEE(ahGalNAe)3(5)(图2a)；寡核苷酸甲基膦酸酯Ump T 7(6)和有Ump T 7帽的5’-乙二胺(6b)结构(图2b)；示踪物、3’结合物(图2c)的结构；用5’-修饰物自动合成的反应过程(图2d)；用于合成1c的反应过程(图2e)。
图3描述用于合成[YEE(ahGalNAc)3]-SMCC-AET-pUmp T 7(10)的反应过程。
图4显示合成结合物10中的中间物的PAGE分析(15％聚丙烯酰胺，4V/cm，2h)。第1道，[5’-32P]-标记的6(A带)。第2道，[5’-32P]-胱胺加合物(B带)和相应胸苷-EDAC加合物(C带)。第3道，[5’-32P]-醇5(D带)和相应胸苷-EDAC加合物(E带)。第4道，[5’-32P]-结合物10(F带)和相应胸苷-EDAC加合物(G带)。
图5描述[35S]3’-末端标记乙肝病毒(HBV)新糖结合物(neoglycoconjugate)的结构。
图6显示的时程用于Hep G2细胞单独(开口圆)和存在100个游离5同等物(闭合圆)时吸收1μM结合物10，以及单独(开口三角形)和存在10个游离5同等物(闭合三角形)时吸收寡核苷酸甲基膦酸酯11。细胞在37℃培养0、1和2小时且样品如实验部分所述收集。各数据点代表三次试验±1个标准偏差的平均值。
图7显示用于Hep G2细胞吸收结合物的24小时时程。细胞在37℃培养且样品如实验部分所述收集。各数据点代表三次实验±1个标准偏差的平均值。
图8显示Hep G2、HL-60和HT 1080细胞组织特异吸收结合物10。收集细胞且在3和24小时确定各细胞系的[32P]量。实验做三次且数据表达为平均值±1个标准偏差。
图9显示Hep G2细胞吸收含核酸酶抗性主链10的新糖结合物。
图10显示Hep G2 2.2.15细胞吸收含核酸酶抗性主链10的新糖结合物。
图11显示结合物10的组织分布，它通过用N-乙酰-葡糖酰胺酶去除结合物10的末端GalNAc残基来产生-每克组织起始剂量百分比对结合物10注射后时间。
图12显示结合物12的组织分布，它通过用N-乙酰-葡糖酰胺酶去除结合物10的末端GalNAc残基来产生。每克组织起始剂量百分比对结合物12注射后时间。
图13(a)显示小鼠中S35标记的反义硫代磷酸酯-包含新糖结合物的组织分布；(b)显示小鼠中末端galNAc残基去除的S35标记反义硫代磷酸酯-包含新糖结合物的组织分布。值报导为三次试验±1个SD的平均值。假定血液是约7％体重且肌肉是40％。
图14显示Hep G2细胞中10的代谢物的放射自显影分析。道1，1；道2，1用N-乙酰-葡糖酰胺酶处理；道3，1用胰凝乳蛋白酶处理；道4-8，用1分别培养2、4、8、16和24小时后的Hep G2细胞提取物。
图15显示小鼠肝脏中10的代谢物的放射自显影分析。道1，1；道2，1用N-乙酰-葡糖酰胺酶处理；道3，1用胰凝乳蛋白酶处理；道4用0.1N HCl处理；道5-9，注射后2小时、1小时和15分钟的肝脏匀浆提取物。注意道5和6以及道7和8是重复。
图16显示10的结构。结合物用位于寡核苷酸甲基膦酸酯部分5’-OH的放射性磷酸盐合成。箭头标志32P标记位置。10的结构用缩写形式。结构11和12-15是通过PAGE分析鉴定代谢物的建议结构。结构12-15分别用N-乙酰-葡糖酰胺酶、胰凝乳蛋白酶或0.1N HCl处理10获得。
图17显示小鼠尿中10的代谢物的放射自显影分析。道1，1；道2，1用N-乙酰-葡糖酰胺酶处理；道3，1用胰凝乳蛋白酶处理；道4用0.1N HCl处理；道5-8，注射后2小时、1小时和15分钟的尿提取物。注意道5和6是重复。
图18显示Hep G2 2.2.15细胞培养基中抗HBV新糖结合物对HBsAG积聚的效果：A.抗S；B.抗C；C.抗E；实心柱＝未处理对照；斑点柱(stippled bar)＝新糖结合物；交叉线柱＝未结合寡聚物。
图19显示Hep G2 2.2.15细胞培养基中抗HBV新糖结合物对HBV病毒粒子DNA积聚的效果：A＝抗S；B＝抗C；C＝抗E；实心柱＝未处理对照；斑点柱＝新糖结合物；交叉线柱＝未结合寡聚物。
图20显示Hep G2 2.2.15细胞培养基中随机新糖结合物和寡聚物对HBsAG和HBV病毒粒子DNA积聚的效果。A＝NG-4对HBs AG积聚的效果；B＝NG-5和相应寡聚物对HBs AG积聚的效果；C＝NG-4和相应寡聚物对HBV病毒粒子DNA积聚的效果；D＝NG-5相应寡聚物对HBV病毒粒子DNA积聚的效果；实心柱＝未处理对照；斑点柱＝新糖结合物；交叉线柱＝未结合寡聚物。
为了方便，使用下列缩写：AET，2-氨基巯基乙醇(氨基硫代乙醇)；ATP，三磷酸腺苷；BAP，细菌碱性磷酸酶；CPG，受控孔隙玻璃支持物；DIPEA，二异丙基乙胺；D-MEM，Dulbecco氏修饰Eagle培养基；DMSO，二甲基亚砜；D-PBS，Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水；DTT，二硫苏糖醇；EDAC，1-乙基-3-[3(二甲氨基)丙基]碳二亚胺；EDTA，乙二胺四乙酸；FCS，胎牛血清；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺；MEM，有Earle盐的极限必须培养基；SMCC，N-羟基琥珀酰亚胺4(N-甲基马来酰亚胺)环己基-1羧酸盐；Tris，tris(羟甲基)胺；PNK，苯基核苷激酶。
                            发明详述
发明针对设计和合成名为配体-接头-前体药物构建物或“A-L-P”构建物的均一分子构建物，其中“A”代表特异结合细胞受体的配体；“P”代表“有效载荷”；“L”是通过其键合连接配体和前体药物的确定分子桥，其中“A”和“P”共价附着于接头；进一步，A-L-P构建物通过受体介导的、定向配体的、内吞途径传递“有效载荷”给具体细胞靶如肝细胞。
在一个较佳实施方案中，A-L-P构建物作为传递系统，包括结构式A-L-P的均一结合物，其中“A”代表特异结合肝受体的肝配体，从而促进结合物进入有此受体的细胞；“L”代表双功能接头，它以区域特异方式共价连接A形成A-L；A-L以区域特异方式共价连接P形成A-L-P；“P”代表生物稳定寡聚物如寡核苷酸或寡核苷酸衍生物，其中P在水解或还原特定生化键后从结合物中释放且从结合物中释放时包含抗酶水解或生物降解的核苷酸间键合。
配体和接头以及接头和前体药物间的键是共价的，通过交联剂形成，能形成配体和前体药物的共价键。有多种能与配体和前体药物上存在的不同功能基团反应的交联剂，因此，可构建物许多化学上不同的键。例如，配体YEE(ahGalNAc)3(图1，1)在其氨基末端包含游离氨基。它会与异生物功能交联剂SMCC(表4；入口3)区特异地反应以形成酰胺键。如果化学修饰前体药物以包含自由巯基(？sulhydryl)基团(表2；例如见入口9-14)，前体药物与SMCC化学结合形成硫醚键。在此例子中，配体和前体药物间形成的键可概括为酰胺/硫醚。显然可通过以所有可能的组合结合配体、交联剂和前体药物形成数百种结构(图1；阐述于表1-4)。因此其它键包括但不限于酰胺/酰胺、硫醚/酰胺、二硫化物/酰胺、酰胺/硫醚、酰胺/二硫。键可进一步分类为生物稳定(硫醚，胺)、有点生物稳定(酰胺)和生物不稳定(二硫)。因此，可结构修饰传递系统以在胞外和胞内介质中面临的不同化学环境中发挥功能。用于传递系统的配体包括但不限于图1所示的。如本文所用，术语“附着基团”指这些和其它适当配体。配体由合成、化学确定、结构均一的寡肽支架组成，支架用任意一些糖残基来糖基化，糖残基包括但不限于：葡萄糖；N-乙酰葡糖胺；半乳糖；N-乙酰半乳糖胺；甘露糖；和海藻糖。
如本文所用，术语“新糖肽”指这些和类似结构。此外，这些寡肽提供框架用叶酸构建物多价配体。
如本文所用，术语“前体药物”指一种化合物，在水解或生物降解具体化学键时从结合物中释放以活化或活性高于包含作为部分结合物的时候。
如本文所用，术语“化学统一”指至少95％的传递聚集体在组成和连通性中是单个种类，99％最优选。确定化学统一性是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、反相高压力液相层析、核磁共振、质谱和化学分析。短语“化学确定和结构均一”与“化学统一”交换使用。
如本文所用，术语“有效”指例如，如果结合物存在于胞外介质，接着37℃培养24小时，胞内浓度至少约3倍于胞外浓度，约10倍优选。
发明内容中所用术语“寡聚物”包括寡核苷酸、寡核苷酸类似物或寡核苷酸，或也称为“有效载荷”或者进入细胞时它也包括前体药物转变成药物。术语“寡核苷酸类似物”指有至少一个非天然产生区域的部分，功能类似或高于天然产生寡核苷酸。寡核苷酸类似物可改变糖部分或糖间键合。有至少一个非磷酸二酯键如改变糖间键合的寡核苷酸可另外称为“寡核苷酸”。这些寡核苷酸指由连接基团连接的核苷单位集合，连接基团除了天然产生的磷酸二酯连接基团。寡核苷酸类似物包括的类似物含至少一个“非磷酸二酯核苷酸间键合”，即除了一个核苷5’末端和另一个核苷3’末端间磷酸二酯的键，其中5’核苷磷酸由任何数量的化学基团替换。优选的是，A-L-P构建物的寡聚物针对肝病原体，其中这种病原体包括任何引起疾病的微生物或过程，如病毒、寄生虫和癌。更优选的是，病毒可包括肝炎病毒，如甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、丁肝病毒(HDV)和戊肝病毒(HEV)。具体是，直接靶向病毒表面抗原、核心抗原、开放阅读框的序列和包壳序列是本发明的目标。例如，乙肝病毒包括乙肝表面抗原、S-基因、核心抗原、C-基因、前S1开放阅读框和病毒包壳信号/序列。此外，寄生虫可包括疟原虫。
不同键-主链如甲基膦酸酯(mp)(所有非离子)、交互甲基膦酸酯/磷酸二酯(mp/po)(一半带电)和硫代磷酸酯(ps)(完全带电)，有不同特征包括括号中所示的不同电荷。其它有另外核酸酶抗性主链的寡核苷酸包括硫代磷酸酯(ps)和含2’O甲基核糖部分与交替磷酸二酯/甲基膦酸酯(po/mp)键的寡聚物。优选合成键包括烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、亚磷酰胺(phosphoroamidite)、磷酸酯、氨基甲酸盐、碳酸盐、磷酸三酯、乙酰胺(acetamidate)和羧甲基酯。任何这些键也可用不同化学基团取代，如氨基烷基磷酸盐。在发明的一个较佳实施方案中，所有寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯酯键连接。使用已知方法制备这些键(Meth.Mol.Biol.，第20卷(Agrawal编辑)，Humana出版社，新泽西州；Uhlmann，同上)
寡核苷酸指一些核苷残基的聚合体。具体是如本文所用，术语“寡核苷酸”有本领域平常所用的意义，如至50个核苷的线性序列(“50聚体”)或更优选15-30个核苷的序列，最优选约20个核苷(“20聚体”)。发明所用寡核苷酸通常但不总是反义寡核苷酸，寡核苷酸有与靶细胞中具体细胞或外源DNA或RNA互补的序列。这些分子也包括指具催化活性RNA分子的核酶，包括但不限于在RNA分子中具体磷酸二酯键切开的能力，它们与这些RNA分子杂合如mRNAs、RNA-包含底物和核酶。一般，如果“P”是反义寡核苷酸，优选分子量是约5,000到10,000道尔顿；最优选分子量是约5,000到7,5000道尔顿。反义RNA指结合互补mRNA分子的RNA分子，形成抑制mRNA翻译的双链区域。一般在此具体情况中，本发明接头的分子量小于或相当于“P”反义的分子量。
优选的是，本发明寡聚物包括非生物降解的键，更具体的是包括完全或部分抗性的任意核酸酶-抗性主链。这些寡聚物的例子包括含内部磷酸二酯和末端甲基磷酸二酯键的嵌合寡核苷酸(Giles等，(1992)，Anticancer Drug Des，7：37-48)，如甲基磷酸二酯/磷酸二酯嵌合反义寡脱氧核苷酸、糖修饰寡核苷酸或碳水化合物修饰寡核苷酸(Perbost等，(1989)，Biochem.Biophys.Res.Commun，165：742-747)和反义磷酸盐-甲基化寡脱氧核苷酸(Moody等，(1989)，Nucleic Acids Res.，17：4769-4782)。
如本文所用，术语“基因特异”指寡核苷酸、寡核苷酸或类似物，序列与结合物靶向组织或细胞类型中发现的基因部分或mRNA分子部分互补。基因特异前体药物和靶mRNA间形成序列-特异双链导致mRNA表达的抑制。用于传递系统的配体包括但不限于那些示于图1的。因此，用适当附着基团和寡核苷酸序列可设计结合物为有效药物化合物用于治疗肝脏疾病和混乱如肝炎，具体是乙肝和肝癌。此外，如本文所用，术语“基因特异”指前体药物是寡核苷酸或寡核苷酸(具体是寡脱氧核苷甲基膦酸酯或其类似物)，序列与结合物靶向组织或细胞类型中发现的基因部分或mRNA分子部分互补。基因特异前体药物和靶mRNA间形成序列-特异双链导致mRNA表达的抑制。
为评估此提高、细胞特异传递的生物效果，整合乙肝病毒(HBV)基因组在一系列体外实验中由肝脏特异新糖结合物靶向。HBV是引起急性和慢性肝炎以及肝细胞癌主要原因的小包膜hepadavirus(Tiollais等，(1985)，Nature.，317：489-495)。此病毒范围广泛，全球感染超过2亿人。HBV复制的分子生物特征已很好地确定且建立了肝细胞瘤细胞加工脱唾液酸糖蛋白受体并用HBV稳定转染(Hep G2 2.2.15)的体外模型系统(参见Sells等，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.，84：1005-1009；Korba和Milman，(1992)，Antiviral Res.，19：55-70)。在确定培养条件下，这些细胞分泌丹氏粒到细胞培养基中。显示这些粒子包括表达乙肝表面抗原(HBsAG)和病毒DNA核心(病毒粒子DNA)的蛋白质外壳，HBsAG和病毒粒子DNA都可在体外容易地分析。证明这些HBV成分的相应mRNA可通过硫代磷酸酯反义寡聚物(ps-寡聚物)进行修饰(Korba和Gerin，(1995)，Antiviral Res.，28：225-242)；Goodarzi等，(1990)，J. Gen.Virology，71：3021-3025)；Offensperger等，(1995)，Intervirology，38：113-119)。最近，证明体外ps-寡聚物非共价结合用于脱唾液酸糖蛋白受体的DNA载体系统可在转染肝脏细胞中提高HBV复制的抑制(Wu和Wu(1992)，J.Biol.Chem.，267：12436-12439)；Madon和Blum，(1996)，Hepatology.，24：474-481；Yao等，(1996)，Acta.Virologica.，40：35-39)。
定向抗整合HBV的反义寡聚物的细胞吸收和生物功效通过它们经结构确定和均一接头系统结合到肝脏特异新糖结合物而显著增加。在此例子中，新糖结合物定义为肝脏-特异配体YEE(ahGalNAc)3和所需反义寡核苷酸组成的结合物，它们由稳定的硫醚桥共价连接一起以产生确定和均一的结构。反义RNA指结合互补mRNA分子的RNA分子，形成双链区域抑制mRNA翻译。结合接头-修饰配体和前体药物产生均一、结构确定的结合物。具体是，接头-配体整体如SMCC-修饰YEE(ahGalNAc)3共价连接到寡核苷酸以产生均一、结构确定的新糖结合物。具体来说，以碳水化合物为基础的肝脏配体YEE(ahGalNAc)3通过异双功能接头共价附着于寡核苷酸甲基膦酸酯(ONMP)。这种配体-接头-前体药物构建物针对小鼠肝脏的寡核苷酸。
一些针对不同靶位点的HBV-特异寡核苷酸例子列于表A(Goodarzi等，(1990)，J.General Virology，71：3021-3025)；Galibert等，(1979)，Nature，281：646-650)。例如，核心基因编码核心蛋白且对于HBV DNA复制是必需的并包装前基因组RNA。核心基因靶是翻译起始位点重叠多腺苷酸化位置。表面抗原基因编码病毒外壳的主要结构蛋白且在肝脏损害的发病机理中发挥关键作用。表面抗原基因靶是翻译起始位点。包壳基因编码包壳蛋白且包装DNA和抑制HBV DNA合成。包壳基因在所有HBV菌株中高度保守。它的靶是上部茎焕/未配对环。可合成其它病毒-特异寡核苷酸以靶向特异病毒位点以及基因-特异靶，包括癌-相关靶(如raf、ras和蛋白激酶)。
表A-肝炎病毒
                               乙肝病毒(HBV)
靶位点          序列(5’-3’)
HBx基因        TTGGCAGCACACCCTAGCAGCCATGGA(SEQ.ID NO：1)
HBV表面抗原(S基因)
帽位置/SPII    GATGACTGTCTCTTA(SEQ.ID NO：2)
内部/前S2      AGGAGATTGACGAGA(SEQ.ID NO：3)
起始子/基因S   GTTCTCCATGTTCGG(SEQ.ID NO：4)
起始子/基因S   TCTCCATGTTCG(SEQ.ID NO：5)
内部I/基因S    GAATCCTGATGTAAT(SEQ.ID NO：6)
内部I/基因S    AACATGAGGGAAACA(SEQ.ID NO：7)
前S1开放阅读框
HBV核心抗原(C基因)
                          丙肝病毒(HCV)
序列(5’-3’)
TFCTCATGGTGCACGGGTCTACGA(SEQ.ID NO：8)
CTTTCGCGACCCAACACTAC(SEQ.ID NO：9)
CATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ.ID NO：10)
GCCTTTCGCGACCCAACACT(SEQ.ID NO：11)
GCCTTTCGCGACCCAAC(SEQ.ID NO：12)
GCCTTTCGCGACCCAAC(SEQ.ID NO：13)
GTGCTCATGGTGCACGGTCT(SEQ.ID NO：14)
GTGCTCATGGTGCACG(SEQ.ID NO：15)
CTGCTCATGGTGCACGGTCT(SEQ.ID NO：16)
                     丁肝病毒(HDV)
序列(5’-3’)
GCGGCAGTCCTCAGT(SEQ.ID NO：17)
CTCGGCTAGAGGCGG(SEQ.ID NO：18)
CTCGGACCGGCTCAT(SEQ.ID NO：19)
TCTTCCGAGGTCCGG(SEQ.ID NO：20)
ATATCCTATGGAAATCC(SEQ.ID NO：21)
TGAGTGGAAACCCGC(SEQ.ID NO：22)
ATTTGCAAGTCAGGATT(SEQ.ID NO：23)
使用发明的方法和其它本领域已知方法，本领域技术人员能合成靶向这些和其它序列的发明结合物。
根据发明的化合物、组合物和方法有助于治疗赘生和感染性疾病且也包括如碳水化合物-包含配体的变化，它们针对细胞表面外源凝集素并特异于它们的配体-结合部分。具体是，可使用任何糖类或糖类-修饰的部分。“生理上可接受载体”包括任何和所有溶剂、散布介质、包被、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收-延迟剂以及包括配体-接头-前体药物(如寡聚物)构建物的试剂。
治疗上有效剂量的发明前体药物可眼内、口头摄取、吸入或肌肉内、静脉内、皮肤或皮下注射施用并可在没有热原、肠胃外可接受的水溶剂中施用。治疗上有效量指A-L-P构建物或方法的药物组合物各活性成分的总量足够表现出对病人有意义的益处，即减少或去除病毒或者减少或去除肿瘤负荷。当应用于单独活性成分如传递前体药物给靶时，术语指单独的成分。当应用于组合物时，术语指产生治疗效果的活性成分组合量，无论组合、连续或同时施用。治疗效果所需量的减少取决于分子和细胞靶、疾病和病人的健康状态。例如，在HBV中，优选达到至少20％减少，至少50％更优选，至少70％最优选。当口头施用治疗上有效量的发明时，结合物以片剂、胶囊、粉末、溶液或西也剂形式。溶液中的药物组合物可包含生理盐水溶液、右旋糖或其它糖类溶液或乙二醇、丙二醇或聚乙二醇或任何其它药学上可接受载体。药物组合物中施用的结合物量取决于治疗状态的性质和严重性。最终，参与医师会决定治疗各单独病人的本发明结合物的剂量和量，这要考虑多种因素如年龄、体重、总体健康、饮食、性别、待施用组合物、施用途径和治疗疾病的严重性。含本发明A-L-P结合物的药物组合物可施用给动物，包括但不限于人和家畜动物(如牛、狗、猫、马、绵羊和山羊)、鸟和鱼。
                            实施例
合成A-L-P结合物
此发明揭示了两种一般结合方法的发展，结合方法1和结合方法2可用于共价连接寡核苷酸类似物和新糖肽以产生结构确定和均一的结合物。结合方法1是三-成分反应，在其结合步骤中使用三种化学物，配体、功能化寡核苷酸类似物和连接两者的异双功能接头。结合方法2是二-成分反应，也指定量结合方法，仅使用结合步骤中的两种反应物；活化配体和功能化寡核苷酸类似物。也揭示了一种用于放射性同位素标记寡核苷酸类似物和它们A-L-P结合物的新方法，包括前面不能通过常规酶标记方法标记的类似物。这些发明使我们合成和放射性同位素标记几乎各类寡核苷酸和寡核苷酸类似物的新糖肽结合物。两种结合方法和与它们相关的放射性同位素标记方法的概述在下面给出，接着是阐明详细过程的例子用于在合成多种A-L-P结合物中使用这些方法。
结合方法1
此方法包括用异生物功能交联剂偶联功能化寡核苷酸类似物和新糖肽并分类为三-成分反应。寡核苷酸类似物在固相合成仪中合成。寡聚物的5’末端在固相合成后酶磷酸化以进一步结合与异生物功能交联剂反应的功能性基团。对于不能在5’末端酶磷酸化的寡核苷酸类似物如甲基膦酸酯寡聚物，另外的核苷单位2’-O-甲基-核苷在固相合成寡聚物中通过磷酸二酯键加入5’末端。例如，如果甲基膦酸酯寡聚物 T 7结合配体表1入口1所示类型的寡聚物Ump T 7，随后用固相方法合成。寡聚物合成后进一步在其5’末端用硫醇接头修饰(表2，入口10)并结合有SMCC(表4，入口3)的YEE(ah-GalNAc)3(表3，入口1)，以获得有与下列相同键的结合物：
Figure A0281636500211
与结合方法1相关的放射性同位素标记方法.当选择结合方法1用于合成A-L-P结合物，在酶磷酸化步骤中容易通过γ-32P-ATP取代未标记ATP在寡聚物5’末端获得32P放射性标记。当结合结束时，放射性结合物可立即用于细胞吸收和生物分布研究。
此三-成分反应的详细过程进一步描述于名为[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmp T 7(10)的32P标记A-L-P结合物的合成中(实施例1)。
结合方法2
在此方法中，新糖肽首先在其N-末端氨基用SMCC修饰以提供与硫醇基团反应的马来酰亚胺-活化配体(表3，入口6)。SMCC-修饰新糖肽在结合反应中使用前纯化到均一。在寡核苷酸类似物5’末端引入硫醇基团通过结合二硫接头到寡聚物在固相合成阶段方便地获得。随后用纯化的马来酰亚胺-活化新糖肽和纯化的5’硫醇-包含寡核苷酸类似物进行最后的结合。此结合方法去除所有与结合方法1相关的潜在副反应，这是通过在结合反应中用纯化的活化配体和寡聚物和通过仔细的实验设计和执行。结合寡核苷酸类似物定量进行，可容易地纯化最终A-L-P结合物。此反应过程分类为二-成分反应，其中结合物的“一半”被修饰并随后活化用于与另“一半”反应。例如，如果相同甲基膦酸酯寡聚物 T 7用SMCC作为异双功能接头来结合YEE(ah-GalNAc)3，结合方法2产生有与下列相同键的结合物：
Figure A0281636500212
此二-成分反应的详细过程进一步描述于实施例2和实施例3。
二-成分反应的更多例子可用相似策略实现。例如，新糖肽可如表3入口2-5所示修饰。可用例如2，2’-双吡啶活化硫醇。如下所示，活化硫醇与任何3’或5’硫醇修饰寡聚物的反应会提供寡聚物和新糖肽间的二硫键。此过程可接近硫原子周围不同空间体积的二硫化物，二硫化物用商业购买的交联剂不能接近(表4，入口4-6)。
与结合方法2相关的放射性同位素标记方法.当选择结合方法2用于合成A-L-P结合物，放射性标记在合成结合物后进行。放射性标记一些寡核苷酸类似物种类的结合物(如硫代磷酸酯寡核苷酸)可通过常规3’-或5’-酶标记方法来获得，取决于游离羟基位于哪端。随后用化学修饰保护放射性磷酸基团不受细胞酶降解。
对于不含可参与酶磷酸化的游离羟基的寡核苷酸类似物(如甲基膦酸酯寡聚物)，需要发展除了酶磷酸化的方法。为了这个考虑，我们发展了一种全面方法用于在任何类型寡核苷酸类似物和它们A-L-P结合物的3’末端结合稳定32P标记，包括那些前面不能用常规酶标记方法标记的。方法使用结合的化学和酶方法以完成标记并包括下列步骤：
1.固相合成前，设计杂合或嵌合寡聚物构建物包含三个共价连接部分。5’部分是二硫接头。中间部分是所需寡核苷酸类似物结构。3’-末端是有反极性的硫代磷酸酯胸苷三核苷酸单位，5’-T-3’-3’-TT-5’。此三核苷酸单位也称为示踪物单元，其结构示于图2c。结合此三核苷酸单位在寡聚物构建物3’-末端引入5’羟基，寡聚物构建物可酶磷酸化。
2.固相合成寡聚物构建物。
3.用结合方法2结合配体。
4.用酶磷酸化32P标记A-L-P的3’末端。
5.化学修饰32P标记的磷酸基团以保护标记不受细胞酶的水解。
图2d和图2e描述了用于制备32P标记A-L-P结合物的完整合成过程，使用结合方法2和其相关放射性同位素标记方法。
此发明发展的两种方法可用于合成多种A-L-P结合物。可结合到A-L-P结合物中的寡核苷酸类似物例子示于表1。表2列出寡核苷酸类似物上的3’-和5’-修饰以提供一级氨基或硫醇基团用于进一步反应。表3显示含N-末端氨基的新糖肽，以及四种修饰氨基以提供硫醇基团的方法加上另一种提供马来酰亚胺基团的方法。最后，表4列出一些异生物功能交联剂和组织蛋白酶D敏感寡肽，可用于连接前体药物到配体。显然有许多其它适当试剂。
表1.寡核苷酸类似物
入口         R1        R2        R3       R41       5’-结合物     H          H          H2            H         H          H      3’-结合物3       5’-结合物   -OCH3     -OCH3       H4            H       -OCH3     -OCH3   3’-结合物B＝A、C、G或T8≤n≤50
入口       R1      R2      R3      R4         R55    5’-结合物   O-       CH3      O-          H6        H        O-       CH3-     O-      3’-结合物7    5’-结合物   CH3     -O        CH3       H8        H        CH3     -O        CH3    3’-结合物9    5’-结合物   S-       CH3      S-         H10        H        S-       CH3      S-      3’-结合物11    5’-结合物   CH3     S-        CH3       H12        H        CH3     S-        CH3    3’-结合物13    5’-结合物   S-       S-         S-         H14        H        S-       S-         S-      3’-结合物B＝A、C、G或T8≤n≤50R6＝H、OH或OCH3
表2.用于结合新糖肽的3’和5’修饰的寡核苷酸类似物
入口              结构            功能基团            反应性
                                                      活性酯
                                                     异硫氰酸盐
1-3             氨基
                                                     异氰酸盐
                                                        醛
4         氨基
5                 氨基
6      氨基
7              氨基
8    
Figure A0281636500246
            氨基
                                                     1°卤化物
9    
Figure A0281636500247
硫醇            马来酰亚胺
                                                      活化二硫化物
10   
Figure A0281636500248
       硫醇
11   
Figure A0281636500249
                      硫醇
12   
Figure A02816365002410
    硫醇
13   
Figure A02816365002411
                      硫醇
14                  硫醇
  表3.YEE(ah-GalNAc)3 a功能基团修饰的说明
入口     修饰剂                  配体                                 功能基团        反应性
                                                                                      活性酯
                                                                                      异硫氰酸盐
 1         无                   H2N-YEE(ah-GalNAc)3                 氨基
                                                                                      异氰酸盐
                                                                                      醛
                                                                                      1°卤化物
 2b           硫醇           马来酰亚胺
                                                                                      活化二硫化物
 3   
Figure A0281636500252
          硫醇
 4   
Figure A0281636500253
           硫醇
 5   
Figure A0281636500254
          硫醇
 6     马来酰亚胺硫醇
a这些试剂可用于修饰任何图1所列配体。
b参见Goff，D.A；Carrol，S.F.(1990)取代的2-亚基硫代化物：用于制备稳定性提高的二硫化物交联结合物的试剂(Subtituted 2-iminothiolanes：regents for thepreparation of disulfide cross-linked conjugates with increased stbility)，BioconjugateChem，1，381-386.
  表4.活化寡核苷酸类似物、活化配体和交联剂可能组合的例子
            反应基团
入口     寡聚物    配体              交联剂                               键
 1       -NH2    -NH2   
Figure A0281636500261
           酰胺/胺
 2       -SH      -NH2   
Figure A0281636500262
                     硫醚/酰胺
 3       -SH      -NH2   
Figure A0281636500263
                   硫醚/酰胺
 4       -SH      -NH2   
Figure A0281636500264
                  二硫化物/酰胺
 5       -SH      -NH2   
Figure A0281636500265
              二硫化物/酰胺
 6       -SH      -NH2   
Figure A0281636500266
   二硫化物/酰胺
                                                                           酰胺/硫醚或
 7       -NH2    -SH                  见入口2-6
                                                                           酰胺/二硫
                                    α-citraconyl-K-(ε-FMOC)
 8       -NH2    -NH2                 PILFFRLa                         酰胺/酰胺
                                   (组织蛋白酶-D敏感接头)
 9       -SH      -SH               需要用2，2’-双吡啶二硫化物或相当
                                                                            二硫
                                    试剂活化
  a所示试剂不能商业购买
     实施例1  用结合方法1合成A-L-P结合物[YEE(ah-GalNAc)3 a]]
                       -SMCC-AET-pUmp T 7(10)
材料：甲基亚磷酰胺(methylphosphonamidite)合成纤维由JBL Scientific公司慷慨提供并可商业购买。它们可由普通技术人员根据规定程序从核苷合成。用于自动合成Ump T 7(图3)的所有其它试剂购自Glen Research公司。HiTrap Q阴离子交换柱购自Pharmacia LKB生物技术有限公司。反相高性能液相层析用购自Rainin仪器公司的Microsorb C-18柱进行。盐酸胱胺、1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺(EDAC)、甲基咪唑、无水二甲基亚砜(DMSO)、二硫苏糖醇(DTT)和Ellmen试剂购自Aldrich并没有进一步纯化就使用。二异丙基乙胺(DIPEA)购自Aldrich且使用前从氢化钙中复蒸馏。N-羟基琥珀酰亚胺4(N-甲基马来酰亚胺)环己基羧酸盐(SMCC)购自Pierce。Waters SepPak C-18柱体购自Millipore公司。YEE(ah-GalNAc)3(图2a)根据Lee等(1995，同上)合成并作为水溶液保存于4℃。三磷酸腺苷(ATP)和[γ-32P]-ATP分别购自P-L生化公司和Amersham。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)用20cm×20cm×0.75mm胶进行，胶含15％聚丙烯酰胺、0.089M Tris、0.089M硼酸、0.2mM EDTA(1×TBE)和7M尿素。样品溶解在加样缓冲液中，加样缓冲液含90％甲酰胺、10％1×TBE、0.2％溴酚蓝和0.2％二甲苯蓝。
合成Ump T 7(6)。寡脱氧核苷酸甲基膦酸酯用5’-O-(二甲氧三苯甲基)-3’-O-甲基-N，N-二异丙基(diispropyl)-亚磷酰胺胸苷在受控孔隙玻璃支持物(CPG)上合成并根据规定方法去保护(Mileer等，(1991)，寡核苷酸和类似物.一种实践方法(Oligo-nucleotides and Analogues.A Practical Approach)(Eckstein，E，编辑)，IRL出版社，牛津，137-154页；Hogrefe等，(1993)，分子生物的方法(Methods on Molecular Biology)，第20卷：寡核苷酸和类似物的操作(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)(Aragawal编辑)，Humana出版社有限公司，Totown，143-164页)。在5’末端结合到寡聚物的最终合成纤维是5’-O-(二甲氧三苯甲基)-2’-O-甲基-3’-[2-氰乙基]-N，N-二异丙基(diispropyl)]亚磷酰胺尿苷。最后的偶联步骤位于末端5’核苷和邻近核苷间的磷酸二酯键，使5’末端羟基可用噬菌体T4多核苷酸激酶磷酸化并由于存在2’-O-甲基基团而保证磷酸二酯的合理稳定性。原始8聚体通过HiTrap Q阴离子交换柱(用含＜25％乙腈的缓冲液加样；用0.1M磷酸钠，pH5.8洗提)和用线性梯度(溶剂A：50mM磷酸钠，pH5.8、2％乙腈；溶剂B：50mM磷酸钠，pH5.8、50％乙腈；梯度：30分钟内0-60％B)的预备反相层析(Microsorb C-18)纯化。这样寡聚物用分析HPLC纯化到97％纯度，仅有少量的n-1种类被污染。
合成[5’-32p]-5’-O-[(N-2-硫代乙基)氨基磷酸酯]-Ump T 7(9)(图3)。结合纯化的寡聚物(168nmol)、ATP(160nmol)、H2O(75μL)、10XPNK缓冲液(5mM DTT、50mMTris(HCl、5mM MgCl2，pH7.6；10μL)、[γ-32P]-ATP(3000Ci/mmol，100μ Ci，10μL)和PNK(5μL中的150U)并在37℃培养16小时并蒸发干燥。剩余物再溶解于0.2M1-甲基咪唑，pH7.0(100μL)和含0.3M EDAC(100μL)的1.0M盐酸胱胺，pH7.2并在50℃加热2小时(Chu等，(1983)，Nucleic Acid Res.，11：6513-6529；Chu等，(1988)，Nucleic Acid Res.，16：3671-3691)。过量试剂通过SepPak去除(用50mM磷酸钠，pH5.8、5％乙腈加样；用5％水中的乙腈洗；用50％水中的乙腈洗提)。溶剂在真空蒸发且原始胱胺加合物再溶解于含50mM DTT的10mM磷酸盐(200mL)并加热至37℃1小时。缓冲盐和过量还原剂如前从反应混合物中去除且原始产物在真空干燥。从6以57％产量生成的化合物9没有进一步纯化就用于下一步。
合成[5’-32P]-[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmp T 7(10)。新糖肽(336nmol)(图2a)溶解于无水DMSO(4mL)并用DIPEA(336nmol)和SMCC(336nmol)处理。反应维持在室温4小时，随后加入新鲜制备的硫醇9(图3)。使反应混合物脱气并在真空室温缓慢浓缩。原始物溶解于甲酰胺加样缓冲液(100μL，由PAGE(4V/cm，1.5小时)纯化)，通过粉碎和浸泡方法回收(50％水中的乙腈)。纯10的总产量是25％。
由于P-N键水解用0.1N HCl(37℃，1小时)处理，10产生[5’-32P]-磷酸化6；然而6不与DTT(50mM，pH8，37℃，1小时)、3-马来酰亚氨基丙酸(50mM，pH8，37℃，1小时)、Ellman试剂(50mM，pH8，37℃，1小时)和BAP(70U，65℃，1小时)反应。用0.1N HCl和BAP连续处理导致[32P]-标记如预期完全失去。以相同方式制备的10的未标记样品化学计量分析显示它含3摩尔N-乙酰半乳糖胺用于每摩尔结合物，与建议结构一致。(Ump T 7的摩尔吸光系数值计算为59,750L/mol-cm，这是结构中所含各核苷的摩尔吸光系数值总和。此值与结合物中所含GalNAc残基摩尔数很一致)。空气协助的电喷射质谱在M/Z 4080(计算质量为4080.7)产生母离子(负离子模式)。
方法1的讨论
合成和纯化YEE(ah-GalNAc)3及pUmp T 7根据规定程序(Lee，(1987)，同上；Miller(1991)，同上)进行。为形成YEE(ah-GalNAc)3和Ump T 7间的共价键，Ump T 7的5’-末段用Orgel方法(Chu，(1983&1988)，同上)修饰。这引入二硫化物到寡核苷酸甲基膦酸酯中，随之可用DTT还原以给出5’-硫醇。新糖肽(图2a)以互补方式用异生物功能交联剂SMCC修饰，SMCC能特异结合YEE(ah-GalNAc)3的N-末端氨基。偶联SMCC引入的马来酰亚氨基和修饰寡核苷酸甲基膦酸酯的5’-硫醇导致寡核苷酸甲基膦酸酯和新糖肽通过代谢稳定硫醚的键合(图3)。
为开始合成，Ump T 7用PNK和0.95[32P]-ATP同等物磷酸化。成功的5’-磷酸化通过产物与亲代寡核苷酸甲基膦酸酯相比电泳淌度增加来确定，这是由于加入5’-磷酸和结合32P到结构时从-1到-3负电荷增加(图4，A带)。以此方式形成的末端-标记反应确保约90％ATP被消耗，有效使用[32P]-ATP以放射性标记结合物。5’-磷酸的修饰在两步骤中完成。5’-末端标记寡核苷酸甲基膦酸酯在50℃用0.5M缓冲液中的盐酸胱胺在pH7.2存在0.15M EDAC时培养来以65％产量产生5’-盐酸胱胺，缓冲液含0.1M 1-甲基咪唑。反应混合物的PAGE分析显示产物移动显著慢于5’-末端标记寡核苷酸甲基膦酸酯。此观察与从-1到-3的变化一致，变化是由于形成P-N键和中和第二个负电荷时在5’-磷酸上单个含氧阴离子的损失，中和是通过胱胺基团末端上存在的正电荷质子化伯胺(图4；比较A和B带)。在此反应中产生直至35％的胸苷-修饰寡核苷酸甲基膦酸酯(图4，C带)，尽管尝试修改反应条件(如降低温度和减少EDAC浓度)，去除它的生成不能没有所需胱胺加合物产量的共同减少。由于EDAC与胸苷的N-3反应以形成胸苷-EDAC加合物，此副产物假定上升(Chu，同上；Gilham，同上)。二硫化物用DTT在pH8还原是定量的并伴随迁移率变动为更快的迁移种类，这是由于失去正电荷质子化一级氨基(图4；比较B和C带)。在一个不同反应中，YEE(ah-GalNAc)3在无水DMSO中结合1当量各SMCC和DIPEA并在室温培养。由于5、7和9上存在的反应基团区特异结合，完成此反应混合物和硫醇9的结合可完全没有YEE(ah-GalNAc)3消耗SMCC，从而产生结构确定和均一的结合物。如所预期，由于结合物10的质量显著大于亲代寡核苷酸甲基膦酸酯，加入修饰新糖肽到活化寡核苷酸甲基膦酸酯的5’末端伴随着其PAGE迁移率显著变慢(图4，F带)。此过程后，当使用2当量(以新糖肽YEE(ah-GalNAc)3的起始寡核苷酸甲基膦酸酯6为基础)时9完全转变成10。结合物10的总产量是寡核苷酸甲基膦酸酯6基础的24％(三种综合体的平均)。10的均一性通过电喷射质谱检测单个母离子(负离子模式)来确认。
实施例2用结合方法合成A-L-P结合物1c
此例子描述了详细过程用于在从新种类寡核苷酸类似物合成A-L-P结合物中使用结合方法2，寡核苷酸类似物是交替甲基-膦酸酯-磷酸二酯主链的2’-O-甲基核糖。表5列出三种此类寡聚物(寡聚物1-3)和它们用肝脏配体YEE(ah-GalNAc)3形成的A-L-P结合物(结合物1c、2c、3c)。下面描述了合成结合物1c的过程。另两个结合物类似合成。
在合成1c中使用结合方法2的过程包括下列步骤：1)合成SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(8)；2)设计寡聚物构建物1b；3)固相合成寡聚物构建物1b；4)结合1b和SMCC-YEE(ah-GalNAc)3-合成1c；5)32P放射性标记结合物1c。
表5.交替甲基膦酸酯类似物的寡核苷酸
序列
1(n＝7)    ApG pUpC pApG pUpC pApG pUpC pApG pU
2(n＝7)    GpU pUpC pUpC pCpA pUpG pUpU pCpA pG
3(n＝10)   UpU pUpA pUpA pApG pGpG pUpC pGpA pUpG pUpC pCpA pU
其中p：磷酸二酯键
    p：甲基膦酸酯键
    ps：硫代磷酸酯键
(xxxx40)
寡核苷酸      R1       R2       R3       R4
a             H         O-       CH3    3’-结合物
b         C6-硫醇-ps    O-       CH3    3’-结合物
c         5’-结合物    O-       CH3    3’-结合物
d       配体-SMCC-AET   O-       CH3   H
e            EDA        O-       CH3         H
其中配体：YEE(ah-GalNAc)3
   5’-结合物：YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-S(CH2)6-ps键(图3)
   3’-结合物：示踪物单元(图9)
   EDA：乙二胺
在表5中，寡聚物1-3可连接表示为表底部寡核苷酸a-e的取代基团，用本文下面所述合成方法进一步形成发明的化合物例子。例如，1b由序列1组成，序列1带根据发明的C6-硫醇-ps、O-、CH3和3’-结合物(结构示于2c)的取代物。如实施例2中详细所列，1b(图2e)和1c所示结构的化合物根据图2d和2e所示过程合成。显然有起始材料的适当取代和合成中的变化，可类似合成其它组合。
合成和纯化SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(8)。约1-2微摩尔的YEE(ah-GalNAc)3在玻璃Reacti-小瓶内干燥。对于此溶液，加入无水DMSO(250μL)和无水DIPEA(3μL)，随后用150μL含真空-干燥SMCC(6mg)的溶液处理，SMCC在无水DMSO中。混合物短暂振动并保持在室温。反应进程通过反相HPLC分析以30分钟间隔监控。HPLC方法：Microsorb C-18 250×4.6mm.。0-5分钟，0-40％B；5-20分钟，40-100％B。A：50mM磷酸钠pH5.8中的2％CAN；B：50mM磷酸钠pH5.8中的50％CAN。流速1mL/分钟。检测：A280nm。HPLC分析的结果表明在2小时内起始YEE(ah-GalNAc)3(洗提时间：7.3分钟)完全转变成所需产物SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(洗提时间：9.8分钟)。反应混合物随后用含2％CH3CN的50mM磷酸钠(pH5.8)稀释到10mL并上样到Sep-Pak柱体。柱体用10mL含2％CH3CN的50mM磷酸钠(pH5.8)洗且产物用10mL 25％CH3CN/H2O洗提。产物在Speed-vac中降低的压力下浓缩并进一步在半-预备反相C-18柱上纯化。HPLC方法：Microsorb C-18 250×7.5mm。0-60分钟，20-60％B。A：50mM磷酸钠pH5.8中的2％CAN；B：50mM磷酸钠pH5.8中的50％CAN。流速2mL/分钟。检测：A280nm。收集含纯SMCC-YEE(ah-GalNAc)3的部分并在Sep-Pak上脱盐。最终产物量：1.89(O.D.2761.35μmole)。UV(25％CAN)：305(br)，282(sh)和276nm。相对强度∶ε305∶ε 282∶ε276＝1∶2.7∶3.0。MS(电喷射，阳离子模式)：1565(M+H)+。分析反相HPLC：在9.8分钟的单峰。(HPLC条件：Microsorb C-18 250×4.6mm.。0-5分钟，0-40％B；5-20分钟，40-100％B。A：50mM磷酸钠pH5.8中的2％CAN；B：50mM磷酸钠pH5.8中的50％CAN。流速1mL/分钟。检测：A280nm。)
设计寡聚物构建物1b(表5)。下列描述阐明了如何设计寡聚物构建物用于使寡核苷酸类似物1结合YEE(ah-GalNAc)3并形成32p标记的A-L-P结合物。寡聚物1属于一种新类型寡聚物，包含具交替磷酸二酯和甲基膦酸酯核苷酸间键合的2’-O-甲基核糖，寡聚物序列示于表5。寡聚物1b(表5)是设计用于使寡聚物1结合配体并使结合物32p标记的构建物。寡聚物1b包括三个部分。中间部分包含寡聚物1的精确结构，即A-L-P的P部分。5’-部分包含C6-硫醇接头，通过硫代磷酸酯键附着于寡聚物1的5’-A。硫醇基团用于结合SMCC-修饰配体，即A-L-P的A部分。3’部分是示踪物单元，通过甲基膦酸酯键共价附着于寡聚物1的3’-U。示踪物单元是有反极性的硫代磷酸酯胸苷三核苷酸单位，5’-T-3’-3’-TT-5’，其结构示于图9或2c。没有此三核苷酸单位，最终的结合物会在其3’-末端有具5’-甲基膦酸酯键的2’-O-甲基尿苷。放射性同位素标记此3’-末端用常规酶方法不可能。结合此三核苷酸单位在寡聚物构建物3’-末端引入5’-羟基，可被酶磷酸化以32p标记结合物。
仅当需用32P标记最终结合物时，需要3’-示踪物单元。对于不需放射性标记结合物的应用，省略了示踪物且寡聚物构建物仅包括硫醇接头和P部分。
固相合成寡聚物构建物1b。修饰的寡聚物1b在固相DNA合成仪上合成，使用来自商业来源(Glen Research)的相应亚磷酰胺和甲基-亚磷酰胺s。示踪物在dT-5’-Lcaa-CPG支持物上用硫代磷酸酯化学通过偶联3’-DMT-dT-5’-CE亚磷酰胺到支持物来聚集，接着用5’-DMT-5-[N-(三氟乙酰)己基-3-丙酰胺]-2’-脱氧尿苷3’-[(2-氰乙基)-(N，N’-二异丙基)]亚磷酰胺(CPG和合成纤维商业购自Glen Research)。随后对应于寡聚物1的序列通过持续偶联2’-O-甲基甲基亚磷酰胺s合成纤维和2’-O-甲基-氰乙基亚磷酰胺合成纤维来聚集在包含示踪物CPG上。接着在固相合成的最后偶联步骤，5’-二硫化物接头用硫代磷酸酯化学通过偶联C6-二硫化物氰乙基-亚磷酰胺合成纤维(Glen Research)来引入寡聚物。必要时，Beaucage试剂(GlenResearch)替换低含水量氧化剂以影响亚磷酸盐的硫化来根据标准规定程序产生硫代磷酸酯。寡聚物合成不去除5-DMT基团。寡聚物在Genta单罐法(one-pot)下去保护(Hogrefe，R.I.，Vaghefi，M.M.，Reynolds，M.A.，Young，K.M和Arnold，L.J.(1993)Nucl.Acids Res.，21，2031-2038)并通过三苯甲基过程纯化。二硫化物-包含寡聚物最后用半预备反相层析C-18柱纯化。HPLC条件：Microsorb C-18250×7.5mm.。0-50分钟，20-60％B。A：50mM磷酸钠pH7中的2％CAN；B：50mM磷酸钠pH7中的50％CAN。流速2mL/分钟。检测：A254nm。
二硫化物部分还原成硫醇受含DTT的5’-二硫化物-包含寡聚物处理影响。因此，2.5 O.D.260(～16纳摩)二硫化物寡聚物溶解于400μL新鲜制备并脱气的50mM DTT溶液中，溶液在10mM磷酸钠，pH8中。混合物37℃培养2小时。定量减少通过反相HPLC分析确定，显示硫醇寡聚物洗提快于亲代二硫化物寡聚物。硫醇寡聚物随后在Sephadex G-25柱(10×300mm)上纯化以去除DTT和盐类。柱填充和样品洗提受使用脱气的2％乙醇-水影响。含纯硫醇寡聚物的G-25部分在下一个反应中立即使用以最小化不需要的氧化。合成YEE(ah-GalNAc)3-包含寡聚物1c。
含1.8O.D.260(12纳摩)纯硫醇寡聚物(1b)的G-25部分收集后立即与SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(50纳摩)混合。混合物在speed-vac中浓缩干燥。剩余物溶解于100μL脱气的50％CH3CN，CH3CN含0.1M磷酸钠pH7。溶液在speed-vac中通过抽真空约5分钟进一步脱气。溶液随后盖紧并室温培养过夜以使结合完全。另外，结合可通过混合新鲜收集的硫醇寡聚物G25部分和50％CH3CN中的SMCC-YEE(ah-GalNAc)3溶液进行，CH3CN含0.1M磷酸钠pH7。溶液立即置于speed-vac中并浓缩至约1mL。溶液随后盖紧并室温培养过夜以使结合完全。发现两个过程都产生硫醇-包含寡聚物的定量结合。
为确定结合反应产量，干燥约0.5μL的反应部分并用[γ-32P]-ATP和PNK磷酸化，通过20％变性PAGE分析。结合物的迁移率与相同胶中未结合寡聚物相比。未标记结合物也可以类似方式通过UV影像分析。PAGE结果指示硫醇寡聚物与新糖肽的定量结合。确认结合物是通过其在胰凝乳蛋白酶消化下的显著胶迁移率和DTT处理下不能变动。结合物最后由Sephadex G-25柱纯化，用20％乙醇洗提。纯化的1c可直接用于生物功效实验和其它不需放射性标记结合物的实验。
32P放射性标记结合物1c。为在细胞吸收和生物分布实验中使用1c，用γ-32PATP和PNK根据常规5’-酶放射性标记过程标记1c。结合纯化的结合物1c(10纳摩)、ATP(10纳摩)、H2O(70μL)、10×PNK缓冲液(5mM DTT、50mM Tris(HCl、5mM MgCl2，pH7.6；10μL)、[γ-32P]-ATP(3000Ci/mmol，150μCi，15μL)和PNK(10μL中的300U)并在37℃培养16小时并蒸发干燥。32P结合到结合物通过15％PAGE和放射自显影分析。随后将0.2M 1-甲基咪唑，pH7.0(100μL)和含0.3MEDAC(100μL)的1.0M盐酸乙二胺，pH7.2加入标记溶液。溶液接着在50℃加热2小时(Chu等，(1983)，Nucleic Acid Res.，11：6513-6529；Chu等，(1988)，Nucleic Acid Res.，16：3671-3691)。过量试剂通过NAP-25柱去除，柱用20％含水乙醇洗提。随后含纯32P标记结合物的部分用UV吸光率测定和scientilation计算分析。特异活性计算为约5-8Ci/微摩。纯化的32P标记结合物再次用15％PAGE和放射自显影分析，没有任何低分子量的32P杂质。
实施例3用结合方法2合成A-L-P结合物NG1到NG5
如本发明实施例2中所述，结合方法2是可用于形成任意寡核苷酸类似物的A-L-P结合物的一般方法。下列描述是使用结合方法2的另一个例子，用于合成不同类型的A-L-P结合物。在此例子中，待结合的寡核苷酸类似物属于寡脱氧核糖核苷硫代磷酸酯类型，是当前全球反义药物发展中所用的一种主要类似物。因为寡脱氧核糖核苷硫代磷酸酯容易通过经典3’-酶标记过程在3’-末端标记，例子2所用的3’-示踪物单元在这里不需要用于放射性标记结合物。因此，待设计的寡聚物构建物仅包含两个部分，硫代磷酸酯寡聚物部分和5’-二硫化物接头部分。
这些5’-二硫化物-包含硫代磷酸酯寡聚物通过自动硫代磷酸酯寡核苷酸合成方法在ABI 392 DNA/RNA合成仪上合成，使用标准3’-CPG支持物、5’-DMT-核苷3’-氰乙基亚磷酰胺和C6-硫醇接头-氰乙基亚磷酰胺。(所有这些试剂购自GlenResearch，Sterling，VA)寡聚物合成没有去除5-DMT基团。寡聚物用浓缩的氢氧化铵55℃去保护16-20个小时。三苯甲基-包含寡聚物随后通过带Microsorb C-18柱的预备反相层析纯化，用50mM磷酸钠pH7.5中的线性梯度乙腈。纯化的三苯甲基-包含寡聚物在Sep-Pak(Water，Milford，MA)上用0.5％TFA去三苯甲基。所有寡核苷酸在后续实验使用前在Sep-Pak柱上脱盐。
与实施例2所述类似，纯化的二硫化物-包含寡聚物随后用于结合SMCC-YEE(ah-GalNAc)3。大部分结合反应通过使用1.5-2当量SMCC-YEE(ah-GalNAc)3到硫醇寡聚物进行。这导致在所有进行反应中的寡聚物定量结合。过量配体和缓冲盐容易通过G-25柱去除，用20％乙醇洗提，产生高纯度结合物。结合反应也用过量硫醇寡聚物代替进行，即1.5当量硫醇寡聚物到配体。在这些情况中，所有配体在反应中消耗且剩余过量硫醇寡聚物通过预备反相高压液相层析(HPLC)去除。下面是上述方法合成的5种寡脱氧核糖核苷硫代磷酸酯A-L-P结合物的序列(图5)。NG1：YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-5’GTTCTCCATGTTCAG3’，靶向HBV sa-基因，NG2：YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-5’TTTATAAGGGTCGATGTCCAT3’，靶向HBV c-基因，NG3：YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-5’AAAGCCACCCAAGGCA3’，靶向HBV e-基因和随机对照，NG4：YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-5’TGAGCTATGCACATTCAGATTT3’和NG5：YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-5’TCCAATTAGATCAG3’。
使用一些方法确定寡聚物结合产量和结合物纯度。1)PAGE分析35S标记的结合反应混合物。干燥约0.5μL的反应部分并用[35S]-ATP-S标记3’末端(见下述3’-标记过程)，通过20％变性分析；2)PAGE分析UV影像显现的未标记结合反应混合物；3)HPLC分析未标记结合反应混合物。所有样品接受上述三种分析前用DTT处理。平行处理和分析未结合的硫醇寡聚物用于比较目的。PAGE分析发现结合物都在胶上表现出显著慢于相应硫醇寡聚物的迁移率，所有硫醇寡聚物完全转变成相应结合物。在反相HPLC分析中，所有结合物显示单峰且它们的保持比未结合硫醇寡聚物长约2-3分钟。
用一些方法表现最终结合物的特征。结合物接受下列处理并接着用PAGE和HPLC分析来分析：1)胰凝乳蛋白酶消化；2)NAGA消化；3)DTT处理。胰凝乳蛋白酶消化产生一种在胶上迁移快于结合物和硫醇寡聚物的寡聚物种类，确定结合物中三-肽结构的存在。HPLC分析也指示消化带来的保持时间变化。糖部分的存在通过NAGA消化确定，产生一种在胶上迁移仅稍快于结合物的寡聚物种类，但此种类在HPLC中表现出比结合物显著长的保持。DTT处理不导致结合物结构的任何变化，此结构是在胶和HPLC分析基础上，表明结构中缺乏二硫化物且所有硫醇基团参与结合反应。结合物结构也通过空气协助的电喷射质谱来确定。
35S放射性标记结合物NG1。代表(NG1)结合物用35S标记并分析Hep G2和HepG2 2.2.15细胞中的细胞吸收。35S放射性标记用末端脱氧核苷酸转移酶(LifeTechnologies，Grand Islang，NY)和[35S]dATP S(＞1000 Ci/微摩)(AmershamBiotech，Piscataway，NJ)的组合作用在3’-末端结合。所有35S标记寡聚物在用于细胞实验前通过Sephadex G25柱或Sep-Pak柱体纯化。
比较结合方法1和结合方法2。
结合方法1是发展早于本发明的综合结合方法。它成功用于从寡核苷酸甲基膦酸酯(如结合物10)和它们含交替磷酸二酯-甲基膦酸酯主链的类似物(如结合物1d，表5)中合成A-L-P结合物。它提供了方法用于构建物这些化学-确定和结构均一的A-L-P结合物并在本发明中发挥重要作用。然而，此方法需要一些改进：1)需要最小化副反应。这些副反应包括EDAC-加合物形成、未反应SMCC和硫醇寡聚物的结合、水解SMCC和硫醇寡聚物的结合。这些副反应减少产物形成量并产生需要使用PAGE作为一种纯化方法的混合物，这进一步使总产量减少到约25％。2)需要精确化学以使用此方法合成有其它主链寡聚物的A-L-P结合物，如硫代磷酸酯。在修饰5’-磷酸中使用EDAC和胱胺不适于此类寡聚物。3)32P标记不能在完成配体结合后进行。由于此标记相对短的半衰期，当需要新的32P标记结合物时，必须重复整个结合过程。
结合方法2提供对方法1的显著改进，改进是在其寡聚物和配体的定量结合、所有寡聚物主链类型的通用相容性、结合物的简单纯化和放射性标记结合物中的灵活性。这些改进通过完成下列方法2中的独特过程来获得：
1)在固相合成中通过结合硫醇接头到寡聚物构建物，防止寡核苷酸类似物的合成后修饰。这去除了方法1中发现的EDAC-加合物形成。这也使合成一些主链类型的寡核苷酸结合物有可能，结合物对EDAC-修饰敏感如硫代磷酸酯寡核苷酸。因此有可能合成所有寡核苷酸类似物类型的A-L-P结合物，硫醇接头可结合到它们的结构中。
2)通过合成活化配体支架、YEE(ah-GalNAc)3-SMCC并在用于结合反应前纯化到均一，去除了不需要的结合物如有未反应SMCC和水解SMCC的结合物。纯化的活化配体可大量制备，保存-20℃冰箱，在结合时可使用。因此防止了重复合成活化配体的必需。
3)通过在严格脱气条件下进行硫醇寡聚物纯化和结合反应来最小化硫醇寡聚物的二聚化到无法检测的水平。本发明脱气条件指温和的厌氧情况，指低氧更优选，指没有氧存在最优选。优选去除任何未反应试剂和其它低分子量硫醇-包含杂质的痕迹。这通过脱气G-25纯化硫醇寡聚物中所用溶剂、使用结合反应中立即新收集的硫醇寡聚物G-25部分、在真空条件中进行结合来完成。这些预防措施在结合反应中结合纯SMCC-修饰配体和纯硫醇寡聚物的使用，形成获得定量结合寡聚物的基础。
4)去除副反应和所得定量结合反应使利用简单G-25纯化方法获得纯结合物有可能。因此，去除了方法1中必须的PAGE纯化。这使总产量中纯结合物大于95％。
5)任选结合3’-示踪物单元到寡聚物构建物，在放射性标记所有主链类型的最终结合物中产生极端灵活性。可制备结合物并同时大量保存，需要时可被稍后标记如在用于细胞吸收和生物分布实验前。如方法1中的情况，这去除了反复合成相同结合物用于放射性标记的需要。
由于结合方法2的这些优势，它成为我们自发明后的常规结合方法。我们的生物功效研究中所用的A-L-P结合物都通过此方法合成。
                          细胞吸收实验
实施例4
此例子描述了用于细胞吸收实验Hep G2细胞、Hep G2 2.2.15细胞、HT 1080或HL-60细胞的材料和方法。
材料：添加L-谷氨酰胺的Earle盐极限必须培养基(MEM)、Dulbecco氏修饰Eagle培养基(D-MEM)、添加L-谷氨酰胺的RPMI培养基1640(RPMI)、Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)、胎牛血清(FCS)、丙酮酸钠(100mM)、非必须氨基酸(10mM)、水合碳酸氢钠(7.5％)和胰蛋白酶(0.25％；在有1.0mM EDTA的HBSS中制备)购自GIBCO BRL。人肝细胞癌(Hep G2)(ATCC HB 8065)、人纤维肉瘤(HT 1080)和人前髓细胞白血病(HL-60)细胞购自ATCC。Hep G2 2.2.15，一种用人乙肝病毒DNA稳定转染的人肝细胞癌细胞系(Hep G2 2.2.15)(Sell等，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.，84：1005-1009)是G.Y.Wu博士的馈赠。其它适当细胞系对本领域技术人员已知，例如PLC/PRF/5(Alexander细胞)、人肝细胞瘤分泌乙肝表面抗原被描述(Jacinta，S.，(1979)，Nature.，282：617-618)且可从American Type Culture Collection获得。
细胞维持在添加10％胎牛血清(FCS)、1mM丙酮酸钠和0.1mM非必须氨基酸的1xMEM或添加10％FCS(Hep G2)的1xRPMI、添加10％FCS(Hep G2 2.2.15)的1xRPMI、添加10％FCS(HT 1080)的1xD-MEM或添加10％FCS(HL-60)的1xRPMI中。硅油开始获增自General Electric(#SF1250)且随后购自Nye Lubricant有限公司(#98-0704)。细胞用购自Coulter ElectronicsCoulter的细胞计数器计数。
方法：Hep G2、Hep G2 2.2.15和HT 1080细胞传代到2cm孔中并在合适培养基生长到约2-4×105个细胞每孔的密度。吸出维持液且细胞用0.5mL含2％FCS的培养基37℃培养并在[5’-32P]-标记10中达到1μM。规定时间过去后，保存5μL等分培养基用于闪烁计数且剩余物从孔中吸出。细胞用D-PBS(2×0.5mL)洗，0.25％胰蛋白酶处理(37℃，2分钟)并悬浮于含10％FCS的新配生长培养基。悬浮细胞在1.7mL锥形微离心管中的硅油(0.5mL)上铺层并通过14,000rpm(12,000g)离心30秒沉淀。小心倒出上清且细胞用100μL溶液裂解，溶液含0.5％NP40、100mM氯化钠、14mM Tris(HCl和30％乙腈)。放射性的量通过闪烁计数推断与细胞裂解物相联10的量来确定。
添加2％FCS并在[32P]-10中达到1μM的RPMI培养基用7.5×106个HL60细胞室温预处理5分钟。细胞通过离心(5分钟)取出。倒出培养基并加入7.5×106个新HL60细胞。细胞均匀悬浮且细胞悬浮液分成六个0.4mL部分。剩余物弃去。细胞培养规定时间，随后通过离心(5分钟)收集，重悬浮于0.5mL D-PBS并铺层于1.7mL锥形微离心管中的硅油上。细胞通过离心(12,000g，30秒)沉淀，裂解，细胞相关的[32P]-标记物质通过闪烁计数确定。
实施例5
此例子阐述了体外Hep G2细胞对10的摄取。在此情况中，10用结合方法1合成。
检测单独和存在100当量游离新糖肽5时结合物10的细胞组合，Hep G2细胞证明细胞吸收是10的新糖肽部分结合肝碳水化合物受体的结果。作为对照，5’-末端乙二胺修饰的寡核苷酸甲基膦酸酯(图2)也在相同条件下用Hep G2细胞培养。乙二胺修饰5’-磷酸是通过在含0.1M咪唑的pH7缓冲液中用0.1M EDAC培养5’-磷酸化的2来完成，培养在37℃进行2小时，接着用缓冲到pH7.0的水溶液0.3M盐酸乙二胺过夜培养(Miller，P.S.；Levis，J.T.，结果未发表)。此修饰防止细胞磷酸酶活性去除5’-磷酸。
在各情况中，修饰的寡核苷酸甲基膦酸酯以1μM浓度存在于含2％胎牛血清(FCS)的培养基中且培养在37℃进行。单独培养时结合物迅速结合细胞，仅两小时后以线性方式将细胞加入至7.8pmol每106细胞程度(图6)。相反，当100倍过量的游离5与1μM结合物一起存在时，10的结合仅为0.42pmol每106细胞，此值与对照寡核苷酸甲基膦酸酯6b获得的值基本相同，寡核苷酸甲基膦酸酯6b不包含新糖肽(0.49pmol每106细胞)。作为另外的对照，Hep G2细胞在存在10倍过量的5时用6b培养，从而尽管缺乏5和6b间的共价建，5可引起Hep G2细胞吸收6b。两小时培养后细胞相联6b的量仅为0.60pmol每106细胞，显著少于用结合物10的。此外，检测更长时间Hep G2细胞对10的摄取(1μM结合物，37℃)，发现它线性增长至约24小时，到达26.6pmol每106细胞的值(图7)。这些实验结果表明：(1)结合物10通过特异结合至脱唾液酸糖蛋白受体来与Hep G2细胞相联；(2)寡核苷酸甲基膦酸酯和新糖肽间的共价建对于显著提高寡核苷酸甲基膦酸酯与Hep G2细胞联合是必须的；(3)Hep G2细胞对10的摄取在此研究所用条件下直到24小时才饱和。
实施例6
此例子阐述了10对肝来源细胞(Hep G2)的特异性。
也检测了化合物的细胞-类型特异性。已很好确定脱唾液酸糖蛋白受体发现于肝细胞表面并代表选择性靶向此组织的一种有效方法用于传递多种治疗剂(Wu和Wu(编辑)，(1991)，肝脏疾病，用特异受体和配体的靶诊断和治疗(LiverDisease，Target Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands)，MarcelDekker有限公司，纽约)。通过在含1μM结合物10和2％FCS的培养基中培养三种人细胞系Hep G2、HL-60和HT 1080来检测组织特异性，培养在37℃进行3和24小时。表现出显著吸收10的唯一细胞系是Hep G2。培养3和24小时后，8.5和26.7pmol每106细胞分别与Hep G2细胞相联(图8)。相反，24小时后仅0.10和0.53pmol每106细胞分别与HL-60细胞和HT 1080细胞相联。
实施例7(图9)
此例子阐述了含寡聚物的肝脏特异新糖结合物的摄取，寡聚物包括其它核酸酶抗性主链。
上述例子说明OMNP’s可结合肝特异配体YEE(ahGalNAc)3以产生均一和确定的新糖结合物。此外，该新糖结合物由肝-获得细胞(Hep G2)特异吸收且在体外速度增加。上述结果扩展到考虑有其它核酸酶抗性主链修饰的寡核苷酸，如含2’O甲基核糖部分和交替磷酸二酯/甲基膦酸酯键(2’Ome-po/mp)的硫代磷酸酯(ps)寡聚物。实验方法与实施例4和5中所用相同。这些实验结果非常类似于用含新糖结合物的OMNP所观察到的。根据结合方法2合成含硫代磷酸酯寡聚物的新糖结合物。YEE(ahGalNAc)3-SMCC-ps5’GTTCTCCATGTTCAG3’(NG-1)用结合方法2中所述3’-末端标记方法来35S-标记，表现出的线性增长在24小时达到17.25皮摩/106细胞程度。相反，Hep G2细胞以降低的速度吸收相应未结合寡聚物ps5’GTTCTCCATGTTCAG3’，在24小时达到1.01皮摩/106细胞。以类似方式，含2’OMe交替po/mp寡聚物的新糖结合物(YEE(ahGalNAc)3-SMCC-2’OMe5’AG pUC pAG pUC pAG pUC pAG pU3’)表现出线性增长，在24小时达到24.3皮摩/106细胞程度。相应未结合寡聚物(2’OMe 5’AG pUC pAG pUC pAG pUC pAG pU3’)在所有试验时间点表现出小于1皮摩/106细胞的最小吸收。所有寡聚物和新糖结合物在细胞培养基中稳定至24小时。这些结果表明独特配体-接头复合体的传递效用并给我们将此系统扩展至传递其它治疗剂的平台。
实施例8(图10)
此例子阐述了体外Hep G2 2.2.15细胞对含寡聚物的肝脏特异新糖结合物的摄取，寡聚物包括核酸酶抗性主链。
Hep G2 2.2.15细胞是用乙肝病毒稳定转染的肝细胞瘤细胞。通过结合方法2合成和标记实施例7中所引用2’OMe po/mp和ps，它们的细胞吸收用实施例4和5中所述方法分析。结果非常类似于实施例7中所述细胞吸收实验。含ps寡聚物的新糖结合物表现出线性和迅速的摄取，在24小时达到20皮摩/106细胞，而相应未结合ps-寡聚物联合较差，在24小时小于1.0皮摩/106细胞(图10)。以类似方式，Hep G2 2.2.15细胞以迅速和线性速度吸收含2’OMe po/mp寡聚物的新糖结合物到28.52皮摩/106细胞程度，24小时培养后吸收少于1.0皮摩/106细胞的相应未结合寡聚物。细胞培养基中的新糖结合物和未结合寡聚物稳定性通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确定。37℃培养至96小时都没有检测到降解产物。
前述用32P-标记寡核苷酸甲基膦酸酯结合物的Hep G2细胞吸收实验扩展到检测含新糖肽5的新糖结合物与具其它核酸酶抗性主链的寡聚物的联合，最显著的是ps和2’OMe po/mp。含硫代磷酸酯寡聚物的新糖结合物、YEE(ahGalNAc)3-SMCC-ps 5’GTTCTCCATGTTCAG3’(NG-1)用结合方法2标记，表现出的线性增长在24小时达到17.25皮摩/106细胞程度。相反，Hep G2细胞以降低的速度吸收相应未结合寡聚物ps 5’GTTCTCCATGTTCAG3’，在24小时达到1.01皮摩/106细胞。以类似方式，含2’OMe交替po/mp寡聚物的新糖结合物(YEE(ahGalNAc)3-SMCC-2’OMe 5’AG pUC pAG pUC pAG pUC pAG pU3’)表现出线性增长，在24小时达到28.52皮摩/106细胞程度(图9；标6)。相应未结合寡聚物(2’OMe5’AG pUC pAG pUC pAG pUC pAG pU3’)表现出小于1皮摩/106细胞的最小吸收。这些结果表明独特配体-接头复合体的传递效用产生将此系统扩展至传递其它治疗剂的平台。
Hep G2细胞中观察到的细胞吸收增加也在Hep G2 2.2.15细胞中明显(图10a)。含ps寡聚物的新糖结合物表现出线性和迅速的摄取，在24小时达到20皮摩/106细胞，而相应未结合ps-寡聚物联合较差，在24小时小于1.0皮摩/106细胞(图10)。以类似方式，Hep G2 2.2.15细胞以迅速和线性速度吸收含2’OMe po/mp寡聚物的新糖结合物到28.97皮摩/106程度(图10b；表7)，24小时培养后吸收少于1皮摩/106细胞的相应未结合寡聚物。研究者用其它肝脏特异配体观察到类似结果且得出用HBV稳定转染不改变这些细胞中受体活性的结论(Wands等，1997，同上)。然而证明这些传递系统仅传递带电sa-寡聚物。此报导中所用肝脏特异配体显示有提高的效用，它可以类似有效程度增加细胞吸收无电荷ONMP’s、带电sa-寡聚物和一半带电的2’OMe ONMP/磷酸二酯交替寡聚物。
表6-培养中Hep G2 2.2.15细胞对结合YEE(ahGalNAc)3-SMCC-AET-2’O-Me
        5’AGpUCpAGpUCpAGpUCpAGpU3’(1d)和EDA-2’O-Me-
      5’AGpUCpAGpUCpAGpUCpAGpU3’(1e)的摄取(皮摩/106细胞)
寡聚物  1小时  2小时  3小时  24小时
1d  3.63  7.71  14.16  28.52
1e  0.277  0.305  0.400  0.450
表7-培养中Hep G2 2.2.15细胞对YEE(ahGalNAc)3-SMCC-S(CH2)6-ps-2’O-Me-5’AGpUCpAGpUCpAGpUCpAGpU3’-UMdT*3’-3’(dT-T)-32P-EDA(1c)(皮摩/106细胞)
寡聚物 4小时 8小时 12小时 16小时 24小时
1c  9.44 18.60 22.05 24.93 28.97
                      整体动物分布和药物动力学
实施例9
此例子阐述了用32P-标记的A-L-P结合物(10)作为例子的整体动物实验中所用材料和方法。
材料：Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水pH7.2购自Meditech(Stefling，VA)。可溶的组织增溶剂购自Life Technologies(Grand Island，NY)。细胞闪烁流体购自(ICNCostaMesa，CA)。闪烁小瓶购自Kimble Glass(Vineland，NJ)。无水乙醚购自J.T.Baker，Sanford，ME。CD-1雄性小鼠(22-35克体重)获得自Charles River(Wilmington，MA)。Centricon过滤器(30,000MWC)获得自(Millipore，Bedford，MA)。组织样品用Polytron匀浆器PCU2-110型(Brinkman Inst.，Westbury，NY)匀浆化。
方法：简言之，亲代寡脱氧核苷甲基膦酸酯(寡核苷酸甲基膦酸酯)、UmpT7用[32P]-ATP和ATP标记5’-末端以产生有300μCi/14nmol特异活性的p*UmpT7(*指示放射性核素的位置)。5’磷酸在1-甲基咪唑和水可溶碳二亚胺存在时用胱胺修饰。所得二硫化物用过量二硫苏糖醇还原并用异生物功能交联剂SMCC结合配体YEE(ahGalNAc)3。结合物10即YEE(ahGalNAc)3-SMCC-AET-pUmpT7通过凝胶电泳纯化，从胶提取并用SepPak柱体脱盐。确定纯结合物的酶和化学特征。部分结合物用N-乙酰氨基葡糖酰胺酶处理以完全去除GalNAc残基来产生11即[YEE(ah)3]-SMCC-AET-pUmpT7(Trubestskoy等，(1992)，Bioconjugate Chem.，3：323-327)。10和11通过PAGE分析都认为＞99％纯度。在制备整体动物生物分布和药物动力学中，含结合物的溶液置于无菌试验管并在无菌条件下冻干。
结合物10和11在无菌水中复蒸馏。体重22到35g的雄性CD-1小鼠(CharlesRiver)接受经静脉末端的单次注射7-30皮摩尔的[32P]-YEE(ahGalNAc)3-SMCC-AET-pUmpT7(10)或7皮摩的[32P]-[YEE(ah)3]SMCC-AET-pUmpT7(11)，它们包含在0.2mL盐水中。小鼠在15、30和60分钟以及2、4、6和24小时通过颈脱臼杀死。收集血液、肝脏、肾、脾、肌肉、上和下胃肠道及粪并称重。称重来自这些器官和组织的代表样品并置于玻璃小瓶。为收集尿(注射后2小时)，在短暂乙醚麻醉下结扎小鼠的外尿道，杀死后取出膀胱并置于玻璃小瓶。将Solvables(NEN；1mL)加入各样品。样品随后置于玻片温热装置上以过夜消化并在第二天早上取出冷却。消化样品用3到7滴H2O2(30％w/v)脱色，加入10mL Formula989(NEN)闪烁混合物。放射性量通过闪烁计数确定(Packard 1900 TR；＜3％误差)。注射剂量的等分样品和样品一起计数以计算百分比剂量每器官或克组织。
体重22到35g的雄性CD-1小鼠接受经静脉末端的单次注射40皮摩的[32P]-YEE(ahGalNAc)3-SMCC-AET-pUmpT7(10)。动物在15、60和120分钟后杀死。如前收集肝脏和膀胱，置于塑料小瓶且立即冷冻于-80℃。肝脏样品解冻到0℃并称重(平均质量0.25g)。组织在4体积乙腈/水(1∶1)中匀浆化(Polytron PCU-2-110组织匀浆器)。组织碎片通过离心(10,000g，20分钟，0℃；Sorval RC-5B型冷却超速离心机)去除。取出上清且重复提取过程。通过比较脱色匀浆和上清的等分样品，来自肝脏样品放射性的一般回收确定为90％。部分上清通过Centricon过滤器(30,000MWC；20分钟，0℃，10,000g；Hermal Z 360K冷却微离心机)过滤并冻干。剩余物在制备中复蒸馏于10mL甲酰胺加样缓冲液(90％甲酰胺、10％1×TBE、0.2％溴酚蓝和0.2％二甲苯蓝)中用于通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE；15％，20×20×0.75cm，2V/cm，45分钟)分析。尿收集自解冻到0℃的膀胱，用0℃乙醇(1∶2v/v)脱蛋白质30分钟。沉淀的蛋白质通过离心(16,000g，20分钟，0℃)去除。通过比较上清和蛋白质沉淀，放射性回收估计为90％。部分上清冻干，再溶解于甲酰胺加样缓冲液中并通过PAGE(15％，20×20×0.75cm，2V/cm，45分钟)分析。在不同反应中用50mM柠檬酸钠pH5.0中的N-乙酰-葡糖酰胺酶、含200mM KCl的10mM Tris(HCl pH8.0中的胰凝乳蛋白酶和0.1N HCl 37℃培养全长结合物1030分钟来产生标准。
细胞(约105)在含1μM[32P]-标记10的培养基中培养2、4、8、16和24小时，用PBS(2x)洗，通过硅油沉淀并裂解(0.5％NP 40、100mM氯化钠、14mM Tris-HClpH7.5和30％CAN)。裂解物用50％水合乙腈(v/v)提取两次。提取物冻干，再溶解于甲酰胺加样缓冲液中并通过PAGE(15％，2V/cm，30分钟)分析。
实施例10
此例子阐述的整体动物实验用于试验传递载体特异传送合成寡核苷酸甲基膦酸酯到小鼠肝脏的能力，载体含脱唾液酸糖蛋白配体、YEE(ahGalNAe)3且用32P放射性标记(图11和12)。
为了比较，也合成和测试缺乏三个末端GalNAc残基的结合物。此无糖结合物用作小鼠中配体(GalNAc)-特异吸收研究的对照。
为研究体内结合物10的组织和器官分布，如上所述小鼠经静脉末端注射放射性标记的结合物且各器官相联放射性的量通过闪烁计数确定。表8显示结合物与肝脏相联程度最大，注射后15分钟值达到69.9％的注射剂量。注射后15分钟其它组织中测得总放射性的降序排列是：肌肉＞肾＞血液＞脾。尿的放射性峰值是28％的注射剂量且在30分钟后达到。肾和血液相联的放射性量随着时间减少。值得注意的是，尽管预期肝脏中产生的结合物的代谢物会通过胆汁分泌沉淀在胃肠道，少量放射性与胆囊、上和下胃肠道和粪相联。当小鼠注射低剂量(7皮摩)新糖结合物10时，观察到类似结果(图11；表9)。
表10显示缺乏三个末端GalNAc残基的结合物11分布顺序为：肌肉＞血液＞肾＞肝脏＞脾。尽管与血液和肾相联，肌肉和肝脏放射性的量保持恒定，且在24小时的研究中降低。注射后30分钟尿中放射性的峰值为39.9％(图12)。
实施例11
此例子阐述的整体动物实验用于试验发明的传递载体特异传送合成、核酸酶抗性硫代磷酸酯寡聚物到小鼠肝脏的能力，载体含脱唾液酸糖蛋白配体、YEE(ahGalNAc)3且用35S放射性标记(图13)。
雄性CD-1小鼠如实施例9所述注射30皮摩的新糖结合物YEE(ahGalNAc)3-SMCC-ps-(TTTATAAGGGTCGATGTCCAT)-{35S}(psA)n，新糖结合物用结合方法2中所述3’-末端标记方法标记。为了比较，也合成缺乏三个末端GalNAc残基的结合物YEE(ah)3-SMCC-ps-(TTTATAAGGGTCGATGTCCAT)-(psA)n {35S}。此无糖结合物用作小鼠中配体(GalNAc)-特异吸收研究的对照。实验结果非常类似于实施例10中所观察到的。含末端糖基的结合物与肝脏相联程度最大，注射后15分钟值达到46.19％的注射剂量。注射后15分钟其它组织中测得总放射性的降序排列是：肌肉＞血液＞肾＞脾。尿的放射性峰值是4.51％的注射剂量且在30分钟后达到。肾和血液相联的放射性量随着时间减少。
缺乏三个末端GalNAc残基的结合物以降低的速度被肝脏吸收，30分钟时达到23.67％注射剂量的峰值。此结合物4小时内从血液和尿中清除。
实施例12
此例子阐述了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结合物10的代谢物，10分离自小鼠肝脏和Hep G2细胞。
图14显示用Hep G2细胞培养2到24小时后PAGE分析结合物10代谢物的结果。根据它们相对对照反应的电泳迁移率鉴定了三种代谢物(图14；标为I-III)。I型似乎由四种化学上不同的种类组成，其中I和II在所有时间点占优势。I和II的分布在最早时间点约为1∶1，在较长培养时间转变成II占优势。此类型的第三种代谢物也在各时间点观察到，它与胰凝乳蛋白酶消化I产生的物质共移动。此种类的相对量保持恒定至最终的时间点(24小时)，在最终时间点只有少量剩余。在所有时间点除了最后观察到第四种未鉴定种类，迁移率稍低于3。所有类型I的代谢物量到最终时间点逐渐减少。类型II的代谢物由放射性标记种类组成，此种类与类型I相比电泳迁移率高许多。观察到至少五条带，然而不是所有都存在于各时间点。例如，最高和最低迁移率位置的带增加到16小时时间点，接着在24小时减少。在占优势种类中观察到相同表现。此带的最大强度出现在8小时，接着到24小时逐步降低。如用类型I的代谢物所观察到的，所有类型II的代谢物量在24小时时间点减少。类型II的代谢物在胶基质中很稳定，大部分保持在聚丙烯酰胺胶的孔中。此带的强度随着时间增加，在24小时到达最大值。
表8.以30pmol剂量水平静脉内注射的小鼠中[32P]-[YEE(ahGalNAc)3]-SMCC-AET-pUmp T 7的动力学
                                                 百分比注射剂量每器官注射后时间(分钟)
器官 15  30  60  120  240  360  1440
血液a 2.79±0.18  2.25±0.48  1.42±0.38  0.90±0.26  1.09±0.16  1.23+0.30  0.61±0.11
肝脏a 69.9±9.9  41.8±9.3  25.2±2.4  14.2+2.2  10.6±4.2  8.5±0.6  3.2±1.4
脾a 0.08±0.04  0.08±0.03  0.2±0.01  0.17±0.04  0.24±0.02  0.16±0.08  0.25±0.04
肾a 3.00±1.26  2.12±0.27  1.58±0.15  1.26±0.19  1.25±0.21  1.80±0.70  0.92±0.19
肌肉a 7.83±1.49  8.42±1.51  8.46±2.32  8.76±0.92  13.0±3.9  1 7.2±4.6  13.9±1.3
上G.I. 3.63±1.85  12.72±9.41  6.28±1.74  3.73±2.80  3.19±0.78  3.82±0.87  2.01+0.28
下G.I. 0.24±0.05  0.33±0.20  0.38±0.14  0.34+0.05  0.63±0.26  0.50±0.22  0.48±0.09
胆囊 0.27±0.23  0.62±0.14  0.7b  0.4c  0.31c  0.17c  NA
粪b 0.01±0.01  0.05±0.05  0.05±0.03  0.27±0.26  1.40±1.11  0.47±0.23  0.55±0.41
a值报导为三个动物中平均百分比注射剂量每器官±一个标准偏差。约0.5微Ci(30pmol)静脉内进入各小鼠。各器官的质量单独确定并用于从注射的结合物百分比剂量每克组织中测定百分比剂量每器官。各器官或组织质量的典型值为：血液＝0.07×体重；肝脏＝1.6+0.21g；脾＝0.17+0.05g；肾＝0.6+0.1g；肌肉＝1.4×体重。平均体重是32.4±2.0g(标准偏差；n＝21)。尿中放射性的峰值为27.7±20.2％的的注射剂量。大标准偏差反映了尿生成和各动物间收集完全中的变化。
b值来自单次测定。
c值是两个独立测定的平均值。
表9.静脉内注射[32P]-[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmp T 7后各器官积聚的百分比注射剂量
                                   百分比注射剂量每器官注射后时间(分钟)
    器官   15   30   60   120   1440
    血液a   1.71±0.32   1.55±0.23   0.87±0.12   1.00±0.37   0.44±0.13
    肝脏a   42.4±8.0   28.9±0.97   21.7±3.0   18.6±6.5   2.89±0.45
    脾a   0.04±0.02   0.08±0.01   0.16±0.03   0.23±0.04   0.30±0.11
    肾a   0.93±0.5   1.17±0.11   1.18±0.06   1.15±0.13   0.68±0.13
    肌肉a   9.95±1.04   8.37±1.26   8.85±1.30   8.62±0.97   8.63±1.16
a值报导为三个动物中平均百分比注射剂量每器官±一个标准偏差。约0.1微Ci(7pmol)静脉内进入各小鼠。下列值用于从百分比剂量每克组织中测定百分比剂量每器官；血液质量＝0.07×体重；肝脏质量＝1.14g；脾质量＝0.124g；肾＝0.4g；肌肉质量＝0.4×体重。平均体重是23.7±1.2g(标准偏差；n＝15)。30分钟时尿中放射性的峰值为17.1±10.2％的注射剂量。大标准偏差反映了尿生成和各动物间收集完全中的变化。
表10.静脉内注射后[32P]-[YEE(ah)3]-SMCC-AET-pUmp T 7的动力学
                                 百分比注射剂量每器官注射后时间(分钟)
    器官   15   30   60   120     1440
    血液a   4.82±0.27   2.35±0.33   0.91±0.43   ND     ND
    肝脏a   1.06±0.21   1.14±0.32   1.65±0.91   1.38±0.83     ND
    脾a   0.07±0.01   0.07±0.01   0.12±0.07   0.08±0.08     ND
    肾a   2.46±0.42   1.82±0.03   0.88±0.27   0.73±0.30     ND
    肌肉a   12.9±2.1   13.8±2.4   25.8±18.6   25.3c     ND
a值报导为三个动物的平均值±一个标准偏差。约0.1微Ci(7pmol)结合物静脉内进入各小鼠。下列值用于从百分比剂量每克组织中测定百分比剂量每器官；血液质量＝0.07×体重；肝脏质量＝1.14g；脾质量＝0.124g；肾＝0.4g；肌肉质量＝0.4×体重。平均体重是23.7±1.2g(标准偏差；n＝15)。30分钟时尿中放射性的峰值为36.9+13.5％的注射剂量。大标准偏差反映了尿生成和各动物间收集完全中的变化。b值是两个独立测定的平均值。
完整小鼠肝脏中10的代谢命运分析以类似方式进行。图15显示获得自小鼠肝脏样品的肝脏匀浆提取物的PAGE分析结果，小鼠用[32P]-标记的结合物10注射。
注射后15分钟，剩余显著量的完整结合物10(图14；类型I代谢物)。胶的分辨率不足以分辨两种类型。此样品中放射性标记种类的剩余物移动显著快于不与任何对照共移动的I和II。这些代谢物有更宽范围的迁移率且最慢的移动显著低于用Hep G2细胞鉴定的类型II代谢物(类型II’)。在稍后时间点几乎所有完整的10(图16)消失，其中类型II代谢物量增加。
图17显示静脉内施用放射性标记结合物10后小鼠尿中观察到的代谢物模式。类型I的代谢物是唯一检测到的放射性标记种类。结合物大部分完整，有少但显著量的物质转变成两种不与任何对照共移动的类型。各种类的相对量在实验进程中保持恒定。在小鼠尿中没有观察到类型II、II’、III代谢物。
本文所述证据表明化学确定和均一的[32P]-标记结合物10能以配体和细胞类型都特异的方式穿过Hep G2细胞的细胞膜。这些研究的逻辑延伸用于确定体内I的组织分布并比较10体外和体内的代谢命运，比较此数据和用缺乏三个末端GalNAc残基的结合物11获得的数据。
体内组织分布数据确认通过培养人细胞获得的结果。高度选择性靶向寡脱氧核苷甲基膦酸酯到肝脏(70±10％的i.d.)通过共价附着寡聚物和脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP)配体YEE(ah)3来有效获得。确实在整体组织测量中，肝脏中结合物浓度比血液中高25倍且比肌肉中约高10倍(图11)。由于脾、肺和肾也聚集放射性标记的寡脱氧核苷酸，复合体对肝脏的优先性很小(如注射后5分钟各组织分布分别为约6、4、2和2％的注射剂量每克；(Lu等，1994，同上)。进一步的兴趣是比较我们的结果和Eichler等(1992，同上)报导的结果，其中肝脏吸收的生物分布和速度在鼠中确定用于hypolipidaemic剂ansamycin，单独和共价连接到另一个三-触角ASGP配体N-[tris(β-D-吡喃型半乳糖苷(galactopyranosylosyl)甲基)-甲基]-N-d-(乙酰)甘氨酰胺(tris-乙酸半乳糖(galacetate))。作者报导游离药物和结合物的肝脏吸收大致相同，使他们得出结论三触角ASGP配体不提高大鼠肝脏吸收药物。此结果与我们的发现相反，我们发现小鼠肝细胞的摄取通过共价附着配体YEE(ahGalNAc)3大为促进。
作为对照，小鼠注射缺乏三个末端GalNAc残基的结合物11，因此不能由ASGP配体识别。如所预期，肝脏中检测到少量放射性且大许多的放射性量与其它组织相联(图12)。此结果扩展了我们前面的发现，放射性标记寡核苷酸甲基膦酸酯靶向肝细胞是其共价附着配体的结果。
氚标记12聚体(d-Tp*TCCTCCTGCGG)除了最后的5’末端磷酸二酯键都由甲基膦酸酯主链组成，此12聚体在小鼠中以单剂量静脉内注射。药物施用后器官在2、5、10、30、60和120分钟收集。数据显示放射性不分布在肝脏、肺、肌肉或脾中，且从血浆中迅速消失进入肾和尿。HPLC研究显示完整12聚体通过酶裂解末端核苷代谢成11聚体且静脉内注射后都迅速消除进入尿。因此，本文所报导结果与前面所得结果很一致，证明GalNAc末端在指导寡聚物结合物吸收入肝脏中的重要性。
上述结果扩展到考虑传递带电、核酸酶抗性硫代磷酸酯寡聚物到CD-1小鼠的肝脏。结果证明含末端糖残基的结合物以两倍高于缺乏末端GalNAc残基结合物的水平传递。与ONMP’s相比肝脏中高浓度含结合物的硫代磷酸酯是硫代磷酸酯寡聚物本身的特征且在文献中注释，结合物缺乏末端GalNAc残基。然而结合物传递这些寡聚物到肝脏增加阐明了此方法用于特异传递不同电荷构象的生物分子的效用，结合物含末端GalNAc残基。
为了解结合物10在体外和体内的代谢命运，我们通过PAGE分析检测了获得自Hep G2细胞以及小鼠肝脏和尿的提取物，细胞生长在培养物中。我们注意到三种代谢物(类型I-III)在Hep G2细胞和小鼠肝脏中产生，在小鼠肝脏中类型I代谢物分离自小鼠尿。由于配体降解产生类型I代谢物。两种酶反应用于模拟生成这些种类：N-乙酰-葡糖酰胺酶和胰凝乳蛋白酶。前种处理产生移动稍快于1的2，这是由于失去三个末端GalNAe残基导致质量稍为减少。后一种处理导致迁移率显著提高，这是由于失去大部分配体和从-1到-2总电荷的增加(图16)。这两种模式反应产生有修饰配体的化合物，保持共价连接于完整的放射性标记寡核苷酸甲基膦酸酯。因此合理推断移动到相同胶区域的其它种类来自于配体降解而不是来自I其它不稳定位点的键裂解。例如，水解单个氨基己基侧链酰胺键产生质量在2和3之间的5(图16)且导致从-1到-2负电荷的增加。在此例子中，通过PAGE分析预期得到迁移率在2和3之间的种类。类型II代谢物移动显著快于鉴定为类型I的。我们推测它们的产生是由于位于寡核苷酸甲基膦酸酯5’-末端单个磷酸二酯键的未预期水解。我们预见此位点在通过核酸内切酶活性裂解时稳定(Sproat等，1989，同上)，这是在用蛇毒磷酸二酯酶进行的模式反应基础上，其中没有观察到裂解。此位点的裂解释放来自10剩余物的寡核苷酸甲基膦酸酯的末端七个核苷，最重要的是生成携带单个核苷的相对低分子量种类，核苷含放射性标记磷酸(图16；15)配体的进一步降解产生鉴定为类型II代谢物的多种类型。仅在Hep G2细胞中观察到的类型III代谢物是含放射性磷的高分子量种类，在胶中移动距离短。放射性磷酸从I中释放和它随后结合到高分子量细胞结构(核酸或蛋白质)引起了这条带。有文献记载内体区室随着成熟而酸化，与溶酶体融合前pH低至5.5(Schwartz，1985，同上)。此外，结合寡核苷酸甲基膦酸酯到配体的氨基磷酸酯键在酸性条件下倾向水解以产生13(图16)。为测试内体区室酸化导致P-N键水解的可能性，I在50mM柠檬酸钠中pH5.5和6.037℃培养。我们观察到I在pH6稳定但24小时后在pH5.5大量水解成13(＞50％)且通过PAGE分析确定水解在氨基磷酸酯P-N键特异发生(数据未列出)。因此合理推断结合放射性磷酸到细胞结构是通过水解P-N键发生，水解由于含I的内体区室酸化和通过磷酸酶活性释放末端磷酸到细胞周围环境。
在Hep G2细胞提取物中观察到的代谢物分布包括各种代谢物。在早期时间点，大部分放射性包含在类型1种类中，主要是I和II。在较后时间点代谢物分布从类型I转变成类型II和III，其中在取样的最后时间点带类型III代谢物的大部分放射性磷残基指示实验进程中发生大量P-N键水解。显然I一旦吸收到Hep G2细胞会被大幅代谢，表明胞内传递反义寡核苷酸甲基膦酸酯或其它试剂通过此方法变得可行。
由于仅N-P键上的磷标记32P，不可能测定寡核苷酸类似物的代谢物命运。因为寡核苷酸的广泛代谢会不利地影响与胞内互补核酸序列特异反应的能力，将来需要进行的研究使用在其它位置标记的寡核苷酸序列。
来自小鼠肝脏和尿提取物的PAGE分析结果证明小鼠肝脏中代谢物生成在两方面不同于用Hep G2细胞观察到的。首先，产生类型II’代谢物的10的消化在肝脏中显著加快，仅1小时后大部分放射性发现于这些种类中。第二，肝脏中类型II’代谢物的迁移率和分布不同于培养细胞中的类型II代谢物，表明小鼠肝脏和HepG2细胞遇到的酶活性不同。在2小时进程中少量或没有类型III代谢物产生，此结果与来自Hep G2细胞的结果一致。与小鼠肝脏中1的广泛降解相反，尿中代谢物模式复杂性更小且仅由类型I代谢物组成。肝脏和尿观察到的代谢物不同模式说明结合物传递入肝脏细胞且不仅位于器官的胞间隙。
化学确定、结构均一的新糖肽-寡脱氧核苷甲基膦酸酯结合物10的体内分布和代谢证明此结合物的传递高度有效，注射后15分钟肝脏中达到约百分之70(70％)的注射剂量水平。与配体迅速和广泛降解一起，这些结果表明此用于传递反义试剂甲基膦酸酯或其它类似物以及另外治疗上有用试剂的方法非常有用。此外，这些结果证明诊断成像过程的可能性，过程利用与反义部分核酸特异性偶联的配体组织特异性，提供了用迄今未实现的特异性在体内测定细胞功能区域异常性的方法。
                    抗-HBV新糖结合物的生物功效
实施例13
此例子阐述了评估抗-HBV新糖结合物的生物功效中所用材料和方法。
材料：Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水pH7.2、胰蛋白酶/EDTA(0.5％胰蛋白酶：0.53mm EDTA)、RPMI和FCS购自Mediatech，(Sterling，VA)。G418和缺口翻译试剂盒购自Life Technologies，(Grand Islang，NY)。Ausyme单克隆HBsAG检测试剂盒购自Abbott实验室(Napierville，IL)。HBsAG标准获得自Chemicon(Temacia，CA)，32P dCTP获得自Amersham，(Piscataway，NJ)且Probequant微旋转柱购自PharmaciaBiotech，(Piscataway，NJ)。48孔组织培养处理平板购自Costar(Cambridge，MA)、1.5mL微离心管来自Sarstadt(Newton，NC)、GeneScreen尼龙膜来自NEN(Boston，MA)、BioTek EIA平板读出器和-492nm波长过滤器来自BioTek，(Burlington，VT)且FujixBas 1000磷图像仪(phosphoimager)和成象平板来自Fujix Medical Systems，(Stamford，CN)。Hep G2 2.2.15细胞是G.Wu博士的馈赠并维持在添加4％FCS的RPMI培养基上。细胞用Coulter计数器-模型ZBI(Coulter Electronics，Hialeah，FL)计数。HBV特异探针(AM-12的3.2kb片断)是Georgetown University的Brent Korba博士的馈赠。
方法：本研究中所用三种治疗新糖结合物的合成通过结合下列前面显示体外抑制HBV复制(Korba和Gerin，1995，同上)的ps-寡聚物和肝脏特异配体YEE(ah-GalNAc)3：(1)5’GTTCTCCATGTTCAG3’，靶向表面抗原基因(sa-基因)的翻译起始位置，(2)5’TTTATAAGGGTCGATGTCCAT3’，靶向核心基因(c-基因)的翻译起始位置且与HBV多腺苷酸化位点重叠，(3)5’AAAGCCACCCAAGGCA3’，靶向HBV基因组包壳位置(e-位置)的未配对茎环。用于合成本研究寡聚物的碱基序列是HBV亚类ayw(Galibert等，(1979)，Nature(London)，281：646-650)，通过HepG2 2.2.15体外表达相同亚类(Acs等，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.，84：4641-4644。此外，制备两种与HBV基因不互补的其它ps-寡聚物NG4：5’TGAGCTATGCACATTCAGATTT3’和NG5：5’TCCAATTAGATCAG3’作为对照以试验新糖结合物的非特异效果。
寡核苷酸的抗病毒活性用铺满培养的HepG2 2.2.15细胞评估。HBV转染的人肝细胞瘤细胞系HepG2 2.2.15维持在RPMI+含4mM谷氨酰胺的4％胎牛血清上(并在37℃，5％湿润大气中的CO2培养。2-3次/周重流入培养物。细胞用G418选择并每2-3次传代再选择。细胞在RPMI+含4mM谷氨酰胺的2％胎牛血清中以3-5×104个细胞/孔的密度接种到48孔板，生长3-4天直到达到铺满。在此点，处理用含上述ps-寡聚物的新糖结合物或相应未结合寡聚物单独在1.0μM到20μM浓度范围来起始。用ZBI型Coulter定量细胞数。由于显示HBV复制仅以此密度在HepG2 2.2.15细胞中到达稳定、最大水平，使用铺满培养(Sells等，(1988)，J.Virology，62：836-844)。所有处理重复三次进行并持续96小时。抗病毒效果如下详述分析并与未处理的对照培养物相比较以确定抑制程度。值报导为6次试验的平均值±一个标准偏差。
抗病毒处理对HepG2 2.2.15细胞的HBV表面抗原表达(HBsAG)的效果用Ausyme单克隆试剂盒通过半定量EIA分析(Muller等，(1992)，J.Infect.Dis.，62：929-933)确定(稀释试验样品从而值在分析的线性动态范围内)。用HBsAG(Chemicon，Temacia，CA)的标准曲线包括在各组分析中。值在Bio-Tek EIA平板读出器上以492nm的固定波长定量。
胞外HBV DNA用修改的前述过程(Korba和Milman，(1991)，Antiviral Res.，15：217-228；Korba和Gerin，(1992)，同上)通过定量点印迹杂交分析。离心实验和对照培养基样品并用相同体积的1N NaOH-10X SSC处理，室温培养30分钟。样品随后通过点印迹仪器直接用于预浸透(0.4 Tris-HCl；pH7.5)的尼龙膜。膜用0.5MNaCl-0.5M Tris-HCl(pH7.5)中和，2X SSC冲洗并在80℃烘2小时。
纯化的3.2Kb Eco R1 HBV片断(Kobra等，1989)用缺口翻译试剂盒标记[32P]dCTP且用Probequant微旋转柱纯化。印记在溶液中42℃预杂交3-4小时，溶液含6x SSC、5x Denhardts溶液、50％甲酰胺、0.5％SDS和125μg/ml变性、剪切的鲑精DNA。杂交在相同组成的溶液中进行18-22小时，溶液加入10％硫酸葡聚糖。点在42℃连续洗且光密度测定用Fujix Bas 1000磷图像仪定量。病毒粒子DNA水平通过比较这些测量和用于各点的已知量的HBV DNA标准来确定。
实施例14
此例子阐述了体外在HepG2 2.2.15中靶向HBV复制关键元件的肝脏特异新糖结合物的生物功效。
为评估新糖结合物对HBV基因表达的效果，铺满单层的HepG2 2.2.15细胞在存在单剂量新糖结合物或相应寡聚物时培养96h，新糖结合物或寡聚物单独靶向表面抗原基因、核心基因或包壳信号。分析了这些处理对培养基中HbsAG和HBV病毒粒子DNA积聚的效果。结合特异性通过用含随机ps-寡聚物的新糖结合物或单独随机ps-寡聚物处理细胞来确定。
抗病毒处理对细胞培养基中HBsAG积聚的效果可变化，这取决于靶向的基因(图18-A.抗S；B.抗C；C.抗E-实心柱＝未处理对照；斑点柱＝新糖结合物；交叉线柱＝未结合寡聚物)。用靶向HBV表面抗原基因的NG1处理使培养基中HbsAG积聚降低，在20μM浓度时从1163ng/106细胞到342ng/106降低70％且在10μM浓度时降低47％到662ng/106细胞。相反，相应未结合寡聚物在20μM时使HBsAG表达减少43％到500ng/106细胞且在10μM减少24％到885ng/106细胞。新糖结合物或寡居物单独在10μM浓度以下对HBsAG表达没有任何显著效果。也检测了对HBV复制靶向抗核心基因的新糖结合物的效果。用NG2处理导致HBsAG适度减少，从1061ng/106到699.49ng/106细胞，相对未处理对照抑制35％。在更低浓度没有观察到显著抑制。用靶向c-基因的未结合寡聚物处理没有导致显著抑制HbsAg。用靶向E-位置上部茎环结构的NG3处理Hpe G2.2.2.15细胞在任何浓度没有导致HBsAG显著下降。用相应未结合寡聚物观察到类似结果。
更惊人的是抗病毒处理对HBV病毒粒子DNA在细胞培养基中积聚的效果(图19-A.抗S；B.抗C；C.抗E-实心柱＝未处理对照；斑点柱＝新糖结合物；交叉线柱＝未结合寡聚物)。在此情况中各新糖结合物抑制病毒粒子DNA积聚到显著高于相应未结合寡聚物的程度。在所有情况中观察到剂量反应。
用NG3处理对培养基中HBV病毒粒子DNA减少有最大的效果。在下降到1的所有浓度观察到相较未处理对照超过80％的减少。证明更低浓度NG3效率更低直到在0.1μM没有观察到显著抑制。用相应未结合寡聚物分别在20和10μM浓度使减少DNA＜80％。在更低浓度病毒粒子DNA增加直到未处理对照水平达到1-2μM浓度间。
靶向核心基因的NG-2显著减少病毒粒子DNA积聚，但程度小于NG-3。在此情况中DNA减少超过80％，下降到5μM浓度。相应未结合寡聚物在20μM浓度也使病毒粒子DNA生成减少超过80％。然而其后证明新糖结合物在所有浓度约4倍更有效，直到未处理对照水平达到1μM。
用NG-1处理也导致细胞培养基中病毒粒子DNA显著减少。水平与未处理对照相比减少超过70％到10μM浓度。在更低处理浓度，病毒粒子DNA水平增加直到对照水平达到1-2μM间。再一次，未结合寡聚物抑制病毒粒子DNA水平到与20μM浓度类似的程度。然而，证明新糖结合物在所有下降到2μM的浓度约4-5倍更有效。
为确认上述处理的特异性，合成与HBV基因组任何部分不互补的随机ps-寡聚物(NG4和NG5)。用NG4和NG5在至30μM浓度处理寡聚物或新糖结合物形式对细胞培养基中HBsAG或病毒粒子DNA积聚没有显著效果(图20-A＝NG-4对HBs AG积聚的效果；B＝NG-5和相应寡聚物对HBs AG积聚的效果；C＝NG-4和相应寡聚物对HBV病毒粒子DNA积聚的效果；D＝NG-5相应寡聚物对HBV病毒粒子DNA积聚的效果。实心柱＝未处理对照；斑点柱＝新糖结合物；交叉线柱＝未结合寡聚物)。
实施例15
此例子阐述了细胞培养基中硫代磷酸酯新糖结合物的稳定性研究。
本研究所用新糖结合物和未结合硫代磷酸酯寡聚物的体外稳定性通过PAGE分析确定。新糖结合物NGI-5和它们未结合形式用RPMI+2％FCS在37C培养24、48和96小时。含2μl新糖结合物或未结合寡聚物的等分样品加入10μl胶加样缓冲液并在含7M尿素的2％聚丙烯酰胺胶上800V电泳20分钟。所得胶用Fuiix Bas1000磷图像仪(Fujix Medical Systems，(Stamford，CT)分析。所有新糖结合物和寡聚物在细胞培养基中保持到96小时。
实施例16
此例子阐述了硫代磷酸酯新糖结合物的毒性分析。
本研究所用各处理的毒性通过锥虫蓝排除确定。测量在用于抗病毒实验的培养条件下进行。在用于实验的任何浓度没有注意到显著毒性。处理阶段后，活细胞数量通过锥虫蓝排除显微确定。计数到了来自各孔至少200个细胞的最小值。所有确定在三倍孔上进行。
发明可以其它具体形式进行，而不离开其精神或本质特征。因此本实施方案在所有方面认为是描述而不是限制。因而要理解大量化合物可用本文所述方法合成。所有本文所述方法可以任何适当顺序进行，除非本文另有说明或与内容明显矛盾。专利、专利申请和其它本文所引用文献通过参考相同范围完全纳入，各文献单独且特别指出纳入参考文献并全部列于本文。
除非本文另有说明或与内容明显矛盾，描述发明内容中使用的术语“一”、“一个”和“这个”及类似指示涵盖单数和复数。除非本文另有说明，本文值范围的描述仅用作单独指范围内各不同值的简化方法，且各不同值纳入说明书，本文单独描述值。
使用本文所提供的任何和所有例子或示范语言(如“例如”)仅用于更好阐述发明且不限制发明的范围，除非另有权利要求。说明书中没有语言指示任何非权利要求要素为发明实践所必需。如申请法所允许，此发明包括附加权利要求书中所述主题物质的所有修饰和相当物。此外，上述要素所有可能变化的任意结合包括在发明中，除非本文另有说明或与内容明显矛盾。

Claims (26)

1.一种包括结构式A-L-P的均一结合物的构建物，其特征在于，
A代表特异结合肝受体的肝配体，从而促进结合物进入有此受体的细胞；
L代表双功能接头，它以区域特异方式共价连接A形成A-L；A-L以区域特异方式共价连接P形成A-L-P；
P代表结合肝病毒包壳序列的生物稳定寡聚物，其中P在至少一个特定生化键水解或还原后从结合物中释放，并在从结合物中释放时包含抗酶水解或生物降解的核苷酸间键合。
2.一种包括结构式A-L-P的均一结合物的构建物，其特征在于，
A代表特异结合肝受体的肝配体，从而促进结合物进入有此受体的细胞；
L代表双功能接头，它以区域特异方式共价连接A形成A-L；A-L以区域特异方式共价连接P形成A-L-P；
P代表结合肝病毒序列的生物稳定DNA寡聚物，其中P在至少一个特定生化键水解或还原后从结合物中释放，并在从结合物中释放时包含抗酶水解或生物降解的核苷酸间键合。
3.一种包括结构式A-L-P均一结合物的构建物，其特征在于，
A代表特异结合肝受体的肝配体，从而促进结合物进入有此受体的细胞；
L代表双功能接头，它以区域特异方式共价连接A形成A-L；A-L以区域特异方式共价连接P形成A-L-P；
P代表结合肝病毒序列的生物稳定寡聚物，其中P在至少一个特定生化键水解或还原后从结合物中释放，并包含一种或更多类型的选自磷酸二酯、硫代磷酸酯、2’-O-甲基核糖甲基膦酸酯、2’-O-甲基核糖硫代磷酸酯和2’-O-甲基核糖磷酸二酯的核苷酸间键合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的构建物，其特征在于，所述寡聚物是寡核苷酸、寡核苷酸类似物或寡核苷酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的构建物，其特征在于，所述病毒是肝炎病毒。
6.如权利要求1或3所述的构建物，其特征在于，所述寡聚物结合RNA前S1开放阅读框序列。
7.如权利要求2或3所述的构建物，其特征在于，所述构建物包括选自GTTCTCCATGTTCAG、TTTATAAGGGTCGATGTCCAT和AAAGCCACCCAAGGCA的序列。
8.如权利要求1-6中任一项所述的构建物，其特征在于，所述构建物包括序列AAAGCCACCCAAGGCA。
9.如权利要求1、2或4所述的构建物，其特征在于，所述寡聚物进一步包括脱氧核糖甲基膦酸酯核苷酸间键合。
10.如权利要求1、2或4所述的构建物，其特征在于，所述寡聚物包括脱氧核糖硫代磷酸酯核苷酸间键合。
11.如权利要求1-4中任一项所述的构建物，其特征在于，所述寡聚物包括磷酸二酯键。
12.如权利要求1、2或4所述的构建物，其特征在于，所述寡聚物包括脱氧核糖甲基膦酸酯/硫代磷酸酯核苷酸间键合的组合、脱氧核糖甲基膦酸酯/磷酸二酯核苷酸间键合的组合、脱氧核糖硫代磷酸酯/磷酸二酯核苷酸间键合的组合、2’-O-甲基核糖甲基膦酸酯核苷酸间键合、2’-O-甲基核糖硫代磷酸酯核苷酸间键合、2’-O-甲基核糖磷酸二酯核苷酸间键合、2’-O-甲基核糖甲基膦酸酯/2’-O-甲基核糖磷酸二酯核苷酸间键合的组合、2’-O-甲基核糖甲基膦酸酯/2’-O-甲基核糖硫代磷酸酯核苷酸间键合的组合或2’-O-甲基核糖硫代磷酸酯/2’-O-甲基核糖磷酸二酯核苷酸间键合的组合。
13.一种合成如权利要求4所述的结合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)形成A-L构建物；
b)纯化A-L构建物以使均一性大于95％并去除未反应的接头；
c)修饰寡核苷酸或寡核苷酸类似物P以形成硫醇-修饰的寡聚物；
d)在脱气条件下纯化硫醇-修饰的寡聚物以去除未反应的试剂和杂质；
e)在双成分结合反应中使A-L构建物在脱气条件下与硫醇-寡聚物反应；其中，反应可用过量的配体支架或硫醇-修饰寡聚物进行以形成A-L-P结合物；并纯化A-L-P结合物。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述A-L-P结合物通过大小排阻色谱法纯化。
15.一种放射性同位素标记如权利要求4所述的结合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)在固相合成中将三核苷示踪物单元5’-T-3’-ps-3’-T-ps-T-5’加入寡核苷酸或寡核苷酸类似物P的3’末端；
b)采用多核苷酸激酶(PNK)和含放射性标记的磷酸的2-氨基巯基乙醇(ATP)，通过酶的作用将示踪物单元磷酸化以将放射性标记的磷酸掺入A-L-P结合物；
c)化学修饰现在存在于带有氨基的A-L-P结合物中的放射性磷酸以防止它被细胞酶降解。
16.一种合成如权利要求4所述结合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)在固相合成中将带有末端二硫化物部分的双功能接头L加入寡核苷酸或寡核苷酸类似物P以形成二硫化物修饰的寡聚物；
b)纯化二硫化物修饰的寡聚物；
c)将二硫化物修饰寡聚物的二硫化物部分还原成硫醇基团以形成硫醇-修饰的寡聚物；
d)在脱气条件下纯化硫醇-修饰的寡聚物；
e)在脱气条件下使配体A与纯化的硫醇-寡聚物反应以形成A-L-P结合物；
f)纯化A-L-P结合物。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤b)-f)用大小排阻色谱法完成。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述A-L-P结合物用电泳纯化。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述A-L-P结合物用HPLC纯化。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述二硫化物修饰的寡聚物被纯化到大于95％的均一性以去除任何痕量的低分子量硫醇污染物。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述二硫化物修饰的寡聚物被纯化到大于99％的均一性。
22.一种放射性同位素标记如权利要求4所述的结合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)用固相合成法将二硫化物-末端接头加入P的5’-末端并将三核苷酸示踪物单元5’-T-3’-ps-3’-T-ps-T-5’加入P的3’末端；
b)纯化二硫化物-和包含示踪物的寡聚物；
c)将二硫化物功能基团还原成硫醇基团以形成硫醇-修饰的P；
d)用大小排阻色谱法在脱气条件下纯化硫醇-修饰的P以去除未反应试剂和杂质；
e)在脱气条件下将A-L构建物结合到纯化的硫醇-修饰的P上以形成A-L-P结合物；
f)用PNK和含放射性标记磷酸的ATP，通过酶的作用将示踪物单元磷酸化以将放射性标记的磷酸掺入A-L-P结合物；
g)化学修饰现在存在于带有氨基的A-L-P结合物中的放射性磷酸以防止它被细胞酶降解。
23.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1-12中任一项所述的构建物和至少一种药学上可接受赋形剂或载体。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述构建物是YEE(ahGalNAc)3-SMCC-5’AAAGCCACCCAAGGCA3’。
25.一种包含结构式A-L-P的均一结合物的构建物，其特征在于，
A代表特异结合肝受体的肝配体，从而促进结合物进入有此受体的细胞；
L代表双功能接头，它以区域特异方式共价连接A形成A-L；A-L以区域特异方式共价连接P形成A-L-P；
P代表结合肝病原体的生物稳定寡聚物，其中P在至少一个特定生化键水解或还原后从结合物中释放，并在从结合物中释放时包含抗酶水解或生物降解的核苷酸间键合。
26.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求25所述的构建物和至少一种药学上可接受赋形剂或载体。
CNA028163656A 2001-06-22 2002-06-21 增强细胞摄取生物分子的配体 Pending CN1555385A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/888,164 US20030119724A1 (en) 1995-11-22 2001-06-22 Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US09/888,164 2001-06-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1555385A true CN1555385A (zh) 2004-12-15

Family

ID=27735037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA028163656A Pending CN1555385A (zh) 2001-06-22 2002-06-21 增强细胞摄取生物分子的配体

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20030119724A1 (zh)
EP (1) EP1409548A4 (zh)
JP (1) JP2005518201A (zh)
CN (1) CN1555385A (zh)
AU (1) AU2002365420A1 (zh)
CA (1) CA2451650A1 (zh)
WO (1) WO2003067209A2 (zh)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) * 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US8895298B2 (en) * 2002-09-27 2014-11-25 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and uses thereof
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
US8137912B2 (en) 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
EP2029779A4 (en) 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
PT2562268T (pt) 2008-09-20 2017-03-29 Univ Leland Stanford Junior Diagnóstico não invasivo de aneuploidia fetal por sequenciação
EP2751270B1 (en) 2011-08-29 2018-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
AU2014259759B2 (en) 2013-05-01 2020-06-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods
KR20150017611A (ko) * 2013-08-07 2015-02-17 삼성전자주식회사 세포로부터 핵산을 분리하기 위한 방법
US9943604B2 (en) 2013-09-20 2018-04-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Targeted therapeutic nucleosides and their use
EP3137476B1 (en) 2014-04-28 2019-10-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
BR122020024443B1 (pt) 2014-05-01 2022-02-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc Composto e composição farmacêutica para modulação da expressão de angptl3
WO2015168532A2 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating pkk expression
RU2701645C2 (ru) 2014-05-01 2019-09-30 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии фактора комплемента в
MX2016014013A (es) 2014-05-01 2016-11-15 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para modular la expresion del receptor de la hormona del crecimiento.
US10570169B2 (en) 2014-05-22 2020-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
CN109477106B (zh) 2015-07-10 2022-10-04 Ionis制药公司 二酰基甘油酰基转移酶2(dgat2)的调节剂
US20180273577A1 (en) 2015-09-24 2018-09-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of kras expression
EP3371201A4 (en) 2015-11-06 2019-09-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds for use in therapy
MX2018005277A (es) 2015-11-06 2018-08-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Modular la expresion de apolipoproteina (a).
KR20230048446A (ko) 2016-03-07 2023-04-11 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 치료용 화합물을 위한 표적화 리간드
JP7197463B2 (ja) 2016-07-15 2022-12-27 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｓｍｎ２の調節のための化合物及び方法
KR20230115344A (ko) 2016-09-02 2023-08-02 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 표적화 리간드
KR20190065341A (ko) 2016-10-06 2019-06-11 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 올리고머 화합물들의 접합 방법
JOP20190215A1 (ar) 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
PE20211242A1 (es) 2018-01-15 2021-07-09 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion dnm2
AU2019212849B2 (en) * 2018-01-26 2024-02-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Radiolabelled oligonucleotides and process for their preparation
EP3752612A4 (en) 2018-02-12 2021-11-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED COMPOUNDS AND USES THEREOF
JOP20200280A1 (ar) 2018-05-09 2020-11-05 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير الوراثي عن fxi
EP3833397A4 (en) 2018-08-08 2023-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND AGENTS AGAINST NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS
TW202023573A (zh) 2018-09-19 2020-07-01 美商Ionis製藥公司 Pnpla3表現之調節劑
EP4045062A1 (en) 2019-10-14 2022-08-24 Astrazeneca AB Modulators of pnpla3 expression
BR112022016238A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-11 Ionis Pharmaceuticals Inc Compostos e métodos para modular smn2
TW202227101A (zh) 2020-11-18 2022-07-16 美商Ionis製藥公司 用於調節血管收縮素原表現之化合物及方法

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4415732A (en) * 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4671958A (en) * 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
DE3329892A1 (de) * 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US4680338A (en) * 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US5284646A (en) * 1986-07-03 1994-02-08 Advanced Magnetics Inc. Hepatocyte specific receptor mediated endocytosis type magnetic resonance imaging contrast agents
US5490991A (en) * 1986-07-03 1996-02-13 Advanced Magnetics, Inc. Directed delivery of radioprotectants using a receptor specific carrier
US4827945A (en) * 1986-07-03 1989-05-09 Advanced Magnetics, Incorporated Biologically degradable superparamagnetic materials for use in clinical applications
US5141739A (en) * 1986-07-03 1992-08-25 Advanced Magnetics, Inc. Delivery of x-ray contrast agents using receptor mediated endocytosis
US5554386A (en) * 1986-07-03 1996-09-10 Advanced Magnetics, Inc. Delivery of therapeutic agents to receptors using polysaccharides
US5342607A (en) * 1986-07-03 1994-08-30 Advanced Magnetics, Inc. Receptor mediated endocytosis type magnetic resonance imaging contrast agents
US5352432A (en) * 1986-07-03 1994-10-04 Advanced Magnetics, Inc. Hepatocyte specific composition and their use as diagnostic imaging agents
US5248492A (en) * 1986-07-03 1993-09-28 Advanced Magnetics, Inc. Low molecular weight carbohydrates as additives to stabilize metal oxide compositions
US5336506A (en) * 1986-07-03 1994-08-09 Advanced Magnetics Inc. Targeting of therapeutic agents using polysaccharides
US5478576A (en) * 1986-07-03 1995-12-26 Advanced Magnetics, Inc. Arabinogalactan derivatives and uses thereof
US5679323A (en) * 1986-07-03 1997-10-21 Advanced Magnetics, Inc. Hepatocyte-specific receptor-mediated endocytosis-type compositions
US4770183A (en) * 1986-07-03 1988-09-13 Advanced Magnetics Incorporated Biologically degradable superparamagnetic particles for use as nuclear magnetic resonance imaging agents
IN165717B (zh) * 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US6005094A (en) * 1986-10-28 1999-12-21 Genta Incorporated Oligonucleotide analogues having improved stability at acid pH
US4975278A (en) * 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5773435A (en) * 1987-08-04 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Prodrugs for β-lactamase and uses thereof
US4952394A (en) * 1987-11-23 1990-08-28 Bristol-Myers Company Drug-monoclonal antibody conjugates
US5563250A (en) * 1987-12-02 1996-10-08 Neorx Corporation Cleavable conjugates for the delivery and release of agents in native form
US5017693A (en) * 1987-12-02 1991-05-21 Neorx Corporation Methods for introducing a sulfhydryl amino or hydroxyl groups to a compound
US5141648A (en) * 1987-12-02 1992-08-25 Neorx Corporation Methods for isolating compounds using cleavable linker bound matrices
IL89220A (en) * 1988-02-11 1994-02-27 Bristol Myers Squibb Co Immunoconjugates of anthracycline, their production and pharmaceutical preparations containing them
US5094849A (en) * 1988-08-08 1992-03-10 Eli Lilly And Company Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized vinca analogs via simple organic linkers
US5028697A (en) * 1988-08-08 1991-07-02 Eli Lilly And Company Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized methotrexate analogs via simple organic linkers
US5006652A (en) * 1988-08-08 1991-04-09 Eli Lilly And Company Intermediates for antibody-vinca drug conjugates
US5144012A (en) * 1988-08-08 1992-09-01 Eli Lilly And Company Cytotoxic drug conjugates
US5169933A (en) * 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5010176A (en) * 1988-11-10 1991-04-23 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US5433955A (en) * 1989-01-23 1995-07-18 Akzo N.V. Site specific in vivo activation of therapeutic drugs
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5308604A (en) * 1989-04-19 1994-05-03 Deutsches Krebsforschungsinstitut Conjugates for tumor localization and/or tumor therapy
US5280113A (en) * 1989-08-16 1994-01-18 Monsanto Company Method for producing synthetic N-linked glycoconjugates
US5116944A (en) * 1989-12-29 1992-05-26 Neorx Corporation Conjugates having improved characteristics for in vivo administration
US5677440A (en) * 1990-07-16 1997-10-14 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
US5149794A (en) * 1990-11-01 1992-09-22 State Of Oregon Covalent lipid-drug conjugates for drug targeting
US5543390A (en) * 1990-11-01 1996-08-06 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
EP0513332A4 (en) * 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
FR2675803B1 (fr) * 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
US6030954A (en) * 1991-09-05 2000-02-29 University Of Connecticut Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells
US5495006A (en) * 1991-09-27 1996-02-27 Allelix Biopharmaceuticals, Inc. Antiviral polynucleotide conjugates
US5700922A (en) * 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5622929A (en) * 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5393737A (en) * 1992-08-20 1995-02-28 Health Research, Inc. Cytotoxic drug conjugates for treatment of neoplastic diseases
US5574142A (en) * 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5556623A (en) * 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US6413949B1 (en) * 1995-06-07 2002-07-02 D-Pharm, Ltd. Prodrugs with enhanced penetration into cells
US5681811A (en) * 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5457187A (en) * 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US6037329A (en) * 1994-03-15 2000-03-14 Selective Genetics, Inc. Compositions containing nucleic acids and ligands for therapeutic treatment
US5589334A (en) * 1994-06-03 1996-12-31 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecule which codes for a tumor rejection antigen precursor which is processed to an antigen presented by HLA-B44, and uses thereof
US5612474A (en) * 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
US5777153A (en) * 1994-07-08 1998-07-07 Gilead Sciences, Inc. Cationic lipids
US5646262A (en) * 1994-07-28 1997-07-08 Georgetown University Antisense oligonucleotides against hepatitis B viral replication
US5591721A (en) * 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5872007A (en) * 1995-02-17 1999-02-16 Hybridon, Inc. CAPL-specific oligonucleotides and methods of inhibiting metastatic cancer
WO1996040662A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5646298A (en) * 1995-06-07 1997-07-08 Procoron, Inc. Cyclopropylindole prodrugs
US5985662A (en) * 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
JP2000501414A (ja) * 1995-11-22 2000-02-08 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 生体分子の細胞取り込みを高めるリガンド
US5700921A (en) * 1995-11-27 1997-12-23 Vector Laboratories Labeling nucleic acids
US5981507A (en) * 1995-12-14 1999-11-09 Advanced Magnetics, Inc. Polymeric carriers linked to nucleotide analogues via a phosphoramide bond
US5880097A (en) * 1996-01-04 1999-03-09 Terrapin Techologies, Inc. Tethered prodrugs
EP0914462A4 (en) * 1996-03-18 2002-05-22 Molecular Biology Resources Amplification of target nucleic acid sequences
NZ330360A (en) * 1997-06-02 1999-03-29 Hoffmann La Roche 5'-deoxy-cytidine derivatives, their manufacture and use as antitumoral agents
US5929049A (en) * 1997-08-08 1999-07-27 Dade Behring Marburg Gmbh Polysaccharide conjugates of biomolecules
US6187335B1 (en) * 1997-12-31 2001-02-13 Orasomal Technologies, Inc. Polymerizable fatty acids, phospholipids and polymerized liposomes therefrom
US6030997A (en) * 1998-01-21 2000-02-29 Eilat; Eran Acid labile prodrugs
US6005098A (en) * 1998-02-06 1999-12-21 Hoffmann-La Roche Inc. 5'deoxycytidine derivatives
AU2002217980A1 (en) * 2000-12-01 2002-06-11 Cell Works Inc. Conjugates of glycosylated/galactosylated peptide

Also Published As

Publication number Publication date
EP1409548A2 (en) 2004-04-21
WO2003067209A2 (en) 2003-08-14
AU2002365420A1 (en) 2003-09-02
CA2451650A1 (en) 2003-08-14
WO2003067209A3 (en) 2003-11-27
JP2005518201A (ja) 2005-06-23
EP1409548A4 (en) 2005-08-31
US20030119724A1 (en) 2003-06-26
AU2002365420A8 (en) 2003-09-02
US20060183886A1 (en) 2006-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1555385A (zh) 增强细胞摄取生物分子的配体
CN1489477A (zh) 糖基化/半乳糖基化肽、双官能接头和核苷酸单体/多聚体的缀合物以及相关的组合物和使用方法
CN1849069A (zh) 用于端粒酶抑制的改性寡核苷酸
CN1604906A (zh) 用于治疗单链rna病毒感染的抗病毒反义核酸的试剂和方法
CN1120707C (zh) 增强生物分子的细胞摄取的配体
CN1771057A (zh) 基于脂肪族生物可降解连接体的可释放的聚合物结合体
JP4358521B2 (ja) 細胞デリバリーのためのコンジュゲートおよび組成物
US5574142A (en) Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
CN1309418C (zh) 免疫刺激性寡脱氧核苷酸
CN1263473A (zh) 增加跨生物膜转运的组合物和方法
CN1305932C (zh) 碳水化合物修饰的聚合物、其组合物及其应用
CN1373768A (zh) 寡核苷酸n3′→p5′硫代氨基磷酸酯,其合成及应用
CN1173745C (zh) 化学修饰的蛋氨酸酶及其在抗蛋氨酸和抗高半胱氨酸的化学治疗中的应用
CN1103815C (zh) 凝血酶突变体
CN108779465A (zh) 用于减少pd-l1表达的寡核苷酸
CN101076353A (zh) 基于脂肪族生物可降解的接头的可释放的聚合物共轭物
WO1994013325A9 (en) Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
CN86100608A (zh) 制备抗病毒剂的方法
CN101273051A (zh) 聚合寡核苷酸前体药物
CN1074911A (zh) 将生物作用的物质结合至生物粒子面膜上的化合物，组合物和方法
CN1124980A (zh) 具有改良抗流感活性的经修饰寡核苷酸
CN1835962A (zh) 利用乙酰化二糖治疗疾病的组合物与方法
CN1112126A (zh) 聚酰胺-寡核苷酸衍生物、其制法和用途
CN1498111A (zh) 包括含二硫键的肽和含氮碱基的化合物及其医学应用
CN1309970A (zh) 尿苷磷酸化酶抑制剂的制药应用及含其的组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: MINGYIN TREATMENT CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: CELL WORKS INC.; APPLICANT

Effective date: 20060901

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20060901

Address after: American Maryland

Applicant after: Therapeutics for the Ming Dynasty, Limited by Share Ltd

Address before: American Maryland

Applicant before: Cell Works Inc.

Co-applicant before: Johns Hopkins University

C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication